АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КАРТОФЕЛЯ И И РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К FHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT.) DE BARY.

Озерецковская, Ольга Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КАРТОФЕЛЯ И И РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К FHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT.) DE BARY.
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КАРТОФЕЛЯ И И РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К FHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT.) DE BARY."

■'? . АКАДШ1Я. НАУК СССР .

Ордена Ленина Институт биохимии.им.А.Н.Баха

Ф-,

■ \

\ >

На^правах рукописи

" '' ч

I 1

ОЗЕРЕЦКОВСКАЯ СЦъга Леонидовна' . V

' \ , * V '.' '

АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КАРТОФЕЛЯ И ИХ РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К РНГГОШТНОЙА IHFESTABS (HÖHT.)

' ■ > de bart.-(специальность 03,00.04 - биологическая; химия)

Автореферат . '; -

диссертации на соискание ученой степени ,

доктора биологических наук

. ,■ ■ 4 i 1 '

Москва 1975 ,

/С ■ j

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

Ордена Ленина Институт биохимии ни.А.Н.Баха

03ЕРЕЦК0ВСКАЯ Одьга Леонидовна

АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КАРТОФЕЛЯ И ИХ РОЛЬ В устойчивости к fkteophthora infestahs (мокт.)

de bart.

(специальность 03.00.СИ - биологическая хиииа)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

"А*

¡Л -■* * п

На правах рукописи

Клираж;» RJT",^ j;^; т^Л Москва 1975

мшг ' " " "

Работа выполнена в лаборатории иммунитета растений . Ордена Ленина Института биохимии им.А.Н.Баха АН СССР.,.ч

.-; . Научный консультант: " ' '". К

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Л.В.МЕТЛИЩШЙ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор, доктор биологических наук, профессор

Б Л". СТЕПАН ЕНКО М.В.ГСРЛЕНКО З.Й.БЕККЕР "

- Работа направлена на официальный отзыв в лабораторию г иммунитета растений-Главного Ботанического сада АН СССР

защита диссертации состоится " 1973 г^

наэаседании Ученого совета Института биохимии иы.А.Н.Баха АН СССР . , ■■'

Отзывы на автореферат просьба направлять по адресу: . Москва 117071, Ленинский проспект, 53, Ученому секретарю ■'';': совета Института биохимии им".А.Н.Баха кандидату биологических наук Н.Н.Дьячкову. \ 1 '/■;■'.

-„ С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Отделения биологических наук АН СССР.

, ^Автореферат разослан п № 1973 г. -

■ /■

ВВЕДЕНИЕ

Проблема иммунитета принадлежит к числу центральны* биологических проблей* Величайший смысл иммунитета, - писал Ф.Бернет (1964)» - состоит не только в защите организма от 1 инфекционных болезней, но и в поддержании его структурной и функциональной целостности. С фитоимцунитеток к тому же связана защита биосферы от загрязнений, и5о чем устойчивее рас- , теще, тем меньше требуется пестицидов для его обработки и» ' следовательно, меньше угроза возникновения различного рода нарушений в биоценозах со всеми вытекающими отсюда отрицательными последствиями.

К настоящему времени всеобщее признание получило учение .

. Н.И.Йавилова Д-1935) 05 иммунитете растений к инфекционным болезням* согласно которому устойчивость основана на многих защитных реакциях, возникающих в растении в ответ на контакт с паразитом или его метаболитами. Разносторонними исследованиями, обобщенными в большом числе обзоров и монографий, показано» что к числу таких реакций относятся образование на пути инфекции механических барьеров* лишение паразита необходимых факторов роста, активация систем энергоснабжения клетки, образование токсических для паразита веществ, инактивация его., экзоферыенгов и токсинов.и;т.д. (Беккер, 1963 ; ВердеревскиВ, 1968; Горленко,1962; Дунин, 1946; Лйпсиц, 1972; Метлицкий, 1970; Рубин, Арциховская, 1968; Сухоруков, 1952; Федотова, 1946; Crulokahank, 1963J GSumann, I95£j Far leas, Kiraly,I962) КиЙ, 1968; l^r, 1965; Mailer, 1959; Van der Plank, 1968J Shaw, 1963; Stahmann, 1964; Toraiyama, 1970; Urltani, I9713 Wood, 1967). , ' „ \ ■

.За последние годы накапливается все больше данных :ô важ-/; ной роли в явлении фитоиммунитета антибиотических веществ» которые» согласно современным представлениям, рассматриваются как специфические продукты жизнедеятельности организмов, . обладающие высокой физиологической активностью по отношению : к определенным группах организмов или к злокачественным опухолям, задергивающие их рост или полностью подавляющие развитие' (Егоров, 1969)•

■ К числу первых экспериментальных работ» показавших защитную роль антибиотических веществ в устойчивости растений к $>и-топатогенным микроорганизмам, относятся исследования А.И. Опарина и О.И. Купленской /1936/.

Основополагающими работами в этой области явились исследо вания Б .П. Токина о фитонцидах /1933,1942,1948,196.?/, получившие дальнейшее развитие в работах Д.Д. Вердеревского /195?, :■■':■' 1959, 1968/. '

Важным этапом в изучении биохимической природы фитоиммунитета явились исследования К.Мюллера ( Möller, Börger, 19^0 ; Mailer, 1958,1959,1966,1969) о фитоалексинах (ФА), под ко-', торыки имеются в виду антибиотические вещества, практически отсутствующие в интактшх растительных тканях и возникающие , в ответ на инфицирование. - v

К моменту начала настоящей работы были идентифицированы;, шесть фА»~ло одному в шести видах растений: ипомеаиарон в батате, орхинол в орхидее, пизатин в горохе, фазеоллин в фасо- ; ли», трифолиразин в клевере, изокумарин в моркови. Мало изучений» однако» оставалась их роль в иммунитете растений и особенно в устойчивости к тем паразитам, которые в ходе сопряженной эволюции сумели преодолеть несцецифичесвий иммунитет и стать специфическими для данного вида растения. А между ' тем именно эти паразиты являются основными источниками потерь культурных растений» на борьбу с которыми затрачивается подавляющая часть средств, выделяемых на защиту урожая.

Исследование этого центрального вопроса фитоиммунитета > наиболее успешно моют быть проведено на растениях, у которых' изучены генетические основы устойчивости к специфическим па- 2 -

'тогенам. Последнее в значительной мере определило наш выбор в качестве объектов исследования картофель и его наиболее опас-' î Ный специфический паразит Pbytopbtkora iafestans CMoat.) de Вагу ' , уносящий в годы эпифитотий до 50% урожая картофеля • (Дорожник, 1955; Попкова, 1972). _ ;

Известно, что устойчивость картофеля к возбудителю фитофтор оз а контролируется двумя типами генов: монофакториально с помощью доминантных r-генов и полигенной системой, вклкмаю- ' щей большое количество рецессивных генов. Генетическим,выра-- жениеммонофакториальной устойчивости является предложенная Флорой { йог * 195^, 1956) система "ген на ген"» в основе которой лежит положение о той, что число генов устойчивости растения соответствует числу генов вирулентности патогена. Между- ч народная система обозначения рас и генов, контролирующих устойчивость картофеля к Ph. lofestans, была предложена в 1953 ГОДУ (Black, Maateabroeok, Mills, Peterscm, 1953). -V Система R-генов ответственна за возникновение реакции

сверхчувствительности, внешний проявлением которой служат об-г 4 раэоваше защитного некроза. Хотя реакция сверхчувствительности широко распространена в растительном мире, до настоящего/ времени остается неясным» что же является непосредственной . причиной ингибироваиия развития паразита в ненротизированных тканях.

В свете сказанного задачей настоящего исследования являлось:

1. Изучение состава антибиотических веществ картофеля:как конституционных, - содержащихся в интактных тканях, - так и индуцированных, - возникающих в ответ на инфицирование.

2. Изучение роли конституционных и индуцированных антибиотических веществ в устойчивости, контролируемой R-генаии, разных сортов картофеля к рь. infestais.

3. Изучение механизма действия антибиотических веществ в связи с их участием в явлении несовместимости картофеля и возбудителя фитофтороза.

Изучение возможностей индуцирования антибиотических веществ с помощью различных химических соединений и ыетаболи-

тов паразита, а также интенсификации процесса их образования 'I; путей регулирования условий внешней среды. V Л. 4■ ^-)'■ •>'.■ Ууу^у ; д'■' В экспериментальных исследованиях, проводившихся с 1963 -• .;

:по■1972'годы. принимали участие Н.И.Васюкова, Ы.А.Давыдова, :..;:•' ^ О.Н.Савельева, Г.И.Чалешсо и Л.И.Чалова.; ,

: V Некоторые работы выполнялись в комплексе с лабораториями -:,

и'1 ряда других институтов и кафедр»с тем чтобы иметь возможность , рассмотреть -полученные данные в различных аспектах исследуо- ■-■■

мой проблемы (Институт химии природных.соединений им.И.М.Шемят Ч - Д " / . кина АН СССР, кафедра низших растений и кафедра высших рас- ''.

тений биолого-почвенного факультета ИРУ, Белорусский Институт , уД' картофелеводства, плодоводства и овощеводства, кафедра высоко-. «' :молекулярных соединений химического факультета Иркутского Го' сударствеиного Университета, Институт органической химии ■ . , Восточно-Сибирского филиала АН СССР, Всесоюзный научно-иссле-* Л дозательекий Институт консервной и овощесушильной проиышленно- . . сти). '■■../ .-.■..

' ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

•" / Объектами исследования служили клубни и листья 20 сортов ■V;" картофеля, различающихся по степени устойчивости': у Большая часть исследований проведена на клубнях картофеля, что позволяло вести эксперимент дочти в течение круглого года, Клуб? ни хранили при температуре 3-4°С и относительной влажности воз- . духа 90-95$. Листья срезали со средней части куста вегетирую- . У цих растений до 'начала их цветения. ■..-"-'",

ЧУ: ■ Монозоосиоровые'изоляты различных рас рь. ■ 1п£евгапз : были )' получены:из лаборатории иммунитета'Белорусского научно-иоследо- ' ; вательского Института картофелеводства, плодововодства и ово-. V": щеводства, а также с кафедры низших растений биолого-почвен- - V нога факультета ИГУ. Культивирование осуществляли на овеяно-агаровой среде, по мере потери агрессивности гриба культуры •

, V;-/. обновляли. Л" . .'г-'

Свежесрезанные ломтики клубней картофеля инфицировали -. суспензией зооспор гриба (при плотности' исходных эооспорангиев " ;

6.3-6.5 хЮ^/выходе зооспор 70-80^). Поскольку устойчивость клубней картофеля не всегда соответствует устойчивости его \ листьев (Попкова и др.« 1972), в каждом опыте оценивали резуль-'. таты,заражения клубней, которые затем сопоставляли с данными биохимических определений. Поэтому приводимый в работе характер ответной реакции на заражение клубней является результатом проведенного испытания, а не механического перенесения генотипа листьев на клубни.

Так как одной из особенностей растительного Организма в отличие от животного является сравнительно высокая автономия органов* с чем связано локальное проявление защитных реакций* в определениях использовали различные ткани клубня. Это, в свою очередь, потребовало проведения ряда анатомических исследований интактных и поврежденных клубней картофеля (Озерецков-ская и др.* 1969*1971,1972,}, что позволило следующим образом дифференцировать ткани длп„экспериментальных исследований:

, I. Естественная перидерма - наружний слой ткани интакт-ного клубня, содержащий суберинизирозанные клетки феллемы, феллоген и феллодерму* а также 1-2 ряда прилежащих клеток коры.

2. Субперидермальная ткань - слой толщиной в I мм* состоящий из клеток первичной коры и части клеток наружной фле»-мы* который снимали с поверхности интактного клубня с удаленной естественной перидермой. -

^ 3. Раневап перидерма - ткань с поверхности разрезанного, во ье инфицированного ломтик^, содержащая опробковевшие клетки феллемы, а также феллоген и часть клеток феллодермы.

4. Приракеван - слой ткани* толщиной в I мм, расположенный под раневой перидермой.

5. Некротизированная - потемневшая ткань, образующаяся на поверхности ломтика клубня* инфицированного несовместимой расой гриба.

6. Принекротизированная - внешне здоровый слой ткани* . толщиной в I ми, расположенный под некротизированньш. -

7. Зараженная - загнившая ткань, образующаяся'на поверхности ломтика клубня* инфицированного совместимой расой гриба

8. Призараженная - внешне здоровый слой ткани, толщиной в I ш, находящийся под зараженным. \

9. Интактная - слой ткани (I им) . срезанный в направлении/ перпендикулярно« оси клубня,с удаленной естественной перидермой. Состоит ка тканей'внутренней и наружной флоэмы, , сердцевины и сосудистых лучков.

■ В этих тканях исследовали'конституционные и индуцированные антибиотические вещества. поскольку по химической природе они принадлежали к различный классах веществ (фенолыше соединения и продукты их окисления, гликоалкалоиды, сескви- . терпеноиды), остановимся прежде всего на методах обнаружения каждого класса соединений и определения их биологической активности. В дальнейшем, в ходе изложения экспериментов, будут освещены также вопросы^ связанные с разработкой и модификацией некоторых дополнительных методов, используемых в работе.

^ Фенольные соединения

Экстрагирование из тканей осуществляли трехкратно 80% кипя- ', дим этиловым спиртом в отношении 1 : 10. Разделение содержащихся в экстракте соединений осуществляли на бумажных хрома-то граммах в системе ВУВ (4:10:20)^. Количество хлорогеновой ! и кофейной кислот после элюции с хроматографы определяли на СФ-^» измеряя оптическую плотность (ОП) при 326 нм и 310 нм -соответственно.

• Ферментативные препараты, обладающие о-дифенолоксидаз-ной акхнзносты} (ОДФО), получали из интактных и поврежденных тканей клубня картофеля. Среда для экстракции содержала 0,04'М трис-глициновый;буфер (рН-8,3), глюкозу - 0,69 М, ЭДТА -0,3 х 10"2 Ц, аскорбиновокислый натрий - 0.055 II и цистеан - -0*22 х Ю"2 М. Ткань гомогенизировали в экстрагенте в отно- -шении 1:1, 20 минут центрифугировали при 18 ООО д, надосадоч-

• ■ I

х) Здесь, 'гак асе как я далее в тексте, отношение составных частей растворителей приводятся в объемах.

/ .■. ■' ■. - I

'■■■: - 6 -

а ■'

ayo жидкость фильтровала через Gj-25, собирая.фракции»' содержание белок. После насыщения (WH4)2S0<k осадок-белка отделяли, растворяли в воде, диализовали,до отрицательной реак- г..;' ции на ионы аммония и диофилиэировали. Количество белка в ' .-препаратах определяли микроыетодом Кьельдаля.

ОДФО - активность полученных препаратов контролировали на-СФ-4 по падению ОП, характерной для хлорогеновой и кофейной кислот. Результаты выражали в мк11 превращенного субстрат , та за первые 3 минуты реакции. - .

Окисление хлорогеновой и кофейной кислоты осуществляли в сре- : -де, содержащей 3 кг субстрата, I мг ферментативного препарата в фосфатном буфере 0.05М (рН-6,8) в общем объеме 5 мл.

Бенэосульфонкофейную кислоту получали, барботируя кисло-" род в течение б часов в реакционную смесь, содержащую ? uU ■■ кофейной кислоты, 3.3 мЫ бензосулъфиновой кислоты и 200 мг ферментного препарата, приготовленные на 0.01 (¡ фосфатном буфере (рН-6.75). Продукт реакции, экстрагированный подкислен-, ным диэтиловым эфиром, хроматографировали на бумаге в систе- -мах БУВ (3:2:95 и 4íl:5> - нисходящая хроматография. Прояви-;; Отелями служила Jjí спиртовой раствор КОН.и реактив Гепфнера.

Гликоалкалоиды ■ . - 7 .'

Экстракцию и последующее определение гликоалкалоидов. (ГА) осуществляли по методу А.Р.Гусевой с сотр.(1965).

Содержание ГА определяли по развитию цветной окраски с реактивом Ыарквиса на основе цветной реакции Альбертк (А1Ъег-ti • 1932). Для количественного определения отдельных веществ экстракт разделяли в тонком слое силикагеля (КСК-2а) с "гипсом в системе этилацетат:лиридин:вода (20:5:2>; обозначившиеся после проявления насыщенным раствором йода в н-гексане вещества элшровали и определяли количественно уже описанный способом.

.Препаративное выделение ГА из ростков картофеля осуществляли после экстракции и последующего разделения на окиси алюминия в соответствии с методом В.А.Пасешниченко и А.Р.Гусевой (1956). . '

- ." Сесквитерпеноиды (фитоалексины) у-

Поскольку мы не располагали данными; относительно хими--ческой природы ФА картофеля, метод^их экстрагирования и определения, изложенные в' настоящем разделе, пришлось заново рая-работать. Экстракцию ткани.осуществляли смесью хлороформ: ме-^ тиловый спирт (2:1). Экстракт разделяли на кетавольную и хло-, реформенную фракцию, последнюю концентрировали*^, перераство- --ряли.в н-гексане и использовали для разделения в тонком;слое. силикагеля. - .

, Для препаративного разделения веществ на колонках из силикагеля применяли более сложную схему экстракции. Сконцентрированный хлороформениый экстракт обрабатывали ацетоном. Последний упаривали и перерастворяли в 80% этиловом спирте,-а,--затем после концентрирования - в н-гексане в отношении 1:5 (н-гексан: исходное количество сырой ткани), который.« использовали для разделения. В ходе процесса экстрагирования осуще-^ .ствляли хроматографияесниК контроль удаляемых фракций. /

'Разделение в тонком слое соединений, входящих в состав ... экстракта>оеуществляли на силикагеле марки Кое1т с; "гипсом в системе хлороформ: ацетон (85:15). Для отделения пигментов, " содержащихся в экстракте листьев, последний рехроматеграфиро-вали-вначале в системе хлороформ: ацетон (90:10),1 а затем, " после эляции веществ дизтиловыы эфиром и повторного наиесения на хроматограмму, в системе хлороформ: метиловый спирт:уксусная кислота (85:12:3). Для проявления чаще всего использовали концентрированную серную кислоту,: ванилин в'соляной кислоте (1% :' раствор) и реактив Эрлиха. "

Разделение на колонках проводили с использованием сшги-нагеля КСЙ-2а (размер частиц юо-гоо меш) , многократно промц-' том концентрированной соляной кислотой. Высушенный силикагель -2 часа прокаливали при 180°С. Для удаления остатков бодцй ; вредных примесей применяли дегидратирующее промывание запол- .

х) Во всех случаях концентрирование экстрактов осуществляли в пленочном испарителе при температуре не выше 40°С.

ненной колонки (Trueblood, Malmberg , 195QK'Фракций, выходящие с колонки, собирали на автоматическом коллекторе, хрома-то графиров ал я в тонком слое силикагеля, однородные фракции объединяли. ■' ■ ' 4

Количественные методы определения ФА: В основу метода : определения рииитика было положено измерение ОП при 500 ом наСФ-4 после взаимодействия с концентрированной серной кис— лотой (красная окраска). Количество любимина определяли, измеряя при 640 нм ОП раствора после взаимодействия вещества с реактивом эрлиха (бирюзовая окраска). Определения ришитинаи любимина в тканях осуществляли после разделения экстракта в тонком слое силикагеля и злюции с хроиатограми веществ с "по-.иощыо диэтилового эфира. В составе диффуэатов эти вещества определяли без предварительного разделения. v

Определение фунгитоксичности

~ Наличие метода измерения фунгитоксичности (ФТ), который позволял бы определить действие веществ в малых концентрациях, было одним из основных условий выполнения настоящей работы. Для этих целей нами был разработан микрометод определения ФТ, основанный на подсчете количества проросших спор а замерах длины образовавшихся гиф грибов, выросших в присутствии испытуемого вещества или экстракта (Оэерецковская и др., 1968). Тест-обёктом служили зооспоры Ph.infestans, а в ряде случаев споры некоторых других паразитарных грибов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Рассмотрим прежде всего полученные нами данные о защитной роли в устойчивости картофеля к возбудители фитофтороза конституционных антибиотических веществ - фенольных соединений и гликоалкалоидов*

• ; . ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ПРОДУКТЫ1 ЮС ОКИСЛЕНИЯ • '

У;; ■Этот: класс соединений уже давно привлекает внимание мно-. * •" гих исследователей (Рубин, Аксенова, 195?;Рагказ,: ~

' . 1962 ; Тош1уата, 1%3 ; СгиЮкаЬапЬ, РеггАп, 1964;ПиЪ1п, Дг- V

^в!Ыютзкауа, Х9б4 ; Ки8, 1964 ; КоЫ1леег,Зап>Ъогвк± , 1967 ; ;.' ^ Немецкий," 1968 ; Ковиве, 1969; Запроыетов, 1970). Тем не ме- " Г. • нее установить прямую корреляцию между содержанием,этих ве-; V ществ в картофеле и его генотипом в связи с устойчивостью к ^ - . ' ;различным расам pь.lllfвзtans до сих пор еще не удалось.

•-. - *Фенольныс соединения, содержащиеся в экстрактах раневой • • V :-' и некрогазированной ткани клубня картофеля, были разделены на- •";' .-.Г-т :: на' на бумажных хроматограммах. Испытание элюатов каждого из.-V-¿Г'

обнаруженных соединений показало, что свойством ФТ обладают . ;: хлорогеновая и кофейная кислоты, которые и служили поэтому • Л..-предметом наших последующих исследований. ' \;

.■..■'. Согласно полученным данным, содержание-обеих кислот за- ; -• метно возрастает в тканях клубня как в ответ на механическое поранение, так и инфицирование несовместимой расой рь. 1п-„V-,■"■ Гез1:апа Л'(Табл.1.) • -у^-у

"Ч-. - " .. ; . Таблица I •":..!

{"■;} •; Содержание хлорогеновой и кофейной кислот в интактных ;

•'. и поврежденных клубнях картофеля сорта Любимец ( к1 ), ; .

■ . . мкг.на I г сырой ткани .■ .^Л"

- ; Ткань Хлорогеновая кислота . Кофейная -Л . - кислота . :

Иитактаая V " "' 30 ' ' . следы .. " У ■'■:

Раневая перидерма - 80 II. 5 ' -ч ' У-

' Прираневая 112 следы."

Некротизнрованная (раса 0] V 49 ' 7.5

; Г: V Принекротизированная 97 -, следы

Зараженная (раса I) 37 . следы -

Приэарахенная 52 следы ■ ■ ■ -'"'У-!

- - 10 - -Л «

■ ■/"Однако даже в поврежденных тканях количество хлорогено-вой и кофейной кислот оказывается во иного раз ниже величины их'ЭДзд* т.е.' концентрации,' необходимой для подавления на-' 5Q/Í) прорастания спор и роста гиф патогена (зооспоры расы CL Ph. Infestaña ):

Хлорогеновая Кофейная

кислота кислота

Прорастание зооспор 1876 «кг/мл • 990 мкг/мл

(53 х I0-í*M) , (55 х I0~*M)

Длина гиф 18^0 мкг/мл 1008 мкг/мл

(52 х I0~4l) , (56х Ю"^)':

Правда, при валовом определении того или иного вещества,. даже в строго определенных тканях, не учитывается его концентрация в отдельных клетках, которая может оказаться' гораздо более высокой. Кроме того, в ходеферментативного окисления фе-нольных соединений могут возникнуть вещества с гораздо более высокой ФТ по сравнению с исходными. Хотя о .такой возможности в литературе часто упоминается (Parkas, Ledlnghan,I959, Williams, 1963; byr, 1962), но в подтверждение не приводятся -данные прямых экспериментов. В связи с этим нами было предпринято, окисление хлорогеновой к кофейной кислот ферментативными препаратами, обладающими ОДФО-активностью, которые были выделены из различных тканей клубня картофеля / Табл. 2 /.

Приведенные данные свидетельствуют, что.ферментативные препараты, выделенные из различных тканей клубня картофеля,отличаются между собой лишь по способности окислять субстрат. \ На это указывают также полученные нами результаты хроматогра-фического разделения продуктов, образующихся в результате ферментативного окисления (Метлицкий, Савельева, Озерецковская и др. 1972).

Таблица 2

Окисление хлорогеновой и кофейяой кислот ферментативными препаратами, выделенными из ннтактной и поврежденных 1 тканей клубня картофеля сорта Любимец

Ткань

Кол-во белка, в препарате, мг на I г сырой ткани

Активность ОДФО, мкЫ на

I г сырой

ткани

I мг

белка

Интактная

Прираневаа

Принекротизированная

Призараженная

Интактиая Прираиевая

'Привевротизированная Прнзараяеннаа

Хлорогеновая кислота *

1,43 0,652 ■ 0,457

3,26 2,011 ' 0,617

2,20 1,150 ■ 0,523

1,58 ^ 0,445 0,290

. Кофейная кислота

1,43 0,715 0,500

3,26 2,132 0,654

2,20 1,456 0,662

1,58 . V. 0,549 ' 0,348

Измерение ФТ продуктов, возникающих в ходе ферментатив-аого окисления хлорогеновой кислоты (после элюции.их с хрома-тограммы), показало,что они лишь незначительно превосходят , токсичность исходного.соединения. Этот факт был подтвержден, мкяв;результатами следующего опыта. Споры гриба присутство- . вали в реакционной среде, где происходило окисление хлороге-; новой кислоты. Через 2 часа их осаждали центрифугированием, 4 промывали и проращивали в воде. Оказалось, что промежуточные;: продукты, образующиеся в процессе окисления, почти не оказали влияния на последующее'прорастание спор (рис.I). Если же споры находились в среде, где происходило окисление кофейнойкис-лоты (в той.же концентрации,), ,то они полностью теряли способность прорастать*

о. н ш .

о «

(ч

О , *

соо

§ 40

о к

№ СО

Си Е5

Хлорогеновая кислота .

Кофейная кислота

/ '2 5

/23

Рис.1. Влияние продуктов, образующихся в процессе окисления хлорогеновой и кофейной кислот, на прорастание конидий гриба. Время инкубирования - 2 часа', "

исходная концентрация кислот - X мг/мл.

В реакционной смеси содержатся: I - ферментный препарат; 2 -субстрат окисления; 3 - ферментный препарат и субстрат окисления. -

Этот факт, а также полученные нами данные, согласно которым токсические продукты образуются на самых первых этапах окисления кофейной кислоты, позволили предположить, что таким соединением является ее о-хинон.

Для того чтобы уловить о-хинон, окисление кофейной кислоты осуществляли в среде, где находилась бензосулъфиновая кислота; яв-Анцаяся "ловушкой" для образующегося о-хжнона.

Реакция протекает в соответфяи со следующим уравнением:

сн=сн-ооон > ^

Ч/

НО

СН=СН-СООН :

ОН

О-хинон кофейной кислоты

Бензосульфонкофейная кислота

• ■'■'; ■ ;. Образующаяся бензосульфонкофейная ^кислота является ста-

бильйым соединением, положение которого на хроыатограыме и ■" - окраска не отличались от соответствующих данных.для'свидетеля. Доказательства того, что обнаруженное соединение'является бен-': : зосульфонкофейной кислотой, были получены Д.И.Стомом с сотрудниками (Стом и др.,1972; ■Ыетлицкий и др., 1972) на основе . определения молекулярного веса, элементарного состава, точки плавления и ИК-спектра вещества. ' Итак, возникающие в ходе ферментативного окисления кофей-, вой кислоты вещества обладают высокой ФТ, благодаря чему могут выполнять защитную роль в устойчивости картофеля к. возбудите-•. лю фитофтороза. Однако проявление их защитного действия в рас-/ ' ^тительных тканях, с нашей точки зрения, ограничено по крайней -х мере двумя обстоятельствами: -

. ч ' I. Низкой концентрацией исходного содержания кофейной/ :'.■■' кислоты, из которой образуется о-хинон. : - .

..''■'■=2. Малым периодом существования о-хикона (около 2 минут).

В связи с этим естественно было ожидать, что б картофеле, ; V'-. наряду.с.хлорогеновой и кофейной кислотами и продуктами их Лферыентивного окисления,' существуют другие антибиотические

вещества, которым принадлежит более существенная роль в его,-' ' 'устойчивости к возбудителю фитофтороза. ■■ ,

• гликоалкалоиды ■■■■-.-.у ;"y

Гликоалкалоиды, представленные в картофеле (Solanum . tuberosum L. ) соланином и чакониноы, в клубне картофеля содержатся преимущественно в составе его перидермы как естественной» так и раневой. По мере формирования раневой перидермы .количество ГА в ней нарастает (табл.3), (Озерецковская и др., 1969). 1■ -

, ■ ' ■ - / д ' .. Таблица 3

Содержание гликоалкалоидов в перидерме клубня картофеля ' сорта Любимец, мкг на I г сырой ткани

Т к а н ъ

ot-Солаиин'

«(-Чаконин

Естественная перидерма Перидермальный слой Раневая перидерца*^

Прираневой слой Раневая перидерма Прираневой слой

,хх)

370 40 < 37 112 75 .130

640 65 35 105 147 230

х) Через 3 дня после поранения, хх) Через 3 месяца после поранения.

Специально проведенные опыты показали» что ГА в основ- *■■ ном локализуются в меристематических тканях феллогена*и фелло-дермы и нескольких рядах клеток прилежащей паренхимы, где их .■. количество в 4-5 раз превосходит содержание в отмерших тканях 1 феллемы. . '

Хотя факт антибиотических свойств ГА известен давно ( Fontaine et ei., 1947,1950; Irving, 1947; Kuba et aI.,1950;, ; Mc Kee, 1959), для того чтобы определить их место в защитных : реакциях картофеля, следовало сопоставить их ФТ с другими ве-ществаыи, обнаруженными в клубне>по единой методике определения. Проведенное нами сравнительное испытание показало, что

\ о<-соланин и с<-чаконин на несколько порядков токсичнее хло-. рогеновой и,кофейной кислот.; Ниже приводятся сравнительные ■ ' : ' w- значения их ЭД^ но отношению к длине гиф раневого паразита - / -' v: : . . картофеля Fusarium solani (Mart.) App. et Wr.:

мкг/мл их Ю

- ot - соланин 1 50 : . 0.5 ■

Л - чаконин 50 0.5 -

Соланидин 940 24

Хлорогеновая кислота 660 19

Кофейная кислота 440 23

- - ':',;'■■'■ Наоборот агликон «¿-соланина и et-чаконина - соланидин Ц-'■■■■.. обладал относительно слабой ФТ и в этой отношении мало отли- ; \ чался от хлорогеьовой и кофейной, кислот.

В тех концентрациях, в которых Га находятся в составе ; ■■<■'■'. перидермы клубня картофеля, эти соединения представляют собой L токсический барьер для проникновения рида фитоцатогенных гри-' ■ . . бов. По мнению Аллена и Кача ( Allen, КиЗ, 1964,1968; Allen, : ■ ; 1970),-о(-соланин и ot-чаконин примерно на 90$ определяют ток-.сические свойства естественной перидермы клубня картофеля.

! Интенсификации образования перидермы и содержащихся в ней " ;•• ГА»-предохраняющая клубни картофеля от.проникновения/раневых -• ' паразитов из рода Fusarium » составляет один из биохимических . • ■ , > принципов метода активного вентилирования, широко используйте- .'.. гося в настоящее время длп хранения картофеля (Озерецковская, • 1965; КетлицкиИ,- Озерецковская,.1966; Озерецковская, Чаленко, . . 1969). Приведем лишь некоторые данные, характеризующие интен- ' L Л-

■: ■.. сификацию образования ГА в раьевой и естественной перидерме . ';;:'■'■ клубня.под влиянием активного вентилирования (табл.4). V'.li

Таблица; 4

Влияние активного вентилирования на:содержание ГА в перидерме клубня картофеля сорта Дорх, мгк/г * сырой ткани '

Ткань Естественное вентилирование Активное вентилирование

¿-соланин «1-чано- «¿-соланин л-чако-

- нин нин

Раневая перидерма 62 128 ■ 101 230 -

Прираневая иг 205 145 287

Естественная перидерма 740 1290 962 1680.

СубперидермалышЙ слой 102 ' 195 173 331

Однако в отношении возбудителя фитофтороза роль ГА оказалась совершенно иной. Согласно полученным данным, в инфицированных тканях картофеля ГА практически отсутствовали, хотя заражению в опыте предшествовало разрезание клубня и, следовательно, имелись основания ожидать их образование в ответ на поранение (рис.г).

300

I 200

. о

с«

100

- /

1 / 3

У? £-

I 2 3 4 5 6 7 Дни Рис. 2. Образование ГА в поврежденных клубнях картофеля сорта Любимец. I - поранение; 2 - инфицирование совместимой расой I; 3 - инфицирование несовместимой расой 0

г.,

■'^■'^i-ч-''.?' ткаки клубня картофеля, инфицированного несовместимой . '. V расой • Ph. infestans , обнаруживались лишь следы ГА» Наобо- "'V " рот г образование г А у клубня, инфицированного совместимой расой," в первый период почти не отличалось от их биосинтеза в ' пораненной ткани,, однако затем их содержание резко упало. Этот период совпадает по времени с массовым развитием гриба, •• . вступающего в стадию сиороношения. Отсюда ;возникло:предполо-л жение, что образующиеся ГА разлагаются Phi. 'infestane

• • ' ' Для того чтобы егчэ проверить, инфицировали совместимойvir:; • расой гриба {раса I) уже залеченную'поверхность клубня карто- ■ v

{Д-'v феля сорта Любимец, в раневой перидерме которого содержалось ' : определенное количество ГА. Через неделю, после того,как гриб , V:;- полностью поразил клубни, в этих же тканях ГА обнаружить не ; -'v^v Ч-; удалось.- В виде следов в них обнаруживался ранее отсутствую-1' ' .■■'■V.:.^

• ;. ций соланидин (Озерецковская и др., 1971). Ниже представлены

.'..'•-"' результаты опыта ыкг/г сырой ткани: ": 'Г -Уу'Ч, ■"■^•уГ

■■ v" ' >V' " "'■ - «(-соланин о(-чаконин " соланидин

- Раневая перидерма 160 ' 250 О". ■ .Чл-Ду'';

Раневая перидерма через 7 " ■ - : - ■ ' 1 " ■

.•• ' дней после инфицирования 0 0 . ...следы ■ : ■■■';

^ . Судя по полученным данным, .можно предположить, что в

О;:- тканях клубня картофеля, .инфицированных несовместимой расой

РЬ. infestons , ГА практически не образуются,' тогда как в сов- • . местимой комбинации они образуются, а затем разлагаются пара-' •/ \

эитом. ' '.;/>;:-

. .По всей вероятности, первым этапом разложения является • . энзиматическое отщепление Сахаров от молекулы гликозида, о . -чем свидетельствуют следы соланидияа, обнаруженные в заразен-

• • 'ной ткани. Этим.одновременно достигается детоксикация ГА, по- •.

: скольку образующийся при этом соланидин обладает относитель- '•:' но малой ФТ. ' . -V-'. ''.■'■''' ■'■■■ - V--'-/;*'

:V;' К аналогичному выводу приходят Ар не сон и Дурбин (Arneson, : Dur Мл, 1966,1967,1968), которые на основе проведенного ис-у.; "V, Д - - следования с листьями томатов и их патогеном septoria ' - - : ■ уч^

" . - 18 - -

Lyoopersici полагаю«» что .присутствующий в ■ томатах ГА то-матин способен предохранить растение только от неспецифических патогенов, тогда.как специфические приобретают способность его детоксицировать. ~ . ■" '■ ■:'■. '

Таким образом, ГА, образующие достаточно надежный барьер по отношению к ряду фитопатогенних микроорганизмов, могут лишь задержать, но не остановить проникновение Ph. infestaos. В связи с этим поиск антибиотических веществ, способных оказать токсическое действие на. данного паразита j нами был продолжен. Его направление определило то обстоятельство» что в некротизированных тканях клубня картофеля образование ГА оказалось резко подавленным. Этот факт не мог бить объяснен разложением образовавшихся ГА под действием -гриба, поскольку его развитие в этих тканях подавлено. Более вероятным представлялось использование предшественников об-/ разования ГА по каким-то иным метаболитическим путям, приводящим к образованию антибиотических веществ» отсутствующих в интактной ткани, то есть фитоалексинов. Дальнейшие экспе- ' рименты-подтвердили это предположение и показали» что ими яв

ляются сесквитерпедоиды. ■

; * \-

СЕСКВИТЕРПЕНОИДЫ ' ' ■ *

Предметом исследования служил экстракт некротизирован-ной ткани, полученный с помощью диэтилового эфира,'поскольку специально проведенное определение показало, что именно- . в его составе сосредотачивается максимальная ФТ.

Для разделения веществ, содержащихся в экстракте» использовали хроматографию на бумаге, -в тонком слое и на колон ках. Был испытан целый ряд систем растворителей (более 30)»" различные марки силикагеля (КСК~2а, КСН, 1,0 и Woelm , ) и различные степени их■активности (Озерецковская и др.»1969; Васюкова, Озерецковская, Ыетлицкий, 1970). В результате мы пришли к ^убеждению, что токсичность-экстракта определяется " .наличием в нем двух соединений, которые были обозначены как , вещества X и У (рис.3).

Рис. 3. Фунгитоксичность элюатов различных зон хрсиатограм-мы в тонком слое силикагеля. В стартовое пятно внесен экст-. ракт;соответствующий А - 400 мг, Б - 200 мг и В - 100 мг сырой '. некротизированной ткани клубня картофеля сорта Любимец. За 100 % принята ФТ элюатов чистого силикягеля. ^ *

Г- Смесь соединений, содержащаяся в составе экстракта>из . '.некротизированной ткани клубня картофеля, была разделена на ■'■■,

'колонках из силикагеля (.марки КСК-2а,'активность I, повтор- í. ; . ; вое рехроматографирование вначале в системе гексан: этилаце-: тат - 85:15, затеи после отделения фракций, содержащих веще., ства х и У, в системе гексан;ацетон - 92:8), Фракции веществ •;

:■;■■;■■■;' X и У, выходящие с колонки, после разделения в ряде систем растворителей и'взаимодействии с большим числом проявителей > • '(Указанных в диссертации) содержали только одно соединение. "V Оба вещества, отсутствовали в интактных тканях клубня ' V картофеля- - в пределах чувствительности методов определения. - только в виде следов обнаруживались в составе ране- . ,v вой перидермы и в основном сосредотачиваются в некротизиро- . Гг,'.- - ванной ткани клубня (табл.5). л

>, Таблица 5

Содержание ГА в интактных и'поврежденных тканях клубня. картофеля сорта Любимец ( Rj)» мкг на ! г сырой ткани i

Ткань

Вещество X

Вещество У

Поврежденная

Некротизированная (раса 0) Принекротизированная Зараженная (раса I) Призараженная Раневая перидерма

Интактная

Естественная перидерма Интактная паренхима

105 27 24 . 10 следи

О О

97 36 23 15 . следы'

о о

В мицелии и зооспорах различных рас Ph. infoateas, вы-, ращенной на синтетической, овеяной, картофельной средах и ломтиках картофеля, так же как в составе культуралькой среды после роста гриба и бесклеточной жидкости, полученной после проращивания его зооспор, веществ X и У обнаружить не удавалось. V

Представляло интерес, проникают ли эти соединения в инфекционную калл», нанесенную на поверхность картофеля, что является характерной особенностью для многих ФА (Cruiokshank, I966;Higgln8, Millar, 1968; Dererall, 1967).

Предложенный для этих целей метод капельных диффузатов, разработанный Мюллером (miller, 1956) для плодов бобовых растений, не мог быть применен к клубню картофеля, поскольку инфекционные капли, нанесенные на поверхность свежего среза клубня, смешивались с содержимым пораненных клеток, растекались и впитывались. -Разработанная нами техника "инфекционных лунок"поэволила:этого избежать (Ыетлицкий, Озерецковская а др;, 1971).

• Для этого на поверхности свежего среза клубня картофе-'- '• ' '' ля специальным ножои вцрезаки полусферические лунки.Клубнй .с вырезанными лунками в течение суток инкубировали во влая- ' ^ '"у. /ной камере, а затеи заполняли суспензией зооспор1 патогена. ; • ' 'За сутки на поверхности лунок образовывался слой суберина, . V/ который препятствовал-впитыванию капли, но не мешал диффузии веществ из ткани в жидкость, которая поэтому называлась • "диффузатом". К тому же стандартные лунки на поверхности . . ч.'.: среза клубня сохраняла .постоянное отношение' объема инфек- • ционной жидкости и поверхности ткани, на которой она нахо-; дилась, что представлялось существенным для количественных • определений. ■■ ''V;. ■'■ ".-./

: аа рисунке Ц- приводятся результаты разделения-в тонком ; слое силикагеля гексановых экстрактов диффузатов и соотвег- ' . . .'.'. V. ствующего экстракта некротизированной ткани, образующейся"; ; :

; на ■ дне: лунки в ответ на инфицирование несовместимой расой ; у^ТЬ. ±в£еаио1в9 из'которой 'и'происходит диффузия веществ, в - жидкость. Оказалось, что из числа 15-20 соединений, присут- "■"*., ствующих в экстракте ткани,' в состав капли преимущественно • ' '^поступают только вещества X и У, то есть именно те два соединения, которые обладают ФТ*'. В составе контрольных диф- • ?' ' • . фуэатов» не содержащих зооспор патогена, веществ X и У об- -/ наружить не удавалось. "■■'.' :

V' ' Присутствие этих соединений-было обнаружено нами в диф-' фуэатах не только клубней, но и листьев картофеля (Метлиц-кий, Оэерецковская и др., 1970). > - : ;

: Таким образом, особенности, характерные для соедине-

ний X я У, а именно: фунгитоксичность, отсутствие у возбу-;> дителя и в интактных тканях картофеля, образование в.ответ ' аа инфицирование, способность выделяться в инфекционную ' каплю,.а также участие в устойчивости картофеля, - о-чем

".'•. х) Некоторые аз соединений, присутствующих в некрозе, удает- • ; ^: :: ся обнаружить на хроматограммах, если увеличить концент- - ^ -:Г рацию экстракта диффузата, внесенного в стартовое пятно.

'ШД-ч-г■ ..г 22-; ,

Вещество У

Вещество X * Чаем

Рис. 4. Схема.хроматографического разделения в тонком слое силикагеля экстрактов некротизированяой ткани/А / и диффуза-тов А/. Клубни картофеля сорта Темп, инфицированные расой 0.

речь пойдет ниже» - позволяют определить иг как свойствен- : ные картофелю ФА. Все это ставило нас перед необходимостью химической идентификации этих соединений. : ,1 '

Химическая идентификация

В начале нашей работы сырьем для накопления веществ X и У служила некротизированная ткань, поскольку именно в ней эти вещества локализованы, это оказалось трудной задачей, < поскольку экстракт некроза содержал слояну» смесь соединений.

Выходом из положения явилась разработанная техника диф-фузатов, в которых преимущественно содержались только вещества X и У. Было получено 50 литров диффузатов. Последние экстрагировали н-гексаном (1:1), экстракт концентрировали и ; разделяли на колонках из силикагеля при использовании систе- < ыы гексан:ацетон (92:8).

Ш 48 96

' • Вещество X: Согласно данным -ИК^спектра*-' ;' (рис."5)■ веще-. ствоХ содержит следующие структурные единицы:■ ги дрок сил ь-,/^ V:: иую^группу"(полоса поглощения - 3410 си"".1)! концевую мети- .'■•' У^/лекову» группу (890,1640,3085 см-1). Результаты "масс-спект-Г-"ра*"*^ свидетельствуют,' что молекулярный^вес вещества состав-: ' ляет 222 (рис.6а). Последовательный двукратный выброс' 18'

массовых единиц, свидетельствует о наличии двух гидроксиль- ■'. • , ных групп в молекуле. . ' ■'■">'■'

' : , к моменту завершения нами этой.части эксперимента, появилось сообщение; Томияиа (Тош1у&юа, ТаЫгака ег а!.Д968 > топ1уата, закшиавгаэ-,, 1968)/ обнаружившего_в\ некротизи- . ■'\-'/ рованной;ткани-клубня картофеля сорта Ришири норсесквитер-

' пеноидкый диол, названный рииштином. Поскольку вещество X „■' ' имело тот же молекулярный вес и функциональные группы, что ' /'-. и ривитин, а также обладало рядом других сходных показате-;лвй (экстракция,■проявление^ биологическая активность);воэ-* никло предположение о тождественности этих соединений.' ' ' . Для того чтобы сопоставить эти показатели, получали~ди~ V- у* 3.б-динитробеязоилпроизводнов вещества X' при его взаимо- . действии'с 3,5-динитрохлористым бензоилом {Чалова, Васюко- . ва, Озерецковская, Метлицкий, 1971). ' ' .,

1 .Точка плавления полученного производного (17Х°С), так. же как и его ИК-спектр совпали с соответствующими данными' \ длярЗ,5-динитробензоата риыи-

. тина (Зя1:о, Тот1уята е* а1.,

1968). Полученные данные дают -основание полагать, что обна-' '■"■)■ ружейное нами. в. некротизирот '' . ванных тканях картофеля вещество X является ришитином.г, .

'- Г'1*

. .х) ИК-спектры обоих веществ снимали на приборе РНэг20 в .,' ; ; . алеякв, полученной испарением раствора в ссв4.'. .' - . хх) Ыасс-спектры были сняты на приборе ЫХ-1303, снабженном системой ввода образца в ионный источник при энергии ' . ионизации 62 ет и Т-120°С для.вещества X и 70 су и

для вещества У.

« 60 я

аа •

1 40

•

а го

/ ■л-' 1 - ,> ■ : '.v • < (

• ' 1 - \ с ё- г1

1 • / "'1 ' \ V [ / Г 1 ■■

1 и и ■ .1 ■г ъ V V V

3600

3200 2900 1800 1400. ' 1000 Рис. £ ИК-спектр ришитвна У вещество'X /.' ■ " \ '

5. V

5.0

í -

Г4 Й

(5 3 IV : А Л

< ( м . 1** п*

1 т / ¡т /и

Л 1 1.1 || | | Й к! |„ II, ||| м и К- г /

—1—;— |

! б

л «1 >9 ■ | У

11 ¡35 п } л 4

игр ■ \Ш 1 я > М -ч

III 1 1111 и Н ) 1II ьл и! Ци. ,,1 1II ¡1 ¿1 1, ч

50 100 ' 150 . 200 250 т/е

Рис. б. : Масс-спектр ришитина /а/ и любнмина /б/.

100

£ 50

.г

о си

N — 1 1

V 1 , V —Г 1Л ¥

1 л 1

3300 " • 2500 • ; 1700 - 900 . «-,л Рис.^. ИК-спектр любим и на.

се

.-i

. . - V

'.7 ч'С

I '■<:. Вещество У: Еще до установления химической природы веще-•. ства У мы назвали его любимином, поскольку впервые,обнаружи-ли в тканях картофеля сорта Любимец (Озерецковская и др., 1969).- ■ . ( ■. ; ,■ *'■■■■

'•/,'•.' Дальнейшие наши исследования (Метлицкий, Оэерецковская, , Вульфсон, Чалова, 197Х) показали, что любимин представляет . собой светлое масло, оптически активное. Величина его уд ель, . .ного вращения + 27 (о 0.62, этанол). По данным элемен- , тарного анализа любимин содержит 75.62% С и 10.30% Н, что отвечает суммарной формуле О^й^О^* для которой вычислено ¡г76.2655 С и 10.1756 Н. Согласно данным масс-спектра (рис.66) :: молекулярный вес любимина равняется 236. Картина низкомолеку-

V лярной области его масс-спектра сходна с такой для ришитина, что свидетельствует о генетической родственности их строения.

"г; : /\ Согласно данным ИК-спектра (рис.7) в молекуле любимина ~ ^■находится гидроксильная группа (3410 см~*), ненасыщенная -

связь (3085,1640 и 890 см"*), карбонильная группа (1715 и / ;; У ; .2740 см"1-). Последняя» по всей вероятности, является альде- ■

гидной, о чем свидетельствует полоса поглощения при 2740 см"?., ' , Наличие в молекуле любимина только одной гидроксильной. V *

^группы помимо данных масс-спектра доказывается также олреде-лением':числа активных водородных атомов (найдено 1.04 актив- . • ных атомов водорода), а также получением ацетильного проиэ->водного любимина. Молекулярный вес последнего, измеренный масс-л ^спектрометрически, равнялся 279, что может.быть объяснено ; , -.V ацетилировакием только одной гидроксильной группы, поскольку ; данные ИК-спект& свидетельствовали, что ацетилирование про- ■;'■■,/■ ,, шло полностью. . \

,;*/. Наличие одной гидроксильной группы в составе молекулы , ^любимина доказывается также масс-спектром его дейтероааало- . ^У-га (молекулярный вес 237), что указывает на замещение дейте-■ рием водорода лишь одной гидроксильной группы.

• " Для подтверждения присутствия карбонильной группы в ч составе любимина был получен его 2,.4-динитрофенилгидразон^ ; % {молекулярный вес которого (4X6) соответствует теоретическо- ~

V му. -' . . ' ■ : .

г.-?':'.

• . 0'наличии в молекуле любимина ненасыщенных связей сви- "

/ • детельствует его способность обесцвечивать бромную воду* : ^ >. .'■'■ , Определение водного числа показало» что в молекуле любими-^ V ; на имеется одна двойная связь. Вычислено (для молекулы с м©-* ~ лекулярным весом 236) йодное число 107.6, найдено экспери- ' ментально-113,19. .'//'.-'.il-.../.-.;'. ■ . ■ ï;'''

г" Согласно данным японских авторов ( Juteul et «1Д968).

■ : иэоаропенильная группа в молекуле ришитина обусловливает •jr> : ^ : поглощение при 1640 и 890 см"1. Соответствующие полосы имв-'- *

V V ются и в молекуле любимина, что свидетельствует о присутст-

1 - вии двойной связи в боковой цепи,' а не в цикле. Это подтвер*- . -дается данными ЯМР-спектрах); (рис.8). Сигнал при & -4.65 • (2Н» синглет уширенный) обусловлен протонами концевой мети- . ..1

V .-.Y-- лёновой группировки (CHgs ), а сигнал при 6.-1.68 (ЗН, . .•

_ синглет) - протонами метильной группы, связанными с углеро-" дом при двойной связи. Таким , образом, .эта сигналы свидетель- : % ствуют о наличии в молекуле любимина изопропенильыой группы ■■<.;.-.-"у

Х// ШР-спектр любимина бил снят на приборе varia» -100 ; ^ Yy в четыреххлористом углероде. 4 \ ^ ' ^-.¿v-^.:,-'

' : -27 - .. .. ,л ■

. ;' ( СНд • 2 )» а пик при 0-2.25 (1Н, триплет) о наличии водорода при углероде, связанной с'изопропёнильной группой. Эти данные'совпадают с показаниями ЯМР-'спектра для изопропе-нильной группы ришитина. > •'

; -0 присутствии в молекуле метальной группы,' связанной с "-/ ' /третичным углеродным атомом, свидетельствует сигнал при 6- . ,.0.96 (ЗН, дублет). Расположение ее в положении С^- подтверж-; ■ дается сравнением с. аналогичным сигналом для метальной - .'; ; ' группы ришитина, а также согласуется с правилами иэопреноид- ' 4 ного биогенеза. г* ,'-■; .■,■■■.; V „./."

^ Присутствие альдегидной группы в молекуле любимина под-,

тверждается наличием в НИР-спектре сигнала,при 6 -9.9 (ХН, дублет)» обусловленной? водородом альдегидной группы, а .также - при 8 -2.2 ЦН, триплет) за счет водорода?углерода, связанно- V -го с альдегидной группой. V: „' .-

: :: Мало вероятно» чтобы альдегидная группа оказалась ангу-

' лярной, скорее она связана с углеродом, содержащим протон» ; в противном случае при 8 -9.9 должен был бы быть только , -■ч-'■".. один пик. Расположение.альдегидной группы при Цд обусловлено ; '.-Ч .данными спектра ЯМР высокого разрешения на основании того,что '

триплет может возникнуть только при взаимодействии протона >■ при С^ с водородами одной соседней С ^-группы. Кроме того» при наложении на область формильной группы двойного магнит. ного резонанса имеет место изменение сигнала» подтверждающе- ■■ , - го такое расположение. г

" Вместе ..'с тем положение альдегидной группы при С^ не под-- .у-■ чикяется правилам изопреАдного биогенеза» поэтому возмож- V - . '*'; '• ность ее присутствия при Сд все же нельзя исключить. ■. ■ : \ ' Данные ЯМР-спектра подтверждают все сказанное выше от-

, ; • восительно гидроксильной группы в молекуле любимина. Сигнал -

при 8 -3.65 (1Н» синглет)^связан с протоном гидроксильной V группы, а при 8 -3.50 (1В, мультиплет) с протоном при угле-: ' . роде, к которому присоединена эта вторичная гидроксильная группа. Положение гидроксильной группы при С^ определяется тем, что сигнал при 8 -3.50 представляет собой сложный.СИМ7 -

метричный мультиплет,, что указывает на положение ОН группы . -между; двумя СН^'-группами.; ЯМР-спектр лгбвмина, снятый в ; V условиях более высокой температуры и присутствии пиридина • V .. вместо четыреххлористого углерода,^обнаружил разложение это- Ч ; го мультиплета на- две идентичные группыпиков,1 что лишний\ -раз подтверждает положение гидрэксила при Сд. 1 ' •

сон.

/ • На .основе полученных данных .была предложена следующая ч наиболее вероятная формула ; ..любимина.-.. ■;"- ;\у;'. . Ч-Ч '..: Таким образом, и ришитин, • • : V .и любимин являются бицикличес-. - кими сесквитерпеноидами, обра-;;.: . зование которых в растении : можно представить в-результате циклизации фарнезилпирофосфата по типу эудесмана: '■IV-' V ■

сяз

Люб и м и н"

I: п^Жо^ оудесман <

Любимин .' V

' V - Чг ; Для превращения эудесмана. в ришитин должно произойти 0 . ' отщепление метильной группы при Сд, в результате чего проис- • . - ; ' ходит образование норсесквитерпена.^ Введение-.гидроксильних; . ¡ ' групп в цикл, очевидно, происходит в результате каких-то .: V

дополнительных процессов. Доказательством того, что ришитин образуется именно таким путей, является факт,' что ти^дегид-рогенйзации над селеном он образует производное эудёемайа ( JCatsui et.al.i96Q). .

■ Образование любимина укладывается в циклизацию фарнезид-пирофосфата по тицу эудесмана только в том случае, если допустить, что метильная группа из ангулярного положения должна мигрировать -в положение при Cg'с последующим окислением. Миграция такого рода является необходимым этаиом при образо-4 вании капсидиола - ФА перца ( Stoeasl et al. ¿972).

Участие ришитина и любимина в явлении сортовой устойчивости картофеля к Ph, mfeetana.

Вопрос об участии ФА в сортовой устойчивости растений "является наиболее дискуссионным. Часть исследователей сило-" няется к мнению, что ФА играют существенную роль лишь в неспецифическом иммунитете растений,- тогда как вопрос о их роли в сортовой устойчивости значительно менее ясен. .

С Crulckshaak, Рerrin, . 1965; Nisbimura, 1964; Gray, Klarman 1967; Littlefield, 1967; Llm et al., 1968,1970; Deverall •t al,, 1967). Именно поэтому в настоящей работе ему уделяется особое внимание.

Исследование содержания ришитина и любимина в составе диффузатов и тканей клубня картофеля 20 сортов позволило установить следующее:

Г. Интенсивность образования защитного некроза всегда .прямо коррелировала с содержанием в его составе ФА.

, 2. В зависимости от характера образующегося некроза количество ришитина и любимина в нем колебалось от 90 до 170 мкг на г сырой ткани (каждого вещества в отдельности), что значительно превышает установленную нами величину их ЭД50 (40-60 мкг/мл). -

3, В совместимых комбинациях хозяина и паразита риш-, тин и любимин или сов'сем не образовывались,, или обнаруживались В малых количествах (до 25 мкг/г сырой ткани).

; Для'; и од тв еряде ниясказанного приведен ; ¿еко торые данные <-(табл.б)V:свидетельствующие о той, что в несовместимой'ком- -:бинации всегда, образуется -значительно больше рииитина: и-лют-" бимина,: чем в комбинации совместимой (при оценке результатов . следует иметь.в виду, :;что'.количество'ФА» выделившихся"в дифт фузаг, составляет примерно треть от их концентрации в некро-тазированных тканях). ' ' ' •- "''■.-.'': : ' ■ • v/

• /ч^-'"'^ 7* о: Таблица б

.V;' .' Количество ^ ришитина и люоимина, выделяющихся в диффу- .

зати*}, в ответ на инфицирование клубней картофеля V*- \ : ; ; РЬу&рЫЬ'ога ;infв8tíLns, мкг/мл V : '.-г-;

.л V.,—' ■;

Сорт ¡Генотип по листьям Раса Состояние лунок (2-й день) Риши- . тин^..; Люби- : МИН

Уральский'.-'V. ■'■ ..В3В4 н+++хх/ 49 ч 41 .

1.2.3.4 ~ 2,2, 4

Красноуфимский' ' в2*3 ' ' о • й Н+++ : 47 66

'-.*'■ " ■:■"■.';;■■';'■' * 1.2.3.4 -2,4 ■ 3 ':■-■■

Эпока- ■■ Е3Е4 '" н+++ 63 51

1.2.3.4 3,3 3 ".'

Столовый-19 " ч 0 ' Н++ 44 ■: 35

с', *■"■- ., .' ■ '..,- 1.2.3.4- : V ' ' :■ .':"■ - ■ 4,з^: 5

Веселовский; . 0 Н+ Г1'.'.':. 23 ^ 33

'/■'■'■ -■'■-. V. 1.2.3.4 •.^ V- 3,7 2

Лава V ' 0 ' ' Н+++ V 52 •,, 45

-■;;. '■„■;■;'■ ■ 1.2.3.4 Н* 10 5

Вулкан • 0 Н+++ — . 42 "" 50

1.2.3.4 ' . . 7 6 ;;

Камераз: '■■.;;.■. ; н++ .;■ .23 .40 •

1.2.З!4\ Н+ ' 9 7 -'у-

Олев '; ■ - .'■.'.'■', ■ »о . 0 Н++ '- 25 • ■ 37- '

1.2.3.4 л 3 '

х) Здесь, так ке как в табл;7, суспензию зооспор вносили в'/: свежевырезанные,предварительно незалеченные'лунки'клубня, хх) Н-некроз,+ обозначена интенсивность проявления реакции.'. '

Если в таблице 6 девять сортов картофеля были инфицированы двумя расами гриба, то в следующей таблице 7 два сорта " заражали семью расами паразита. „

Контрольное заражение показало, что клубни сорта Северная Роза совместимы ко всем испытанным расам гриба. 3 соответствии с атим в диффузатах, полученных,в ответ на инфицирование любой расой, обнаружено малое содержание ФА. Клубни сорта Агрономический оказались несовместимы к первым трем расам и совместимыми ко всем остальным. Количество ришитина-и любишша, обнаруженное в ответ на инфицирование несовместимыми расами, 'значительно превосходило их содержание в совместимой комбинации.

Таблица 7

Количество ришитина и любишша в'диффузатах,полученных при инфицировании клубней картофеля различными расами Phjrtophthora Inf estan^MKr/ыл.

Со р т Состояние лунок (2-й день) Раса Риши-тин • Люби-мин

Северная Роза

( г ) 0 5,4 9,1

- 4-' 0,6 6,4

Н+ 2,3,4 8,2 . 9,8

н+ I ' 7,1 10,2

- 1.4 5,1 5,7

- 1,2,3,4 9,0 10,4

.. ■ - 1,2,3,4,5,6 4,2 8,5

Агрономический Н++ 0 42,1 20,3

< HJ Н++ 4 37,1 19,7

Н+++ 2,3,4 44,5 28,9

, - '■ I 2,4 4,8

- 1,4 1,6 5,2

- I»2,3,4 , 5,2 ; 8,2

- 1,2,3,4,5,6 2,6

' ' Корреляция между степенью устойчивости к Ph. Infestans и способностью образовывать ришитин и любимин1былаполучена -нами также на листьях картофеля (Метлицкий, Озерецковская и др., 19?о).

Все изложенное-свидетельствует о том, что образование ришитина и любимина является одним из факторов вертикальной устойчивости картофеля кРЬ.,Infestaña , то есть устойчивости регулируемой R -генами. - : '....*■ Хотя именно вертикальная, устойчивость к возбудителю фитофтороза-является предметом исследования -настоящей рабо- . ты, в последней учитывали:также степень горизонтальной или полигенной устойчивости,' присущей исследуемым сортам. О.био-химической-природе полигенной устойчивости практически еще ничего не известно, поэтому этот вопрос заслуживает само- \ стоятельш^иссяедования. Согласно Ьолученным нами предвари-, тельным данным, полигенная устойчивость в некоторых случаях; коррелировала со способностью картофеля образовывать в ответ на инфицирование любимин. ' ■ .

. Известно, что все виды устойчивости генетически детерминированы; фенотипическое проявление активности гена определяется суммой внешних и внутренних факторов. Это, в свою очередь! означает,-что процессом устойчивости можно управлять. Показано,, что одним из способов "управления является \ уже упоминавшийся' метод активного вентилирования,Согласно : полученным данным^под влиянием вентилирования не только уско ряется,процесс формирования естественных и раневых покровов, препятствующих проникновению раневых паразитов, ;но и .интенсифицируется реакция сверхчувствительности,'проявляющаяся в образовании более интенсивного защитного некроза,' содеркаще-. го значительно большее количество Фк (Озерецковская и др.,: 1971). . '

Биологическая активность и механизм действия : :: ришитина и любимина

; Сесквитерпеновые соединения, представителями которых являются риштин и любимин, являются'грунпоВ биологически

- 33 - . . г.

активных'веществ. . К их числу откосится один из самых мощных ростовых ингибиторов - абсцизиновая кислота, фарнезол а юва-дион, обладающие активность» ювенильных 'гормонов, половой , ; аттрактаит сиренин, ФА - ипомеамарон и капсидиол и многие другие вещества.

Исследования биологической активности риштина и люби-' -миНа были начаты нами с определения степени их ФТ. Величина ЭДзд, определенная в отношении роста гиф рь. езгапз, колебалась от 40 до 60 мкг/мл, полное подавление роста гриба достигалось при 200-230 мкг/мл. Различные расы РЬ.

(0,1,1.4, 1.2.3.4) не различались между собой в отнопекии чувствительности к этим ингибиторам (для примера в таблице 8 приводятся данные по расе 0 и 1.2.3.4).

Таблица 8.

' Влияние риштина и любимина на зооспоры РЬ. 1п£еяЪапз ' -

Ришитин-

МКГ/МЛ¡Мх Ш~4|мкг/мл

Дюбимин

Полное подавление

ишитин

:кг/]МхЮ мл

'Любимин

мкг/МхЮ ыл )

Раса О

Прорастание зооспор

Рост гиф

раса 1.2.3.4

Прорастание зооспор

Рост гиф .

110 ■50

100 60

5,0 2,2

4,5

2,5

50 2,1 220 40 1,7 220

10.0 200 10.0 200

80 3,4 230 10,3 200 45 1,9 230 1 10,3 ' 200

8,5 8,5

Таким образом, общее количество риштина и любимина, обнаруженное нами в.накротизированной ткани клубня картофеля, составляет дозу, летальную.для гриба.

Полученные данные также свидетельствуют о том, что сте-

7;'-7 / " пень устойчивости картофеля к различным pac¿M-Pb. infe'stan3:. ' _ • * ■ - не" св яза на с их разной чувствительностью: к : лмбимину iT риии-. i 7.7 . тину, а зав/сит от способности или неспособности раститель- ч 7 ■■■■ ной 'ткани; продуцировать ФА в- фунгитоксических количествах^ в'... 7 ■ ответ на контакт с теми или иными расами паразита.

. ' - Помимо Ph. infestans оба соединения подавляли также " • * : прорастание спор и рост гиф других паразитарных грибов: например, Fusarium solanl, - Botrytis cinerea ' и Vertió lili-y-;: :; ; um dahliae (величина ад50 составляла около Ю-г,М). Различий

в-чувствительности исследованных грибов:обнаружено не было.• ', ' \v ■ .У-:;; Исследовалось также действие ришитина- и любимина на' 7 ' V, ' ;■ V' процессы делениями "растяжения клеток. .Тестами для этих • -7 ,'.■;. определений служили.удлинение колеоптилей пшеницы и корнеоб-

• разование у черенков фасоли.;'-.. ■'■ ' ■' ■ 7-':"vV

■ I. Любимин в концентрации. IÜO и 200 мкг/мл'ингибировал " ' i' О * ■ удлилнение колеоптилей пшеницы на .55 и 35%, тогда как риши- - • /'

" тин,соответственно, только на Ц- и 33$. Оба весества подавля- --Г>ли как образование корней у фасоли, так и их poctf в длину! ' .ч, ; Способность любимина и риыитина тормозить процессы клеточного деления была продемонстрирована также на примере их ч .-г влияния на образование раневой перидермы клубня картофеля. '7v;7:i .-7 Оба соединения в' концентрации 50 мкг/мл ингибировали 7 .'7 -'■: у S деятельность феллогена, что приводит"к образованию перидерма; Я. , . с широкими вертикальными рядами, глубоким 'залеганием;и малым - . '..-■числом клеточных делений.. При совместном применении обоих 7s :VCv соединений (I0U мкг/мл риаитина 100 мкг/мл любимина) фел-' . . 7 -7'. логен совсем не образуется. Очень возможно, что наличием 7- 7; /у . этих соединении объясняется "отсутствие раневой перидермы в 7 "'тканях некроза, тогда как в-совместимой комбинации хозяина и: ~ : 7.-. - паразита клеточные1 деления удается наблюдать. i 77

■'." '¡."Обнаруженная в ряде случаев более высокая биологическая '•.' 77 .. активность любимина по сравнению с ришитином, возможно, свя- 1 /"' зана; с присутствием в составе-его молекулы реакционной аль- '•• .7 ■ ''.-■■ дегидной группа.. . • ' у'7у.¡, '7 -■ -77'-'- 'S- '■" '■■", ■'■7' 7'-* ■ 74 7;*-г/.*1 Что касается механизма действия ФА, то в литературе этот ; i--'. ■ вопрос пока еще не освещается, - что 'объясняется главным обра-

-Зои, трудностями методического порядка. Нами исследовалась способность ришитина„и любимина подавлять биосинтез нуклеи-, новых кислот и разобщать окисление от фрсфорилирования.

В качестве меченного предшественника использовали аде-'Нии-8-С*\ в присутствии которого в течение 2 часов инкубиро-- вали глазки картофеля. Из глазков выделяли нативный препарат . РНК, из которого осаждали фракцию высокомолекулярной РНК. (добавлением равного объема ЗМ *аС1 ),~в супернатаите, со-■ держащем низкомолекулярну» РНК, и во фракции высокомолеку-, - - лярной РНК измеряли количество нуклиновых кислот и определяли их удельную радиоактивность на газопроточном счетчике.

; Раствор высокомолекулярной РНК фракционировали на ; ультрацентрифуге ( 5р1поо ь ) в течение 12 часов в гради-. енте плотности сахарозы. Получали седиментационную кривую, а'также кривую распределения радиоактивности по фракциям.

■Л- Оказалось, что под действием обоих веществ, в несколь-

ко раз увеяичивамгкоймчество выделенной низко- и высокомолекулярной РНК, что сопровождается падением их удельной активности, особенно заметное во фракции низкоиолекулярной РНК (табл.9).

Таблица 9

Действие ришитина и любимина на зкстрагируемость и удельную радиоактивность РНК меристем клубня картофеля

Вариант Концентра-' Ция, Низкомолекулярная РНК,ДНК,ДНК-РНК Высокомолекулярная РНК

мкг/мл Кол-во, мг удельная актигность< имп/мин/мг КОЛ-ВЦ иг удельная активность, имп/мин/мг

Контроль _ 0,21 4700 0,42' 4160

Любимин 200 1,90 300 1,65 1500

Любиыин 50 1,30 575 ,2.71 1740

Контроль 0,58 2300 0,79 3150

Рншитин 150 0,83 1000 1,66 1930 Ч

Ришитин 50 1,56 625 • 2,82 1400

Вместе-с-тем.определения показали» что оба испытанных• вещества ,не влияют на профиль' седиментации:и кривые' распре-;"-деления'радиоактивности высокомолекулярной РНК. ■ г

Возможно, что повышенный.выход РНК объясняется" свойством риштина И: любимина сорбироваться на поверхности глазков -в'результате чего эти соединения, действуя как детергенты». увеличивают выход-РНН.За счет возрастания количества выделяемой РНК лроисходит разбавление ее метки, что и объясняет падение удельной активности.- ,, , '

В связи с этим был проведен контрольный-опыт, в котором количество РНК измеряли непосредственно ,в тканях, минуя стадию выделения!нативного препарата и исключая тем самым возможность воздействия ришитина и любимина в процессе экстрагирования (табл. Ю). " .

■. Таблица 10

Действие любимина (50 мкг/мл) на "количество и удельную радиоактивность РНК в меристемах клубня картофеля

Вариант' * Количество РНК Удельная активность-

; мг % от контроля имп/мин/мг ( % от контроля

Контроль 0,65 : 100- 2291 : 100

Любимин 0,70 .107 -,.; 1359 59

Согласно полученным,данным, инкубирование в присутст--вии любимина не изменило количества РНК в глазках, но поч- " .ти наполовину подавило включение в.ее состав меченого ■ предшественника. '

■ Дляизучения влияния ФА на сопряженность процессов " окисления и фосфоршшрования, исследованиях влияние на поглощение кислорода митохондриями печени крысы, которые выделяли в соответствии с методом И.М.Мосоловой с сотр^ (1972). " Кислород .определяли полярографически,■используя ячейку конструкции Х.Ф.Шольца и Д.Н.Островского (1965). Испытуемые •

вещества *в водной фазе вносили в ячейку после измерения начального дыхания с сукцинатом (табл.И).

':. Таблица II

Влияние ришитина и любимина на. поглощение кислорода митохондриями печени крысы. ' .

Испытуемое '¡Концентрация, | ?~птппнии ^ Дыхательный вещество . } мкг/мл [ ИИИмроля 5 «°нтроль ,

Контроль v _ 100 3,68

Любимин 50 124 2,58

Любимин 100 162 1,61

Любимин 200 3X4 I

Ришитин 50 273 1,13

"Ришятин 100 360 I

Оказалось, что оба испытанных соединения ускоряют дыхание митохондрий в 1У "состоянии и уменьшают величину дыха-. . тельного контроля. Ингибирующее действие развивается во времени.

Полученные данные свидетельствуют о способности ришитина и любимина уменьшать степень сопряжения дыхания и £юс-форилирования митохондрий, то есть оказывать на них разобщающее действие. Ингибирующее свойство ришитина выражено более четко, чем у любимина, полное снятие контроля дыхания в первом случае .наблюдается уже при концентрации 100 мкг/млл тогда как для любимина этот эффект достигается лишь при 200 мкг/мл.

Индуцирование ришитина и любимина

Уже давно внимание исследователей привлечено к изучению возможности индуцирования иммунитета у растений (Mttller, BArger, 1940; lovrekofich, Parkas, 1965; Weber, Stahmann, 1966). Тем не менее этот вопрос еще далек от своего разрешения,'поскольку до сих пор остается по-существу неясным, что индуцировать и чем индуцировать.

; В связи 'с этим мы провели' сери» опытов по изучению вое-'" можности индуцирования ришитина и любимяяа у картофеля с по-, мощью различных химических веществ* а также метаболитов РЬ. infeзtшlв • (Иетлицкий, Дьяков, Озерецковская и др., 1971). • ' -у у-, Образование ФА: удавалось; вызвать целым рядом соединений л'/;.:; (рис.9).: Ответная' реакция выражалась в виде одновершинной * "кривой с максимумом образования риоитина и дябвмяна на определенной концентрации индуктора.поэтому активность каждого Ч г,-'. из исследованных веществ приводится:при-той его концентра-!' * ции, которая;обладала" максимальной способностью к индукции. ' Ч Индуцирующаяспособность выражалась в лроценгах, причем ва уу 100% принимали то наибольшее; количество риаитина и любимива, , ' ^которое удавалось' обнаружить в тканях-клубня картофеля этого же сорта, инфицированного несовместимой расой гриба. :

у V" :■■' 200.

150.

"л.&

' ' о ы •• • ,

Н-Г". . ■ Л н' • о 100,.

., - •:

50..

П п П

.-v

I 2 3 4 5 6 7 8 9 Ю у-

Рис. 9. Сравнительная индуцирующая активность испытанягыхм соединений. I - азид натрия /10_4М/^-цианистый калий /Ю"^ М/, 3 - диэтилдитиокарбомат /Ю_2М/, 4 - а-бензохинон /ЬхЮ'Щ/. 5 - яодацетат / Ю"3«/, 6 - фтористый натрий /ЛЮ"3!!»/, 7 - п-хлормеркурибенэоат / ХС^и/, 8 - серя окис-- ,. ■ лая медь /КГ2!!/, 9 - общий белок / 120 мкг в'мл';/, 10 -фракция белка 0.2-0.4 / 70 мкг в мл /. ■ ; ■ • ; Ч;

По своей способности индуцировать ФА все'испытанные-соединения, сильно между собой различались. Так, группа ингибиторов металлосодержащих ферментов почти,не индуцировала образование ФА, тогда как тиоингибитори индуцировали примерно 5р% от их количества в некрозе. Примерно такой асе индуцирующей способностью обладали фтористый натрий, хлорамфеникол и сернокислая медь.

Значительный интерес представляет обнаруженная способность к индукции у сернокислой меди. Дело в том, что обработка картофеля микродозами меди (0.02-0,1%) в настоящее . время рекомендуется для борьбы с фитофторозом (Дорожкин, Реынева, 1956). Поскольку при столь низких концентрациях рабочего раствора трудно допустить непосредственное воздействие вещества на патоген, можно полагать, что эффективность . обработок связана с индукцией ФА и повышением на этой основе свойства устойчивости растений.

Последнее обстоятельство побудило нас испытать способность к индукции ряда других металлов (в виде их хлористых / солей). По своей активности они расположились в следующий ряд:

Нв+2> Си+2> Ре+3> К±+2> Со+2 -

Была испытана также индуцирующая способность некоторых фунгицидов, применяемых в настоящее время для борьбы с фитофторозом (бордоская жидкость, хлорокись меди, Цинеб, ТМТД). Оказалось, что все они в той или иной мере обладали способностью к индукции» особенно препараты-^ содержащие медь» которые индуцировали от 30 до 50% ФА, содержащихся в некрозе.

Это обстоятельство открывает возможности поисков соединений, которые наряду с непосредственным действием на возбудителя болезни, одновременно индуцировали бы свойство устойчивости у растения.

Обнаруженный факт множественной индукции ФА не исключал возможности существования специфического индуктора среди метаболитов самого возбудителя болезни, теп более, что ни один из испытанных индукторов не вызвал образования ФА в таких ко дичествах, как сам гриб.

.'V'v.K- настоящему времени обнаружены лишь -два специфических индуктора, выделенные из мицелия; паразитарных 1рибов * ; . (.Crulokshank, Perrln, 1968; Frank, Paxton, 1971). Оба вещества по своей природе.являются:белковыми соединениями.

Согласно нашим определениям, способностью вызывать образование ФА обладал водный экстракт, полученный из мицелия гриба. Индуцирующая способность такого экстракта не зависет ' ла от степени вирулентности расы гриба, из которой он был ^ • получен. ,■ ;■ " -

Имеются основания полагать,- что индуцирующее начало,' К содержащееся в экстракте, является1 белковым соединением.' Об этом свидетельствуют полученные нами данные, согласно кото-рым:препарат белка, выделенный из мицелия; обладал высокой "!' индуцирующей способностью, тогда как надосадочная жидкость; оставшаяся послеего.выделения, не' содержала.индуцирующего начала. ■ . ■■„

■ ■'■;■"'. , Особенно активной оказалась фракция белка 0.2-0.4, полученная в результате' насыщения раствора сернокислым аммонием. Индуцирующая способность раствора этого белка отличалась : двумя характерными особенностями: . .

I. Белок,;содержащийся в составе этой фракции, в концент рации 70 мкг/мл вызывал образование ФА, вдвое превышающее то -максимальное количество, которое нам когда-либо удавалось обнаружить*в . некрозе. ,""'

; ' 2. Индукция, достигнутая с .его помощью, оказывалась ..удивительно "прицельной". (Если при индукции любым из вышеупомянутых. химикатов наряду с ришитином и 1любиминоы образовывав лось также большое-количество посторонних соединений, то в ответ на индуцирование белком возникали только ришитин и любимин. ' ■ "\ ■

С помощью раствора этого белка удавалось вызвать образование некроза, содержащего высокие количества ришитина.илю-; бимина,. то есть сделать устойчивыми к повторному заражению.', универсально восприимчивые сорта, рецессивные по R-генам и,-следовательно, поражающиеся всеми расами и», infeatans. Это позволяет выдвинуть, с нашей точки зрения, принципиаль- -ное положение, что все сорта картофеля, независимо от их ге--

нотипа, обладают потенциальной устойчивостью^ возбудителю фктофтороза, которая может быть реализована при наличии соответствующего индуктора.

7.'".'' ЗАКЛЮЧЕНИЕ " ;■■■■ о

Б заключение попытаемся сформулировать некоторые общие .У- положения, вытекащие из экспериментальных исследований и - . ! ./'■■ ; анализа данных литературы относительно защитной роли антибио- , " тических веществ картофеля. / .*: - '

_ Конституционные антибиотические вещества(хлорогеновая ' -к кофейная кислоты, ГА) сосредоточены преимущественно в по.- - " ' , кровах клубня, его естественной и раневой перидерме. Ране-1.'' ' вая перидерма образуется по образцу естественной в местах -■. механических поранений клубня. - Так же, как и естественная .. - перидерма,,она состоит из многослойных, практически лишенных \ . : межклетников рядов клеток, оболочки которых адкрустированы суберином. Оба типа покровов содержат одни и те же антибиоти-;.'„ ческие вещества, однако в естественной перидерме они нахо- ' ■ дятся в более высоких концентрациях. Внутри перидермы анти- • ' V •ч ■ биотические вещества локализованы определенным образом: кофейная кислота преимущественно в оиробковевших клетках фел-лемы, ГА - в составе меристем, тогда как хлорогеновая кислота в прираневой зоне.

Таким образом, клубень картофеля как бы опоясан своеоб-- ^ разными механическими и токсикологическими барьерами, в образовании которых принимают участие вещества различной химической природы и соответствующие ферментные системы. Эти барьеры, являющиеся одними из факторов естественного иммуни- ' тета клубня, препятствуют проникновению в него неспецифических и раневых паразитов. Среди них наиболее существенная защитная роль принадлежит ГА.

Отличительной особенностью специализированного паразита картофеля рь. 1пГез1апз является его способность разлагать ГА. Этот факт служит экспериментальным подтверждением того,"что специализация патогена к определенному растению-хозяину неизбежно связана с возникающей у него в ходе

- иг - '

сопряженной эволюции способность^, преодолевать'защитные си- Г ч'ч-Улй.неснецифическо'го иммунитета,'; впервую.очередь, его "аити- У " : У л биотические свойства,' без . чего паразитизм не представляет-,.-; У-.-(г . . .ся возможным (ВердеревскиЯ,' 1968).' /.'-.-■'■' .-У- ;

- йз сказанного, конечно, не следует, что перидерма клуб-- У 1//У;."' ня картофеля совсем лишена'защитных свойств но отношению к -"У;-'' рь. 0 ее защитной роли свидетельствует хотя бы

Г.: , ' то обстоятельство, что патоген, обладающий способностью пре-^^ одолевать перидермальный барьер, все же преимущественно про-:У; ', л*; "'.-- ; никает в - клубень" через глазки, чечевички и поврежденные 1;"'.-■ - "' участки покровов." Скорость 'преодоления перидермы, по всей • • :'. .

. ; • вероятности, зависит от ряда факторов: ее механических у!", г ;. свойств, количества содержащихся в, ней антибиотических ве-.. " •. :: д ,' щсств, степени их локализации и т.д. ~ • .*_''

У ' Значительно большая роль.в ограничении развития патоге- '.'у

. ;; . 'на принадлежит индуцированным антибиотическим веществам кар- ."

• тошеля - сесквитеоиеноилаы. Последние, как следует из схем У'УУ'УУ -"' биосинтеза терпенов / Гусева, 1967 / , биогенети- \ ; У;УУ

• ;; чески" связаны' с конституционными;, ингибиторами - ГА. Таким;.'; у У^УУ; -;.: . образом, - соланин и чаконин, с одной стороны, и ришитин и лю- '• • , бйыин, с другой, имеют общее, происхождение ; ; пути их. образования расходятся на уровне образования фарнезилпирофосфата. • . " . ~ Действительно, данные, полученные в работе, свидетель- -- ствуют, что образование ГА и сесквитерпеноидов в тканях клуб- .' . • ня "является взаимозависимым, , а в ряде случаев и взаимоисключающим. Так, в механически, пораненных, но не инфицированных -' У у? У >;. . ^тканях клубня, образуются с><-соланин и ©(-чаконин,. тогда как ; . \ '••;•" ришитин и любимин присутствуют' в виде следов. Наоборот, в ... У.-;инфицированных несовместимой расой тканях преимущественно .'1 У; . . образуйся ришитин и любимин. Это позволяет предполагать,. ; * : ;' что под влиянием несовместимой расы гриба происходит измене- .. ¿уу УУУ'.'; ние направленности" терпенового биогенеза,. приводящее к тому, У У что фарнезилпирофосфат,1 использующийся в пораненных тканях. ;: • на образование:соланидина,^подвергается циклизации, приводя. .. У щей к образованию ришитина и любимина. : ' - ■ ,:• у-

:"*•- -- ■ В тканях, инфицированных совместимой расой гриба, по-УУУ-:- добаое переключение, если и происходит, -то в значительно ЛУУУ-^У

'■ -'*""■''.'■.■ " - 4?, - : " , у : ' ;

меньшем масштабе. В результате лишь небольшая часть фарне-. " зилпирофосфата циклйзуется с образованием сесквитерпеноидов, тогда как его основная масса используется для образования соланидина.В этом случае количество образующихся ришитина и лейишна недостаточно для подавления роста гриба, а возникающие ГА им разлагаются. Все сказанное можно проиллюстрировать в виде следующей схемы:

Раневая перидерма Фаркезилпирофосфат

х/

^Ришитин ! Т1юбиыин

^Соланин Чаконин

Некротиэированная Фарнезилпирофосфат-ткань

Се

Ришитин Любимин

олаяин конин

Зараженная ткань Фарнезилпирофосфат.

___^Ришития

| Любимин

МСоланин} Чакон и ф

Разлож

ение

х/ Пунктиром обозначен нефункционирующий патогеном

путь биогенеза

Таким образом, взамен ГА - группы антибиотических веществ, освоенных РЬ. 1п*езгапз, возникают сесквитерпеноиды, оказывающие на патогена токсическое действие. Следует'иметь в виду, .что образование сесквитерпеков является более выгодным процессом, поскольку требует примерно вдвое меньших за-" трат энергии и пластического материала, чем на образование ГА.

' Однако значение обнаруженных изменений метаболитической направленности терпеноидного биогенеза в некротизированннх тканях этим не ограничивается. Дело в том, что грибы семейства Ру^Маое&е, куда входят роды Ру№1ит и РЬ^орЬ^ога^ не имея самостоятельного пути баогенеза стеролов, для своего успешного развития в них нуждаются. Эти грибы эффективно поглощают стеролы из культуральной среды и включают в состав

своих мембран (Elliott et al., 1964; SohlSsser, Gottlieb, 1966,1969; Sietsma, Haskins, 1967). ; -

' Известно также, uW> некоторые'паразитарные грибы утра- , чиваат путь самостоятельного синтезастеролов, удовлетворяя": свои.потребности в них; за.счет "того-растения, на котором па- : разитируют (Ахрем и Титов, 1970). Зсли допустить,•что к чис- -лу.таких паразитов; относится Ph. lnfestans,следует признать, что свойственный клубнхк картофеля стероидный биоге- - ; ,нез. является для гриба дане необходимым, в силу того, что ' Ч:"; паразит, .щишенный'экзогенных стеролов, плохо растет, слабо •;;;,. спороносит и становится чувствительным к воздействию многих, .ингибиторов (Elliott, Х96б;1969; Hendrix, 1964; Haaklns '■■■ et al., 1966, 1969). v "';."..''■■ .

■""'.' Поскольку метаболитический блок,, препятствующий биосинте-: зу стеролов, находится у.: гь. infeatans на этапе окислитель- v-ной циклизации: сквалена ( Hendrlx, Х964), наиболее вероятно;";/ что гриб использует предшественники уже после зтапа циклиза-'. ции. Одновременно с этиы патоген обладает способностью разла-; .гать ТА,: первым этапом чего,, по всей вероятности,' является ;j энзиматическое отщепление Сахаров, чем одновременно достига-.; ется их детоксикации ( Мс кее£959). ''■'. '.;''■/V':'v

- ; Все изложенное изображено', в виде схемы (рис .10), некоторые этапы которой пока еще остаются гипотетическими. Это, в .';. ■ первую'очерсдь, 'касается возможности использования грибом ■ предшественников ГА растения-хозяина. ''

Пример взаимоотношений картофеля и Ph.infевъал» "позволяет совместить две ведущие теории фитоиымунитета: питательно-тормозящую теорию t,Gaxber, 1954, 1956)'и теорию индуциро-ванных.ингибиторов - ФА; (Mailer,BSrger, I940). Переключение метаболизма с процесса образования.ГА-на возникновение сескви-терпеноидов одновременно лишает паразита.фактора, необходимо—' 'го-для его нормального развития, и приводит к образованию.: -вещесть,-оказывающих .на него-токсическое действие. '■V-/ Таким образом;.изменение направленности биогенеза с глико алкалоидов на сесквитерпеноиды является одним из факторов, ; обуславливающих несовместимость картофеля к возбудителю фито-

Патоген Инфицированный картофель

■совмест расой

несовместимой расой ■

Изопентенилпирофосфат

со/г

Использование патогеном

Ингиби^ование , патогена

• — -) Холестерин| Соланидин 1

I---

Разложение патогеном

«(-соланин вС-чакон ин

Рас. 10 Схема терпенового биогенеза в инфицированных РЬу-ЬорЫКога 1п£еб-ь»па тканях клубня картофеля.

■.',■■ фнтофгороза. Для того чтобы подобное переключение произошло достаточно полно, необходимо наличие соответствующего иикробиального индуктора "прицельного действия Использование таких индукторов могло бы-открыть возможности для * ; повышения устойчивости растений; что представляется весьма ' заманчивым как для их зашиты от болезней, так и для защиты биосферы от загрязнений пестицидами, .'■' ; На пути практического * решения этой задачи имеются мно-

гочисленные трудности, для преодоления которых нужны даль-, нейшие исследования.

выводы

I* Проведенное''исследование свидетельствуй о важной роли антибиотических веществ в устойчивости растения-хозяина к паразиту, сумевшему в ходе сопряженной эволюции преодолеть его неспецифический иммунитет, то есть иммунитет к подавляющему большинству,фитопатогенных.микроорганизмов, благодаря чему устойчивость в'природе является правилом, а восприимчивость исключением.

В защитных реакциях растения участвуют антибиотические вещества различные по своей-химической природе, происхождению и биологической активности, поражающие одновременно раз личные звенья обмена и физиологические функции, благодаря чему их действие возрастает. ' I

2. Степень участия различных антибиотических веществ в устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза не равнозначна. Конституционные антибиотические вещества, являющиеся одним из факторов иеспецифичсского иммунитета, лишь в ма лой степени могут предохранить растение от инфицирования специфическим патогеном. Более важная защитная роль принадлежит индуцированным антибиотическим веществам - фитоалекси нам.-В картофеле открыт новый фитоалексин, названный любими ном и индентифицированный как сесквитерпеновый оксиальдегид

На примере 20 сортов показано, что устойчивость картофеля к отдельным расам рь. ^езгапз^контролируемая к -генами, находится в прямой зависимости от их способности продуцировать фитоалексины в фунгитоксических количествах. Тем самым открывается возможность использования фитоалексинной активности в качестве одного из показателей устойчивости растений при их селекции и интродукции.

3. Для образования фитоалексинов используетря специфический для данного растения путь биогенеза конституционных стероидных гликоалкалоидов, с переключением их предшествен-

ников на; образование сесквитерпеноидов.Предполагается, что ; подобное изменение:метаболитической направленности одновре-', менно лишает' патогена' фактора," необходимого для его развития •взамен чего образуются соединения,1"оказывающие на'него токси ческое действие. - ■■"'.- ,- ,- ' . -

Преодоление паразитом барьера из антибиотических веществ может быть достигнуто разнымипутями: детоксикацией уже существующих антибиотических веществ и ингибированием процесса их образования* Б совместимой комбинации картофедь-т. ±nfestans это достигается путем -разложения констигу-ционных антибиотических'веществ и блокированием путей "био- . синтеза.индуцированных.' .''■*■,.".' ■■'■'■■ :

' V-.'- 5. Способность растений продуцировать антибиотические -вещества, будучи генетически детерминирована, вместе'с тем ;' зависит от условий внешней среды, благодаря чему.ею можно управлять. Это удалось осуществить при хранении картофеля в условиях активного вентилирования путем интенсификации в перидермальных тканях биосинтеза гликоалкалоидов и повышении способности клубней продуцировать фитоал'ексины.:

' б./Экспериментально показано, что универсально- восприимчивые, рецессивные по К-генам,сорта картофеля могут образовывать фитоалексины при обработке соответствующими индукторами, способными включить механизм их биосинтеза..Наибо-. лее активными'индукторами оказались метаболиты/ выделенные из гриба. Последние а отличие-от фитоалексинов, являются высокомолекулярными соединениями белковой природы, по своей биологической активности-значительно превосходящими индуцирующую; способность самого патогена в несовместимой комбинации. • ' ; . .'■ ■.у у-;;-, ■■.;

; Тем/самым открываются принципиально новые подходы как ■ для изучения биохимической природы'фитоиммунитета, так и-' для;разработки эффективных мер защиты растений от инфекционных болезней.\ - ' - / . ' ■

список

работ* опубликованных по материалам диссертации

X. "Озерецковская О.Л.» ЗасЬкова Н.И. 1965. Новообразование фенолов в*поврежденных тканях клубня картофеля. ДАН СССР, т.161, fe 4, 968-970.

2. Ыетлицкий Л.В., Озерецковская О.Л., Чаленко Г.И., Строкова Г*А. 1965. О фунгитоксичном действии фенольных соединений, возникающих в клубнях картофеля при поранении. ДАН СССР, т.160, № 4, 964-967.

3. Озерецковская О.Л. 1965. Биохишческап природа защитной роли раневых реакций растений. Тезисы ХУ Всесоюзного совещания по иммунитету растений,' Кишинев.

•4. Озерецковская О.Л. 1965. Биохимия раневых реакций в связи с применением метода активного вентилирования для хранения картофеля* овощей и сахарной свеклы. Тезисы IX иен-дел.съезда* Киев.

5. Озерецковская О.Л., Ыетлицкий Л.В. 1966. Изучение окислительного фосфорилирования митохондрий клубая картофеля при поранении. Материалы симпозиума "Структура и функция митохондрий" 10-12 мая, 1965 г., Ы., I59-I6I.

6. Озерецковская О.Л., иетдицкий^Л.В. 1966. Биохимическая природа раневых реакций и их регулирование. Сб."Биохимические основы защиты растений", Ы., "Наука", 57-72.

7. Озерецковская О.Л., Ыетлицкий Л.В., чаленко Г.И. 1966. Роль энергетического обмена в реакции сверхчувствительности. Труды ВИЗР, вып.26, Л., "Колос", 103-106.

8. Ыетлицкий Л.В., Соколова В.Е., Салькова Е.Г., Савельева O.K., Озерецковская О.Л. 1966. Образование и превращение веществ вторичного происхождении, участвующих в защитных реакциях растений. Тезисы 1У Международного симпозиума по химии естественных продуктов, Стокгольм,

. • '9. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л. 1966. Иммунитет рас- . . • " тений. Изд-во "Знание", М. (брошюра). ■.'■ '' V'y.o.1

10. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Давыдова U.A. 1968. ■ с Исследование антибиотических веществ клубня картофеля.' Прикл. биохимии, мякробиол., т.вып.б, 698-703. ■"'.■' -

. -II. ОзерецковскаяО.Л., Васюкова Н.И., Метлицкий Л.В. 1968.

Изучение антибиотических'веществ картофеля, образующих- г ся в ходе некротической реакции. ДАН СССР, т.178, te I, -'-._■ ". 244-24?. ... : /V ■ . " ■ vY-:e

12- Osereakowskaya>O.L.1SaTeÍjeva>O.H.í Vasjuko>a,H.I., Mo-rosora E.V., 1968. Wound reactions and their role In plant Immunity. Abstracts of papers First, International Congress of Plant Pathology. London.140.

13. Озерецковская O.Jt., Чаленко 1'.И., Давыдова H.A. 1968. раневые реакции растений и их защитная1роль. Тезисытру-

; дов У совещания по иммунитету растений, Киев, buii.I, 26. •

14. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.й. 1968. Антибиотические , :у. ■■" - вещества клубня картофеля. Труды У совещания по иммуни-

■ ■ тету растений. Киев. ; • - 1 "

::15. метлицкий Л.В., ОзерецковскаяО.Л. 1968. Фитоиммунитет. Изд-во "Наука", М. (Монография). .

, Metlitstetl, L.V.,OzeretskoTskaya O.L.l96e. Plant immun!-" ty. Plenum Press, Ne* Jork. 16. Ыетлицкий Л.В., Озерецковскал О.Л. 1968. Биохимия имму- . : витета растений к инфекционным болезням. Ё ки. Руковод-_ ■ ство для изучения бактериальных болезней растений.-. (06-.■ * ■ зор). . '■ ■■" ■ ■ _ - у' . ; : - : ■ '

- 17.' Озерецковская О.Л.V Давыдова.Ы.А., Васякоза п. И., Ивт- -лицкий Л.В. 1969. Участие гликоалкалоидоя ©(-соланина я <<-чаконина в защитных свойствах покровных, раневых - и кекротизиров&нных тканях клубня картофеля. Сб.Биохи-

мия иммунитета и покоя растений. U., "Наука", 22-22. ^

18., Сзерецковская'О.Л.¿ Чаленко Г.И. 1969. Методы "оценки . t ' •раневой перидермы клубня хартофеляГ'Сб.Виохнмия иммунн- ■ тега и покоя растений. М., "Наука", 83-93. ■ ' У у

19. Озерецковская О.Л., Чаленко 1'.И. 1969. Сравнительное > - изучение раневой и естественной перидермы клубня картофеля. Сб."Биохимия иммунитета и покоя растений". М., "Наука", 70-82.

20. Озерецковская О.Л. 1969. Защитная роль раневых и некро--f тических реакций в явлениях фитоиммунитета. Тезис«!

J II Еиохим. съезда, Ташкент, 25 секция.

.21. Озерецковская О.Л,, Васюкова Н.И., Метлицкий Л.В. 1969. Изучение фитоалексинов картофеля. ДАН СССР, т.189» i<f 5, ' H46-II49.

22. Васюкова Н.Й., Озерецковская О.Л., Метлицкий Л.В. 19701 Изучение фитоалексинов картофеля. Приют.биохим.микробиол., т.6, вып.4ÎI-435.

22. Метлицкий Л.В., Озерецковская 0.Л. 1970. Фитонциды и фитоалексаны и их роль в иммунитете растений. Микология и фитопатол.» т.Л: 2, 146-156 (обзор).

; 24. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И.',-Давыдова М.А., Дорожкин Н.А., Ремнева з.И.» Ивашок В.Г. 1970. Устойчивость картофеля к Phytophthora infestans в связи с фитоалексинной активностью листьев. Прикл. биох. ыикробиол.» вып.5, т.6, 568-573.

25. Озерецковская O.S., СаведЛева О.Н.,'Бали^ри Б.Д. 1970. . Ферментативное окисление кофейной и хлорогенозой mслот и его роль в защитных реакциях клубня картофеля. Тезисы 1» симпозиума по фенольным соединениям, Алма-Ата.

26.0zeretskoTskaya,O.L., Vasjukova N.I.1970. Substances antibiotiques des tubercules de pomme de terre et propriétés intensiflcation.de leur formation. Congres international de la protection des plantes (Paris).

27. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л., Чалова Л.И., Васкь _ . нова Н.И., Давыдова М.А. '1971. фитоалексин картофеля-

любиыин. Микология и фитопатол.» т.5,' te 3, 263-271,.

28. Дорожкин Н.А., Ремнева З.И., Озерецковская О.Л., Ива-нюк В.Г., Псарева В.В. 1971. Ришитин в листьях томатов. ДАН БССР, т.15, Кг 8, 745-747.

' 29.. Озерецковская О.Л., Чаленко .Г.И.,: Чистякова О.Н. 1971. '5 Естественная и раневая поридерма клубня картофеля в уело- . : винх:активного вентилирования. Ирикл.биох.микробиол., " . •

,"'■■■"1 ''-" т.?,' зып.4. ' " ; ' ■ * ■"- .'.'■■'■■' ... . ' ■ ■ ■■■■■■ ■-* '"r^-v

• " 20. Озерецковская О.Л.,.Давыдова М.А., Васюкова Н.И., Мет- - * V . лицкий Л.В. 1971. Гликоалкалоиды.в здоровом и повреж- г-, .'■■"' :: денном клубне картофеля. ДАН СССР, т.196, te 6, 14701473. ,'. " ■' ;'. / ■;■ 21- Чалова Л.И.i Васюкова Н.И.Озерецковская .О.Л. f 'Кет-' к

Г .. лицкий Л.В.: 1Э7Х. Химическая идентификации одного из' Л.:,:-,,-; , ;-■' '■ щитоалексинов'картофеля. Лрикл. биох.ыи1фобиол.,. т.Т1,"' ■ ■ ;.. вы:.. 1, 55-58.."■ •;'--•

-2. Медведева Т.Н., Давыдова.М.А., Васюкова Н.И., Цетраш И.11.» Озерецковская О.Л., Ковальская Л.II., Ыетлицкий Л.В. 1971. . •-' •. Роль ^итоалексинов в устойчивости плодов при хранении.

1фикл.йка.с.и«лк^о0., т.7, вып.3, 334-328. 4 v1.. ■ "7'Я- ■

, : 33. Ыетлицкий Л.В;,Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л.» Юргано-; : " ' ва Л.А., Чалопа Л.К., Васюкова Н.И. 1971. Индукция фито- • ; алексинов картофеля. Изв.АН СССР, сер.биол., ils. 3, ' 399- "г": .407. ■ ^ ■ ■ ■" ■ ". \ ' ■■ ' ^

'34. Ыетлицкий Л.В., Озерецковская О.Л., Вульфсон Н.С., Чало-i;! ва Л.И., 1971. Роль любимйна в устойчивости картофеля к • Phytophthora lnfestans : д его химическая идентификация. 7 - "'.'.-■■'.■'.■■ Микология, фитопатологии, т.5, вып.5, 439-443. ■ _ . " . ' ■ 35. Чалова Л.И., Тюкавкина'Н. А., Озера-цковская. О.Л.', Мет- 7 . лицкик Л.В. 1971. Некоторые данные о химической природе

s';:';"..' любимина и метод его определения. Ирикл.биох.микробиол., .' " ■ -.. т.7, ; вып. 5. V , 7 .. ;. '. ' •" • ;

36. Кетлицкий Л.В., Озерецковская О.Л.»Вульфсон Н.С., Ча-

лова Л^И. 1971. Химическая природа любимина - нового ' -'л ; 'фитоалоксяна картофеля.; ДАН ССОР, т.200, 1470, 1972. . s 37. Wulfson H.S., Wetlitskli, I.V., Ozeretskovskâya,O.L., Chalova L.I.I972. The structura of lubimin - of new potato phytoalexln .Thesis International Symposium of the V'-:.^"' Chemistry of Natural Products. Delhi. 212- 213.' \

38. Метлнцкий Л.В., Озерецковская О.Л.» Савельева О.Н., Балиаури Б.Д., Стон Д.It. 1972. Участие кофейной кислоты и продуктов ее ферментативного превращения в защитных реакциях картофеля против Pbytophthora iufea-tans ДАН СССР, т.202, № I, 228-231.

39. Савельева О.Н., Балиаури В.Д., Озерецковская О.Л., Ыет-лицкий Л.В. 1972. Ферментативное окисление хлорогеновой кислоты в здоровых и поврежденных клубнях картофеля. Прикл.биох.микробиол., т.8, выл.4. 4I8-42S.

40. иетлицкий Л.В., Озерецковская О.Л., Вульфсон Н.С., Ва-

: сюкова Н.И., Чалова Л-И., Давыдова М.А. 1972- Обнаруие-ние, биологическая активность и химическая природа фито-алексина картофеля-любиыина. Сб.Иммунитет и покой растений, U., "Наука", 3-30.

41. Нетлицкий Л.В., Савельева О.Н., Озерецковская О.Л., Балиаури В.Д., Стом Д.И., Тимофеева С.С. 1972. Фунгитоксичность продуктов ферментативного окисления хлорогеновой и кофейной кислот. Сб. Иммунитет и покой растений. М., "Наука", 58-72. _

42. Озерецковская О.Л., Чалешсо Г.И. 1972. Окислительное фосфорилирование в здоровых и залеченных после механиче-окого поранения клубнях, картофеля. Сб.Иммунитет и покой растений, Ы., "Наука", 73-82.

43. Чаленко Г.И.,.Озерецковская О.Л., Чистякова О.Н. 1972; Влияние внешних условий на образование раневой перидермы. Сб. Иммунитет и покой растений, «., "Наука", 83-95.

Подписано в печати 2/1У - 1973 г. . Объем 3,5 п.л. Тир 200 экз. Зак. 306.

Офсетное производство типографии № 3 изд-ва «Itayua» Москва, Центр, ул. Арбат. 33/12

Информация о работе

Озерецковская, Ольга Леонидовна
доктора биологических наук
Москва, 1975
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КАРТОФЕЛЯ И И РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К FHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT.) DE BARY. ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КАРТОФЕЛЯ И И РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К FHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT.) DE BARY."

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
АНТИБИОТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КАРТОФЕЛЯ И И РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К FHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT.) DE BARY.
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия