Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития вьюна (Misgurnus fossilis L. )

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития вьюна (Misgurnus fossilis L. )"

Российская Академия Наук Институт Обшей Генетики им. Н.И. Вавилова р ¡' ^ 0 Д

7 " ДВГ 2000

На правах рукописи УДК 575.113.1

Ильичев Александр Владимирович

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПОД КОНТРОЛЕМ ГЕТЕРОГЕННЫХ ПРОМОТОРОВ В ПРОЦЕССЕ РАННЕГО РАЗВИТИЯ ВЬЮНА (Шэдитиэ Лмв/"/« I-.).

(03.00.15.-генетика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2000

Работа выполнена в Группе генетической инженерии животных Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Д.В. Муха. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, Л.И. Корочкин, кандидат биологических наук A.B. Баранова.

Ведущее учреждение:

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова,

Защита состоится "¿-3" и^гЛ_2000 года в. /О часов

на заседании диссертационного совета Д 002.49.01 в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. (117809, ГСП-1, Москва, В-333, ул. Губкина, 3, факс: (095) 132-89-62)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан" а ¿у 2000 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук Г.Н. Полухина

О

£ 6ГЗЛ (0

Актуальность проблемы.

Один из подходов к исследованию механизмов регуляции экспрессии генов эукариот основан на анализе данных, полученных при экспериментальном введении в эукариотические клетки генов или других сегментов ДНК (Уотсон Дж. и др. 1986).

В качестве реципиентов в работах подобного плана используют многие виды зукариотических организмов: дрожжи, насекомые, растения, млекопитающие и т.д. Не так давно, немногим более десяти лет назад, в научных исследованиях началось активное использование трансгенных рыб (Maclean N. etal.1985).

К настоящему времени накоплен достаточно большой материал относительно эффективности работы гетерологичных промоторов в клетках трансгенных животных и растений. Описан характер экспрессии гетерологичных промоторов, как в культуре клеток, так и в процессе эмбрионального развития. Однако, в большинстве экспериментов использовали промоторы генов, клонированные из близкородственных организмов; оставался открытым вопрос об эффективности функционирования промоторов генов, клонированных из организмов, сильно эволюционно отдаленных. Таким образом, являлось актуальным проведение данного анализа.

Кроме того, ранее было показано, что определенные бактериальные последовательности ДНК, часто представленные в плазмидах, которые используются для конструирования рекомбинантных векторных молекул, могут негативно влиять на работу зукариотических промоторов (Townes Т.М. et al. 1986). В рамках данного исследования была предпринята попытка более глубокого изучения влияния бактериальных последовательностей ДНК на промоторы зукариотических генов.

Следует отметить, что исследование механизмов регуляции экспрессии генов, их регуляторных элементов не только расширит наше представление о структуре функциональной активности генов, но и позволит использовать полученные знания в биотехнологии, являющейся на сегодняшний день одной из самых перспективных отраслей промышленности.

Цели и задачи исследования.

1. Создание векторных молекул, которые могут быть использованы для трансгеноза различных видов организмов и проведения сравнительного анализа эффективности экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов. С этой целью представлялось актуальным конструирование нескольких серий рекомбинантных векторных молекул ДНК, содержащих маркерные гены Neo и Lac Z под контролем сильных промоторов, клонированных из ДНК организмов, принадлежащих эволюционно отдаленным таксонам.

2. Анализ эффективности экспрессии созданных векторных конструкций в процессе раннего развития вьюна (Misgurnus fossilis L).

3. Изучение влияние бактериальных последовательностей ДНК, в частности, БАК-домена лактозного оперона Е. coli (последовательность ДНК, ответственная за взаимодействие с белком активатором катаболизма) на функционирование эукариотических промоторов.

Научная новизна и практическая ценность работы.

1. Показано, что экспрессия маркерного гена, находящегося под контролем гетерогенного промотора, зависит от степени эволюционной консервативности структурных частей генов, промоторы которых подвергаются сравнению, а не от степени эволюционной удаленности организмов. Для выявления эволюционного консерватизма регуляторных элементов генов предлагается использовать описываемый в данной работе "функциональный" подход.

2. Показано, что определенные последовательности бактериальной ДНК, часто представленные в плазмидах, используемых для конструирования рекомбинантных векторных молекул, могут значительно изменять характер активности промоторов эукариотических генов. Заметим, что ранее было описано "негативное" влияние определенных последовательностей бактериальной ДНК на работу эукариотических промоторов (Townes Т.М. et al. 1986) , в данной работе мы впервые описываем "активизирующее" действие бактериальных последовательностей.

3. Впервые показано, что БАК-домен лактозного оперона Е. coli может позитивно влиять на функционирование эукариотического промотора и, возможно, является регуляторным элементом транскрипции

не только прокариотических, но и эукариотических организмов. В составе ряда эукариотических генов, нуклеотидные последовательности которых представлены в EMBL - банке генов, выявлены домены, имеющие высокую (до 100%) степень сходства с БАК - доменом лактозного оперона Е. coli.

Апробация работы. Основные материалы работы доложены на межпабораторном семинаре ИОГен РАН (22 июня 1999 г.). По материалам диссертации представлены и опубликованы тезисы на евроазиатском симпозиуме по биотехнологии (Анкара, Турция, 1995).

Объем и структура диссертации. Публикации.

Диссертация изложена на /2 S страницах, включает стандартные разделы и иллюстрирована 1 таблицей и 62 рисунками. Некоторые данные, представленные в диссертации, получены в результате плодотворного сотрудничества с руководителем Центра по переносу генов в эукариоты Института молекулярной генетики РАН (Москва) к.б.н. Андреевой Людмилой Евгеньевной. По теме диссертации опубликованы две экспериментальные работы.

Результаты и их обсуждение.

1. Создание рекомбинантных векторных молекул, предназначенных для анализа экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов.

Одной из задач данной работы было создание двух серий рекомбинантных векторных молекул, содержащих маркерные гены Neo и Lac Z под контролем промоторов, клонированных из ДНК организмов, принадлежащих эволюционно отдаленным таксонам: промотор ß-1-тубулинового гена инфузории Tetrahymena pyriformis (5'Tu), промотор гена 35S вируса мозаики цветной капусты (35S), LTR мобильного элемента Copia плодовой мушки Drosophila melanogaster (Сор), промотор раннего гена обезьяньего вируса SV40 (SV40). Создание серий рекомбинантных векторных молекул, имеющих общий план строения, представлялось актуальной задачей, поскольку открывала перспективу их использования для трансгеноза различных видов организмов и проведения сравнительного анализа эффективности экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных

промоторов. В качестве "структурных блоков" при создании данных векторных молекул использовали фрагменты как коммерческих плазмид, так и любезно предоставленных коллегами. Плазмиды, содержащие регуляторные элементы гена (5-1-тубулина ТекаИутепа рул/олий были

рЭУЫеоЗТи - р5Ти№о

ЕсоИХ пс!Х XX »„от

Рис. 1. Плазмиды с маркерным геном Neo. a) pSVNeo3'Tu, б) p5'TuNeo3'Tu, в) pCopNeo3Tu, г) p35SNeo3'Tu. SV-промотор вируса SV40, 35S-npoMorap вируса мозаики цветной капусты, 5'Ти-промотор тубулинового гена инфузории Tetrahymena pyriformis, Cop-LTR мобильного элемента Copia D.melanogaster, Amp-ген устойчивости к ампицилину, З'Ти - участок терминации транскрипции и полиаденилирования ß-l-тубулинового гена Tetrahymena pyriformis. Neo - ген устойчивости к неомицину, канамицину и G418.

£coR I, Hind III, Ват H I, Sal I, Pst I - участки узнавания одноименных рестрикгаз.

получены в Группе генетической инженерии животных ИОГен РАН. Сконструированные плазмиды с маркерным геном Neo pSVNeo3'Tu, p5'TuNeo3'Tu, pCopNeo3Tu, p35SNeo3Tu (рис.1 а,б,в,г, соответственно) предполагается использовать для проведения трансгеноза и дальнейшей доминантной селекции полученных трансгенных особей. Живой организм, имеющий в своем составе функционирующий ген Neo, приобретает способность выживать в присутствии неомицина и/или G418. В рамках представленной работы основные структурные элементы данных векторных конструкций были использованы для создания и анализа эффективности экспрессии рекомбинантных ДНК на основе маркерного гена Lac Z.

Для анализа экспрессии чужеродного генетического материала в клетках эукариот немаловажное значение имеет выбор "маркерного" гена. Поэтому для анализа транзиторной экспрессии были созданы две серии векторов, имеющие в своем составе в качестве репортерного гена бактериальный ген Lac Z, функционирование которого легко определяется гистохимическими реакциями. На рис. 2 представлена схема создания серии векторых конструкций: pSV-ß-Gal, p35S-ß-Gal, p5'Tu-ß-Gal, pCop-ß-Gal. Основой этой серии векторов с маркерным геном Lac Z был вектор pSV-ß-Gal (Promega). BeicTop pSV-ß-Gal одновременно обрабатывали рестриктазами £coR I и Hind III. По этим сайтам, из соответствующих плазмид p5'TuNeo3'Tu (рис. 16), pCopNeo3'Tu (рис. 1в) и p35SNeo3'Tu (рис. 1г), переклонировали промоторы 5Tu, Сор, 35S (рис. 2а). В результате получили серию на основе маркерного гена Lac Z, имеющую в своем составе четыре разных промотора, участки терминации транскрипции и полиаденилирования раннего гена вируса SV40 (рис. 2а-г). Отметим, что плазмиды этой серии перед анализирующими промоторами имеют промоторный участок бактериального гена Lac Z, на рисунке обозначенный буквой А.

На рис. 3 представлена схема создания другой серии векторных конструкций на основе маркерного гена Lac Z: pGEM-SV-Gal-3'Tu, pGEM-35S-Gal-3'Tu, pGEM-5Tu-Gal-3Tu, pGEM-Cop-Gal-3'Tu. Для создания векторных конструкций этой серии использовали следующий

Создание плаэмид p35S-beta-GaJ. p5Tu-beta-Gal л pCop-bet^Oai из pSV-buLd-Gdl

Рис. 2. Схема создания плазмид б) p35S-ß-Gal, в) p5'Tu-ß-Gal, г) pCop-ß-Gal на основе плазмиды а) pSV-ß-Gal "Promega". SV-промотор вируса SV40, 35S-np0M0T0p вируса мозаики цветной капусты, 5'Ти-промотор тубулинового гена инфузории Tetrahymena pynformis, Cop-LTR мобильного элемента Copia D.melanogaster, Amp-ген устойчивости к ампицилину, LacZ-ген ß-галактозидазы лакгозного оперона Е. coli с участком терминации транскрипции и полиаденилирования вируса SV40.

EcoR I, Hind III, ВатН I, Sal I, Pst I - участки узнавания одноименных рестрикгаз.

А - промоторный участок бактериального гена LacZ.

Создание pGEM2-3Tu

Создание плазмиды pGEM2-3Tu-delta-Gal из плазмиды pGEM2-3Tu

sali из pSV-öeta-Gaf

CoaEatw плаэмид pGEM-SV-Ga^Tj. pGEM-35S-Ga(-3Tu, pGEM-5Tu-Ga^Tu, pGEM-Cop-Gat-ЗТи на основа плазмиды pGEM2-3Tu-delt*Gaf

pGEM^OP-Gat-ЗТи

Рис. 3. Этапы создания плазмид д) pGEM-SV-Gal-3'Tu, ж) pGEM-35S-Gal-3'Tu, е) pGEM-5'Tu-Gal-3'Tu, г) pGEM-Cop-Gal-3'Tu. SV-промотор раннего гена вируса SV40, 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты, 5'Ти-промоторная область тубулинового гена инфузории Tetrahymena pynformis, Cop-LTR мобильного элемента Copia D.melanogaster, Amp-ген устойчивости к ампицилину, LacZ-ген ß-галактозидазы лактозного оперона Е. coli. EcoR I, Hind III, BamH I, Sal I, Pst I - участки узнавания одноименных рестриктаз.

методический подход. В плазмиду pGEM2 по сайтам рестрикции EcoR I -Hind III из плазмиды pUCBM20-3'Tu (полученной ранее в Группе генетической инженерии животных ИОГен РАН) переклонировали 3' нетранслируемую область тубулинового гена Т. pynformis. Полученную плазмиду назвали pGEM2-3'Tu (рис. За-б). Далее, в pGEM2-3Tu по сайтам рестрикции EcoR I - Sal I переклонировали участок гена Lac Z из pSV-ß-Gal (рис.Зб). Таким образом, получили плазмиду pGEM2-AGal-3Tu

(рис. Зв). На заключительном этапе плазмиду pGEM2-AGal-3Tu обработали рестриктазой EcoR I. Образовавшуюся линейную форму плазмиды pGEM2-AGal-3Tu с помощью лигазы соединили с оставшейся частью гена Lac Z и интересующими нас промоторами: SV40, 35S, 5Ти и Сор (рис. Зв). Таким образом, получили следующие плазмиды pGEM-SV-Gal-3'Tu (рис. Зд), pGEM-35S-Gal-3Tu (рис. Зж), pGEM-5Tu-Gal-3Tu (рис. Зе), pGEM-Cop-Gal-3'Tu (рис. Зг).

2. Анализ экспрессии чужеродного генетического материала в процессе раннего развития вьюна (Misgurnus fossilis L.).

Для анализа эффективности экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития вьюна использовали две серии векторных конструкций, на основе маркерного гена Lac Z, описанных ранее. Схематично план строения используемых рекомбинантных молекул ДНК изображен на рис.4.

У/МТОРП Ы<|

прокатиот

участок rwoMOTo^,

взаимодействия •эаииодмэстмл акгм»лм» •

с ийМФ-БДК с РНК-поимнегаэоя ядрах »укэриот прокариот

V

Рис.4. Схематическое изображение используемых векторных конструкций. Векторные молекулы на основе маркерного гена Lac Z: I -первой серии (см. рис. 3); II -второй серии (см. рис. 2). Lac Z - нуклеотидная последовательность ß-гапактозидазы В. coli', SV (poly А) - терминатор транскрипции и участок полиаденилирования вируса SV40. Условные обозначения промоторов генов: Tu - ß-1-тубулина Т. pyriformis; Сор - LTR мобильного элемента Copia D. melanogaster, 35S - 35S гена вируса мозаики цветной капусты; SV- ранний промотор вируса SV40.

V - детальное изображение структуры регуляторных элементов прокариот, используемых в векторных конструкциях второй серии на основе маркерного гена Lac Z. Lac I - фрагмент гена репрессора лаетозного олерона Е coli, Lac О - оператор лактозного оперона Е. coli.

Для анализа векторных конструкций использовали несколько десятков эмбрионов вьюнов, инъецированных на стадии первого деления

дробления. Эффективность экспрессии чужеродного генетического материала определяли гистохимическими методами.

2а) Анализ экспрессии векторных конструкций первой серии [рис. 4(1)]. Результаты, полученные с использованием плазмид первой серии представлены на рис. 5-7. "Зоны экспрессии" маркерного гена Lac Z имеют синий цвет и легко отличаются от других темных структур зародыша. На фотографиях видно, что промоторы генов, в норме активные в ядрах млекопитающих, растений, насекомых и простейших, т.е. эволюционно удаленных от рыб таксонов, способны обуславливать экспрессию репортерного гена в процессе раннего развития вьюна. Вероятно, соответствующие факторы транскрипции значительно консервативны в пределах различных таксонов эукариот. Отметим, что до описываемых исследований способность экспрессировать чужеродный генетический материал в клетках рыб была показана только для промоторов генов, клонированных из организмов в пределах типа позвоночные (Friedenreich Н., Schatl М. 1990), либо в пределах LTR вирусов позвоночных (Reihard Е. et al. 1994; Stuart G.W. et al. 1988; Андреева Л.Е.. Дворянчиков Г.А. 1995).

Рис.5. Выявление активности ß-галактозидазы в трансгенных зародышах вьюна (24 ч развития), содержащих маркерный ген Lac Z под контролем промотора гена тубулина инфузории Т. pyriformis - -промотора 5'Tu. 5'Ти - промотор гена ß-1-тубулина Т. pyriformis.

Рис.6. Выявление активности ß-галакгозидазы в трансгенных зародышах вьюна (24 ч развития), содержащих маркерный ген Lac Z под контролем регуляторных элементов: SV - промотор раннего гена вируса SV40; 35S - промотор 35S гена вируса мозаики цветной капусты; Сор - LTR мобильного элемента Copia D. melanogaster.

Используемый в данной работе метод определения активности промоторов является качественным и не позволяет строго определять количество синтезированного продукта маркерного гена. В то же время мы можем визуально сравнивать эффективность работы исследуемых регуляторных элементов генов различных таксонометрических групп по экспрессии репортерного гена Lac Z. Интенсивность окраски эмбрионов вьюна после микроинъекций различных векторных конструкций сильно различалась. Трансгенные зародыши, содержащие маркерный ген Lac Z под контролем промотора гена ß-1-тубулина T. pyriformis, имели большее количество клеток с галактозидазной активностью, чем зародыши, содержащие маркерный ген под контролем промотора вируса SV40, промотора гена 35S вируса мозаики цветной капусты или LTR Copia D.melanogaster (рис. 5, 6). Известно, что тубулины являются эволюционно консервативными белками (Liand M.-F. et al. 1992). В то же время

простейшие являются значительно эволюционно удаленным от рыб таксоном.

Мы предполагаем, что экспрессия маркерного гена, находящегося под контролем гетерогенного промотора, зависит не от степени эволюционной удаленности организмов, а от степени эволюционной консервативности структурных частей генов, промоторы которых подвергаются сравнению. Другими словами, эволюционный консерватизм структурных частей гена сопряжен с консерватизмом системы регуляции активности данных генов. Это предположение согласуется с раннее опубликованными данными, в которых показано, что промоторы эволюционно консервативных хит-шоковых и металлотионеиновых генов одних организмов активно функционируют в других, сильно эволюционно отдаленных (Спирин A.C. и др. 1990).

Для выявления эволюционного консерватизма последовательностей структурных частей генов с успехом применяется метод "нуклеотидных выравниваний" (Франк-Каменецкий М.Д. и др. 1990). Однако для выявления эволюционного консерватизма регуляторных элементов генов данный метод не применим. Для этих целей мы предлагаем использовать описываемый в данной работе "функциональный" подход.

На рис.7 представлены трансгенные зародыши вьюна на 5 сутки развития. В качестве трансформирующего агента использовали вектор p5'Tu-ß-Gal (рис. 2в). По сравнению с трансгенным эмбрионом на стадии развития 1 сутки, интенсивность экспрессии гена Lac Z стала значительно меньше. По мере развития эмбрионов экспрессия маркерного гена постепенно уменьшается и на 10-20 сутки развития сходит на нет. Вероятно, по мере развития эмбриона происходит или элиминация чужеродного генетического материала или его сайленсинг. Явление сайленсинга чужеродного генетического материала более глубоко изучено на растениях, хотя данное явление было обнаружено и у представителей животного царства. (Depicker A. and Montagu М. 1997). Так же немаловажную роль в регуляции генной активности трансгенов может играть метилирование ДНК (Matzke М.А. and Matzke A.J.M. 1995).

Рис.7. Выявление активности ß-галактозидазы в трансгенных зародышах вьюна (4-е сутки развития), содержащих маркерный ген Lac Z под контролем промотора гена тубулина инфузории Т. pyriformis (5'Ти).

26) Анализ экспрессии векторных конструкций второй серии [рис. 4(11)]. При анализе векторных конструкций второй серии были получены следующие результаты. Степень и структура окраски трансгенных эмбрионов вьюна, трансформированных векторами p35S-ß-Gal, pCop-ß-Gal и p5'Tu-ß-Gal не отличалась от окраски эмбрионов, проинъецированных соответствующими векторами первой серии. В тоже время, наблюдалось резкое различие в активности промотора вируса SV40. Как видно из рис. 6, векторная конструкция pGEM-SV-Gal-3'Tu, содержащая маркерный ген Lac Z под контролем промотора раннего гена вируса SV40 [первая серия (рис. 4(1)], экспрессировала незначительное количество анализируемого белкового продукта. В то же время, когда в векторной конструкции перед промотором SV40 находились регуляторные элементы промотора лактозного оперона Е. coli (вектор pSV-ß-Gal, рис. 2а, рис. 4(11), наблюдалась мощная экспрессия репортерного гена (рис. 8).

Мы предполагаем, что основная роль в регуляции активности промотора вируса SV40 в данных экспериментах принадлежит последовательности промотора лактозного оперона Е. coli, ответственной за взаимодействие с комплексом цАМФ-БАК (белок -

активатор катаболизма, САР), БАК-домену. Известно, что взаимодействие комплекса цАМФ-БАК с БАК-доменом лактозного оперона Е. coli обуславливает позитивную регуляцию лактозного промотора (Стент Г.С., Кэлиндар Р. 1981). Более того, регуляция экспрессии зукариотических генов, отвечающих за метаболизм может быть связана с цАМФ (Стент Г.С., Кэлиндар Р. 1981; Mason М. et al. 1998).

фг

Г

SVCap

Рис. 8. Выявление активности ß-галактозидазы в трансгенных зародышах вьюна (24 ч развития), содержащих маркерный ген Lac Z под контролем сочетания регуляторных элементов /ас-оперона Е. coli и промотора раннего гена вируса SV40 (SVCap).

В качестве подтверждения, что БАК-домен Е. coli может являться регуляторным элементом зукариотических генов, была предпринята попытка обнаружить БАК-подобные домены в последовательностях зукариотических генов, представленных в EMBL банке генов. В результате проведенной работы было выявлено 10 последовательностей зукариотических генов, содержащих БАК-подобные последовательности (степень сходства не менее 95%). Отметим, что .ранее БАК-подобные гомологичные участки данных генов не могли обнаружить, так как при сравнении протяженных последовательностей гомология в 35 нуклеотидов не определяется. Для их обнаружения необходимо

направленно анализировать последовательности генов на гомологию с короткой последовательностью.

Обнаруженные последовательности генов принадлежали к широкому кругу таксонов, от растений до человека. В таблице 1 представлены данные, полученные при анализе последовательностей эукариотических генов на гомологию с БАК-доменом лактозного оперона Е. coli.

В качестве примера на рис. 9 приведена последовательность первых 600 нуклеотидов кДНК белка ЕОР75 гороха (Х83767) (Tranel P.J. et al. 1995). Выделенный подчеркиванием фрагмент - БАК-подобный домен, имеющий 100%-ное сходство с последовательностью БАК-домена лактозного оперона Е. coli.

caacttccaa occtttcttc ttctctttcc 30

gccacccaaa tgagttacta caaccaacaa 60

caaccgcccg tcggcgttcc tccgccgcaa 90

ggttatccgc agcaagagtc ttatggaaaa 120

gacgcttaco ctccgccggg gtatccgccg 150

caaggctacc ctccacagca gggctatcca 180

ccgcaaggct atccacagca aggctatcca 210

ccgcaatatg ctcctcagta tgctcagcct 240

ccgcctcaac aacagcaaaa ttcatccggt 270

gctggttgct tggaaggctg cttggctgct 300

ctctgctgct gctgtctttt ggatgcgtgc 330

ttttgagggg agatattact ttgcacaaat 360

tgggttgatt acaaatgtat tttgactttg 390

agtacatgat gattattgtt cttgtagttt 420

cttttacttt tccttgttta ttgtttgttt 450

ttatgaatat caagttatga actactgctt 480

ctaaataaaa gtgcctaatg agtqaqctaa 510

ctcacattaa ttgcgttgcq ctcaotgccc 540

tttttttttt caotctacag cgacctaatc 570

tctacaatgc gtacttccgt tattcccaat 600

Рис. 9. Фрагмент нуклеотидной последовательности кДНК белка ЕОР75 гороха. Подчеркиванием выделен БАК-подобный домен, курсив-ДНК, кодирующая последовательность аминокислот.

Таблица 1. Эукариотические гены, имеющие в своем составе последовательности, сходные с последовательностью БАК-домена лактозного оперона Е. соН.___

Регистрационный номер в EMBL банке генов Организм Нуклеотид-ная последовательность Расположение БАК-подобного участка Процент сходства сБАК- доменом E.coli

Х68127 грызун Mesocrice-tus auratus малая субъеденица рибонуклео-тид редуктазы 3'- нетранслиру-емая регуляторная область гена 100%

S85459 человек цитохром Р450-|7а интрон II 95%

Х58217 мышь последовательность ДНК, соединяющая Vk и Jk гены С -легкой цепи иммуноглобулина 3' область V -сегмента 100%

D34614 человек тромбоксан синтазы (TBXAS1) интрон II 100%

Х16234 перепел Coturnix cotumix а-тропо-миозина интрон IV, часть С 100%

Z22638 гидра Hydra magnipa-pillata гомеобокс интронная часть гомеобокса 100%

D28584 овца LFA-3 3' - нетрансли-руемая область 100%

D12719 дрожжи Candida maltosa ALK7 и ALK8, необходимые для создания n-алкан инду- цибельного цитохрома Р450 5' - нетранкриби-руемая регуляторная область 100%

D16136 нематода Dirofílaria immitis cd31s З'-нетрансли-руемая область 97,1%

Х83767 горох кДНК белка ЕОР75 5'-нетрансли-руемая область гена 100%

Анна Биасон (Anna Biason) с соавторами обнаружила в составе последовательности мутантного гена цитохрома P450i7a человека фрагменты ДНК, сходные с последовательностью лактозного оперона £. coli. В данной работе авторы предполагают, что последовательности ДНК, сходные с последовательностями ДНК прокариот, могут содержаться и распространяться по геному" эукариот в составе нового типа транспозонподобных элементов (Biason А. et al. 1991). С нашей точки зрения, более простым объяснением появления БАК-подобных доменов в составе геномной ДНК эукариот может являться их происхождение из генома органелл - митохондрий и/или хлоропластов, которые, как предполагается, имеет прокариотическую природу.

Известно, что в процессе эволюции генома эукариот происходило сложное перераспределение функций между органеллами и ядром (Gray W. 1989). Возможно, часть регуляторных последовательностей ДНК органелл, в частности, БАК-подобные последовательности, в ходе эволюции были использованы для регуляции эукариотических ядерных генов. Возможно также, что ВАК-подобный домен изначально являлся частью промоторной области некоторых эукариотических генов и мог участвовать в регуляции активности этих генов еще на заре возникновения эукариот.

Мы предлагаем назвать БАК-подобные домены генов эукариот протеобоксами (proteobox), считая их новыми регуляторными элементами транскрипции генов эукариот.

3. Анализ влияния БАК-домена лактозного оперона Е. coli на экспрессию маркерного гена Lac Z под контролем эукариотического промотора в процессе раннего развития вьюна (Misgurnus fossilis).

Для прямого подтверждения позитивного влияния БАК-домена лактозного оперона Е. coli на работу промотора раннего гена вируса SV40 были созданы две дополнительные векторные конструкции. Эти рекомбинантные молекулы ДНК содержали маркерный ген Lac Z, промотор и участок терминации транскрипции раннего гена вируса SV40. Однако одна из этих векторных конструкций содержала (рис. 11 в), в отличие от другой (рис.Юв), перед промотором SV40 бактериальную

последовательность, ответственную за взаимодействие с комплексом цАМФ-белок (БАК-домен лактозного оперона Е. coli). Этапы создания этих плазмид описаны ниже.

Оба вектора были созданы на основе плазмиды pAT-CopNeo (Rio D.C., Rubin С.М. 1985). По сайтам рестрикции EcoR I - Hind III в рАТ-CopNeo из pSV-ß-Gal (рис. 2а) был клонирован промотор вируса SV40 (рис. 10а), таким образом была получена плазмида pAT-SV-Neo (рис. 106). В плазмиду pAT-SV-Neo по сайту EcoR I была клонирована искусственно синтезированная последовательность ДНК, соответствующая бактериальной области связывания с БАК-белком (белком - активатором катаболизма). Для создания искусственного БАК-домена, идентичного БАК-домену лактозного оперона Е. coli, были синтезированы два олигонуклеотида следующего состава:

а) 5 ' AATTCGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTG 3 1

б)5' AATTCAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCG 3'

Синтез данных олигонуклеотидов был заказан в Институте Молекулярной Биологии им. Энгельгардта РАН. В результате совместного отжига этих олигонуклеотидов получали фрагмент двунитевой ДНК, имеющей следующую последовательность нуклеотидов:

AATTCGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTG

GCGCGTTGCGTTAATTACACTCAATCGAGTGAGTAACTTAA

"Основная" двунитевая часть полученной молекулы ДНК соответствовала последовательности БАК-домена, а "липкие" 5' концы соответствовали последовательности участка узнавания рестриктазы EcoR I. Плазмида pAT-SV-Neo была подвергнута рестрикции ферментом EcoR I. После проведения совместной реакции лигирования полученного фрагмента ДНК, последовательность которого соответствует последовательности БАК-домена, и вектора pAT-SV-Neo, обработанного

рестриктазой £coR I (рис. 11a), был получен вектор pAT-CAP*-SV-Neo (рис. 116). Отбор клонов £. coli, имеющих интересующую нас плазмиду pAT-CAP*-SV-Neo, проводили с помощью гибридизации in situ. В качестве зонда использовали один из двух олигонуклеотидов, описанных ранее, в котором б'-концы ДНК были помечены [у-Р32] АТФ.

Окончательным этапом создания данных векторных конструкций была замена гена Neo по сайтам рестрикции Hind III - ВатН I у плазмид pAT-SV-Neo и pAT-Cap-SV-Neo на маркерный ген Lac Z (из pSV-ß-Gal) (рис. 106, 116) и получение плазмид pAT-SV-Gal (рис. 10в), pAT-Cap-SV-Gal (рис. 11 в).

Создание плазмиды pAT-SV-Neo.

EcoRI / 8V40

Получение плазмиды pAT-SV-Gai из плазмиды pAT-SV-Neo

SV40 - промотор раннего гена вируса SV40

Сор • LTR мобильного элемента Copia D meianogaster

Neo - ген устойчивости к неомицину Amo • ген устойчивости к ампицилину

EcoRI, Hindlll. BamHI, Sali • участки узнавания одноименных рестрикгаэ

pAT-SV-Gal

SV40 - промотор ражего гена вируса SV40 LacZ - ген бетэ-галактоэидазы ег

Neo - ген устойчивости «неомицину Amp - ген устойчивости к ампицилину

EcoRI, hinaill, Bamhl, Sail • участки узнавания одноименных рестриктаэ

SV40 - промотор раннего гена вируса SV40

LacZ - ген бетачалактоэидззы

Amp - ген устойчивости к ампицилину

EcoRI. Mind111. BamHI, Sail - участки узнавания одноименных

рестриктаэ

Рис. 10. Этапы создания векторной конструкции pAT-SV-Ga!. SV40 - промотор раннего гена вируса SV40. Сор - LTR мобильного элемента Copia D.melanogaster. Neo -ген устойчивости к неомицину. Amp - ген устойчивости к ампицилину. LacZ - ген ß-галакгозидазы лакгозного оперона Е. coli. EcoR I, Hind 111, ВатН I, Sal I -участки узнавания одноименных рестрикгаз.

Создание плазмиды pAT-Cap-SV-Neo из плазииды pAT-SV-Neo

EcoRI I CAP

CAP - искусственно синтезированная последовательность БАК-дсмена

SV40 • лроыотор рзннего гена еиоуса SV40 Е coli

Neo - ген устойчивости к неомицину

Anр - ген устойчивости к змпицилину

EcoRI Hindill. BamHl. Sail - участки узнавания одноименных

рестриктаз

Этап создэния плазмиды pAT-CAP-SV-Gai из рАТ-САР- S V- Neo

BamHt í

CAP - искусственно синтезированная последовательность БАК-домена Е coli SV40 - промотор раннего гена вируса SV40 LacZ - ген бета-галактозидазы Neo • ген устойчивости к неомицину Amp • ген устойчивости к ампицилину EcoRI. Н'nclll BamHl. Sail - участки узнавания одноимемньи рестриктаэ

САР - искусственно синтезированная последовательность БАК-домена SV40 - промотор раннего гене вируса SV40 g co)l

LacZ ■ ген бета-галактозидазы Агпр - ген устойчивости к ампицилину

EcoRI, Hmaill, BamHl Sail - участии узнавания одноиыениь« рестриктаз

Рис.11. Этапы создания векторной конструкции pAT-CAP*-SV-Gal. SV40 -промотор раннего гена вируса SV40. Сор - LTR мобильного элемента Copia D.melanogaster. CAP* - искусственно синтезированная последовательность БАК-домена Ecoli. Neo - ген устойчивости к неомицину. Amp - ген устойчивости к ампицилину. LacZ -ген ß-галактозидазы лактозного оперона Е. coli. EcoR I, Hind 111, BamH I, Sal I - участки узнавания одноименных рестриктаз.

В ооциты вьюна на стадии первого деления дробления были проинъецированы векторные конструкции pSV-ß-Gal (положительный контроль), pAT-CAP*-SV-Gal и pAT-SV-Gal. Трансформированных

зародышей фиксировали и окрашивали через 24 часа после микроинъекций. Полученные результаты представлены на рис. 12.

На рисунке видно, что зародыши вьюна, трансформированные вектором pAT-CAP*-SV-Gal значительно сильнее окрашены, чем зародыши, трансформированные вектором pAT-SV-Gal. Отметим, что единственное отличие между pAT-CAP*-SV-Gal и pAT-SV-Gal - это искусственно синтезированный БАК-домен Е. coli, локализованный перед промотором SV40. На основе полученных результатов можно с уверенностью сказать, что на активность промотора SV40 в яйцеклетках вьюна позитивно влияет БАК-домен Е. coli.

Следует отметить, что трансгенные зародыши, несущие в своем составе ДНК вектора pSV-ß-Gal, не отличались по интенсивности окраски от зародышей, инъецированных вектором pAT-CAP*-SV-Gal. Обе эти плазмиды, кроме маркерного гена Lac Z под контролем промотора SV40, имеют в своем составе последовательность БАК-домена.

Рис.12. Выявление активности ß-гапактозидазы в трансгенных зародышах вьюна (24 ч развития), содержащих маркерный ген Lac Z под контролем регуляторных элементов: SVCAP* - промотор раннего гена вируса SV40 в сочетании с искусственно созданной последовательностью БАК-домена Е. coli (вектор pAT-CAP*-SV-Gal); SVCap -сочетание регуляторных элементов /ас оперона Е. coli и промотора ранних генов вируса SV40 (вектор pSV-ß-Gal); SV - промотор раннего гена вируса SV40 без БАК-домена (вектор pAT-SV-Gal); К - контрольный зародыш.

Различие в активности гена Lac Z под контролем промотора SV40, находящегося в составе плазмид, содержащих или не содержащих возле промотора SV40 последовательность БАК-домена Е. coli, является прямым доказательством позитивного влияния БАК-домена лактозного оперона Е. coli на работу промотора раннего гена вируса SV40.

Выводы.

1. Создано несколько серий рекомбинантных векторных молекул ДНК, содержащих маркерные гены Neo и Lac Z под контролем сильных промоторов, клонированных из ДНК организмов, принадлежащих эволюционно отдаленным таксонам: промотор ß-1-тубулинового гена инфузории Tetrahymena pyriformis, промотор гена 35S вируса мозаики цветной капусты, LTR мобильного элемента Copia плодовой мушки Drosophila melanogaster, промотор раннего гена обезьяньего вируса SV40.

2. Промоторы, в норме функционирующие в клетках организмов различных таксонов эукариот (млекопитающие, насекомые, растения и простейшие) активны в течение раннего развития вьюна (Misgumus fossilis). Наиболее активным из исследованных промоторов является промотор гена ß-1-тубулина Т. pyriformis.

3. Показано, что определенные последовательности бактериальной ДНК, часто представленные в плазмидах, используемых для конструирования рекомбинантных векторных молекул, могут значительно изменять характер активности промоторов эукариотических генов. Впервые описано "активизирующее" действие бактериальных последовательностей.

4. Впервые показано, что БАК-домен лактозного оперона Е. coli может позитивно влиять на функционирование эукариотического промотора. В составе ряда эукариотических генов, нуклеотидные последовательности которых представлены в EMBL - банке генов, выявлены домены, имеющие высокую степень сходства с БАК - доменом лактозного оперона Е. coli. Предполагается, что БАК-домен лактозного

оперона Е. coli является регуляторным элементом транскрипции не только прокариотических, но и эукариотических организмов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Mukha D.V., Andreeva L.E., llyichev A.V. Expression directed by heterologous promoters during early embryonic development of loach (Misgurnus fossilis L). Тезисы представлены на евроазиатском симпозиуме по биотехнологии и опубликованы в журнале Karadeniz Journal of Medical Sciences. 1995. V.8. № 4. P.228.

2. Д.В. Муха, Jl.E. Андреева, А.В. Ильичев. Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития вьюна (Misgumus fossilis L). Генетика. 1996. Т.32. №10. С.1387-1391.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития вьюна (Misgurnus fossilis L. )"

Один из подходов в исследовании механизмов регуляции экспрессии генов эукариот основан на анализе данных, полученных при экспериментальном введении в эукариотические клетки генов или других сегментов ДНК (Уотсон Дж. и др. 1986).

В качестве реципиентов в работах подобного плана используют многие виды эукариотических организмов: дрожжи, насекомые, растения, млекопитающие и т.д. Не так давно, немногим более десяти лет назад, в научных исследованиях началось активное использование трансгенных рыб (Maclean N. et al. 1985) . К настоящему моменту количество видов рыб, применяемых в научных исследованиях с использованием трансгеноза, значительно увеличилось. Кроме коммерчески ориентированных видов рыб в научных исследованиях используются и малоценные в пищевом отношении рыбы (Maclean N. 1998). Анализ функционирования трансгенов может нести не только строго научный, но и коммерческий интерес. Например, генная конструкция, содержащая промотор вируса RSV и ген гормона роста, выделенного из форели, интенсивно экспрессировалась в тканях трансгенных карпов. Трансгенные особи имели больший размер, по сравнению с контрольными рыбами (Zhang P. et al. 1990). Используя в качестве трансформирующего агента ген, кодирующий антифризный белок, можно повысить толерантность трансгенных особей к пониженной температуре. Например, у трансгенной золотой рыбки, несущей антифризный белок камбалы, уменьшалась смертность от пониженной температуры (Wang R. et al. 1995).

К настоящему времени накоплен достаточно большой материал относительно эффективности работы гетерологичных промоторов в клетках трансгенных животных и растений. Описан характер экспрессии гетерологичных промоторов, как в культуре клеток, так и в процессе эмбрионального развития. Однако, в большинстве экспериментов использовали промоторы генов, клонированные из близкородственных организмов; оставался открытым вопрос об эффективности функционирования промоторов генов, клонированных из организмов, сильно эволюционно отдаленных. Таким образом, являлось актуальным проведение данного анализа.

Кроме того, ранее было показано, что определенные бактериальные последовательности ДНК, достаточно часто представленные в плазмидах, которые используются для конструирования рекомбинантных векторных молекул, могут негативно влиять на работу эукариотических промоторов (Тоу/упев Т.М. а1. 1986). В рамках данного исследования была предпринята попытка более глубокого изучения влияния бактериальных последовательностей ДНК на промоторы эукариотических генов.

Следует отметить, что исследование механизмов регуляции экспрессии генов, их регуляторных элементов не только расширит наше представление о структуре функциональной активности генов, но и позволит использовать полученные знания в биотехнологии, являющейся на сегодняшний день одной из самых перспективных отраслей промышленности.

В соответствии со сказанным выше были сформулированы следующие основные задачи данного исследования.

1. Создание векторных молекул, которые могут быть использованы для трансгеноза различных видов организмов и проведения сравнительного анализа эффективности экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов. С этой целью представлялось актуальным конструирование нескольких серий рекомбинантных векторных молекул ДНК, содержащих маркерные гены Neo и Lac Z под контролем сильных промоторов, клонированных из ДНК организмов, принадлежащих эволюционно отдаленным таксонам.

2. Анализ эффективности экспрессии созданных векторных конструкций в процессе раннего развития вьюна (Misgurnus fossilis L).

3. Изучение влияние бактериальных последовательностей ДНК, в частности, БАК-домена лактозного оперона Е. coli (последовательность ДНК, ответственная за взаимодействие с белком-активатором катаболизма) на функционирование эукариотических промоторов.

Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Ильичев, Александр Владимирович

Выводы.

1. Создано несколько серий рекомбинантных векторных молекул ДНК, содержащих маркерные гены Neo и Lac Z под контролем сильных промоторов, клонированных из ДНК организмов, принадлежащих эволюционно отдаленным таксонам: промотор ß-1-тубулинового гена инфузории Tetrahymena pyríformis, промотор гена 35S вируса мозаики цветной капусты, LTR мобильного элемента Copia плодовой мушки Drosophila melanogaster, промотор раннего гена обезьяньего вируса SV40.

2. Промоторы, в норме функционирующие в клетках организмов различных таксонов эукариот (млекопитающие, насекомые, растения и простейшие) активны в течении раннего развития вьюна (Misgurnus fossilis). Наиболее активным из исследованных промоторов является промотор гена ß-1 -тубулина Т. pyríformis.

3. Показано, что определенные последовательности бактериальной ДНК, часто представленные в плазмидах, используемых для конструирования рекомбинантных векторных молекул, могут значительно изменять характер активности промоторов эукариотических генов. Впервые описано "активизирующее" действие бактериальных последовательностей.

4. Впервые показано, что БАК-домен лактозного оперона Е. coli может позитивно влиять на функционирование эукариотического промотора. В составе ряда эукариотических генов, нукпеотидные последовательности которых представлены в EMBL - банке генов, выявлены домены, имеющие высокую степень сходства с БАК - доменом лактозного оперона Е. coli. Предполагается, что БАК-домен лактозного оперона Е. coli является регуляторным элементом транскрипции не только прокариотических, но и эукариотических организмов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ильичев, Александр Владимирович, Москва

1. Андреева Л.Е., Дворянчиков Г.А. (1995) Анализ экспрессии RSV-lacZ гена в трансгенных эмбрионах вьюна Misgurnus fossilis L. при различных вариантах инъекций. Генетика. Т.31 С.759-766.

2. Козлов А.П., Решетников В.Л., Нейфах A.A. (1988) Судьба плазмидной ДНК в развивающихся эмбрионах вьюна, Misgurnus fossilis. Молек.Биол. Т.22 С. 1614-1622.

3. Колесников A.A., Алимов A.A., Барминцев В.А., Бенюмов А.О., Зеленина И.А., Краснов A.M., Джабур Р., Зеленин A.B. (1990) Высокоскоростная механическая инъекция чужеродной ДНК в яйцеклетки рыбы.Генетика. Т.26 С.2122-2126.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) "Молекулярное клонирование". Москва: "Мир".

5. Спирин A.C., Агол В.И., Богданов A.A., Гвоздев В.А., Грагеров А.И., Колчинский A.M., Мирзабеков А.Д., Никифоров В.Г. (1990) "Молекулярная биология: структура и биосинтез нуклеиновых кислот." М.: Высшая школа.

6. Стент Г.С., Кэлиндар Р. (1981) "Молекулярная генетика." М.:Мир.

7. Франк-Каменецкий М.Д. и др. (1990) "Компьютерный анализ генетических текстов." М.: Наука.

8. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. (1986) "Рекомбинантные ДНК" М.:1. Мир.

9. Andres.A.C., Muellener.D.B. (1984) Persistence methylation andexpression of vitellogenin gene derivatives after injection intofertilized eggs of Xenopus laevis. Nuc.Acid.Res. V.12. P.2283-2302.

10. Ang D., Liberek K., Skowyra D., Zylicz M., Georgopoulos C. (1991) Biological role and regulation of the universally conserved heat shock proteins. J.Biol.Chem. V.266 P.24233-24236.

11. Biason A., Manter F., Scaroni C. et al. (1991) Deletion within the CYP17 gene together with insertion of foreign DNA is the cause of combined complete 17a-Hydroxylas/17, 20-lyase deficiency in an italian patient. Mol.Endocrinology. V.5 P.2037-2045.

12. Brinster R.L., Chen H.Y., Trumbauer M.E., Yagle M.K., Palmiter R.D. (1985) Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc.Natl.Acad.Sci. P.4438-4442.

13. Bukau Bernd. (1993) Regulation of the Escherichia coli heat-shock response. Mol.Microbiology. V.9 P.671-680.

14. Chaudhuri M.M., Tonin P.N., Srinivasan P.K. (1992) cDNA sequens of the small subunit of the hamster ribonucleotide reductase. Biochim.Biophys.Acta. V1 P.117-121.

15. Chong S.S.C., Vielkind J.R. (1989) Expression and fate of CAT reporter gene microinjected into fertilized medaka (Orizias latipes) eggs in the form of plasmid DNA, recombinant phage particles and its DNA. Theor.appl.Genet. V.78 P.369-380.

16. Chourrout D., Guyomard R., Houdebine L.M. (1986) High efficiency gene transfer in rainbow trout (Salmo gaurdneri Rich) by microinjection into egg cytoplasm. Aquaculture. V5. P.369-380.

17. Courey A.J. and Tjian R. (1998) Analysis of Sp1 in vivo reveals multiple transcriptional domains, including a novel glutamine-rich activation motif. Cell V.55 P.887-898.

18. Davies P.L., Hew C.L., Shears M.A., Fletcher G.L. (1989) Antifreeze protein expression in transgenic salmon. J.cell.Biochem. Suppl.13B P.169.

19. Depicker A. and Montagu M.V. (1997) Post-transcriptional gene silencing in plants. Current Opinion in Cell Biology. V.9 P.373-382.

20. Dreano M., Marq J.B., Bromley P. (1988) Antibody formation against heat-induced gene products expressed in animals. Biotechnology. V6. P. 1340-1342.

21. Dunham R.A., Eash J., Askins J., Townes J.M. (1987) Transfer of metallothionein human growth hormone fusion gene into channel catfish. Trans.Am.Fish.Soc. V.116 P.87-91.

22. Etkin L.D., Pearman B., Roberts M., Bektesh S.L. (1984) Replication, integration and expression of exogenous DNA injected into fertilized eggs of Xenopus laevis. Differentiation. V.36 P. 194-202.

23. Etkin L.D., Pearman B. (1987) Distribution, expression and germ line transmission of exogenous DNA sequences following microinjection into Xenopus laevis eggs. Development. V.99 P. 15-23.

24. Evans T., Reitman M., Felsenfeld G. (1988) An erythrocyte-specific DNA-binding factor recognizes a regulatory sequence common to all chicken globin genes. Proc.Natl.Acad.Sci. USA V.85 P.5976.

25. Falkner F.G., Zachau H.G. (1984) Correct transcription of an immunoglobulin kappa gene requires an upstream fragment containing conserved sequence elements. Nature V.310 P.71.

26. Fletcher G.L., Shears M.A., King M.J., Davies P.L., Hew C.L. (1988) Evidence for antifreeze protein gene transfer in Atlantic salmon (Salmo salar) Can.J.Fish.Aquat.Sci. V.45 P.352-357.

27. Fracasso C., Patarnello T. (1998) Evolution of the dystrophin muscular promoter and 5' flanking region in primates. J.MoI.Evol. V.46 P. 168179.

28. Friedenreich H., Schatl M. (1990) Transient expression directed by homologous and heterologous promoter and enhancer sequences in fish cells. Nucl.Acids Res. V.18 P.3299-3305.

29. Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. (1986) Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nature. V.319 P.791-793.

30. Gedamu L., Olsson D., Zafarullah M. (1989) Control of metallothionein gene expression in the rainbow trout. J.cell.Biochem. Suppl.13B P. 167.

31. Gray W. (1989) Origin and evolution of mitochondrial DNA. Annu.Rev.Cell.Biol. V.5 P.25-50.

32. Guyomard R., Chourrout D., Leroux C., Houdebine L.M., Pourrain F. (1989) Integration and germ line transmission ot foreigh genes microinjected into fertilized trout eggs. Biochimie. V.71 P.857-883.

33. Hayat M.,Joyce C.P.,Townes T.M.,Chen T.T.,Powers D.A.,Dunham R.A. (1987) Survival and integration rate of channel catfish and common carps embryos microinjected with DNA at various development stages. Aquaculture V.51 P. 12-20.

34. He Y., Chen H., Quon M., Reitman M. (1995) The mouse obose gene. Genomic organization, promoter activity, and activation by CCAAT/enhancer-binding protein a. J.Biol.Chem. V.270 P.28887-28891.

35. Hirano F., Tanaka H., Hirano Y., Hiramoto M., Handa H., Makino I., Scheidereit C. (1998) Functional interference of Sp1 and NF-kB through the same DNA binding site. Molec. And Cell.Biology V.18 P.1266-1274.

36. Indig E.E.,Moav B.A. (1988) A procaryotic gene is expressed in fish cells and perists in tilapia embryos and adults following micriinjection. Reproduction in Fish and Applied Aspects of Endocrinology and Genetics. INRA Press, Paris. P.221-225.

37. Inoue K., Ozato K., Kondoh H., Iwamatsu T., Wakamatsu Y., Fujita T., Okada T.S. (1989) Stage-dependent expression of the chicken 8-crystallin gene in transgenic fish embryo. Cell.Diff.Dev. V.27 P.57-68

38. Inoue K., Yamashita S., Hata J.I., Kabeno S., Asada S., Nagahisa E., Fujita T. (1990) Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell.Diff.Dev. V.29 P.123-128.

39. Ivies Z., Izsvak Z., Hackett P. (1993) Enhanced incorporation of transgenic DNA into zebrafish chromosomes by a retroviral integration protein.

40. Iyengar A., Maclean N. (1995) Transgene concatamerisation and expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykkis). Mol.Mar.Biol.Biotechnol. V.4 P.248-254.

41. Joyce C.P., Townes T.M., Chen T.T. .Powers D.A.,Dunham R.A. (1987) Survival and integration rate of channel catfish and common carps embryos micro injected with DNA at various development stages. Aquaculture. V.51 P.12-20.

42. Kadonaga J.T., Carner K.R., Masiarz F.R., Tjian R. (1987) Isolation of cDNA encoding transcription factor Sp1 and functional analysis of the DNA binding domain. Cell. V.51 P. 1079-1090.

43. Klemsz M.J., McKercher S.R., Celada A, Van Beveren C., Maki R.A. (1990) The macrophage and B cell-specific transcription factor PU1 is related to the ets oncogene. Cell V.61 P.113.

44. Kroll K.L., Amaya E. (1996) Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signalling requirements during gastrulation. Development. V.122 P.3173-3183

45. Liand M.-F., Brinkmann H., Cerff R. (1992) The p-tubulin gene family of pea: Primary structures, genomic organization and intron-dependent evolution of genes. Plant Mol.Biol. V. 18 P.639-651.

46. Lindquester G.J., Flach J.E., Fleenor D.E., Hickman K.H., Devlin R.B. (1989 ) Avian tropomyosin gene expression. Nucl. Acids Res. V.5 P.2099-2118.

47. Logue J., Tiku P., Cossins A.R. (1995) Heat injury and resistance adaptation in fish. J.Therm.Biol. V.20 P. 191-197.

48. Maclean N. (1998) Regulation and exploitation of transgenes in fish. Mut.Research V.399 P.255-266.

49. Maclean N., Penman D., Zhu Z. (1987) Introduction of novel genes into fish. Biotechnology V.5 P.257-281

50. Maclean N., Talwar S. (1985) Injection of cloned genes into rainbow trout eggs. J.EmbryoI.Exp.Morph. V.82 Suppl.136.

51. Mason M., Yufang H., Chen H., Quon M., Reitman M. (1998) Regulation of leptin promoter function by Sp1, C/EBP, and a novel factor. Endocrinology. V.139 P. 1013-1022.

52. Marini N.J., Etkin L.D., Benbow B.M. (1988) Persistence and replication of plasmid DNA microinjected into early embryos of Xenopus laevis. Devi Biol. V.127 P.421-434.

53. Matzke M.A. and Matzke A.J.M. (1995) Homology-dependent gene silencing in transgenic plants: what does it really tell us? Tends in Genetics V.1 P. 1-3.

54. McEvoy T., Stack M., Keane B., Barry T., Sreenan J., Gannon F. (1988) The expression of foreign gene in salmon embryo. Aquaculture. V.68 P.27-37.

55. Miyata A., Yokoyama C., Ihara H., Bandoh S., Takeda 0., Takahashi E., TanabeT. Characterization

56. Morimoto R.I., Sarge K.D., Abravaya K. (1992) Transcriptional regulation of Heat Shock genes. J.Biol.Chem. V.267 P.21987-21990.

57. Muller F., Ivies Z., Erdelyi F., Papp T., Varadi L., Horvath L., Maclean N., Orban L. (1992) Introducing foreign genes into fish eggs with electrorated sperm as a carrier. Mol.Mar.Biol.Biotechnol. V.1 P.276-281.

58. Naito M., Ishiguro H., Fujisawa T., Kurosawa Y. ( 1993 ) Presence of eight distinct homeobox-containing genes in enidarians. FEBS V.3 P.271-274.

59. Ozato K., Kondoh H., Inohara H., Iwamatsu T., Wakamatsu Y., Okada T.S. (1986) Production of transgenic fish: introduction and expression of chicken Delta-cristallin gene in medaka embryos. Cell.Diff. V. P. 19237-244.

60. Pasleau F., Leung F., Kopchick J.J. (1987) A comparison of bovine growth hormon expression directed by bHG genomic or intronless DNA in transiently transfected eucaryotic cells. Gene. V.57 P.47-52.

61. Peek A.S., Wheeler P.A., Ostberg C.O., Thorgaard G.H. (1997) A minichromosome carrying a pigmentation gene and brook trout DNA sequences in transgenic rainbow trout. Genome V.40 P.594-599.

62. Penman D.J., Beechihg A.J., Penn S., Maclean N. (1990) Factors affecting survival and integration following microinjection of novel DNA in rainbow trout eggs. Aquaculture. V.85 P.35-50.

63. Perkins N.D., Agranoff A.B., Pascal E., Nabel G.J. (1994) An interaction between the DNA-binding domeins of RelAp65 and Sp1 mediates human immunodeficiency virus gene activation. Mol.Cell.Biol. V.14 P.6570-6583.

64. Perkins N.D., Edwards N.L., Duckett C.S., Agranoff A.B., Schmid R.M., Nabel G.J. (1993) A cooperative interaction between NFkB and Sp1 is required for HIV-1 enhancer activation. EMBO J. V.12 P.3551-3558.

65. Pugh B.F. and Tjian R. (1990) Mechanism of transcriptional activation by Sp1: evidence for coactivators. Cell V.61 P.1187.

66. Qureshi S.A., Baumann P., Rowlands T., Khoo B., Jackson S.P. (1995A) Cloning and functional analysis of the TATA-binding protein from Sulfolobus shibatae. Nucleic Acids Res. V.23 P. 1775-1781.

67. Qureshi S.A.,Khoo B., Baumann P., Jackson S.P. (1995B) Molecular cloning of the transcription factor TFIIB homolog from Sulfolobus shibatae. Proc.Natl.Acad.Sei.USA V.92 P.6077-6081.

68. Reihard E., Nedivi E., Wegner et al. (1994) Natural selective activation and temporal regulation of a mammalian GAP-43 promoter in zebrafish. Development. V.120 P. 1767-1775.

69. Rio D.C., Rubin C.M. (1985) Transformation of cultured Drosophila melanogaster cells with a dominant selectable marker. Mol.Cell.Biol. V.5 P. 1833-1838.

70. Rokkones E., Allestrom P., Skjirvold D.H., Gautvik K.M. (1989) Microinjection and expression of a mouse metallothionein human growth hormone gene in fertilized salmon eggs. J.Comp.Physio. V.158 P.751-758.

71. Saffer J.D., Jackson S.P., Annarella M.B. (1991) Developmental expression of Sp1 in the mouse. Mol.Cell.Biol. V.11 P.2189-2199.

72. Shears M.A., Fletcher G.L., Hew C.L., Ganthier S., Davies P.L. (1991) Transfer, expression and stable inheritance of antifreeze protein genes in Atlantic salmon (Salmo salar). Mol.Mar.Biol.Biotechnol. V.1 P.58-63.

73. Shimizu T., Iwasato T. Yamagishi H. (1991) Deletions of immunoglobulin C kappa region characterized by the circular excision products in mouse splenocytes. J.Exp.Med. V.5 P.1065-1072.

74. Slieker L.J., Sloop K.W., Surface P.L., Kriauciunas A., LaQuier F., Manetta J., Bue-Valleskey J., Stephens T.W. (1996) Regulation of expression of ob mRNA and protein by glucocorticoids and cAMP. J.Biol.Chem. V.271 P.5301-5304.

75. Stuart G.W., McMurray J.V., Westerfield M. (1988) Replication, integretion and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryous. Development. V.103 P.403-412.

76. Stuart G.W., McMurray J.V., Westerfield M. (1989) Germ-line transformation of the zebrafish. Gene Transfer and Gene Therapy., New York. P. 19-28

77. Stuart G.W., Vielkind J.R., McMurray J.V., Westerfield M. (1990) Stable lines of tansgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. V.109 P.577-584.

78. Szelei J., Varadi L., Muller F., Erdelyi F., Orban L., Horvath L., Duda E. (1994) Liposome-mediated gene transfer in fish enbryos. Transgenic Res. V.3 P. 116-119.

79. Townes T.M., Lingrel J.B., Chen H.Y. et al. (1986) Erythroidspecific expression of human p-globin genes in transgenic mice. EMBO. J. V.4 P. 1715-1723.

80. Tranel P.J., Froehlich J., Goyal A., Keegstra K. ( 1995 ) A component of the chloroplastic protein import apparatus in targeted to the enter envelope membrane via a novel pathway. EMBO J. V.14 P.2436-2446.

81. Wallich R., Brenner C., Brand Y., Roux M., Reister M., Meuer S. (1998) Gene structere, promoter characterization, and basis for alternative mRNA splicing of the human CD58 gene. J. Immunology V.160 P.2862-2871.

82. Wang R., Zhang P., Gong Z., Hew C.L. (1995) Expression on the antifreeze protein gene in transgenic goldfish (Carassius auratus) and its implication in cold adaptation. Mol.Mar.Biol.Biotechnol. V.4 P.20-26.

83. Williams T., Tjian R. (1991) Analysis of the DNA-binding and activation properties of the human transcription factor AP-2. Genes Dev. V.5 P.670.

84. Yoon S.J., Liu Z., Kapuscinski A.R., Hallerman E.M., Faras A.J., Gross M., Schneider J.F., Guise K.S. (1990) Transfer of the gene for neomycin resistance into goldfish. Aquaculture. V.85 P.21-23.

85. Yoshisaki G., Oshiro T., Takashima F. (1989) Prevention of hardening of chorion and dechorionation for microinjection into fish eggs. Nippon Suisan Gakkaishi V.55 P.369.

86. Yurochko A.D., Kowalik T.F., Huong S., Huang E. (1995) Human cytomegalovirus upregulats NF-kB activity by transactivating the NF-kB p105/p50 and p65 promoters. J.Virol. V.69 P.5391-5400.

87. Zhang P., Hayat M., Chen T.T., Powers D A. (1990) Gene transfer expression and inheritance of pRSV-rainbow trout-GH cDNA in the common carp. Molec.Reorod.Dev. V.25 P.3-13.

88. Zhao J.-Q., Hoare S., McFarlane R., Muir S., Parkinson K., Black D., Keith N. (1998) Cloning and characterization of human and mouse telomerase RNA gene promoter sequences. Oncogene. V.16 P. 1345-1350.