Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ взаимодействия генов при скрещивании низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5 и высокопродуктивного штамма вируса гриппа человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ взаимодействия генов при скрещивании низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5 и высокопродуктивного штамма вируса гриппа человека"

на правах рукописи

КОЧЕРГИН-НИКИТСКИЙ КОНСТАНТИН СЕРГЕЕВИЧ

АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЕНОВ ПРИ СКРЕЩИВАНИИ НИЗКОПАТОГЕННОГО ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ ПОДТИПА Н5 И ВЫСОКОПРОДУКТИВНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА ЧЕЛОВЕКА

03 00 03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003160889

Москва-2007

003160889

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Научный руководитель: Доктор медицинских наук, академик РАМН

Каверин Николай Вениаминович.

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор

Альтштейн Анатолий Давидович

Доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна

Ведущая организация:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи РАМН

Защита состоится « 29 » о КТ* 2007 г в /<? часов на

заседании диссертационного Совета Д 001 020 01 при ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН (адрес 123098 Москва, ул Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ Вирусологии им Д И Ивановского РАМН

Автореферат разослан « 24 сентября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного Совета Доктор медицинских наук

НП Косякова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Одним из распространенных возбудителей вирусных заболеваний человека и животных является вирус гриппа Существуют три типа вируса гриппа А, В, С Они принадлежат к одному семейству, образуя отдельные роды Вирусы гриппа В и С поражают преимущественно людей, тогда как вирус гриппа А обладает широким кругом хозяев Вирус гриппа А, в отличие от вирусов гриппа В и С, вызывает не только локальные вспышки и сезонные эпидемии, но и глобальные пандемии, охватывающие весь земной шар и случающиеся с интервалом 10 — 40 лет, когда болеют миллионы и десятки миллионов человек

Вирус гриппа А характеризуется большой вариабельностью Наиболее подвержены изменениям поверхностные гликопротеины вириона -гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA) Известны два пути изменения Первый - антигенный дрейф, присущий в основном вирусам гриппа человека В человеческой популяции на вирус давит коллективный иммунитет, и мутации, позволяющие вирусу преодолеть иммунитет, дают ему серьезное преимущество и закрепляются В итоге антигенные варианты сменяют друг друга Второй путь - антигенный сдвиг или шифт (от англ Shift - сдвиг, изменение), то есть изменение антигенной формулы из-за замены гена и соответствующего белка в результате реассортации генов, которая может происходить при совместной инфицировании двумя и более вирусами В результате вирус может полностью выйти из под давления иммунитета и вызвать эпидемию или даже пандемию

Последнее время большую озабоченность вызывают вирусы гриппа А подтипа H5N1, вызывавшие эпизоотии у птиц в юго-восточной Азии, а также вспышки в других регионах мира Некоторые из них проявили способность передаваться человеку, вызывая тяжелое, часто смертельное заболевания И хотя пока эти вирусы, похоже, неспособны передаваться от человека к человеку в массовом порядке, ситуация может измениться Для этого достаточно нескольких мутаций или скрещивания с вирусами гриппа человека, например, в случае возникновения обычной вспышки гриппа в регионе, где отмечаются случаи заражения людей вирусом гриппа птиц H5N1

Человечество, преодолевшее не одну пандемию гриппа, может столкнуться с гораздо более тяжелой ситуацией при возникновении пандемии, вызванной вирусами подтипа H5N1, обладающими особыми свойствами, позволяющими вирусу поражать многие ткани организма и вызывать тяжелейшую инфекцию Так смертность с 1997 г в мире от этих вирусов среди людей составила -60% (199 случаев из 327 заболевших) ^

Вероятность возникновения пандемии, вызванной вирусом подтипа Н5, достаточно велика, и поэтому весьма актуальна проблема получения высокопродуктивных и иммуногенных вирусов-реассортантов, имеющих гемагглютинин подтипа Н5 и пригодных для продукции вакцин Однако из-за особенностей НА подтипа Н5 эти вирусы зачастую столь «агрессивны», что с ними трудно и опасно работать Все же, попытки создать вакцины на основе реассортангных вирусов с модифицированным для снижения вирулентности гемагглютинином были предприняты в разных странах [1ли е1 а1, 2006, Нойпшш й а1, 2002] Продуктивность таких реассортангных штаммов часто не достигает значений, характерных для обычных вакцинных штаммов, хотя и превосходит продуктивность патогенного вируса Н5Ш Низкий уровень накопления вообще часто встречается у реассортантов вируса гриппа человека и вируса гриппа птиц в связи с неполным функциональным соответствием вирусных генов [11ш1пеуа е1 а1,1993, МИиаи1 й а1, 2000]

Среди природных вирусов, содержащих НА подтипа Н5, имеются варианты, у которых иммунная специфичность НА близка к таковой у высокопатогенных вирусов Н5КИ, но сам белок не столь легко разрезается протеазами Эти вирусы не обладают высокой патогенностью Такие штаммы выделены на территории России сотрудниками отдела экологии НИИ вирусологии им ДИ Ивановского Благодаря относительной безопасности в работе и близкому иммунологическому сходству с высокопатогенными вирусами подтипа Н5 они могут быть использованы для выявления причин ограничения продуктивности реассортантов и для разработки научных подходов к оптимизации вакцинных штаммов

В связи с важностью получения данных о механизмах, обуславливающих вариации репродуктивных свойств реассортантов, содержащих НА подтипа Н5, особую актуальность приобретает исследования тех свойств реассортангных вирусов, которые определяются взаимодействием генов, полученных от разных вирусов-родителей и которые ограничивают продуктивность реассортантов Этим обусловлена актуальность исследований, выполненных в рамках настоящей работы

Цели и задачи исследования

Целями данной работы были получение и характеристика реассортантных вирусов, получивших гены поверхностных белков от низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5, а гены внутренних белков от высокопродуктивного вируса гриппа человека, исследование постреассортационного взаимодействия генов, оптимизация генного состава высокопродуктивных реассортантов и

определение эффективности реассортантов в опытах перекрестной иммунной защиты в отношении вируса подтипа H5N1

Для достижения поставленных целей было необходимо решить следующие задачи

1 Получить набор реассортантов низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5 и высокопродуктивного вируса гриппа человека

2 Провести характеристику генного состава полученных реассортантов

3 Провести оптимизацию генного состава реассортантов и селекцию высокопродуктивных вариантов

4 Исследовать фенотипические свойства реассортантов и их вариантов

5 Определить иммуногенность реассортантов в опытах перекрестной иммунизации на мышах

Научная новизна и практическое значение

В ходе настоящей работы, путем скрещивания вируса гриппа человека A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (вариант Mount Sinai) и вируса гриппа птиц A/Duck/ Pnmone/2621/01 (H5N2) были получены реассортанты, получившие либо только НА, либо оба поверхностных белка от вируса H5N2 Проведена характеристика их фенотипических свойств продуктивности при заражении эмбрионов кур, вирулентности для мышей, сродства НА к сиаловым рецепторам, иммуногенности в опытах перекрестной иммунной защиты на мышах в отношении вируса, содержащего НА и NA современного вируса подтипа H5N1 Проведена оптимизация генного состава реассортансга посредством обратного скрещивания, существенно повысившая продуктивность вируса

Полученные реассортанты обладают некоторыми характеристиками штамма, пригодного для получения инактивированной вакцины Они безопасны, поскольку не содержат высокорасщепляемого НА, придающего вирусам Н5 такую высокую вирулентность При этом они высокопродуктивны, хотя и уступают в этом отношении вирусу-родителю A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) Полученные данные указывают на реальную возможность использования низковирулентных штаммов подтипа Н5 для получения реассортантов, пригодных для применения в качестве штаммов для производства инактивированных или субъединичных вакцин для использования в случае появления в человеческой популяции высокопатогенного штамма подтипа Н5, обладающего пандемическим потенциалом Данные указывают на необходимость детальной антигенной характеристики низкопатогенных вирусов подтипа Н5, выделяемых в Евразии, в особенности на территории Российской Федерации, в связи с потенциальной возможностью их

использования в качестве вирусов-родителей для получения реассорташных вакцинных штаммов При использовании таких вирусов отпадает необходимость в применении дорогих и сложных генно-инженерных методов для снижения патогенности вируса путем устранения пептида в участке разрезания НА Несмотря на неполное соответствие антигенной специфичности НА низкопатогенных вирусов подтипа Н5 и высокопатогенных вирусов H5N1, реассортанты такого типа могли бы использоваться в качестве «баррикадной» вакцины по Килбурну [Kilbourne, 2004] для уменьшения смертности при первой волне пандемии

Важным аспектом нашей работы является повышение продуктивности реассортантов в результате оптимизации его генного состава Применение для этой цели метода обратного скрещивания может оказаться полезным для получения высокопродуктивных штаммов-кандидатов для инактивированных и субъединичных вакцин против вероятного возбудителя пандемии гриппа Такой подход может быть применен не только к реассортантам, полученным методом скрещивания и селекции, но и к вирусам, полученным с использованием генно-инженерной техники, для оптимизации их генного состава

Таким образом, полученные результаты расширяют представления о взаимодействии генов вирусов гриппа А при реассортации и должны учитываться в будущем при проведении исследований практического характера, направленных на создание и усовершенствование вакцинных штаммов, которые будут направлены против вероятных возбудителей будущих пандемий гриппа

Основные положения, выносимые на защиту

1 В результате получения и характеристики набора реассортантов установлено, что реассортант, содержащий гены гемагглютинина и нейраминидазы вируса A/Duck/Pnmone/2621/01 (H5N2) и 6 генов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) имеет более высокую продуктивность, чем вирус A/Duck/Pnmone/2621/01 (H5N2), но уступает вирусу A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) Реассортант, имеющий ген гемагглютинина вируса A/Duck/Рпшonе/2621/01 (H5N2) и 7 генов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), имеет низкую продуктивность Селекция методом серийного пассирования позволила получить вариант, сходный по продуктивности с реассортантом, содержащим 6 генов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) Повышение продуктивности коррелирует со снижением аффинности к сиалосодержащим субстратам, вызванным аминокислотной заменой N244D в субъединице НА1

2 Наиболее высокопродуктивен реассортант, содержащий гены гемагглютинина, нейраминидазы и РВ1 вируса A/Duck/Pnmone/2621/Ol (H5N2) и остальные 5 генов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)

3 Все полученные и охарактеризованные реассортанты обладают вирулентностью для мышей при интраназальном заражении, близкой к вирулентности вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и намного превосходящей вирулентность вируса A/Duck/Primorie/2621/01 (H5N2), что указьшает на связь ограничения вирулентности для мышей вируса A/Duck/Pnmorie/2621/01 (H5N2) с иными генами, нежели гены гемагглютинина, нейраминидазы и РВ1

4 Реассортант, содержащий ген гемагглютинина вируса A/Duck/Pnmone/2621/01 (H5N2), обеспечивает перекрестную иммунную защиту против вируса-реассортанта, содержащего ген гемагглютинина современного высокопатогенного вируса подтипа H5N1, близкую по эффективности к защите гомологичным вирусом

5 Полученные данные позволяют предложить новый подход к оптимизации генного состава реассортантных вирусов, предназначенных для использования в качестве штаммов для инактивированных вакцин против вирусов, содержащих гемагглютинины вирусов гриппа плиц Результаты указывают на перспективность применения инактивированных вакцин, содержащих гемагглютинин низкопатогенных вирусов гриппа плиц подтипа Н5 без генно-инженерной модификации

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ Вирусологии им Д И Ивановского РАМН 13 сентября 2007 г

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, том числе 2 статьи в реферируемых научных журналах Одна статья принята в печать

Объем и структура диссертации

Диссертация написана на 140 печатных страницах, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов Диссертация содержит 12 таблиц и 5 рисунков Список использованной литературы содержит 301 отечественный и зарубежный источник

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вирусы.

Вирус гриппа птиц A/Duck/Primorie/2621/2001 (H5N2) [Львов с соавт, 2003, 2004] получен из отдела экологии, а вирусы

А/Шск/Ргшюпе/2633/2001 (H5N3) и A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), вариант Mount Smai, были получены из коллекции НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН Реассортантный вирус VNH5N1-PR8/CDC-RG, содержащий гены гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) вируса A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), был получен от д-ра Дониса Р (CDC, Атланта, США) Вирус содержит ген НА, модифицированный сайт-специфическим мутагенезом и не имеющий цепочки основных аминокислот в сайте нарезания, которые придают некоторым вирусам подтипа Н5 высокую вирулентность Вариант вируса А/Мallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2), адаптированный к мышам, был предоставлен профессором Смирновым ЮА [Smirnov et al, 2000] Вирусы размножали в 10-дневных куриных эмбрионах Вируссодержащую аллантоисную жидкость хранили при 4°С или при - 80°С

Очистка и концентрация вирусов.

Использовали высокоскоростное центрифугирование вируссодержащей аллантоисной жидкости в роторе SW-27 1 при 23000 об/мин в течение 90 мин при 4°С, осветленной центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 минут Вируссодержащую жидкость наслаивали на 4 мл 20% сахарозы на буферном растворе (0,1 М NaCl, 0,01 М Трис-HCl рН 7,4) Концентрированный вирус ресуспендировали в 2 мл того же буферного раствора или фосфатно-солевого буфера (PBS) (NaCl 0,18 М, КС1 0,003 М, Na2HP04 0,01 М, КН2Р04 0,015 М, рН 7,4)

Инактивация вируса глютаральдегидом.

В препараты концентрированного вируса в фосфатно-солевом буфере, добавляли глютаровый альдегид (0,05%) и инкубировали при 4°С в течение 4 суток Операцию проводили дважды Для контроля инактивации препарат разводили в 50 раз и использовали для заражения 5 куриных эмбрионов

Антитела и иммунизация морских свинок.

Моноклональные антитела (МКАТ) ср46, ср58 и ср79 против вируса A/Chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2), МКАТ 176/26, 364/1 и 777/1 против штамма A/Chicken/Pennsylvama/8125/83 (H5N2), а также моноклональные антитела к вирусу A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) и поликлональные бараньи сыворотки, полученные иммунизацией вирусами A/Hong Kong/15 6/97

(H5N1) и A/Hong Kong/213/2003 (H5N1), были любезно предоставлены доктором Вебстером Р Г (Детская Клиника Сент-Джуд, Мемфис, США) Для получения иммунных сывороток морских свинок использовали вирус, очищенный, концентрированный и инактивированный по вышеописанной методике Инактивированный вирус вводили в 2 задних лапки, в плантарные лимфоузлы, по 0,15 мг вирусного белка на лапку Иммунизацию проводили либо один раз, либо дважды (с разрывом в 30 дней), а также иногда применяли полный адьювант Фрейнда (Hoechst CalBiochem - BEHRING) Взятие крови проводили через 21 день после иммунизации

Получение реассортантов.

Для получения реассортантных вирусных клонов использовалось две процедуры реассортахщи Для скрещивания исходных родительских вирусов A/Duck/Pnmorie/2621/2001 (H5N2) и A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) пользовались методикой, описанной Shulman и Palese [Schulman, Palese, 1976] с некоторыми модификациями Вирус А/Шск/Рпшопе/2621/2001 в титре 107 - 108 ЭИД50 подвергали УФ-облучению в дозе, необходимой для снижения инфекционного титра на 6 логарифмов и смешивали с вирусом A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) в титре 5*108 - 5*Ю9 ЭИДзо Смесь использовали для заражения куриных эмбрионов Для устранения фенотипических смесей проводили дополнительный пассаж Полученный материал обрабатывали иммунной сывороткой против вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и заражали им куриные эмбрионы по 12 эмбрионов на каждое разведение Сбор аллантоисной жидкости производили раздельно из каждого эмбриона и использовали для дальнейшего 6-кратного клонирования методом предельных разведений

При получении реассортанта методом обратного скрещивания (back-cross) использовали аналогичную схему, но в качестве одного из родительских вирусов использовали один из реассортантов, а в качестве другого - либо A/Duck/Pnmone/2621/2001 (H5N2), либо A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) В этом случае вируссодержащую аллангоисную жидкость не подвергали УФ облучению

Количественное определение вирусных белков в гель—электрофорезе.

Электрофорез вирусных белков в полиакриламидном геле (ПААГ) проводили в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) [Laemmli, 1970] Осадок вируса после ультрацентрифугирования, растворяли в диссоциирующем буфере и наслаивали на фокусирующий гель Фокусирующий гель и разделяющий гель содержали акриламид в концентрации соответственно 5% и 17 5%. В качестве сшивающего агента использовали N-N-

метиленбисакриламид в конечных концентрациях, составляющих 1/100 от концентрации акриламида Электрофорез проводили в течение 16 часов при 7 мА Гель фиксировали в растворе, содержащем этанол, Н20 и ледяную уксусную кислоту в соотношении 5 5 1 соответственно в течение 60 минут, затем отмывали тем же раствором и окрашивали Кумасси R 350 (PhastGel Blue R, Phannacia Biotech) в течение 2x часов Пластину геля сушили и сканировали Интенсивность окраски определяли с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop Суммарное количество вирусного белка рассчитывали по соотношению со стандартом, содержащим 8 мкг сывороточного альбумина крупного рогатого скота

Определение аффинности НА вирусов к сиаловым субстратам.

Использовали твердофазный метод с иммобилизацией вируса и связыванием его с коньюгатом фетуина, меченным пероксидазой хрена, описанный ранее в работе [Gambaryan, Matrosovich, 1992], с некоторыми модификациями Вирус по 8-10 ГАЕ с добавлением ингибитора нейраминидазы Amino-GN (0,002%) иммобилизировали в лунках 96 луночных специализированных планшетов Предварительно в лунках сорбировали фетуин и дополнительно обрабатывали бычьим сывороточным альбумином (BSA) В прямой реакции проводили титрование фетуинового конъюгата для выяснения его рабочей концентрации, которую использовали в конкурентной реакции с синтетическими сиалосодержащими субстратами Растворы субстратов титровали в присутствии конъюгата фетуина и пероксидазы в выбранной рабочей концентрации, а также ингибитора нейраминидазы Реакцию проявляли добавлением смеси стабилизированного тетраметилбензидила (2,5 мМ) и субстратного буфера производства «МДЛ» 1 1 Реакцию останавливали добавлением серной кислоты (5%) Оценку результатов осуществляли после измерения оптической плотности смеси в лунках Константу диссоциации для синтезированных сиалосодержащих субстратов рассчитывали через значение 50% ингибирования связывания вируса с фетуиновым коньюгатом

Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Выделение РНК из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов проводили с помощью набора «RNEasy Mmi Kit» фирмы QIAGEN по приложенным к набору методическим указаниям

Обратную транскрипцию и непосредственно амплификацию ДНК-транскриптов вирусных генов проводили с использованием одних тех же праймеров и дезоксинуклеозидов Этап, на котором РНК-зависимая-ДНК-

полимераза при температуре 50°С синтезировала цепь кДНК, бьш включен в программу ПЦР для амплификатора

При постановке ПЦР с целью накопления полноразмерных ДНК копий гена НА для последующего их секвенирования использовали праймеры описанные в таблице 1 Программа ПЦР состояла из трех стадий I — получение кДНК (50°С - 1час + 95°С - 5 мин), II этап - непосредственно ПЦР, 35 циклов (денатурация - 95°С - 30 сек, отжиг праймеров - 53°С - 30 сек, элонгация - 72°С — 1 мин) и Щ - 10 мин при 72°С Для одной пары праймеров (UNIhaf~H5-1695Re) программу модифицировали 1 цикл проводили при температуре отжига 49°С, 8 циклов - при температуре отжига 50°С, 8 — при 51 °С и 17 — при 53 °С

При постановке ПЦР для последующего частичного секвенирования амплификата с целью генотипирования полученных реассортантов использовали праймеры, идентичные описанным в работе Hoffmann Е [Hoffmann et al, 2001] Результаты оценивали при помощи электрофореза в 1,5 % агарозном геле Использовали маркеры молекулярных весов GeneRuler™ 1 Kb DNA Ladder либо 1 Kb Plus DNA Ladder

ТАБЛИЦА 1. Праймеры для секвенирования НА вирусов гриппа подтипа Н5_

Название праймера Нуклеотидная последовательность Направление Ген

H5-F CAAAATGGAGAAAATAGTACTT forward HA

H5-506F AGAACAATGCATACCCAACAA forward HA

UNIhaf Неизвестна* forward HA

H5-650Re CCAACAGAAACATAGGTGGT reverse HA

H5-1154Re TTTTGAGTGGACTCTTTGTCT reverse HA

H5-1695RS CTAGATGCAAATTCTGCACTG reverse HA

* Праймер из диагностического набора производимого фирмой "Нарвак" [Гребенникова, Киреев с соавт., 2006]

Автоматическое секвенирование.

Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http //www genome-centre narod гц) с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v 3 1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant

Образцы подготавливали по инструкции Центра Праймеры подобраны таким образом, чтобы получаемые фрагменты (600 - 650 нуклеотидных остатков) перекрывались на достаточное число нуклеотидов для обеспечения корректного прочтения концевых участков и точного выравнивания полученных фрагментов последовательности относительно друг друга Каждый из полученных фрагментов секвенировали при помощи прямого и обратного

9

праймеров, использовавшихся в ПЦР Амплификат служил в качестве матричной ДНК в полимеразной цепной реакции Нуклеотидные последовательности обрабатывали с помощью программы BioEdit Sequence Alignment Editor

Заражение мышей

Белых беспородных мышей весом 6-8 г, полученных из Питомника лабораторных животных РАМН (Андреевка, Московская область) заражали интраназальным путем под легким эфирным наркозом по 100 мкл вируссодержащей жидкости на мышь

В опытах по определению вирулентности вируса мышей заражали 10-кратными разведениями вируса по 6 мышей на разведение Количество павших мышей регистрировали в течение 10 дней, после чего рассчитывали 50% летальную дозу (МЛД50) по методу Reed и Muench [Reed et al 1938] Параллельно вирус титровали методом предельных разведений для определения 50% эмбриональной инфекционной дозы (ЭИДэо) Вирулентность вируса выражали в lg (ЭЙД50/ МЛД50)

В экспериментах по адаптации вирусов гриппа птиц к организму мышей использовались пассажи из легкого в легкое По завершении пассирования проводили Зх-кратное клонирование вируса методом предельных разведений на куриных эмбрионах

Опыты перекрестной иммунной защиты на мышах

Очищенный вирус инактивировали глютаральдегидом как описано выше Мышей дважды иммунизировали внутримышечными инъекциями инактивированного вируса по 10 мкг вирусного белка на одну мышь Контрольной группе инъецировали PBS, содержащий глютаральдегид в той же концентрации, что в препарате вируса Через 3 недели после последней иммунизации мышей инфицировали вирусом в дозе 1 МЛД50 или 5 МЛД50 Уровень выживания мышей и вес тела отслеживали в течение 14 дней

Статистическая обработка результатов экспериментов.

Использовали два метода статистической обработки получаемых результатов Случайные ошибки эксперимента вычисляли с учетом коэффициента Стьюдента Кроме того, применялась оценка достоверности различий в опытах по иммунной защите с использованием критерия («мерила») %2 [Финни, 1957] В качестве «нулевой гипотезы» принимали таковую, что результат эксперимента не зависит от иммунизации Значение Р (уровень значимости критерия %2) брали из таблиц, приведенных в справочной

литературе [Финни, 1957] Количество степеней свободы рассчитывали по формуле v = (г - 1)(с - 1)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

С целью изучения молекулярных механизмов неполного функционального соответствия генов нами был получен ряд реассортантов, различающихся по генному составу (рисунок 1) Реассортант Я22, содержавший оба гена поверхностных гликопротеидов, полученные от родительского А/Оиск/Рптопе/2621/01 (Н5Ы2),

УФ облу-

2621/ 2001 (H5N2) и A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)

по продуктивности был выше, чем родительский вирус — донор генов гемагглютинина и нейраминидазы, однако уступал по этому параметру второму родительскому вирусу A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), как по данным реакции гемагглютинации (РГА), так и по результатам измерения тотального вирусного белка при помощи сканирования профиля вирусных вирусов в ПААГ

11

«Одногенный» реассортант R22/II, полученный скрещиванием R22 с вирусом A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), накапливался в куриных эмбрионах в титрах даже более низких, нежели A/Duck/Primone/2621/01 (H5N2 (Таблица 2)

Более ранние данные [Rudneva et al, 1993, Mitnaul et al, 2000] указывали на то, что подобный пониженный уровень репродукции в случае скрещивания вируса гриппа птиц и вируса гриппа человека может быть следствием неполного функционального соответствия белков НА и NA, что приводит к агрегации вирионов и иммобилизации их на поверхности клетки Кроме того, имелись данные о том, что баланс активностей белков-продуктов этих

ТАБЛИЦА 2 Уровень накопления вирусов в куриных эмбрионах

Вирус Антигенная формула ГАЕ Тотальный вирусный белок (мг/л)*

A/Duck/Pnmorie/2621/01 (H5N2) H5N2 256-512 21,12 ±6,41

A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) H1N1 1024-2048 63,96 ±6,57

R22 H5N2 512-1024 33,03 ± 14,82

R22/II H5N1 128-256 13,47 ±4,69

R22/II-10 H5N1 512-1024 34,86 ± 10,93

BC-R22-DP H5N2 1024 43,83 ±9,22

*Средняя из 5 определений в разных партиях вируса ± вЕгде вЕ - стандартная ошибка средней, - коэффициент Стьюдента с вероятностью а (а = 0,95)

генов может быть восстановлен при появлении аминокислотных замен в районе рецептор-связывающего кармана НА, снижающих его сродство к сиалосодержащим субстратам, и что такие замены могут быть селекционированы в серии пассажей [Кауепп е1 а1 2000] Нами была предпринята попытка повысить продуктивность «одногенного» и «двугенного» реассортантов посредством их серийного пассирования в куриных эмбрионах Реассортанты Я22 и 1122/11 пассировали десятикратно в куриных эмбрионах при дозе заражения 5000 ЭИД50, оптимальной для селекции высокопродуктивных вариантов [Дг^пеуа е1 а1, 1996] Пассирование не оказало влияния на продуктивность «двугенного» реассортанта, но значительно повысило продуктивность «одногенного» реассортанта 1*22/11 Был получен вариант R22/II-10, продуктивность которого была примерно такой же, как у «двугенного» реассортанта R22 или даже немного превышала ее и превосходила продуктивность родительского вируса гриппа птиц, хотя и уступала продуктивности родительского вируса гриппа человека Полученные данные показали, что тотальное содержание вирусного белка в аллантоисной жидкости у «двугенного» реассортанта R22, имеющего антигенную формулу Н5Ш, и у пассажного варианта «одногенного» реассортанта К22Я1-10, практически одинаково Они сильно уступали по этому параметру

родительскому вирусу A/Puerto Rico/8/34(HlNl), но превосходили как исходный «одногенный» реассортант R22/II (H5N1), так и родительский вирус гриппа птиц A/Duck/Pnmorie/2621/2001(H5N2) (Таблица 2)

Секвенирование НА варианта R22/II-10 выявило аминокислотную замену в большой субъединице НА (N244D) Мы предположили, что эта замена, приводящая к повышению отрицательного заряда поверхности НА, снижает аффинность белка к сиалосодержащим субстратам, восстанавливая, таким образом, баланс активностей НА и NA Ранее это было показано для таких замен у пассажных вариантов реассортантов вирусов гриппа человека и птиц [Rudneva et al, 1996] Для проверки были проведены опыты по сравнительному определению аффинности «одногенного» реассортанта R22/II и его высокопродуктивного варианта R22/II-10 в отношении сиалосодержащих субстратов - фетуина и различных сиалосодержащих полимеров

Данные, приведенные в Таблице 3, свидетельствуют о том, что имеется увеличение константы диссоциации НА вируса R22/II-10 по сравнению с исходным реассортантом R22/II, как в реакциях с фетуином, так и в реакциях с некоторыми синтетическими высокомолекулярными сиалосодержащими полимерами (примерно в 1,5 — 2 раза) Это позволяет говорить, что механизм, лежащий в основе повышения продуктивности пассажного варианта после аминокислотной замены N244D в НА, состоит в снижении аффинности НА к сиаловым субстратам, как это было показано ранее для реассортантов вирусов гриппа человека и птиц [Kavenn et al, 2000, Rudneva et al, 1996]

ТАБЛИЦА 3. Аффинность НА вариантов «одногенного» реассортанта к

сиаловым субстратам.

Сиалосодержащий субстрат Kt** (мкМ)

R22/II R22/II-10

Фетуин 0,297±0,024 0,394+0,013

p3'SL 0,390±0,002 0,567±0,004

P3'SLN 7,75±0,001 15,36±0,048

p3'SiaLeC 15,32+0,019 21,26+0,043

p3'SiaLeA >20* >20

p3'SiaLeX >20 >20

* При результате больше, чем 20 мкМ считали, что субстрат не связывается

** К(1 - константа диссоциации, обратно пропорциональная аффинности

Помимо селекции высокопродуктивного варианта «одногенного» реассортанта R22/II методом последовательных пассажей, нами также было проведено исследование возможности получения оптимального сочетания генов по признаку высокой продуктивности реассортанта С этой целью было проведено обратное скрещивание реассортанта R22 с вирусом-родителем

13

A/Duck/Pnmorie/2621/01 (H5N2) и выбран наиболее высокопродуктивный реассортантный клон Этот реассортант, обозначенный нами как BC-R22-DP, кроме генов НА и NA вируса A/Duck/Pnmorie/2621/01 (H5N2), содержал также ген РВ1 этого вируса Хотя этот вирус все же уступал по уровню продуктивности родительскому вирусу гриппа человека, он значительно превосходил как вирус A/Duck/Primorie/2621/01 (H5N2), так и реассортант R22 и даже R22/II-10 (Таблица 2) Таким образом, прибавление к уже имевшимся в составе «двугенного» реассортанга генам НА и NA вируса A/Duck/Pnmorie/2621/01 (H5N2) еще и гена РВ1 этого вируса приводит к оптимизации генного состава по признаку продуктивности Полученный результат может быть важен в практическом аспекте, поскольку он указывает на перспективность использования в качестве вакцинных штаммов таких реассортантов, которые содержат не только гены НА и NA актуального «птичьего» штамма, но и его ген РВ1 Не исключено, что и другие гены «птичьего» вируса могут играть роль в увеличении продуктивности реассортантов Поэтому применение обратного скрещивания в качестве методического приема может оказаться полезным для повышения продуктивности вирусов-реассортантов, в том числе и тех, которые получают методами обратной генетики Другой аспект полученного нами результата связан с проблемами природной эволюции вирусов Вирусы, вызвавшие пандемии 1957 и 1968 гг, содержали ген РВ1, полученный от вирусов гриппа птиц Можно предположить, что образование и последующее сохранение в циркуляции именно таких реассортантов было обусловлено их более высокой продуктивностью, которую им придавал ген РВ1 вируса гриппа птиц, подобно тому, как это было выявлено у полученных нами реассортантов

Важной характеристикой любого вируса, а особенно вируса с потенциалом вакцинного штамма, является его вирулентность, в частности, вирулентность для мышей, которая позволяет проводить опыты по перекрестной иммунной защите Кроме того, генетические основы вирулентности вирусов гриппа птиц для млекопитающих вообще недостаточно изучены В отношении вирусов гриппа птиц вопрос изучен, главным образом, для высокопатогенных вирусов H5N1, которые обладают очень высокой вирулентностью для мышей без адаптации, причем уровень вирулентности для мышей коррелирует, в известной мере, с вирулентностью для человека [Gao et al, 1999] При этом у вирусов H5N1 вирулентность для млекопитающих, и, в частности, для мышей, зависит, главным образом, от генов НА, РВ2 и NS [Hatta et al, 2001] Напротив, для низкопатогенных вирусов гриппа птиц данные о роли того или другого гена в приобретении патогенности для мышей отсутствуют

Штамм A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) обладает патогенностью для мышей, поскольку он прошел ряд пассажей на мышах при выделении Низкопатогенные вирусы гриппа птиц, напротив, обычно авирулентны для мышей Вирус А/Утка/Приморье, использовавшийся в нашей работе как один из родительских вирусов, обладал очень низкой вирулентностью по отношению к мышам Более того, этот вирус, в отличие от близкого к нему вируса A/Duck/Pnmone/2633/Ol (H5N3), так и не удалось адаптировать к мышам, несмотря на проведенную работу в этом направлении (Таблица 4) Секвенирование гена НА адаптированного к мышам A/Duck/Pnmorie/2633/Ol (H5N3) выявило только одну аминокислотную замену, Q173P Различие в способности к адаптации у этих двух близких вирусов нельзя объяснить наличием NA разных подтипов, поскольку присутствие NA, полученной от низковирулентного для мышей вируса A/Duck/Pnmone/2621/2001 (H5N2), не снижает вирулентность реассортантов В отличие от этого родительского вируса гриппа птиц, все полученные нами и использовавшиеся в работе реассортанты («двугенный» R22, «одногенный» R22/II и «трехгенный» BC-R22-DP, получивший не только гены НА и NA, но и ген РВ1 от вируса гриппа птиц) обладали определенной вирулентностью для мышей, сходной с таковой у вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), от которого они получили большинство генов Значимых различий в их вирулентности не наблюдалось (Таблица 5)

ТАБЛИЦА 4. Адаптация вирусов к мышам.

A/Duck/Primorie/2621/01 A/Duck/Primorie/2633/01

Номер пассажа Способ пассированиия Титр вируса в легких в ГАЕ Номер пассажа Способ пассированиия Титр вируса в легких в ГАЕ

I Заражение аплантоис-ной жидкостью <2 I Заражение алантоис-ной жидкостью 16

II Пассаж из легких в легкие без трипсина <2 II Пассаж из легких в легкие без трипсина 8

III То же, но с трипсином <2 III -II- 128

IV -II- <2 IV -II- 64

V -II- <2 V -II- 128

VI -II- <2 VI -II- 256

VII Не проводили VII -II- 128

VIII Не проводили VIII -II- 128

IX Не проводили IX -II- 128

ТАБЛИЦА 5. Вирулентность для мышей вирусов гриппа разного генного состава.

Виру© Подтип ig ЭИДэдМЛДм*

A/Puerto Rico/8/34 H1N1 4,33 ±0,46

A/Duck/Pnmorie/2621/01 H5N2 8,93 ± 0,48

R22 H5N2 4,00 ± 0,26

R22/II H5N1 3,73 ±0,41

R22/I1-10 H5N1 3,56 ±0,53

BC-R22-DP H5N2 4,27 ±039

A/Duck/Pnmorie/2633/01 H5N3 7,30 ± 0,42

A/Duck/Pnmorie/2633/01-MA H5N3 2,93 ±0,36

*Вирулентность как lg ЭИД50/МЛД50 ± стандартная ошибка средней^ при а = 0,95.

Таким образом, на вирулентность реассортантов для млекопитающих (мышей) не влияло наличие генов низковирулентного для них вируса гриппа птиц - ни одного, ни обоих поверхностных гликопротеинов, ни даже трех генов - НА, NA и РВ1 Для точной идентификации генов, ответственных за ограничение вирулентности у низкопатогенных вирусов гриппа птиц, необходимы дальнейшие исследования Наличие вирулентности для мышей у реассортантных вирусов позволяет повысить информативность опытов перекрестной иммунной защиты, которые необходимы для оценки широты профилактического эффекта вакцинации

Полученные нами реассортанты не предназначены для прямого использования в качестве вакцинных штаммов Однако представляло интерес выяснить, в какой мере можно ожидать эффективной иммунизации против современных патогенных вирусов подтипа H5N1 при использовании инактивированных препаратов вирусов, содержащих НА низкопатогенного вируса подтипа Н5 Мы использовали в опытах перекрестной иммунной защиты полученный от д-ра Дониса Р (CDC, Атланта, США) реассортант VNH5N1-PR8/CDC-RG, содержавший гены поверхностных белков от высокопатогенного вируса H5N1 A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), а гены внутренних белков - от A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) Поскольку из гена НА этого вируса был удален полиосновной пептид, облегчающий протеолигическую активацию НА, вирус не был столь высокопатогенным, как сам штамм A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) Однако он обладал такой же вирулентностью для мышей, как и A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), что позволило нам использовать его в опытах по перекрестной защите с реассортантом R22, содержащим гены НА и NA вируса A/Duck/Pnmone/2621/01 (H5N2)

Несмотря на то, что гемагглютинины вирусов A/Duck/Pnmone/2621/Ol (H5N2) и A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) принадлежат к одному подтипу, они

имеют значительные различия в антигенной специфичности, которые были выявлены в реакции торможения гемагглютинации, как с поликлональными иммунными сыворотками, так и с моноклональными антителами (Таблицы 6, 7, 8) Тем не менее, как показали опыты иммунной зашиты на мышах, эти антигенные различия не препятствуют иммунитету против гетерологичного вируса

Данные, полученные нами в опытах перекрестной иммунизации (Таблица 9, рисунок 2), позволяют говорить, что иммунизация Я22 дает достаточно выраженный защитный эффект в отношении вируса, содержащего НА штамма А/У1е1пат/1203/2004 (Н5Ш) Защита, создаваемая иммунизацией И22, не отличается в количественном отношении от защиты, создаваемой иммунизацией гомологичным вирусом, или отличается очень мало, так что различия не имеют статистической значимости Такой же результат был получен и в обратном опыте, когда мышей иммунизировали вирусом УМН51<Г1-Р118/СВС-1Ш Таким образом, нами была показано формирование выраженной перекрестной иммунной защиты между одним из наших реассортантов (1122) и вирусом, содержащим поверхностные гликопротеины высокопатогенного штамма подтипа Н5Ш, несмотря на то, что в РТГА с моноклональными антителами и поликлональными сыворотками выявляются значительные различия между гемагглютининами вирусов А/УшШат/1203/2004 (Н5Ш) и АЯЭиск/Рптопе/26721/01 (Н5№)

Вирус, Полигональные сыворотки

А-156* А-213* А-22** А-22ДИ0**

A/Duck/Pnmone/2621/01 (H5N2) 640 320 640 640

R22 640 320 640 640

R22/II 640 320 640 640

R22/II-10 640 320 640 640

A/Duok/Pnmorie/2633/01 (H5N3) 640 160 160 160

A/Duck/Pnmorie/2633/01-MA (H5N3) 640 160 160 160

VNH5N1-PR8/CDC-RG 2560 160 40 80

*А-156 и А-213 - бараньи сыворотки против вирусов A/Hong Kong/156/97 (H5N1) и A/Hong Kong/213/03 (HSN1). **A-22 и А-22Я1-10 - сыворотки морской свинки против реассортантов R22 и R22/II-10.

ТАБЛИЦА 7. РТГА с моноклональными антителами против штамма вируса A/Vietnam/1203/04__

Вирус MKAT

VN04-2 VND4-S VN04-9 ¥(®Мг1в VN04-13 VN04-15 VN04-16

VNH5N1-PR8/CDC-RG 51200 6400 51200 6400 12800 6400 <200

A/Duck/Pnmorie/2621/01 (H5N2) <200 <200 <200 800 6400 <200 <200

R22 <200 <200 <200 800 12800 <200 <200

R22/II <200 <200 <200 1600 6400 <200 <200

R22/II-10 <200 <200 <200 1600 <200 <200 <200

BC-R22-DP <200 <200 <200 800 6400 <200 <200

A/Duck/Pnmorie/2633/01 (H5N3) <200 <200 <200 3200 6400 <200 <200

A/Duck/Prtmorie/2633/01 -MA (H5N3) <200 <200 <200 3200 6400 <200 <200

ТАБЛИЦА 8. РТГА с моноклональными антителами против штаммов A/Chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2) и A/Chicken/Pennsylvama/8125/83 (H5N2)

Вирус MKAT

cp46 cp55 cp58 cp79 176/26 364/1 777/1

A/Duok/Pnmone/2621/01 (H5N2) 6400 12800 6400 25600 25600 25600 12800

R22 12800 12800 3200 25600 25600 12800 12800

R22/II 12800 12800 3200 25600 25600 25600 6400

R22/II-10 12800 25600 6400 51200 51200 12800 25600

A/Duck/Pnmorie/2633/01 (H5N3) 6400 12800 6400 25600 25600 12800 12800

A/Duck/Pnmorie/2633/01-MA (H5N3) 3200 12800 6400 51200 25600 12800 51200

VNH5N1-PR8/CDC-RG <200 <200 800 800 <200 <200 12800

ТАБЛИЦА 9. Выживаемость в опытах по прямой и перекрестной иммунной защите. _„_______„„__

Заражение Иммунизация Выжила Погибло Всего %** Ра РЬ

СОС^б (1 МШм*) Плацебо 10 8 18 55,5 Н/П Н/П

\МН5М1-Р1*8/ сос-яв 18 0 18 100 < 0,0016 Н/П

М2 18 0 18 100 < 0,0016 Н/П

ШН5№-Р1?8/ СОС-ЯБ (5 МШи) Плацебо 5 17 22 22,7 Н/П Н/П

\ГОН5№1-Р1?8/ сос-кв 20 2 22 90,9 <00001 Н/П

К22 18 4 22 81,8 < 0,0001 >0,3

(1 МШи) Плацебо 12 10 22 54,5 Н/П Н/П

\тН5№-Р1?8/ С0С-1УЗ 21 1 22 95,5 <0,002 >0,3

1*22 22 0 22 100 < 0,0005 Н/П

"Доза вируса, использовавшегося для заражения, * * Процент выживших

Ра - Статистическая значимость повышения выживаемости иммунизированных

мышей по сравнению с мышами, получившими плацебо.

Рь - Статистическая значимость различия выживаемости мышей, иммунизированных гетерологичным вирусом, и выживаемости мышей, иммунизированных гомологичным вирусом.

Н/П — не применимо.

а

Е

Рис. 2. Потеря веса (А) и гибель мышей (Б) при заражении вирусом УРШ5М-Р118/СВС~1Ю после иммунизации гомологичным вирусом (1), реассортантом И22 (2) и без иммунизации (3). По оси ординат - дни после заражение По оси абсцисс (А) -средний вес (% по отношению к весу незараженных мышей), по оси абсцисс (Б) -количество живых мышей

Наши результаты соответствуют в этом отношении тем данным, которые были ранее получены в отношении штаммов подтипа Н5 [Бпнпюу й а1, 2001], и указывают на реальную возможность использования низкопатогенных вирусов подтипа Н5 в качестве доноров гена НА для вакцинных противопандемических

штаммов широкой специфичности, которые могли бы быть использованы для подготовки инактивированных вакцин «баррикадного» типа

Настоящее исследование было проведено для выяснения возможности преодоления функционального несоответствия генов, характерного для реассортантов вирусов гриппа человека и птиц [Rudneva et al, 1993] Представлялось вероятным, что повышение продуктивности реассортантов, содержащих гемагглютинин Н5, может быть достигнута на пути преодоления функционального несоответствия генов Нам удалось восстановить высокий уровень продуктивности полученных реассортантных вирусов, причем это было достигнуто двумя различными путями Первый подход - через селекцию варианта реассортанта, несущего мутацию в гене НА, который вследствие этой замены обладает пониженным сродством к сиаловым субстратам Другим вариантом достижения поставленной цели стало повышение продуктивности посредством оптимизации генного состава реассортанта Разработанные нами варианты оптимизации вирусов-реассортантов могут быть использованы при получении штаммов для инактивированных и субъединичных вакцин, характеризующихся как хорошими защитными свойствами, так и высокой продуктивностью Кроме того, результаты, полученные в опытах перекрестной защиты, показывают, что можно ожидать эффективной иммунизации против вероятного агента будущей пандемии при использовании вирусов, содержащих НА низкопатогенных вирусов гриппа хггиц

ВЫВОДЫ

1 Получены и охарактеризованы реассортанты, содержащие ген гемагтлютинина низкопатогенного вируса гриппа птиц A/Duck/Primone/2621/01 (H5N2) и гены внутренних белков высокопродуктивного вируса гриппа человека A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)

2 Реассортант, содержащий гены гемагтлютинина и нейраминидазы вируса A/Duck/Pnmone/2621/01 (H5N2) и б генов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (реассортант 6 2) имеет более высокую продуктивность, чем вирус A/Duck/Pnmone/2621/01 (H5N2), но уступает вирусу A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)

3 Реассортант, имеющий ген гемагтлютинина вируса A/Duck/Pmnone/2621/01 (H5N2) и 7 генов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (реассортант 7 1), имеет низкую продуктивность Селекция методом серийного пассирования позволила получить вариант, сходный по продуктивности с реассортантом, содержащим 6 генов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) Повышение

продуктивности коррелирует со снижением аффинности к сиалосодержащим субстратам, вызванным аминокислотной заменой N244D в субъединице НА1

4 Реассортант, содержащий гены гемагглютинина, нейраминицазы и РВ1 вируса A/Duck/Pnmone/2621/Ol (H5N2), имеет более высокую продуктивность, чем реассортанты 6 2 и 7 1

5 Все реассортанты обладают вирулентностью для мышей при интраназальном заражении, близкой к вирулентности вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и намного превосходящей вирулентность вируса A/Duck/Pnmone/2621/Ol (H5N2), что указьшает на связь ограничения вирулентности для мышей вируса A/Duck/Pnmorie/2621/01 (H5N2) с иными генами, нежели гены гемагглютинина, нейраминидазы и РВ1

6 Реассортант, содержащий ген гемагглютинина вируса A/Duck/Pnmorie/2621/01 (H5N2), обеспечивал перекрестную иммунную защиту против вируса-реассортанта, содержащего ген гемагглютинина современного высокопатогенного вируса подтипа H5N1, близкую по эффективности к защите гомологичным вирусом (VNH5N1-PR8/CDC-RG)

7 Полученные данные позволяют предложить новый подход к оптимизации генного состава реассортантных вирусов, предназначенных для использования в качестве ппаммов для инактивированных вакцин против вирусов, содержащих гемагглютинины вирусов гриппа птиц

8 Результаты указывают на перспективность применения инактивированных вакцин, содержащих гемагглютинин низкопатогенных вирусов гриппа птиц подтипа Н5 без генно-инженерной модификации

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Rudneva IА, Timofeeva Т А, Shilov А А , Kochergin-Nikitsky К S , Vanch N L , Ilyushina N A, Gambaryan A S , Kxylov P S , Kavenn N V Effect of gene constellation and postreassortment ammo acid change on the phenotypic features ofH5 influenza virus reassortants Arch Virol 2007,152(6) 1139-45

2 Кочергин-Никитский К С , Руднева И А, Тимофеева Т А, Ильюшина H А, Варич H JI, Власова А H , Каверин H В , Львов Д К Реассортация и взаимодействие генов при скрещивании низкопатогенного вируса гриппа гггиц подтипа Н5 с вирусом гриппа человека Вопр вирусологии, 2007, т 52, №1, с 23-8

3 Кочергин-Никитский К С, Руднева И А, Тимофеева Т А , Шилов А А , Варич H JI, Каверин H В Оптимизация генного состава высокопродуктивных реассортантов, содержащих, гемагглютинин вируса гриппа птиц подтипа Н5 Материалы IV конгресса ассоциации педиаторов-инфекционистов Москва, 2006 г, С 89-90

4 Kochergm-Nikitsky К S , Rudneva IА , Timofeeva Т А, Varich NI, Kavenn N V Generation and characterization of reassortants between a low pathogenic avian influenza H5 virus and the high-growth A/Puerto-Rico/8/34 (H1N1) strain Abstracts of ХП1 international conference on "Negative strain viruses" Salamanca, Spam, 2006, P185

5 Kavenn N V, Rudneva IA, Timofeeva T A, Shilov A A, Kochergm-Nikitsky К S , Vaiich N L Reassortants between a low pathogenic avian influenza H5 virus and A/Puerto-Rico/8/34 (H1N1) strain effect of gene constellation on virus yield Abstracts international conference on "Preparedness to the influenza pandemic - an international outlook", Saint-Petersburg, Russia, 2007, P25-26

6 Каверин H В , Руднева И А , Тимофеева Т А , Шилов А А, Варич H Л, Кочергив-Никитский К С Получение и характеристика реассортантов, содержащих гемагглютинин низкопатогенного вируса гриппа подтипа Н5 Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Москва, 2007, С 245

7 Руднева И А, Каверин H В , Тимофеева Т А, Шилов А А , Варич H Л , Кочергин-Никитский К С , Крылов П С , Львов Д К Оптимизация генного состава реассортантов, содержащих гемагглютинин вируса гриппа подтипа Н5, и их эффективность в опытах перекрестной иммунной защиты Вопр вирусологии, в печати

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубочайшую благодарность моему научному руководителю доктору медицинских наук, академику РАМН, заведующему лабораторией физиологии вирусов Каверину Николаю Вениаминовичу за предоставление возможности проводить данные исследования, определение целей и внимание к проводимой работе, поддержку, понимание и терпение, ведущему научному сотруднику лаборатории физиологии вирусов Рудневой Ирине Александровне за всемерную помощь и непосредственное участие в работе, в постановке ее задач Благодарю старшего научного сотрудника лаборатории физиологии вирусов Тимофееву Татьяну Анатольевну за участие в получении и характеристике реассортантных вирусов, ведущего научного сотрудника лаборатории физиологии вирусов Варич Наталью Львовну, помощь в количественных измерениях вирусных белков Выражаю глубокую признательность за консультации и помощь в освоении методик определения сродства гемагглютинина вирусов гриппа к сиалосодержащим субстратам, а также за предоставление реактивов, заведующую лабораторией поисковых исследований НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов Гамбарян Александру Сергеевну и ведущего научного сотрудника лаборатории химии углеводов НИИ биоорганической химии РАН Мочалову Ларису Витальевну Приношу благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной диагностики, оказывавшим консультативную помощь при проведении секвенирования

Подписано в печать 21 сентября 2007 г

Формат 60x90/16

Объем 1,5 п л

Тираж 100 экз

Заказ № 2109076

Оттиражировано на ризографе в ООО «У ниверПриит» ИНН/КПП 7728572912Y772801001

Адрес 117292, г Москва, ул Дмитрия Ульянова, д 8, кор 2 Тел 740-76-47,125-22-73 http //www umveipnnt ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кочергин-Никитский, Константин Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Молекулярная биология и генетика вируса гриппа А.

1.1. Таксономия.

1.2. Геном вируса гриппа А.

1.3. Вирион вируса гриппа А и белки, входящие в его состав.

1.4. Стадии репродукции вируса гриппа А.

1.4.1. Проникновение в клетку.

1.4.2. Транскрипция и репликация РНК.

1.4.3. Регуляция экспрессии генов вируса гриппа.

1.4.4. Сборка вириона и выход из клетки.

Глава 2. Реассортация у вирусов гриппа А.

2.1 .Сегментированность генома вируса гриппа как основа реассортации.

2.2. Контроль упаковки вирусного генома в вирион.

2.3. Реассортация вирусов гриппа в природных условиях.

Глава 3. Использование реассортации для исследования взаимодействия генов и для получения вакцинных штаммов.

3.1. Области применения реассортации в лаборатории.

3.2. Функциональное взаимодействие НА и ЫА и баланс их активностей.

3.3. Получение вакцинных штаммов на основе реассортантных вирусов гриппа.

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 1. Материалы и методы.

1.1. Вирусы.

1.2. Очистка и концентрация вирусов.

1.3. Инактивация вируса глютаральдегидом.

1.4. Антитела.

1.5. Получение реассортантов.

1.6. Реакция гемагглютинации.

1.7. Иммунологические реакции.

1.8. Количественное определение вирусных белков в гель-электрофорезе.

1.9. Определение аффинности НА вирусов к сиаловым субстратам.

1.10. Постановка полимеразной цепной реакции.

1.11. Электрофорез в агарозном геле.

1.12. Автоматическое секвенирование.

1.13. Заражение мышей.

1.14. Опыты перекрестной иммунной защиты на мышах.

1.15. Статистическая обработка результатов экспериментов.

Глава 2. Получение реассортантных вирусов.

Глава 3. Вирулентность реассортантов для мышей.

Глава 4. Сравнение антигенной специфичности реассортантов, содержащих ген НА вируса A/Duck/Primorie/2621/01 (H5N2), с вирусом, содержащим ген НА современного вируса H5N1.

4.1. Иммунологические реакции.

4.2. Опыты перекрестной иммунной защиты.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ взаимодействия генов при скрещивании низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5 и высокопродуктивного штамма вируса гриппа человека"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Одним из распространенных возбудителей вирусных заболеваний человека и животных является вирус гриппа. Существуют три типа вируса гриппа: А, В, С. Они принадлежат к одному семейству, образуя отдельные роды. Вирусы гриппа В и С поражают преимущественно людей, тогда как вирус гриппа А обладает широким кругом хозяев. Вирус гриппа А, в отличие от вирусов гриппа В и С, вызывает не только локальные вспышки и сезонные эпидемии, но и глобальные пандемии, охватывающие весь земной шар и случающиеся с интервалом 10-40 лет, когда болеют миллионы и десятки миллионов человек.

Поскольку поверхностные вирусные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA) наиболее важны для иммунитета к инфекции, номенклатура вируса гриппа А основана на подтипах НА и NA. Известно 16 подтипов НА (HI - Н16) и 9 подтипов NA (N1 - N9). В настоящее время в человеческой популяции циркулируют вирусы H1N1 и H3N2. У птиц, являющихся природным резервуаром вируса гриппа А, выделяют вирусы всех подтипов НА, однако у разных видов те или иные подтипы встречаются с разной частотой.

Вирус гриппа А характеризуется большой вариабельностью. Наиболее подвержены изменениям поверхностные гликопротеины вириона - НА и NA. Известны два пути изменения. Первый - антигенный дрейф, присущий в основном вирусам гриппа человека. В человеческой популяции на вирус давит коллективный иммунитет. В таких условиях мутации, позволяющие вирусу преодолеть иммунитет, дают ему серьезное преимущество и закрепляются. В итоге антигенные варианты сменяют друг друга. Второй путь - антигенный сдвиг или шифт (от англ. shift), то есть изменение антигенной формулы из-за замены гена и соответствующего белка в результате реассортации генов. Если два вируса гриппа А заражают одну и ту же клетку, то в вирусном потомстве многие вирусные частицы окажутся реассортантными, то есть получившими часть генов от одного вируса-родителя, а часть - от другого. К вирусу гриппа, получившему ген НА (или НА и ЫА) от вируса гриппа птиц, который ранее не циркулировал в человеческой популяции, у населения нет иммунитета. Поэтому он быстро распространяется и вызывает пандемию.

В последние годы вирус гриппа птиц подтипа Н5Ш вызвал эпизоотии у птиц в юго-восточной Азии, а также вспышки в других регионах мира. При этом некоторые варианты этого вируса обладали способностью иногда передаваться людям, вызывая тяжелейшие заболевания, часто со смертельным исходом. Пока еще не зарегистрирована массовая передача этих вирусов от человека к человеку. Имеются основания полагать, что для приобретения вирусом способности распространяться среди людей достаточно нескольких мутаций. Другим фактором, повышающим вероятность приобретения вирусом подтипа Н5Ш к распространению среди людей, может быть его скрещивание с вирусом гриппа человека. В случае возникновения обычной вспышки гриппа в регионе, где отмечаются случаи заражения людей вирусом гриппа птиц Н5>П, возможно появление вирусов-реассортантов, способных успешно распространяться среди людей.

Человечество уже преодолело не одну пандемию гриппа. Однако при возникновении пандемии, вызванной высоковирулентными вирусами гриппа, относящимися к подтипу Н5, последствия могут оказаться гораздо более тяжелыми, нежели при прежних пандемиях. Вирусы этого подтипа часто обладают особыми свойствами, которые позволяют им поражать многие ткани организма и вызывать у птиц тяжелейшую, обычно смертельную инфекцию. Те вирусы, которые оказались способны заражать человека, также вызывали заболевание с необычно высокой смертностью.

Вероятность возникновения пандемии, вызванной вирусом подтипа Н5, достаточно велика, и поэтому весьма актуальна проблема получения высокопродуктивных и иммуногенных вирусов-реассортантов, имеющих НА 6 подтипа Н5 и пригодных для продукции инактивированных и субъединичных вакцин. Однако ген НА вирусов подтипа Н5№ делает своего носителя столь агрессивным, что зараженный им куриный эмбрион гибнет раньше, чем вирус накапливается в необходимых титрах. Кроме того, эти вирусы небезопасны в работе. Попытки создания инактивированных вакцин против вируса подтипа Н5>П, тем не менее, были предприняты в ряде стран. Были получены реассортанты, содержащие модифицированный гемагглютинин, из которого удален сайт расщепления, делающий вирус высокопатогенным. Но продуктивность таких реассортантных штаммов часто не достигает значений, характерных для обычных вакцинных штаммов, хотя и превосходит продуктивность патогенного вируса Н5№. Низкая продуктивность вообще часто встречается у реассортантов вируса гриппа человека и вируса гриппа птиц в связи с неполным функциональным соответствием вирусных генов.

Среди природных вирусов, содержащих НА подтипа Н5, имеются варианты, у которых иммунная специфичность НА близка к специфичности НА вирусов Н5Ш. Однако у этих вирусов НА не столь легко разрезается протеазами, и вирус поэтому не обладает высокой патогенностью. Такие штаммы выделены на территории России сотрудниками отдела экологии НИИ вирусологии им Д.И. Ивановского. Благодаря относительной безопасности в работе и близкому иммунологическому сходству с высокопатогенными вирусами подтипа Н5 они могут быть использованы для выявления причин ограничения продуктивности реассортантов и для разработки научных подходов к оптимизации вакцинных штаммов.

В связи с важностью получения данных о механизмах, обуславливающих вариации репродуктивных свойств реассортантов, содержащих НА подтипа Н5, особую актуальность. приобретает исследование тех свойств реассортантных вирусов, которые определяются взаимодействием генов, полученных от разных вирусов-родителей и которые ограничивают продуктивность реассортантов. Этим обусловлена актуальность исследований, выполненных в рамках настоящей работы.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

Целями данной работы были получение и характеристика реассортантных вирусов, получивших гены поверхностных белков от низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5, а гены внутренних белков от высокопродуктивного вируса гриппа человека, исследование постреассортационного взаимодействия генов, оптимизация генного состава высокопродуктивных реассортантов и определение эффективности реассортантов в опытах перекрестной иммунной защиты в отношении вируса подтипа Н5Ш.

Для достижения этих целей нами были поставлены следующие задачи:

1. Получить набор реассортантов низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5 и высокопродуктивного вируса гриппа человека.

2. Провести характеристику генного состава полученных реассортантов.

3. Провести оптимизацию генного состава реассортантов и селекцию высокопродуктивных вариантов.

4. Исследовать фенотипические свойства реассортантов и их вариантов

5. Определить иммуногенность реассортантов в опытах перекрестной иммунизации на мышах.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Получение эффективных вакцин против вируса гриппа А, как известно, затруднено из-за высокой изменчивости поверхностных белков его вириона. Требуется достаточно много времени, чтобы получить вакцину на основе актуального штамма. При угрозе пандемии, вызванной высоковирулентным вирусом гриппа, относящимся к подтипу Н5, такое промедление может привести к огромным человеческим потерям. Однако существуют возможности, позволяющие отразить или значительно ослабить первые удары пандемии. Одна из таких возможностей - создание «баррикадных» вакцин (по терминологии Э. Килбурна), то есть таких, которые способны создать определенный уровень иммунитета, несмотря на неполное соответствие актуальному штамму, и обеспечить защиту наиболее уязвимых контингентов населения, что позволит снизить массовую смертность при пандемии. Реассортантные штаммы для таких вакцин должны обладать набором свойств, необходимых для эффективной вакцинации. Для исследования тех свойств реассортантов, которые существенны для вакцинных штаммов, целесообразно использовать модельные системы, позволяющие исследовать взаимодействия генов в составе реассортантов, что и было выполнено в настоящей работе.

В ходе настоящей работы, путем скрещивания вируса гриппа человека A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (вариант Mount Sinai) и вируса гриппа птиц A/Duck/Primorie/2621/01 (H5N2) были получены реассортанты, получившие либо только НА, либо оба поверхностных белка от вируса H5N2. Проведена характеристика их фенотипических свойств: продуктивности при заражении эмбрионов кур, вирулентности для мышей, сродства НА к сиаловым рецепторам, иммуногенности в опытах перекрестной иммунной защиты на мышах в отношении вируса, содержащего НА и NA современного вируса подтипа H5N1. Проведена оптимизация генного состава реассортанта посредством обратного скрещивания, существенно повысившая продуктивность вируса.

Полученные реассортанты обладают некоторыми характеристиками штамма, пригодного для получения инактивированной вакцины: они безопасны, поскольку не содержат высокорасщепляемого НА, придающего вирусам Н5 такую высокую вирулентность, но при этом они высокопродуктивны, хотя и уступают в этом отношении вирусу-родителю A/Puerto Rico/8/34 (H1N1).

Полученные данные указывают на реальную возможность использования низковирулентных штаммов подтипа Н5 для получения реассортантов, пригодных к применению в качестве штаммов для 9 производства инактивированных или субъединичных вакцин для использования в случае появления в человеческой популяции циркулирующего высокопатогенного штамма подтипа Н5, обладающего пандемическим потенциалом. Данные указывают на необходимость детальной антигенной характеристики низкопатогенных вирусов подтипа Н5, выделяемых в Евразии, в особенности на территории Российской Федерации, в связи с потенциальной возможностью их использования в качестве вирусов-родителей для получения реассортантных вакцинных штаммов. При использовании таких вирусов отпадает необходимость в применении дорогих и сложных генно-инженерных методов для снижения патогенности вируса путем устранения пептида в участке разрезания НА. Несмотря на неполное соответствие антигенной специфичности НА низкопатогенных вирусов подтипа Н5 и высокопатогенных вирусов Н5Ш, реассортанты такого типа могли бы использоваться в качестве «баррикадной» вакцины по Э. Килбурну для уменьшения смертности при первой волне пандемии.

Важным аспектом нашей работы является повышение продуктивности реассортантов вирусов гриппа человека и птиц в результате оптимизации их генного состава. Применение для этой цели метода обратного скрещивания может оказаться полезным для получения высокопродуктивных штаммов-кандидатов для инактивированных и субъединичных вакцин против вероятного возбудителя пандемии гриппа. Такой подход может быть применен не только к реассортантам, полученным методом скрещивания и селекции, но и к вирусам, полученным с использованием генно-инженерной техники, для оптимизации их генного состава.

Таким образом, полученные результаты расширяют представления о взаимодействии генов вирусов гриппа А при реассортации и должны учитываться в будущем при проведении исследований практического характера, направленных на создание и усовершенствование вакцинных штаммов, которые будут направлены против вероятных возбудителей будущих пандемий гриппа.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кочергин-Никитский, Константин Сергеевич

выводы.

1. Получены и охарактеризованы реассортанты, содержащие ген гемагглютинина низкопатогенного вируса гриппа птиц A/Duck/Primorie/2621/01 (H5N2) и гены внутренних белков высокопродуктивного вируса гриппа человека A/Puerto Rico/8/34 (H1N1).

2. Реассортант 6:2, содержащий гены гемагглютинина и нейраминидазы вируса A/Duck/Primorie/2621 /01 (H5N2) и 6 генов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) имеет более высокую продуктивность, чем вирус A/Duck/Primorie/2621/01 (H5N2), но уступает вирусу A/Puerto Rico/8/34 (H1N1).

3. Реассортант 7:1, имеющий ген гемагглютинина вируса A/Duck/Primorie/2621/01 (H5N2) и 7 генов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), имеет низкую продуктивность. Селекция методом серийного пассирования позволила получить вариант, сходный по продуктивности с реассортантом 6:2. Повышение продуктивности коррелирует со снижением аффинности к сиалосодержащим субстратам, вызванным аминокислотной заменой N244D в субъединице НА1

4. Реассортант 5:3, содержащий гены гемагглютинина, нейраминидазы и РВ1 вируса A/Duck/Primorie/2621/01 (H5N2), имеет более высокую продуктивность, чем реассортанты 7:1 и 6:2.

5. Все реассортанты обладают вирулентностью для мышей при интраназальном заражении, близкой к вирулентности вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и намного превосходящей вирулентность вируса A/Duck/Primorie/2621/01 (H5N2), что указывает на связь ограничения вирулентности для мышей вируса A/Duck/Primorie/2621/01 (H5N2) с иными генами, нежели гены гемагглютинина, нейраминидазы и РВ1.

6. Реассортант, содержащий ген гемагглю^инина вируса А/Оиск/Рптопе/2621/01 (Н5Ш), обеспечивал перекрестную иммунную защиту против вируса-реассортанта, содержащего ген гемагглютинина современного высокопатогенного вируса подтипа Н5Ш, близкую по эффективности к защите гомологичным вирусом (УЫН5№-РК.8/С0С-110).

7. Полученные данные позволяют предложить новый подход к оптимизации генного состава реассортантных вирусов, предназначенных для использования в качестве штаммов для инактивированных вакцин против вирусов, содержащих гемагглютинины вирусов гриппа птиц.

8. Результаты указывают на перспективность применения инактивированных вакцин, содержащих гемагглютинин низкопатогенных вирусов гриппа птиц подтипа Н5 без генно-инженерной модификации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кочергин-Никитский, Константин Сергеевич, Москва

1. Александрова Г.И. Применение метода генной рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопр. вирусол. 1997, №4, стр. 387-395

2. Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Акопова И.И., Коптяева И.Б., Исаченко A.A., Мазуркова H.A., Нечаева Е.А. Разработка культуральной живой холодоадаптированной реассортантной гриппозной вакцины. Вопр. вирусол. 2003, т.48, №2, стр. 12-17.

3. Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика (4-е издание). Москва, Высшая школа, 1972, стр. 145-146.

4. Гребенникова Т.В., Киреев Д.Е., Забережный А.Д., Алипер Т.И. Разработка средств молекулярной диагностики. Ветеринария 2006, № 6, стр. 30-33.

5. Жирнов О.П. Белки вируса гриппа: получение растворимого полипептида Ml посредством поэтапной депротеинизации вирионов. Мол. биол. 1991, т.25, № 2, стр. 375-380.

6. Жирнов О.П. Влияние pH in vitro на депротеинизацию у орто- и парамиксовирусов. Мол. ген., микробиол., вирусол. 1990, № 3, 11-15.

7. Кингсбери Д.У. Орто- и парамиксовирусы и их репликация. В: Вирусология. Том 2, Москва, Мир, 1989, стр. 446-486.

8. Киселева И.В., Ларионова Н.В., Исакова И.Н., Руденко Л.Г. Генетическая стабильность холодоадаптированных вирусов гриппа. Вопр. вирусол. 2006, т.51, №4, стр. 13-16.

9. Львов Д.К., Подчерняева Р.Я., Вебстер Р., Ронина М.В., Пысина Т.В., Получение рекомбинантов, антигенно идентичных циркулирующим в природе штаммам вируса гриппа. Вопр. вирусол. 1979, № 5, стр. 493497.

10. Мэйхи Б. Мутанты вируса гриппа. В: «Генетика вирусов гриппа», под ред. П. Пейлиза и Д. У. Кингсбери, Москва, Медицина, 1986, стр. 186248.

11. Руднева И.А., Ильюшина H.A., Шилов A.A., Варич Н.Л., Синицын Б.В., Кропоткина Е.А., Каверин Н.В. Функциональное взаимодействие гликопротеинов вируса гриппа. Мол. биология 2003, т.37, № 1, стр. 3440.

12. Финни Д.Д. Применение статистики в опытном деле. Москва, Государственное статистическое издательство, 1957, стр. 14-32.

13. Шилов А.А., Руднева И.А., Образцова-Серова Н.П., Чайка О.В., Синицын Б.В. Генетическая изменчивость вируса гриппа человека в процессе адаптации к мышам. Вопр. вирусол. 1984, т.29, № 4, стр. 410417.

14. Шубладзе А.К., Гайдамович С.Я. Краткий курс практической вирусологии. Москва, Медгиз, 1964, стр. 379.

15. Baez М., Palese P., Kilbourne E.D. Gene composition of high-yielding influenza vaccine strains obtained by recombination. J. Infect. Dis. 1980, 141,362-365.

16. Bancroft C.T., Parslow T.G. Evidence for segment-nonspecific packaging of the Influenza A virus genome. J. virol. 2002, 76, 7133-7139.

17. Baron S., Jensen K.E. Evidence of genetic interaction between noninfectious and infectious influenza A viruses. J. Exp. Med. 1955, 102, 677697.

18. Barry R.D. The multiplication of influenza virus. II. Multiplicity reactivation of ultraviolet irradiated virus. Virology 1961,14, 398-405.

19. Basak S., Compans R.W., Studies of the role of glycosylation in the function and antigenic properties of influenza virus glycoproteins. Virology 1983, 128, 77-91.

20. Basak S., Tomana M., Compans R.W. Sialic acid is incorporated into influenza hemagglutinin glycoproteins in the absence of viral neuraminidase. Virus Res. 1985,2,61-68.

21. Baum L.G., Paulson J.C. The N2 neuraminidase of human influenza virus has acquired a substrate specificity complementary to the hemagglutinin receptor specificity. Virology 1991,180, 10-15.

22. Beaton A.R., Krug R.M. Transcription antitermination during influenza viral template RNA synthesis requires the nucleocapsid protein and the absence of a 5' capped end. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83, 6282-6286.

23. Bergman M., Muster T. The relative amount of an influenza A virus segment present in the viral particle is not affected by a reduction in replication of that segment. J. Gen. Virol., 1995, 76, 3211-3215.

24. Brown E.G. Increased virulence of a mouse-adapted variant of influenza A/FM/1/47 virus is controlled by mutations in genome segments 4, 5, 7, and 8. J. Virol. 1990, 64, 4523-4533.

25. Brown E.G., Bailly J.E. Genetic analysis of mouse-adapted influenza A virus identifies roles for the NA, PB1, and PB2 genes in virulence. Virus Res. 1999,61,63-76.

26. Brown E.G., Liu H., Kit L.C., Baird S., Nesrallah M. Pattern of mutation in the genome of influenza A virus on adaptation to increased virulence in the mouse lung, identification of functional themes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001,98, 6883-6888.

27. Brown I.H., Harris P.A., McCauley J.W., Alexander D.J. Multiple genetic reassortment of avian and human influenza A viruses in European pigs,resulting in the emergence of an HIN2 virus of novel genotype. J. Gen. Virol. 1998, 79, 2947-2955.

28. Bullough P. A., Hughson F.M., Shekel J .J., Wiley D.C. Structure of influenza hemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature 1994, 371, 37-43.

29. Burnet F.M., Lind P.E. Recombination of characters between two influenza virus strains. Aust. J. Sci. 1949,12,109-110.

30. Burnet F.M., Lind P.E. Studies on recombination with influenza viruses in the chick embryo. III. Reciprocal genetic interaction between two influenza virus strains. Aust J. Exp. Biol. Med. Sci. 1952,30,469-477.

31. Callan R.J., Early G., Kida H., Hinshaw V.S. The appearance of H3 influenza viruses in seals. J. Gen. Virol. 1995, 76,199-203.

32. Campitelli L., Donatelli I., Foni E., Castrucci M.R., Fabiani C., Kawaoka Y., Krauss S., Webster R.G. Continued evolution of H1N1 and H3N2 influenza viruses in pigs in Italy. Virology 1997, 232,310-318.

33. Castrucci M.R, Kawaoka Y. Biologic importance of neuraminidase stalks length in influenza A virus. J. Virol. 1993, 67, 759-764.

34. Chambers T.M., Hinshaw V.S., Kawaoka Y., Easterday B.C., Webster R.G. Influenza viral infection of swine in the United States 1988-1989. Arch. Virol. 1991,116, 261-265.

35. Chen W., Calvo P.A., Malide D., Gibbs J., Schubert U., Bacik I., Basta S., O'Neill R., Schickli J., Palese P., Henklein P., Bennink J.R., Yewdell J.W. A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. Nat. Med. 2001,7, 1306-1312.

36. Claas E.C., de Jong J.C., van Beek R., Rimmelzwaan G.F., Osterhaus A.D. Human influenza virus A/HongKong/156/97 (H5N1) infection. Vaccine 1998, 16, 977-978.

37. Claas E.C., Osterhaus A.D., van Beek R., De Jong J.C., Rimmelzwaan G.F., Senne D.A., Krauss S., Shortridge K.F., Webster R.G. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet 1998,351,472-477.

38. Clements M.L., Snyder M.H., Buckler-White A.J., Tierney E.L., London W.T., Murphy B.R. Evaluation of avian-human reassortant influenza A/Washington/897/80 x A/Pintail/119/79 virus in monkeys and adult volunteers. J. Clin. Microbiol. 1986, 24,47-51.

39. Compans R. W., Choppin P. W. Reproduction of myxoviruses, In: Comprehensive virology, vol. 6. Eds H. Fraenkel-Conrat and R. R. Wagner (ed.), New York, Plenum Press, 1975, pp: 179-252.

40. Compans R.W., Content J., Duesberg P.H. Structure of the ribonucleoprotein of influenza virus. J. Virol. 1972, 10, 795-800.

41. Couceiro J.N., Paulson J.C., Baum L.G. Influenza virus strains selectively recognize sialyloligosaccharides on human respiratory epithelium, the role of the host cell in selection of hemagglutinin receptor specificity. Virus Res. 1993,29,155-165.

42. Doms R.W., Lamb R.A., Rose J.K., Helenius A. Folding and assembly of viral membrane proteins. Virology 1993,193, 545-562.

43. Donald H.B., Isaacs A. Counts of influenza virus particles. J. Gen. Microbiol. 1954,10, 457-464.

44. Edwards K.M., Dupont W.D., Westrich M.K., Plummer W.D. Jr., Palmer P.S., Wright P.F. A randomized controlled trial of cold-adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease. J. Infect. Dis. 1994, 169, 68-76.

45. Elbers A.R., Fabri T.H., de Vries T.S., de Wit J.J., Pijpers A., Koch G. The highly pathogenic avian influenza A (H7N7) virus epidemic in The Netherlands in 2003 lessons learned from the first five outbreaks. Avian Dis. 2004,48, 691-705.

46. Els M.C., Air G.M., Murti K.G., Webster R.G., Laver W.G. An 18-amino acid deletion in an influenza neuraminidase. Virology 1985, 142,241-247.

47. Enami M. Structure and function of influenza virus NS1 and NS2 proteins. Nippon Rinsho 1997, 55, 2605-2609.

48. Enami M., Fukuda R., Ishihama A. Transcription and replication of eight RNA segments of influenza virus. Virology 1985, 142, 68-77.

49. Enami M., Luytjes W., Krystal M., Palese P. Introduction of site-specific mutations into the genome of influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87,3802-3805.

50. Enami M., Palese P. High-efficiency formation of influenza virus transfectants, J. Virol. 1991, 65,2711-2713.

51. Enami M., Sharma G., Benham C., Palese P. An influenza virus containing nine different RNA segments. Virology 1991,185, 291-298.

52. Flandorfer A., Garcia-Sastre A., Basler C.F., Palese P. Chimeric influenza A viruses with a functional influenza B virus neuraminidase or hemagglutinin. J. Virol. 2003,77,9116-9123.

53. Fujii Y., Goto H., Watanabe T., Yoshida T., Kawaoka Y. Selective incorporation of influenza virus RNA segments into virion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003,100, 2002-2007.

54. Gabriel G., Dauber B., Wolff T., Planz O., Klenk H.D., Stech J. The viral polymerase mediates adaptation of an avian influenza virus to a mammalian host. Proc. Natl. Acad Sci. USA 2005, 102, 18590-18595.

55. Gambaryan A., Tuzikov A., Pazynina G., Bovin N., Balish A., Klimov A. Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. Virology 2006, 344,432-438.

56. Gambaryan A.S., Matrosovich M.N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J. Virol. Methods. 1992, 39, 111-123.

57. Gambaryan A.S., Piskarev V.E., Yamskov I.A., Sakharov A.M., Tuzikov A.B., Bovin N.V., Nifant'ev N.E., Matrosovich M.N. Human influenza virus recognition of sialyloligosaccharides. FEBS Lett. 1995, 366, 57-60.

58. Gao P., Watanabe S., Ito T., Goto H., Wells K., McGregor M., Cooley A.J., Kawaoka Y. Biological heterogeneity, including systemic replication in mice, of H5N1 influenza A virus isolates from humans in Hong Kong. J. Virol. 1999, 73,3184-3189.

59. Garcia-Sastre A., Egorov A., Matassov D., Brandt S., Levy D.E., Durbin J.E., Palese P., Muster T. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology 1998, 252, 324-330.

60. Gog J.R., Afonso Edos S., Dalton R.M., Leclercq I., Tiley L., Elton D., von Kirchbach J.C., Naffakh N., Escriou N., Digard P. Codon conservation in the influenza A virus genome defines RNA packaging signals. Nucleic Acids Res. 2007,35,1897-1907.

61. Goto H., Bethell R.C., Kawaoka Y. Mutations affecting the sensitivity of the influenza virus neuraminidase to 4-guanidino-2, 4-dideoxy-2, 3-dehydro-N-acetylneuraminic acid. Virology 1997, 238, 265-272.

62. Gourreau J.M., Kaiser C., Valette M., Douglas A.R., Labie J., Aymard M. Isolation of two H1N2 influenza viruses from swine in France. Arch. Virol. 1994,135,365-382.

63. Govorkova E.A., Gambaryan A.S., Claas E.C., Smirnov Y.A. Amino acid changes in the hemagglutinin and matrix proteins of influenza a (H2) viruses adapted to mice. Acta. Virol. 2000, 44, 241-248.

64. Gregoriades A., Hirst G.K. Mechanism of influenza recombination. III. Biochemical studies of temperature-sensitive mutants belonging to different recombination groups. Virology 1976, 69, 81-92.

65. Guan Y., Shortridge K.F., Krauss S., Chin P.S., Dyrting K.C., Ellis T. M., Webster R.G., Peiris M. H9N2 influenza viruses possessing H5Nl-like internal genomes continue to circulate in poultry in southeastern China. J. Virol. 2000,74,9372-9380.

66. Guan Y., Shortridge K.F., Krauss S., Webster R.G. Molecular characterization of H9N2 influenza viruses: were they the donors of the "internal" genes of H5N1 viruses in Hong Kong? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 9363-9367.

67. Gubareva L.V., Bethell R., Hart G.J, Murti K.G., Penn C.R., Webster R.G. Characterization of mutants of influenza A virus selected with the neuraminidase inhibitor 4-guanidino-Neu5Ac2en. J. Virol. 1996, 70, 18181827.

68. Gubareva L.V., Matrosovich M.N., Brenner M.K., Bethell R.C., Webster R.G. Evidence for zanamivir resistance in an immunocompromised child infected with influenza B virus. J. Infect. Dis. 1998,178,1257-1262.

69. Gulati U., Wu W., Gulati S., Kumari K., Waner J.L., Air G.M. Mismatched hemagglutinin and neuraminidase specificities in recent human H3N2 influenza viruses. Virology 2005, 339,12-20.

70. Ha Y., Stevens D.J., Skehel J.J., Wiley D.C. H5 avian and H9 swine influenza virus hemagglutinin structures, possible origin of influenza subtypes. EMBO J. 2002,21, 865-875.

71. Ha Y., Stevens D.J., Skehel J.J., Wiley D.C. X-ray structures of H5 avian and H9 swine influenza virus hemagglutinins bound to avian and human receptor analogs. Proc. Natl. Acad Sci. USA 2001, 98,11181-11186.

72. Hartley C.A., Reading P.C., Ward A.C., Anders E.M. Changes in the hemagglutinin molecule of influenza type A (H3N2) virus associated with increased virulence for mice. Arch. Virol. 1997, 142, 75-88.

73. Hatchette T.F., Walker D., Johnson C., Baker A., Piyor S.P., Webster R.G. Influenza A viruses in feral Canadian ducks: extensive reassortment in nature. J. Gen. Virol. 2004, 85, 2327-2337.

74. Hatta M., Gao P., Halfmann P., Kawaoka Y. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses. Science 2001, 293, 1840-1842.

75. Hatta M., Neumann G., Kawaoka Y. Reverse genetics approach towards understanding pathogenesis of H5N1 Hong Kong influenza A virus infection. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2001, 356,1841-1843.

76. Hayden F.G., Rollins B.S., Madren L.K. Anti-influenza virus activity of the neuraminidase inhibitor 4-guanidino-Neu5Ac2en in cell culture and in human respiratory epithelium. Antiviral Res. 1994, 25, 123-131.

77. Hinshaw V.S., Bean W.J., Webster R.G., Rehg J.E., Fiorelli P., Early G„ Geraci J.R., St Aubin D.J. Are seals frequently infected with avian influenza viruses? J. Virol. 1984, 51, 863-865.

78. Hoffmann E., Krauss S., Perez D., Webby R., Webster R.G. Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines. Vaccine 2002, 20, 3165-3170.

79. Hoffmann E., Mahmood K., Chen Z., Yang C.F., Spaete J., Greenberg H.B., Herlocher M.L., Jin H., Kemble G. Multiple gene segments control the temperature sensitivity and attenuation phenotypes of ca B/Ann Arbor/1/66. J.Virol. 2005,79,11014-11021.

80. Hoffmann E., Stech J., Guan Y., Webster R.G., Perez D.R. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch. Virol. 2001,146,2275-2289.

81. Holsinger L.J., Nichani D., Pinto L.H., Lamb R.A. Influenza A virus M2 ion channel protein, a structure-function analysis. J. Virol. 1994, 68,1551-1563.

82. Horimoto T., Kawaoka Y. Pandemic threat Posed by Avian Influenza A Viruses. Clinical Microbiology Reviews, 2001, 14, 129-149.

83. Hoyle L. The entry of myxoviruses into the cell. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1962,27, 113-121.

84. Hughes M.T, Matrosovich M., Rodgers M.E., McGregor M., Kawaoka Y. Influenza A viruses lacking sialidase activity can undergo multiple cycles of replication in cell culture, eggs, or mice. J. Virol. 2000, 74, 5206-5212.

85. Hulse D.J., Webster R.G., Russell R.J., Perez D.R. Molecular determinants within the surface proteins involved in the pathogenicity of H5N1 influenza viruses in chickens. J. Virol. 2004, 78, 9954-9964.

86. Jin H., Leser G.P., Zhang J., Lamb R.A. Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase cytoplasmic tails control particle shape. EMBO-J 1997, 16, 1236-1247.

87. Karasin A.I., Brown I.H., Carman S., Olsen C.W. Isolation and characterization of H4N6 avian influenza viruses from pigs with pneumonia in Canada. J. Virol. 2000, 74, 9322-9327.

88. Karasin A.I., Olsen C.W., Anderson G.A. Genetic characterization of an H1N2 influenza virus isolated from a pig in Indiana. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 2453-2456.

89. Katinger D., Mochalova L., Chinarev A., Bovin N., Romanova J. Specificity of neuraminidase activity from influenza viruses isolated in different hosts tested with novel substrates. Arch. Virol. 2004, 149, 2131-2140.

90. Katz J.M., Liu X., Tumpey T.M., Smith C.B., Shaw M.W., Subbarao K. Molecular correlates of Influenza A H5N1 virus pathogenesis in mice. J. Virol. 2000,74,10807-10810.

91. Kaverin N.V. Rudneva I.A., Uyushina N.A., Varich N.L., Lipatov A.S., Smirnov Y.A., Govorkova E.A., Gitelman A.K., Lvov D.K., Webster R.G.

92. Structure of antigenic sites on the hemagglutinin molecule of H5 influenza virus and phenotypic variation of escape mutants. J. Gen. Virol. 2002, 83, 2497-2505.

93. Kaverin N.V., Rudneva I.A., Smirnov Y.A., Finskaya N.N. Human-avian influenza virus reassortants: effect of reassortment pattern on multi-cycle reproduction in MDCK cells. Arch. Virol. 1988, 103, 117-126.

94. Kawaoka Y., Krauss S., Webster R.G. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics. J. Virol. 1989, 63, 4603-4608.

95. Kawaoka Y., Yamnikova S., Chambers T.M., Lvov D.K., Webster R.G. Molecular characterization of a new hemagglutinin, subtype H14, ofinfluenza A virus. Virology 1990,179, 759-767.

96. Kemink S.A., Fouchier R.A., Rozendaal F.W., Broekman J.M., Koopmans M., Osterhaus A.D., Schneeberger P.M. A fatal infection due to avian influenza-A (H7N7) virus and adjustment of the preventive measures. Ned. Tijdschr. Geneeskd. 2004,148, 2190-2194

97. Kendal A.P. Cold-adapted live attenuated influenza vaccines developed in Russia: can they contribute to meeting the needs for influenza control in other countries? Eur. J. Epidemiol. 1997,13, 591-609.

98. Kida H., Ito T., Yasuda J., Shimizu Y., Itakura C., Shortridge K.F., Kawaoka Y., Webster R.G. Potential for transmission of avian influenza viruses to pigs. J. Gen. Virol. 1994, 75, 2183-2188.

99. Kida H., Shortridge K.F., Webster R.G. Origin of the hemagglutinin gene of H3N2 influenza viruses from pigs in China. Virology 1988, 162, 160-166.

100. Kilbourne E.D. Influenza pandemics of the 20th century. Emerg Infect. Dis. 2006, 12,9-14.

101. Kilbourne E.D. Influenza pandemics, can we prepare for the unpredictable? Viral Immunol. 2004, 17, 350-357.

102. Klenk H.D., Compans R.W., Choppin W.P. An electron microscopic study of the presence or absence of neuraminic acid in enveloped viruses. Virology 1970,42, 1158-1262.

103. Klimov A.I., Kiseleva I.V., Desheva J.A., Alexandrova G.I., Cox N.J., Rudenko L.G. Live attenuated reassortant vaccine prepared using

104. Klimov A.I., Sokolov N.I., Orlova N.G., Ginzburg V.P. Correlation of amino acid residues in the Ml and M2 proteins of influenza virus with high yielding properties. Virus Res. 1991,19, 105-114.

105. Kou Z., Lei F.M., Yu J., Fan Z.J., Yin Z.H., Jia C.X, Xiong K.J., Sun Y.H., Zhang X.W., Wu X.M., Gao X.B., Li T.X. New genotype of avian influenza H5N1 viruses isolated from tree sparrows in China. J. Virol. 2005, 79, 15460-15466.

106. Kuiken T., Rimmelzwaan G., van Riel D., van Amerongen G., Baars M., Fouchier R., Osterhaus A.D. Avian H5N1 influenza in cats. Science 2004, 306,241.

107. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680-685.

108. Lakadamyali M., Rust M.J., Zhuang X. Endocytosis of influenza viruses. Microbes Infect. 2004, 6, 929-936.

109. Lamb R.A. and, Krug R.M. Orthomyxoviridae. In: Fields Virology. Section 2, Specific Virus Families. Eds B.N. Fields and D.M. Knipe, Lippincott, Williams & Wilkins, 2001, pp: 1091-1137.

110. Lamb R.A., Choppin P.W. Segment 8 of the influenza virus genome is unique in coding for two polypeptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76,4908-4912.

111. Lamb R.A., Choppin P.W. The gene structure and replication of influenza virus. Ann. Rev. Biochem 1983, 52, 467-506.

112. Lazarowitz S.G., Goldberg A.R., Choppin P.W. Proteolytic cleavage by plasmin of the HA polypeptide of influenza virus, host cell activation of serum plasminogen. Virology 1973, 56, 172-180.

113. Li S., Liu C., Klimov A., Subbarao K., Perdue M.L., Mo D., Ji Y., Woods L., Hietala S., Bryant M. Recombinant influenza A virus vaccines for the pathogenic human A/Hong Kong/97 (H5N1) viruses. J. Infect. Dis. 1999, 179, 1132-1138.

114. Li S., Perdue M.L., Patzer E. Seed viruses containing novel avian HA and NA antigens for prevention against potential influenza pandemic. Dev Biol (Basel) 2002,110, 135-141.

115. Lin Y.P., Shu L.L., Wright S., Bean W.J., Sharp G.B., Shortridge K.F., Webster R.G. Analysis of the influenza virus gene pool of avian species from southern China. Virology 1994, 198, 557-566.

116. Lipatov A.S., Govorkova E.A., Webby R.J., Ozaki H., Peiris M., Guan Y., Poon L., Webster R.G. Influenza: emergence and control. J. Virol. 2004, 78, 8951-8959.

117. Liu C., Air G.M. Selection and characterization of a neuraminidase-minus mutant of influenza virus and its rescue by cloned neuraminidase genes. Virology 1993, 194, 403-407.

118. Liu M., Wood J.M., Ellis T., Krauss S., Seiler P., Johnson C., Hoffmann E., Humberd J., Hulse D., Zhang Y., Webster R.G., Perez D.R. Preparation of a standardized, efficacious agricultural H5N3 vaccine by reverse genetics. Virology 2003, 314, 580-590.

119. Liu M., Zhang Y., Liu C.G., Pan W.Q., Liu C.N., Yang T. Generation high yield vaccine strain wholly derived from avian influenza viruses by reverse genetics. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2006, 22, 720-726.

120. Liu T., Muller J., Ye Z. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins may control viral growth and morphology. Virology 2002, 304, 89-96.

121. Lu X., Cho D., Hall H., Rowe T., Sung H., Kim W., Kang C., Mo I., Cox N., Klimov A., Katz J. Pathogenicity and antigenicity of a new influenza A (H5N1) virus isolated from duck meat. J. Med. Virol. 2003, 69, 553-559.

122. Lu X., Tumpey T.M., Morken T., Zaki S.R., Cox N.J., Katz J.M. A mouse model for the evaluation of pathogenesis and immunity to influenza A (H5N1) viruses isolated from humans. J. Virol. 1999, 73, 5903-5911.

123. Luke C.J., Subbarao K. Vaccines for pandemic influenza. Emerg. Infect. Dis. 2006,12, 66-72.

124. Ma W., Gramer M., Rossow K., Yoon K.J. Isolation and genetic characterization of new reassortant H3N1 swine influenza virus from pigs in the midwestern United States. J. Virol. 2006, 80, 5092-5096.

125. Maeda Y., Horimoto T., Kawaoka Y. Classification and genome structure of influenza virus. Nippon Rinsho. 2003, 61, 1886-1891.

126. Marozin S., Gregory V., Cameron K., Bennett M., Valette M., Aymard M., Foni E., Barigazzi G., Lin Y., Hay A. Antigenic and genetic diversity among swine influenza A H1N1 and H1N2 viruses in Europe. J. Gen. Virol. 2002, 83, 735-745.

127. Martin K., Helenius A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. J. Virol. 1991, 65, 232-244.

128. Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y., Webster R. The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties. J. Virol. 1999, 73, 11461155.

129. Matrosovich M.N., Matrosovich T.Y., Gray T., Roberts N.A, Klenk H.D. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. 2004, 101,4620-4624.

130. McGeoch D., Fellner P., Newton C. Influenza virus genome consists of eight distinct RNA species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976, 73, 3045-3049.

131. Mitnaul L.J., Matrosovich M.N., Castrucci M.R., Tuzikov A.B., Bovin N.V., Kobasa D., Kawaoka Y. Balanced hemagglutinin and neuraminidase activities are critical for efficient replication of influenza A virus. J. Virol. 2000, 74, 6015-6020.

132. Mould J.A., Drury J.E., Frings S.M., Kaupp U.B., Pekosz A., Lamb R.A., Pinto L.H. Permeation and activation of the M2 ion channel of influenza A virus. J. Biol. Chem. 2000, 275, 31038-31050.

133. Murphy B.R. Use of live attenuated cold-adapted influenza A reassortant virus vaccines in infants, children, young adults, and elderly adults. Infect. Dis. Clin. Pract. 1993, 2, 174-181.

134. Murphy B.R., Coelingh K. Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines. Viral Immunol. 2002,15,295-323.

135. Murti K.G., Brown P.S., Bean W.J., Webster R.G. Composition of the helical internal components of influenza virus as revealed byimmunogoldlabeling/electron microscopy. Virology 1992,186, 294-299.

136. Naeve C.W., Hinshaw V.S., Webster R.G. Mutations in the hemagglutinin receptor-binding site can change the biological properties of an influenza virus. J. Virol. 1984, 51, 567-569.

137. Naffakh N., Massin P., Escriou N., Crescenzo-Chaigne B., van der Werf S. Genetic analysis of the compatibility between polymerase proteins from human and avian strains of influenza A viruses. J. Gen Virol. 2000, 81, 1283-1291.

138. Nakajama K., Compans R.W. Biosynthesis of the oligosaccharides of influenza viral proteins. Virology 1979, 93, 31-47.

139. Nakajima K. Influenza virus genome structure and encoded proteins. Nippon Rinsho 1997, 55, 2542-2546.

140. Nakajima K., Sugiura A. Three-factor cross of influenza virus. Virology 1977,81,486-489.

141. Nayak D.P., Chambers T.M., Akkina R.K. Defective-interfering (DI) RNAs of influenza viruses: origin, structure, expression, and interference. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1985, 114, 103-151.

142. Neumann G., Fujii K., Kino Y., Kawaoka Y. An improved reverse genetics system for influenza A virus generation and its implications for vaccine production. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 16825-16829.

143. Neumann G., Hughes M.T., Kawaoka Y. Influenza A virus NS2 protein mediates vRNP nuclear export through NES-independent interaction with hCRMl. EMBO J. 2000,19, 6751-6758.

144. Nichol K.L., Treanor J.J. Vaccines for seasonal and pandemic influenza. J. Infect. Dis. 2006,194,111-118.

145. Nicolson C., Major D., Wood J.M., Robertson J.S. Generation of influenza vaccine viruses on VERO cells by reverse genetics, an H5N1 candidatevaccine strain produced under a quality system. Vaccine 2005, 23, 29432952.

146. Odagiri T. Development of attenuated H5N1 avian influenza vaccines using reverse genetic technology. Nippon Rinsho 2006, 64, 1855-1864.

147. Olsen C.W. The emergence of novel swine influenza viruses in North America. Virus Res. 2002, 85, 199-210.

148. O'Neill R.E., Talon J., Palese P. The influenza virus NEP (NS2 protein) mediates the nuclear export of viral ribonucleoproteins. EMBO J. 1998, 17, 288-296.

149. Palese P., Compans R.W. Inhibition of influenza virus replication in tissue culture by 2-deoxy-2,3-dehydro-N-trifluoroacetylneuraminic acid (FANA, mechanism of action). J. Gen Virol. 1976, 33, 159-163.

150. Palese P., Tobita K., Ueda M., Compans R.W. Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuraminidase. Virology 1974,61,397-410.

151. Peins J.S., Guan Y., Markwell D., Ghose P., Webster R.G., Shortridge K.F. Cocirculation of avian H9N2 and contemporary "human" H3N2 influenza A viruses in pigs in southeastern China: potential for genetic reassortment? J. Virol. 2001,75, 9679-9686.

152. Peiris J.S., Yu W.C., Leung C.W., Cheung C.Y., Ng W.F, Nicholls J.M., Ng T. K., Chan K.H., Lai S.T., Lim W.L., Yuen K.Y., Guan Y. Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease. Lancet 2004, 363, 617619.

153. Peiris M., Yuen K.Y., Leung C.W., Chan K.H., Ip P.L., Lai R.W., Orr W.K., Shortridge K.F. Human infection with influenza H9N2. Lancet 1999, 354, 916-917.

154. Pennisi E. First genes isolated from the deadly 1918 flu virus. Science 1997, 275, 1739.

155. Philpott M., Easterday B.C., Hinshaw V.S. Neutralizing epitopes of the H5 hemagglutinin from a virulent avian influenza virus and their relationship to pathogenicity. J. Virol. 1989, 63, 3453-3458.

156. Pinto L.H., Holsinger L.J., Lamb R.A. Influenza virus M2 protein has ion channel activity. Cell 1992,69, 517-528.

157. Plotch S.J., Bouloy M., Ulmanen I., Krug R.M. A unique cap(m7GpppX.m)-dependent influenza virion endonuclease cleaves capped RNAs to generate the primers that initiate viral RNA transcription. Cell 1981, 23, 847-858.

158. Podchernyaeva R.Ya, Shchipanova M.V., Elkin V.S., Melnichenko E.I. Preparation of influenza B virus recombinant strains. Acta. Virol. 1987, 31, 475-480.

159. Polezhaev F.I., Garmashova L.M., Koval T.A., Taranova G.P., Topuriya N.V., Aleksandrova G.I. Attenuated ts-recombinants of influenza

160. A/USSR/77 (H1N1) virus obtained by crossing with the cold-adapted donor A/Leningrad/134/57 (H2N2) virus. Acta. Virol. 1982, 26, 221-226.

161. Porter A.G., Barber C., Carey N.H., Hallewell R.A., Threlfall G., Emtage J.S. Complete nucleotide sequence of an influenza virus hemagglutinin gene from cloned DNA. Nature 1979, 282, 471-477.

162. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 1938, 27, 493^97.

163. Ritchey M.B., Palese P., Kilbourne E.D. RNAs of influenza A, B, and C viruses. J. Virol. 1976, 18, 738-744.

164. Roberts P.C., Lamb R.A., Compans R.W. The Ml and M2 proteins of influenza A virus are important determinants in filamentous particle formation. Virology 1998,240, 127-137.

165. Rogers G.N., Paulson J.C. Receptor determinants of human and animal influenza virus isolates: Differences in receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on species of origin. Virology 1983, 127, 361-373.

166. Rott R. Genetic determinants for infectivity and pathogenicity of influenza viruses. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1980, 288, 393-399.

167. Rott R., Orlich M., Scholtissek C. Correlation of pathogenicity and gene constellation of influenza A viruses. III. Non-pathogenic recombinants derived from highly pathogenic parent strains. J. Gen Virol. 1979, 44, 471477.

168. Rudneva I.A., Sklyanskaya E.I., Barulina O.S., Yamnikova S.S., Kovaleva V.P., Tsvetkova I.V., Kaverin N.V. Phenotypic expression of HA-NA combinations in human-avian influenza A virus reassortants. Arch. Virol. 1996,141,1091-1099.

169. Russell R.J., Gamblin S .J., Haire L.F., Stevens D.J., Xiao B., Ha Y., Skehel J.J. HI and H7 influenza hemagglutinin structures extend a structural classification of hemagglutinin subtypes. Virology 2004, 325, 287-296.

170. Schafer J.R., Kawaoka Y., Bean W.J., Suss J., Senne D., Webster R.G. Origin of the pandemic 1957 H2 influenza A virus and the persistence of its possible progenitors in the avian reservoir. Virology 1993, 194, 781-788.

171. Scholtissek C., Burger H., Bachmann P.A., Hannoun C. Genetic relatedness of hemagglutinins of the HI subtype of influenza A viruses isolated from swine and birds. Virology 1983, 129, 521-523.

172. Scholtissek C., Rohde W., Von Hoyningen V., Rott R. On the origin of the human influenza virus subtypes H2N2 and H3N2. Virology 1978, 87,13-20.

173. Scholtissek C., Spring S.B. Extragenic suppression of temperature-sensitive mutations in RNA segment 8 by replacement of different RNA segments with those of other influenza A virus prototype strains. Virology 1982, 118, 28-34.

174. Schultz U., Fitch W.M., Ludwig S., Mandler J., Scholtissek C. Evolution of pig influenza viruses. Virology 1991, 183, 61-73.

175. Schulman J.L., Palese P. Selection and identification of influenza virus recombinants of defined genetic composition J. Virol. 1976, 20, 248-254.

176. Sha B., Luo M. Structure of a Afunctional membrane-RNA binding protein, influenza virus matrix protein Ml. Nat. Struct. Biol. 1997,4, 239-244.

177. Shapiro G.I., Gurney T.Jr., Krug R.M. Influenza virus gene expression, control mechanisms at early and late times of infection and nuclear-cytoplasmic transport of virus-specific RNAs. J. Virol. 1987, 61, 764-773.

178. Shapiro G.I., Krug R.M. Influenza virus RNA replication in vitro, synthesis of viral template RNAs and virion RNAs in the absence of an added primer. J. Virol. 1988, 62,2285-2290.

179. Sharp G.B., Kawaoka Y., Jones D.J., Bean W.J., Pryor S.P., Hinshaw V., Webster R.G. Coinfection of wild ducks by influenza A viruses: Distribution patterns and biological significance. J. Virol. 1997, 71, 6128-6135.

180. Shinya K., Watanabe S., Ito T., Kasai N., Kawaoka Y. Adaptation of an H7N7 equine influenza A virus in mice. J. Gen Virol. 2007, 88, 547-553.

181. Shu L.L., Lin Y.P., Wright S.M., Shortridge K.F., Webster R.G. Evidence for interspecies transmission and reassortment of influenza A viruses in pigs in southern China. Virology 1994, 202, 825-833.

182. Sims L.D., Domenech J., Benigno C., Kahn S., Kamata A., Lubroth J., Martin V., Roeder P. Origin and evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza in Asia. Vet. Rec. 2005, 157, 159-164.

183. Smeenk C.A., Brown E.G. The influenza virus variant A/FM/1/47-MA possesses single amino acid replacements in the hemagglutinin, controlling virulence, and in the matrix protein, controlling virulence as well as growth. J. Virol. 1994, 68, 530-534.

184. Smeenk C.A., Wright K.E., Burns B.F., Thaker A.J., Brown E.G. Mutations in the hemagglutinin and matrix genes of a virulent influenza virus variant, A/FM/1/47-MA, control different stages in pathogenesis. Virus Res. 1996, 44, 79-95.

185. Smirnov Y.A., Lipatov A.S., Van Beek R., Gitelman A.K., Osterhaus A.D., Claas E.C. Characterization of adaptation of an avian influenza A (H5N2) virus to a mammalian host. Acta Virol. 2000, 44, 1-8.

186. Smirnov YA, Gitelman AK, Govorkova EA, Lipatov AS, Kaverin NV. Influenza H5 virus escape mutants: immune protection and antibodyproduction in mice.Virus Res. 2004, 99,205-208.

187. Smith G.L., Hay A.J. Replication of the influenza virus genome. Virology 1982, 118,96-108.

188. Subbarao K., Luke C. H5N1 viruses and vaccines. PLoS Pathog. 2007, 3, e40.

189. Subbarao Xu.X., Cox N.J., Guo Y. Genetic characterization of the pathogenic influenza A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) virus: similarity of its hemagglutinin gene to those of H5N1 viruses from the 1997 outbreaks in Hong Kong. Virology 1999,261, 15-19.

190. Sugimura T., Yonemochi H., Ogawa T., Tanaka Y., Kumagai T. Isolation of a recombinant influenza virus (Hsw 1 N2) from swine in Japan. Arch. Virol. 1980, 66, 271-274.

191. Suzuki Y. Sialobiology of Influenza. Molecular mechanism of host range variation of influenza viruses. Biol. Pharm. Bull. 2005, 28, 399-408.

192. Taubenberger J.K. The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus. Proc. Am Philos. Soc. 2006, 150, 86-112.

193. Taubenberger J.K., Reid A.H., Krafft A.E., Bijwaard K.E., Fanning T.G. Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus. Science 1997, 275, 1793-1796.

194. Taylor P.M., Askonas B.A. Influenza nucleoprotein-specific cytotoxic T-cell clones are protective in vivo. Immunology 1986, 58,417-420.

195. Tian G., Zhang S., Li Y., Bu Z., Liu P., Zhou J., Li C., Shi J., Yu K., Chen H. Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1-inactivated vaccine developed by reverse genetics. Virology 2005, 341, 153-162.

196. Tsuchiya E., Sugawara K., Hongo S., Matsuzaki Y., Muraki Y., Li Z.N., Nakamura K. Antigenic structure of the hemagglutinin of human influenza A/H2N2 virus. J. Gen. Virol. 82,2475-2484.

197. Tumpey T.M., Basler C.F., Aguilar P.V., Zeng H., Solórzano A., Swayne D.E, Cox N.J., Katz J.M., Taubenberger J.K., Palese P., García-Sastre A. Characterization of the reconstructed. 1918 Spanish influenza pandemic virus. Science 2005,310, 77-80.

198. Tumpey T.M., Garcia-Sastre A., Taubenberger J.K., Palese P., Swayne D.E., Basler C.F. Pathogenicity and immunogenicity of influenza viruses withgenes from the 1918 pandemic virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 3166-3171.

199. Tyrrell D. Discovery of influenza viruses. In: Textbook of influenza, Eds, K. G. Nicholson, R. G. Webster, and A. J. Hay. U.K., Blackwell Science Ltd, 1998, 19-26.

200. Ulmanen I., Broni B.A., Krug R.M. Role of two of the influenza virus core P proteins in recognizing cap 1 structures (m7GpppNm) on RNAs and in initiating viral RNA transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, 78, 7355-7359.

201. Varghese J.N., Laver W.G., Colman P.M. Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9 A resolution. Nature 1983, 303, 35-40.

202. Wagner R., Matrosovich M., Klenk H.D. Functional balance between hemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections. Rev. Med. Virol. 2002,12, 159-166.

203. Wagner R., Wolff T., Herwig A., Pleschka S., Klenk H.D. Interdependence of hemagglutinin glycosylation and neuraminidase as regulators of influenza virus growth: a study by reverse genetics. J. Virol. 2000, 74, 6316-6323.

204. Wallenstain A., Munster V.J., Elmberg J., Osterhause A.D., Fouchier R.A.M., Olsen B. Multiple gene segment reassortment between Eurasian and American lineages of influenza A virus (H6N2) in guillemot (Uria aalge). Arch. Virology 2005, 150, 1685-1692.

205. Wareing M.D., Marsh G.A., Tannock G.A. Preparation and characterisation of attenuated cold-adapted influenza A reassortants derived from the A/Leningrad/134/17/57 donor strain. Vaccine 2002, 20, 2082-2090.

206. Watanabe T., Watanabe S., Noda T., Fujii Y., Kawaoka Y. Exploitation of nucleic acid packaging signals so generate a novel influenza virus-based vector stably expressing two foreign genes, J. Virol. 2003, 77, 10575-10583.

207. Webby R.J., Webster R.G. Emergence of influenza A viruses. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2001, 29, 356,1817-1828.

208. Webster R.G., Brown L.E., Laver W.G. Antigenic and biological characterization of influenza virus neuraminidase (N2) with monoclonal antibodies. Virology 1984,135, 30-42.

209. Webster R.G., Geraci J., Petursson G., Skirnisson K. Conjunctivitis in human beings caused by influenza A virus of seals. N. Engl. J. Med. 1981, 304,911.

210. Webster R.G., Kawaoka Y., Bean W.J., Beard C.W., Brugh M. Chemotherapy and vaccination, a possible strategy for the control of highly virulent influenza virus. J. Virol. 1985, 55,173-176.

211. White J., Matlin K., Helenius A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 1981, 89, 674-679.

212. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A resolution. Nature 1981, 289, 366-373.

213. Winter G., Fields S. The structure of the gene encoding the nucleoprotein of human influenza virus A/PR/8/34. Virology 1981, 114, 423-428.

214. Wright P.F., Webster R.G. Orthomyxoviruses. In: Fields Virology. Section 2: Specific virus families. Eds B.N. Fields and D.M. Knipe, Lippincott, Williams & Wilkins, 2001, pp: 1091-1137.

215. Yasuda J., Nakada S., Kato A., Toyoda T., Ishihama A. Molecular assembly of influenza virus, association of the NS2 protein with virion matrix. Virology 1993,196, 249-255.

216. Ye Z.P., Baylor N.W., Wagner R.R. Transcription-inhibition and RNA-binding domains of influenza A virus matrix protein mapped with antiidiotype antibodies and synthetic peptides. J. Virol. 1989, 63, 3586-3594.

217. Yoshimura A., Kuroda K., Kawasaki K., Yamashina S., Maeda T., Ohnishi S. Infectious cell entry mechanism of influenza virus. J. Virol. 1982, 43, 284-293.

218. Zheng H., Palese P., García-Sastre A. Antitumor properties of influenza virus vectors. Cancer Res. 2000, 60, 6972-6976.

219. Zhirnov O.P. Solubilization of matrix protein Ml/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology 1990, 176, 274279.

220. Zhou N.N., Senne D.A., Landgraf J.S., Swenson S.L., Erickson G., Rossow K., Liu L., Yoon K., Krauss S., Webster R.G. Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs. J. Virol. 1999, 73, 8851-8856.1. БЛАГОДАРНОСТИ.