Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ проводимости и рН-зависимости межклеточных каналов гепатоцитов мыши

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ проводимости и рН-зависимости межклеточных каналов гепатоцитов мыши"

9 А °

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕБОЛЩ1И ГОСУДЛРСТВЕ1-№П ФШЗЕРСИТЕТ КМ91И М.В.ЛОМОНОСОВА

биологический факультет

На прпздх рукописи

глонскга Илья -Михайлович

удк: 576.52

АНАЛИЗ ПРОВОДИМОСТИ и рН-ЗАВИСИМОСТИ МЕШЛЕТО'аих КАНАДОЙ ГК11АТ0ЩТ0В МЫШИ,,

03.00.i3 - физиология человека и животных

Автореферат лкесортзцш н.'э соискание ученой ствпе:ш кандидат?) биологических каук Москва 1Э91г.

Работа шюлвена в Институте прооЛом передачи информации Академиии наук СССР

<

Научный руководитель: члоН-корр. АН СССР, профэсоор^ доктор

биологических наук Л.М.ЧаЙЛйхян й®ицйальай9 onh&Hdirai: доктор биологических, паук Л-.Б.Йаргояио

кандидат биологических наук М.А.Посконова Бздушэе учроедеяйо: Институт олоктрохимии им.А.Н.Фрумкипа Академии

iieyK ССОР

Зашита ссстойтся "____*_______________¡S3 г, в_____часов

на заоедаиш: специализированного Ученого Совота Д.033.03.36 в Московском Государственном Унтаэрситете по адресу: Москва) 1 i'983, jteiht-icKttii гори, МГУ Им.М;В.Ломоносова Биологический факультет. С iJrjjcepTaiiie'c tooSalci ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ. Азторофорат разослан "___"___________юэ г.

УчониЙ секретарь спёц&'алйзировайного Совета кандидат биологйчбских наук

Ь.А.Умарова

I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РА КОТЫ

Актуяль^ьрстьттроОлеж. Мвкклсточнне внсокоггро:яЫавкнб контакта "(ШКУ продотаатяют собой структуры, с помошью которых соседствующие клатки з -гкзнях могут напр жую сОмоэдппгься ¡пкзкочзлекулярными метаболитами и электричоскими сигналам?. Их отхрчтиа анэели определенные коррективы в сфовмулирсзакннй ¡Члайдеиом класпиччскмй постулат 1слуточной биологии, согласно которому клетки "представляют собой индивидуальны*, неваБЯСКлм единицы ут.зни" (Лев-зивтеЯн, Г.ХЛ, !■€?).>Б тканях с хорошо резвитими ВПК их пропускающая способность полагает естостгешшЯ предел такой индивидуальности. Е)"!К нринтааэт участие с поддергаикк злектрохшкччских градизлтоа, межклеточном обмене метболиггми и сигналыш молекулами, проса-дечии вогоузденил. Изучен:« ВПК пррдставляот китарао и с «фактической точки зрения, поскольку иу&ются дан1шо, свидотельствуишк» о том, 1то изманение состояния таких контактов сопрсвокгзйт опухоло-бнЯ рост клеток. аритмии и ткани сердца (Веркичблит и др..

Исследование морфологической и молекулярной структура, г?лко • иомаркостоЯ регуляции и функционального насначопил ИИ оячз из актуальных оадач совремзшюй клеточной Сколот'., ЭгохтрофдоохэгН" чес!с1г1* анализ межклеточных доменов мембран пригр.ян ъне.тзч-: ягкосп-13 пс-чт-ос о том, каковы механизмы, обес1Ю'пн;«эг.иа ди4>Гуа;«;о попов и метоооли-ов из клетки' в клетку. глштрпфяизлугвгсеки'» могяя являются удойшм подходе« к зналиэу деРстрия фактмрез, рагулир./*, Щ5К проницаемость межклеточных мзг/.Орг.н.

В гечекио тридцатилетних интенсивных вссл'доганкй яг.л'2ну л мокклс-точпоЯ гтрог-.оддаостн сформировалось нре 1стаг..':"':гчг; о Ы1К к'зК о •'.-счкжупиост". специфичоокп.". но обладающих са-.-октевнооть» ус«клеточных кьнало.ч, мот^слогичепим коррелятом которых .чкляотс* качтакг. Г< .нп'птол'дэв время достигнуты спеч-чтллвд«'* успехи зг солиста '^нчхил^г^скиг. и Мо'л^.чулйрно-Оиологичсских исс.!идокаш1Л ЬГ'К:

ьыдолоно и охарактеризовано семойстто бел:« ов ВЛК-кошгскикноз; клонированы кодирущ/л конхексини ткапеспецифические JCHIí; к белкам

л

ВПК получоцы моно- и г.оликлоналыше антитела (bermett, 19У1). С другой ciopoim, развитие современных э.чоктрофизиоло:т№<с::их методов ИССЛОЦОВЗШЯ позволило Билотну» приблизиться К ПРЯМОМУ ИОМйрО-нию проводимости и кинетических характеристик межклеточных. каналов (lieytor., TjMatinann, 1 'J8S). Особенно эффективном с Э1СЙ точки зрения продст&акяотся метод решстрацга токов соеедню. клеток в условия фиксации потенциалов (двойная "wholc-oell•• -регистрация). Метод обеспечивает больаую точность и разрешающую способность (вплоть до ■иаморения проводимости одиночных межклеточных каналов) и позьолнет контролировать составы внутриклеточных сред посредством диализа клеток растворами, заполняющим отводящие пипетки. Таким образом, исследователям.; предоставляется возможность анализа конкретных механизмов сопряжения моишоточной проницаемости и метаболизма, п частности, регуляции внутриклеточных процессов со сторону гормонов и медиаторов.

Цель_и_садата_иссл5£о§ания. В сочетании с высокой разрешающей способностью, теглкка двойной w»ihola-oeii,,-poracTpauim - один из наиболее эффективных методов исследований в области Ы1К, способных, предоставить информацию о молекулярных механизмах явлений межклеточной проницаемости. Целью настоящей работа было, ьо-перььх, использование всзмолюстей метода для анализа разосланного (блокирующего меяш, точную проьодимость) действия, окакыьаемого обогащенными С02 ра<г:вопами на ВЛК иэолкрсвагашх пар гопагошпов мики. Прямой проверке полагалось выдвинутое ранее яре цполоксние о ток, что оф£ект СС« обусловлен апшлшем г>нутргс:лу точного рЧ (Тчг1п ut al., 1у7<Л к не связан с новмгаяяем внутркклото шого С г" . Постовых, разобщающий зфхект таких растворов (далое называемая эффектом 00,,) использовался для оценки npoi:onrM'jt;'¡! удкпочннх моэе-

клеточшх копалов ВГК печеночных клеток. Конкретными задачау;: настоящей робота бил;?:

1.Описание и эпялж? эффекта обогащенных СО., растворов на проводимость межклеточных контактов з изолированных пара/, гепато--цитоп [«аи котодсм двойной ни11о1е-оо11"-регистрэцж. С это1 целью гепзтош'ты подвергали внеклеточной перфузии (супорфузкк растворами, обогзщешшми С02. Анализировали время, степень угнетения к обратимость оф1*зкта углекислого газа.

о ,

2. Оценка роли внутриклеточного С а'' как возмогиого посредника разобщающего действия СО^. Для '¿того клетки подвергали диализу растворам с различными концентрациями свободного ('а' 4' и кальикп-внми б.,'с»мрам1 и обрабатывали сОогаь.екшми СО.-., растворами с флкси-рсвэтпшм значением рН.

3. Прямая проверка представлений о том, что аффект С02 '-С5ус— ловлен сиихониом внутриклеточного рН. С этой целью: а) гепатоцитк подвергали диализу кислыми растворами различной бу^рней енлн; 6) разоощиааг/еся а ходе эксперимента клетки еуперфузнровп.::;: сэдол.ччи-тг.тк иетачлязму раствором ■

(тагха проводкиости одиночных мотсл.".! сччих ¡'-игалов, гопагонитев жши. Эффект С0о использовали для блокирое.симя шггег-ральгой да жле точной проводимости; г:ола-?чыЯ сигнал гфлуктуя.чкя <;к) выделялся из шума с помощью устройства сюароннсй детекции; величина 7 рассчитывалась с помомья анзлЕза фдуктузгхиЯ <зг. ;>эуч1ьчгт_ловизна_работа. 1: помощь» мотога лглЯнс« "«•!!";7ое.;1"-регистрации показано, что еупор-рузид изоларокзкчих пар гппа?пц»тде мнши растворен, обобщенным С0~. приводит к быстрому дозо-гасисэдзму обратимому угнетении межклеточной про.*одйкозтв (Ск). Обработка клеток расгп"г.',ми, рН которых снижался с рояывыэ не пряпоюпдего через кемэроч.у буферного соазиионии ад?, не с хасыизло педоенот лейотния. 3;.к:;сл<лв«о внутриклеточного с;'дер;са«ого, соп-

ровокданцее обработку гыютоцитое раётдораки, содержащими СО.-,,

приводит к увеличенкю. внутрдаметочной концентрации свободного Са

*

за счет рН-зависимости Оа^-свдй^ида свойств хелатора юта . Иами впервые было показана, что увеличение рСа "внутриклеточных" растворов с 7 до 9 не шжлот на способность расгвсроБ СОр блокировать (¡к; применэшо т зависимого от рК хелатора Са" BAPl'A также кп сказывается на жДектв СО.;. На основании о тих экспериментов сделан вывод с. том, что механизм действия СОо не сподитсл к сонут-птвупцзму повеет!*; концентрации свободного вешу его висво-ооадения из комплекса Ca-EGTA пли выброса катиона из внутрюслеточ-депо.

Предположение о том, что разобщающий э№кт СО, опосредован снзисонлем внутриклеточного рН, подвергалось прямой проверке в серии ыссперимритов, ' в которой проводили диализ клеток кислыми "внутриклеточных".!" растворами. Показано, что такой диализ способен имитировать действие СОо на' ск. Повышенно буферной силы "внутри-клоточннх" растворов, исключение уточки Н*' во внеклеточную среду (выравнивание трансмомбранного протонного градиента), икгибировэ-ние Ыа+/Н+-антипортера (обработка клеток средой, не содержащей ионов ыа+) увеличивают эффективность разобшения, развиваниегося при диализе гепатоцитов кислые растворами. Заболачивание внутриклеточного содержимого, достигавшееся с помощью содержавят Nli^CH (но не NaQH) внеклеточных растворов, приводит к полному восстаноь-ленив oR. На основании этой серии экспериментов сделан вывод о тем, что вызываемое CO., разобщение, по всей вероятности, опосредуется сникекизк внутриклеточного рН.

Разобщающее действие СОр било использовано для сценки проводимости одиночшх меислеточкмх каналов гепатсиитоз мыши С целью улучшения соотношении "сигнэл-^ум" регистрации испзльзо&'-лн технику "look-in" (синхронная догокцчя). График зависимости диспе-

рсяи Ск от среднего значения проводимости (£к) представляет

гобой параболу, что согласуется с представлением? о том, что ВПК состоят из независимо срабатывающих к .-.на лов с одним уровнем nvonо-димости. "¿'ассчктвнныв значения 7 лежат в области напдантдах значения параметра, измеренных прямнм способом на других объектах. Н5УН"ОгЩ^?Тич?ская_значшость_рзбдти. Использованная е рабогэ экспериментальная модель (изолированные пары гзпатоцитов мыши) и метод (двойная "wnolo-oell"-регистрация) позволяв проводить исследовании регуляции проницаемости мембран печеночных клеток. Преимуществом такого подхода является полная информация о состоянии олектройазиологичоских. параметров (проводимостей контактной и н°*снтпкт!ША' мембран, мембранных потенциалов, траггскембрагашх токов), высокая разреаашая способность метода (вплоть до измерения проводимости одашочных мекклэточш/х каналов), возмогаость контролирования составов внэклоточной и внутриклоточкой сред. Описании? свойства модели предоставляют уникальную возможность ггроведениг исследований в области гормонально? регуляции ¡трошглаэ-мости х/и точных мембран г норме У. патолога!, поиска и апяллзя действия опосредующих, влкягае гормонов вторичных мессеаджсрсп, скрининга Фармакологических агэптов. В случае дсстизсения нцсяспй степени р.азргкенил сигналов такой анализ миатт • псс>од»т ей на уровне одиноч;шх каналов.

Иес.'^доьаиив блокирующего с дойгтпия со,, ир^ястарляй? инто-ре с как ч "инструшнталььсп", так и с научной точки зрении. анализ о на у\х>ьно одгегачшх кргплов в ряд* хоре®-; сгяспшыл (зйлагаюьях I-UC-киш -тачаниями о.,? ¡таточках енотом возгажш ,т с при/ei«» -iraew сяокятергв, а СО« - достаточно уякр-эрсадоюз угкч-

тегсгс» !!ПХ (Srr^y. W> •. С друге", стортм, внутриклеточный рН (рН •' мгхэт <ят посредником действия, сх.г-жпшого на о.с ряде.« Горм:»!! \ Г* »ir-uUi et а' .. 1931; De Vrie:> ct a!., i;<6'.t). ОтраСОТКа

методов фиксации и направленного сдвиг'? рК^ в диализуемых клеткчх мокет сказаться полезно!* как для анализа предполагаемого моссозд--парного действия }>КВ, так- и для исследования любах других рН-зависимых функций клетки, в том числе, механизмов, обоспечивайцнх поддержание постоянства рНв.

Техника синхронной детекции позволяет осуществлять пэстслшое намерение «к с высоким амплитудным разрешенном, что удобно анализа биохимических к фармакологических модуляторов и1;. './гот метод может оказаться сдинстзеиним подходом к исследованию проводимости одиночных мемшз точных каналов в клетках с высоким уровнем базовых кумов.

¿(цюб5цкя .работы • Материалы диссертации докладывались ка Всесоюзных симпозиумах "Иогаше каналы в биолоппеских мембранах" (Кара-Даг, 1Я39, 199$) -и Международном семинаре "Молекулярная и клеточная биология долевых контактов" (ФРГ, Ирзсе. 1У8&). Диссертация апробирована на семинара лаборатории Я 12 ("Информационные процессы в биологических системах") ¿Института проблем передачи информации ¿Н СССР.

Публгсазди. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, шестая публикация находится в печати»

о^укт$;рг_и_обгем_работы. Диссертация изложена на 13*3 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (Глава I), опиезнжг объекта к метало» исследования (Глава II), результатов исследований и их обсуждения (Глава Ш)г заклв'шлия (Глаза IV), выводов и библиографического указателл, содархацого К1 отечественных и '¿02 зарубежных источника. Работа иллюстрирована рисунками и 4 таблицами.

ОГ/ЬЕКТ И МЕТОДй ЙСОДДОВАКЖ 1]а2вичная_культура ^епптощ?тсг;_ж Культуру клеток получа• ли, порфузируя ::-?чеш. беекзлызквим раствором, а зятем распором.

п

содержащим ксллагеназу (Segien, 1973: Дугоша-Барковскэн, Миттель-ман ; S31). Извлеченный орган диспергировали до ^кхсда отдельных

V ч

клотск. Суммарный выход гяпатоцитов составлял 10 -10" клеток/г :ro'íoin;, кгза-jcnocoOfiocTi. (по тосту трипаловнм cierre') - 80--9CS. Получе!шук суспензии (10-10" клеток/:лп) выливали на пластиковые чашки Петри. Клетки культшзирозали при 37с0 в '•рэдо ir-ir- в присутствии 1С?; омбриоьэльной телячьей сыЕсротки (Serva). Чорэз 1,5-2 часа после посева удаляли ..но прикрепившиеся к субстрату клетки. ЭлэктроС'Изиологические эксперименты проводили через 3-7 часов после посев?, при комнатной температуре (23-£Ь°С). С1лектрар1Г^;!ологичрсю;е_экст_:ер . Проводимость РГ:К измерялась методом дсоРнсЙ "whole-<-еИ"-регистрацни (иямерэнкс токов соседних клеток п режиме фиксации потенциалов), Для оценки проводимости одиночных межклеточных каналов использовали усилитель синхронной детекции ("ior.k-ín"). Суть метода двойной "whole-cell "--регистрации состоит в том, что каадад из пари меток'с помощь» отводящих пипеток подключается к усчлителю "patch-clanj-'" в кок,£:гурйцш: "who1, е -ср 11" (регистрация от целой клетки ь условкм\ плотного контакта). Тгжой подход позволяет создавать трпнсхсн'гдчтнуу разность пстетдаалов (д7) и измерять ток, текуядай через сопротивление контакта г,. (rK=VG,t). Значения GK вычисляли по Фгфмул пм

т2'/¡Avr {11' rni-I2'' гп?'' 11 г>;0 L\ и

- токи, отЕодимке от порвоЗ и второй клеток пр.! подятг manor-

•га потнпмалов ¿V, на первую клечку, a u - токи, .ппододие

от второй- и первой клеток при подаче ^ на втсуув клыку; м-

гпо'-'сопротивления per истраруяцлх пипеток, значения српоотиед*-

кий неконтактных кембтан (г^ и г^; вычислялись из сом ношений

и V'i^VV1, х? Р1-':еа ТСКСР, ГОКУЦИ/

через гк| и>к, U - cynvo токов чзрзп и гк (рис. !, 3. г).

Отводящие пипетки изготовляли из стандарта ix легк'.'ГПГ.РлПГ/.- запето-

u

б .

« т '

'«Л

■it.i; Vk.AV, Vk,ûV2

10 CD

L

50MC

Рйс. 1. Эквивалентная электрическая схема'"whole-oeii"-регистрации (a) и запись токов и потенциалов .' при быстрой развертке (0). Ij , Ig* - трансхонтактный ток / 1к /.

ьок (Аяа1зtant ,•. ФРГ ) ; их сэпроташюте в растворо обычно составляло Z МОм и не превчшало 5 МОм. Лля биууильного контроля олектро^и-ииологических экспериментов использовали осциллограф С! -93; фюто-регистрзгино'сигналов осуществляли с sкрана цифрового осциллографа

• ATiOPS^I (П ;?. Piv, Computer Dapt, Karsaw Jnstituio of ТаоЬг.оло/ет» Польша). При статистической обработке дчншх вычислялось стамаЬт ■

• нос отклонение по ^рмуле _ ^---/хх'- (D: ;'''/г:J/ 1 ). ст-viv.-wec-

I

кую достоверность различий r;{ у клеточных пзр определяли с помояью дисперсионного анализа по критерию ?-<1и;:ера.

В случае применения техники синхронной детекции тс командному потенциалу ¡слетки 1 добавляли синусоидальный' сигнал u^a'inut амплитудой 3,6 мБ и частотой 80 Гц. Ток фиксация клетки 2, представляющий собой трансконтактггый ток. i (lK=u0arîjj№t), подключали ко ВХОДУ усилителя "lock-in" (Stanford Peaearoh, CR 5 'JO). ПОМИМО первого усилителя "piitoh-olanp" синусоидальный сигнал подавался по опорный вход-устройства "look-in". Синхрогашй детектор производил умножение тока фиксации второй клетки (I ) на опорную синусоиду и с помощью выходных фильтров с частотой среза С;3 Гц подавлял гармоническую компоненту результирующего сигнала.

u;vo

Y.,= u0-3.ir,ut- (-и0 <i;j-sinut) = • V--- O-coi'.ZW'.) =

bf,Ou. u?,- C„ u?• 0

= .(.„"..л + —У—к ,-ios2wt). После фильтрации Y., г - ,

то есть на выходе получали линейный сигнал, пропорциональный величине fîK <рис. 2). Этот си1тол подвергался оцифровке АЦП (CW Instruments, Mac Alien ) и обрабатывался с тжеь-о компьютера Apple Macintosh ЬЙ (коммерческая программ Lai: Vi<-w, National Tnstr. ». Исходя кз фрагментов записи, соответствовавших восстановлению при OTi-TJCKG содержащего СО,, раствора, рассчитывалось среднее значение пк, (g^, ее дисперсия и величина проводимости одиночного

о

межклеточного канала, 7, равная о"0 /0К.

Растворы. В работе использьеала двенадцать шгеклэто'тих и "внутри-клоточшх" (заполняющие отвояясл:? пипетки) раствокг-в с различными величинами рН, рОа, содеркатаем буферных осоданлттй. Обогащение CiJç, получали, пропуская чт-л каружний рпегкер »<Х» Со,. Количеству раствор-, 'иной угольной кислоты К-/;0- сс-стт.* тот го вала степень пакислоли;. с.: [ниоо.. j 'морл"р!'-- , где К - константа

гжееци.-.т;'и ¿f.C', {. рг.ру. uycri'ywHv.'fi rcniuu.3er>vni

сигнал

Ю

перемножитель ,

х"

постоянная составляющая'

сигнал (2с0)

фильтр низшие. выходной частот сигнал

I

I *

___

I---—

—о !

I г

Рис. 2. Принцип действия устройства »1оок-1пч. внеклеточный раствор, рН которого доводили до 8,0-8,1 с помоцью 4-5 мМ Ш40Н (или Маон). КЕБ (2[Н-морфолино]атансульфоноьая кислота) использовалась для поддержания рН растворов в области в,О, поскольку ее рК=6,1.

Принятые обозначения: рНц - рК внеклеточных растворов; рНь и рСа'в - рН и рОа внутриклеточного содержимого; рН^ и рСап - рН и рСа заполняющих гашетки ("внутриклеточных" растворов).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЗДНКЕ 1л_Электрдфизислогиче<ж^^ .Оас.гс^у'^цитсп

мыщк. В контрольных условиях (рН^ 7,2; рСа[; 7,о; рК^ ",2,1 с помощью метода двойной " *то 1 <! - с е 11" - ро га а т р ации были получены следуи-иие значения осношшх электрофизиологических параметров печеночных клеток: г..-8,3*4,а, Юм (п-20); г„-1&5г132 МОм ■ п-34 >; пстоицизлы

г. и." М

чпокоя клегск варьировали з пределах -Ь-50 мО. Эти значения хорошо

соответствуют полученным нами и др;т;(ми авторами длшшм Оиюнский и др., 1988; Лунина-Барксьская и др., 1У88; î^verd' г et al.,

• 7

190S), - также косвенным сцешсам (Шарозская к rp., 19Ы; Craf et al., 197 : Meyer et al., 1931). Особенностью контактов печеночных клеток является стабильность с в }словша 'сопровсвдаюшого двойную "vmole-ceil" -регистрацию диализа контрольным раствором (Душша-Барковгкал и др., 1988; Reverdln et al., 1988). Эта особенность делает пары гепатоцитов удобным объектом для анализа модуляций БПК гормонами, вторичными моссещшервми, фармакологическими агентами. 2_._йщса1ше »JiJieKTa COg на_^Ж_пар_гепатдцитов_мши. В 197?г. впервые было показано, что обеспечиваемая ;1ПК межклеточная злек-тротоничоская связь может быть блокирована при супер£узии клеток обогащенными СО-, растворами (Turin et al., 1977'. Авторы интерпретировали этот эффект как результат закисления цитоплазмы вызываемый проникающими чорез клеточную мембрану молекулами С0о (COg H^o j H^oo^ j Hf + НС03~).-Предполагалось, что протоны прямо действуют на межклеточные каналы и вызывают конформзциошшо изменения коннексинов. Эффект СОо представляет интерес не только как -универсальный (хотя и неспецифаческий) способ угнетения ВПК. Возможно, что рНв может быть посредником действия, оказываемого нэ ВПК рядом модипторов (Iwatsuki et al., 1979: De Yri«s et. al., 1989). ? Cyrii5 рфузия пар клетдк_закисле^м_отх_раствдром_^рН0 6j О ). Обогащение CO., приводит к ' зокислению внеклеточных растворов. С целью проверки, способно ли снижение рНд оказывать влияние на ВПК, пары гепатоцитов суперфузировали кислой средой. Обработка клеток раствором с pHjj 6,0 не вызывала угнетения 1к в пяти экспериментах. Инкубация гопатоцитсв в содержащей MES среде в течение 40 мин не пршюдилч к иг. полному разобщению. 8олео того, отмывка содрржарда Чй' растворам ;рНу 0,0) восстанавливала межклеточную связь, блокированную при обработке пар геиатоиктов средой, обогащенной■ CO.,

(см. :шке).

__СО2 JJз__фоне___диализа____клзток_раствором___с__рСап V.

Суперфузия клеток раствора,'vm, обогащенными CO., приводила к быстрому, обратимому, дозо-зависимому угнетению трансконтактного тока. При использовании насыщенного С02 раствора (pty-j 5,4) у 87% пар клеток (г.-7) полное разобютгис развивалось к 1,7-0,8 мин от начала супер})уаии. При обработке пар клеток раствором Со, с рН^ ¿,0 (рис. 3, г.) разобщение развивалось несколько медлошюе: у пар (п-11; полное блокирование с.у развивалось к 2,2±1,6 мин. При дальнейшем сниу.о ник содержаний С09 в наружном растворе (рНц 6,1-6,4) разобщенно клеток было неполным (до 20-50% от начальной величины т..) и

к

развивалось к 4~Ь мин.

рСа„г9. снижение рН'цитоплазмы ъ условиях диализа клеток растворами, сод-ляящима комплекс Са-ЕСТА, должно' гфиводать к увеличению концентрации свободного ¡Ca'^jg за счет изменения константы связывания EG'X'A. Известно, что ВПК ряда клоток млекопитающих обладают ДОВОЛЬНО ВЫСОКОЙ чувствительностью К [Ca^ljj (Neyton et ai.. '986 ; Noma et al., 1987). Согласно расчетам, при суп-рфузии клеток раствором С02 с pHQ 6,0, pHj, должен снизиться до б.Ь-б.7 (Turin et al., 1930). Б этом случае pCaD снижается от 7 до Ь,6 (Fabiato ot al., 1979). Такое повышение [Са2+ JR может сказаться на 0R. Чтсои проверить возмоюгость участия Са':' в описываемом эффекте С02. были проведены опыты с использованием "внутршслоточных" растворов с pHjr 7,2 и рОа^Э. Согласно расчетам, еден: pil такого раствора да 6,5 не мог.ег привести к пресыщению си.чиглоигг.-'сксгс рСас гепзтоцитав,.равного 7,0 (Woods et al., 19«С). Супер^узии клеток раствором, обогащенным С0?, с рНс 6,0, осуществляемая на фоне диализа гепатопитоБ раствором с рСа~9, приьодила к полному угнетению х е 7325 исследовании! пар (Г.--11). Среднее время развит::).

зффок' я составляло в этом случае 2,2^1 ,7 мин. Таким образом, аги-кенио рСа во "внутриклеточных" растворах не сказывалось на снооо-Зности СО., блокировать мекклвточну» проводимость, что свидетельствует о том, что эффект С02 не связан с сопутстьукдал снижнию р!^ мсоьобождешюм Са''+ из его комплекса с КОТА.

нз.^ке__^¿тск. _растьур.;Мг... ее* доедим

ЗАГ'ГА,. Дополнительным источником Сч'*4 при накис.ч-лти дагоплазмы могут являться внутриклеточные калыдовио депо. Носко-иьку со снижением рН »;та утрачивает спои Са - связывай:^ сюйст-за, рСа может превысить рассчитанное .'значение, насомим аргументом против причастности Си к разобщающему дейст;-:ч" со.., является данные, получешше в серии экспериментов с "п-утриклегочьым" рг.от -юром, содержащим но чувствительный к рН халатор Са"''* Во

зсех опытах этой сории СО., вызывал полное обр.-симс.) о ,

зремя развития эф^кта составляло 2,410,'.' мин ри.-. б).

^5._диализ..пйр_гепатопитоь_растрорж ео£йрхмда и !'<»!?4 •

3 целью выяснения действия Са на ВПК гепатецктоя мыаи нр. оали ;орию экспериментов, в которых пары клеток подвергал;; диализу заствором с (Ся64, ]п=5- 1СГ4 М. В четырнадцати подобных иигах н-»о-эдалось угнетение ак: Бремя развития аффекта от начала р.тпотра-хии до величины 1к, равной 50Ж от исходной, составляла 4, ь;;, Я млн [см. таюко Дунина-Барковская и д{)., 1988). В данной сери;: удались юказзть, что диализ клеток растворами с высокой кош.^'.чтраниея За'4, приводит к увеличению последовательного сопротивления зирущкх пипеток и, как следствие, сниконию амплитуды I... Это )бстоя-тельство затрудняет анализ эффекта разобщения, одлгко, мод-генный характер угнетения ск, гызваннэго диализом кл'.-ток р-'.створом : высокой !Са"+)п (рСаи 3,3,). - дополнительный аргумент н пользу !р*оставления о низкой чувствительности В13К г«пчго!£;;г.-ж к Са*-4 и

о.

отсутствия Са" зависимости г.Фгокта Со-..

14

а

I I

(Чю, 3. Разобщающее действие обогащенных С02 раствороз с рНц 6,0 (т) ни фоно диализа пар клеток а) раствором с р0ап 7 • (хела-тор юга); б) раствором с рСн^Э (хелатор варга).

3*.Лизлиз. пар клеток растворами.с .рНд 6^0.' С целью проверки предположения о том, что аффект СОг, обусловлен снижением внутриклеточного рП, пари гппатоцитов подвергали диализу кислыми растворами, обладавшими различной буферной силой. Если ото предположение верно, эффект СОо может быть имитирован при диализе клеток кислыми растворами. Величина р!^ 6,0 била выбрана, поскольку такое закис-деда.е цитоплазмы оказывалось достаточным для полного подавления Ск и пара?: обрабатываемых С09 гепатоцитов крыс (ярга.у ъ1 а1., 19-36). 3 .Диализ,нг>р_1и;етдк.раствордм,..содержась. 10 ^ММК^ 1рНц.. При диализе пар гепатоцитлв кислим раствором в первый момзпт реги-стрны^ среднее значение г составляло 9,?±Э,4 МОк (п-Ьв). В отли-

им от экспериментов, в которых pl^ Сил равен 7,2, в процессе диализа клеток раствором с pIIlI 6,0, наблюдалось разобщенно гепато-хятов. Условно, быстрым считалось такое угнетение I,,, ко1'да чорм 3 минуты от начала диализа второй клетки амплитуда i составляла ïe более 50'{ от исходной величины. Такая градация скоростей разсб-цения основана на расчетах, согласно которым концентрация mis в клетках к третей минуте диализа достегает 95% от содержания буфера з отводящих пипетках (Pusch, Неуег. 1983). В ходе диализа клеток раствором, содержащим 10 мМ MES (р!^ 6,0), быстрое разобщение ¡аблцяалось в 35% случаев (рис. 4, а). Г. остальных 65% экспериментов эффект развивался медленно; в ряде опытов снижения акплитудй Гк не происходило в течение первых 5-7 минут. На рисунке -î, ci тривэдено распределений скоростей разобкет'.я гопатецитов, вызван-того диализом клеток раствором, содержащим 10 мМ mid (рНп С.О).

_pacTbgiigM ___I-

[,2Щ?тов_раствдрдк_с_рП11 6,0. Обработка клеток растворами слабых оснований и их солей - известный способ еащола'шваш'я цитоплазмы (Thomas, 1974; Rood «t al., 1981J. В случае, если угнетение под [шйствием диализа пар гепатоцитов кислым раствором связано со :нижением рНв, защелачиванш цитоплазмы долило восстанавливать Г.(. 1ри суперФусии разобщешшх в результант диализа кислыми растворами lap гепатоцитов средой, содержащей 4-5 мМ КН^ОН (рНу 0,1; n-2! Ц, постанавливался до исходного уровня (рис. 4, а). Действии чн^он зтличалось высокой скорость» и сопровождалось развитие!: входяцего гока, возможно, связанного с активацией чувствительной к рПв калиевой проводимости неконтактных мембран гепатоцитов (Bear' et al., 1998). Суперфузия клеток раствором, рН которого доводили до iï.< с TJMOS1 ». не прокикашшего сил?.¡¡ого основания NaGH ¡'^ влияла на лмп-татуду 1 , либо приводила к слабому, медленному <к- увеличения 4, a i. Таким образом, выгшьаимое диализе!.', киелчч (пся/ики

1й

угнетение с: , по всей вероятности, связано с закислением внутри-

моточного содержимого.

3;?1_Схп21ф}г.2ид.иаВ_кл£>ХС«„В?ствдром_с_р90

ст|доржг1щей_иокоь_?<у\ Угнетение С(., вызываемое диализом клетзк раствором с р!^ С.О, у большинства наследованных пар развивалось значительно медленен, чем разобщение- клеток под действием СО,,, одно из везмозшх -объяснений такого несоответствия состоит в том, что осуществляемый через малуи поверхлость внутриююточный диализ но приводит к достаточно быстрому к аффективному снижению рИ^. Ь частности, причиной такой неэффективности могут быть пассивная уточка Н+ из клетки и откачивание протонов Ка*/})1 --антплортером. С целью снижения трансмембрашюго градиента концентрации И1 и блокирования антипортера медленно разобщающиеся пары гопатецитов суперфорировали безнатриевым раствором с рНу 0,0. В десяти подобных экспериментах наблюдалось значительное ускоре!ше развития разобщения; обработка клеток раствором, содержащим КН^ОН, приводила к восстановлению Сь. В случае, когда клетки суперфузировзли бознат-риэвой средой с рКц С,0 на Фоне диализа контрольным "Енутрикле-точь-.'м" раствором с р!^ 7,Я, тк оставался стабильным (п=-С>). При достаточно высокой скорости да}фузии буфера ИГГ, из пипеток в клетку (см. вы2и? §3.1> степень снижения рН зависит от соотношения буферной силы (ЕС) "внутриклеточного" раствора (при рН С,0 и концентрации мгг;, равчой 10 мМ, она составляет Ь слаЯков) и собственной БС го^атоцитов. Последняя оценивается величиной ?,0- 30 с.шГ.ков !Пося е-: иI., 1081), что при нейтральных рН эквивалентно ■10-СО бу^орз с рК,,=7,2. Естественно предположит»., ч го диализ г»пг;тоц::тон слабо забуф(>ренн:<\: кислим раствором недостаточно •}0К-;К1'1!0 сч-нгп'-т рК , с чем связано пгелбд".дан::;' м-гжчшз р.*с:<0-лгнскхе.ч пг.;;. о другой п:оронн, не.и-зя псдн.'О'ч.к исключить г.-.'р и!?!:.::"!того, что способен г.рлчо д.'й'-твог ать :п ••. -.':!-..•:•-т - !

ние каналы, (например, связываясь с ттогруггладл коишксыюв) imî осуществлять косвенное влияние на ВПК, меняя состогаие ляпидоь з контактной ооласти мямбраш, пспобил ряду упнтаад« гидрофоб ;шх веществ (Spray et al., 1590).- В этом случае нрадблалпн/о i/n;i-лешю разобщающихся пар объясняется тем, что диал:з кл<:ггл. кислим раствором не воспроизводит сффжта СО^.

3.4.а ..(<■!. М. <рН„ 6L(j}. Если наблюдаемое в прэдндущей серия злспчримснтоа преобладание медленно разоСизящихся пар связано с тем, что слабо забу-ферэннпй "внутриклеточный" раствор но способен ь достаточной степени зйкислкть цитоплазму гепатоцитоз, то уас-жшао) концентрации буфера долню способствовать _ разобщении клеток. D случае, когда кодаентраияя mes в растворах била равна 40 им {n«11 ) и ВО Ш (п--11 >, "(SusTtse" пары составляли, сооте^тсгг.еию, fAZ и'80% общею числа. Обработка клеток безнагриевнм pnsraajw с t«,0 &?фрктяв-но ускоряла рззо?ще:пге "медленных" пар. Супор^узия плеток растпо-ром, содержащим ;■ ^ мМ NK^OH аосстзпавливэла 1к до величин, близких к исходным. Рэспредилегао пар по скоростям разобвдшч при диализе клеток раствором, содержащим 40 и i!0 tai mes, показано на рисунке 4, г., г. В пяти окопергаонта?:., когда пары гепатопи-хч:. подвергали даалгзу раствором- с 80 мМ mes и рНд 7,t. aR оставалось ci-абилькпм в течение всего времени псгистршии». Таким образом.

раствор:, с большей оуфзрясЯ силой при одинаковом значении рйд обладает болэо эффективным тазоСаагицим действием. Увеличение к». Г^куирнсстд рнзобменнл rte ск.-пг.чо с повг^згаем концентрации ШЗ, а в.чгьр.го уье./ич епиом зу&па:?!! '•сгО'тр«лйтсч»Е»хпрвст5л/рсь.

Эти данние евкдотольс;вугг з шдьчу ща/аюлж'яая о том, что sv-■Jovr 00., опосредован сникони.-* pttp. К'алал ¡хйкгт'.ыюоть расобт.лл--•"лго Д'-йстьия дыъгиза ыкус-к раствором, ссдиржаздм 10 v.V «к

40

Mi 10

(УО с

го /,а 60 ро юо

20 ДО 60 80 100

Рис. 4. ) ГззоОчеиие пари клеток под действием диализа гелатоци-Toi- кислым раствором о рН^ е,0 (10 мМ MES); обработка клеток ЗиМо-шшя jiacTirOpy.u! (рНу.8,П, содержащими МаОН С; и ПН^ОН (1 У. пар по скорости разобщения в условиях.

йк«:/..-ч4> 'онток pucpoopoM с -.0 (0). Ю (в) и.80 мМ m£s (г;. По ■• чссло пар в щюаиитах от общего количества. По г.-ривонтау. - степадь упгнтсния :< трстьзй ют?те диализа у npcaeîcîsx от начальной величины тока. ,ipui; с'.О) сила, ио f.Cftf. вероятности, связана с низкой буферной сило* такого "г:г/:\.';;илеточчого" раствова.

TÎ*^"^¿'^'Гочнмх ьанплоь rynaTouyj;oç:_ ■•:/., ; с -у /л....jiiaur.a?.ач.wи:.. »клестагко» излгмрог чилх

• с:-■•.•;:•: vs, ..т.-.с.гЛч'а^ж ялу.-рг-.ти) •'¿2з»«-,л«гло-п»: у глнл'.ч-ччц«-:

праметров одиночки* шкклеточшх кппш.ъ янлздтоя ем.-cmt rtas'.cdíit :y?.i рехистрацаи. Среднеквадратичное значен;!»:; Плзововго t,;1> в

10.Ü00C г=и КГц оценивалось по формуле: i =• //ГКЗГЩУр-Т,' гдо К -юстоянияя Водьцмшга, Т - температура в гъадуосх Ншяыгаа. Reí1/,} ■ действительная часть адмиттанса клетки в iii\';-v:m Ьежчинч !e{Yr) paCC'HTUäesTCfl ПО формуле Kelïj,-JM' • '"J где

?м - емкость клетки, а ср •• rpototatw-cri. :vîktkiî. Пая

юдстаноьке реальных значений шрау-'-тров ill ¡>J-, ап-4 >'(:м) шяскячтся, что величина Ro{Yf) Moser caí ъ рассччтапг- .зо форель îei'VjJ^rjjiif'с а в полосе 100 Га и 1 КЛ'н ï.., ¡•■сП-.юц-.-.тог. рагеч, хютветстве!»но. 0,06 и 1,4 пД, что в 4-5 р&л-np-urav:"! хромавших клеток (Марти, Неер, 1387). ЗначительниЛ ьклад с л'ум рггяст-защш по току вносит шум по напряжения, У м сопр/л-нилен-:л обратной ;вязи, R , приложенный к импедансу "пинетки-юл vita". Lf.3 fассчип:-заетея по формуле '^-/.{КТ7!^ (собптваняой е:.'!гост1.Е ¡ц„ мы irpoitort-xvaeu). В полосе а.' и 1 КГц гщ, пороздзем»я и , суде', равен о,с ! 1,3 ПА (R -6'jû M:¡M>.

Помимо базового ц:умч, его источникам являются испгеые капали «контактной области клеточной мембраны, которые vary г преобладать з полосе частот < 1 КГц. С целью улучя.спка соо';« ленин • вал-шум" применяли тет'г.ку "J с.ск- in" (синхронной даг<;кциг). С у tí лстода сводится к толу» что разность потенциалов синусоидальна! •ормы навязывается гк, но не г,^ а). '¡лига образом, ггро-

ясдкг.ооп- неконтактной мембраны (флуктуации о^..,) не будут детентд--,ХЧмТЬСЯ yCTp-MÎTÎÊOV. "lock-ir." Iсм. раздел "М"ТО;иГ ).

Лоск-мг..ку для i зпатоцит?» харчктсрги высокие :.кач»-.нкя о,., для .•»цепки проводимости ча yp;ir-i? откнтх событий жоп/мат-) блокировать польшуы часть кеглг.етохнjx ;<шзлоь. На риеувве 5 ;тедс;зв-

пен-) : гаот&иие «к иод деЛсгвпр.'.' -х\,. "-ша«:а со, в первый v.owht

посусна t;cnp,'>r.c.ï'i-wrc4 увел;-:- .!:: •i^yrvyaIU..1 '¡¡.. "о м:ре вовгао-

ПО

юн

1

.■о

10а

z*

С' .ч:

ii.i

H : iC

..

■n

й. :::

<1 S I I.S 2 2.S МИЛ

время

Рис. fc. Блокирование монете точной проводимости С02 в случае применения тс-хинта сиихронлой детекции, тшшя 3 . дисперсия проводимости возрастает, а затем укапывается (рис. в). Такая ч&этеимооть дисперсии от 5К согласуется с предота-нлоннем о том, что меалиеючт»; каналы представляют собой однородную и независшло орг.батавзмадю популяцию. '5 отом случае, для малой вероятности срабатывания (р 1 ), проводимость одаючного канала, }, м<.»>т Лить р:»считана по формуле ^-o-Zva (Неер, Стивене, 19Ы). проводимости ownio'riiiix. каналов и швдх экспериментах изменялись в пред-лат. '/,в-2!-.С> iiG. paccaiimiив наш значения 7 находятся в ггре)«.г.2х на'лиеиыьпх кличга, характер!»« для пар клеток с кпзкик уровнем Eywov. регистрации (Kook ol al., 19? Я; Сотому! er. al.. iw3). Однако тзромдимзоти межклеточник каналов .других объектов •;i»37std«mr &0-1 кО tu'J 'Spray, 1990). В геь'атоиитах mu;: идентифлци-{¡■-■fMu два napiranu бодког ЕПК - кош:ексшс: M и 2п, причем оба r-wa даа'-ыт'.а !ГЧ'мср,;о ь'сг.з1акових количествах (Nlohvlson aj.,

НС

Л • л .

_____________-.........

о л le а ге л >э. у- -о • - Ш.

с ре.иош ироиодкыостъ ко.ч?ак-м Рис. 6. Характер зависимости дисперсии межхлетоидай нрсаодимосчи от садней величины а,(.

Í5B5-; 1 SSh;. Проводимость кош-зксина 32 сила прямо намерена в экспериментах, в которых Седок бил акспроесирончн в клеточней . линии с низким уровнем саган и вумов регистрация; т составляла 120-150 ПО (EgtibaU et al., 'ОЭО). Шмкмо домивир^щей проводимости авторы отменяли наличие событий с ■(, равной £0-30 пС. Низкие значения 7, характерна для нак'х зкепер.чмянгов, г.озко'лю, связаны с WM, что СО., "nop-vi-oxvr" кагалн в состояние с меньшей ирою-дишетьп; подобном сг,гйг:тв; м обладав* гидрофобные разобщители (Ve.ir.ntra «t ах., т.'Ьб;. ¿льтернт/ивнчм ярляотся пр»:дполопение :> том, что CCg преимууеотважо г.одг'-ляэ? лочев чувствитольнуг к príf, провод-кос rt кокноксина 32; o^mvbkíí растворов СО., з п«р?.ий мом<ыт

времени позволяет регистрировать активацию каналов коннексина 26.

ШСЮДУ

!. Pacraepu, ооогвщеише COg, быстро, обратимо и дого-зависамо блокируют мсжглето-шую проводимость г. порах и.ч'ллировашшх гег.ато-цчтое мъъи; диьлпз клеток ь рекиме двойней "nii'/jo-o'iii- tvnicTp'jîyi.ï m проп-т..'стг;ует рнзвгчш &тогг эффекта, обряоотка клеток или га инкубации б растворах, заккслеыгых с яомо-ui'att ко проникание го через мембрану буф.-ра ME3, не снижает QK. Таким образом, разобщяпщй эф£ект но обусловлен снижением внеклеточного pli, а сь.чзан с присутствием в растворе углекислого газа.

2. Разобщающее действие растворов, обогащенных С02, не ссяза-по с увеличением концентрации С;:*- , поступающим вследствие аакис-j'ohhîî виутриклутечного содержимого и высвобождения on* из связанной с iK'J4 фг.рга, та.с как эф^.'кт СО., развивается на фане диализ; клеток растводои с рСа г9. Согласно расчетам, згжиолаки" такс» среда не мотет приводить к превышению физиологического уроач* ÎCb^^Jj.. с-ф^кт (»., нзолядазтел в зкопериментах, в котор1« вместе eV.ta го "ьнутриклеточиа" растворах используется хелатор ВАРГА, сохраня'лиий euooK'>: сродство к За'"' с кислых средах. Это свидетельствует о тьк, что разобщавшее действие С0о, по вог-й зероятносги, нэльзя отнесги на счет другого источника погашения [Са 1Е - вну тршелеточннх кальциевых депо, о низкой чувствительное"!! ШК гепа-Toisrvor. к С.</' говорят опиты, г которых клетки подвергаются диали зу растворам с Бисокой концентрг.1»й катиона (рСа 3,3): скорост; блокк(Х'&."!П!Я i'.'K р атом случае значительно мвныад характерной дл, гк^кта С'.1,,.

3. Прямее р.-жиел-мие цктоидагмм гнпатоцитов под дьЯстяте: дк^чпоо нлотск кислими за0у4ер»?'шми ¿.эстнорами способно имитиро ьйть iv, ,ча м-ижлоточиую прогсдимость. ЭДОж-тькость разоб ovr.ero дейгтв/я упьчсит от к^кцектрщеи ■oy-j^pa: при увеличен»

^ферн"й силы подрастает количество пар, в которых рг-.асгх.евие

завивается со скоростью, характерной для аодлстэ С0~. Еясксровди-

.¡я при диализе жслыми растворами ок быстро и подность*.' госстана-

пинается при суперфушш гепатощ?тсг зчщелз'цц.йьяум внугг-иклогач--

л» содерягимое раствором ян^он! Все эти данные сБидетольотвугг о

гом. что разоЯщлтее действие СО,, по всей керонгпооти, огюсреду-

¡'ся закислекием цитоплазмы.

1. й тех экспериментах, в котеркх диализ клс-тск кисяла раст-

эрями не вызывает быстрого блокирования л , рпзобзк-яго кнетск

/ществешю ускоряетс^гри их супер1уз1ы растворами, но содсряпгими

:ноп КЗ* к низким рН (рНд 6,0). По всей вероятноеги, отсутствие

ззобщения связан^ с тем, что гепатоциты в регаме

■?Ьо1-?-се1!"- регистрации сохраняют высокук Суфэрнук; силу. Дколпз

ниток слабо забуф^-ранними кислы!«! растворам,1 ь 6с льиинстве случа-

пи спосоойн с'гипи'1 ь рН цитоггльсиы дк> урс,з;.л, достаточного для

покироъакчя о... Тот факт, чю ьре.'опфащенио пассивной угочкп Н"*"

угнетете Ка4 /И*-антипортера ¡обработка клеток безнатриевой

редей с р"я в,С.» способегьуег разобщению, свидетельствует о том,

го плазматическая мембрана мг«ех вносить существенный вклад в

Зесяечекаа поддержания вкутркклеточного рН гвязтоцитоз.

о. Ьксокий уровень базовых шумов регистрации и низкое соггра-

1вдение юнтзктчей мембраны, г... затрудняют прямое ьзмерии'е

эсводкмостя одиночных межк-кточюх. км«алов, 7, в парах гепатоци-

••3 м.г:Ч!. Для увеЛ1"1еш!Я гк (блокирован!*;-. Соляшчютйч каналов)

1ет;<ц ооы:ба .'¡тлись рзстьорзин, обогащенными С0.;.; улучшен:»

зотпо^еннч "сипшд-уум" достигалось за счет применения метода

мхронн:'.': ц^такции. Грк оглги!«о гзпатоцитой от растворов, обога-

¿иа;г '"-О,-, зависимость .«'снзрса;*. мея^-точной •"роводнмости. о,, ",

•'к

г чо сс^дн"!о зчачочия, н.-.ь-л-: 'лаи'болпческий харпкчо?. Меж к точны- 'каналы гепатоцг. гоь >.ы:-.ч: в на:,;кх зкепернмлнт.^лышх угле-

виях продст^.кк.? однородную понул.чци?.) (оолцдши' одам уровнем проводимости^ и граЗашгаыт нагшмсимо друг от друга. Рассчитанные величины 7 <7,0'2.5,;) иС) ленмт в области наименьших значений <-подгмости мех'Ш;кочнах каналов, нзкероннзЧ прямым спссьОсх на дгутх типах ¡(.четок.

Работы, опубл;:ког.ашше па гаме диссертации: |.. Дуииио-Вапкскскяя Л.Я., Шетяокий '.'.V., Чайлахян Л.М. Свойства мокклаточких контактов в доухклеючных агрегаг&х гапатоцитов мыши. Тезисы доклапов Всесоюзного симпозиума "Одкчочнно ионные каналы в биологически): момбралах", Кара-Даг. Юй;».

2. ¡'лонзкнй Н.М., Душ-ла-Еа'ркоьскам Д.Я., Чайл-хяк Л.М. Анализ действия СО., на проводимость мехмоточны* каналов. Тезисы докладов Всесоюзного гимтозиума "Ионные каналы в биологических моубранах", Кяра-Даг, 1900.

3. Пленения Я.М.. Дунина-Г-нрковскал А.Я.. ЧаЛгахян /..V. Дейстзиа СО., на проводимость коиуьчючного контакта гчпатоцитов мыши. Зависимость аффекта от концентрации Сэ^"1 во внутриклеточных растрорах. Глологичоокие «¿л/брчны, 1М1, Т. в, » б, С. 639-545!.

4. Ялонс:иЙ И.«., Л/нина-Парксвсчая Л.Я., Чайлахяя Л.М. Диализ изг.^зп.'ованзих пар гочятоцитог ьетг. внутриклеточными растворам с р!1 К.О: действие на проводимость меагаоточного контакта. Еиалоги-ческие мембрана, 1'ЛЧ, Т 8, * 6, С. 54У-5Ь7.

ОлоискпЯ Ч.Ч., Лунина-Еарко?ская А.Л., Чайлахяя "..М. Диализ изошгроргингых пар гс^а-'оцитов мыли внутриклеточными раствор-ми с ;:Н ь.Л: за^лкооть розобвдвд'.то действия от буерной силы эчг?-ворь. Пнолог-'ч^'л;;!'.,' к»м.".р-,им, , Т. У. * 10, С. 1075-1001. О Рлоп'>(-•,/ 1.Я., 1Хт:па- РагкоукКл/н А.Уь. «п Лиг.оМопа!

а'.!<*. !Г.-.1'тсИопя1 акчиЬгагкгп ^Г К«яеиг<мгл>п1 Ъу РмЬ.:)| •

С1 чо.-. ИТ 1пи'гс.»ии1«1г СотшогЛь-а'.лоп, Кампав,

-.Г; Р