Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ молекулярных механизмов взаимодействия синтетических гомологов ретинола1 с компонентами эритроцитарной мембраны и свободным гемоглобином

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Анализ молекулярных механизмов взаимодействия синтетических гомологов ретинола1 с компонентами эритроцитарной мембраны и свободным гемоглобином"

На правах рукописи

I

РЕЗВАЯ Сергей Григорьевич

АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ГОМОЛОГОВ РЕТИНОЛА! С КОМПОНЕНТАМИ ЭРИТРОЦИТАРНОЙ МЕЖРАНЫ И СВОБОДНЫМ ГЕМОГЛОБИНОМ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание учёкой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 1996

- г -

Работа выполнена в Воронежском государственном университете.

Научный руководитель - доктор биологических наук.

профессор Аргюхов В.Г.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Холмогоров В.Е., доктор биологических наук, профессор Бузлама В. С.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.В.Палладина

АН Украины

Защита диссертации состоится 30 октября 1996 года в 1330 час. на заседании Диссертационного совета К 063.48.14 при Воронежском государственном университете по адресу: 394693, г.Воронеж, Университетская площадь, 1.

С диссертацией монно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан " & " сентября 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук.

доцент /Л^^----- Ковалева Т.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Особое место в ряду синтетических токсинов в настоящее время занимают биомиметики - соединения, молекулы которых структурно гомологичны природным биологически-активным веществам. При попадании их в организм возможно индуцирование трудно предсказуемых реакций, приводящих к патологий жизненно вак-ных органов и систем. По этой причине одной из важнейших задач биофизики является установление корреляционной связи между структурой молекулы и её биологической активностью.

Разносторонние экспериментальные исследования функциональных свойств биомиметиков позволят оценить вклад отдельных групп атомов, особенности их молекулярной архитектоники в проявлении общей активности изучаемых соединений. К числу биологически-активных синтетиков с выраженными токсическими свойствами относят промежуточные продукты синтеза ретинола!: метилгептенон, дегидролиналоол и ¡5-ионон. По своей структуре последние представляют собой ненасыщенные, амфифильные алифатические и циклические соединения, обладающие летучестью и высокой проникающей способностью. Химические свойства указанных веществ изучены достаточно подробно, в то время как понимание молекулярных механизмов их биологической активности остаётся неполным.

Для выявления молекулярно-клеточных основ промышленной интоксикации человека синтетическими производными ретинола! представляет особый интерес изучение на модельных системах первичных реакций этих соединений при их взаимодействии с различными биологическими структурами. Исследования такого рода не могли получить должного развития в связи с нерешённой проблемой "доставки" гидрофобного вещества к растворенному в воде объекту исследования. Практически значимый интерес представляет задача по разработке возможных для условий производства методов утилизации синтетических токсинов из окружающей среды.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в исследовании молекулярных механизмов взаимодействия синтетических гомологов ретинола! с компонентами зритроцитарной мембраны и свободным гемоглобином.

Для реализации этой цели необходимо было решить ряд задач.

1. Разработать методику получения молекулярно-диспергирован-ных инклюзионных комплексов типа "молекула-гость - молекула-хозяин" с использованием метода молекулярного инкапсулирования и провести анализ биологической активности водных растворов синтетических терпеноидов, включённых в ИК-комплексы.

2. Изучить влияние метилгелтенона (МГ). дегидролиналоола (ДГЛ), р-ионсна и ретинола, на структурные свойства эритроцитарных мембран методом осмотических и кислотных эритрограмм.

3. ИсследоЕать спектральные свойства растворов оксигемоглоби-на, модифицированного названными алифатическими и циклическими изопреноидами.

4. Изучить комбинированное действие кетонов (спиртов) и температуры на интенсивность светорассеяния в растворах КЬ02.

5. Автоматическими методами кислотно-основного и спектрофото-метрического титрования выявить характер взаимодействия МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола! с ионогенными группами оксигемоглобина.

Научная новизна. Впервые методом молекулярного инкапсулирования получены водорастворимые инклюзионные комплексы (ИК) гидрофобных веществ (МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола!) с р-циклодекстрином (р-ЦД): в последовательно усложняющемся ряду названных изопренои-дов определён вклад отдельных групп атомов, степени полярности функциональных групп терпеноидных кетонов и спиртов, особенностей их внутримолекулярной архитектоники в проявлении ими общей активности в реакциях гидрофобного, нуклеофильного и электронофильного взаимодействий с указанными биологическими объектами в условиях, приближенных к физиологическим.

Методом автоматической регистрации осмотических эритрограмм определено, что инклюзионные комплексы МГ (ДГЛ) (1-Ю"8 + 1-Ю"3 моль/л), р-ионон (1-10-9+1'10"3 моль/л) и ретинол! (1-10~1г+1-10"3 моль/л) с р-циклодекстрином вызывают снижение осмотической резистентности эритроцитов, по величине которого (в интервале концентраций реагентов 1-Ю"6 * 1-10"3 моль/л) составлен ряд убывающей активности гемолитических агентов: МГ > ДГЛ > р-ионон > ретинол!.

Показано, что.модификация водных растворов оксигемоглобина синтетическими кетонами (МГ и р-ионон) и спиртами (ДГЛ и ретинол!) (Смод= 1-Ю"3 + 1-Ю"10 моль/л) в составе инклюзионных комплексов с р-ЦД индуцирует переход гемопротеида в окисленную форму (МШЬ).

Изучена динамика этого многоступенчатого перехода системы "Мод.+ НЬ02 Мод, - МШЬ". Установлено, что по суммарной химической активности, вызывающей изменения спектральных свойств растворов гемоглобина в условиях интоксикации (Смод> 1-Ю"5 моль/л) кетонами или спиртами, формируется (как в случае химической модификации эритроцитарных мембран) следующий убывающий ряд: р-иснон > МГ > ретинол! > ДГЛ.

Изучено комбинированное влияние температуры и амфифильных ке-тонов (МГ, р-ионон) или спиртов (ДГЛ, ретинол!) на конформационные свойства гемоглобина. Выявлен двухфазный характер конформационных переходов в апобелке, обусловленных суммарным вкладом гидрофобных, электростатических и ковалентных типов взаимодействия в системе "реагент-апоглобин".

В интервале рН 2*12 при 20 и 37 0 С установлена пропорциональная зависимость уменьшения буферной емкости растворов гемоглобина и числа ионогеннкх групп от концентрации МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола! • Представлены схемы и реакции взаимодействия амфифильных реагентов с апоглобином в кислой, нейтральной и щелочной областях рН.

Практическая значимость. Научные положения и экспериментальные материалы диссертационной работы, выполненной в рамках содружества с Белгородским АО "Витамин", расширяют существующие и формируют новые представления о молекулярно-клеточных механизмах действия синтетических изопреноидов терпеноидного ряда (МГ, ДГЛ, (3-ионона и ретинола!) на структурные свойства эритроцитарных мембран и свободный оксигемоглобин, являющиеся ключевыми звеньями кис-лородтранспортной и адаптационно-защитной систем организма.

Выявленные концентрационная и видоспецифическан (от типа реагента и биологического образца) зависимости повышения гемолитической активности зритроцитов и процессов химической деструкции гемоглобина ксенобиотиками могут быть включены в перечень профилактических и терапевтических мероприятий с целью разработки эффективных методов предупреждения профессиональных заболеваний человека в условиях промышленной интоксикации.

Впервые установленные минимально действующие концентрации синтетических изопреноидов позволяют рекомендовать Минздраву РФ пересмотреть утвержденные и выработать объективные нормы ПДК и ОБУВ для условий промышленного синтеза витамина А4 и других каро-

тиноидов.

Разработка и внедрение предложенной модели молекулярного фильтра позволят снизить концентрацию летучих токсинов в промышленной зоне и тем оамьм снизить риск интоксикации организма человека.

Материалы работы используются в учебном процессе биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета при чтении спецкурсов "Биоэлектроника и электрические методы измерения в биологии", "Электробиология" и при выполнении лабораторных работ малого и большого "Практикумов по биофизике", курсовых и дипломных работ студентами-биофизиками 4-5 курсов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991); Научных сессиях Воронежского госуниверситета (Воронеж, 1988, 1990, 1994); Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1995); Международной научной конференции "Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах" (Тверь, 1996); Совещании-семинаре "Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации" (Воронеж, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 статей к 3 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения

1. Метод молекулярного инкапсулирования гидрофобных веществ (МГ, ДГЛ, р-ионон и ретинол!) и получение их водорастворимых комплексов с (З-циклодекстрином.

2. Инклюзконные комплексы МГ, ДГД, р-ионона и ретинола! с р-циклодекстрином индуцируют снижение осмотической резистентности эритроцитов человека.

3. Ряд убывающей активности гемолитических агентов:

МГ > ДГЛ > [5-ионон > ретинол^

4. Метгемоглобин - конечный продукт воздействия МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола! на водные образцы оксигемоглобина.

5. Схемы химических процессов структурных модификаций белковых макромолекул (гемоглобин), индуцированных промежуточными продуктами синтеза витамина ^ .

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа включает 165 страниц машинописного текста, 23 таблицы,'53. рисунка. Состоит из введения, девяти глав, заключения, выводов и приложения. Список литературы содержит 236 работ, из них 149 отечественных и 67 зарубежных.

Содержание работы.

ГЛАВА 1. Витамин А1, его структура, некоторые свойства и

Функции

В глазе представлен обзор основных работ, посвященных анализу строения, функций и свойств синтетических терпеноидов каротиноид-ного ряда: витамина (ретинола!) и промежуточных продуктов его синтеза (метилгептенона, дегидролиналоола и (5-ионона); приводятся данные о характере нарушений в системах организма человека и животных при острой и хронической интоксикации названными изопренои-дами.

ГЛАВА 2. Структура и функции эритроцитов

Освещены современные представления о механизмах эритропоэза, структуре и функциях эритроцитов, молекулярной организации и физико-химических свойствах их мембран.

ГЛАВА 3. Структура и свойства гемоглобина

Изложены современные сведения о структуре, основных функциях и физико-химических свойствах гемоглобина.

ГЛАВА 4. Объекты и методы исследования

В опытах применяли суспензию отмытых эритроцитов и растворы оксигемоглобина, полученные из крови доноров-мужчин и крови белых беспородных мышей.

Растворы амфифильных модифицирующих веществ (метилгептенона, дегидролиналоола, (5-ионона и ретинола!) готовили из предварительно очищенных методом вакуумной перегонки товарных препаратов МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола!, предоставленных ЦЗЛ Белгородского витаминно-

го комбината.

С целью получения молекулярно-диспергированного раствора названных липофильных модификаторов нами разработана методика получения их инклюзионных комплексов (ИК) с кристаллическим ß-циклодекс-трином (ß-ЦЦ) фирмы REANAL (Венгрия).

Степень осмотической резистентности эритроцитов донорской крови в присутствии ИК Мод-р-ЦЦ (СМОд= 1-10"12 + 1-Ю"3 моль/л) анализировали при использовании гипоосмотических концентраций хлорида натрия (0.4 + 0.85%).

Кинетику индуцированного МГ (ДГЛ и др. веществами) гемолиза эритроцитов изучали (при CNaC1= 0.5-5%) с помощью разработанной на кафедре биофизики Воронежского госуниверситета методики автоматической регистрации интегральных, дифференциальных и разностных эритрограмм. На модельной системе "модификатор - эритроциты - HCl" по изменению химической резистентности эритроцитарных клеток к воздействию соляной кислоты (0.08 моль/л) в изоосмотическом растворе NaCI с ИК Мод-р-ЦД (Смод= МО"12 * 1-Ю"3 моль/л) оценивали степень влияния кетонов и спиртов терпеноидного ряда на физико-химические свойства белково-липидных комплексов плазматических мембран. Фотометрическая регистрация кинетики Н+-индуцированного распада эритроцитов осуществлялась с помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-56М, объединенного с двухкоординатным регистратором ЛКД4-003 и цифровым вольтметром В7-20. Для термостатирования суспензии эритроцитов применяли ультратермостат UTU-6 и термостатированные кюветы (1=1 см).

Для выявления характера структурных изменений гемоглобина регистрировали электронные спектры поглощения его водных растворов (CHb= 6.S-10"8 - 2'10"5 моль/л) на спектрофотометрах СФ-Ю, СФ-46, SPECORD UV-VIZ "SPEC0RD М-40" (ФРГ) с ИК МГ (ДГЛ, ß-ионон и рети-нол^-р-цд (Снод= МО"8 * МО"3 моль/л).

О термоиндуцированных переходах в молекулах гембелка судили по интенсивности светорассеяния (т) в его термостатированных растворах.

С целью установления возможного взаимодействия реакционных центров алифатических или циклических кетонов и спиртов с SH-rpyn-пами белка был использован метод (Бойера) спектрофотометрического титрования (при X = 250 * 255 нм) растворов белка (1-Ю*3 моль/л) парохлормеркурий бензоатом (ПХМБ) (1-Ю"3 моль/л); для определения

"скрытых" SH-rpynn титрование белковых образцов проводили в 1%-ом растворе додецилсульфата натрия.

Кислотно-основное титрование опытных растворов гемоглобина и свободного цистеина (МО'4 моль/л) с ЙК МГ (ДГЛ, р-ионон, рети-нол^-р-ЦД (1-Ю"4 - 1-Ю"3 моль/л) осуществляли 0.2 моль/л КОН с помощью разработанного нами блока титратора (VK0H= 100 + 2 ООО мкл/мин). Автоматическую регистрацию кривых титрования осуществляли с помощью модернизированного самописца ЭПП-ОЭ (или КСП-4М).

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили на персональных ЭВМ типа IBM PC/AT с помощью прикладных статистических программ "STATGRAPHICS"; минимальный объем выборки п > 6; величина доверительной вероятности (Р) в опытах не ниже 0.95.

ГЛАВА 5. Осмотическая резистентность эритроцитов, модифицированных ретинолом! и его синтетическими производными (метил-гептеконом, дегидролиналоолом и р-иононом)

Результаты проведённых опытов (рис. 1) свидетельствуют о снижении осмотической резистентности эритроцитарных клеток, инкубированных в растворе хлорида натрия с метилгептеноном, дегидролиналоолом, р-иононом и ретинолом!. Зависимость степени индуцированного алифатическими изопреноидами (МГ и ДГЛ) гемолиза эритроцитов G = f(С„г_ Сдгл) в интервале концентраций 1-Ю"7 + 1-10"3 моль/л подчиняется закону изменения линейной функции вида: G=KCX + b (1), где b > О, G - функция, характеризующая {%) количество гемолизиро-ванных сфероцитов, Сх - концентрация МГ (ДГЛ) (моль/л), к - константа, величина которой определяется типом гемолитического реагента (рис. 1а). При моделировании условий "повышенной" интоксикации организма человека по значениям величин G = f(CMoi= 1-Ю"3 моль/л) был сформирован ряд активности синтетических изопреноидов:

МГ (G=43%) > ДГЛ (G<30% > р-ионона (G=8%) > ретинола! (G=6%). С целью выявления основного механизма проницаемости ретинола! и его синтетических гомологов (МГ, ДГЛ и р-ионона) через липидный бислой изучали кинетику осмотического гемолиза эритроцитов, помещённых в гипоосмотический раствор хлорида натрия (0.55%).

Динамика МГ-индуцированного распада эритроцитов (рис. 1а,в) формально подчиняется экспоненциальному закону изменения кинетических кривых S-образной формы, описываемых уравнением вида:

зо

20

Ю

О

-ю

40

30 20 Ю

О

-Ю

3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 к б »в170

8

<6

4

2

О

3 4 5 6 7 8

В 181/С

Рис. 1. Изменение во времени степени гемолиза эритроцитов, индуцированного ИК МГ(ДГЛ, Р-ионон, ретикол)-(3-ЦД (а, Смод=Н0-3 моль/л). Влияние ИК МГ (ДГЛ, р-ионон, ретинол)-Р-ЦД на степень гемолиза эритроцитов (б) и на величину константы максимальной скорости гемолиза (в). С - концентрация модификаторов (моль/л): 1 - МГ, 2 - ДГЛ, 3 - (3- ионон, 4 - ретинол, в - относительная величина, характеризующая число распавшихся эритроцитов (%), вычисленная относительно контрольного гипоосмотического раствора эритроцитов (0.55% N301).

Gt = Ga ■eb/c (l-ect) (2), где b,c >0; G0 и Gt - степень гемолиза эритроцитов в моменты времени t0 и t1# t - время (с). Зависимость во времени скорости распада эритроцитов в присутствии ДГЛ (ß-ионо-на, ретинола!) подчиняется экспоненциальному закону монотонно возрастающей функции вида: Gt= c-ln(t+l) + В (3), где с > 0; В - асимптота, величина которой контролируется концентрацией гемолитического реагента (рис. 1а).

Высокие значения констант максимальной скорости гемоглобино-

ЛИза (Кгаах(МГ)= 4.2, (дГЛ ) = 7.3, Kj,ax ( ß-ионон) = 3, Ктах(рети-

нол)= 2.8) (рис. 1в) свидетельствует в пользу представлений о преимущественном транспорте незаряженных молекул малых размеров через липидный бислой по механизму простой диффузии в объёме кин-ков или через дефектные зоны МГ- и других кластеров по химическому градиенту {¡х). Пассивный перенос амфифильных молекул внутрь клетки соответствует изменению величины свободной энергии (AG), что можно представить дифференциальным уравнением вида : dG = (Дт-Mout )äCx (4) (при ¡х = ц0 + RTlnCx), где d - толщина фазы раздела (мембраны); Сх - число молей транспортируемого вещества, цои1 ~ химические потенциалы данного вещества внутри и снаружи мембраны, д0 - стандартный химический потенциал. Из уравнения (4) следует, что скорость диффузии через мембрану МГ, ДГЛ и ß-ионона и сопряженная с ней динамика распада эритроцитов при условии одинаковой величины энергетического барьера лишдного бислоя определяется концентрацией липофильных соединений в окружающей среде (рис. 1в, уравнение 1). Из изложенного следует, что структурные свойства СН-радикала определяют вероятность встраивания и диффузии амфифильных соединений через мембрану, а реакционная способность функциональных групп - степень их химической активности. Подтверждением сделанного вывода является слабая концентрационная зависимость гемолитической активности (G) и скорости (vmax) ретинол-индуцированного распада эритроцитов (рис. 1а,б,в).

ГЛАВА 6. Изучение влияния синтетических терпеноидов (МГ, ДГЛ,

ß-ионона, ретинола!) на кислотную резистентность эритроцитов

На модельной системе "модификатор - эритроциты - HCl" показано, что изменение химической резистентности эритроцитов (t„BT), зависящее от концентрации алифатических или циклических кетонов и

О

60

120

180 а

240

300

360 с

20

О

-40

200

ХОО

/\3 Ч / —

-- --

'30.5.10'30.25 Ю"31 ЛО"41 ,Ю"51 б ЛО"61 ,ю'71 .1 о"81 ЛО"91

Рис. 2. Влияние ИК МГ (ДГЛ, р-ионон, ретинол)- р-циклодекстрин на кинетику кислотного гемолиза (а, Смод= МО3 моль/л), на длительность латентного времени (б) и на величину максимальной скорости (в) распада эритроцитов. ДЬат - изменение латентного времени, ДУшах - изменение скорости гемолиза эритроцитов, вычисленные относительно контроля (%). По оси абсцисс (б, в) - концентрация МГ и других модификаторов (моль/л). 1- контроль, 2 - МГ, 3 - ДГЛ, 4 - Р-ионон, 5 - ретинол 1.

спиртов в интервале 1-10'10 * 1-Ю"3 моль/л, носит фазный характер, определяемый смещением результирующей химической деструкции белко-во-липидных комплексов мембраны и степенью гидрофобизации её поверхности амфифильными соединениями каротиноидного ряда (рис. 26).

Регистрируемое смещение кинетических кривых (рис. 2а) кислотного гемолиза влево от контроля свидетельствует о накоплении в суспензии эритроцитов клеток с пониженной стойкостью к Н+-иокам. Это позволяет заключить, что в модифицированных мембранах эритроцитов накапливаются структурные нарушения белково-липидных комплексов, вызывающие снижение энергетического барьера для диффузии в клетку протонов. Плотность потока Н+-ионов через мембрану оценивали по величине максимальной скорости (Утах) распада эритроцитов (рис. 2в), которая для МГ-модифицированных эритроцитов слабо коррелировала с концентрацией кетона в интервале 1-Ю"9 * 1'10"3 моль/л (рис. 2в, кривая 2). Выявленный эффект относительной стационарности потока катионов через липидный бкслой может быть интерпретирован конечным числом дефектных зон в МГ-модифицированных мембранах и малым вкладом алифатического СН-радикала МГ в компоненту гидрофобных сил взаимодействия.

Менее полярное соединение - ДГЛ (¿1дгл< 2.8 рмг> 3.8 0) при последовательном повышении его содержания в инкубационной среде снижает до 80% (при Сдгл = 1-Ю"3 моль/л) скорость Н+-индуцированного распада эритроцитов, что свидетельствует о превышении гидрофобных сил на поверхности мембраны над химической деструкцией участков взаимодействия с Н+-ионами (рис. 2а,в; кривая 3).

Для выявления роли СН-радикала в проявлении гемолитических свойств липофильных изопреноидов были использованы гомологи МГ и ДГЛ - р-ионон и ретинол!. Изучение кислотной резистентности эритроцитов, модифицированных циклическим кетоном или спиртом, позволило установить, что при низких концентрациях р-ионона (1-Ю"10 * 1-Ю"7 моль/л) и ретинола! (1-Ю"10 + 1 - Ю-9 моль/л) химическая устойчивость эритроцитов ниже по отношению к контролю (рис. 26, кривые 4, 5). Очевидно, что в этом случае степень химической деструкции компонентов мембраны преобладает над величиной сил гидрофобной составляющей.

Сочетание гидрофобности СН-радикала с выраженной электроно-фильностью карбонильной группы в молекуле р-ионона (в отличие от ретинола!) обусловило циклоалкену свойства агрессивного гемолиги-

ческого агента, в присутствии которого (при С > 1-Ю"4 моль/л) наблюдается резкое повышение скорости Н+-индуцированного распада эритроцитов (рис. 2в, кривая 4).

ГЛАВА 7. Исследование спектральных свойств водных растворов оксигемоглобина, модифицированного синтетическим ретинолом! и его производными (МГ, ДГЛ и р-иононом)

Методом абсорбционной спектрофотометрии исследовали характер взаимодействия амфифильных реагентов (МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола! ) с водными растворами оксигемоглобина человека. При этом выявлено сходство спектров поглощения модифицированных названными изо-преноидами растворов гемоглобина и его высокоспиновой формы (МШЬ;.

Сравнимое по величине (максимальное) снижение интенсивности полосы Соре вызывается различным содержанием отдельных реагентов в растворе гембелка (рис. За): МГ (МО"3 моль/л), р-ионона (1-10"4 моль/л), ретинола! (1-Ю"5 моль/л).

Анализ зависимости величин оптической плотности полосы Соре от типа используемого реагента (при попарном сравнении) показал, что замена алифатического СН-радикала повышает реакционную способность кетона или спирта, что обусловлено увеличением числа реакционных центров в полиеновом СН-радикале (С5_6,С7_а и Си.1г), а также дополнительной поляризацией >С=0 или >С~0Н связей алкильными заместителями (~СН3) с положительным индукционным (+1) и мезомер-кым (+М) эффектами (рис. За, кривые 5, 4 и 2, 3). Установленная зависимость соответствует ряду суммарной химической активности синтетических терпеноидов (Смод< 1-Ю"5 моль/л) при их взаимодействии с белком: ДГЛ < МГ < р-ионон < ретинол! (5).

Скорость отрицательного приращения интенсивности поглощения полосы Соре (414 нм) от убывающей концентрации кетона или спирта с хорошим приближением подчиняется экспоненциальному закону монотонно убывающей функции вида: = 00 - (ес1/ь + 1) (7), где Б0, -оптические плотности белковых образцов в моменты времени Ц и Ц; с > 0, при 0 < Ь < 1; I - время (мин) (рис. 36).

Процесс образования окисленного продукта при взаимодействии синтетических изопреноидов с НЬ02 сопровождается монотонным приращением оптической плотности в области 500 и 630 нм (рис. Зв).

В первые минуты инкубации белка с ретинолом! (в отличие от

а

В <«81'

Рис. 3. Влияние ИК ретинол (МГ, ДГЛ, р-ионон) - ¡3-ЦД на спектры поглощения оксигемоглобина. А-оптическая плотность (а). Изменение во времени интенсивности поглощения МГ (ДГЛ, р-ионон, ретинол) -модифицированных растворов гемоглобина при 414 нм (б) и 500 нм (в). А-оптическая плотность (%), вычисленная относительно контрольного раствора оксигемоглобина. Концентрации ретинола и других соединений (моль/л): 1 - контрольный раствор оксигемоглобина, 2 - ДГЛ МО"3, 3-ретинол МО5,4-р-ионон МО"4, 5 - МГ МО3.

других соединений) на кинетических кривых формируется лаг-фаза (рис. Зв, кривая 3). При увеличении числа ретинол-индуцированных структурных деформаций в белковой макромолекуле приращение скорости образования MtHb может быть описано уравнением экспоненциальной функции вида : Dt = В0ей/С(1-е01) (8). При воздействии на белок соединений с более короткой СН-цепыо (МГ, ДГЛ и р-ионон) динамика перехода нативного гемоглобина в высокоспиновую форму (MtHb) подчиняется экспоненциальному закону монотонно возрастающей функции вида: Dt = D0 + cln-(Ul) (9). где с > 0.

Результаты проведенного анализа показали, что изменение спектральных свойств растворов НЬ02, инициированное водными растворами ИК МГ (ДГЛ, р-ионон или ретинол!)-р-ЦД, сопровождается глубокими структурными нарушениями порфиринового и полипептидного комплексов гемопротеида.

Нами предложены молекулярные модели химической модификации белка изопреновыми кетонами и спиртами.

1. Взаимодействие кетонов с К-нуклеофилами:

а) образование основания Шиффа по ЫН2-группам лизина, аргинина и концевым a-NH2-группам полипептидной цепи макромолекулы

СН3 СК3

—СН2—¿=0 + H2N—R2 - Ri—СН2—¿=N—Ег + H20 (10)

приводит к изменению буферной емкости белкового раствора, блокированию переноса протонов, нарушению подвижности cq-fS;, и других меж-субъедкничных контактов, разрыву или ослаблению Н+-связей;

б) реакции со вторичными аминами: >КН-группами гистидина и

триптофана по N3-атому

СН3 R3 К3С ОН R3

I | 3 \/ / 3

Rt —СН2—С=0 + HN—R2 - Rj —СН2—С—N—R2 (И)

приводят к блокированию дистального гистидина Е7, концевых остатков гистидина ¡3-субъединиц, снижению буферной емкости белка, смещению электронной плотности триптофана и др.

2. Взаимодействие кетонов с мягкими S-нуклеофилами: -SH-rpyn-

пами остатков цистеина

СН3 НО СН3 RS СН3

I V V

Rj-CHg— С=0 + HSR - Rj—СН2—С—SR + HSR Rt —СНг —С—SR+H2 0 (12)

приводит к изменению буферных и структурно-функциональных свойств

белков; легче протекает при некотором избытке протонов.

3. Активация и присоединение к алкенам жестких нуклеофилов: HO-групп тирозина, молекул воды и др. '

сн3 но сн3

1 v Rt —СН2 —С=0 + НО—С6Н5—R - Rj —СН2 —С—0—С6Н5 —R (13)

вызывают изменение буферных свойств белка, нарушение мэжсубъеди-ничных контактов, разрыв или ослабление Н+-связей.

4. Опосредованная гидратацией реакция кетоков с карбоксильной группой

СН3 НО CH. НО сн3 О

I \/ - V II

R1-CH2-C=0 + НОН - Rj-СНг-С-ОН 4 HOOC-R - Rj -CHZ -С-0—СЧ?+Нг 0 (14)

оказывает влияние на величину суммарного заряда, распределение и прочность Hv-связей, а так&е на другие свойства белка.

Возможные типы химического взаимодействия третичного монотер-пенола ацетиленового ряда и ретинола! с молекулой НЬ02:

1. Реакции нуклеофильного замещения (реакция этерификации) : ROH + HO-OCRj - R-O-C(0)—Rj+HgO (15) с ß~ и Y-карбоксильными группами аспарагинового и глутаминового аминокислотных остатков, а-карбоксилами концевых участков полипептидных цепей белковой глобулы и -СООН-группами пропионовых остатков порфирина приводят к образованию эфирных комплексов с порфирином, блокированию межсубь-единичных a-ß-контактов, изменению суммарного заряда молекулы гемоглобина и буферной емкости белкового раствора.

2. Алкилирование с HO-группами тирозина и другими аминокислотными остатками, содержащими гидроксил

Н-э С R* Н-з С Rj

3 V V

R2—С—ОН +- H0R - R2—С—0—R 4 н20 (16),

вызывают пертурбацию тирозинового хромофора.

3. Реакции нуклеофильного замещения по С3-атому (атомДГЛ): а) со вторичными й-нуклеофилами (>Ш-групглми гистидина и

триптофана по N9-атому), (см. анализ реакции 12)

й H3CVRl R

R С—ОН 4 HN< 3 R2—С—ïï< 3 4 н20 (17).

ü D

Л4 K4

б) взаимодействие с мягкими Б-нуклеофилами (БН-группами цис-теина), (см. анализ реакции 13)

Н3 С К} Н3 С

Бг—С—ОН + НБЕ - К2—С—Э—й + Кг0 (18)

, в) возможные реакции нуклеофильного присоединения (в кислой

среде) активных электронофилов - образование полуацегалей

Н3С И, Н3С И, НО Е3

V К3 V V

й2—С—ОН + 0=С< - йг— С—О—С—Й4 (19)

к4

вызывают перераспределение электронной плотности и конформационные изменения белковой глобулы.

Выявленный характер зависимости интенсивности поглощения света от концентрации и структуры липофильных реагентов в растворе НЬОг (рис. За), подтверждает наши теоретические предположения о накоплении критической суммы внутримолекулярных изменений, приводящих к необратимым функциональным нарушениям молекул гембелка.

ГЛАВА 8. Комбинированное действие синтетических терпеноидов каротиноидного ряда (МГ, ДГЛ, р-ионона, ретинола!) и температуры на интенсивность светорассеяния в растворах оксигемогло-бина

Для оценки роли белковой части молекулы гемоглобина в химическом повреждении тема определяли интенсивность светорассеяния (т) в его термостатированных (20 * 50 °С) растворах с амфифильными кетонами и спиртами (Сиод = 1-Ю"4 + 1-Ю*3 моль/л).

Анализ полученных данных позволил выявить (при нагревании образцов) двухфазный характер внутримолекулярных перестроек, обусловленных суммарным вкладом компонент конформационной энтропии (ТДЭ) и энтропии гидрофобных сил взаимодействия в системе "реагент - белок" (рис. 4). Увеличение содержания в инкубационной среде алифатического (циклического) кетона или спирта (до Смод= = 1-Ю"3 моль/л) приводит (при 50 0С) к повышению интенсивности светорассеяния в белковых растворах, обусловленному резким конфор-мационным переходом в глобине при достижении критической суммы внутримолекулярных структурных изменений (рис. 4). В интервале 20-37 °С наиболее высокая конформационная чувствительность гемогло-

ДГЛ Р-ИОНОН ретинол нь

Рис. 4. Комбинированное влияние температуры и синтетических терпеноидов в комплексе с Р-ЦД (МГ, ДГЛ, Р-ионона и ретинола!) на интенсивность светорассеяния в растворах гемоглобина. Концентрации химических модификаторов 1.0-Ю'З моль/л. Т(%) - вычисленная величина светорассеяния при X = 490 нм.

Рис. 5. Изменение величины буферной ёмкости растворов оксигемоглобина при действии ИК метилгептенон (цегидролиналоол, Р -ионон и ретинол))-р-циклодекстрин в области рН 2 - 12. Концентрация модификаторов 0.5-10"3 моль/л: [~] - МГ, Ц - ДГЛ, - р-ионон, П - ретинол^ Ш - ретинол] -ШО. Д(5 - величина буферной емкости, вычисленная относительно контрольного раствора оксигемоглобина (мкг-экв/мл). Время инкубации 1 час.

бина проявляется к присутствию циклического кетона (р-ионона). На оснований полученных данных составлены ряды активности соединений, вызывающих при 37 * 50 0 С необратимые структурные нарушения в апо-глобине: р-ионон > МГ > ДГЛ > ретинол! (37-45 °С), МГ > р-ионон > > ДГЛ > ретинол! (50 °С) (рис. 4).

ГЛАВА 9. Изучение влияния синтетического ретинола! и его производных (метилгептенона, дегидролиналоола и р-иснона) на буферные свойства водных растворов оксигемоглобина

Изучение влияния ретинола! и его синтетических гомологов на величину буферной емкости водных растворов гемоглобина в интервале рН 2 + 12 при 20 и 37 0 С позволило выявить пропорциональную зависимость уменьшения буферной емкости растворов гемоглобина и числа ионогенных групп белка от содержания МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола! . Характер химического взаимодействия функциональных групп ке-тонов и спиртов, реакционных центров СН-радикалов р-нонона и ретинола! представлен схематически на рис. 6.

Рис. 6. Схема процессов химического связывания ионогенных групп гемоглобина МГ, ДГЛ, р-иононом и ретинолом!.

Снь=1-Ю'4 моль/л, Смод=1-10"М-10"3 моль/л, Скон=0.г моль/л.

На основании полученных данных (рис. 5) составлены ряды убывающей активности синтетических терпеноидов в условиях различных значений рН (для Смод= о.5-Ю*3 моль/л), т.е. при соотношении молекул реагента и белка, равном 5:1:

а) рН 2 * 5: ретинол! (6.5) > ДГЛ (4) > МГ (3) > р-ионон (1);

б) рН 5 * 9: ретинол! (4) > р-ионон (2);

в) рН 8.5 + 12: р-ионон (4) > ретинол! (3), где цифры в скобках - число блокированных данным реагентом груш белка.

Спектрофотометрическим титрованием растворов гемоглобина ПХМБ и титрованием щёлочью (КОН) свободного цистеина показано, что синтетические изопреноиды (МГ, ДГЛ, р-ионон и ретине^) связывают БН-группы, вызывая в первом случае структурную деформацию белковой макромолекулы.

Заключение. С помощью методов автоматической регистрации кинетики осмотических и кислотных эритрограмм, спектрофотометрии растворов свободного оксигемоглобина донорской крови, термостати-рования его модифицированных образцов и методов автоматической регистрации кривых кислотно-основного и спектрофотометрического титрования белковых растворов и цистеина проанализированы структурно-функциональные превращения зритроцитарных мембран и оксигемоглобина человека, индуцированные метилгептеноном, дегидролиналоо-лом, р-иононом и ретинолом!.

Рис. 7. Схема возможных процессов взаимодействия синтетических изопреноидов (МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола!) с компонентами зритроцитарных мембран.

С помощью метода автоматической регистрации осмотических эрит-рограмм исследовано влияние ИК МГ (ДГЛ) (1-Ю"8 + МО"3 моль/л); ß-ионона (1 • 10"9 + 1-Ю"3 моль/л) и ретинола! (l-10"lz * 1 • 10"3 моль/л) на величину осмотической резистентности и динамику распада эритроцитов, помещённых в 0.55%-ный раствор хлорида натрия. На основании ряда убывающей активности гемолитических агентов: МГ > ДГЛ > ß-ионон > ретинол^ предложена схема процессов осмотического гемолиза эритроцитов, модифицированных МГ и его производными (рис. 7а).

Фазный (от концентрации модификатора 1-10"10 + МО"3 моль/л) характер влияния синтетических кетонов и спиртов терпеноидного ряда (МГ, ß-ионон и ДГЛ, ретинол,,) на химическую резистентность клеточных мембран был выявлен при использовании метода автоматической регистрации интегральных кривых, отражающих кинетику кислотного гемолиза эритроцитов. Наблюдаемый концентрационный эффект изменения проницаемости липидного бислоя для Н+-ионов обусловлен суммарным вкладом химической и гидрофобной составляющих молекулы реагента в проявление барьерных и структурных свойств эритроцитаркой мембраной при ее взаимодействии с HCl. Физико-химическая модель изменения кислотной резистентности клеточных мембран может быть представлена (на примере химической модификации эритроцитов) схемой (рис. 76).

Методами абсорбционной спектрофотометрии белковых растворов, а также измерения интенсивности светорассеяния термостатированных растворов оксигемоглобина, модифицированного ретиноломх и его синтетическими гомологами (Смод= 1-Ю"10 * 1-Ю*3 моль/л), выявлен переход гембелка в окисленную форму (MtHb). Отдельные стадии процесса модификации белковой макромолекулы синтетическими изопренои-дами могут быть представлены схематически (рис. 8).

Методом кислотно-основного титрования водно-солевых растворов гемоглобина (МО"4 моль/л) исследовано влияние МГ и его производных на буферные свойства системы "модификатор - гемоглобин" при различном времени инкубирования гембелка с модифицирующими агентами (МО"4 * МО"3 моль/л) при 20 и 37 °С. Для изучения роли отдельных групп атомов и свойств функциональных групп кетонов и спиртов проводили анализ характера изменения буферных свойств растворов гемоглобина в различных областях pH (2-5-5; 5+9; 8.5+12)/ На примере гемоглобина показано, что алифатические (цикличес-

же) алкены (МГ, 0-ионон) и спирты (ДГЛ, ретинол^ (МО"4 + .•Ю"3 моль/л) блокируют ионогенные группы белка, вызывая снижение буферной емкости в характерных для этих групп участков рН (рис.5).

Рис. 8. Схема процессов структурной модификации молекул гемоглобина, индуцированных МГ, ДГЛ, [5-иононом и ретинолом!.

Проведённый анализ молекулярных механизмов физико-химической модификации компонентов эритроцитарных мембран и свободного окси-^емоглобина человека позволил выявить характер структурных превращений в белках и липопротеидных ансамблях, индуцированных синтети-«скими соединениями каротиноидного ряда.

На основании метода молекулярного инкапсулирования гидрофобах веществ с р-ЦД нами разработана и предлозкена к внедрению мо-цель молекулярного фильтра для утилизации из воздуха промышленной зоны летучих токсинов (МГ, ДГЛ, (3-ионона и других промежуточных 1родуктов синтеза витамина Ах).

Вывода

1. Установлено, что металгептенон, дегидролиналоол, р-ионон и ретинол.! в диапазоне концентраций 1-Ю'10 * МО"3 моль/л индуцируют гемолиз эритроцитов человека.

2. По гемолитической активности названные кетоны и спирты -промежуточные продукты синтеза витамина А1 - могут быть расположены в следующий ряд: МГ > ДГЛ > р-ионон > ретинол^

3. Модификация эритроцитарной мембраны алифатическими молекулами метилгептенона и дегидролиналоола (1-Ю"3 моль/л) приводит к гемоглобинолизу "средних" и "старых" популяций эритроцитов соответственно до 43% и 30% от интактных клеток (при 0.55% содержании

4. Под воздействием циклических соединений - р-ионона и ретинола! - также в концентрации МО-3 моль/л снижается (соответственно до 8% и 6%) осмотическая резистентность холестеринобеднбнньк мембран "старых" клеток.

5. Накопление в 0.85%-ном растворе хлорида натрия алифатических (циклических) кетонов или спиртов (Смод(ш1п)> 1-Ю"10 моль/л) инициирует в эритроцитарной суспензии увеличение низкостойких (к Н*-ионам) популяций дискоцитов - наиболее агрессивными в этом отношении являются кетоны: р-ионон > МГ > ретинол! > ДГЛ.

6. Выявлено, что оксигемоглобин человека вследствие протекания реакций комплексирования с метилгептеноном, р-иононом, дегид-ролиналоолом и ретинолом! (1-Ю-8 1-Ю"3 моль/л) переходит е функционально неактивную форму - метгемоглобин.

7. Обнаружено, что в растворах с р-иононом (1-Ю"4 моль/л) и ретинолом! (1'Ю*5 моль/л) спектры поглощения гемоглобина в видимой области сходны с таковыми свободного гема, что свидетельствует о возможности разрыва связей гем - белок в составе молекулы гемо-протеида.

8. Реакционная (модифицирующая) способность молекул синтетических изопреноидов при взаимодействии с апоглобином возрастает при сочетании в их структуре циклического СН-радикала с кетогруп-пой: р-ионон > метилгептенон > ретинол! > дегидролиналоол.

9. Молекулярные комплексы метилгептенона (дегидролиналоола, Р-ионона, ретинола!) с оксигемоглобином характеризуются меньшей

'ермоустойчивостью по сравнению с немодифицированным (50 °С) гем-¡елком.

10. Установлено, что метилгептенон, дегидролиналоол, ß-ионон [ ретинол! индуцируют уменьшение буферной емкости и числа ионоген-1ых групп молекул оксигемоглобина пропорционально концентрации модифицирующих агентов (1-Ю"4 - 1-Ю'3 моль/л).

11. Методом спектрофотометрического титрования растворов ок-¡игемоглобина мышей выявлено, что метилгептенон и ß-ионон вызывают ¡локирование доступных и "скрытых" сульфгидрильных групп в составе шоглобина.

12. На основе разработанного метода молекулярного инкапсули-ювания гидрофобных амфифилькых молекул с ß-циклодекстрином пред-южена модель фильтра для очистки воздуха промышленной зоны от летучих изопреноидов: метилгептенона, дегидролиналоола и ß-ионона.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Резван С.Г. Спектральные свойства оксигемоглобина, модифи-дарованного метилгептеноном // VII Конференция по спектроскопии жополимеров: Тез. докладов Всесоюзн. конф. - Харьков, 1991. - С. 100 - 201.

2. Жуков Ю.А., Резван С.Г., Шмелёв В.П., Пищугина Е.М. Влия-ще температуры на гемолитическую стойкость эритроцитов //Мслеку-шрные и клеточные основы кислотно-основного и температурного го-шостаза: Тез. докладов Всесоюзн. конф. - Сыктывкар, 1S91. -С. 40.

3. Артюхов В.Г., Вашанов Г.А., Лавриненко И.А.. Резван С.Г. О сарактере структурных превращений молекул гемоглобина при действии шкоторых физико-химических факторов //1-й Сьезд Украинского биофизического общества: Тез. докладов съезда. -Киев, 1994. - С 30.

4. Артюхов В.Г., Резван С.Г. Спектральные свойства оксигемо-■утобина, модифицированного метилгептеноном, включенным в инклюзи-жный комплекс с ß-циклодекстрином // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов: Материалы Международного ;импозиума. - Воронеж, ВГУ, 19Э5. - С. 20-24.

5. Резван С.Г., Артюхов В.Г. Влияние синтетических производ-шх витамина At - метилгептенона и дегидролиналоола - на буферные ;войства растворов оксигемоглобина // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов: Материалы Международного

симпозиума. - Воронеж, ВГУ, 1995. - С. 115-116.

6. РезванС.Г., Шмелёв В. П. Изучение спектральных свойств I термоустойчивости растворов оксигемоглобина, модифицировании: (5-каротином и его производными //Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов: Материалы Международного симпозиума. - Воронеж, ВГУ, 1995. - С. 116-119.

7. Шмелёв В.П., Резван С.Г. Гемолитическое действие на эритроциты крови человека водных растворов витамина А3 и промежуточны: продуктов его синтеза (МГ, ДГЛ, (З-ионона) //Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов: Материалы Международного симпозиума. - Воронеж, ВГУ, 1995. - С. 148-149.

8. Резван С.Г., Артюхов В.Г. Динамика ретинол-индуцированно-го изменения спектральных свойств растворов оксигемоглобина //Международная научная конференция "Математические модели нелинейны возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированны: системах и других средах". - Тверь, 1996. (в печати).

9. РезванС.Г., Артюхов В.Г. Изучение гемолитической активности эритроцитов, модифицированных алифатическими кетонами : спиртами каротиноидного ряда // Совещание-семинар "Первичные фото физические и фотохимические процессы в биосистемах различных уров ней организации". - Воронеж, 1996. - С. 116-118.

10. Резван С.Г., Артюхов В.Г. Динамика р-ионон-индуциро ванного изменения спектральных свойств растворов оксигемоглобин // Совещание-семинар "Первичные фотофизические и фотохимически процессы в биосистемах различных уровней организации". - Воронеж 1996. - С. 113-115.

11. Артюхов В.Г., РезванС.Г. Влияние инклюзионного комп лекса ретинол!-р-циклодекстрин на динамику изменения спектральны свойств растворов оксигемоглобина // совещание-семинар "Первичны фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различны уровней организации". - Воронеж, 1996. - С. 11-15.

Заказ-З-б'"/ от27.9.1996 г. Тир. 100 экз. Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ