Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антигенно-активные компоненты CANDIDA ALBICANS и разработка тест-систем для диагностики кандидоза

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Антигенно-активные компоненты CANDIDA ALBICANS и разработка тест-систем для диагностики кандидоза"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ЛЕНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ИНСТИТУТ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ВРАЧЕЙ имени С.М.КИРОВА

На правах рукописи

Игнатьева Светлана Михайловна

УДК 576.8.097.2:582.282.23.095(04)

АНТИГЕННО-АКТИВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ CANDIDA ALBICANS И РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КАНДИДОЗА

03.00.24 - микология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ленинград 1990

Работа выполнена в Ленинградском ордена Ленина и ордена Октябрьской Революции институте усовершенствования врачей имени

С.М.Кирова МЗ СССР

Научный руководитель:

доктор медицинских наук З.О.Караев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.А.Заикина кандидат медицинских наук, доцент О.Д.Васильев

Ведущее учреждение:

Институт медицинской паразитологии и тропической медицины имени Е.И.Марциновского МЗ СССР

Защита состоится " $ _ 1990года в_ час

на заседании специалиэированног овета (Д 074.16.03)

по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Ленинградском государственном ордена Ленина и ордена Октябрьской Революции институте усовершенствования врачей имени С.М.Кирова МЗ СССР (193015,Ленинград, ул.Салтыкова-Щедрина, д.41)

С диссертацией можно ознакомиться в библиртеке института

Автореферат разослан " ¿6 " _ 1990г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат медицинских наук, ст.н.с. А.В.Соболев

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ.

Возрастающая роль грибов рода Gandida в патологии человека выдвинула проблему заболеваний, вызванных этими микроорганизмами в ряд актуальных проблем современной медицины. Клинические проявления кандидоза в большинстве случаев лишены специфических черт, течение часто напоминает другие инфекции, обусловленные бактериями, вирусами и простейшими. В большинстве случаев канди-доз является следствием продолжительной высокодозируемой анти-биотикотерапии, употребления кортикостероидных и иммуносупрес-сивных препаратов, иммунодефицитных состояний и нарушения имму-нореактивности организма при эндокринных растройствах, онкологических заболеваниях и т.п. (Караев 3.0. с соавт.,1983; Камкин К.П.,1978; Bodey G.Р.,1988; Kaplan H*S. ,1980). Клинико-лаборатор-ная диагностика кандидоза в настоящее время основывается на комплексном обследозании, включающем в себя клиническую картину заболевания, культуральные, микологические, аллергологические и иммунологические исследования. Последние обладают различной степенью чувствительности и специфичности. Тенденцией в диагностике микозов является отбор наиболее надежных и доступных для практического использования экспресс-методов. Среди исследователей, однако, нет единого мнения о преимущественном использовании той или иной серологической реакции. Одни отдают предпочтение пре-ципитационным тестам ( Glew R.H. et al. ,1978; Tomaikova A. et al.,1982), другие склонны к применению реакций, основанных на феномене агглютинации ( Pasel J. et al. ,1983), флюоресцентной или ферментативной метки ( Kühn G. ,1983"; Jones J. ,1982). Разноречивость информативных данных обусловлена, главным образом, отсутствием коммерческих диагностических препаратов из грибов рода Candida , критериев отбора штаммов-продуцентов анти-генно-активных веществ, а также научных разработок по вопросам стандартизации антигенов. Поэтому, представляется необходимым изучение биохимических особенностей, антигенной активности и специфичности отдельных клеточных компонентов с.albicans и оценка возможности их использования в иммунологических тестах.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основная цель исследования заключалась в характеристике биохимической природы антигенно-активных компонентов Candida albicans и разработке тест-систем для диагностики кандидоза.'

В задачи исследования входило:

- получить клеточные фракции с.albicans различи >й локализации, исследовать их биохимический и компонентный состав, электрофоретические характеристику;

- получить специфическую сыворотку к отдельным компзнентам С.albicans для стандартизации антигенно-активных фракций;

- изучить антигенные свойства с.albican-, и их зависимость от биохимических параметров клеточных фракций;

- разработать тест-системы на основе встречного иммуноэлект-рофореза (ВИЭ4?) и иммуноферментного анализа (И¿А) для выявления антител к с.albican;! и оценить эффективность использования

в них в качестве антигенов клеточных фракций различной химической природы;

- провести апробацию иммуноферментной тест-системы в группах больных с подозрением на кандидоз и заболеваниями смешанной бактериально-грибковой этиологии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЙ,ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАДИТУ:

1. Антигенная активность клеточных компонентов с.albicans зависит от сочетания двух факторов: химического состава и молекулярной массы (М.м.) фракции. Наиболее антигенно-активными являются фракции клеточной стенки (КС) с молекулярной массой г,2 -85кДа и отношением углеводов к белкам от 2/1 до 9/1. К родоспе-цифическим относится высокомолекулярная фракция маннанпротеина и фракция кислых гликопротеинов КС с изоточкой 3,5-4,5:

2. Разработанные тест-системы на основе ВИЗФ и И¿А обладают . ОДИНакОВОЙ эффеКТИВНОСТЬЮ При ВЫЯВЛеНИИ аНТИТеЛ К U.albicans; '

у больных кандидозом. Реакция ВИЭ£ характеризуется высокой специфичностью (94,7$), a MiA - высокой чувствительностью, выявляя 75,0 - 94,4% положительных реакций в группах больных с различными формами кандидоза при специфичности 85,7%. Показана диагностическая ценность иммуноферментной тест-системы при дифференциальной диагностике заболеваний смешанного бактериально-грибкопо-

го генеза и диагностике преимущественно висцеральных форм канди-доза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЮРВГИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Проведенными исследованиями впервые установлена зависимость иммунохимической активности выделенных клеточных фракций с.albicans от их молекулярной массы и биохимического состава. Разработана схема иммунизации кроликов и получена иммунная сыворотка адекватно реагирующая с различными клеточными компонентами с.albicans . Научно обоснованы критерии создания тест-системы для обнаружения антител к с.albicans п реакции ВИЭФ с использо-нием антигенно-активных фракций различной химической природы. Разработана и внедрена в систему практического здравоохранения первая отечественная иммуноферментная тест-система для определения антител к с.albicans . Впервые проведено сравнительное изучение чувствительности, специфичности и эффективности использования тест-систем на основе ВИЭ1> и ИФА при диагностике различных форм кандядоза. Апробация разработанной иммуноферментной тест-системы при диагностике кандидозных осложнений у больных гемоблас-тозами и туберкулезом органов дыхания показала пригодность данной системы для выявления и дифференциации висцеральных форм заболевания у больных с острым лейкозом и гематосаркомами, а также при туберкулезе легких.

ПР/иСГИЧЕСКАН ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Исследования биохимического и компонентного состава экстрактов КС, цитоплазмы и нативного раствора, а также их электрофоре-тических характеристик и антигенной активности позволили разработать тест-системы на основе ВИЭ£ и ИМ. с применением антигенно-активных фракций с.albicans • Разработанные тест-системы при обследовании больных кандидозом, а также контрольных групп лиц показали их высокую эффективность при определении антител 1С с. а 1 ьiс:Iпи • Иммуноферментная тест-система апробироггша на базе микологической клиники НИО глубоких микозов ЦЭВОг.'), стационара кафедры гематологии и трансфузиологии Лен.ГИДУВа (1^89г.), Институт! медицинской паразитологии и тропической медицины '<13 C'JCP им.л.И.Марциновского (г.Москва, 1990г.) и Ленин-гр1де:П)Г'о института фтизиопульмонологии (1989,1990гг.). Препара-

ты из КС и цитоплазмы c.albicabs были использованы для конструирования антигенных эритроцитарных диагностикумов, которые вместе с тест-системами на основе ВИЭФ и ИФА внедрены в практику микологической лаборатории НИО глубоких микозов с клиникой Лен.ГИДУВа. Очищенная фракция цитоплазматических белков (ЦБ) с.albicans нашла применение также для выявления повышенной чувствительности к с.albicans методом укола. Полученные материалы диссертации использованы при составлении научно-технической документации на иммуноферментную тест-систему для выявления антител к с.albicans (экспериментально-производственный регламент, временная фармакопейная статья, инструкция по применению, отчет о лабораторном экспериментальном изучении, техническое задание) и аллерген для определения гиперчувствительности к с.albicans и переданы на рассмотрение в Комитет медицинских иммунобиологических препаратов при Минздраве СССР с целью организации промышленного выпуска. Диагностическая 'иммуноферментная тест-система для выявления антител к с.albicans экспонировалась на выставках "Интенсификация - 90" и ВДНХ СССР.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены на заседаниях Всесоюзного центра по глубоким микозам МЗ СССР (1984,1985г.), на заседаниях секции микологии Ленинградского общества микробиологов и эпидемиологов (1983г.,1986г.), I Всесоюзной конференции "Хроматография в медицине" (г.Москва, 1983г.), II Всесоюзной конференции "Результаты и перспективы научных исследований микробных полисахаридов" (г.Ленинград, 1984г.), Международном симпозиуме "Актуальные вопросы медицинской микологии:заболевания, вызванные условно-патогенными грибами" (гЛенинград, 1987г.), Научно- медицинской конференции "Научно-технический прогресс и здоровье населения" (г.Калуга, 1987г.), на конференции французского научного общества микробиологов (г.Париж, 1988г.).Отраслевом совещании "Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций (г.Оболенск, 1989г.). Диссертационная работа апробирована на научном заседании Всесоюзного центра по глубоким микозам МЗ СССР (май, 1990г.).

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, вы-вкводов и приложения. Работа иллюстрирована 1Ь рисунками, 4Û фотографиями, kB таблицами. Указатель литературы содержит и -JOQ источников отечественных и зарубежных работ.

Диссертация выполнена в начно-исследовательском отделе глубоких микозов с клиникой (зав. - д.м.н. З.О.Караев) Ленинградского государственного института усовершенствования врачей имени С.М.Кирова.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Исследования проводились на 14 штаммах Candida albicans , в том числе б штаммах из Всесоюзной коллекции патогенны-í грибов МЗ СССР ( шт.846,1,4,А-207,475) и 8 штаммах, выделенных от больных кандидозом и кандидоносителей (шт.248,315,677,57,152, 2!32), находившихся в стационаре НПО глубоких микозоп Лен.ГИДУВа. В качестве основной кульгуры для выделения клеточных фракций использовали с.albicans шт.846 серотипа А + ti + С. Для контроля специфичности применяли штаммы грибов рода Candida : С.tropicalis ШТ.336,337,329,97, C.r.ulliermondii IUT.582, 6 53,586,569,с.krusiè шт.573,576,503,896,с.parap silo jis CIT. 6U9, С. ut il i a ШТ.651.

Ферментацию грибов проводили в режиме 'Чыного культивирования на жидкой питательной среде Сабуро с 4% глюкозы, pH 7,0-7,2 в течение 48 час при 37°С в ферментере "Биотек" или на качалочных колбах. Биомассу грибов подвергали дезинтеграции с бусами Баллотини диаметром 0,5-1,0мм на приставке JI-Í7 к центрифуге ЦДР при 2-4(">С, ЮООоб/мин, в течение I часа. КС почали согласно Mendosa с.G. (1963). Экстракты КО получали водной экстракцией при азтонлавировании ( I20UC, 2 часа) (АЭ) и солюбилизацией фосфатным буфером с 5мМ ЭД'ГА, pH 7,2 п тгче-

ние 18час при 37^С (СЭ). Цитоплазматический экстракт (ЦЭ) отделяли от клеточных органвлл центрифугированием при 313000 об/мин на ультрацентрифуге "весктап " в течение I час.

Химический состав экстрактов и их фракций определяли по содержанию белка ( Lowry ,1951), углеводов с антроновым реактивом (Петров К.П.,1965), общего азота (Балябина Н.Д., 1974), нуклеиновых кислот по Спирину Л.С.(1958) и характеризовали условной величиной соотношения содержания углеводов к содержанию белка ( У/Б). Анализ моносахаридного состава проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах " ¡jiiufoi " (ЧССР) в системе н-бутанол-этанол-вода'(10:1:2). Для проявления пластин использовали 3% раствор солянокислого п-анизидина при нагревании до ЮО^С в течение 3-4мин.

^акционирование экстрактов КС, цитоплазмы и нативного раствора (HP) с.albicans шт.846 проводили осадительными методами с применением этилового спирта (Зобъэма/объем экстракта) или сульфата аммония (753,80%,90% насыщения), а также гель-фильтрацией на сефадексе С-100 фирмы " Pharmacia " (Швеция), аффинной хроматографией на СоА-сефарозе ( Pharmacia .Швеция). Молекулярную массу (М.м.) компонентов определяли с помощью гель-хроматографии на ультрагеле АсА-44 ( LKB , Франция) с маркерами ( Pharmacia , Швеция): ферритин (№.м.440000), ти-роглобулин (М.м.669000), химотрипсиноген (М.м.25000), овальбу-мин (М.м.43000), рибонуклеаза (М.м.13700), бычий сыворочный альбумтн (М.м.67000), альдолаза (М.м.158000), каталаза (М.м. 232000). Основными условиями для проведения хроматографических исследований были следующие: для гель-фильтрации - колонка 1,5x100см, 0,IM фосфатный буфер,рН 7,2, скорость элгоции-Юмл/час, объем фракции -Змл; для аффинной хроматографии -колонка 1,0x10см, 40мМ фосфатный буфер с 0,25М NaCI, рН 7,2, скорость элюции -20мл/час, объем фракции-Змл; для гель-хроматографии на ультрагеле - колонка 0,6x29см, 0,45% раствор хлористого натрия, p'rl 6,0, скорость элюции-Змл/час, объем фракции-1мл. Измерение оптической плотности полученных фракций производили при 280нм и использовали приборы фирмы LKB (Швеция): Уви-корд -2, Ультрарак, Рекордер и Вариоперпекс.

Электрофоретические парметры экстрактов и фракций

с.albicans изучали методами электрофореза (Э1>) п агарошюм геле (1,0% гель, барбитал-ацетатный буфер, р!18,2-0,4) и полиакрил-амчдном (ПААГ) геле (7,5% гель, трис-глициновый ^уфер, рМ 8,9), изоо.юктрнческого фокусирования (ИМ в агарозном геле п диапазоне рП 3-9. Методики воспроизводились с помощью реактивов и инструментов фирмы "LKB " на приборе "Мультнфор" (Швеция), ¡'дентнфнкацию фракций с различной электрофоретичоской подвижностью проводили окрашиванием на белки, гликопротеины и полисахариды общепринятыми методами (Gaal О.,et al, 1982).

¡í> качестве источников специфических антител были использованы гипериммунные кроличьи сыворотки к вакцинам из целых клеток С. albicans ,гат.846,С.tropicalis ,щт.97,C.gillier-mondJ,tnT.569, C.parapsiloaia,mT.899, C.utilia ,шт.651, а также к ЦЭ и разрушенной биомассе с.albicans шт.846. Иммунизацию ЦЭ осуществляли по схемам George i1. (1982), Wilson E.V. и Hearn V.M.(1982).Jnrzaball A. (1976), Greenfield R.„ Jones J. (1961), Пашинина (1961), сухой клеточной разрутенной взвесью (Юрмг/мл) 2 раза в неделю комбинированными инъекциями внутри-пенчо и внутримышечно в течение 4 недель. В работе в целом было использовано 29 кроликов породы "Шиншилла" пегом 2,0-2,.'~жг.

Иммунохимическое изучение клеточные фракций осуществляли с различным набором иммунных сывороток в реакции дяойной диф-фузич п агаровом геле (РДЦ) по Ouchterlony о.(1Э49), встречном чммуноэлектрофорезе (ВИЭФ) согласно Bedarida G. (1969), перекрестном иммуноэлектрофорезе (ПИЭ^) поЛхе1леп М.(1977) и иммучоолектрофорезе (H3Í) по Grabar Р. и Williams С(19:33), а также твердофазном иммуноферментном анализе (И£А) в непрямом варианте ( Voller л.et аЦ979). Постановку И5А проводили в поли-отир->лопых микротитрационных панелях производства "Медполимер" (Ленинград) и фирмы " Dynatech в качестве конъюгата применяли белок А золотистого стафилококка, меченный пероксидазой хрена, производства ЛНИИЭМ им.Пастера. Субстратом служил раствор О-фенилендиамина (0,4мг/мл) в цитратном буфере, pH 5,0 в присутствии перекиси водорода (конечная концентрация 0,006%). Учет результатов реакции проводили спектрофотометрически на "Миниридер -И" фирмы "Dynatech " и КАИ-Ц-01 (Йошкар-Ола) при длине волны 490нм.

При разработке тест-систем использовали сыпоротпч иммунных животных к грибам рода Candida , Aspergillus , Trichophyton, бактериям-возбудителям кишечных инфекций, а также ситроткч кропи г»< .ьных с различными формами кандидоза v. контрольных лиц. йтрминов -жие групп обследуемых осуществляли врачи микологической клиники НИО глубоких микозов и кафедры фтизиопульмонологин Леи.ГИДУ;5а на основе клинической картины заболевания и комплексного обследования (микологические исследования биоеубстратов, гистологические исследования биоптатов, рентгенодиагностика, иимун-!-лллор|" <л П'ические тесты). В ходе апробации тест-систем на основе ВИЭ1> и ИМ были исследованы сыворотки крови 127 больных с различными формами кандидоза, 46 больных с соматическими заболеваниями, 34 больных дерматомикозами, 48 больных с острым лейкозом и гаматооаркомами, страдающих кандидозом и без наличия клмдидоинфекции, 84 больных туберкулезом легких и 63 практически здоровых лиц. Оценку чувствительности, специфичности • и эффективности ВИЭ& и ИМ проводили по эмпирическим формулам

согласно Galen R. и Gambino S. (1932). Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием методов параметрической и непарлметрической статистики (Ручион Р. ,198.':!; Пустыаьник Е.И., 1968).

ПОлУЧКНШЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Би тшическая характеристика клеточных- ..оракций С.albicans и их антигенные свойства.

3 процессе Ферментации С.albicans шт.846 в условиях глуби w> го культивирования в ферментере выход биомассы гриба составлял 1Ь~20г влажных (70-7Ь$) клеток на 1л питательной среды. При выращивании различных штаммов С.albicans на качалках получали грибных клеток в 5,5-7,7 раз меньше, чем при биосинтезе в ферментере. Накопление биомассы зависело от вида Candida . Так, -птаммы грибов C.guiliiermondiin с.tropicalis характеризовались большей продуктивностью (5,5г/л и 6,1г/л), чем штаммы с.albicans и c.krusei (2,8г/л и 3,8г/л). В ходе культивирования происходило изменение кислотности питательной среды с 6,7-7,2 до 4,0-4,9 не зависимо от вида и штамма гриба. Количество внеклеточных веществ составляло 2,1-4,4г/л, при этом наибольший выход отмечен у штаммов C.gulliermondiiH С.tropicalis.

Соотношение биомасса:метаболит составляло для с.albicans 1,1/1, C.tropicalia -I,7/1,С.krusei и С.gulliermondiiI,5/I, что указывает на существенные различия в процессе культивирования различных видов Candida

3 ходе дезинтеграции биомассы грибов степень разрушения последней варьировала я пределах 90-95%, а выход влажных КС колебался в пределах от 43,3 до 52,0%.

При получении экстрактов КС выход препаратов составлял 25-34^ (ЛЭ) и 18-27% (СЭ) по отношению к весу КС, а фракции ЛЭ п ) количественному содержанию не превышали 1%. Выделенные фракции по химическому составу представляли собой гликопротеиновые комплексы с преобладанием углеводного компонента: У/Б от I/I до 27/1. Исключение составляли спиртовая фракция КС (У/Б =1/5,6) и СЭ (У/Б =1/3,6). Анализ моносахаридного сотава методом ТСХ показал, что фракции КС принадлежат к классам маннанглюканпро-теинов, маннанпротеинов и глюканпротеинов.

При получении ЦЭ с.albicans исследовали способы наиболее полной солюбилнзации водорастворимых гликопротеинов цитоплазмы гриба. В качестве экстрагентов использовали различные по составу инградиёнтов и рН буферные растворы. Наиболее полная экстракция биологически активных веществ осуществлялась с помощью буферных растворов, включающих в себя микродобавки детергентов (ЭДТД, тритон Х-100). По химическому составу ЦЭ представляли собой гликопротеиновые комплексы с преобладающим содержанием белка ( У/Б=1/1,9 - 1/2,4) и были аналогичны по составу ЦЭ C.gulliermondii . У грибов C.tropicalia иС.krusei ДОЛЯ белкового компонента в ЦЭ была выше.

Белковые фракции цитоплазмы С.albicans выделяли сульфатом аммония при различных значениях рН и степени насыщения ЦЭ (75%, 80%, 90%). Полученные данные свидетельствовали о том, что основное количество ЦБ удается получить при 75% насыщении, при этом выход белковой фракции увеличивается в слабощелочном и нейтральном диапазоне рН. Фракция, осажденная сульфатом аммония, как правило, содержала в 4-9 раз больше белкового компонента, чем ЦЭ ( У/Б=1/1,3 - 1/2,0 и 1/5,6 - 1/17,0, соответственно). Выход белковой фракции составлял 6-18% от суммарного белка в ЦЭ. В надосадочной жидкости обнаружена фракция гликопротеинов, имеющая выоокуто концентрацию углеводов ( У/Б=2,8/1-3,9/1).

Пои аффинной хроматографии ЦЭ С.albicans на СоЛ-сефаро-зе. очистка белка от углеводсодержащих примесей происходила менее эффективно (1,8-2,0 раза), чем при высаливании сульфатом аммония. Фракцию ЦБ с 95,% содержанием белка удавалось получить сочетанием методов осаждения сульфатом аммония и хроматографией на аффинном сорбенте. ,

Эчзоклеточные фракции С.albicans , C.gulliermcmdU, O.krusei по химическому составу практически не отличались от соответств вующих ЦЭ, HP с.tropical!а, напротив, содержал в 1,5-2,1 раза больше болка, '--ем его ЦЭ. В углеводном компоненте HP обнаружен маннан и глюкан.

Электрофоретическое изучение экстрактов и фракций с.albicans в'агарозком геле показало их гетерогенность. При окрашивании форегр'амм различали белковые, гликопротеиновые и полисахаридные фракции с различной подвижностью в электрическом поле и зарядом молекул. Основная часть фракций КС и цитоплазмы обладала отрицательным зарядом, но в то же время была выявлена стартовая незаряженная фракция, окрашивающаяся на полисахариды и, по данным ТСХ, содержащая маннан. Среди фракций, имеющих сродство к аноду, присутствовала высокоподвижная фракция' кислых гликопро-теинов с pl= 3,0-4,5 наиболее характерная для компонентов КС и присутствующая в ЦЭ в незначительных количествах.Мало- и сред-неподвижные в электрическом поле фракции содержали значительное количество белка и обнаружены как в ЦЭ, так и во фракциях КС ( pl=4,8-5,8 и 5,5-6,5, соответственно). При ЭФ исследовании в ПААГе различных штаммов С.albicans условно различали 3 группы белков с низкой, средней и высокой подвижностью, при этом наиболее интенсивно окрашивались амидочерньгм 10В фракции со средней подвижностью к аноду. Отмечены более выраженные различия в интенсивности окраски последних по отношению к малоподвижным фракциям и менее интенсивное окрашивание высокоподвижных фракций у музейных штаммов с.albicans , чем у клинических штаммов от больных кандидозом. Количество высокоподвижных белковых фракций у различных штаммов С.albicans варьировало в широких пределах, в то время как малоподвижные высокомолекулярные фракции характеризовались постоянством состава. При ИФ в агарозном геле в катодной области выявлялась фракция с pl=9,0, идентифицировать химическую природу которой не удалось. Фракции HP локализовались, в основном, в стартовой

зоне и слабо окрашивались на белки.

Аналитическая хроматография на ультрагеле АсА-44 и определение М.м. показали, что в КС содержатся, главным образом, высоко- и среднемолекулярные углеводсодержащие фракции (М.м.62-120кДа), и фракция кислых гликопротеидов (М.м.30-35кДа); в ЦЭ - белковые фракции с М.м.43-54кДа и гликопротеиновые фракции с М.м.62-120кДа. В HP обнаружено высокое^ содержание низкомолекулярных пептидов (М.м.20кДа).

На основании электрофоретических и хроматографических исследований выявлено 7 компонентов С. albicans (табл.1). '

' : Таблица I.

Компонентный состав С. albicans

М.м. Химическая Локализация

компонента У/Б - Pi природа в клетке

(кДа)

I00-I20 I0/I-27/I 7,0 маннанпротеин КС,цитоплазма,HP

• 62-85 5,4/1-9,7/1 6,0-6,5 _____п______ ______и________

43-54 1/5,9-1/17,0 4,8-5,8 протеин цитоплазма

30-35 1/3,6-1/4,2 3,5-4,5 маннанпротеин КС, цитоплазма

28 .. 1/1 3,0-3,5 маннанглюкан- КС

протеин

25 1/5,6 5,5-6,5 глюканпротеин КС

20 1/2,0 9,0 пептид HP,КС,цитоплазма

Для изучения антигенной активности компонентов с. albicans были получены иммунные кроличьи сыворотки к вакцинам из целых клеток грибов рода candida и ЦЭ с.albicans шт.846. При иммунизации кроликов корпускулярным антигеном титры циркулирующих антител после 2-го цикла иммунизации с гомологичным антигеном составляли 1:8 -1:32 в РДЦ. Парентеральное введение целых клетокc.al-bicana способствовало индукции противокандидозных антител, специфичных, главным образом, в отношении антигенов КС гриба и нереарирующих с очищенными белками цитоплазмы. Поэтому, для характеристики антигенных свойств ЦБ получали иммунные сыворотки к ЦЭ G.albicans . В отличие от вакцины из целых клеток, смесь ЦБ обладала слабыми иммуногенными свойствами и получение активной иммунно сыворотки представляло значительные трудности. Наилучшие результаты зарегистрированы при использовании схемы иммунизации ЦЭ по Пашинину (1961), однако величины титров

специфических антител данной сыворотки в РДД не превышали 1:4. Гипериммунная кроличья сыворотка против ЦЭ с.albicans активно реагировала с L[Bin"vitroH не взаимодействовала с углеводсо-держащими фракциями цитоплазмы г. КС гриба. Поэтому, для оценки антигенных свойств клеточных фракций различной химической природы и стандартизации антигенно-активных компонентов с.albicans была предпринята попытка получения иммунной сыворотки, специфичной к отдельным компонентам разрушенной биомассы гриба.

В доступной нам литературе мы не обнаружили подобно? схемы иммунизации относительно с.albicans , поэтому считали целесообразным изучить динамику накопления сывороточных антител при инъекциях вакциной гриба, приготовленной из разрушенных клеток патогена. Согласно разработанной схеме, первые пре-ципитины появлялись после 5 инъекции на 15 день иммунизащ-и и достигали максимальных значений I: .6*/в реакции ВИЭФ и 1:4 -- 1:8 в РДЦ к 23-30дню. При использованном методе иммунизации происходила активная выработка антител как к антигенам КС, так и антигенам цитоплазмы грибной клетки (рис.1).

ДТ-1

32

16 8

4

2

10 20 30 40 Дни

Рис.1. Динамика накопления антител при иммунизации разрушенной клеточной взвесью с.albicans -По оси абсцисс - дни иммунизации, по оси ординат-обратная величина титров антител (ЛТ). I - антиген КС, 2 - ЦЭ, 3 -ЦБ. Таким образом, полученная гипериммунная кроличья сыворотка может быть универсальной сывороткой для стандартизации ангиген-

ных фракций.

Изучение антигенных спектров экстрактов КС с.albicans в ИЭФ с помоьв преципитирующей сыворотки к разрушенной клеточной взвеси гриба позволило выявить 8 антигенов, различающихся по электрофоретической подвижности. Два из них относились к области высокоподвижных кислых гликопротеиновых фракций, два -к области фракций со средней электрофоретической подвижностью к аноду, один антиген идентифицирован в стартовой зоне фореграммы и три антигена - в катодной области. Следует отметить, что такого антигенного спектра нам не удавалось получить при использовании для иммунопроявления гипериммунной сыворотки к вакцине из целых клеток С.albicans.

Методами ИЭФ и ПИЭФ с сывороткой к ЦЭ в цитоплазме гриба выявлено до 20 индивидуальных антигенов, локализованных, в основном, в области белков со средней электрофоретической подвижностью к аноду, I антиген в зоне высокоподвижиых белков и 2-3 антигена в катодной и стартовой зонах иммунофореграммы, соответствующих углеводсодержащей фракции ЦЭ.

При изучении антигенных свойств С.albicans были использованы музейные и клинические штаммы грибов, полученные из патологического материала больных кандндозом. Тестирование экстрактов из различных штаммов С. albicans с гомологичной иммунной сывороткой в реакции ВИЭФ показало, что антигенная активность клинических штаммов в 8-32 раза превышала таковую у музейных. Хранение культур в музейных условиях, по-видимому, приводит к частичной утрате их антигенности.

Анализ антигенной активности фракций КС, ЦЭ и HP показал, что антигенные свойства гликопротеинов, различных по химическому составу, зависели от содержания в них углеводного компонента: уменьшение доли углеводов сопровождалось снижением удельной активности фракции. Однако, в некоторых слуииих такая закономерность не наблюдалась, поэтому мы проводили исследования зависимости антигенных свойств не только от химическ и") состава гликопротеинов, но и их М.м. Аналитическое изучение фракции, полученных при хроматографическом разделении экстрактов на .ультрагеле Ас.1-44 и сефадексе С-ЮО показало, что средняя величина уде-льно!': активности антигенных фракций колеб.-ылеь п ннтерьа-ле 0,00-0,73. Наиболее активными являлись среднемо^еку.»ирные

фракции гликопротеинов с М.м. в диапазоне 62-85кДа. При увеличении М.м. до 100 кДа и снижении до 25-27кДа удельная активность фракций уменьшалась. фракции с М.м. более 100 кДа л менее 23кДз антигенными свойствами не обладали. Следовательно. йнгиге-ямя активность зависела от сочетания двух параметров:биохимического состава и М.м. фракции.

Ряд исследований был посвящен определению перекрестно-реагирующих антигенов у некоторых видов Gandida . С этой целью экстракты КС, ЦЭ и HP С.albicans , С.tropicalis , C.gulliermondii, C.krusei тестировали в РДЦ и ПИЭФ с иммунной сывороткой к С.albicans . Полученные результаты свидетельствуют о большом сходстве антигенной структуры С.albicans ис.tropicalis , обнаружены также перекрестные реакции сc.gulliermondiii, в меньшей степени, с c.krusei , что вполне соответствует результатам зарубежных исследователей ( Greenfild et al., 1982). Для выяснения роли отдельных фракций с.albicans в перекрестных реакциях с грибами рода Candida , последние были исследованы в РДЦ с гетерологичными иммунными сыворотками. Полученные результаты дают основание заключить, что фракция кислых гликопротеинов с изоточкой 3,5-4,5 имеет наряду с фракцией маннанпротеи-нов КС с pi 7,0 и М.м. 100- 120кДа целый набор антигенов, об< щих с другими видами Candida , т.е. эти фракции могут быть идентифицированы как родоспецифичее :ие. Наиболее специфичной оказалась фракция с.albicans с М.м. 62-85кДа, реагирующая перекрестно только с сыворотками кc.gulliermondii, С.tropicalis, однако высокоспецифичной для С.albicans фракции обнаружено не было.

Разработка тест-систем для иммунодиагностики кандидоза.

3 ходе разработки наиболее специфичных и чувствительных тест-систем для выявления антител к с.albicans была проведена оценка пригодности клеточных фракций различной химической природы в РДЦ, ВИЭ5 л ИМ. 3 ряде экспериментов с применением гипериммунной кроличьей сыворотки к с.albicans а пула сывороток крови больных кандидозом показана более высокая чувствительность реакции ВИЭ5, чем РДЦ, особенно при исследовании клинического материала (в 3- 20 раз), что подтверждает данные odds Р. (1975).Оба теста оказались достаточно специ-

фичными и не выявляли линий преципитации с нормальной сывороткой кролика. Учитывая значительную экономичность реагентов в реакции ВИЭ'5 (10мкл) и скорость проведения анализа (40-5Смин), данный тест был выбран в качестве экспресс-метода при изучении сывороток крови больных с различными формами кандидоза. Оценку реакции осуществляли по величине титра, наличию и количеству зон преципитации. Статистически достоверные различия в титрах антител зарегистрированы лишь у группы больных с хроническим кандидозом кожи и слизистых (ХККС) и в группах больных с ХККС и висцеральными формами кандидоза при оценке среднего числа зон преципитации ( Р < 0,01).

При тестировании сывороток крови больных кандидозом в реакции ВИЭ£ выявлены специфические антитела как к антигенам КС, так и к цитоплазматическим фракциям с.albicans (табл.2). У больных I группы с ХККС антитела обнаружены в 88,9-85,2^ случаев, а во 2 и 3 группах больных, страдающих висцеральными и локальными формами кандидоза - 54,Ъ% и 30,0$, соответственно. Отмечено 4т0-8,7$ положительных реакций у контрольных лиц с заболеваниями некандидозной этиологии и отсутствие антител в сыворотках крови практически здоровых людей. Наименее специфичным из используемых антигенов оказался маннанпротеин с М.м.100-120кДа, а высокая эффективность реакции ВИЭФ достигалась при применении ЦЭ и составляла для 1-2 групп больных 85,6$ и 83,3$ у больных кандидозом генеталий (табл.3). Низкую специфичность маннансодержащих антигенов отмечали также Syver-son R. et aliI977) и Glew R. et al.,(1Э75) при исследовании сывороток как здоровых лиц, так и б>. шных с соматическими заболеваниями без кандидоинфекции.

Таким образом, тест-система на основе ЗИЭ'£ должна включать в себя в качестве антигена ЦЭ с.albicans , положительный (гипериммунная кроличья сыворотка со специфическими антителами или пул сывороток больных кандидозом), отрицательный контроль (пул сывороток здоровых лиц) и набор инградиентов, необходимых для проведения анализа.

При разработке ИЗА изучали сорбционные свойства, антигенную активность и специфичность отдельных клеточных фракций с. albicans • Показано, что для получения эффективного иммуно-сорбента необходимо учитывать следующие факторы:

Таблица 2

Выявление антител к с.albicans у больных различными формами кандидоза в реакции В'ЛЭФ

№ группы "Диагноз Количество обследованных Положительные реакции' (Г?)

МП-I МП-2 ДЭ ОЦЭ ЦБ ЭЦБ

I ХККС 27 63,5 88,9 85,2 73,8 81,8 81,5

2 Висцеральный канди-доз 22 54,5 54,0 64,5 50,0 31,8 27,3

3 Кандидоз генеталий 18 35,0 36,3 45,0 30,0 30,0 35,0

4 Соматические заболевания 23 17,4 4,3 8,7 8,7 8,7 8,7

5 Дерматоми-коз 25 16,0 8,0 4,0 4,0 4,0 4,0

6 Здоровые 28 0 0 0 0 0 0

Примечание. МП-I и МП-2 -маннанпротеиновые фракции с

М.м. 100-120кДа и б2-85кДа, соответственно; ЦЭ.ОИЭ.ЦБ.ОЦБ - ци-топлазматические фракции в порядке увеличения степени очистки от углеводного компонента.

- сорбционная способность фракций различной химической природы увеличивается при переходе от нейтральных к щелочным значениям р.Ч и максимальна при рН 9,5;

- оптимальная концентрация фракций различной химической природы для иммобилизации на полистироле соответствует 10-20мкг/мл;

- углеводсодержащие фракции с р1 7,0 и 6,0-6,5 и фракция кислых гликопротеинов с р1=3,5-4,5, локализованные в КС, имеют большую сорбционнуго емкость, чем цитоплазматические белковые фракции с р1= 4,8-5,8;

- использование вибровстряхивателя на этапе сорбции антигена позволяет сократить время инкубации без заметного снижения величин оптической плотности контролей в б раз.

3 опытах с гипериммуными кроличьими сыворотками к грибам

бакрериям-возбудителям кишечных инфекций отмечена наибольшая специфичность и антигенная активность маннанпротеиновзй фракции КС с М.м.62-8окДа. Фракция ЦБ с М.м.43-54кДа в большей степени реагировала с гетерологичными антисыворотками к указанным выше грибам перекрестно.

При тестировании в ИФА сывороток крови больных с различи ными формами кандидоза и контрольных групп людей с маннанпроте-иновой фракцией КС в качестве антигена получены данные, свидетельствующие о наличии у доноров Candida -антител в сравнительно низких титрах ( 1:200-1:800), в то время как в группах больных кандидозом уровень специфических антител достигал 1:51200. Поэтому, разведение сывороток крови больных 1:1600 было выбрано в качестве диагностичекого. С учетом этого, у больных 1-ой группы с ХККС, 2-ой группы с висцеральным кандидозом и 3 группы лиц, страдающих кандидозом генеталий, выявлено 94,4%,92,3% и 75,0$ положительных реакций, соответственно. Ложноположительные результаты в контрольных группах, при этом, составляли 7,9-23,0% (рис.2).

Рис.2. Количество положительных (заштрихованный столбик) и отрицательных (светлый столбик) результатов ИМ у различных групп обследуемых.

По оси абсцисс-группы лиц (обозначения аналогичны табл.2), по оси ординат - количество обследуемых.

рода Candida

Aspergillus и Trichophyton t а также

1 2 3 4 5

1руппы лиц

Кроме перечисленных групп больных в И<М были исследованы сыворотки крови людей повышенного риска в отношении кандидо-инфекции: больных гемобластозами и туберкулезом органов дыха-

ния. При этом, у лиц с острым лейкозом и гематосаркомами, стра-страдаккцих висцеральными формами кандидоза, выявлено 62,5% положительных реакций, в то время как при кандидозе полости рта у такого контингента больных статистически достоверные данных получепо не было ( Р > 0,5). В контрольной группе онкологических больных без кандидоинфекции ложноположительных реакций не обнаружили. Это указывает на эффективность использования разработанной ИФЛ-теет-системы для диагностики висцеральных поражений у больных с острым лейкозом и гематосаркомами, что согласуется с данными некоторых авторов ( Holmberg к. et al. > 1980) и не совпадает с мнением Bodey G. (1988), обнаруживающего у такого контингента лиц большое число ложно-положительных и ложноотрицательных реакций. В группе больных туберкулезом легких в 48,8% случаев зарегистрированы антитела к с.albicans , что указывает на необходимость контроля возникновения кандидоза у данной категории лиц. Эффективность использования ИМ-тест-системы для указанных групп риска на кандидоз составила 76,6% (онкологические больные) и 57,7% (больные туберкулезом легких).

Результаты сравнительной оценки диагностической эффективности ИМ и ВИЭФ оказались сопоставимыми (табл.3).Большая эффективность ИМ была обусловлена его высокой чувствительностью (94,4%- 75,ОХ), а реакции ВНЭФ - высокой специфичностью {9Ц,7%). Показано преимущество ИМ при выявлении специфических антител у больных, страдающих висцеральными и поверхностными формами кандидоза, что существенно повышает его диагностическую ценность. Параллельное изучение одних и тех же сывороток кропи больных кандидозом в обоих тестах выявило в 60,0% случаев совпадение результатов тестирования, при этом, полностью совпадали отрицательные результаты (100%) и лишь 56,0% положительных. Отмечена также удовлетворительная корреляционная зависимость между титрами антител в ИМ и ШЭ1' ( г = 0,75 ± 0,22), но вто же время 28,6% положительных в ИМ образцов находились за пределом чувствительности реакции ВИЭ1>.

Тт:.;ица 3.

Сопоставление результатов использования реакции ВЛЭ2 и iiiu при исследовании антител к с.albicans в сыворотках крови больных кандидозом.

Чувст- Прогности- Прогности- Сопоставлен-!?

Метод витель- Специ- ческая ческая ■ Эффектив ¡ьтагоз 1)

исследования группы больных ность {%) фичность (55) ценность (+) ре-з'/льтата ценность (-) результата ность(%) Cosee число П звательные Отрицательные

I 65,2 88,5 94,8 93 ,2

2 54,5 94,7 80,0 88,0 36

3 . 30,0 72,7 £8,0 83 ,3 50,0 56,0 100,0

I 94,4 77,7 96,8 68

И ЗА 2 87,0 85,7 82,2 90,9 66 .9

3 75,0 70,6 83,2 84 0

Примечание: Т° группы больных аналогичен обозначению таблицы 2.

22 вывода:

1. Фракционирование и физико-химическая характеристика компонентов КС, цитоплазмы и метаболитов с.albicans показало наличке в КС, главным образом, высоко- и среднемолекулярных маннанпротеи-нов (М.м.100-120кДа и 62-85кДа) с высоким содержанием углеводов, фракции кислых гликопротеинов (М.м.30-35кДа); в ЦЭ -среднемолекулярних белков (М.м.43-54кДа) и углеводсодержащих фракций (М,м.отб2 до 120кДа); HP гриба содержал пептиды (М.м.20кДа) и незначительное количество маннанпротеинов (М.м. от 62 до 120кДа).

2. Разработаны способы получения специфических антисывороток к отдельным компонентам с.albicans , произведена стандартизация антигенно-активных фракций с применением иммунной сыворотки против разрушенной клеточной взвеси гриба.

3. Изучение антигенных свойств компонентов с.albicans и их зависимости от биохимического состава и М.м. выявило наиболее высокую активность и специфичность маннанпротеинов КС (М.м.62-65кДа) соотношение У/Б от 2/1 до 9/1). Белковые фракции цитоплазмы (М.м.43-54кДа) и пептиды метаболитов (М.м.20кДа) обладали слабой иммунохимической активностью. Установлено, что высокомолекулярная фракция маннанпротеина (М.м.100-120к,Да) и кислые гликопро<?е-ины (М.м.30-35кДа) являются родоспецифическими для Candida

4. Показана высокая эффективность ЦЭ, содержащего белковые фракции (М.м.34-54кДа) и маннанпротеины (М.м.от 62 до 120кДа), в качестве антигенного препарата в реакции ВИЭФ для выявления антител в сыворотки крови больных кандидозом.

5. Разработана тест-система для лабораторной диагностики кандидоза на основе твердофазного ИФА с использованием антигена КС, содержащего маннанпротеиновую фракцию Ш.м.62-85кДа) и коммерческого конъюгата белок Л-перэксидаза хрена. Сконструированная ИМ-тест-система для обнаружения антител к с.albicans обете- • чивает высокую чуас-гвительность (75,0-94,4$), специфичность (83,7$) и воспроизводимость анализа (коэффициент вариации 3.0&).

6. Показана диагностическая ценность ИФА при различных формах кандидоза, смешанных инфекциях бактериально-грибкового генеза, а также у лиц с повышенным риском в отношении кандидоинфекции.

7. Эффективность использования реакции ВИЭФ и ИФА в лабораторной диагностике кандидоза одинакова и обусловлена, прежде всего, высокими показателями специфичности первой и чувствительности второго.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Хроматография антигенно-активного комплекса грибов рода Кандида// .(роматография в биологии и медицине: Тезисы докладов

I Всесоюзной конференции.-Москва, 1983.-С.112 (соавт.Бабенко Г.Л., Кграев 3.0.).

2. Гликолрптеидные антигенные препараты из дрожжоподобных грибов родг Кандида// Результаты и перспективы научных исследований микробных полисахаридов: Тезисы докладов II Всесоюзной конфпре-щии.-Ленинград, 1984.-С.146 (соавт.Бабенко Г.Л., Федорова И.З., Зуева Е.В., Мизонов В.Н.).

Т. Метод встречного иммуноэлектрофореза в диагностике кандидоз-ной инфекции// Лабораторные методы и их применение для диагностики прюфаллергозов, обусловленных аллергенами химической и биологической природы:Тезисьт конференции.-Москва,1986.-С.69-72.

4. Характеристика гуморального иммунного ответа при кандидозе и асперглллезе//Актуальные вопросы медицинской микологии: Тезисы докладов международного симпозиума.-Ленинград,1987.-С.53 (соавт.Мизонов В.Н..Ильина В.Я..Могилевская A.B.).

5. Показатели специфической иммунной перестройки организма как факторы диагностики и прогнозирования течения кандидоза// Актуальные вопросы медицинской микологии: Тезисы докладов международного симпозиума.-Ленинград,1987.-С.43 (соавт.Караев 3.0., Лебедева Т.Н.,Бабенко Г.А. .Соловьева Г.VI.).

6. Разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики специфических антител класса С к с.albicans // Твердофазный гммуноформентный анализ: Сборник трудов Института им.Пастера.-Ленинград, ,1988.-С .174-185 (соавт.Караев 3.0., Чайка H.A.).

7. Иммуьэхимические методы в диагностике кандидоза// Микология и фитопатология.-Ленинград,1988.-Т.22, № I.-С.92-101.