Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана"

На правах рукописи

Вллиев Руслан Радисович

АНАЛИЗ ГЕНА ФИБРИЛЛ ИНА-1 У БОЛЬНЫХ СИНДРОМОМ МАРФАНА

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА-2005

Работа выполнена в Инстнггуте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Янковский Николай Казимирович

доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович

Ведущая организация: Московская государственная медицинская академия им. Сеченова И. М.

Защита диссертации состоится 17 ноября 2005 г. в 10 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, Просп. Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН

Автореферат разослан 15 октября 2005 г.

Ученый секретарь

регионального диссертационного совета, к.б.н.

Бикбулатова С.М.

toob-ч now£9

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синдром Марфана (СМ) - тяжелое наследственное системное заболевание соединительной ткани, с выраженными патологическими нарушениями в скелетной, глазной и сердечно-сосудистой системах, наследуемое по аутосомно-доминантному типу (MIM 154700). Частота встречаемости СМ в различных странах мира составляет 1:5000 -1:10 000 (Pyeritz, McKusick, 1979; Pyeritz et al., 2000). Для CM характерными особенностями являются высокий процент спорадических случаев (25-30%), обусловленных мутациями de novo, варьирующая экспрессивность и неполная пенетрантность (Pyeritz, McKusick et al., 1979; Collod-Beroud et al., 2003). В настоящее время в качестве основной причины заболевания рассматриваются мутации в гене фибриллина-1 (FBN1) (Human Genome Sequencing Project NT 034890) (Bayers et., 2004; Boileau et al., 2005), локализованного на длинном плече 15 хромосомы (15ql5-21) (Kainulainen et al., 1990; Dietz et al., 1991). Ген FBN1 кодирует белок фибриллин-l (OMIM 134797), являющийся основным компонентом межклеточного вещества. За более чем десятилетний период изучения гена FBN1 выявлено более пятисот различных мутаций по всему гену, большая часть из которых является миссенс-мутациями, затрагивающими высоко консервативные аминокислотные остатки в кальций связывающих доменах белка фибриллина-1 (Collod-Beroud et al., 2003; Boileau et al., 2005). Однако, несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании молекулярно-генетических основ, остается еще открытым ряд ключевых вопросов, касающихся патогенеза этого заболевания. Многими исследователями отмечаются значительные трудности в сопоставлении данных молекулярно-генетического анализа с клинической картиной CM (Kainulainen et al., 1990; Black et al., 1998; Collod-Beroud et al., 2002). Также установлено, что повреждения в гене фибриллина-1 приводят не только к развитию СМ, но и являются причиной других заболеваний соединительной ткани (Dietz et al., 1992; Lonqvist et al., 1994; Sood et al.,1996; Writz et al., 1996). В последнее время все больше появляется исследований, показывающих участие других генов в патогенетических процессах синдрома Марфана (Guisti et al., 2003; Mizuguchi, Collod-Beroud et al., 2004), что, наряду с высоким клиническим полиморфизмом и плейотропным характером патологических нарушений, свидетельствует о гетерогенной природе заболевания. Таким образом, инвалидизирующее течение,

значительный клинический полиморфизм СМ, наличие схожих по клиническим

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

CUE flUATrVA

признакам заболеваний, высокий риск повторного заболевания в семье и отсутствие терапевтических методов лечения делают наиболее актуальным проведение профилактических мероприятий, направленных на предотвращение возникновения повторных случаев заболевания в отягощенных семьях. Эффективное медико-генетическое консультирование в значительной мере зависит от результатов молекулярно-генетических исследований, направленных на выявление первичного генетического дефекта заболевания, что позволяет провести дифференциальную, пресимгггоматическую и пренатальную диагностику синдрома Марфана.

Цель ■ задачи исследования. Целью работы является эпидемиологическое и молекулярно-генетическое изучение синдрома Марфана. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести эпидемиологические исследования, определить этнические и территориальные особенности распространения синдрома Марфана в Республике Башкортостан.

2. Провести поиск мутаций и полиморфизмов в гене фибриллина-1 у больных синдромом Марфана.

3. Исследовать распределение частот аллелей и генотипов полиморфных ДНК-локусов МТБ-1, МТ5-2, \fTS-4 гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана и здоровых доноров.

4. Провести анализ гаплотипов по локусам МТБ-!, МТБ-2, МТЕ-4 гена фибриллина-1 у здоровых доноров и в семьях больных синдромом Марфана.

5. Изучить полиморфизм 6770Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы у больных синдромом Марфана и здоровых доноров.

6. Разработать алгоритм проведения ДНК-диагностики синдрома Марфана.

Научная новизна. Впервые дана эпидемиологическая характеристика синдрома Марфана в Республике Башкортостан. Впервые в России проведен анализ гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана. Обнаружены две новые миссенс-мутации в гене фибриллина-1: 0117611; С2489У и 3 новых полиморфизма: 1У865+131п80; 31710Т; 1У824-150>А. Выявлена ассоциация аллеля *С полиморфизма 1875Т>С в гене фибриллина-1 с развитием пролапса митрального клапана у больных синдромом Марфана. Показана ассоциация аллеля *Т полиморфизма 677С>Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы с развитием тяжелой формы нарушений в сердечно-сосудистой системе у

больных синдромом Марфана. Обнаружен гаплотип 2-11-8 по полиморфным локусам МТБ-1, МТБ-2, МТ8-4 гена фибриллина-1 на 40% нормальных хромосом и гаплотип 2-2-8 на 18% мутантных хромосом, что предполагает сцепление данного гаплотипа с относительно частой мутацией.

Н аучно-практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить представление о молекулярно-генетических механизмах развития синдрома Марфана, а также способствуют разработке косвенной ДНК-диагностики данного заболевания на основе анализа гаплотипов для внедрения его в практику медико-генетической службы. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту:

1. Неравномерность территориального распространения синдрома Марфана в Республике Башкортостан.

2. Идентификация двух новых мутаций и девяти полиморфизмов при скрининге тридцати экзонов гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана.

3. Ассоциация полиморфизма 1875Т>С гена фибриллина-1 с развитием пролапса митрального клапана у больных синдромом Марфана.

4. Ассоциация полиморфизма 6770Т гена метилентетрагидрофолат-редуктазы с развитием тяжелой формы нарушений в сердечно-сосудистой системе у больных синдромом Марфана.

5. Статистически значимые различия в распределении частот аллелей и гаплотипов полиморфных локусов МТ8-1, МТБ-2, МГ8-4 гена фибриллина-1 между нормальными и мутантными хромосомами у больных синдромом Марфана.

6. Возможность проведения косвенной ДНК-диагностики синдрома Марфана с использованием анализа гаплотипов по локусам МТБ-1, МТ5-2, \fTS-4 гена фибриллина-1.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы современной генетики" (Москва, 2003), на Ежегодных конференциях Европейского общества генетиков человека (Бирмингем, 2003; Прага, 2005), Всероссийской конференции Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004), на V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц и 42 рисунка. Список литературы включает 150 источников.

Материал исследовании. Для проведения эпидемиологических исследований использована база данных по больным, состоящим на диспансерном учете в Медико-генетической консультации Республиканского перинатального центра (МГК РПЦ) Республики Башкортостан с клиническим диагнозом "синдром Марфана", согласно Джентовским критериям. Молекулярно-генетические исследования проведены у 75 больных из 71 семьи, а также 67 членов их семей разной этнической принадлежности. Забор крови больных осуществлялся на базе МГК РПЦ, Республиканской клинической больницы им. Г.Г.Куватова, а также в ходе экспедиционных выездов в 20012004 гг. в районы Республик Башкортостан, Татарстан, Саха (Якутия), Северная Осетия-Алания и Кабардино-Балкария. В контрольную выборку были отобраны здоровые индивиды (N=57) без клинических проявлений патологий соединительной ткани, а также здоровые семьи (N=74) для проведения анализа гаплотипов.

Методы исследования. Выделение ДНК проводили методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции из цельной венозной крови (Mathew, 1984). Анализ полиморфных ДНК-локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 и экзонов гена фибриллина-1 (FBN1), а также полиморфизма 6770Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью праймеров, предложенных рядом исследователей (Lee et al., 1994; Pereira et al., 1994; Nijbroeck et al., 1995; Hayward et al., 1997; Tiecke et al., 2001; Koikko et al., 2002). Поиск мутаций и

полиморфизмов в гене фибриллина-1 осуществляли методом конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP-анализ) (Orita et al., 1989). Результаты SSCP-анализа оценивали в 10%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием азотнокислым серебром. Очистку проб для секвенирования осуществляли путем элюирования ДНК из агарозного геля с последующим использованием набора реагентов "DIAtomenDNA Elution" по методике, описанной в инструкции. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism модель 310 (Applied Biosystems).

Статистическая обработка полученных результатов. Математическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета программ статистического анализа "Rows х Columns" (Roff, Bencen, 1989), Statistica ver. 6.0 (StatSoft, Inc., 2003) с использованием следующих методов анализа: непараметрической корреляции Спирмена, хи-квадрат, простой линейной регрессии. Вычисление показателей отношения шансов (Odds Ratio) и относительного риска (Relative Risk) для качественных бинарных данных проводили с использованием интерактивной таблицы сопряженности 2x2 с вычислением статистик связи, а также их доверительных интервалов (с поправкой Иэйтса на непрерывность), разработанной В. П. Леоновым (http://www.biometrica.tomsk.ru/). В случае, когда ожидаемое число наблюдений в одной из ячеек было меньше пяти, использовали точный двухсторонний критерий Фишера (Гланц,1999). Показатель фактической гетерозиготности рассчитывали по формуле, предложенной Л. А. Животовским (1991), теоретическую гетерозиготность определяли как ожидаемую долю гетерозигот по Харди-Вайнбергу (Nei М., 1975), величину аллельной ассоциации оценивали по коэффициенту стандартного неравновесия (Krawczak М. et al., 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Эпидемиологическое исследование синдрома Марфа на в Республике Башкортостан

На 2005 год, в Республике Башкортостан (РБ) состоят на учете в Медико-генетической консультации 105 больных с клиническим диагнозом "синдром Марфана" из 96 семей. На сегодняшний день распространенность заболевания в республике составляет 2,55 на 100 000 населения. Проведенное исследование выявило неравномерный характер распространения СМ на территории

республики (рис.1). Заболевание зарегистрировано в 18 из 54 административных районов и в 11 из 21 города республики. Согласно полученным результатам, в городах проживает достоверно больше больных, нежели в сельской местности 0^=17,79, df=l, р<0,001). Подобная закономерность может объясняться более высоким уровнем диагностики заболевания в городах РБ. Частота спорадических случаев СМ в Республике Башкортостан составила 30,3%, что подтверждает высокий процент возникновения мутаций de novo в европейских популяциях (Pyeritz and McCusick, 1979; Collod-Beroud et al., 2003).

Рис.1 Распространенность синдрома Марфана в Республике Башкортостан.

Большое число спорадических случаев и особенности территориального распределения СМ в РБ предполагает существование взаимосвязи между экологической ситуацией и частотой заболевания. Проведенные корреляционный (11=0.5850, р=0.0085) и регрессионный анализы (11=0.5047, Я2=0.2547, df=l, Р=5,8098, р=0.0275) показывают существование статистически значимой взаимосвязи между частотой заболеваемости СМ и наличием крупных промышленных предприятий, объясняющей 25,47% вариабельности

частоты СМ в республике. Половой состав больных распределился следующим образом: 43 больных мужского пола, что составляет 40,95% от общего числа больных и 62 (59,05%) больных женского пола. Различия не достигли статистической значимости (р>0,05). Средней возраст больных на момент постановки диагноза составил 13,4±3,7 лет, что ниже, чем в ряде европейских стран, где средний возраст манифестации составил 21,6 лет (De Bei et al., 2004). Это, по-видимому, связано с различным подходом к постановке диагноза. Заболевание встречалось в шести этнических группах, являющихся наиболее многочисленными в составе населения республики. По этническому составу больные СМ распределились следующим образом: 43,81% русских, 26,67% татар, 13,33% башкир, 2,86% чувашей, 1,90% армян, 0,95% украинцев, 10,48% метисов от межнациональных браков, образованных сочетанием этносов, представленных выше.

Таким образом, обнаружено неравномерное распространение СМ в Республике Башкортостан, вероятно, связанное с различным уровнем экологической обстановки, а также с уровнем клинической диагностики заболевания в отдаленных районах РБ; установлены особенности этнической и половой структуры заболевания, возраст манифестации, частота спорадических случаев СМ.

2. Поиск мутаций и полиморфизмов в гене фмбрнллнна-1 у больных синдромом Марфам

Проведен скрининг мутаций в тридцати (1-4,15,18,24-40,59-65) функционально значимых экзонах гена фибриллина-1 (FBN1) (Tiecke et al., 2001; Rommel et al., 2002; Collod-Berod et al., 2003) у 60 больных CM из Республики Башкортостан, а также из Республик Татарстан, Саха-Якутия, Северная Осетия-Алания и Кабардино-Балкария. Методом SSCP-анализа было выявлено 52 случая изменения подвижности одноцепочечной ДНК в 12 экзонах гена FBN1. В 18 экзонах SSCP-анализ изменений подвижности не выявил. В 45 случаев секвенционный анализ выявил изменения в нуклеотидной последовательности гена FBN1 (табл.1). Обнаруженные изменения локализованы преимущественно в центральных (24-28) и концевых экзонах (60,62,65) гена фибриллина-1, что в целом подтверждает повышенную мутабильность данных регионов гена (Tiecke et al., 2001; Rommel et al., 2002; Collod-Beroud et al., 2003).

Таблица 1

Изменения в нуклеотидной последовательности гена фябриллива-1 у больных синдромом Марфана

Изменение Экзон Положат в гене Кадон Кодон дикого пш .1 ih 'I Ссылки

1875Т>С 24 15 1875 625 ААТ ААС Asn Asn (Hayward et al., 1997)

IVS18-46AM2 2 18 2167 - - - - - (Hayward et al., 1997)

IVS24-15G>A 1 24 2952 984 GTC GTA Val Val -

31710Т 1 25 3171 1057 AGC AGT Ser Ser -

32940Т 1 26 3294 1098 GAC GAT Asp Asp (Yvman et al., 1999)

34420G 2 27 3442 1148 ССС GCC Pro Ala (Tynan et al„ 1993)

1У82в+15ёеГГ ТТТА 9 28 3589 - - - - - (Nijbroek, et al.,1995)

35260А 1 28 3526 1176 GGG AGG Gly Arg -

1ШОА 1 60 7466 2489 TGT ТАТ Cys Тут -

1У842+вА>С 2 62 7819 - - - - - (Youil et al., 2000)

IVS65+13Ia»G 1 65 8628 - - - - - -

Функционально значимыми оказались два изменения, приводящие к заменам консервативных аминокислотных остатков в кальций связывающих доменах белка фибриллина-1 (3526G>A (G1176R); 7466G>A (C2489Y)). По типу изменений они классифицируются как миссенс-мутации, по характеру последствий - как доминатно-негативные мутации (gain-of-function mutation) (Горбунова, Баранов, 1997). В литературе данные мутации не описаны. В ходе скрининга обнаружено девять полиморфизмов в кодирующих и некодирующих регионах гена: 1875Т>С, IVS18-46A>G, IVS24-15G>A, 31710Т, 32940Т, 3442C>G, IVS28+15delTTTTA, IVS62+8A>C, IVS65+13InsG. Наиболее часто встречаемыми у больных СМ были полиморфизмы 1875Т>С (40%) и IVS28+15de(TTTTA)n (15%), расположенные в 15-ом экзоне и в 28-ом ишроне, соответственно. Для проверки их функциональной значимости было проведено изучение данных локусов в контрольной группе здоровых индивидов. Были выявлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей полиморфизма 1875Т>С у больных СМ с пролапсом митрального клапана (ПМК) (хМ.28; df=l,p = 0,038) по сравнению с контрольной группой здоровых

индивидов (рис. 2). Показано, что аллель FBN1*C является генетическим фактором риска (RR=I,58 [95%С1=1,02 - 2,23)]; Odds ratio=2,3 [95%CI=1,04-5,1]) развития пролапса митрального клапана у больных СМ. Различия в распределении частот генотипов между больными с ПМК и здоровыми донорами не достигли статистической значимости (р>0,05). Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма IVS28 + 15(ТПТА)п между больными СМ и контрольной группой здоровых индивидов не выявило статистически значимых различий (р>0,05).

■ Больные синдромом Мврфена с ГМК □ Контроль

т С тт ТС сс

Ряс. 2. Распределение частот аллелей и гевотипов полиморфизма 1875Т>С гена Ш1 у больных сицдромом Марфана с пролапсом митрального клапана и в

контрольной группе.

3. Анализ полиморфных ДНК-локусов МТ8-1, МШ-2, МТЯ-4 гена фибрнллнна-1 у больных синдромом Марфана н в контрольной группе

В связи с большим размером гена РВЫ1 и отсутствием мажорных мутаций актуальной становится разработка косвенной ДНК-диагностики СМ с использованием генетических маркеров, сцепленных с заболеванием. Применение косвенных методов молекулярной диагностики среди больных предусматривает в качестве обязательного предварительного этапа исследование частот аллелей соответствующих полиморфных локусов в анализируемых популяциях, а также определение вероятности рекомбинации и неравновесия по сцеплению между маркерными сайтами и мутантными аллелями гена.

Проведено изучение трех полиморфных ДНК локусов МТБ-1, А/75-2, МТЗ-4 гена РВЮ, содержащих микросателлитные (СА)п повторы, в контрольной группе здоровых индивидов и у больных СМ (рис.3). Анализ

полиморфных ДНК-локусов МТБ-!, АШ-2, МТБ-4 гена РВМ в выборке здоровых индивидов татарской и русской этнической принадлежности выявил статистически значимые различия по локусу МТБ-! 0^=11,66; с!:Р=5, р=0,04).

В

Я Больны» (В ц«лом) О КонгролЦВ налом)

0,6 о,«' 0.4' 0,3 ' 0,2 ' 0.1 ' 0** |

|

■■

■ ■

1 2 3 4 б в

■ Больные (В целом) О Контроль(В целом)

0,5 0.4 0,3 0.2 0,1 О

ЖМ1Й1Х1

10 11

■ Вольны* (В чалом) □ Контроль (В чалом)

0,6 0,5 0,4 0.3 0.2 0.1 О

■ я . . * . * . . < " * Ъ " - 1

(

* с ^ J

1 ■ • 1

Г711 1

10 11 14

Ряс. 3. Распределение частот аллелей полиморфных локусов гена фибриллнна-1 у больных синдромом Марфаня я в контрольной группе здоровых доноров.

А - локус МТ8-1, Б - локус МТ8-2, В - локус тй-4.

Различия в распределении частот аллелей и генотипов по двум другим локусам оказались статистически не значимыми (р>0,05). Не выявлено статистически достоверных различий и в распределении частот аллелей и генотипов полиморфных ДНК-локусов \fTS-l, М"П>-2, МТБ-4 гена фибриллина-1 у больных СМ с учетом их этнической принадлежности (рХ),05). Проведенный сравнительный анализ показал статистически значимые различия между больными СМ в целом и контрольной группой здоровых индивидов в распределении частот аллелей локусов МТ8-2, МТЗ-4 гена фибриллина-1 (р<0,05) (рис.3). Распределение частот аллелей изученных локусов между

больными и контролем с учетом их этнического происхождения выявило достоверные различия между больными СМ и здоровыми донорами татарской этнической принадлежности по локусу МТБ-1 (^=9,51; <1£=4; р=0,043).

Таким образом, проведенное исследование полиморфных локусов МТБ-!, МТ8-2, \fTS-4 гена РВМ, с одной стороны, свидетельствует об отсутствии межэтнической гетерогенности по распределению частот их аллелей, с другой стороны, показывает различия в целом между больными СМ и контролем, что наряду с мультиаллельностью и высокой гетерозиготностью данных локусов, позволяет использовать их для молекулярно-генетической диагностики СМ.

4. Анализ полиморфных ДЕПС-локусов МП}-1, МТЪ-2, МТБ-4 гена фнбриллина-1 в семьях с синдромом Марфана

Проведено исследование полиморфных ДНК-локусов МТБ-!, МТ8-2, \fTS-4 в двадцати девяти семьях с СМ разной этнической принадлежности. В двадцати двух семьях (76%) наблюдался аутосомно-доминантный тип наследования и по данным полиморфным локусам были определены аллели, ассоциированные с нормальными (Ы) и мутантными (М) хромосомами. В семи семьях (24%) определение мутантной хромосомы оказалось невозможным в силу того, что родители пробандов, а также их родственники были фенотипически здоровы, что характеризует данные случаи как спорадические.

В локусе МТ8-1, в целом, на мутантных хромосомах было выявлено четыре аллельных варианта, а на нормальных - пять (рис.4-А). Частыми аллелями на мутантных хромосомах оказались аллели МТБ-1*2 и МТ5-1*3, обнаруженные с частотой 0,54 и 0,32, соответственно. Эти же аллели были доминирующими и на нормальных хромосомах, где их частота составила 0,6 и 0,2. Различия в распределении частот аллелей локуса \iTS-l между нормальными и мутантными хромосомами, а также с учетом их этнического происхождения не достигли статистической значимости (р>0,05).

В локусе МТЗ-2, в целом, на мутантных хромосомах было определено восемь аллельных вариантов, а на нормальных - пять (рис. 4-Б). Различия в распределении частот аллелей, в целом, между мутантными и нормальными хромосомами оказались статистически значимыми (х2=17,37, <1£=8, р=0,025). Достоверно чаще на мутантных хромосомах встречался аллель МТБ-2*2 с частотой 0,36 (х2=5,02, <ИИ, р=0,025). На нормальных хромосомах чаще других наблюдался аллель МТБ-2*II с частотой 0,6 0^=7,95; (№=1, р=0,005).

Обнаружены также статистически значимые различия в распределении частот аллелей между мутантными и нормальными хромосомами у лиц русской этнической принадлежности (%2=14,44; (И=7, р = 0,03).

В локусе \fTS-4, в целом, на мутантных хромосомах количество аллельных вариантов составило восемь, а на нормальных - пять (рис.4-В). Статистически значимые различия наблюдались по частоте аллеля МТ$-4*8, встречавшегося на мутантных хромосомах с частотой 0,36, а на нормальных хромосомах - с частотой 0,72 0^=4,49; сК=1, р = 0,034). Распределение частот аллелей, в целом, между мутантными и нормальными хромосомами, а также с учетом их этнического происхождения не достигли статистической значимости (рХ>,05).

1 2 3 4 8 0

1 2 3 •» в в 7 в I 10 11 11 <3 И II

■ Мутантные хромосомы и Нормальные хромосомы Рве. 4. Распределение частот аллелей полиморфных ДНК локусов гена фнбрнллнна-1 на мутантных н нормальных хромосомах у больных синдромом Марфана. А - МТБ-!; Б - А/75-2; В - МТ5-4.

С целью выявления степени ассоциации аллелей полиморфных ДНК-локусов \fTS-l, МТ8-2, МТБ-4 гена FДЛ7 был определен стандартный коэффициент неравновесия по сцеплению - ДБ! для наиболее частых аллелей, расположенных на мутантных хромосомах. Максимальная величина АБ! наблюдалась для аллеля М7$-2*2 локуса \fTS-2 (-0,44). Заметно ниже величина отмечена для локусов МТБ-! и МТЗ-4 (-0,14 и -0,15). Это, вероятно, связано с тем, что наиболее частые аллели одинаково встречаются и на мутантных и на нормальных хромосомах.

5. Изучение гаплотипов полиморфных локусов МТ5-1, МТ5-2, МШ-4 гена фибриллнна-1 в контрольной группе здоровых доноров

Проведено изучение гаплотипов МТБ-1 -\iTS-2-MTS-4 гена ЕВЮ в семьях здоровых доноров с целью выявления закономерностей распределения гаплотипов данных полиморфных локусов у здоровых индивидов в целом, а также в зависимости от их этнической принадлежности. Всего было выявлено 51 различных гаплотипов на 90 хромосомах. На 52 хромосомах русского происхождения было определено 30 гаплотипов, на 38 хромосомах татарского происхождения - 29 гаплотипов. У русских наиболее частыми оказались гаплотипы 2-11-8 и 1-11-8, обнаруженные с частотой 0,21 и 0,07, соответственно. У татар чаще других встречались гаплотипы 2-11-8, 1-11-8, 3-11-8, частота которых составила 0,16, 0,08 и 0,08, соответственно, остальные гаплотипы были редкими и встречались с частотой менее 0,05. По распределению частот гаплотипов полиморфных локусов МТ5-1-МТ8-2-МП>-4 гена РВМ между русскими и татарами статистически значимых отличий не выявлено (р>0,05). Таким образом, у здоровых доноров по локусам МТБ-!, МТБ-2, \fTS-4 гена FBN1 показано отсутствие этнических особенностей в распределении частот гаплотипов и существование одного частого гаплотипа 2-11-8.

б. Изучение гаплотипов полиморфных локусов МТ5-1, МШ-2, МТБ-4 гена фнбриллина-1 на нормальных и мутантных хромосомах у бальных синдромом Марфана

По локусам МТ8-1, МТ^-2, МТБ-4 гена фибриллина-1 проведен анализ гаплотипов на нормальных и мутантных хромосомах у больных синдромом Марфана из 22 семей. На 22 мутантных хромосомах было определено 19

гаплотипов, 15 (79%) из которых не встречались на нормальных хромосомах (рис.5). Выявлено 12 гаплотипов на нормальных хромосомах, на которых достоверно чаще встречался гагоготип 2-11-8, определенный с частотой 0,4, в десять раз превышающей таковую на мутантных хромосомах (0,04) 0^=6,34; <1£=1, р=0,012). Самым частым на мутантных хромосомах оказался гаплотип 2-2-8, обнаруженный с частотой 0,18, что предполагает сцепление данного гаплотипа с относительно частой мутацией. На нормальных хромосомах частота гаплотипа 2-2-8 составила 0,04. Выявленные различия в распределении частот гаплотипов в целом на нормальных и мутантных хромосомах оказались статистически значимыми (х2=32,53; <1(=21; р=0,027). Достоверные отличия были обнаружены также и в распределении частот гаплотипов на нормальных и мутантных хромосомах русского происхождения (хЧ6,6; <1£=12, р=0,037).

0,6-1-

0,55 , -г-'"*' ' ,-< '

0,5 ^ , ^ „ ** * ■* Ь*

0/15-

0/ : - * ^ , - / - * .

0,35

03

0,25 ?«!»£ . -я**.

02

0,15

0,1 л

0,05 0 тмкммяш

I ю г. ' 1 • < ( • « ■ ^ ^ ^ ■ • ■ N • т ■ и> г ,— ■ ■

« М СЧ (Ч и <4 « М « Ч

■ Мутаетные хромомсомы (В целом) О Нормальные хромосомы (В целом)

Рис. 5. Распределение частот гаплотипов МТ8-1-МТЗ-2-МТ$-4 на нормальных н мутантных хромосомах у больных синдромом Марфаиа.

Таким образом, проведенный гаплотипический анализ позволил предположить о существовании широкого спектра мутаций в гене фибриллина-1 и одной относительно частой мутации, ассоциированной с гаплотипом 2-2-8.

7. Практическое применение анализа гаплотнпов в семьях с синдромом Марфана

В нашей работе исследованы 35 семей, в которых зарегистрированы случаи СМ. В 29 семьях с помощью полиморфных ДНК-локусов МТ8-1, МТБ-2, М115-4 гена FBN1 удалось составить варианты гаплотипов для каждого из членов семьи. В остальных шести семьях, в виду отсутствия одного из родителей, определение гаплотипов не представилось возможным. В 76% семей наблюдался аутосомно-доминантный тип наследования, что позволило проследить передачу гаплотипа, сцепленного с заболеванием. На рисунке 6-А показана родословная семьи X., в которой был определен гаплотип 2-2-8, сцепленный с СМ у пробанда, а также у его матери и ее родного брата, имеющих клинические признаки заболевания. В 25% исследованных семей определение мутантных хромосом оказалось невозможным, поскольку оба родителя были фенотипически здоровы, пример подобной родословной представлен на рисунке 6-Б. Родители пробанда и сибс не имеют каких-либо клинических признаков СМ. Данная семья не информативна для косвенной ДНК-диагностики из-за невозможности определить гаплотип, сцепленный с заболеванием.

Рис.6. Анализ родословных семей с синдромом Марфяяа.

А - аутосомно-доминантный тип наследования, Б - спорадический случай. Пробанд указан стрелкой. Белым цветом указаны нормальные хромосомы, черным - мутантные.

В связи с вышеизложенным, проведение ДНК-диагностики СМ с использованием анализа гаплотипов возможно только в каждой отдельной семье, при условии аутосомно-доминантного типа наследования и информативности данной семьи по изучаемым генетическим маркерам.

8. Исследование полиморфизма 6770Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (Мтнкк) у больных синдромом Марфана

Высокий клинический полиморфизм СМ с выраженными нарушениями в различных системах органов предполагает также вовлечение других генов, участвующих в патогенезе заболевания. В последнее время активно проводится изучение влияния гомоцистеина в сыворотке крови на развитие нарушений в сердечно-сосудистой системе для ряда заболевания (М^уао е1 а1., 1998; Сайапео е1 а1., 1999; ЗевИасМ е1 а1., 2002). Поскольку, нарушения в сердечно-сосудистой системе являются одним из главных диагностических признаков СМ, было проведено изучение полиморфизма 677С>Т гена МТНРИ в выборке больных СМ, а также в группе здоровых индивидов.

В контрольной группе здоровых доноров аллель МГЯРДТ обнаружен с частотой 0,14. Частота аллеля МТНРЯ*Т в общей выборке больных составила 0,25. В целом, различия в распределении частот аллелей полиморфизма 677С>Т гена МТНГЯ не достигли статистической значимости (р>0,05). У больных СМ достоверно чаще встречался генотип МТНП1*С/*Т (х2 = 4,203; <1£=1, р = 0,045), частота которого составила 0,44. Полученные показатели относительного риска (011=2,5 [95%С1=1,03-6,1]; Ш1=1,42 [95%С1=1,01- 1,89]) свидетельствуют о том, что генотип МТНП{*С/*Т является генетическим маркером риска сердечно-сосудистых нарушений у больных СМ. Различия в распределении частот гомозиготного генотипа МТНРЯ*Т/*Т, в целом, между больными СМ и контрольной группой не достигли статистической значимости (р>0,05).

Для дальнейшего анализа больные СМ были подразделены по степени тяжести поражения сердечно-сосудистой системы на среднюю (пролапс митрального клапана без расширения основания аорты) и тяжелую формы (пролапс митрального клапана первой и второй степени с расширением основания аорты). Распределение частот аллелей полиморфизма 677С>Т гена \fTHFR между больными со средней формой тяжести сердечно-сосудистых нарушений (ССН) и контролем не выявило статистически значимых различий (р>0,05). Генотип МТНР1{*С/*Т чаще встречался в группе со средней формой тяжести нарушений в сердечно-сосудистой системе, где частота его составила 0,43. Гомозиготный генотип МТНРК*Т/*Т ъ группе больных со средней формой тяжести сердечно-сосудистых патологий не встречался, в то время как частота его у больных с тяжелой формой ССН составила 0,18. Обнаруженные различия

в распределении частот аллелей локуса МПТРВ. между больными с тяжелой формой ССН и контролем оказались статистически значимыми = 4,47; (1£=2, р=0,034). Сравнительный анализ распределения частот генотипов полиморфизма 6770Т гена \fTHFR у больных с различной степенью тяжести поражения сердечно-сосудистой системы и здоровых индивидов выявил статистически значимые различия в группе больных с тяжелой формой ССН и контролем (двусторонний критерий Фишера, р=0,043) (рис.7). Полученные значения относительного риска (ОЯ=3,43 [95%С1=1,07-10,88]; ЯЯ=2,54 [95%С1=1,06-5,44] для аллеля МТНРЯ*Т свидетельствуют об ассоциации данного аллеля с развитием тяжелой формы нарушений в сердечно-сосудистой системе у больных СМ. Несмотря на высокий показатель относительного риска (011=10,66) для генотипа МТНРЯ*Т/*Т, доверительный интервал в этом случае является очень широким (0,64 - 333,3), что не позволяет сделать однозначного вывода о том, является ли этот генотип рисковым для развития тяжелой формы нарушений в сердечно-сосудистой системе у больных СМ. Увеличение объема выборки приведет к сужению границ доверительного интервала и, как следствие, позволит сделать более надежные оценки.

■Больные сицдромом Марфана с тяжелой формой ССН □Котроль

С Т СС СТ ТТ

Рас. 7. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма 6770Т гена МТНШ у больных синдромом Марфана с тяжелой формой сердечнососудистых нарушений (ССН) и в контрольной группе здоровых доноров. -

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что ген МТНШ вовлечен в патогенез синдрома Марфана и аллель МТНРЯ*Т способствует утяжелению клинических признаков нарушения в сердечно-сосудистой системе у больных синдромом Марфана.

ВЫВОДЫ

1. Распространенность синдрома Марфана в Республике Башкортостан составляет 2.55 на 100 ООО населения, что на порядок ниже, чем в целом по Европе. Установлена неравномерность территориального распространения заболевания в РБ. Число спорадических случаев синдрома Марфана в РБ соответствует среднемировому показателю.

2. Скрининг 30 экзонов гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана выявил 9 полиморфизмов и 2 мутации. Низкая частота мутаций в гене РВЫ1 предполагает гетерогенность заболевания.

3. Обнаружены две новые миссенс-мутации (0117611; С2489У) и 3 новых полиморфизма (ГУ865+131шО; 3171С>Т; 1У824-150А) в гене фибриллина-1.

4. Выявлена ассоциация аллеля *С полиморфизма 1875Т>С 15-го экзона гена фибриллина-1 с развитием пролапса митрального клапана у больных синдромом Марфана.

5. Обнаружена ассоциация аллеля *Т полиморфизма 677С>Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы с развитием тяжелой формы нарушений в сердечно-сосудистой системе у больных синдромом Марфана.

6. Установлены различия в распределении частот аллелей полиморфных ДНК-локусов МТБ-1, МТ5-2, МТБ-4 гена фибриллина-1 между больными синдромом Марфана и контрольной группой здоровых доноров, а также достоверные различия в распределении частот аллелей полиморфного локуса МТ5-2 гена фибриллина-1 между нормальными и мутантными хромосомами.

7. Выявлены статистически значимые отличия в распределении частот гаплотипов по трем полиморфным локусам МТБ-!, МТ&-2, МТБ-4 на нормальных и мутантных хромосомах. Гаплотип 2-11-8 чаще встречается на нормальных хромосомах (0,4), гаплотип 2-2-8 - на мутантных хромосомах (0,18).

8. Разработан алгоритм проведения ДНК-диагностики синдрома Марфана, позволяющий использовать анализ гаплотипов по локусам МТЭ-1, МТ8-2, МТБ-4 гена фибриллина-1 для косвенной ДНК-диагностики заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Валиев P.P., Фатхлисламова Р.И., Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетическое изучение синдрома Марфана в Республике Башкортостан // «Актуальные проблемы современной генетики» - Москва, 2003. - С. 13.

2. Valiev R. R, Khusainova R. I., Khusnutdinova E.K. Mutation analysis of the FBN1 gene among patients with Marfan syndrome from Bashkortostan, Russia // European Journal of Human Genetics - European Human Genetics Conference.-Birmingham, 2003,- V.7. - P. 259.

3. Валиев P.P., Хусаинова Р.И., Хуснутдинова Э.К. Синдром Марфана: клинические и генетические аспекты // Медицинская генетика - 2003.-№11-С. 450-459.

4. Валиев P.P., Хусаинова Р.И., Кутуев И.А. Скрининг мутаций в гене фибриллина-1 у больных с синдромом Марфана, проживающих в Республике Башкортостан // Материалы Ш съезда ВОГиС 'Тенетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" - Москва, 2004. -С.21-22.

5. Valiev R., Khusainova R., Khusnutdinova E. The study of Marfan syndrome in Republic of Bashkortostan // European Journal of Human Genetics - European Human Genetics Conference.- Munich, 2004. - V.12. - P.102.

6. Хусаинова Р.И., Валиев P.P., Кутуев И.А., Хуснутдинова Э.К. Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое изучение синдрома Марфана // Медицинская генетика - 2004. - № 6.- С. 290-296.

7. Хуснутдинова Э. К., Хидиятова И. М., Хусаинова Р.И., Карунас А.С., Исламгулов Д.В., Валиев P.P., Мурзабаева С.Ш. Молекулярно-генетическое изучение наследственной патологии в Волго-Уральском регионе // Вестник ВОГИС - 2005. - №6. - С. 102-123.

8. Валиеи P.P., Хусаинова Р.И., Хуснутдинова Э.К. Анализ гена фибриллина-1' у больных синдромом Марфана // Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков - Уфа - 2005.- Медицинская генетика -2005 -№4.-С.163.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

СМ - синдром Марфана FBN1- ген фибриллин-1

SSCP - анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК

MTHFR - ген метилентетрагидрофолатредуктазы

ССН - сердечно-сосудистые нарушения

ПМК - пролапс митрального клапана

Odds ratio (OR) - отношение шансов

RR - relative risk - относительный риск

95% CI - confidence interval - 95% доверительный интервал

Валиев Руслан Радисович

Анализ гена фибриллина-1 у больных синдромом марфана

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 14.10.2005 г. Отпечатано на ризографе. Формат 60x84 716. Усл.-печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,7 Тираж 100 экз. Заказ № 315.

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет РОСЗДРАВА»

По

РНБ Русский фонд

2006-4 21290

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Валиев, Руслан Радисович

ВВЕДЕНИЕ

Цель и задачи исследования.

Научная новизна

Практическая значимость.

Положения, выносимые на защиту

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпидемиология синдрома Марфана.• .И

1.2. Клинические особенности синдрома Марфана. ф 1.3. Молекулярно-генетическая основа синдрома Марфана.

1.3.1. Структура и функция белка фибриллина-1.

1.3.2. Структура и функция микрофибрилл

1.4. Патогенез синдрома Марфана.

1.5. Роль других генов в клинической картине заболевания.

1.6. Молекулярно-генетическая диагностика синдрома Марфана

Глава П. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

11.1. Материал исследования.

11.2. Методы исследования.

11.2.1. Выделение геномной ДНК.

11.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК.

11.2.2.1. Исследование гена фибриллина-1.

11.2.2.2. Исследование гена метилентетрагидрофолатедуктазы

11.2.2.3. Анализ полиморфных ДНК локусов.

11.2.3. Рестрикционный анализ.

11.2.4. SSCP-анализ.

II.2.4.1. SSCP с щелочной денатурацией.

11.2.5. Определение нуклеотидной последовательности.

11.3. Статистическая обработка результатов.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 52 III. 1. Эпидемиологическое исследование синдрома Марфана в Республике Башкортостан.

111.2. Поиск мутаций и полиморфизмов в гене фибриллина-1 у больных синдромом Марфана.

111.3. Анализ полиморфных ДНК-локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана и в контрольной группе.

111.3.1. Анализ полиморфных ДНК-локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 в контрольной группе.

111.3.1.1 Исследование полиморфного локуса MTS-1.

111.3.1.2. Исследование полиморфного локуса МГЗ^

111.3.1.3. Исследование полиморфного локуса MTS

111.3.2. Анализ полиморфных ДНК-локусов MTS-J, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана.

111.3.3. Анализ гаплотипов полиморфных локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 в контрольной группе.

111.4. Анализ полиморфных ДНК-локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 в семьях больных синдромом Марфана.

111.5. Анализ гаплотипов полиморфных локусов на нормальных и мутантных хромосомах у больных синдромом Марфана

111.6. Практическое применение анализа гаплотипов в семьях с синдромом Марфана.

111.7. Исследование полиморфизма 677С>Т гена метилентетрагидро-фолатредуктазы {MTHFR) у больных синдромом Марфана.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана"

Синдром Марфана (СМ) - тяжелое наследственное системное заболевание соединительной ткани, с выраженными патологическими нарушениями в скелетной, глазной и сердечно-сосудистой системах, наследуемое по аутосомно-доминантному типу (MIM 154700). Частота встречаемости СМ в различных странах мира составляет 1:5000 - 1:10 000 [Pyeritz, McKusick, 1979; Pyeritz et al., 2000]. Для CM характерными особенностями являются высокий процент спорадических случаев (25-30%), которые обуславливаются мутациями de novo, варьирующая экспрессивность и неполная пенетрантность [Pyeritz, McKusick et al., 1979; Collod-Beroud et al., 2003]. В настоящее время в качестве основной причины заболевания рассматриваются мутации в гене фибриллина-1 (FBN1) (Human Genome Sequencing Project NT 034890) [Bayers et., 2004; Boileau et al., 2005], локализованного на длинном плече 15 хромосомы (15q 15-21) [Kainulainen et al., 1990; Dietz et al., 1991]. Ген FBN1 кодирует белок фибриллин-l (OMIM 134797), являющийся основным компонентом межклеточного вещества. За более чем десятилетний период изучения гена FBN1 удалось выявить более пятисот различных мутаций по всему гену, большая часть из которых является миссенс-мутациями, затрагивающими высоко консервативные аминокислотные остатки, участвующие в процессах связывания кальция и формирования вторичной структуры белка фибриллина-1 [Collod-Beroud et al., 2003; Boileau et al., 2005]. В результате точечных замен возникают либо сайты для протеолитических ферментов и белок подвергается ферментативному гидролизу, либо изменяется конформационная структура [Downing et al., 1996; Reinhardt et al., 1997; McGettrick et al., 2000], что выражается в уменьшении количества нормального белка фибриллина-1 в межлеточном веществе соединительной ткани и, как следствие, теряется упругость и прочность стенок кровеносных сосудов, кожных покровов, хрящевых связок [Rantamaki et al., 1997; Robinson et al., 2000, Nollen et al., 2004].

Однако, несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании молекулярно-генетических основ со времен открытия гена FBN1, остается еще открытым ряд ключевых вопросов, касающихся патогенеза этого заболевания. Многими исследователями отмечаются значительные трудности в сопоставлении данных молекулярно-генетического анализа с клинической картиной CM [Kainulainen et al., 1990; Black et al., 1998; Collod-Beroud et al., 2002]. Также установлено, что повреждения в гене фибриллина-1 приводят не только к развитию синдрома Марфана, но и являются причиной других заболеваний соединительной ткани, имеющих схожие клинические признаки с CM [Dietz et al., 1992; Lonqvist et al., 1994; Sood et al.,1996; Writz et al., 1996]. В ' последнее время все больше появляется исследований, показывающих участие других генов в патогенетических процессах синдрома Марфана [Guisti et al., 2003; Mizuguchi, Collod-Beroud et al., 2004], что, наряду с высоким клиническим полиморфизмом и плейотропным характером патологических нарушений, свидетельствует о гетерогенной природе заболевания.

Таким образом, инвалидизирующее течение, значительный клинический полиморфизм СМ, наличие схожих по клиническим признакам заболеваний, высокий риск повторного заболевания в семье и отсутствие терапевтических методов лечения делают наиболее актуальным проведение профилактических мероприятий, направленных на предотвращение возникновения повторных случаев заболевания в отягощенных семьях. Эффективное медико-генетическое консультирование в значительной мере зависит от результатов молекулярно-генетических исследований, направленных на выявление первичного генетического дефекта заболевания, что позволяет провести дифференциальную, пресимптоматическую и пренатальную диагностику синдрома Марфана.

Цель и задачи исследования

Цель и задачи исследования. Целью работы является эпидемиологическое и молекулярно-генетическое изучение синдрома Марфана.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести эпидемиологические исследования, определить этнические и территориальные особенности распространения синдрома Марфана в Республике Башкортостан.

2. Провести поиск мутаций и полиморфизмов в гене фибриллина-1 у больных синдромом Марфана.

3. Исследовать распределение частот аллелей и генотипов полиморфных ДНК-локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана и здоровых доноров.

4. Провести анализ гаплотипов по локусам MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 у здоровых доноров и в семьях больных синдромом Марфана.

5. Изучить полиморфизм 677С>Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы у больных синдромом Марфана и здоровых доноров.

6. Разработать алгоритм проведения ДНК-диагностики синдрома Марфана.

Научная новизна. Впервые дана эпидемиологическая характеристика синдрома Марфана в Республике Башкортостан. Впервые в России проведен анализ гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана. Обнаружены две новые миссенс-мутации в гене фибриллина-1: G1176R; C2489Y и три новых полиморфизма: IVS65+13InsG; 3171 ОТ; IVS24-15G>A. Выявлена ассоциация аллеля *С полиморфизма 1875Т>С в гене фибриллина-1 с развитием пролапса митрального клапана у больных синдромом Марфана. Показана ассоциация аллеля *Т полиморфизма 6770Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы с развитием тяжелой формы нарушений в сердечно-сосудистой системе у больных синдромом Марфана. Обнаружен гаплотип 2-11-8 по полиморфным локусам MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 на 40% нормальных хромосом и гаплотип 2-2-8 на 18% мутантных хромосом, что предполагает сцепление данного гаплотипа с относительно частой мутацией.

Научно-практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить представление о молекулярно-генетических механизмах развития синдрома Марфана, а также способствуют разработке косвенной ДНК-диагностики данного заболевания на основе анализа гаплотипов для внедрения его в практику медико-генетической службы. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту:

1. Неравномерность территориального распространения синдрома Марфана в Республике Башкортостан.

2. Идентификация двух новых мутаций и девяти полиморфизмов при скрининге тридцати экзонов гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана.

3. Ассоциация полиморфизма 1875Т>С гена фибриллина-1 с развитием пролапса митрального клапана у больных синдромом Марфана.

4. Ассоциация полиморфизма 677С>Т гена метилентетрагидрофолат-редуктазы с развитием тяжелой формы нарушений в сердечно-сосудистой системе у больных синдромом Марфана.

5. Статистически значимые различия в распределении частот аллелей и гаплотипов полиморфных локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 между нормальными и мутантными хромосомами у больных синдромом Марфана.

6. Возможность проведения косвенной ДНК-диагностики синдрома Марфана с использованием анализа гаплотипов по локусам MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Валиев, Руслан Радисович

138 ВЫВОДЫ

Распространенность синдрома Марфана в Республике Башкортостан составляет 2.55 на 100 ООО населения, что на порядок ниже, чем в целом по Европе. Установлена неравномерность территориального распространения заболевания в РБ. Число спорадических случаев синдрома Марфана в РБ соответствует среднемировому показателю. Скрининг 30 экзонов гена фибриллина-1 у больных синдромом Марфана выявил 9 полиморфизмов и 2 мутации. Низкая частота мутаций в гене FBN1 предполагает гетерогенность заболевания.

Обнаружены две новые миссенс-мутации (G1176R; C2489Y) и 3 новых полиморфизма (IVS65+13InsG; 3171С>Т; IVS24-15G>A) в гене фибриллина-1.

Выявлена ассоциация аллеля *С полиморфизма 1875Т>С 15-го экзона гена фибриллина-1 с развитием пролапса митрального клапана у больных синдромом Марфана.

Обнаружена ассоциация аллеля *Г полиморфизма 677С>Т гена метил ентетрагидрофолатредуктазы с развитием тяжелой формы нарушений в сердечно-сосудистой системе у больных синдромом Марфана.

Установлены различия в распределении частот аллелей полиморфных ДНК-локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 между больными синдромом Марфана и контрольной группой здоровых доноров, а также достоверные различия в распределении частот аллелей полиморфного локуса MTS-2 гена фибриллина-1 между нормальными и мутантными хромосомами.

Выявлены статистически значимые отличия в распределении частот гаплотипов по трем полиморфным локусам MTS-1, MTS-2, MTS-4 на нормальных и мутантных хромосомах. Гаплотип 2-11-8 чаще встречается на нормальных хромосомах (0,4), гаплотип 2-2-8 - на мутантных хромосомах (0,18).

8. Разработан алгоритм проведения ДНК-диагностики синдрома Марфана, позволяющий использовать анализ гаплотипов по локусам MTS-1, MTS-2, MTS-4 гена фибриллина-1 для косвенной ДНК-диагностики заболевания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное эпидемиологическое исследование в РБ показало не равномерный характер распространения синдрома Марфана в республике. Распространенность синдрома Марфана в РБ составляет 2,55 на 100 000 населения. Заболевание было зарегистрировано в 18 из 54 административных районов ив 11 из 21 города республики. Показано, что в городах проживает достоверно больше больных, нежели в сельской местности. Обнаружена статистически значимая взаимосвязь между частотой заболеваемости СМ и наличием крупных промышленных предприятий, объясняющая 25,47% вариабельности частоты СМ в республике. Определен средний возраст манифестации больных СМ, составляющий 13,4 лет. Частота спорадических форм заболевания в республике составила 30,3%, что согласуется с литературными данными.

Анализ гена фибриллина-1 у больных СМ показал отсутствие мажорных мутаций. Обнаружено две ранее не описанные миссенс-мутации (G1176R, C2489Y), затрагивающие высоко консервативные аминокислотные остатки в кальций связывающих доменах белка фибриллина-1. В ходе скрининга было выявлено девять полиморфизмов как в кодирующих, так и в некодирующих регионах гена FBN1, три из которых ранее в литературе не описаны (IVS65+13InsG; 3171С>Т; IVS24-15G>A). Обнаружена ассоциация полиморфизма 1875Т>С гена фибриллина-1 с развитием пролапса митрального клапана у больных СМ. Показано, что аллельный вариант FBN1*C является генетическим маркером риска развития митрального клапана.

Проведен анализ полиморфизма 677С>Т гена метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR) у больных СМ с нарушениями в сердечно-сосудистой системе. Выявлены статистически значимые отличия в распределении частот аллелей гена MTHFR в группе больных с тяжелой формой поражения сердечно-сосудистой системы, по сравнению с больными со средней формой нарушений. Показано, что относительный риск развития тяжелой формы нарушений в сердечно-сосудистой системе у больных СМ связан с аллелем MTHFR*T.

Проведено сравнительное изучение полиморфных ДНК-локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4, расположенных в гене FBN1 между этническими группами в контрольной выборке здоровых индивидов. Статистически значимые различия в распределении частот аллелей наблюдались по локусу MTS- Г.

Различия в распределении частот аллелей полиморфных ДНК локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 у больных СМ разной этнической национальности оказались статистически не значимыми.

Установлены статистически достоверные различия в распределении частот аллелей внутригенных полиморфных локусов MTS-1, MTS-2, MTS-4 между больными синдромом Марфана и контрольной группой здоровых индивидов.

Статистически значимые различия были выявлены в распределении частот аллелей локуса MTS-2 на мутантных и нормальных хромосомах больных СМ. Максимальная величина коэффициента ASt наблюдалась для аллеля MTS-2 *2 локуса MTS-2 (-0,44).

Проведенный анализ гаплотипов по локусам MTS-1, MTS-2, MTS-4 в контрольной выборке здоровых индивидов выявил доминирующий гаплотип 2-11-8 во всех этнических группах. Различия в распределении частот гаплотипов между этническими группами оказались статистически не значимыми.

Статистически значимые различия были выявлены в распределении частот гаплотипов по локусам MTS-1, MTS-2, MTS-4 между мутантными и нормальными хромосомами у больных синдромом Марфана. На мутантных хромосомах частым оказался гаплотип 2-2-8, обнаруженный с частотой 0,18.

Проведенное исследование гаплотипов в гене фибриллина-1 в семьях с синдромом Марфана позволило разработать алгортим проведения косвенной ДНК-диагностики.

В общем плане молекулярно-генетических исследований результаты данной работы могут послужить теоретической и методической основой для разработки и оптимизации молекулярно-генетической диагностики такого сложного заболевания как синдром Марфана.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Валиев, Руслан Радисович, Уфа

1. Борисова Н. В. Исследование структуры и метаболизма коллагена при наследственных и врожденных заболеваниях соединительной ткани: Дисс. канд. мед. наук. -М., 1991.

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. -М.: Практика, 1999. С. 130.

3. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. Спб.: Специальная литература, 1997. - С. 96.

4. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. М.: Наука, 1991. - 272 с.

5. Кадурина Т. И. Наследственные коллагенопатии. — СПб.: Невский диалект, 2000. 270 с.

6. Козлова С. И., Семанова Е., Демикова Н. С., Блинникова О. Е., Наследственные синдромы и медико-генетическое консультирование. — М., 1996.-416 с.

7. Котовская Е.С., Мазаев В.П., Жданова С.М., и др. Сердечно-сосудистые заболевания и дисфункция соединительной ткани. Деп.-ЦМБ.- М.,1993.-С.1-8.

8. Семячкина А. Н. Диспансеризация детей с наследственными болезнями соединительной ткани. Лечение и диспансеризация детей с наследственной и врожденной патологией. - М. - 1988. С. 23-31.

9. Семячкина А. Н. Клинический полиморфизм наследственных болезней соединительной ткани у детей. // Автореф. дис. докт. мед. наук. М., 1995.

10. Ю.Яковлев В.М., Нечаева Г.И., Викторова И.А., Глотов А.В. // Врожденные дисплазии соединительной ткани: Тез.симп. Омск. - 1990. — С.3-5.

11. П.Яковлев В.М., Нечаева Г.И., Кардио-респираторные синдромы при дисплазии соединительной ткани. Омск. - 1994. - С.217.

12. Abrams W., Ma R-I., Kucich U. et al. Molecular cloning of the microfibrillar protein MFAP3 and assignment of the gene to human chromosome 5q32-q33.2 // Genomics . 1995.- Vol. 26. - P. 47-54.

13. Answorth J., Murphy G., Rock M. et al. Fibrillin degradation by matrixw>metalloproteinases: implications for connective tissue remodeling // J. Biol. Chem.-1999.-Vol.240.-P. 171-181.

14. Arc View GIS, Version 3.0. Environmental Systems Research Institute, Inc http://www.esri.com

15. Baldock C, Koster A, Ziese U et al. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils // J. Cell Biol. 2001. - Vol.152- P.1045-1052.

16. Bayers P.H. Determination of the molecular basis of Marfan syndrome: a growth industry // J.Clin. Invest.- 2004. Vol.114 - №2 - P. 161-163.

17. Beighton P., De Paepe A., Danks D. International nosology of heritableMdisorders of connective tissues. // Am. J. Med. Genet. 1986. - Vol.29. - P. 581594.

18. Biery N.J., Eldadah Z.A.,. Moore C.S., Stetten G., Spenser F., Dietz H.C. Revised genomic organization of FBN1 and significance for regulated gene expression // Genomics. Vol.56. - P.70-77.

19. Black C., Withers A., Gray J. et al Correlation of a recurrent FBN1 mutation (R122C) with an atypical familial Marfan syndrome phenotype. // Hum. Mutat. -1998. suppl: S. 198-200.

20. Boileau C., Jondeau G., Mizuguchi Т., Matsumoto N. Molecular genetics of У* Marfan syndrome // Current Opinion in Cardiology. 2005. - Vol.20. - P. 194200.

21. Booms P., Cisler J., Mathews K. R et al. Novel exon skipping mutation in fibrillin-1 gene: two 'hot spots' for the neonatal Marfan syndrome // Clin. Genet. -1999.-Vol.55.-P. 110-117.

22. Booms P., Tiecke F., Rosenberg Т., Hagemeier C., Robinson P. Differential effect of FBN1 mutations on in vitro proteolysis of recombinant fibrillin-1 fragments. // Hum. Genet. 2000. - Vol.107. - P. 216-224.

23. Brand-Saberi, В., Ebensperger, C., Wilting, J., Balling, R., Christ, B. The ventralizing effect of the notochord on somite differentiation in chick embryos //

24. Anat. Embryol. 1993. -V.188. - P. 239-245.

25. Bressan G. M., Daga-Gordini D., Colombatti A. et al. Emelin, a component of elastic fibers preferentially located at the elastin-microfibrillis interface // J. Cell Biol. 1993. - Vol.121 - P. 201-12.

26. Buntinx I., Willems P., Spitaels S., VanReempst P., DePaepe A., Dumun J.: Neonatal Marfan syndrome with congenital arachnodactyly, flexion contractures, and severe cardiac valve insufficiency. // Med. Genet. 1991. -Vol.28. - P. 267-273.

27. Cardy C.M., Hanford P.A. Metal ion dependency of microfibrillis supports a rod-like conformation for fibrillin-1 calcium binding epidermal growth factorlike domains // J. Mol. Biol. 276. - P.855-860.

28. Cattaneo M. Hyperhomocysteinemia, atherosclerosis and trombosis // Tromb Haemost. 1999. - Vol.81-P. 165-76.

29. Choy H-T., Shi Y-R., Hsu Y., Tsai F-J. Association between fibrillin-1 gene exon 15 and 27 polymorphisms and risk of mitral valva prolapse // J. Heart. Valve Dis. 2003. - Vol.12 - P. 475 - 481.

30. Comeglio P., Evans A.L., Brice G., Cooling R.J., Child A.H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus // Br. J. Ophthalmol. 2002. - V.86. - P. 1359-62.

31. Collod-Beroud G, Le Bourdeles S, Dehaupas I et al. New update of the FBN1 mutation database 7/ Am. J. Hum. Genet. 2001 - Vol.64 (suppl) - Abstract 2583.

32. Collod-Beroud G., Beroud C., Ades L. et al. Marfan database(second edition): software and database for the analysis of mutation in the human FBN1 gene. // Nucleic. Acids. Res. 1997. - Vol.25. - P. 147-150.

33. Collod-Beroud G., Boileau C. Marfan syndrome in third Millennium. // Eur. J. Hum. Genet. 2002. - Vol.10. - P. 673-681.

34. Collod-Beroud G., Bourdelles S., Ades L., et al. Update of the UMD-FBN1 mutation database and creation of an FBN1 polymorphism database // Hum. Mutat. 2003. - Vol.22 - P.199-208.

35. Corson G, Chalberg S, Dietz H, Charbonneau N, Sakai L. Fibrillin binds calcium and is coded by cDNAs that reveal a multidomain structure and alternatively spliced exons at the 5' end // Genomics. 1993. - Vol.17 - P. 476 - 484.

36. Cotton R.G.H. Mutation detection and mutation database //Clin. Chem. Lab. Med. 1998. - Vol.36(8) - P.519-522.

37. De Bie S., De Paepe., Delvaux I., Davies S., Hennekam R. Marfan syndrome in Europe // Com. Genet. 2004. - Vol.7 - P. 216-225.

38. De Paepe A., Devereux R., Dietz H. et al. Revised diagnostic criteria for the Marfan syndrome. // Am. J. Med. Genet. 1996. - Vol.62. - P. 417-426.

39. Dean J. Management of Marfan syndrome. // Heart. 2002. Vol.88. - P. 97-103.

40. Dietz H. C., Pyeritz R. E., Puffenberg E. G. et al. Marfan phenotype variability in a family segregating a missense mutation in the epidermal growth factor-like motif of fibrillin gene. // Clin. Genet. 1992. - Vol.89. - P. 1674-1670.

41. Dietz H., Cutting G., Pyeritz R. et al. Marfan syndrome caused by a recurrent de novo missense mutation in the fibrillin gene. // Nature-1991. Vol.352. - P. 337-339.

42. Edwards M., Challinor CJ., Coley P. W. et al.Clinical and linkage study of a large family with simple ectopia lentis linked to FBN1 // Am. J. Med. Genet. -1994.- Vol.53 -P.573-576.

43. Fleisher K., Nousari H., Anhalt G., Stone C., Laschinger J. Immohistochemical abnormalities of fibrillin in cardiovascular tissues in Marfan's syndrome // Ann. Thorac. Surg. 1997. - Vol.63 - P. 1012-17.

44. Francke U., Berg M., Tynan K. et al. A Gly 1127Ser mutation in an EGF-like domain of the fibrillin-1 gene is a risk factor for ascending aortic aneurysm and dissection. // Am. J. Hum. Genet. 1995. - Vol.56. - P. 1287-1296.

45. Geva Т., Sanders S. P., Diogenes M.S., Rockenmacher S., Van Praagh R. Two-dimensional and doppler echocardiographic and pathologic characteristics of the infantile Marfan syndrome // Am. J. Cardiol. 1990. - V.65. -P.l230-1237.

46. Giltay R., Kostka G., Timpl R. Sequence and expression of a novel member (LTBP-4) of the family of novel latent transforming growth factor- (3 protein // FEBS Lett 1997. - Vol.411 - P.l64-168.

47. Glanville RW, Qian RQ, McClure DW, Maslen CL. Calcium binding, hydroxylation, and glycosylation of the precursor epidermal growth factor-like domains of fibrillin-1, the Marfan gene protein // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269.-P. 26630-26634.

48. Godfrey M., Raghunath M., Cisler J. et al. Abnormal morphology of fibrillin microfibrils in fibroblast cultures from patients with neonatal Marfan syndrome. // Am. J. Hum. Genet. 1995. - Vol.146. - P. 1414-1421.

49. Gray J.R., Bridges A.B., Faed M.J., Pringle Т., Baines P., Dean J., Boxer M. Ascertainment and severity of Marfan syndrome in a Scottish population // J. Med. Genet.-1994.- V.31 P.51.54.

50. Greally M., Carey J., Milewicz D. et al. Shprintzen-Goldberg syndrome: a clinical analysis. // Am. J. Med. Genet. 1998. - Vol. 76. - P. 202-212.

51. Grompe M. The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids // Nature Genet.- 1993.-Vol.5-P. 111-117.

52. Guisti В., Porciani M.C., Brunelli T. et al. Phenotypic variability of cardiovascular manifestations in Marfan syndrome: possible role of hyperhomocysteinemia and C677T MTHFR gene polymorphism // Eur. Heart. J. 2003. - Vol.24 - P.2038-2045.

53. Hanford P.A, Mayhew M., Baron M., Winship P.R., Campbell I.D., Brownlee G.G. Key residues involved in calcium-binding motifs in EGF-like domains // Nature. 1991- Vol.351. P -164-167.

54. Hayward C., Porteous M.E., Brock D.J. A novel mutation in the fibrillin-1 gene (FBNI) in familial arachnodactyly // Mol. Cell. Probes 1994. - Vol.8. P.325-327.

55. Hollister D., Godfrey M., Sakai., Pyeritz R. Immunohistologic abnormalities of the microfibrillar-flber system in the Marfan syndrome. // N. Eng. J. Med. — 1990.-Vol.323.-P. 152-159.

56. Hynes R. Integrins: versality, modulation, and signaling in cell adhesion. // Cell. 1992.-Vol.69.-P. 11-25.

57. Jensen S. A., Reinhardt D. P., Gibson M.A., Weiss A.S. Protein interaction studies of MAGP-1 with tropoelastin and fibrillin-1 // J. Biol. Chem. 2001.-Vol.276. - P.39661-39666.

58. Judge D., Biery N., Dietz H. Characterization of microsatellite markers flanking FBNI: Utility in the diagnostic evalution for marfan syndrome // Am. J. Med.Genet. 2001.- Vol.99 - P.39-47.

59. Kainulainen K., Karttunen L., Puhakka L. et al. Mutations in the fibrillin gene responsible for dominant ectopia lentis and neonatal Marfan syndrome. // Nature Genetics. 1994.-Vol.6. - P. 64-69.

60. Kainulainen K., Pulkkinen L., Savolainen A., Kaitila I., Peltonen L. Location on chromosome 15 of the gene defect causing Marfan syndrome. // N. Engl. J. Med. 1990. - Vol.323. - P. 935-939.

61. Kainulainen K., Sakai L.Y., Child A. et al. Two mutations in Marfan syndrome resulting in truncated fibrillin polypeptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992.-Vol.89. -P. 5917-5921.

62. Katzke S., Booms P., Tiecke F., Palz M. et al. 'TTGE screening of the entire FBN1 coding sequence in 126 individuals with Marfan syndrome and related fibrilinopathies // Hum. Mutat. 2002.-Vol.20. - P. 197-208.

63. Keene D.R., Maddox B.K., Kuo H.J., Sakai L.Y., Glanville R.W. Extraction from extendable structures and their identification as fibrillin-containing extracellular matrix microfibrillis // J. Histochem. Cytochem. 1991. - Vol.39 -P.441-449.

64. Kettle S., Yaun X., Grundy G., Knott V., Downing A.K., Hanford P.A.

65. Defective calcium binding to fibrillin-1: consequence of an N2144S change for fibrillin-1 structure and function // J. Mol. Biol. 1999. - Vol.285. - P-1277-1287

66. Knott V., Downing A.K., Cardy C.M., Hanford P. Calcium binding properties of an epidermal growth factor-like domain pair from human fibrillin-1 // J. Mol. Biol. Vol.255. - P. 22-27.

67. Krawczak M., Konecki D.S., Schmidtke I. et al. Allelic association of the cystic fibrosis locus and two DNA markers, Xv-2c and KM-19 in 55 German families //Hum. Genet.- 1988.- V. 80.- № i. p. 78-80.

68. Lee В., Godfrey M., Vitaele E. et al. Linkage of Marfan syndrome and phenotypically related disorder to two different fibrillin genes. // Nature. 1991. -Vol.352.-P. 330-334.

69. Lee B.N. Cheong H. I., Shin et al. The effect of C677T mutation of methylenetetrahydro folate reductase gene and plasma folate level on hyperhomocysteinemia in patients with meningomyelocele // Child's Nerv. Syst. 2000. - Vol.16. - P. 559-563.

70. Lipscomb K. J., Clayton-Smith J., Harris R. Evolving phenotype of Marfan's syndrome //Arch. Dis. Child. 1997.- Vol.76. - P. 41- 46.

71. Liu W., Schrijver I., Brenn Т., Francke U. Multi-exon deletions of the FBN1 gene in Marfan syndrome // BMC. Med. Genet. 2001. - Vol.2. - P. 11-19.

72. Loeys B, De Backer J, Van Acker P, et al. Comprehensive molecular screening of the FBN1 gene favors locus homogeneity of classical Marfan syndrome // Hum. Mutat. 2004. - V.24. - P. 140—146.

73. Loeys В., Nuytinck L., Delvaux I, et al. Genotype and phenotype analisis at 171 patients referred for molecular study of the fibrillin-1 gene because of suspected Marfan syndrome // Arch. Intern. Med. 2001. - Vol.161. - P.2447-54.

74. Lonqvist L., Child A., Kainulainen K., Davidson R., Puhakka L., Peltonen L. A novel mutation of the fibrillin gene causing ectopia lentis. // Genomics. 1994. Vol.19.-P. 573-576.

75. MacArthur M.W., Thornton J.M. //J. Mol. Biol. -1991. Vol.218. - P. 397-412.

76. Maddox, B.K., Sakai, L.Y., Keene, D.R., Glanville, R.W. Connective tissue microfibrils. Isolation and characterization of three large pepsin-resistant domains of fibrillin//J. Biol. Chem. 1989. - V.264. -P. 21381-21385.

77. Magenis R.E., Maslen C.I., Smith I., Allen I., Sakai Y. Localization of the fibrillin (FBN) gene on chromosome-15 band q21.1//Genomics. -1991. Vol.11.-P.346-351.

78. Majors A.K., Pyeritz R.E. A deficiency of cysteine impairs fibrillin-deposition: implication for pathogenesis of cystathionine betasynthase deficiency //Mol. Genet. Metab. 2000. - Vol.70 - P. 252-260.

79. Marfan A: Un cas de de'formation conge'nitale des quatre membres, plus prononce'e aux extre'mite's, caracte'rise'e par l'allongement des os avec un certain degre' d'amincissement // Bull Me'm Soc Me'd Ho"p 1896. - Vol. 13.--P. 220-227.

80. McGettrick A., Knott V., Willis, A., Hanford P. Molecular effects of calcium binding mutations in Marfan syndrome depend on domain context // Hum. Mol. Genet. 2000. - Vol.9. - P. 1987-1994.

81. McKuisck V. The cardiovascular aspects of Marfan Syndrome: A heritable disorder of connective tissue. // Circulation. 1955. - Vol.11. - P. 321-341.

82. McKusick V.The defect in Marfan syndrome.//Nature.- 1991. Vol.352.- P. 279-281.

83. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in molecular biology / Ed. Walker J.M. N.Y.; Haman press, 1984.- P.31-34.

84. Milewicz D., Grossfield J., Cao S.N., Kietly C., Covitz W., Jewett T. A mutation in FBN1 disrupts profibrillin pressing and results in isolated skeletal features of the Marfan syndrome // J. Clin. Invest. 1995. - Vol.95. - P. 2373-2378.

85. Milewicz D., Michael K., Fisher N., Coselli J., Markello Т., Biddinger A. Fibrillin-1 (FBN1) mutations in patients with thoracic aortic aneurysms // Circulation. 1996. - Vol.94 - P. 2708-2711.

86. Miyao M., Morita H., Hosoi T et al. Methylentetrahydrofolate reductase polymorphism and bone mineral density in postmenopausal Japanese women // J. Bone Min. Res. 1998. - Vol.l3S373 -P.304.

87. Mizuguchi Т., Collod-Beroud G., Akiyma Т., Abifadel M., NaradaN., Morisaki Т., Allard D. Heterozygous TGFBR2 mutations in Marfan syndrome 2004. -Vol.36-P.855-860.

88. Moren A., Olofsson A., Stennman G et al. Identification and characterization of LTBP-2, a novel latent transforming growth factor- (3 protein // J. Biol. Chem. -1994. Vol.269 - P.32469-78.

89. Nagashima H., Sokomura Y., Aoka Y., et al. Angeotensin II type 2 receptor mediates muscle cell apoptosis in cystic medical degeneration associated with Marfan's syndrome // Circulation 2001. - Vol.104 (suppll): 1-228-7.

90. Nei M. Molecular Population Genetic and Evolution. Amsterdam: North-Holland, 1975.-P.278.

91. Neptune E.R., Frishcmeyer P.A., Arkung D.E., Mayers et al. Dysregulation of TGF- P activation to pathogenesis in Marfan Syndrome // Nat. Genet. 2003. -Vol.33. -P. 407-411.

92. Palz M., Tiecke F., Booms P., Goldner В et al. Clustering of mutations associated with mild Marfan-like phenotypes in the 3' region ofFBNl suggests sy<) potential genotype-phenotype correlation. 2000. - Vol.91 - P.212- 221.

93. Pereira L., Andrikopoulos K., Tian J. et al. Targetting of the gene encoding fibrillin-1 recapitulates the vascular aspect of Marfan syndrome // Nat. Genet. -1997.-Vol.17-P.218-22.

94. Pereira L., D'Alessio M., Ramirez F et al. Genomic organization of the sequence coding for fibrillin, the defective gene product in Marfan syndrome // Hum. Mol. Gen. 1993. - Vpl.2 - P.1762.

95. Pereira L., Levran O., Ramirez F., Lynch J.R., Sykes В., Pyeritz R.E., Dietz H.C. A molecular approach to the strati.cation of cardiovascular risk in families with Marfaris syndrome // N. Engl. J. Med. 1994. - Vol.331 - P.148-153.

96. Pfaff M., Reinhardt D.P., Sakai L.Y., Timpl R. Cell adhesion and integrin binding to recombinant human fibrillin-1 // FEBS Leu 1996.- Vol.384. - P-245-250.

97. Powell Т., Turner R., Henney A., Miller G. An association between arterial pulse pressure and variation in the fibrillin-1 gene. // Heart. 1997. - Vol.78. -P. 396-398.

98. Pyeritz R. E. The Marfan syndrome. New York: Wiley-Liss, 1993. - P. 437468.

99. Pyeritz R. E. The Marfan syndrome.// Annu. Rev. Med 2000. - Vol.51 - P. 481-510.

100. Pyeritz R.E., McKusick V.A. The Marfan syndrome: diagnosis and management // N. Engl. J. Med. 1979. - Vol.300. - P. 772-777.

101. Quondamatteo F.,Reinhardt D.,Charbonneau N.,Pophal G., Sakai L., Herken R. Fibrillin-1 and fibrillin-2 in human embiyonicand early fetal development // Matr. Biol. 2002. - V. 21. - P.637-646.

102. Raghunanth M., Kietly C., Stiemann B. Truncated profibrillin of a Marfan patient leads to over-N-glycosilation. // J. Mol. Biol. 1995. - Vol.248. - P. 901-909.

103. Ramirez F. The fibrillins./Ant. J. Biochem.Cell Biol.-l999.Vol.31.-P. 255-259.

104. Rantamaki T, Lonnqvist L, Karttunen L, Kainulainen K, Peltonen L. DNA diagnostics of the Marfan syndrome: application of applifable polymorphic markers // Eur. J. Hum. Genet. 1994. - Vol.2 - P.66-75.

105. Rantamaki Т., Karttunen L., Peltonen L. Badly engineered fibrillin: lessons from molecular studies of marfan syndrome // Trends. Cardiovasc. Med. -1997.- Vol.7-P282-288.

106. Reinhardt D., Keene D. R., Corson G.M. et al. Fibrillin-1 organization in microfibrillis and structural properties // J. Mol. Biol. 1996. - Vol.258 - P. 104116.

107. Reinhardt D., Ono R., Sakai L. Calcium stabilizes fibrillin-1 against proteolytic degradation. // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. - P. 1231-1236.

108. Reinhardt D.P., Sasaki Т., Dzamba D. et al. Fibrillin-1 and fibullin-2 interact and colocalized in some tissues // J. Biol. Chem. 1996. - Vol.271 - P.l9489-96.

109. Richmond J., Hui H., Hwa J., McCarron H., Clifford F., Richards J. Relation between age, arterial distensibility and aortic dilatation in the Marfan Syndrome // Am. J. Card. 1994. - V.74. - P.369-373.

110. Robinson P., Godfrey M. The molecular genetics of Marfan syndrome and related microfibrillopathies. // J. Med. Genet. 2000. - Vol.37. - P. 9-25.

111. Roff D.A., Bentzen P. The statistical analysis of mitochondrial DNA: % and problem of small samples // Mol. Biol. Evol.- 1989.- V. 6.- P. 539-545.

112. Roman MJ, Rosen SE, Kramer-Fox R, Devereux RB. The prognostic significance of the pattern of aortic root dilatation in the Marfan syndrome // J. Am. Coll. Cardiol. 1993. - V.22. - P.1470 -1476.ч

113. Rosen R. Genetic modulation of homocysteinemia // Semin Thromb Hemost -2000. Vol.22-P. 255-261.

114. Rupp P., Maslen C. Interaction of the fibrillins with laminin 02 identified by yeast two hybrid analisis (abstract) // Eur. J. Pediatr. 1996. - Vol.l55 - P. 736.

115. Sakai L., Keene D., Engvall E. Fibrillin, a new 350-kD glycoprotein, is a component of extracellular microfibrils. // J. Cell. Biol. — 1986. Vol.103. - P. 2499-2509.

116. Sakamoto H., Broekelmann Т., Cheresh D., Ramirez F. etal. Cell-type cpecific recognition of RGD- and non-RGD-containing cell binding domains in fibrillin-1. // J. Biol. Chem. 1996. - Vol.271. - P. 4916-4922.

117. Seshadri S., Beiser A., Selhub J et al. Plasma homocysteine as a risk factor for dementia and Alzheimer's disease //N. Engl. J. Med 2002.-Vol.346.- P.476-83.

118. Sham P.C., Curtis D. Monte Carlo tests for associations between disease and alleles at highly polymorphic loci//Ann. Hum. Genet.-1995.-Vol.59.-P. 97-105.

119. Shores J., Berger K., Murphy E., Pyeritz R. Progression of aortic dilatation and the benefit of long-term {3-andrenergic blockade in Marfan's syndrome. // N. Engl. J. Med. 1994. - Vol.330. - P. 1335-1341.

120. Shrijver I., Liu W., Francke U. The pathogenicity of the Pro 1148Ala substitution in the FBN1 gene: causing or predisposing to Marfan syndrome and aortic aneurysm, or clinically innocent?//Hum.Genet.- 1997.-Vol.99 P.601-611.

121. Silverman DI, Burton KJ, Gray J et al. Life expectancy in the Marfan syndrome // Am. J. Cardiol. -1995. Vol. 75 - P. 157-60.

122. Sood S., Eldadah Z. et al. Mutation in fibrillin-1 and the Marfanoid-craniosynostosis (Shprintzen-Coldberg) syndrome. // Nat. Genet. 1996.-Vol.l2.-P.209-211.

123. Terada Т., Yokoto H., Tsuura M., Nakai R., Ohshima A., Itakura T. Marfan syndrome associated with moyamoya phenomenon and aortic dissection. // Acta Neurochir.-1999. Vol.141. - P. 663-665.

124. The FBN1 mutations database. http://www.umd.be:2030/

125. Tiecke F., Katzke S., Booms P., Robinson P., Godfrey M. et al. Classic, atypically severe and neonatal Marfan syndrome: twelve mutations and genotype-phenotype correlations in FBN1 exons 24-40. // Eur. J. Hum. Genet. -2001.-Vol.9-P. 13-21.

126. Tsipouras P.et al. Marfan syndrome is closely linked to a marker on chromosome 15ql.5—>q2.1. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol.88. -P.4486-4488.

127. Ueland P. M., Hustad S., Schneede J et al. Biological and clinical implicationsof the MTHFR C677T polymorphism // Trends in Pharmacol Sci 2001.-Vol.22. -P. 195-201.

128. Vaughan CJ, Casey M, He J et al. Identification of a chromosome Iq23.2-q24 locus for familial aortic aneurysm disease, a genetically heterogeneous disorder // Circulation. 2001. - V.103. - P. 2469-75.

129. Wang M., Clericuzio C.L., Godfrey M. Familial occurrence of typical and severe lethal congenital contractural arachnodactyly caused by missplicing of 34 exon of fibrillin-2 // Am. J. Hum. Genet. 1996. - Vol.59 - P. 1027-1034.

130. Wang M., Kishnani P., Decker-Phillips M., Kahler S., Godfrey M. Doublek>mutant fibrillin-1 (FBN1) allele in a patient with neonatal Marfan syndrome. // J. Med. Genet. 1996. - Vol.33. - P. 760-763.

131. Weve H. U" ber Arachnodaktylie (dystrophia mesodermalis congenita, Typus Marfan) // Archiv. Augenheilk 1931. - Vol. 104. P. - 46.

132. Wheatley H.M., Traboulsi E.L., Flowers B.E at al. Immunohistochemical localization of fibrillin in human ocular tissue // Connect. Tissue. Res. — 1995. -Vol.113-P.103-109.

133. Whiteman P., Downing K., Hanford P. NMR analysis of cbEGF domains gives new insights into the structural consequences of a P1148A substitution infibrillin 1 // Protein. Eng. 1998. - Vol. 11 - P. 957-959.

134. Writz M., Samples J., Kramer P. et al. Weil-Marchesani syndrome possible linkage of the autosomal dominant form to 15.q21.1. // Am. J. Med. Genet. -1996.-Vol.65.-P.68-75.

135. Wu-Chen W.Y., Letson R.D., Summers C.G. Functional and structural outcomes following lensectomy for ectopia lentis // J. AAPOS. 2005. - V.4 -P. 353-357.

136. Yaun X., Downing A.K., Knott V., Hanford P.A. Solution structure of the transforming growth factor b-binding protein like module, a domain associated with matrix fibrillis // EMBO J. 1997. - Vol.15. - P- 6659-66.

137. Yin W., Smiley E., Germiller J. et al. Isolation of a novel latent transforming growth factor- p protein //J. Biol. Chem. 1995. - Vol.270. - P. 1798-806

138. Zhang H., Apfelroth S., Hu W. et al. Structure and expression of fibrillin-2, a novel microfibrillar component preferentially located in elastic matrices. // J. Cell. Biol. 1994. - Vol.124. - P. 885-863.

139. Zhang H., Hu W., Ramirez F. Developmental expression of fibrillin genes suggests heterogeneity of extracellular microfibrills // J. Cell. Biol-1995. -Vol.129- P. 1165-76.