Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ топологической гетерогенности ДНК человека на модельных (нуклеоидных) системах генетического аппарата лейкоцитов и фибропластов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ топологической гетерогенности ДНК человека на модельных (нуклеоидных) системах генетического аппарата лейкоцитов и фибропластов"

российская академия медицинских наук

р Г 8\леДИ1о-генетическии научный центр

2 7 0 КТ 1991 На правах рукописи

УДК 575. ИЗ+577.323.5

Сигора Галина Анатольевна

АНАЛИЗ ТОПОЛОГИЧЕСКОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ДНК ЧЕЛОВЕКА НА МОДЕЛЬНЫХ (НУКЛЕОИДНЫХ) СИСТЕМАХ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ЛЕЙКОЦИТОВ И ФИЕРОБЛАСТОВ

генетика 03.00.15, биофизика 03.00.02

.Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

российская академия медицинских наук медико-генетический" научный'центр

На правах рукописи УДК 575.113+577.323.5

Сигора Галина Анатольевна

АНАЛИЗ ТОПОЛОГИЧЕСКОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ДНК ЧЕЛОВЕКА НА МОДЕЛЬНЫХ (НУКЛЕОИДНЫХ) СИСТЕМАХ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ЛЕЙКОЦИТОВ И ФИБРОБЛАСТОВ

генетика 03.00.15, биофизика 03.00.02

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в группе физико-химических исследований хроматина человека Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук В.Д.Папонов Научный консультант:

Доктор физико-математических наук В.Н.Лысцов

Официальные оппоненты: Засухина Галина Дмитриевна, профессор, доктор биологических наук, заведующая лабораторией мутагенеза и репарации Института общей генетики РАН.

Спитковский Давид Михайлович, профессор, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной биологии Медико-генетического научного центра РАМН.

Ведущее учреждение: Институт- цитологии и.генетики Сибирского отделения РАН.

Защита состоится « /<£> ШЛЯ 1998 г. в У/ч . На заседании Диссертационного Совета Д.001.16.01 при Медико-генетическом центре РАМН по адресу: г.Москва, 115478, ул.Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медпко-генетического научно!« центра РАМН.

Автореферат разослан « О^&УУ-1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук,

профессор Л.Ф.Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуалъггость темы. Выделенные из клеток ДНК-содержащие системы представляют собой модели генетического аппарата, под которым принято понимать ДНК-содержащие структурные формирования клеток.

Исследования генетического аппарата человека на его модельных системах в плане их структурной гетерогенности позволяют изучать особенности многоуровневой организации системы управления жизнедеятельностью клеток, структурное обеспечение дифференциальной экспрессии генов и вопросы наследования и изменчивости в проявлении генов клеточных поколений в онтогенезе.

Без уяснения всех особенностей структурной реализации функциональных состояний генетического аппарата едва ли станет возможным понимание закономерностей функционирования клеток человека в норме и при патологии. Проблема структурной гетерогенности ДНК является основополагающей для молекулярной генетики, поскольку именно разнообразие структурной организации наследственного материала клеток обеспечивает все многообразие функционального проявления генома.

Структурная гетерогенность ДНК предполагает не только специфическую организацию последовательности нуклеотндов, по также специфическую пространственную организацию ДНК в суперспнрализовапньге петли, структурно-функциональный смысл которых еще требует активных исследований. Уровень петельной суперсниральной организации ДНК оказывает эффективное влияние на интепсивпостъ всех процессов, вовлекая в свое обеспечение специальные ферменты - топоизомеразы.

Однако, хотя первое сообщение Кука и Брэзил о суперспирализации ДНК эукариот появилось более 20 лет назад (Cook P.R., I.A.Brazell, 1975 ) все еще остается множество вопросов по поводу организации этого уровня структурирования ДНК и продолжается поиск новых подходов к его изучению.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в изучении структурной гетерогешюсти лизатов клеток человека в их реакции на шгтеркалиругощий в ДНК бромид этидия и л

поиске доказательств топологической (суперсппралыгой) гетерогенности ДНК генома человека.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие

задачи:

1. Разработать метод получения лизатов клеток человека, способный обеспечить выделение нуклеондов лейкоцитов и фибробластов в состоянии, где равновесность системы позволяет осуществлять вискозиметрическое титрование нуклеоидов ннтеркалирующим в ДНК бромидом этидия.

2. Проанализировать природу аномальной зависимости вязкости клеточных лизатов от концентрации бромида этидия.

3. Охарактеризовать полипептидный состав остаточного белка на ДНК нуклеоидов клеток человека.

4. Проанализировать возможности вискозиметрического тшрования бромидом этидия нуклеоидов в лизатах клеток для исследования популяционной гетерогенности генома человека на уровне топологии ДНК.

Научная новизна работы. Проведенные в диссертационной работе исследования являются первым шагом в экспериментальном обосновании идеи о том, что регулируемая сунерспирализация ДНК на отдельных участках генома является механизмом регуляции активности генов эукариот. Обнаружение специфических для каждого из обследованных индивидов уровней сунерспирализации петель ДНК предлагает новый тип генетических маркеров, которые как показано сохраняются у конкретного индивида в течение изученного трехлетнего периода и обнаруживают различия в разных дифференцированных клетках. Выявление определенной вариабельности сунерспирализации некоторых петель ядерной ДНК лейкоцитов при повторных заборах крови.свидетельствуют о существовании адаптациошшй реакции генома на этом уровне организации ДНК. Научно-практическая значимость. Получешше данные могут быть использованы для дальнейшего углубления современных представлений о механизмах генетических процессов с учетом дифференциальной и регулируемой сунерспирализации ДНК. Представляет интерес проведите анализа уровней сунерспирализации ДНК в клетках родственных индивидов (семейный анализ).

Основные положения, выносимые на защиту.

1.Метод вискозиметрического ттрования бромидом этидш нуклеоидов в лизироваштых специально разработанным способом лейкоцитах, и фибробластах человека, позволяет получать воспроизводимые кривые титрования при выделении клеток из конкретного объекта (однократный забор крови донора, сбор фиб-робластов с конкретного пассажа культивирования).

2. Интеркаляция бромида этидия в ДНК нуклеоидов исследуемых клеток и сопровождаемые изменения суперспирализации ДНК обусловливают экстремальный характер кривых титрования (наличие макагмумов и мшпшумов).

3. Выявлена частичная вариабельность кривых титрования доноров при повторных заборах крови, отражающая физиологические изменения геномов ленкошпов периферической крови.

4.Обнаружены специфические для каждого из обследованных индивидов уровни суперспирализации петель ДНК.

5. При сравнении кривых титрования лизатов лейкоцитов и фибробластов допоров выявлено, что в разпых дифференцированных клетках каждого индивида имеются семейства петель ДНК с достоверно различающейся плотностью су-перешгрализацни.

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и метода исследований, результаты и обсуждение, выводы, заключение, список литературы. Работа изложехи на 139 страницах машинописного текста и иллюстрирована 11 таблицами и 17 рисунками. Список литературы содержит 213 публикаций, включая 172 работы зарубежных авторов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись и обсуждались на: 9-м Всесоюзном симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра», (Черноголовка, 1987) , 1-м съезде Вангоговского общества генетиков и селекционеров, (Москва, 1994), 6-м Всероссийском симпозиуме «Эколого-физиолоппеские проблемы адаптации», (Москва, 1994), 1-м Всероссийском

съезде медицинских генетиков, (Москва, 1994), Ученом Совете МГНЦ РАМН (1537).

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ и получено авторское свидетельство на изобретение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В качестве объектов исследования в работе использовали лейкоциты периферической крови и фибробласты человека. Для получения лейкоцитов человека к 10 мл венозной крови с антикоа1улянтом.( 200 мкл 0,5 М цитрата Ка ) добавляли 3% раствор желатина в 0,15 М ЫаС! в соотношении 3:1 и инкубирорали 40 мин при После расслаивания надосадок отбирали ( около 7 мл ), клетки осаж-дшш центрифугированием в течение 5 мин при 3000 об/мин ( 1500£ ). Осадок ре-сусненднроиали в 3 мл надосадочной жидкости и осуществляли гемолиз оставшихся эритроцитов добавлением 45 мл дистиллированной воды на 30 сек, затем доводили среду до физиологической ионной силы добавлением 10 мл 3,6% КаС) к центрифугировали 5 миг. при 3000 об/мын., 1500g. Осадок рссуспсндировалн в 0,15 М №С1+1мМ РМБР. После определения в дисперсии концентрации нук-леиповых кислот готовили 10 мл суспензии клеток с концентрацией ю мкг/мл по нуклеиновым кислотам в 0,15 М КаС'1 НмМ РМ5Р, которые добавляли к равному объему лизирутощего раствора. Конечная смесь выливалась в плоскую бутыль и перемешивалась на качалке (Яоскег-р1айогт) в течете 1 часа, после чего инкубировалась при 4° С в течение 20 часов до начала измерения. Перед измерением лизат клеток повторно перемешивался па качалке в течение 30 мшт.

Конечный состав лидирующего раствора: 0,15 М КаСЬ 1м.VI РХШ'' ! 0,5% Тритон Х-100+ гепарин ( в соотношении НКленарин 1:200), +0,0025 М №2НР04+0,0175 М ЫаН2Р04, рН-6,0.

Культуры кожных фибробластов получали из биоптагов кожи, полученных из тыльной стороны предплечья доноров (Кухаренко, 1974). Для этой цели кожный биоптат в стерильных условиях размельчали на несколько кусочков размером не более 1 мм3, кусочки котиком глазного ножа помещали между двумя покровными стеклами 24x12 мм, которые переносили в пещнщллшговый

флакон. Во флакон осторожно приливали 2 мл ростовой среды и оставляли его при 37° С. Через 15-/0 дней инкуОации обычно появлялся мопослой клеток, которые после обработки трипсином переносились во флакон Карреля (60 мл ) со свежей ростовой средой. Последняя содержала 80% простой среды Игла, 10% сыворотки крупного рогатого скота, 10% сыворотки пуповшшой крови. Для измерения клетки брались, начиная с 5-го пассажа.

• Клетки фибробластов спимали 0,25% раствором трипсина. В растворе трипсина фибробласты выдерживались 3 мин, а затем 10 мин без него, но со смоченной раствором трипсина поверхностью клеток. Потом сосуд встряхивали и к отслоившимся клеткам добавляли 10 мл 0,15 М ЫаС1. Клетки ресуспендиро-вали до образования однородной клеточной суспензии. Далее клетки осаждали па центрифуге в течение 10 мин в режиме 2000 об/мин (600g). Надосадочную жидкость отбирали, а осадок ресуспепдировали в 5мл 0,15 М №С1 и снова осаждали. Полученный после второй отмывки осадок ресуспеидировали в 5 мл 0,15 М КаС1+1мМ РМЯР и доводили тем же раствором до 10 мл. После определения концентрации нуклеиновых кислот готовили 7 мл суспензии клеток в 0,15 М МаС1+1мМ РМБР с концентрацией нуклеиновых кислот 10 мкг/мл. Далее инкубировали в лнзирующем растворе аналогично лейкоцитам.

Для определения вязкости растворов нуклеоидов лейкоцитов и фибробластов человека был использован ротационный вискозиметр Цимма-Крозерса (2нпт В.К, Сго&еге Б., 1962). Дисперсию нуклеоидов лейкоцитов или фибробластов человека перед измерением тщательно фильтровали через слой капрона и помещали в рабочую ячейку вискозимтра, где определяли начальное значение вязкости. Титрование интеркалятором проводилось с шагом 0,25 мкг/мл в интервале концентраций интеркалятора от 0 до 6 мкг/мл. Причем, после каждого очередного добавления бромида этидия в рабочую ячейку вискозиметра раствор инкубировали в течение 10 минут для перемешивания бромида этидия в объеме раствора. Все кривые вискозиметрического титрования растворов нуклеоидов снимались в области ньютоновского течешга. Напряжения сдвига ( рассчитанное для дистиллированной воды) на 1-ом и 2-ом вискозиметрах составляли соответственно З,61х10"3 и 3,08 х10"3( дош/см2 ). Измерение вязкости лизата клеток при

титровании схх) бромидом этидия проводилось непосредствешю в рабочей ячейке вискозиметра. Ошибки в измерении влияния бромида этидия на клеточные лизаты определяются похрешностью определешш периода вращения ротора: ±0,1%.

Титрование клеточных лизатов бромидом этидия проводили всегда одновременно на двух вискозиметрах и уплывали только те экстремумы на кривых титрования, которые совпадали на кривых, полученных на обоих приборах.

Седиментация в сахарозных градиентах. Лейкоциты человека лизирова-ли гепарином стандартно и на следующий день нуклеоид осаждали через градиент сахарозы 10-20%, ротор 55, 10000 об/мин, 4500& 3 часа. Осадки переводили в белковый буфер стандартно для электрофореза по методу Лэммли (ЬаетпШ, 1970).

Измерения флюоресценции проводились па флюоресцентном спектрофотометре МРР-2А фирмы "НЦасЫ'ХЯпония). Готовились лизаты клеток. После каждого добавления бромида этидия раствор инкубировался в течение 10 минут. Измерения флюоресценции лизатов лейкоцитов проводились при длине волны эмиссии 590 нм и при длине волны возбуждения 510 им.

Фракционирование белков осуществлялось методом Лэммли (ЬаеттЦ, 1970 ) в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ЗБЗ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 .Отработка метода приготовления лизатов клеток человека со стабильными

гидродинамическими характеристиками. Анализ топологии ДНК в пуклеоидах обычно проводят с помощью титрования ДНК интеркалирующими в нее агентами, приводящими к преобразованию отрицательных суперспиралей в положительные в доменах кольцеобразной су-персцирализованной ДНК. Структурный переход проявляется в экстремальной зависимости гидродинамических характеристик нуклеоидов от концентраций интеркалятора. Кривые титрования имеют минимум при седимсьггационном анализе и максимум при реологическом. Данные исследования проводятся уже бо-

лее двух десятков лет. Для выделения 1гуклеоидоз использовали следующие типы лизирующих смесей: 1 - концентрированные ионные детергенты БББ, deoxycholale; 2 - ко I ще нтр и р ованны е солевые растворы + небольшие концентрации неионных детергентов; 3 - умеренные котщентращш солевых растворов (0,9 М КаС1) и неионного детергента; 4 - нолианноны (декстрансульфат и гепарин).

На ротационном вискозиметре типа Цимма-Крозерса ('¿\тт В.II., СгоЛеге О., 1962) можно наблюдать изменение вязкости во времени при выбранном режиме течения (в отличие от капиллярных вискозиметров), то есть наблюдать равновесность или неравновеспость растворов. При использовании в качестве лизирующей смеси умеренно концентрированных растворов соли ( 1 М №С1 ) наблюдалась сильная неравповеспость дисперсии пуклеоидов, причем этот характер сохранялся на вторые и третьи сутки инкубацшг При использовании в качестве лидирующей смеси забуферетпгого раствора 2 М №С1 неравновесность дисперсии нуклеоидов исчезала, но встала задача сохранения характера экстремальной зависимости вязкости от концентрации бромида этндия, поскольку позиции экстремумов вдоль оси титрования изменялись в зависимости от времени инкубации клеток в лизирующем растворе. В работе Папонова с соавт.(1988) на лейкоцитах человека показано, что реологическое титрование нуклеоцдов позволяет получшъ не менее 8 максимумов, при шаге концетрации бромида эти-дия 0,25 мкг\мл. Но они не обсуждали как меняется экстремальная зависимость после инку бации лейкоцитов в лизирующей смеси более длительное время. Мы провели измерение относительной вязкости лейкоцитов в лизирующей смеси: 1,95 М МаСНО, I М Ма:ЭДТА+2мМ трис-ОН+ 0,5% зригон Х-100, рН 8,0 через 20 и 40 часов после разведения (рис. 1) .

Из рис. 1 видно, что максимумы, которые наблюдаются в первые 24 часа инкубации, практически исчезают через 48 часов. Тшрованис же 24 точек разлить« концентраций бромида эгидая занимает приблизительно 8 часов, поэтому встал вопрос о подборе такой лизирующей смеси, которая держит систему в более стабильном состоянии. Мы обратились к лизиругощей смеси содержащей в качестве декомпактнзиругощего агента гепаркн. В работе (К А\'.А(!о1Г, 1977)

Рис.1. Ттрование личаюв лейкоцитов бромидом л иди л в 1,95 М ЫаС1+0,1 М Ыа2ЭДТА 12мМ трис-ОН+ 0,5% тритон Х-100 рН 8.0 через 20 и 40 часов после разведения.

Сэт.бр.мкг/ыл

представлены структуры, обнаруженные при обработке метафазных хромосом гепарином, представляющие собой петли ДНК, ответляющиеся от так называемого "хромосомного сюффодда", образованного белком, прочно евзанным с ДНК. В работах Папонова В.Д. с соавт.( 1980,1985) показано, что полианион гепарин в среде "физиологической" ионной силы обладает диссоциирующим влиянием на белки хроматина и декомпакгизирующим влиянием на фибриллы выделенного из клеток хроматина.

Особенности экспериментально подобранного лизирующего раствора состоят в том, что соотношение гепарин/ДНК при добавлении лизирующего раствора к клеткам становится 200-кратным. Присутствие гепарина блокирует ферментативную активность лизата (Папонов 1985). Кроме того было показано, что зависимость вязкости лизата от концентрации ДНК имеет незначительный наклон (рис.2). Это означает, что измеряя приведенную вязкость, при концентрации ДНК в яизатах клеток 2,5 мкг/мл, мы фактически получаем значаще характеристической вязкости, позволяющей судить о размерах исследуемого объекта (нуклеоида). Одновременно можно говорить о том, что в используемой ли-

зируюпгей смеси при такой концентрации клеток взаимодействие между нуклео-идами незначительно.

Рис.2. Концентрационная зависимость приведенной вязкости ДНК нуклео-ндов в лизатах лейкоцитах человека.

При подборе тезирующего раствора важную роль в стабильности системы играл рН лизирующего расгвора. Исследования проводились при рН 5,0; 6,0; 7,0; 8,0. Следует отметить, что при рН=7,0 и 8,0 наблюдалась неравповесность системы и без добавления бромида этидия. Наиболее стабильная система при воспроизводимой локализации максимумов вязкости на кривых титрования наблюдается при рН 6,0. Это предполагает, что изменение вязкости лизатов нук-леоидов во времени в нашей системе, ослабевающее при понижении рН может бьггь связано с коыформациотгыми изменениями или диспергированием агреги-роватшх нуклеоидов.

Следует отметить, что на стабильность системы влияет и время нахождения лейкоцитов в лизируюшей смеси. По-видимому, диспергирование лизатов клеток до состояния неагрегировашшх стабильно организованных нуклеоидов требует определенного времени. Экспериментально было подобрашю время приготовления: смесь выливалась в плоскую бутыль и перемешивалась на качалке (Rocker-platform) в течешге 1 часа, после чего инкубировалась при 4° С в течение 20 часов до начала измерения.

В результате был разработатан метод получения лизатов клеток человека, способный обеспечить выделение нуклеоидов ядер лейкоцитов и фибробла-стов в состоянии, где равновесность системы позволяет осуществлять вискози-метрическое титровшше нуклеоидов интеркалирующим в ДНК бромидом эти-дия.

Такое титровашге с концентрациями бромида этидия от 0 до 6 мкг\мл позволило получить нам кривые с множеством максимумов вязкости па лизатах лейкоцитов венозной крови и культивируемых фибробластов человека (рис.3). Для оценки достоверности получения макимумов воспользовались правилом трех сигм. Ниже приведен типичный расчет для одной кривой титрования.

Рис.3. Кривая титрования нуклеоидов лейкоцитов бромидом этидия. По оси абсцисс - концентрация бромида этидия, по оси ординат - период вращения ротора в секундах.

Сэт.бр., мкг/мп

Визуально обнаруживаются максимумы в точках концентраций бромида этидия 0,75; 1,75; 3,0; 3,75; 4,75 мкг/мл. Рассмотрим первый максимум. Понятно, что период вращения ротора в точке концентрации бромида этидия 0,75 мкг/мл надо сравнивать с периодами вращения в точках концентраций Он 1,5 мкг/мл. Период вращения ротора для каждой точки измерялся 6 раз. Были посчитаны средние значения периода Тср, стандартное отклонение (а). По правилу трех сигм, если выполняется неравенство ТосР + 3,03а < Тодзср- 3,03а> Т1>5ср 4 3,03а,

то максимум достоверен. Подставляем значения: 363,7< 365,88 > 364,99. Таким образом максимум в точке концентрации бромида этидия 0,75 мкг/мл достоверен с вероятностью 0,999. Была составлена таблица для всех максимумов (ем.таб. 1)

Таблица 1. Статистическая обработка кривой титрования.

Время, период вращения ротора. Концентрация бромида этидия, мкг/мл.

Ссх 0 0,75 1,5 1,75 2 3 3.5 3,75 4,5 4,75 5

т, 363,0 366,1 364,8 366,1 365,4 367,5 365,3 367.8 365,4 366,1 365,4

т2 363,5 366 364,9 366 365,5 367,4 365,4 367,8 365,4 366 365,5

т3 363,6 366 364,8 366 365,4 367,5 365,4 367,9 365,5 365,9 365,4

Т, 363,6 366 364,7 366,1 365,3 367,5 365,4 367,8 365,4 366 365,5

Т3 363,6 366,1 364,8 366 365,4 367,6 365,5 367,7 365,4 366 365,4

Т6 363,6 366 364.8 366 365,4 367,5 365,4 367,8 365,5 366 365,4

Тер 363,58 366,03 364,80 366,03 365,40 367,50 365,40 367,80 365,43 366,00 365,43

о 0,041 0,052 0,063 0,052 0,063 0,063 0,063 0,063 0,052 0,063 0,052

3,03а 0,124 0,156 0,192 0,156 0,192 0,192 0,192 0,192 0,156 0,192 0,156

Твр+З.ОЗст 363,71 366,19 364,99 366,2 365,6 367,69 365,59 367,99 365,6 366,2 365,59

Тф-З.ОЗс 363,46 365,88 364,608 365,9 365,2 367,31 365,21 367,61 365,3 365.8 365,28

Из таблицы видно, что все пять максимумов достоверны с вероятностью 0,999. Аналогичный расчет был проведен для всех кривых титрования. В дальнейшем мы оперируем терминами относительной и приведенной вязкости. Относительная вязкость представляет собой отношение вязкости раствора к вязкости растворителя. Приведенная вязкость: т|прг ( л ти -1) /С. Где С - концентрация пук-лешювых кислот.

2. Анализ влияния отдельных этапов прнготовлеття лизатов клеток человека на воспроизводимость кривых титрования.

Всего было проведено исследование лейкоцитов крови 10 человек ( 9 разных доноров и один донор повторно через три года) и фибробластов двух человек. Титрование бромидом этидия проводилось одновременно на двух виско-

зиметрах, чтобы избежать случайных ошибок. Типичные кривые приведены на рис. 4.

Рис.4. Кривые титрования нуклеоидов лейкоцитов бромидом этидия на двух ротационных вискозиметрах.

совпадают, что говорит о том, что используемая методика получения кривых титрования дает воспроизводимые результаты по положению максимумов.

Надо было проверить влияет ли процесс выделения клеток и получения нуклеоидов в лизирующем растворе на положения максимумов при титровании. Для этого у донора была взята кровь однократно, но выделение лейкоцитов и переведение клеток в лидирующую смесь проводилось независимо друг от друга ( кровь была разделена на две части, отдельно осаждалась желатшюм, отдельно проводился гемолиз, определение концентрации нуклеиновых кислот, перевод в лизируюгцую смесь и перемешивание на качалке в течение 1 часа.).(См.рис.5) Видно, что положения максимумов полностью совпадают.

Рис.5. Титрование двух независимо полученных образцов нуклеоидов го однократно взятой венозной крови донора.

105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55

• | I. - - —

■4 .г - !

\ ■ ( / А'

(- Д\

- - -

\ 1 -

4 - ( : 1

-

Ют-Ц^СЧЦЭ сс о" оГ г) ю*

-1-й образец

-2 образец

С эт. 6р. икг/ил

В результате вышеизложенного удалось разработать метод получения нуклеоидов из лейкоцитов и фибробластов человека, позволяющий получать воспроизводимые по положению максимумов вязкости кривые титрования интерка-шгругощим в ДНК агентом - бромидом этидия. Показано, что замораживание выделенных лейкоцитов в среде физиологической иоттой силы (0,15 МаС1) при -70° и замораживании фибробластов в среде Игла в нрисутствдш сыворотки и 10% DM.SC) не влияло на характер кривых титрования.

3. А нал из природы аномального (экстремального) характера кщпзых титрования лпзатов клеток человека.

Необходимо обсудить различные альтернаппшые трактовки получаемых нами кривых вискозиметрического титрования. В связи с таким большим количеством максимумов, получаемых в довольно узком интервале концентраций шггеркалирующего в ДНК агента бромида этидия (от 0 до 6 мкг\мл) для их интерпретации невозможно привлечь представление о конформациошлтх переходах В<=>2, ВоЛ, как это было сделано в ряде работ (Лучших, 1982,1983). Поэто-

му получение многочислештых максимумов на кривых вискозиыетрического титрования нуклеоидов лейкоцитов и фибробластов человека позволяет предположить наличие в нуклеоидах групп доменов суперснирализоваипой ДНК с разной плотностью суперспирализации, т.е. можно говорить о топологической гетерогенности ДНК в нуклеоидах лейкоцитов и фибробластов человека. Чтобы показать, что в используемых нами лшагах клеток именно взаимодействие су-нерснирализовашюй ДНК с шггеркалируюшим агентом бромидом этндгог дает максимумы на кривых титрования, были проведены дополнительные эксперименты. На рис.6 представлены 4 кривые титрования: кривые 1 и 2 представляют собой типичные кривые титрования лизатов фибробластов и лейкоцитов соответственно. Кривая 4 представляет собой кривую титрования лидирующего раствора.

Рис.6. Кривые титрования лизатов фибробластов , лейкоцитов, смеси, лизирующей клетки человека и комплекса клеточных белков с гепарином в ли-зирующей смеси.

1,0 7

-1.Фибробласты

-2.Лейкоциты

3.комплекс белок-гепарин

-4.Лизирующий раствор

С бр.эт. мкг/мл

Используемый нами лизирующйй раствор включает в себя сложное высокомолекулярное вещество - генартш, который при взаимодействии с этцдием бромида, возможно, может каким-либо образом изменять свою конформацию, тем са-

мым давая ряд максимумов на кривой титрования. Кривая 4 на рис.6 полностью отвергает эту возможность.

С другой стороны, существует вероятность, что белки в получаемых нами лизатах клеток при взаимодействии с гепарилом дают сложную высокомолекулярную систему, которая также может давать максимумы на кривой титрования. Для выяспепия этого вопроса был предпринят эксперимент по получешко комплекса белки-гепарин и последующему титрованию получешюй системы. Схема получетпта следующая: лейкоциты лизировали в среде высокой иошюй силы ( 2М NaCl ) в присутствии неионного детергента ( 0,5% тритон Х-100) так, чтобы концентрация нуклеиновых кислот в лизате составляла 10 мкг/мл, затем удаляли комплекс ДНК - остаточные белки центрифугированием ( 1 час при 70000 g ). Супернатант дополнительно обрабатывали ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе MSE ( Великобритания ) в режиме "High", 10 минут во льду. Понижали ионную силу среды диализом до 0,15 М NaCl и добавляли равный объем стандартного лизирующего раствора. Смесь инкубировали в течении 20 часов при 4° С, а затем титровали бромидом этидия аналогично клеточным лизатам. Кривая 3 на рис.6 представляет собой кривую титрования полученного приведенным выше способом комплекса гепарин-белки. Нетрудно заметить, что максимумы на кривой 3 полностью отсутствуют. Следовательно, единственно возможной системой, дающей максимумы на получаемых нами кривых, является суперспирализованная ДНК. Таким образом, выдвинутое предположение о наличие в нуклеоидах лейкоцитов и фибробластов человека групп доменов супер-спирализоващюй ДНК с разной плотностью суперспирализшши является па сегодняшний день пока единственно возможным обьяснашсм полученных нами кривых вискозиметрического титрования.

В литературе давно обсуждается вопрос о природе организации супер-спирализованных петель ДНК в клетках эукариотов. Предполагают, что длинные, хромосомоподобные молекулы ДНК замкнуты в петли компонентами отличной от ДНК химической природы. Для их изучения используются различные агенты, способные разрушить эти связи. Мы добавляли в лизирующий раствор 5% меркаптоэтанол, способный разрушать дисульфидные связи. Однако, экс-

тремальный характер крилой титрования не исчезал, как показано иа рис.7. Добавление в обычную лизирующую смесь ОД м хчаз ЕйТл ведет к существенному сглаживанию максимумов на кривых титрования (см.рис.8). Это указьшает на то, что пошл двухвалентных металлов вносят существенный вклад в формирование петельной структуры ДНК нуклеоидов. Это согласуется с работой Глаз-кова М.В.(1986). Методами ссдимешащюнного и флюоресцентного анализа нуклеоидов, получегшых из клеток печени он показал,

Рис.7 Кривые титрования лизатов лейкоцитов человека в лизирующей смеси с добавлением 5% меркаптоэтанола.

Рис.8. Кривые титрования лизатов лейкоцитов человека в лизируюгцей смеси с добавлением 0,1 М Ка2 НОТА.

что меркаптоэтаиол (разрывающий дисульфидтоте связи) не вызывает релаксацию суперспиралыюй ДНК. Релаксация обнаружена при совместном действии меркаптоэтанола и №2 Ь'Ш'А.

4. Электрофоретический анализ состава остаточного белка на 7МК иук-леоидов клеток человека.

Поскольку обычно при анализе химического состава нуклеоидов эука-риотов обнаруживается присутствие белка (около 5 %, Збарский (199')), был проведен электрофоретический анализ белков лейкоцитов человека, остающихся в нуклеоидах при депротехшнзации в использованной нами лизирующей среде в присутствии различного количества бромида этидия. Это было связано с возможностью диссоциации белков по мере возрастания концентрации бромида этидия и влияния этого эффекта на форму кривой титрования. Было показано, что различия в белковом спектре нет, т.е. бромид этидия не влияет качествегшо в данной лизирующей системе на состав белков, остающихся в нуклеоиде. 11ри исследовании остаточных белков, присутствующих на ДНК в лизатах фибробла-стов и лейкоцитах человека, обнаружили белки с массой, близкой к массе ви-ментипа и продукта его деградации ( 55 и 54 кДа соответственно ). Дворецкий и соав. в лаборатории Стейна (1992) обнаружили в ядерном матриксе белки с массами 54 и 43 кДа. Эти данные следует рассматривать с учетом возможной частичной протеолитической деградации белков в процессе выделения нуклеонда. В этой связи использование в нашей методике выделешм нуклеонда гепарина вместе с РМБР может оказаться фактором, способствующем значительному тт-гибированию ферментативной деградации нуклеоидов.

Для анализа белков нуклеоидов лейкоцитов человека лейкоциты лизи-ровали в стандартной лизируюшей смеси и на следующий день нуклеоид осаждали через градиент 10-20% раствора сахарозы, (ротор 55, 10000 об/мин, 4500^ 3 часа). Осажденные иуклеоиды с остаточным белком переводили в белковый буфер стандартно.

5.Анализ природы вариабельности положетпт максимумов на кривых титровагшя лизатов лейкоцитов человека при последователыгых заборах крови.

Рассмотрим особенности кривых титрования, позволяющие разлтпатъ отдельных индивидуумов. Проведено исследование кривых титрования лейкоцитов крови 9-ти человек, одного человека повторно через 3 года и кртшых титрования фибробластов 2-х человек.

Среди обследованных 9-тн пациентов 5 человек здоровых доноров ( 2 мужского пола 33 и 25 лет, и 3 женского пола 18, 21, 30 лет ), 2 пациента с синдромом Дауна ( 25 и 30 лет ), один с псориазом ( 58 лет ), один с а- ' гаммаглобулинемией ( 22 года ) ( все мужского пола ). Одтг из здоровых доноров был обследовал повторно через три года. У каждого человека бралась кровь 10 раз в течение от одного до шести месяцев, выделялись лейкоциты и проводились измерения вязкости лизатов лейкоцитов при разных концентрациях бромида этидия. У двух обследованных доноров (мужского и женского пола) были взяты биоптаты кожи и выращены фибробласты. Для измерения клетки брались, начиная с 5-го пассажа. Фибробласты лизировалн и проводили измерения вязкости аналогично измерениям для лизатов лейкоцитов.

Всего было снято 120 кргаых титрования. Все кривые титрования имели экстремальный характер и обнаруживали от 5 до 8 максимумов в пределах концентрации бромида этидия от 0 до 6 мкг/мл.

По результатам титрования составлялись таблицы встречаемости максимумов на кривых титрования (см. табл.2 (фрагмент) ) для каждого донора. Из таблиц видна вариабельность позиций отдельных максимумов при повторных заборах крови у донора. . ,, 1 .

Для выяснения причин такой вариабельности в Институте иммунологии МЗ РФ проанализировали популяциошпый состав лейкоцитов с помощью световой микроскопии и субпопуляцнонньш состав лимфоцитов на проточном лазерном цитометре. Полученные даяние дают основание связывать вариабельность кривых титровашш с изменетшем в ноиуляционном составе лейкоцитов.

Таблица 2. Положение максимумов на кривых титрования лизатов лейкоцитов доноров (фрагмент).

Попансниа пика еа кривой тшровани? - ■1

шты ДрнсоБГ I I I I I I I

Ррта N3 Концентрация бромода этцция м<т/мп

сгъгга висх 0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 2,25 2,5 2,75 3 3,25 3,5 3,75 4 4,25 4,5 4,75 5 5,25 5,5 5,75 6

11.06. 1 А - ■1' ! п-; "Л:. 1

11.03. 2 -'1 . : .1 ,-Г-

1809. 1 : 1 1 1 . М-

18.09. 2 /М" >1 1 • :г,

20.09. 1 ; 1: '1 *' •1 ! л1

20.09. 2 ■ -Н »Я'. -'1: : .1 -

30.09. 1 1 ' ГД ' . ф:

30.С9. 2 1 1 ■ : ••1 -

8.10. 1 * :1. 1 '1- 1 '■'Л,, ..'Л-. . 1

8.10. 2 1 Ж >т м-, VI'

15.10. 1 1 "-Т .1'. : .1: л;.

15.10. 2 11'-' 1.: 1", ■•К ■ л':

22.10. 1 ¡1' ; '1Л 1' 1

22.10. 2 -» 1', . л- 1 1 ■ 1 1

24.10. 1 И 5 ;т л 1 ' 1 '1* ¡4: Мт

24.10. 2 1' 1- ; ,г - '¿1;" "1: 1 ^ 1\.

30.10. 1 1-. >1 • -1. а- И' • г ';1-

30.10. 2 .1' 41 -1; ? " 1' * 11; 11 Г 1.'

25.12 1 ■ 1. - 'И' ' 1 ? а;

25.12. 2 1- "1: ■ и: •1 ;.' 1

26.12 1 V 1- • 1- - 'И • * 1 ■

26.12 2 г 1- ' -1т. м; • 1;

Итого 0 2 4 12 4 в 6 6 10 8 0 20 0 16 2 2 6 10 2 10 6 0 12 0 0

Тем не менее, наблюдение за пациентом посредством десятикратного повторного забора крови позволяет достоверно различать геном одного изучаемого индивида от другого.

Сравнение частот встречаемости максимумов вязкости для изучаемых концентраций бромида этидия позволяет статистически достоверно различить . геномы лейкоцитов всех девяти изученных пациентов и фибробластов двух пациентов. Для оценки достоверности применялся критерии % в применении к четырехпольным таблицам.(Рокицкий, 1973)

В таблице 3 приведено количество позиций встречаемости максимумов на кривых титрования лизатов лейкоцитов, по которым доноры различаются достоверно друг от друта. Из таблицы отчетливо видно, что все 9 доноров отличаются друг от друга. Донор РС, который исследовался дважды (повторно через 3 года) сам от себя не отличается. Это говорит о том, что набор из 9 кривых титрования лизатов лейкоцитов достаточен для идентификации топологического состояния ДНК генома конкретного человека несмотря на частичную вариабельность этих кривых при повторном заборе крови. >.

Таб.3. Количество позиций на кривых титрования, по которым.индивиды

достоверно отличаются друг от друга.(ф) - исследовались фибробласты донора.

РС(Ф) ЕГ(ф) БГ БМ СГ РС-1 РС-2 ЮЛ ДС-а МЮ-пс АБ-д КД-Д

РС(ф) 2 4 2 1 2 ■ 1 1 5 3 1 2

БГ(ф) 2 1 5 2 4 2 11 1 , 2 1 2

БГ 4 1 3 4 6 4 3 3 4 3 3

БМ 2 5 3 1 2 2 3 7 2 5 ' 2

сг 1 2 4 1 3 1 2 3 1 2 1

РС-1 2 4 6 2 3 0 4 8 2 5 2

РС-2 1 2 4 2 1 0 1 2 1" 1 1

ЮЛ 1 1 3 3 2 4 1 3 2 3 -2

ДС-а 5 1 3 7 3 8 2 3 3 . 6 3

МЮ-пс 3 2 4 2 1 2 1 2 3 3 1

АВ-д 1 1 3 5 2 5 1 3 6 3 3

КД-д 2 2 3 2 1 2 1 2 3 1 3

При исследовании различных клеток (лейкоцитов и фибробластов) одно-

го человека обнаруживаем, что есть позиции, при которых они различаются (БГ(ф) от БГ в точке концентрации бромида этидия 3,25 с р<0,05 и РС(ф) от РС в точках 2,25 и 5,0 с р<0,01). Это предполагает, что в разных клетках одного ин-

.Tire i г да имеются семейства петель ДНК с достоверно различающейся илотно-СТЪгО CyjucpCiiïipâjitijâurm.

Надо отметить, что при сравнении здоровых доноров и нацистов с cim-дромом Дауна, с агаммаглобул пиемией , с псориазом не обнаружено каких-либо принципиальных отличий при выбранных способах титрования, при том, что два пациента с синдромом Дауна достоверно отличаются друг от друга. Это согласуется с результатами анализа сателлитной ДНК человека, свидетельствующие о том чго ютдивидуалыше различия генома сильнее групповых различий (Cavalli-Sforza,1998 ).

6. Возможности вискозиметрического титрования клеточных лизатов бромидом этидия для исследования популяционной гетерогенности генома человека ira уровне тополопм ДНК.

Как уже обсуждалось, все обследованные доноры отличаются достоверно друг от друга по критерию % -квадрат. Один донор, обследованный повторно через 3 года, сам от себя не различался.

Можно посчитать теоретически, сколько человек можно различить хтри титровании. Всего па кривой титрования имеется 25 позиций. за вычетом первой и последней, где максимум находиться не может, остается 23 позиций локализации максимума. Всего на кривых титрования наблюдается до 9 максимумов. Определим численное значение числа сочетаний из 23 по 9, которое равно:

С92З -23!/9!/(23-9)!=817190 Такое количество человек можно различить по положению максимумов. Но существуют еще так называемые "запрещенные состояния", то есть при некоторых концентрациях бромида этидия максимумы у конкретного человека не наблюдаются при всех обследованиях. Таких состояний было по 4 у каждого человека. Определи!1,i »пшло сочетаний из 23 по 4.

С4 23—23!/4!/(23-4)!~8855

С учетом позиции максимумов и «запрещенных состояний» можно разяичить: СУ21* С4 23= 7.236.217.450 человек.

Итак, на основании проделанной работы можно сделать следующие выводы.

4.ВЫВОДЫ

■ ■ ;

1. Предложен способ лизиса клеток человека (лейкоцитов и фибробластов) и разработаны условия, позволяющие получать на этих объектах воспроизводимые кривые вискозиметрического титрования шттеркалирующим в ДНК лшан-

ДОМ.

2. Показано, что экстремальный характер кривых титрования(наличие максимумов и минимумов) обусловлен тштеркаляцией бромида этидия в ДНК нук-леоидов исследуемых клеток и сопровождаемыми при этом изменениями супер-спирализацин ДНК

. 3. Показано, что при титровашти ДНК разными концентрациями шперкаля-тора в нуклеоидах, полученных в использованной лизирующей среде, сохраняются нолипептиды с молекулярными массами 55 и 54 кДа.

4. Показало наличие частичной вариабельности кривых титрования нук-леоидов в лизатах клеток доноров при повторных заборах крови, отражающей физиологические изменетыв топологической организации геномов лейкоцитов периферической крови. .

5. Обнаружены специфические для обследованных индивидов особенности топологической организации ДНК.

6. При сравнении кривых титрования нуклеоидов в лизатах лейкоцитов и фибробластов доноров обнаружено,, что в разных диффере1щироваццых клетках каждого индивида имеются семейства петель ДНК с достоверно различающейся плотностью суперспирализащш.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. В.Д.Папонов Г.А.Сигора, С.П.Радько О динамичном и статичном хроматине. Бюлл..эксп.биол .и мед. 1986,102, № 12, с.741-743.

2L В.Д.Папонов Г.А.Сигора, С.П.Радько Проблема структурной гетерогешюсти препаратов хроматина в свете представлешш о тополопш ДНК генома. 9-й Всесоюзный симпозиум «Структура и функции клеточного ядра», Черноголовка, 1987 г., Тез.докл., с.76.

х В.Д.Папонов Г.А.Сигора, С.П.Радько, Структурная гетерогенность препаратов хроматина па уровне тополопш ДНК, Бюлл..эксп.биол.и мед. 1987, 104. №9, с. 114

£ В.Д.Папонов Г.А.Сигора, С.П.Радько, Лысцов В.И. Топологическое состояние генома эукариотов и структурная гетерогеппость препаратов хроматина. Доклады АН СССР, 1987,296, № 2, с.453-457.

5. С.П.Радько, В.Д.Папонов Г.А.Сигора, Лысцов В.Н. Радиационное воздействие на хроматин как новый подход к анализу суперспнральных кольцеобразных доменов ДНК генома клетки. 6 Всесоюз.совещание по микродозиметрии, Ка-нсв, 1989. Тез.докл., с. 148-149.

<L Алипов Е.Д., Крючков В.П., Лысцов В.Н., Сигора Г.А. Устройство для измерения реологических характеристик. Авторское свидетельство на изобретение №1389430.

7. Палонов В.Д., Г'.А.Сгггора. Вискозиметрический анализ топологической организации ДНК генома человека. 1-й съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров Л994, Генетика, 30, Приложение, с.117.

8. Г.А.Сигора, Папонов В.Д. Дипамика топологической организации ДНК генома человека, как возможная реакция на влияние внешней среды и механизм адаптации. 6-й Всероссийский симпозиум «Эколого-физиологические проблемы адаптации», Москва, 1994, с.52

i Г.А.Сигора , Папонов В.Д. Перспективы изучения топологической гетерогенности ДНК гепома человека посредством вискозимстрического титрования бромидом этидия лизированных клеток. 1-й Всероссийский съезд медицинских генетиков. 1994, с.48