Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аналоги олигонуклеотидов с пептидными межнуклеотидными связями

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Аналоги олигонуклеотидов с пептидными межнуклеотидными связями"

На правах рукописи

ВАРИЖУК Анна Михайловна

АНАЛОГИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ПЕПТИДНЫМИ МЕЖНУКЛЕОТИДНЫМИ СВЯЗЯМИ

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 2 МАЙ 2011

Москва 2011

4846066

Работа выполнена в Лаборатории стереохимии ферментативных реакций

Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель:

доктор хим. наук, профессор ВЛ. Флорентьев

Официальные оппоненты:

кандидат хим. наук Л.А. Александрова, доктор хим. наук, профессор Г.Е. Позмогова

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «2011 г. в /л. часов на заседании диссертационного Совета Д002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан «>ХУ» гя-Иур г он г.

Ученый секретарь Диссертационного совета ___

кандидат химических наук у // /

А.М. Крицын

Список использованных сокращений:

ДБУ - 1,8-Диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен; ДИПЭА- диизопропилэтиламин; ДЦК — дициклогексилкарбодиимид; КДИ - карбонилдиимидазол;

КССВ - константа спин-спинового взаимодействия;

ПНК-пептидно-нуклеиновые кислоты;

ТГФ - тетрагидрофуран;

ТЭА - триэтиламин;

ВОМ - бензилоксиметил;

ВОР - гексафторфосфат (бензотриазол-1-илокси)грис (димегиламино)фосфония; BSA - МО-би^триметилсилшОацетамид;

COSY - correlation spectroscopy, методика двумерной гомоядерной корреляции;

DMTr-диметокситритил;

NHS - /У-гидроксисукцинимид;

TBAF - тетрабутиламмонийфторид;

TBDMS - третбутлдиметилсилил;

TEMPO - 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил;

TMSOTf- гримегилсилилтрифторметансульфокислота.

Актуальность исследования. Аналоги олигонуклеотидов находят широкое применение в диагностике и терапии вирусных и онкологических заболеваний, а также в исследованиях функций генов. В особую группу можно выделить аналоги, содержащие повторяющиеся амидные фрагменты (полиамидные ДНК-миметики). Среди них наиболее известны пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК) и олигонуклеотиды с амидными межнуклеотидными связями. ПНК изначально вызвали значительный интерес благодаря более высокому и специфическому (в сравнении с природными олигонуклеотидами) гибридизационному сродству к комплементарным фрагментам ДНК/РНК. Однако их практическое применение осложнено низкой растворимостью в водных средах, затрудненным прохождением через клеточные мембраны и склонностью к самоагрегации. Ключом к решению перечисленных проблем стало введение в ПНК остатков хиральных аминокислот (остов «классических» ПНК содержит лишь глициновые фрагменты), в частности амино- и карбокси-содержащих. Наличие положительно или отрицательно заряженных боковых групп позволяет регулировать гибридизацию путем изменения ионной силы и рН раствора. В более широком смысле ■ встраивание в олигонуклеотидные аналоги остатков аминокислот с боковыми радикалами можно рассматривать как метод функционализации ДНК для последующего присоединения репортерных групп и получения всевозможных конъюгатов. Кроме того, дополнительная функционализация олигонуклеотидов может применяться для повышения эффективности катализаторов и лигандов на основе нуклеиновых кислот.

Разработка олигонуклеотидов с амидными межнуклеотидными связями (структуры, в которых в отличие от ПНК сохранены рибозные остатки) велась практически параллельно разработке ПНК. Как и ПНК, олигонуклеотиды с амидными линкерами рассматриваются в качестве потенциальных терапевтических агентов, в частности регуляторов генной экспрессии. Несмотря на значительное разнообразие амидных модификаций межнуклеотидной связи, попыток введения боковых групп через амидсодержащие линкеры практически не предпринималось. Между тем функционализация, открывающая возможность конъюгации (например, с пептидами для осуществления адресной доставки) и маркирования (например, флуоресцентного маркирования для детектирования гибридизации) могла бы повысить эффективность и расширить сферу применения таких аналогов. При этом функционализация не должна мешать собственно гибридизации.

Т.о. перспективной представляется модификация олигонуклеотидов с амидными межнуклеотидными связями, аналогичная модификации «классических» ПНК, которая, как показано выше, имела принципиальное значение и обеспечила данному направлению дальнейшее развитие.

Целью работы явился синтез и изучение свойств нового типа аналогов олигонуклеотидов -аналогов со встроенными в межнуклеотидные связи остатками аминокислот. В ходе исследования решались следующие задачи:

- разработка общей стратегии синтеза динукпеозидных блоков с различными пептидными линкерами (т.е. содержащими остатки различных аминокислот) для использования в стандартном олигонуклеотидном синтезе;

-изучение гибридизационных свойств новых аналогов олигонуклеотидов;

-демонстрация возможности применения новой модификации олигонуклеотидов для флуоресцентного маркирования на примере маркирования производными карбазола и пирена.

Научная новизна и практическая значимость работы. Разработан метод синтеза аналогов олигонуклеотидов нового типа. Предложенная модификация олигонуклеотидов открывает возможности создания на их основе новых эффективных регуляторов генной экспрессии -терапевтических агентов и инструментов исследования функций генов. В ходе работы синтезировано 66 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на XVI Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2008) и Научной конференции молодых ученых Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (151 наименование). Работа изложена на 131 странице, включает 6 рисунков, 26 схем и 9 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Встраивание в олигонуклеотиды аминокислотных остатков является модификацией известного типа ДНК-миметиков - аналогов олигонуклеотидов с амидными межнуклеотидными линкерами. Новая модификация является перспективной при условии, что она не снижает сродства олигонуклеотидов к комплементарным ДНК/РНК. Хотя точно предсказать заранее гибридизационную способность новых аналогов нельзя, предположения о влиянии пептидного линкера на термическую стабильность дуплексов можно сделать, исходя из данных по гибридизации известных соединений с простыми амидными линкерами. В литературе собраны и сопоставлены некоторые данные по термической стабильности дуплексов, образуемых природными олигонуклеотидами и аналогами с различными амидными линкерами. Однако это сопоставление нельзя назвать полным и окончательным. Сравнение модификаций осложнено тем, что их влияние на стабильность дуплексов зависит от конкретной олигонуклеотидной последовательности.

В нашей лаборатории было проведено отдельное исследование гибридизационной способности некоторых описанных ранее аналогов с амидными линкерами. Это исследование стало предварительным этапом разработки принципиально новой модификации. Были получены новыми методами модифицированные динуклеозидны с двумя изомерными амидными линкерами (СЗ'-СНг-CO-NH-C5' и C3'-NH-CO-CH2-C5') (Схемы 1,2). Ключевыми соединениями в синтезе таких соединений являются З'-дезокси-З'-карбоксиметил- или 5'-дезокси-5'-карбоксиметилнуклеозиды. Их получали из общих углеводных предшественников по реакции гликозилирования.

Предшественник З'-дезокси-З'-карбоксиметилнуклеозидов 5 синтезировали из защищенной а-D-ксилофуранозы модифицированным нами методом Лю с сотр. [D.-M.Lu, J.-M. Min, L.-H. Zhang. Carbohyd. Res. 1999, 317, P. 193-197] (Схема 1). D-ксилозу окисляли до З'-кето-производного периодатом натрия с двуокисью рутения в двухфазной системе с катализатором межфазного переноса. Полученный кетон 2 превращали в непредельное соединение 3 по реакции Водсворта-Хорнера-Эммонса. Образовавшуюся смесь Е- и Z-изомеров (соотношение 7:1 по 'Н-ЯМР-спектрам) гидрировали при атмосферном давлении. В результате с выходом, близким к количественному, было получено единственное соединение 4, эритро-конфигурация которого была подтверждена NOESY-спектром. На стадии удаления изопропилиденовой защитной группы и получения 2-О-ацетильного производного за счет оптимизации условий ацетолиза удалось существенно повысить выход по сравнению с оригинальным методом - с 41 до 82%. З'-Дезокси-З'-карбоксиметилнуклеозиды ба-д получали по методу Форбрюггена.

Углеводный предшественник 5'-дезокси-5'-карбоксиметилнуклеозидов 17 синтезировали новым методом из защищенной a-D-аллофуранозы (Схема 2). Диол 12, полученный в результате селективного удаления 5,6-изопропилиденовой группы, окисляли периодатом натрия до альдегида 13. Альдегид превращали в непредельное соединение 14 по реакции Водсворта-Хорнера-Эммонса (судя по КССВ олефиновых протонов в 'Н-ЯМР спектре соединения 14 (У 15.71 Гц), двойная связь имеет Е-

конфигурацию). Олефин 14 гидрировали при атмосферном давлении. При этом одновременно с гидрированием двойной связи происходило удаление ВОМ-защиты. После бензилирования соединения 15 полностью защищенное производное 16 подвергали кислотному гидролизу и затем ацетилированию. Диацетат использовали для синтеза аналогов нуклеозидов по методу Форбрюггена.

В = Thy (a); Ura (б); Cyt (в); Ade (г); 2-JV-AcGua (д)

Схема 1. Синтез З'-дезокси-З'-карбоксиметилнуклеозидов и аналогов динуклеозидов с амидным линкером C3'-CH2-CO-NH-C5'.

a) NaI04, Ru02, Et3BnNCl, хлороформ/вода; b) (Et0)2P(0)CH2C00Et, NaH, ТГФ; с) H2, Pd(OH)2/C, этанол; d) AcOH, Ac20, MeS020H; e) нуклеиновые основания, BSA, TMSOTf, ацетонитрил. j) i -KOH, H20/Et0H, ii - AcOH. 70°C; g) 2-оксипиридин, ДМФ, 70°C 30 ч;

З'-Дезокси-З'-карбоксиметил- и 5'-дезокси-5'-карбоксиметилнуклеозиды конденсировали с

аминонукпеозидами. Полученные динукпеозиды переводили в фосфорамидитные блоки 10 и 21 для

стандартного олигонукпеотидного синтеза.

6-JV-Ade (r); 2-№AcGua (д)

Схема 3. Синтез 5'-дезокси-5'-карбоксиметилнукдеозидов и аналогов динуклеозидов с амидным линкером C3'-NH-CO- СН2-С5\

à) ВОМС1, ДИПЭА, СН2С12; Ь) 50% АсОН, 50°С; с) NaI04; d) (Et0)2P(0)CH2C00Et, NaH, ТГФ; é) H2, Pd(OHyC, этанол; f) BnBr, NaH, ТГФ; g) 80% АсОН, кипячение затем Ас20, пиридин; А) нуклеиновые основания, BSA, TMSOTf, ацетонитрил. /') К2СОз, МеОН; j) TBDMSC1, имидазол, ацетонитрил; к) КОН, этанол/вода; Г) КДИ, СН2С12.

Фосфорамидитные динуклеозидные блоки использовали в синтезе аналогов олигонуклеотдов с различным положением модифицированых фрагментов TamT (ат = амидный линкер СЗ'-СН2-СО-NH-C5') и ТтаТ (та = амидный линкер C3'-NH-CO-CH2-C5'). Помимо этого синтезировали природные олигонуклеотиды той же последовательности и комплементарные им. Также нами были получены олигонуклеотиды с оксалодиамидными межнуклеотидными связями (модифицированный динуклеозидный фрагмент - TmaamT, где maam = оксалодиамидный линкер C3'-NH-CO-CO-NH-С5')- Очистку олигонуклеотидов проводили методом обращено-фазовой ВЭЖХ. Структура всех олигонуклеотидов подтверждена MALDI-TOF масс-спектрами. Выбор поли-Т-произ водных

8

(регулярная последовательность) в качестве модельных соединений связан с тем, что для олигонуклеогидов нерегулярной структуры эффект модификации может зависеть от конкретной последовательности. Кроме того, комплементарные поли-Т поли-А-последовательности содержатся на З'-концах практически всех зрелых матричных РНК эукариот.

Были измерены профили термической диссоциации природных и модифицированных дуплексов. По полученным кривым определены температуры плавления дуплексов (Таблица 1).

Таблица 1. Температуры плавления модифицированных и природных дуплексов (концентрация дуплексов 10"5М).

Последовательность модифицированной цепи 5'—>3'* Тт, °С ± 0.5 (ДГт,°С**)

X = ТашТ X = ТтаТ X = ТтаатТ

О-ТТ-ТТ-ТТ-ТТ-ТТ-О 36.2

О-Х-ТТ-ТТ-ТТ-ТТ-О 35.8 (-0.4) 35.4 (-0.8) 26.6 (-9.4)

С-ТТ-ТТ-ТТ-ТТ-Х-С 35.8 (-0.4) 35.7 (-0.5) 29.9 (-6.3)

О-ТТ-ТТ-Х-ТТ-ТТ-О 35.3 (-0.9) 34.5 (-1.7) 17.6 (-18.6)

С-Х-ТТ-ТТ-ТТ-Х-С - - 16.8 (-19.4)

в-Х-ТТ-Х-ТТ-Х-О - 31.0 (-5.2) -

*Х = ТатТ, ТтаТ и ТтаатТ - фрагменты модифицированных динуклеозидов с линкерами СЗ'- СН2-СО-Ш-С5', СЗ'-Ш-СО-СН2-С5' и СЗ'-Ш-СО-СО-Ш-С5' соответственно. ** Разность температур плавления модифицированного и природного дуплексов.

Как видно из данных таблицы, алкиламидные модификации линкеров незначительно

сказываются на гибридизационной способности олигонуклеотидов (А Т,„ -0.6° в среднем на модификацию для линкеров СЗ'- СН2-СО->1Н-С5' и -1.4° в среднем на модификацию для линкеров СЗ'-ЫН-СО- СН2-С5'). Оксалодиамидная модификация существенно дестабилизирует дуплексы (АТт - 10.7° на модификацию).

На основании этих данных можно предположить, что для сохранения высокой гибридизационной способности олигонуклеотида в случае линкера с 2 конформационно-жесткими амидными фрагментами между ними должен находиться гибкий фрагмент - С$рЗ атом. Этому условию удовлетворяет структура линкера, содержащего аминокислотный остаток.

Нами разработана общая стратегия синтеза динуклеозидных блоков со встроенными остатками различных аминокислот. Динуклеозиды использованы для получения аналогов олгонуклеотидов нового типа, в том числе оптически-чистых производных хиральных аминокислот. Как и в случае аналогов с алкиламидными линкерами, модифицированный фрагмент с пептидным линкером может быть введен в любое положение цепи, возможны множественные модификации. Есть основания полагать, что новые аналоги с пептидными линкерами продемонстрируют как повышенную устойчивость к нуклеазам, так и способность проникать через клеточные мембраны, характерные для конъюгатов ДНК-пептид. (Конъюгация с пептидами широко используется для улучшения фармакокинетических свойств антисмысловых олгонуклеотидов и з11ША). Особенности аналогов

олигонуклеотидов нового типа были изначально изучены на более простых структурах -производных гидрофобных аминокислот (глицина, Ь- и О- аланина, Ь- и О- фенилаланина). Аналоги олигонуклеотидов с гидрофобными пептидными линкерами. Синтез З'-фосфорамидитных блоков динуклеозидов со встроенными остатками гидрофобных аминокислот представлен на Схеме 3.

23 24а-д 25а-д

Схема 3. Синтез динуклеозидных блоков, содержащих остатки глицина (29а), L- и D-аланина (296, 29 в) и L- и D- фенилаланина (29д, 29е).

а) ВОР, ТЭА, СН2С12; Ь) КОН, этанол/вода; с) ВОР, ТЭА , СН2С12 для 25а и ДЦК, NHS, СН2С12, 4°С для 25 б-д; d) TBAF, ТГФ; е) NCCH2CH2OP(NPr2)2, тетразол, пиридин, СН2С12.

3'-0-т/)ет-Бутилдиметилсилилтимидин-5'-карбоновую кислоту 23 - получали окислением З'-О-

/л/?е/л-бутилдиметилсилилтимидина бисацетоксииодбензолом в присутствии каталитических

количеств 2,2,6,6-тетраметшшиперидин-1-оксила (TEMPO) в смеси ацетонктрил-вода (1:1) с выходом

93% (20°С, 3 ч). Кислоту 23 конденсировали с метиловыми эфирами аминокислот 22 с ВОР в

качестве конденсирующего агента в присутствии триэтиламина в тетрагидрофуране (20°С, 1 ч).

Эфиры 24а-д омыляли 0.5 М КОН в смеси этанол-вода (3:1) (20°С, 2 ч). Кислота 25а (производное

глицина) была получена с выходом 48%, тогда как выходы производных L- и D-аланина, L- и D-

фенилаланина составили 81-92%. Это согласуется с литературными данными по омылению С-

концевых глициновых эфиров в пептидах. Конденсация кислот 25а-д с 3'-амино-3'-дезокси-5'-0-

10

диметокситритилтимидином 26 приводила к полностью защищенным динуклеозидам 27а-д. Условия конденсации для соединения 25а (глициновое производное) были такими же, как для 23. В случае производных аланина и фенилаланина 25б-д использовали ДЦК и NHS, что позволило избежать эпимеризации, наблюдавшейся при использовании ВОР (около 15% для аланина и около 30% для фенилаланина по данным ЯМР). Оптическую чистоту соединений 27б-д подтверждали данными 'Н-ЯМР-спектроскопии. Силильную защитную группу удаляли 0.5 М тетрабутиламмонийфторидом в тетрагидрофуране (20°С, 4 ч). Образующиеся в результате динуклеозидьг со свободной 3'-гидроксигруппой 28а-д превращали в соответствующие амидиты 29а-д, обрабатывая 2-цианэтил-Л',Л',Л'',Л''-тетраизопропилфосфорамидитом в присутствии тетразола и пиридина в дихлорметане. Строение полученных соединений подтверждено данными 'Н-ЯМР-спектроскопии. В случае динуклеозидов отнесение сигналов к протонам остатков З'-амино-З'-дезокситимидина и тимидин-5'-карбоновой кислоты осуществляли с помощью COSY-ЯМР-спектров (Рисунок 1). Динуклеозиды 29а-д также охарактеризованы MALDI-TOF-масс-спектрами.

8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 f2 (м.д.)

Рисунок 1. COSY-ЯМР спектр соединения 28в. сТ = остаток тимидин-5'-карбоновой кислоты, Та = остаток 3 'амино-3 '-дезокситимидина.

Амидиты 29а-д были использованы для синтеза модифицированных олигонуклеотидов на автоматическом синтезаторе (для модифицированных амидитов время конденсации было увеличено до 15 мин). Помимо модифицированных были получены природные олигонуклеотиды с теми же последовательностями и комплементарные им. Очистку олигонуклеотидов проводили методом обращено-фазовой ВЭЖХ. Все олигонуклеотиды охарактеризованы МА1ЛЭ1-масс-спектрами. Были измерены профили термической диссоциации природных и модифицированных дуплексов (Рисунок 2). По полученным кривым определены температуры плавления дуплексов (Таблица 2). Как видно из данных таблицы, Ь-фенилаланиновая и й-фенилаланиновая модификации существенно снижают стабильность дуплексов как для случайной последовательности (АТт в среднем -1.8 и -1.0° на модификацию, соответственно), так и для регулярной последовательности (ДТт в среднем -3.4 и -2.6° на модификацию, соответственно). Глициновая и Ь-аланиновая модификации вызывают незначительную дестабилизацию (АТт -1.1 и -0.9° на модификацию, соответственно, для случайной последовательности и ДТт -1.9 и -2.3° на модификацию, соответственно, для регулярной последовательности). О-Аланиновая модификация, напротив, обладает небольшим стабилизирующим эффектом (ДТт в среднем + 0.3° на модификацию для случайной последовательности и + 0.2° на модификацию для регулярной последовательности).

Рисунок 2. Кривые плавления модифицированных и природного дуплексов. Последовательность (5'—>3') модифицированной цепи: ОХТТХТТХТТХО, где X - модифицированный динуклеозидный фрагмент, содержащий остаток глицина (кривая 2), В-алапипа (кривая 3), Ь-аланина (кривая 5), Э-фенилаланина (кривая 4) или Ь-фенилаланина (кривая 6) в межнуклеотидных связях. Кривая 1 -^модифицированный дуплекс.

20

30 40 50

Температура (°С)

60

Таблица 2. Температуры плавления модифицированных и природных дуплексов (концентрация дуплексов 5*Ю'6М).

Последовательность модифицированной цепи Тт, °С ± 0.5, (ДТт, °С**)

X = Gly X = L-Ala X = D-Ala X = L-Phe X = D-Phe

ТТААСТТСАСАТТС 51.6

ТТААСТТСАСАХС 50.3 (-1.3) 50.8 (-0.8) 51.6(0.0) 49.7 (-1.9) 50.0 (-1.6)

ХААСТТСАСАХС 49.7 (-1.9) 49.9 (-1.7) 52.5 (+0.9) 58.1 (-3.5) 50.2 (-1.4)

GTTTTTTTTTTTTTTG 44.3

GXTTTTTTTTTTTTG 42.1 (-2.2) 42.0 (-2.3) 44.1 (-0.2) 39.7 (-4.6) 41.4 (-2.9)

GTTTTTTXTTTTTTG 42.9 (-1.4) 42.8 (-1.4) 44.6 (+0.3) 41.5 (-2.8) 42.2 (-2.1)

GTTTTTTTTTTTTXG 42.2 (-2.1) 42.1 (-2.2) 44.4 (+0.1) 40.9 (-3.4) -

GXTTTTTTTTTTXG 40.3 (-4.0) 39.1 (-5.2) 44.4 (+0.1) 35.9 (-8.4) 38.9 (-5.4)

GXTTTTXTTTTXG 38.4 (-5.9) 36.8 (-7.5) 44.8 (+0.5) 32.6 (-11.7) 36.7 (-7.6)

GXTTXTTXTTXG 37.4 (-6.9) 35.3 (-9.0) 45.3 (+1.0) 34.4 (-9.9) 34.0 (-10.3)

* Х - модифицированный динуклеозидный фрагмент

** Разность температур плавления модифицированного и природного дуплексов.

Таким образом, олигонуклеотиды с D-аланиновым остатком удовлетворяют критерию стабильности дуплексов, установленному для модифицированных олигонуклеотидов. D-Аминокислотные производные образуют в целом более стабильные дуплексы, чем L-аналоги, что согласуется с результатами, полученными для ПНК. Это может иметь большое значение для применения новых аналогов in vivo (производные D-аминокислот могут быть использованы для предотвращения расщепления пептидных межнуклеотидных связей карбоксипептидазами).

Следующим шагом стало получение аналогов олгонуклеотидов, содержащих остатки аминокислот с боковыми функциональными группами.

Аналоги олигонуклеотидов с линкерами на основе лизина.

Синтезированы олигонуклеотиды со встроенными остатками лизина. Выбор аминокислоты отчасти обусловлен тем, что именно лизиновые производные продемонстрировали наилучшие гибридизационные свойства в случае ПНК. Лизиновая модификация не только позволяет вводить в олигонуклеотиды репортерные группы, но интересна и сама по себе. При кислых значениях рН боковые аминогруппы протонированы, и аминоалкил-олигонуклеотиды могут образовывать дуплексы или триплексы повышенной стабильности. Для получения аналогов олигонуклеотидов с остатками лизина схема синтеза модифицированных динуклеозидов была несколько изменена с

учетом необходимости защиты боковой аминогруппы (Схема 4).

13

NHCOCF3

30a,б 31a,б 32a,б

Схема 4. Синтез динуклеозидных блоков, содержащих остатки L- и D-лизина в межнуклеотидных связях, а) ДЦК, NHS, СН2С12, 4°С; b) К2С03, метанол/вода, кипячение; с) ВОР, ТЭА, СН2С12; d) i -NH4COOH, Pd/C, метанол, кипячение; ii - CF3COOEt, ТЭА, метанол; е) TBAF, ТГФ; J) NCCH2CH2OP(NPiJ2)2, ltf-тетразол, пиридин, СН2С12.

Соединения 31а,Ь, ключевые интермедиаты в синтезе целевых динуклеозидов 36а,Ь, получали конденсацией З'-амино-З'-дезокситимидина 26 с L- и D- лизиновыми производными 30а,b в присутствии ДЦК и NHS (4 °С, 24 ч). Использование ДЦК и NHS позволило избежать эпимеризации при а-углеродных атомах аминокислотных остатков (эпимеризация около 30% при использовании ВОР по 1Н-ЯМР спектру). Соединения 31а,b были получены с выходом 83%. Оптическая чистота 31а,b подтверждена данными 'Н-ЯМР спектроскопии. Трифторацетильную защитную группу удаляли кипячением 31а,b с К2СОз в смеси метанол/вода в течение 4 ч, в результате получали соединения 32а,b со свободными а-аминогруппами с выходом 71-80%. Далее конденсировали соединения 32а,b с 3'-0-(л1/>е/и-бутилдиметилсилил)тимидин 5'-карбоновой кислотой 23 в присутствии ВОР и ТЭА в СН2С12 (20 °С, 1 ч). Выходы динуклеозидов 33а,b составили 84-89%. Бензилоксикарбонильную защитную группу замещали на трифторацетильную без выделения

промежуточных нуклеозидов со свободными £-аминогруппами. Для этого динуклеозиды 33а,Ь обрабатывали формиатом аммония в метаноле в присутствии 10% Р(1/С (кипячение, Зч), а затем действовали этилтрифторацетатом с ТЭА в метаноле. Трифторацетилированные динуклеозиды 34а,Ь были получены с выходом 80-82%. Проводили десилилирование по стандартной методике и образовавшиеся динуклеозиды 35а,Ь со свободными З'-гидроксильными группами обрабатывали 2-цианоэтил-Лг,Лг,Л''//'-тетраизопропилфосфорамидитом в присутствии тетразола и пиридина в дихлорметане (20°С, 2 ч). Амидиты 36а,Ь были получены с выходами 64-65%. Все динуклеозиды охарактеризованы МАЬ01-Т0Р масс спектрами и структуры 32а,Ь - 35а,Ь подтверждены данными СОБУ-ЯМР спектроскопии. СОЗУ-спектры позволили выполнить однозначное отнесение сигналов к протонам остатков лизина, тимидин-5'-карбоновой кислоты и 3'-амино-3'-дезокситимидина.

Динуклеозидные фосфорамидинтые блоки с трифторацетил-защищенными е-аминогруппами были использованы в олигонуклеотидном синтезе (время конденсации было увеличено до 15 мин для модифицированных амидитов). Обработка аммиаком в конце синтеза привела к аналогам олигонуклеотидов со свободными боковыми аминогруппами. Измерены профили термической диссоциации дуплексов, по полученным кривым определены температуры плавления (Таблица 3).

Таблица 3. Температуры плавления модифицированных и природных дуплексов (концентрация дуплексов 2.5 *10"6 М).

Последовательность 5'—3'* Тт, °С ± 0.5, (ДГт, °С**)

X = L-Lys X = D-Lys

ТТААСТТСАСАТТС 50.3

ТТААСТТСАСАХС - 51.0 (+0.7)

ХААСТТСАСАТТС 50.9 (+0.6) 50.6 (+0.3)

ТТААСХСАСАТТС 48.9 (-1.4) 50.2 (-0.1)

ХААСТТСАСАХС 50.4 (+0.1) 51.7 (+1.4)

ХААСХСАСАХС 49.2 (-1.1) 51.3 (+1.0)

*Х = L- и D- Lys - модифицированные динуклеозидные фрагменты. ** Разность температур плавления модифицированного и природного дуплексов.

Как видно из данных Таблицы 3, олигонуклеотиды, содержащие остатки D-лизина, образуют в целом более стабильные дуплексы, чем L-аналоги (АТт = +0.4°С и -0.3°С в среднем на модификацию соответственно; что согласуется с закономерностью, выявленной на производных гидрофобных аминокислот). Эффект модификации зависит от ее положения. Концевые модификации стабилизируют дуплексы, тогда как модификация в середине цепи вызывает небольшую дестабилизацию, более выраженную в случае L-лизинового производного.

Поскольку D-лизиновые производные продемонстрировали наилучшие гибридизационные свойства, они были выбраны для дальнейшего исследования - оценки возможности конструирования

15

на их основе олигонуклеотидных зондов - инструментов диагностики и изучения структуры генома. С этой целью проводили маркирование аналогов олигонуклеотидов по боковым аминогруппам Б-лизиновых фрагментов флуорофорами, чувствительными к микроокружению, т.е. способными менять параметры флуоресценции при гибридизации модифицированного олигонуклеотида с комплементарным фрагментом ДНК/РНК (Схема 5).

соон

(Н2С)5 + nh2

37

DMTrO-, Thy

h2n nh

(CH2). ¿О 40 ил"4?

Ун

HN

со

с

Thy

DMTrO

СО

hn

1

Р

NH

Thy

DMTrO

СО

(СН2)5 |

СО (СН2)4Х0 'NH С,

гн

HN,

\

со Thy

hn

(СН2)5 NH

СО ^(СН2)4,С0 -NH Sc,

сн4

и

44 OTBDMS OR Ni/.Pr^

г 45а,б - R = TBDMS d I

a-R= 1-пиренил, б - R = 9-ЛГ-карбазолилметил -*-46a,6-R = H 47а,б OCH2CH2CN

Схема 5. Синтез флуоресцентно-меченых динуклеозидов с остатками D-лизина в межнуклеотидных связях, a) NaHC03, ТГФ/Н2О, затем HCI; a") NaHC03, диоксан/Н20, затем НС1; b) NHS, диоксан; b') NHS, пиридин; с) 40, ДИПЭА, ТГФ или 43, ДБУ, диоксан; d) TBAF, ТГФ; е) NCCH2CH20P(NPr'2)2, ltf-тетразол, пиридин, СН2С12.

Изменение микрооокружения флуорофора при гибридизации обычно связано с его

интеркаляцией между основаниями дуплекса или встраиванием в большую/малую бороздку. Для

16

обеспечения такой укладки флуорофор должен быть присоединен к пептидному межнуклеотидному фрагменту через линкер определенной длины. Оптимизация длины и жесткости линкера в каждом конкретном случае представляет собой отдельную задачу. В модельных экспериментах длину выбрали, исходя из литературных данных для олгонуклеотидов, меченых по 2'-положению рибозного остатка. В качестве линкера использовали остаток е-аминокапроновой кислоты. Ее конденсировали с активированными карбокси- или карбоксиметильными производными флуорофоров (38, 41), продукт активировали и вводили в реакцию с модифицированным динуклеозидом на основе О-лизина со свободной е-аминогруппой 44 (получали из динуклеозида 336, удаляя бензилоксикарбонильную защиту гидрированием, см. Схему 4, Л г). В качестве флуорофесцентных меток были использованы производные карбазола и пирена. Пирен широко используется для маркирования олгонуклеотидов, и в дуплексе, как правило, интеркалирует между основаниями. Производные карбазола, несмотря на планарную структуру, в свободном виде могут встраиваться в малую бороздку двойной спирали.

Динукпеозиды, меченные пиреном и карбазолом по пептидным межнуклеозидным связям, были использованы в олигонуклеотидном синтезе. Введение интеркаляторов в олигонуклеотиды обычно стабилизирует образуемые ими дуплексы. Действительно, маркирование карбазолом и пиреном вызвало стабилизацию, более выраженную для производных пирена (АТт =+1°С и +3.7°С в среднем на модификацию соответственно, Таблица 4).

Таблица 4. Гибридизационные свойства флуоресцентно-меченых модифицированных олигонуклеотидов. (концентрация дуплексов 2.5 *10"6М).

Последовательность 5'—*3'* Тт, °С ± 0.5, (ДГт, °С**)

X = СагЬ. X = Руг.

ТТААСТТСАСАХС 52.1 (+1.8) 55.5 (+5.2)

ХААСТТСАСАТТС 52.8 (+2.5) 54.7 (+4.4)

ТТААСХСАСАТТС 50.1 (-0.2) 53.0 (+2.7)

ХААСХСАСАХС 52.1 (+1.8) 60.1 (+9.8)

*Х = СагЬ. и Руг. - модифицированные динуклеозидные фрагменты, меченные карбазолом и пиреном соответственно.

** Разность температур плавления модифицированного и природного дуплексов.

Флуоресценцию пирена и карбазола определяли в одноцепочечных олигонуклеотидах и в

дуплексах. Различие спектров испускания для одноцепочечных олигонуклеотидов и дуплексов

представлено на Рисунке 3 на примере олигонуклеотидов с центральной модификацией.

Гибридизация олигонуклеотидов, меченных карбазолом, сопровождается увеличением интенсивности

флуоресценции (приблизительно в 3 раза) при центральном положении модифицированного

фрагмента в цепи. При концевых модификациях эффект гибридизации незначителен. Для

17

производных пирена гибридизация, напротив, вызывает падение интенсивности флуоресценции (при центральной модификации более чем десятикратное).

Рисунок 3. Изменение спектров испускания флуоресценции при гибридизации меченых модифицированных олигонуклеотидов с комплементарными природными. X = СагЬ. и Руг. -модифицированные динуклеозидные фрагменты, меченые карбазолом и пиреном соответственно. 55-одноцепочечный олигонуклеотид; ББ - дуплекс. Оси абсцисс - длина волны, нм; оси ординат -интенсивность флуоресценции, нормированная к концентрации 4x10"6 М.

Результат, полученный для карбазола, можно объяснить тушением его флуоресценции в олигонуклеотиде молекулами воды и устранением тушения за счет экранирования карбазола в дуплексе. Уменьшение интенсивности флуоресценции пирена в дуплексе может объясняться тушением за счет миграции электрона между возбужденными пиреном и нуклеиновыми основаниями. Чтобы подтвердить предположения об укладке флуорофоров в дуплексах, определяли поляризацию, анизотропию и времена жизни флуоресценции, позволяющие судить о времени корреляции. Встраивание флуорофора в дуплекс должно сопровождаться уменьшением вращательной диффузии и увеличением времени корреляции. Даннные, полученные для карбазола, не противоречат встраиванию в малую бороздку. Данные, полученные для пирена, косвенно подтверждают интеркаляцию между основаниями.

Таким образом, нами показано, что параметры флуоресценции меняются при гибридизации меченых аналогов олигонуклеотидов с природными, следовательно, аналоги с пептидными межднуклеотидными связями могут быть использованы при конструировании молекулярных зондов.

выводы

1. Получены потенциальные регуляторы генной экспрессии нового типа - аналоги олигонуклеотидов с пептидными межнуклеотидными связями.

2. Синтезированы и охарактеризованы олигонуклеотиды, содержащие пептидные линкеры на основе глицина, Ь- и О- аланнина, Ь-и Б- фенилаланина, Ь-и Б-лизина.

3. Изучена зависимость гибридизационной способности модифицированных олигонуклеотидов от природы пептидного линкера. Показано, что модификации на основе О-алапина и О-лизина приводят к стабилизации дуплексов.

4. Продемонстрирована возможность флуоресцентного маркирования аналогов олигонуклеотидов по пептидным межнуклеотидным связям для детектирования гибридизации, что может быть использовано при создании олигонуклеотидных зондов - инструментов исследования структуры генома.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

1. С.В.Кочеткова, А.М.Варижук, Н.А.Колганова, Э.Н.Тимофеев, В.Л.Флорентьев. Синтез З'-дезокси-З'-карбоксиметилнуклеозидов - предшественников олигонуклеотидов с амидной межнуклеотидной связью. Биоорган, химия, 35, 76-83 (2009).

2. С.В.Кочеткова, А.М.Варижук, Н.А.Колганова, Э.Н.Тимофеев, В.Л.Флорентьев. Аналоги олигонуклеотидов, содержащие межнуклеотидную связь C3'-CH2-C(0)-NH-C5\ Биоорг. химия., 35, N2, 202-209 (2009).

3. А.М.Варижук, С.В.Кочеткова, Н.А.Колганова, Э.Н.Тимофеев, В.Л.Флорентьев._Синтез 5'-дезокси-5'-этоксикарбонилметилнуклеозидов - предшественников олигонуклеотидов с амидной межнуклеотидной связью C3'-NH-CO-CH2-C5'. Биоорган. химия, 35, 650-656 (2009).

4. А.М.Варижук, С.В.Кочеткова, Н.А.Колганова, Э.Н.Тимофеев, В.Л.Флорентьев. Аналоги олигонуклеотидов, содержащие межнуклеотидную связь C3'-NH-C(0)-CH2-C5'. Биоорган, химия, 36. N2. 215-222. (2010).

5. А. М. Варижук, С. В. Кочеткова, Н. А. Колганова, Э. Н. Тимофеев, В. Л. Флорентьев Новый класс модифицированных олигонуклеотидов с пептидной межнуклеотидной связью. Биоорган, химия. 2010. 36. N4. 570-573.(2010).

6. A. Varizhuk, S. Kochetkova, N. Kolganova, Е. Timopheev, and V. Florentiev. Oligonucleotide Analogs with Peptide Internucleotide Linkages. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 30. N1. 31-48. (2011).

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 08-04-01078).

Формат 60x90/16. Заказ 1406. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Варижук, Анна Михайловна

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Методы синтеза полиамидных ДНК-миметиков. (Обзор литературы).

1.1 .Методы синтеза пептидно-нуклеиновых кислот.

1.1.1. «Классические» ПНК.

1.1.2. «Хиральные» ПНК.

1.2. Методы синтеза аналогов олигонуклеотидов с амидными межнуклеотидными связями.

Глава 2. Олигонуклеотиды с пептидными межнуклеотидными связями. (Обсуждение результатов).

Глава 3. Экспериментальная часть.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аналоги олигонуклеотидов с пептидными межнуклеотидными связями"

Аналоги олигонуклеотидов находят широкое применение в диагностике и терапии вирусных и онкологических заболеваний, а также в исследованиях функций генов. В особую группу можно выделить аналоги, содержащие повторяющиеся амидные фрагменты. Среди них наиболее известны пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК) и олигонуклеотиды с амидными межнуклеотидными связями. ПНК изначально вызвали значительный интерес благодаря более высокому и специфическому (в сравнении с природными олигонуклеотидами) гибридизационному сродству к комплементарным фрагментам ДНК/РНК [1-7]. Однако их практическое применение осложнено низкой растворимостью в водных средах, затрудненным прохождением через клеточные мембраны и склонностью к самоагрегации. Ключом к решению перечисленных проблем стало введение в ПНК остатков хиральных аминокислот [8-11] (остов «классических» ПНК содержит лишь глициновые фрагменты), в частности амино- и карбокси-содержащих. Наличие положительно или отрицательно заряженных боковых групп позволяет регулировать гибридизацию путем изменения ионной силы и рН раствора. В более широком смысле встраивание в олигонуклеотидные аналоги аминокислот, содержащих боковые радикалы, можно рассматривать как метод функционализации ДНК для последующего присоединения репортерных групп или получения различных конъюгатов. Кроме того, дополнительная функционализация олигонуклеотидов может быть использована для повышения эффективности всевозможных катализаторов и лигандов на основе нуклеиновых кислот.

Целью данной работы была модификация олигонуклеотидов с амидными межнуклеотидными связями (структуры, в которых в отличие от ПНК сохранены рибозные остатки), аналогичная модификации «классических» ПНК, имевшей, как показано выше, принципиальное значение и обеспечившей данному направлению дальнейшее развитие. Разработка олигонуклеотидов с амидными межнуклеотидными связями велась практически параллельно разработке ПНК. Как и ПНК, олигонуклеотиды с амидными линкерами рассматриваются в качестве потенциальных терапевтических агентов, в частности регуляторов генной экспрессии [12, 13]. Несмотря на значительное разнообразие амидных модификаций межнуклеотидной связи, попыток введения боковых групп через амидсодержащие линкеры практически не предпринималось. Между тем, функционализация, открывающая возможность конъюгации с пептидами и маркирования (например, флуоресцентного маркирования для детектирования гибридизации [14-16]) могла бы повысить эффективность и расширить сферу применения таких аналогов. При этом функционализация не должна мешать собственно гибридизации.

В настоящей работе основные усилия были направлены на определение общей стратегии синтеза аналогов олигонуклеотидов со встроенными в межнуклеотидные связи остатками аминокислот, изучение гибридизационных свойств новых соединений и оценку возможности использования модификации данного типа для флуоресцентного маркирования олигонуклеотидов (на примере маркирования производными карбазола и пирена).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Варижук, Анна Михайловна

выводы

1. Получены потенциальные регуляторы генной экспрессии нового типа — аналоги олигонуклеотидов с пептидными межнуклеотидными связями.

2. Синтезированы и охарактеризованы олигонуклеотиды, содержащие пептидные линкеры на основе глицина, Ь- и Б- аланнина, Ь-и Б- фенилаланина, Ь-и Б-лизина.

3. Изучена зависимость гибридизационной способности модифицированных олигонуклеотидов от природы пептидного линкера. Показано, что модификации на основе Б-аланина и Б-лизина приводят к стабилизации дуплексов.

4. Продемонстрирована возможность флуоресцентного маркирования аналогов олигонуклеотидов по пептидным межнуклеотидным связям для детектирования гибридизации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Варижук, Анна Михайловна, Москва

1. Egholm М., Buchardt О., Christensen L., Behrens С., Freier S.M., Driver D.A., Berg R.H., Ют S.K., Norden В., Nielsen P.E. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen bonding rules. // Nature. 1993, 365, P. 556-568.

2. Uhlmann E., Peyman A., Breipohl G., Will D. W. PNA: Synthetic polyamide nucleic acids with unusual binding properties. // Angew. Chern. Int. Ed. 1998, 37, P. 2796-2823.

3. Giesen U., Kleider W., Berding C, Oram H., Nielsen P.E. A formula for thermal stability (Tm) prediction of PNA/DNA" duplexes // Nucleic Acids Res. 1998,26, P. 1601 -1620.

4. Ratilainen Т., Holmen A., Tuite E., Haaima G., Christensen L., Nielsen P. E., Norden В. Hybridization of peptide nucleic acid // Biochemistry. 1998, 37, P. 12331-12342.

5. Wang G., Xu Xiaoxin S. Peptide nucleic acid (PNA) binding-mediated gene regulation // Cell Research. 2004,14, P. 111-116.

6. Norden В., Ray A. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical application and promise for the future. // FASEB J. 2000,14, P. 1041-1060.

7. Nielsen P.E. Peptide Nucleic Acids (PNA) in chemical biology and drug discovery // Chem. Biodiversity. 2010, 7, P. 786-804.

8. Haaima G., Lohse A., Buchardt O., Nielsen P.E. Peptide Nucleic Acids (PNA) containing thymine monomers derived from chiral amino acids: Hybridization and solubility properties of D-lysine PNA. H Angewandte Chemie. 1996,35, P. 1939-1941.

9. Piischl A., Sforza S., Haaima G., Dahl О., Nielsen, P.E. Peptide Nucleic Acids (PNAs) with a functional backbone. II Tetrahedron Lett. 1998,39, P. 4707-4710.

10. Sforza S., Haaima G., Marchelli R., Nielsen P.E. Chiral peptide nucleic acids (PNAs): helix handedness and DNA recognition//Eur. J. Org. Chem. 1999, P. 197-204.

11. Sforza S., Corradini R., Ghirardi S., Dossena A. DNA binding of D-lysine-based chiral PNA: direction control and mismatch recognition // Eur. J. Org. Chem. 2000, P. 2905-2913.

12. Baker В. F., Monia В.P. Novel mechanisms for antisense-mediated regulation of gene expression. // Biochim. Biophys. Acta. 1999,1489 P. 3-18.

13. Micklefield J. Backbone modification of nucleic acids: synthesis, structure and therapeutic applications. // Curr. Med. Chem. 2001, 8, P. 1157-1179.

14. Afonina I.A., Reed M.W., Lusby E., Shishkina I.G., Belousov Y.S. Minor groove binder-conjugated DNA probes for quantitative DNA detection by hybridization-triggered fluorescence. // BioTechniques. 2002, 32, P. 940-949.

15. Nazarenko I., Pires R., Lowe В., Obaidy M., Rashtchian A. Effect of primary and secondary structure of oligonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. // Nucleic Acids Res. 2002, 30, P. 2089-2195.

16. Ikeda S., Kubota T., Yukin M., Yanagisawa M., Tsuruma S., Okamoto A. Hybridization-sensitive fluorescent DNA probe with self-avoidance ability // Org. Biomol. Chem. 2010, 8, P. 546-551.

17. Hyrup В., Nielsen P.E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 4, P. 5-23.

18. Анципович С.И. Пептидно-нуклеиновые кислоты: структура, свойства, применение, стратегии и практика химического синтеза. // Успехи химии. 2002, 71, № I, С. 81-95.

19. Shakeel S., Karim S., Ali A. Peptide nucleic acid (PNA) a review. Il J. Chem. Technol. Biotechnol. 2006, 81, P. 892-899.

20. De Mestmaeker A., Altmann K.-H., Waldner A., Wendeborn S. Backbone modifications in oligonucleotides and peptide nucleic acid systems. II Curr. Opin. Struct. Biol. 1995, 5, P. 343-355.

21. Agrawal S., Iyer R.P. Modified oligonucleotides as therapeutic and diagnostic agents. // Curr. Opin. Biotechnol. 1995,6, P. 12-19.

22. Freier S.M., Altmann K.-H. The ups and downs of nucleic acid duplex stability: structure-stability studies on chemically-modified DNA:RNA duplexes. // Nucleic Acids Res. 1997, 25, P. 4429-4443.

23. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a tliymine-substituted polyamide. // Science. 1991, 254, P. 14971500.

24. Ferrer E., Eisenhut M., Eritia R. A convenient route for the preparation nucleic acid monomers carrying acid-labile groups for the protection of the amino function. // LUWER/HSCOM. Letters in peptide science. 1999, 6, P. 209-219.

25. Thomson S. A., Josey J. A., Cadilla R., Gaul M. D., Hassman C. F., Luzzio M. J., Pipe A. J. Reed K. L., Ricca D. J., Wiethe R. W., Noble S. A. Fmoc mediated synthesis of peptide nucleic acids. // Tetrahedron. 1995, 51, P. 6179-6194.

26. Stetsenko D. A., Lubyako E. N., Potapov V. K., Azliikina T. L., Sverdlov E. D. New approach to solid phase synthesis of polyamide nucleic acids analogues (PNA) and PNA-DNA conjugates. // Tetrahedron Lett. 1996, 37, P. 3571-3574.

27. Breipohl G., Knolle J., Langner D., O'Malley G., Uhlmann E. The synthesis of polyamide nucleic acids (PNAs) using a novel Fmoc/Mmt protecting-group combination. // Bioorg. Med Chem. Lett., 1996, 6, P. 665-670.

28. Will D.W., Breipohl G., Langner D., Knolle J., Uhlmann E. The synthesis of polyamide nucleic acids using a novel monomethoxytrityl protecting-group strategy. // Tetrahedron. 1995,51, P. 12069-12082.

29. Mitsunobu O. The use of diethyl azodicarboxylate and triphenylphosphine in synthesis and transformation of natural products // Synthesis. 1981,16, P. 1-29.

30. Dueholm K.L., Eghohn M., Buchardt O. An efficient synthesis of Boc-aminoacetaldehyde and its application to the synthesis of N-(2-Boc-aminoethyI)glycine esters. // Org. Prep. Proced. Int. 1993,25, P. 457-461.

31. Finn P. J., Gibson N. J., Fallon R., Hamilton A., Brown T. Synthesis and properties of DNA-PNA chimeric oligomers. // Nucleic Acids Res. 1996, 24, P. 3357 3363.

32. Kosynkina L., Wang W., Chyan Liang T. A convenient synthesis of peptide nucleic acid (PNA) monomers. //Tetrahedron Lett. 1994, 35, P. 5173 -5176.

33. Christensen L, Fitzpatrick R., Gildea B., Peterson K.H., Hansen H.F., Koch T., Egholm M., Buchart O., Nelson P.E., Coull J., Berg R.G. Solid-phase synthesis of peptide nucleic acids. // J. Pept. Sci. 1995, 3, P. 175-183.

34. Koch T., Hansen H.F., Andersen P., Larsen T., Batz H.G., Ottesen K., Oram H. Improvements in automated. PNA synthesis using Boc/Z monomers. // J. Pept. Res., 1997, 49, P. 80-88.

35. Aldrian-Herrada G., Rabie A., Winersteiger R., Brugidou J. Solid-phase synthesis of peptide nucleic acid (PNA) monomers and their oligomerization using disulphide anchoring linkers. II J. Pept. Sci. 1998, 4, P. 266-281.

36. Casale R., Jensen I.S., Egholm M. Sinthesis of PNA oligomers by Fmoc chemistry. In Peptide nucleic acids: protocols and applications. (Eds Nielsen P.E., Egholm M.). Horizon Scientific Press, Wymondham, 1999. P. 39.

37. Bergmann F., Bannwarth W., Tam S. Solid phase synthesis of directly linked PNA-DNA-hybrids. // Tetrahedron Lett. 1995, 36, P. 6823-6826.

38. Kocienski P. Protecting Groups. Georg Thieme, Stuttgart, 1994.

39. Sonveaux E.Jn Protocols for Oligonucleotides Conjugates, Methods in Molecular Biology, V. 26, (Ed. S. Agrawal), Humana Press, Totowa, 1994, P. 1-12.

40. Timar Z., Kovacs L., Kovacs G., Schmel Z. Fmoc/aeyl protecting groups in the synthesis of polyamide peptide nucleic acid monomers. II J. Chem. Soc. Perkin Trans.I. 2000,1, P. 19-26.

41. Kuwahara M., Arimitsu M, Sisido M. Novel peptide nucleic acid that shows high sequence specificity and all-or- none-type hybridization with the complementary DNA. // J. Am. Chem. Soc. 1999,121, P. 256-257.

42. Breipohl G., Will D.W., Peyman A., Uhlmann E. Novel synthetic routes to PNA monomers and PNA-DNA linker molecules. // Tetrahedron. 1997,53, P. 14671-14686.

43. Efimov V.A., Choob M.V., Buryakova A.A., Chakhmakhcheva O.G. Synthesis and binding study of phosphonate analogs of PNAs and their hybrids with PNAs. // Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids. 1998,17, P. 1671-1679.

44. Efimov V.A., Choob M.V., Buryakova A.A, Kalinkina A.L., Chakhmakhcheva O.G. Synthesis and evaluation of some properties of chimeric oligomers containing PNA and phosphono-PNA residues. II Nucl. Acids Res. 1998, 26, P. 566-576.

45. Coste J., Le-Nguyen D., Castro B. PyBOPR: a new peptide coupling reagent devoid of toxic by-product. // Tetrahedron Lett. 1990, 31 (2), P. 205-208.

46. Carpino L.A. The 9-fluorenylmethoxycarbonyl family of base-sensitive amino- protecting groups. // Acc. Chem. Res. 1987, 20, P. 401-407

47. Uhlmann E., Will D.W., Breipohl G., Langner D., Ryte A. Synthesis and properties of PNA/DNA chimeras. IIAngew. Chem., Int. Ed. Engl. 1996,35, P. 2632-2635.

48. Van der Laan A.C., Brill R., Kuimelis R.G., Kuyl-Yeheskiely E., van Boom J.H. Andrus A., Vinayak R. A convenient automated solid-phase synthesis of PNA-(5')-DNA-(3')-PNA chimera. // Tetrahedron Lett. 1997, 38, P. 2249-2252.

49. Van der Laan A.C., Meeuwenoord N.J., Kuyl-Yeheskiely E., Oosting R.S., Brands R., van Boom J.H. Solid support synthesis of a PNA-DNA hybrid. // Trav. Chim. Pays-Bas. 1995, 114, P. 295-297.

50. Eriksson M, Christensen L., Schmidt J., Haaima G., Orgel L., Nielsen P.E. Mechanisms and kinetics of N-terminal degradation at high pH. // New J. Chem. 1998, 22, P. 1055-1059.

51. Le-Nguyen D., Heitz A., Castro B. Renin substrates. Part 2. Rapid solid phase synthesis of the ratine sequence tetradecapeptide using BOP reagent. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1. 1987, P. 1915-1919.

52. Schnolzer M, Alewood P., Jones A., Alewood D., Kent S.B. In situ neutralization in Boc-chemistry solid phase peptide synthesis. Rapid, high yield assembly of difficult sequences. // Int. J. Pept. Protein Res. 1992, 40, P. 180-193.

53. Koch T., Naesby M., Wittung P., Jorgensen M., Larsson C., Buchardt O., Stanley C.J., Norden B., Nielsen P.E., 0rum H. PNA-peptide chimera. // Tetrahedron Lett. 1995, 36, P. 6933-6936.

54. Scarfi S., Gasparini A., Damonte G., Benatti U. Synthesis, uptake, and intracellular metabolism of a hydrophobic tetrapeptide-peptide nucleic acid (PNA)-biotin molecule. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997, 236, P. 323-326.

55. Lesignoli F., Germini A., Corradini R., Sforza S., Galaverna G., Dossena A., Marchelli R. Application of mixed partition-adsorption systems in high-performance liquid chromatography of purines and pyrimidines. // J. Chrom. A. 2001, 922, P. 177-185.

56. Lenzi A., Reginato G., Taddei M., Trifllieff E. Solid phase synthesis of a self complementary (antiparallel) chiral peptidic nucleic acid strand. // Tetrahedron Lett. 1995, 36, P. 1717-1718.

57. Mayfild L.D., Corey D. R. Automated synthesis of peptide nucleic acids (PNAs) and peptide nucleic acid-peptide conjugates. II Anal. Biochem. 1999, 268, P. 401-404.

58. Hyunil L., Jae Hoon J., Jong Chan L., Hoon C.,Yeohong Y., Sung Kee K. Peptide nucleic acid synthesis by novel amide formation. // Org. Lett. 2007, 9 (17), P. 3291-3293.

59. Inoue T., Joyce G.F., Grzeskowiak D., Orgel L.E., Brown J.M., Reese C.B. Template-directed synthesis on the pentanucleotide CpCpGpCpC. // J. Mol. Biol. 1984, 178, P. 669676.

60. Yon Kiedrowski G. A self-replicating hexadeoxynucleotide. 11 Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1986, 25, P. 932-935.

61. Li X.; Zhan Z.-Y.; Knipe R.; Lynn D. G. DNA-catalyzed polymerization. // J. Am. Chem. Soc. 2002,124, P.746-747.

62. Xu Y,, Karalkar N.B., Kool E.T. Nonenzymatic autoligation in direct three-color detection of RNA and DNA point mutations. II Nat. Biotechnol. 2001,19, P. 148-152.

63. Chen J.J., Cai X., Szostak J.W. N2'—>p3' phosphoramidate glycerol nucleic acid as a potential alternative genetic system. // J. Am. Chem. Soc. 2009,131, P. 2119-2121.

64. Rosenbaum D.M., Liu D.R. Efficient and sequence-specific DNA-templated polymerization of peptide nucleic acid aldehydes. II J. Am. Chem. Soc. 2003,125, P. 13924-13925.

65. Ura Y., Beierle J.M., Leman L.J., Orgel L.E., Ghadiri M.R. Self-assembling sequence-adaptive peptide nucleic acids. // Science. 2009, 325, P. 73-77.

66. Heemstra J.M., Liu D.R. Templated synthesis of peptide nucleic acids via sequence-Selective base-filling reactions. II J. Am. Chem. Soc. 2009,131(32), P. 11347-11349.

67. Ganesh K.N., Nielsen P.E. Peptide nucleic acids: analogs and derivatives. // Curr. Org. Chem. 2000, 4, 931-943.

68. Beck F., Nielsen P.E., Peptide nucleic acid (PNA): a DNA mimic with a pseudopeptide backbone. In Artificial DNA: Methods and Applications, Eds. Khudyakov Y.E., Fields H. A. CRC Press LLC, Boca Raton, 2003, Chapter 3.

69. Kehler J., Henriksen U., Vejbjerg H., Dahl O. Synthesis and hybridization properties of an acyclic achiral phosphonate DNA analogue. // Bioorg.Med. Chem. 1998, 6, P. 315—322.

70. Peyman A., Uhlmann E., Wagner K., Augustin S.,Weiser C., Will D., Breipohl G. PHONA -PNA Co-oligomers: nucleic acid mimetics with interesting properties. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl 1997,36, P. 2809-2812.

71. Pokorski J.K., Witschi M.A., Purnell B.L., Appella D.H., (S,S)-Trans-cyclopentane-constrained peptide nucleic acids. A general backbone modification that improves binding affinity and sequence specificity. II J. Am. Chem. Soc. 2004,126, P. 15067-15073.

72. Gangamani В., Kumar V., Ganesh К. Synthesis of Na-(purinyl/pyrimidinyl acetyl)-4-aminoproline diastereomers with potential use in PNA synthesis. // Tetrahedron. 1996, 52. P. 15017-15030.

73. Ефимов B.A., Авралов A.B., Чахмачева О.Г. Миметики на основе пирролидина и гидроксипролина. // Биоорг. химия. 2010, 36 (6), стр. 725—746.

74. Falkiewicz В., Kowalska К., Kolodziejczyk A.S., Wisniewski К., Lankiewicz L. Synthesis of new chiral nucleic acid (PNA) monomers by a simplified reductive animation method // Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids. 1999,18 (3), P. 353-361.

75. Falkiewicz В., Wisniowski W., Kolodziejczyk A.S., Wisniewski K., Lankiewicz L. Synthesis and characterization of new chiral peptide nucleic acid (PNA) monomers. // Nucleic Acids Symposium Series. No. 42, P. 29-30

76. Dragulescu-Andrasi A., Zhou P., He G., Ly D.H. Cell-permeable GPNA with appropriate backbone stereochemistry and spacing binds sequence-specifically to RNA. // Chem. Commun. 2005, P. 244-246.

77. Totsingan F., Tedeschi Т., Sforza S., Corradini R., Marchelli R. Highly selective single nucleotide polymorphism recogniton by a chiral (5S) PNA beacon. // Chirality. 2009, 21, P. 245-253.

78. Sforza S., Tedeschi Т., Corradini R., Dossena A., Marchelli R. Direction control in DNA binding of chiral D-lysine-based peptide nucleic acid (PNA) probed by electrospray mass spectrometry. // Chem. Commun. 2003, 9, P. 1102-1103.

79. Lioy E., Kessler H. Synthesis of a new chiral peptide analogue of DNA using ornithine subunits and solid-phase peptide synthesis methodologies. // LiebigsAnn., 1996, P. 201-204.

80. Dzimbova T., Pajpanova T., Synthesid of different types of PNAs, containing chiral pseudopeptide backbone. // Trakia Journal of Sciences. 2010, 8, Suppl. 2, P. 98-101.

81. Zhang L.G., Min J.M., Zhang L.H. Synthesis of two new chiral blocks for the construction of peptide nucleic acid (PNA). // Chinese Chemical Letters. 1999,10 (3), P. 195-198.

82. Falkiewicz B. Koiodziejczyk A. S., Liberek B., K. Wisniewski. Synthesis of achiral and chiral nucleic acid (PNA) monomers using Mitsunobu reaction. // Tetrahedron, 2001, 57, P.7909-7917.

83. Hu H„ Goon H.J., Sung R.C., Su N.K., Yong T.K., Chwang S.P., Joon H.H., Wonjae L. Synthesis of enantiopure r-glutamic acid fiinctionalized peptide nucleic acid monomers. // Bull. Korean Chem. Soc. 2010, 31 (7), P. 2054-2056.

84. Sforza S., Tedeschi T., Corradini R., Ciavardelli D., Dossena A., Fast R.M. Solid-phase synthesis of chiral peptide nucleic acids with a high optical purity by a submonomeric strategy. //Eur. J. Org. Chem. 2003, 6, P. 1056-1063.

85. De Mestmaeker A., Waldner A., Sanghvi Y.S., Lebreton J. Comparison of rigid and flexible backbones in antisense oligonucleotides. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4 (3), P.395-398.

86. De Mestmaeker A., Lebreton J., Waldner A., Fritsch V., Wolf R.M. Replacement of phosphodiester linkage in oligonucleotides: comparison of two structural amide isomers. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4 (7), P. 873-878.

87. Lebreton J., Waldner A., Fritsch V., Wolf R.M., De Mestmaeker A. Comparison of two amides as backbone replacement of phosphodiester linkage in oligodeoxynucleotides. // Tetrahedron Lett. 1994, 35 (29), P. 5225-5228.

88. Stirchak E.P., Summerton J.E., Weller D.D. Uncharged stereoregular nucleic acid analogues. Synthesis of a cytosine-containing oligomer with carbamate internucleoside linkages. // J. Org. Chem. 1987, 52, P. 4202-4206.

89. Habus I., Temsamani J., Agrawal S. Synthesis of di-, tri-, and tetrameric building blocks with novel carbamate internucleoside linkages and their incorporation into oligonucleotides. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4 (8), P. 1065-1070.

90. Waldner A., De Mestmaeker A., Lebreton J. Synthesis of oligodeoxyribonucleotides containing dimers with carbamate moieties as replacement of the natural phosphodiester linkage. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4 (3), P. 405-408.

91. Ramasamy K.S., He L., Stoisavljevic V., Harpham B., Seifert W. Synthesis and biophysical studies of oligonucleotides containing hydroxamate linkages. // Tetrahedron Lett. 2000, 41, P. 4317-4321.

92. Waldner A., De Mestmaeker A., Lebreton J., Fritsch V., Wolf R.M. Ureas as backbone replacements for the phosphodiester linkage in oligonucleotides. // Synlett. 1994, P. 57-61.

93. Vandendriessche F., Voortmans M., Hoogmartens J., Van Aerschot A., Herdewijn P. Synthesis of novel N-substituted guanidine linked nucleoside dimers and their incorporation into oligonucleotides // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993,3 (2), P. 193-198, 1993.

94. Garegg P.J., Samuelsson B. Oxidation of primary and secondary alcohols in partially protected sugars with the chromium trioxide-pyridine complex in the presence of acetic anhydride. // Carbohyd. Res. 1978, 67, P. 267-270.

95. Lu D.-M., Min J.-M., Zhang L.-H. Synthesis of l-(5-amino-3,5-dideoxy-3-methoxycarbonylmethyl-p-D-ribofuranosyl)thymine. HCarbohyd. Res. 1999, 317. P. 193— 197.

96. Morris P.E., Kiely D.E. Ruthenium tetraoxide phase-transfer-promoted oxidation of secondary alcohols to ketones. II J. Org. Chem. 1987, 52, P. 1149-1152.

97. Von Matt P., Lochmann T., Kesselring R., Altmann K.-H. An expeditious synthesis of 3"-a-carboximethyl-2,-0-methyl rybonucleosides. // Tetr ahedron Lett. 1999, 40. P.1873-1876.

98. Lebreton J., De Mestmaeker A., Waldner A., Fritsch V., Wolf R.M., Frier S.M. Synthesis of thymidine dimer derivatives containing an amide linkage and their incorporation into oligodeoxyribonucleotides. II Tetrahedron Lett. 1993, 34 (40), P. 6383-6386.

99. Robins M.J., Sarker S., Xie M., Zhang W„ Peterson M.A. Synthesis of 2,,3<-fused(3.3.0)y-butyrolacton-nucleosides and coupling with amino-nucleosides to give amide-linked nucleotide-dimer analogues. // Tetrahedron Lett. 1996,37 (23), P. 3921-3924.

100. De Mestmaeker A., Lebreton J., Waldner A., Fritsch V., Wolf R.M., Freier S.M. Amides as substitute for the phosphodiester linkage in antisense oligonucleotides. // Synlett. 1993, P. 733-736.

101. Rozners E., Katkevica D., Bizdena E., Stromberg R. Synthesis and properties of DNA analogues as interuridine linkages at selected positions. // J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, P. 12126-12136.

102. Lebreton J., Waldner A., Lesueur C., De Mestmaeker A. Antisense oligonucleotides with alternating phospodiester-«amide-3» linkages. // Synlett. 1994, 41, P. 137-140.

103. Idziak I., Just G., Damha M.J., Giannaris P.A. Synthesis and hibridisation properties of amide-linked thimidine dimers. Incorporation into oligonucleotides. // Tetrahedron Lett. 1993,34, P. 5417-5420.

104. Peterson M.J., Nilsson B.L., Sarker S., Doboszewski B., Zhang W., Robins M.J. Amide-linked ribonucleoside dimmers derived from 5" -amino-5' -deoxv and 3' -(carboxymethyl)-3' -deoxynucleoside precursors. II J. Org. Chem. 1999, 64, P. 8183-8192.

105. Robins M.J., Doboszewski B., Nilsson B.L., Peterson M.A. Synthesis of amide-linked (3'CH2CO-NH(5'). nucleoside analogues of small oligonucleotides. // Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids. 2000,199(1 &2), P. 69-86.

106. Dias N., Stein C.A. Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms. // Molecular Cancer Therapeutics. 2002,1, P. 347—355.

107. Hajeri P.B., Singh S.K. siRNAs: their potential as therapeutic agents Parti. Designing of siRNA. // Drug Discovery Today. 2009,14 (17/18), P. 851-858

108. Rozners E. Carbohydrate chemistry for RNA interference: synthesis and properties of RNA analogues modified in sugar-phosphate backbone. // Curr. Org. Chem. 2006, 10, P. 675-692

109. Inoue H, Hayase Y, Imura A, Iwai S, Miura K, Ohtsuka E. Synthesis and hybridization studies on two complementary nona(2'-0-methyl)ribonucleotides. I I Nucleic Acids Res. 1987, 15, P. 6131-6148.

110. Robins M.J., Doboszewski B., Timoshchuk V.A., Peterson M.A. // Glucose-derived 3'-(carboxymethyl)-3"-deoxyribonucleosidcs and 2\3"-lactones as synthetic precursors for amide-linked oligonucleotide analogues. // J. Org. Chem. 2000, 65, P. 2939-2945.

111. Lavallee J.-F., Just G. Asymmetric synthesis of 3'-deoxythymidine via radical cyclization. // Tetrhedron Lett. 1991, 32 (29), P. 3469-3472.

112. Wendeborn S., Nussbaumer H., Robert F., Jorg M., Pachlatko J.P. Towards novel amide-modified oligonucleotides: asymmetric synthesis of 5" -(S)-methyl-3 " -carboxymethylene-3'-deoxythymidine. // Tetrhedron Lett. 2002, 43, P. 5461-5464.

113. Rozners E., Xu Q. Total synthesis of 3',5'-C-branched nucleosides. // Org. Lett. 2003, 5 (21), P. 3999-4001.

114. Rosners E., Liu Y. Monomers for preparation of amide-linked RNA: asymmetric synthesis of all four nucleoside S'-azido-S'-carboxylic acids. // J. Org. Chem. 2005, 70, P. 9841-9848.

115. Von Matt P., De Mestmaeker A., Pieles U., Zurcher W., Altmann K.-IT. 2,-Deoxyribo-PNAs: a structurally novel class of polyamide nucleic acids with good RNA and DNA binding affinity. // Tetrahedron Lett. 1999, 40, P. 2899-2902.

116. Vorbruggen H., Lagoja I.M., Herdewijn P. Synthesis of ribonucleosides by condensation using trimethylsilyl triflate. // Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. Eds Glick G.D., Jones R.A. Wiley Intersciense, Chapter 1. Unit 1.13.

117. Pierce T.L., White A.R., Tregear G.W., Sexton P.M. Peptide-oligonucleotide hybrids in antisense therapy. // Mini-Rev. Med. Chem. 2005, 5, P. 41-55.

118. Venkatesan N., Kim B.H. Peptide conjugates of oligonucleotides: synthesis and applications. // Chem. Rev. 2006,106, P. 3712-3761.

119. Juliano R., Md. Alam R., Dixit Y., Kang H. Mechanisms and strategies for effective delivery of antisense and siRNA oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2008, 36(12), P. 4158-4171.

120. Murao S., Fujii M. Organic synthesis and antisense effects of oligonucleotide-peptide conjugates. // Curr. Org. Chem. 2009,13, P. 1366-1377.

121. Epp J.B., Widlanski T.S. Facile preparation of nucleoside-5'-carboxylic acids. // J. Org. Chem. 1999, 64(1), P. 293-295.

122. Maclaren J.A. Amino acids and peptides. V. The alkaline saponification of N-Benzyloxy-carbonyl peptide esters. // Aust. J. Chem., 1958,11(3), P. 360-365.

123. Hashimoto H.; Nelson M.G.; Switzer C. Formation of chimeric duplexes between zwitterionic and natural DNA. II J. Org. Chem. 1993, 58, P. 4194-4195.

124. Bijapur J., Keppler M.D., Bergqvist S., Brown T., Fox K.R. 5-(l-Propargylammo)-20-deoxyuridine (u-p): a novel thymidine analogue for generating DNA triplexes with increased stability.// Nucleic Acids Res. 1999, 27, P. 1802-1809.

125. Sollogoub M., Darby R.A.J., Cuenoud B., Brown T., Fox K.R. Stable DNA triple helix formation using oligonucleotides containing 20-aminoethoxy,5-propargylamino-U. // Biochemistry. 2002, 41, P. 7224-7231.

126. Heystek L.E., Zhou H.Q., Dande P., Gold B. Control over the localization of positive charge in DNA: the effect on duplex DNA and RNA stability. // J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, P. 12165-12166.

127. Molina J., Maslen H.L., Simons C. Methyl 5-<9-benzoyl-2,3-oxazole-D-ribofuranose: a useful intermediate for the synthesis of conformationally restricted nucleosides. // Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids. 2001, 20, P. 981-983.

128. Tor Y. (ed.), Fluorescent nucleoside analogs: synthesis, properties and applications. // Tetrahedron. 2007, 63 (17), P. 3415-3614.

129. Printz M., Richert C. Optimizing the stacking moiety and linker of 2'-acylamido caps of DNA duplexes with 3'-terminal adenine residues. // J. Comb. Chem. 2007, 9 (2), P. 306-320.

130. Wang G., Bobkov G. V., Mikhailov S. N., Schepers G., Van Aerschot A., Rozenski J., Van der Auweraer M., Herdewijn P., De Feyter S. Detection of RNA Hybridization by Pyrene-Labeled Probes. II ChemBioChem. 2009,10, P. 1175 1185.

131. Hwang G.T., Seo Y.J., Kim S.J., Kim B.H. Fluorescent oligonucleotide incorporating 5-(l-ethynylpyrenyl)-2'-deoxyuridine: sequence-specific fluorescence changes upon duplex formation. // Tetrahedron Lett. 2004, 45, P. 3543-3546.

132. Smalley M.K., Silverman S.K. Fluorescence of covalently attached pyrene as a general RNA folding probe. // Nucleic Acids Res. 2006, 34 (1).

133. Okamoto A., Kanatani K., Saito I. Pyrene-labeled base-discriminating fluorescent DNA probes for homogeneous SNP typing. II J. Am. Chem. Soc. 2004,126 (15), P. 4820^1827.

134. Yamana K., Ohtani Y., Nakanoa H., Saito I. Bis-Pyrene Labeled DNA Aptamer as an Intelligent Fluorescent Biosensor. II Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13. P. 3429-3431.

135. Tanious F.A., Ding D., Patrick D.A., Bailly C., Tidwell R.R., Wilson W.D. Effects of compound structure on carbazole dication-DNA complexes: tests of the minor-groove complex models. II Biochemistry. 2000, 39, P. 12091-12101.

136. Tanious F.A., Wilson W.D., Patrick D.A., Tidwell R.R., Colson P., Houssier C., Tardy C., Bailly Sequence-dependent binding of bis-amidine carbazole dications to DNA. // Eur. J. Biochem. 2001, 268 (12), P. 3455-3464.

137. Wilson J.N., Cho Y., Tan S., Cuppoletti A., Kool E.T. Quenching of fluorescent nucleobases by neighboring DNA: the "insulator" concept. // ChemBioChem. 2008, 9, P. 279-285.

138. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 08-04-01078).