Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ дисульфидсодержащих фрагментов альфа-субьединицы Na+, K+-АТФазы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ дисульфидсодержащих фрагментов альфа-субьединицы Na+, K+-АТФазы"

- п С

• 9 2

Российская Академия наук Институт биоорганической химии имММШемяквва РАН

Лй ^упАтУ рул&шси

ГАВРИПЬЕЁА ЕЛЕНА ЕГОРОВНА

Анализ дисульфид содержащих фрагментов Л-субъеднницы И^Д^АТФазы

03.00.04- Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-1992

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им .М.М.Шемякина РАН

Научный руководитель - доктор химических наук Н.Н.Модянов

Официальные оппоненты: доктор химических наук Ц.А.Егоров

кандидат химических наук В.А.Гринкевич

Ведущая организация : Научно - производственное объединение " Биотехнология ".*

С о

Защита состоится "¿¿¿Сй*? 1992 года в^'часов на заседании Специализированного совета Л 002.35.01 при Институте Оиоорганической химии им.Ы.Ы.Шемякина РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул.Миклухо-Маклая 16/10

С диссетацией мокно ознакомиться в библиотеке Института Оиоорганической химии им.М.М.Шемякина РАН

Автореферат разослан " года

Учений секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

В.А.Несмеянов

и

К^нТЗЦИЙ I

~ "Актуальность ироблегд. t<;Г,и1'- ATC< -зза представляет собсй ол1го:гзреыя ме!.йрсшг-31 белок, состояе^й из двух стюа субъедяпиц: кетздктпческой •¿-субьедэт.шзг ( Иол.м. 112 ООО к»а ) и глккозилн-ровсаной 5 -субъзд:-:т:хда ( Мол.и. бэлкогой часта - 35,5 кДа .углеводной - 7 КДч ). .

Устснозлоняэ а^сгаогглс/.откой по^гэдоБатальетста субъедтяпц ь*а!", н^-АТФ-агз значительно повысило дггерсо к структурно-флпсцсонапкшм исследованиям этого ва:нб£2=го , мембранного фзркзкгз. Ра+»S^-AT^ssa прэдстввляе? собсй гесьма данаочЕуа колбку.гяряочйологнчеасуа систему, использу-одуз энергию ггдро-.жза АК> для транслокащп покоз Иат л к+ чэрзз ' плазматическую мзкбраку, при этом циклически изменяется сродство Фермента к ионам и АТФ. 3 настоящее время достоверно установлено, что существуют две форгет фзркэнта Bj к Еу. Шказззэ такие, что вот

фор«г5ы ОТЛЯЧВЗВТСЯ ПО сесэй ГВДООфОбНОСТН И .ТУВСТЕКТеЛЬНОСТИ К ингибптсрЕМ. Конкурентное иш^гбярущ-зе дейсгая-э &Есз.1ирупцкх зн-рвагептов реализуется в Ка+- форме фэртэнта. Полноо ипгЕбкро-ваякз акшзяостп фермента достигается пра свяадааши 4-5 SE-груш. Гполоеыо соединения и А'И> сказывает зггзизов'. дэйстпео в случав На?" - Формы фврмзята. С подовые десульфадсодерзаднх аналогов АТ5 были получены доказательства ¡шлзчяя SE-груш в АЗФ-связикпщзм центре об -субъедизици.

■ ' Суннцяснальная роль дасульфидных связей з КзГ .н^-АТФ-азе, пока не установило. Тем не менее, разрыв их. приводит к инактивации фергента. Таким образом, определенна чзсла дисуль^ядных связей и установление их нестополоташтл в полгизптдцнок цепи J- -субъедпншщ является проблемой актуальной для понимания структзрно-чйгзквдсшальноа организации Па+, К^-АТФ -азы.

Поль работы. Настоящая работа является частьэ проводимых в Институте бпоорганической хикии структурно-функциональнкх НССЛЗДОВ2НИЙ слотом зктивпого транспорта ИОВОВ, з частности, Ка+,к+-АТФ-ази. Главной цель» настоящей работа являлось установления числа дисуль^эдных связей в На+,х+-АТФ-азе и определения положения ах в полипептидной цепи об -субъединицы. В задачи исследования входило разработка методологического подхода к анализу сульфгидрильншс грушт и дисульфдаых связей в

На+,к+-АТФ-азе ж пептидах, условий количественного алкшшрования замаскированных БН-групп, методов выделения и анализа цистивсодэржяттздх пептидов.

Научная новизва и практическая ценность работа. В результате комплексного исследования с применением различных методических подходов установлено наличие пяти дасульфидных связей в На+,к+-АТФ-азе ( два дасульфидных мостика в об -субъединице, три в р -суЛьединицв ) и показано, что большинство из 20 остатков цистеина относятся к разряду замаскированных.

Определено, что полное алкилирование свободных БН-грушг мотет быть достигнуто только после предварительного гидролиза меыбранно-связаиюй Ыа .¿"-АТФ-азы. Установлено, ^ что дисульфидные моста в -субъединице расположены в гидрофильном цитоплазматичеош домене фермента.

Выявлена инертность замаскированных БН-грутш к тиол-дасуль-фидному обмену в процессе выделения, что подтверждается идентичностью триптичесних цистинсодержицих фрагментов гидролизата дативной На+ ,к+-АМ-азы и гидролизата, подвергшегося предварительному алкилирсвяниЕ.

Определена ашнокислотвая последовательность двух цисишсо-держащих пептидов до и после восстановления дасульфидных связей, с использование различных методов химической модификации БН-групп, в том числе непосредственно в ходе анализа' на секзена-торе.

Установлено ишкжениз двух дасулы^цщых связей в полипептидной цепи -субьедпницы На+ ,К+-А1Ф-азы.

Полученная информация о локализации дасульфвдвнх мостиков вносит существенные • изменения в молекулярную организации X -субъеданицы и ставят вопрос о выяснении функциональной значимости этих внутримолекулярных ковалентных связей.

Разработанные в процессе исследований методические подхода могут быть использованы при изучении пространственной организации мембранных белков.

Объем работы. Диссертационная работа галогена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов п списка цитируемой литературы.

СОДЕРКАНИЕ РАБОТЫ

I. Дифференциация замаскированных БН-групп я Б-Б-групп в иа^.к1"- АТФ-азе.

Изучение дисульфадных мостиков в мембранных белках - процесс крайне сложный, поскольку наличие замаскированных 5Н -груш ставит вопрос дифференциации истинных БЯ-грушт, участвующих в образовании дисульфидвых связей, от замаскированных- Именно этим можно объяснить противоречивость данных о количества дисульфвдных мостиков и свободных БН-груш во^-субьодишще. ¡Рачительное число замаскированных БН-групп в На!" .н!" -АТФ-азе дает основание предполагать, что они участвуют во внутримолекулярных гидрофобных взаимодействиях , оцределящих структурную организации полипептидной цепи. Эффект демаскирования их при воздействии реагентов , ослабляющих гидрофобные связи; годтвервдает правомерность такой точки зрения В последние годы были получены доказательства существования ферментативной системы ацшшрования остатков цистеива зирныыи кислотами, что существенно модифицирует гидрсфобность цистеин-содер^ащих участков полипептидной цепи , ведет к их заякориваншз в мембрана. Возможность существования таких актированных остатков цнстеина в На" -АТФ-азэ довольно вешка, что ставит вопрос их дифференциации от истинных остатков цистеива, участвующих в образовании Б-Б-связи.

Разработка способа выявления всех замаскированных ЗН-групп в На+,К+-АТФ-азе приобретает первостепенное значение, поскольку для локализации дисульфидных мостиков на всех этапах получения дисульфид содержащих фракций необходим. качественный и количественный контроль БН-груш.

II. Выбор способа детекции замаскированных аьгрупп и дясулкТйпних связей в па+.к+-АТФ-азе

Определение БН-груш и дисульфидах связей в белках основано на применении трех типов реакций : ыеркаптидирование нитратом серебра или ртутьорганическимк соединениями , реакции тиол-дисульфидвого обмена с использованием дисульфидсодержащих

реагентов ( реактив Эллмана), рэакций алкплирозания, например, кодухсусной кислотой , В-этилмапоимвдом , 4нвЕпилдар-дяшом к др. Однако все это позволяет определять ¿езь наиболее доступные { реакшювкосшсобяпе ) БН-грутш, оставляя ггрт это!.: нетронутыми замаскированные. Последние могут быть выявлена при использовании высоких концентрация денатурируксскх агентов и детергентов , а иногда только после глубокого гидролиза белка. Однако в этих ус-ловлях присутствие подобных рэагенхов п, са?:,ое главное, низкая растворимость мэмбраяшх бэлкоЕ; пептидов резко ограничивают боз-юаность использования спехтрофотомотрзческзг методов дехакцш. Цри этом становится очэвздаым прэгэдцзство рэахцаи меркшггвдк- ' розашл , апредахябкой ампаромегрочесаищ тнтрогзнизк КЕтратон серебра. Этот способ , ьюдафшщроватзй в езеой лаборатории для мембранных балков, с целью одновременного определения всех свободных sn-труш и дксулъфздяых связей в одаой и той ьв проба, позволил резко сократить расход белкового е пептидного материала прк ойрэделеЕпи л значЕтельно повысить точность Езизрения. Buôop был обусловлен таая к те:.; , что этот метод &*лкро:<:етржескаго титрования сзотеоюхлнм сервброй саеца^гчен, сщсокочувстаигзлаз ■и шквт быть использован для г-утяых z окрсээнзих растворов в присутствии ¡шсокзх концентраций дэнатурируюдш. агентоз л детергентов. Крот.® того, кош серебра югу? проникать в стерически ыалодоступЕнэ для других. алгааггрукда: реагентов участку; и избирательно связываться со свободными Sïi-ipyinisia, с способность ионов серебра расцеплять алкилтпо&^цтлгм свйзп позьолязт ваяЕить в число заыаскщюзанннх такгэ остатки цзстекнз, ашизровашЕХ Езрйкмя кислотами. Такт.) образом , разработанной способ позь^йы пэ только дифференцировать в На+ ,£+-АТ£-взе вез свободный SH-грутш и установить дасульфВДЕае связи, но и судить об пх реактаввеД способкоста.

В настоядеС работа Сил исдользоезе гокогепний препарат На+,к+ -АК—азы почек сеяньн с удельной актквнэстьй ~ 1500 нк моль Р^ fe кг белка), Korapii: содержал 6,5S легкодоступных БЕ-групп, 13,4 замаскированных и пять дасульфщзшх связей ( ?.:оль / моль белка ), при этом соотнопешз легкодоступных SE- групп к замаскированны:.: составляло. 0,43. Баланс числа SH-групп фер.?епта соответствовал

теоретически опщаемоиу , поскольку Ка+,К+-Айьаза , согласно сиипокислотнсй последовательности, содержит 30 остатков цистезша ~лг которых 23 приходятся на JL -субьедншщу.а 7 на р -субьздшшцу.

III. Анализ полуццотаксодзрзБших шптттдоз алкздяровенного

гидролиз ата на4". к^-АРЭ-азы.

Существует ойцзпрппятая схота определения дисудьфадннх сзязей, которая вгслэтаот слздушдаэ эташ : частичный гидролиз бежа з условиях , псклняащиг пэрзгруппировку днсуяь&здных связей ; фракикоЕзрованкв солучонпоа смеси с цальп выделения цистгсодэргащих пэптвдоз ; расщепление s-s -связи и выделение цпстеиваляептэдоа. Учтивая особенности каггбргппых белков н, з частности, ыа+,£|"-АТФ-азы бил прнявнэн ксстлэксшй многоэтапный анализ дасульфщннх связей ( схема I ). Для предотвращения тиол-днсуль^щдаого обмена. который Еогнсгап в процессе, выделения дасульфздсодерващих пептидов, на нервен этшзв исследования необходимо проЕасти алкЕлгровЁНке всех свободных sh-групп. Однако з налей прздцдуцей работе было показано.что полнээ апгашфовазпо сульфгпдрнльных груш з натявном препарате Kaf" -АТФ-азы невознояно из-за их зг&гасхировааности. 3 связи с этан доя повышения доступности sh-rpynn фэршнт подвергая! трипткческому гидролизу.

1. Адкидярованне иштиче ского гидролаззта 4-вишш!зтшцш£ом.

Для предотвращения окисления SH-групп гидролиз вали в атмосфере азота в присутствии ЕДТА в 0,1 Ы акмоний-бикарбонатном буфере, рН 7,0 при нагрузка трипсина - IS. Анализ показал, что в процессе реакции в течение 60 мин при 37 0 С содержание свободных SH-групп и дасульфидныг связей в гидролззате не изменялось. По окончании гидролиза' скесь сразу подвергали алкилированив 4-вишшжрщцшш. Выбор алкилирупяего реагента бал обусловлен тем , что введение полярной группировки способствует растворимости фрагментов , прядает устойчивость остатку цистеина при деградации, том csseci, облегчает ндонпфпсацпа фенилтиогидан-тоиновых ( РГН ) производных при сехвенировапни я, самое главно^ избыток алюзлпрупгего реагента но иеазет акперсметричзскому

&

пептид V—1-а •см-Суз Суз' (452-461)

лялтил У11-1-0 Су»1 (507-519)

пептид VII-1 -б Суг' (545-558) 1 пептид \i-2-i. (452-461) V4

пептид •си-Су» (576-581) ПвПТКД 1 У«-2-;в 1 Су«1 1 (507-519)

Схема I. Общая схема определения положения дисульфидник связей в полипаптиддой деш -субъединицы Иа+,к+-А1Фазы

1 Таблица 1

■ Определение 5Н-групп и дисульфидных связей

э триптическом гидролиэате N5, К —АТ1?—азы до и после алкилирозания 4-—зкнилпиридином

препарат ЗК-группы, моль/моль балка

легко— доступные эамаски— розеннхе сумма езобод-кых еисзоос:::— лагиьа при суль-9итслизе обшеэ количество

На*К+-АТ<Роэс1 6,56 13,4 19.95 10,0 29.95

ги/зролизат На +ГК+—АТ9азы 5,9 1 4,4 20,30 9,67 29,97

олкилировонныя гидролизат Ыа+,К+-АТ<Разы 2ч. 4ч. бч. ооо 7.1 3.65 0 7,1 3,65 0 9,3 Ю.1 10,2 15,0 13,75 10,2

гилролизат Ма^К^АТ'Раэы выдерживание 24ч при +4 С 4,8 14,9 19,7 9,97 •29,67

А01 СУ5Р0КТ5АТ«1А1-5К1Ае1-С^АУРаАМаЕШ.Р11.КЙАУА00А5Е5А1.1 450

151 К С 1 ЕЦ С ССБУКЕМРЕЙУТ К1\/Е1РРН5Т ЫКУО!.5 I НКНРМТАЕРКНИ-УМ 500

501 KGAPERH.DRCSSJLIHGKEaPLDEELKDAFaNAYLELGGLGERVI.GFCH 550

551 1Г1Р0ЕаРРЕ0РаР0Т007МГР1.0М1.СРУС1Л5М1ОРРЯААУРОАУ6КСН 600

60) 1К V I МУТСОНР! Т А К А }АКС'/311Б ЕОНЕТУЕ01ЛАЯ1.тРУ50УНР 550

Схема 2.. Фрагмент аминокислотной последовательности об - субъелинииы Ыа+,К*-АТ$-гзи.

титровании , с ломощью которого контролировалось блокирование сульфгидрпдьннх т чупп.

Анализ показал, чю в присутствии 8 Ы мочевины в течение 2 ч при комнатной температур.' 20-крагкоа кольном избытке 4-винилпириди-на ( моль / моль SE-.групп ) полному алкалЕроваш» подвергались только легкодоступные SH-грушш, замаскированные SH-группы -лишь частичному. Дополнительное введение аналогичной порции 4-вишлпнрндана п 2 Н мочевины не вносило существенных изменений, в течение следущнх 2 ч при анализе еще обнаруживались свободвне SH-группы. Полного алкшшрования удалось достичь спустя 6 ч с монанга начала реакции ( после третьего введения аналогичной порции 4-виншпвфВДИна и ыочэвиаы, см.табл.1).

Результата титрования свидетельствуют, о том, что алкшшрова-ние гидролизата Ва+,К+-АТФ-83и является слоевым многоступанчатым процессом, для его проведения требуется тщательный контроль и подбор условий. Быстрое алкшшровааио легкодоступных реакционно-способных SE-груш полностью исклшает вероятность таюл-днсуль-фцдаого обкена, а стабильное сохранение пяти дясульфвдных связей в процессе столь длительного алкшифовшия позволяет продолжить выделение дасульфздсодершшшх пептадов J- -субъеданици.

2. Выдалошо дЕсулы&вдсодеряадцп: пептидов из адшларованного гидролизата

Ранее пгш бшго показано ,что центрифугирование пщролизата ферлента, получэшого б результате ограниченного трзпсннолиза, приводит к разделению его на два фракции: ыем^азнуа, в которой, как правило, всегда выявляются три дисульфядные связи сL-субъеданицы, и водорастворимую, содзргагцта практически все свободные SH-группы и 1-2 дасульфвдшэ связи. Центрифугирование алкиларованного гвдролкзата фермента в течение 2 ч при 4° С и 35 ООО об /млн привело к аналогичному распределению дисульфздных связей , при STOK в супернатанте , содорзг^аы около 80 % белковой матерки, находилось 2 дисульфадные связи, а в осадке-3.

С долью выявления дясульфидсодврзэдих , пептидов полученный • супернатаят подвергался разделению с помощью высокоэффективной жидкостной хроиатографш на колош« с обращенной фазой с

а260 а2С

0.64-

032

[СНзСМ).%

50 20 30 40 50 60 70 80 90 юо мкн

а2Ю

0.32-

0.16-

!СНзСМ}.%

хАю/мии

60

■30

50 МИН

Рис. I. Разделение водорастворимых триптических фрагментов На+,к+-АТФ-азы методом ВЭ2Х на колонке ( 0,4Б х 25см)с носителем Шс1еоеЦ с^ ( градиент концентрации ацетонитрила в О,Г % ТФУ ). Скорость актирования I мл / мин. Пунктирной линией показано изменение процентного содержания ацетонитрила ; а - алкилированного 4-винил-пиридином гвдролизата. Прямоугольником отмечены фракции, содержащие з-дирнлинилзтилцистеин ( поглощение при 71 -260 ем ). Стрелкой отмечена дисульфидсодержащая фракция, б - рехроматография фракции к алкилированной радиоактивно качанной иодуксусной кислотой после восстановления дисульфидам связей. Буферы : А - 5 I се^сн, 0,1 г ТФУ В - 90 Ж са^сят, 0,1 % ТФУ. Высота заштрихованных прямоугольников соответствует величине радиоактивности во фракциях.

носителем ' Nuolaosíl с.^ градпенгогл концэетрацая ецетоштршза в 0,1% раствор зряфгоруксуеной кислоты ( ТФУ ). Хрсматогракка первичного ра'ддайэшя приведена да рис.1 а.

Методом еашарскэзфятескоро титрования йнла выявлена дисуль£вд-содзргащая фракцал ЕС, однако она, согласно результатам н-нонцэ-вого аналдза, представляла смесь пептидов. Дальнейшие попытки • разделения еэ на пргшэли к получекка гомогенных дасульфэдсодер-ващах пзптидов ввиду сильной агрэгацяк, которая, Езроятно, связана с приыананием ясЗыгка 4-Егшадпирздяна, 8 U ыочэвиш и с пошнжшем рН ерэды до 3 для остановки реакции апкяшфэзагзш.

З.Полтчэвдэ мода&здирозанизх ^'сггаЕзилквптвдов

Получение геггогенвнх пзптидов нз . фракцшз IX "[оказалось bosüoshhk татшко посла восстаЕсздсния дпеульфадных сзязз£.Ласазлпзарованная фракция подвергалась' инкуаефована» 100-кратшы мольным избытком j> - мэркштоэтанола ( тль / коль s-s-груш- ) в 0,1 ei а^онаа-ожаро'онатшн буферном растворе ,рН 8,0, в присутствии 2 í¿¡ здта п 8 м шчэешш, .в течение i ч при 60 0 с в атмосфера азота, без доступа света. ¿жшявроваязэ шсеойо5щзещзшзя sh-грушг велось еззэжзай-нзбнтзюы "(-в расчэ-хо на sh-группу ) шрекргстадшзовашюй радиоактивно каченной иод-уксусной кислотой в той se реакционной ерзда в течение 20 мин. До окончании реакции с цельв удаления избытка роагентоз смесь немедленно наносилась на колонку с носителем ii-uclsosil с„а , уравновешенную 5 % ацэтонЕтрплоы в 0,1 % растЕорэ т®у,-"а подвергалась фракционированию методом вззх в условиях, аналогичных первому делэнш. в результате хроматографии сылн ндентафщироваш три гомогенных радиоактивно качанных пэшЕда ЕС-1, IX-2, гх-з ( рис.1 б ), íi- концевнми аминокислотными остатками которых являлись Cys, lia, Tal, соответственно, причем в одной из фракций (IX—1) наблюдалось двукратное превышение радиоактивности свидетельствуйте о возможном присутствия двух остатков цистеиыа в одном и том сз пзпгадэ. Наличие в вздэлзаных гаптадах радиоак-■пшно качанных остатков з-карбоксимеишщстэина было годтвзрзде-но такае результатам аминокислотного анализа ( табл. 2 ).

Таким образом, в результата фракционирования алкилированного

Таблица 2

Аминокислотный состав водорастворимых пептидов

+ +

К—1, (X—2, IX—3 триптического гияролизата На ,К —AT?—азы, алкилированного 4-винилпиридином

Аминокислоты

К-Г (452-4 61)*"

К-2 (507-51 д)**''

К-3 (545—558)*

Asx

Gix

Ser

Gly

His

Arg

Ihr

Ala

Pro

Tyr

Val

Met

lle

Leu

Phe

Trp ■

Lys

p.e.—Cys ' см-Cys

13.2(0) 31.2(1) 27.9(1) 33.8(1) 14.0(0)

16.4(0)

21(0)

6.9(0) 3.9(0) 9.9(0) 34.1(1) 12(0) 28.4(1) 36.4(1) 18.9(0) 0 (0>

32.4(1) +

+

41.9(1) 22.4(0) 92.1(2) 47.1(1) 39.4(1) 43.4(1) 10.4(0) 10.8(0) 14.2(0) 1 1.4(0) 1 3.4(0) 4(0)

158.9(3) 74.8(2) 21.2(0) 0(0)

46.3(1) +

+

14.4(1)

287,1(2)

24.7(0)

134.3(1)

140(1)

27.4(0)

31(0)

41.4(0)

144(1)

13.8(0)

134(1)

14.0(0)

44.3(0)

398(3)

294(3) 0(0)

0.43(0) +

+

номера фракций соответствуют нумерации рис. 1(6) f<* см—Cys —радиоактивно меченный [С]—карбоксиметил (*СМ) "'p.e.—Cys — S—пирмдинилзти/щистеик

*»» — коорлинаш пептидов соответствуют участкам по/мпептидной цепи<^-субединицы

4-вшилпиридинои ГЕдролизата были получены три полуцистеинсодер-жащих пептида, остатки цистеина которых, образуют двз дисульфвд-ше связи.

Результаты проведенного эксперимента свидетельствует о том, что ■ алкилирование свободных SH-групп в процессе выделения пептидов, успешно применяете для растворимых белков оказывается ыалоприемлемым щи выделении пептидов Па+., к+-АТФ- азы, поскольку алкилирование представляет слоеный процесс, сопровоадаидийся денатурацией и агрегацией , что ослоеняэт выделение дисульфвдсо-держащих пептидов.

Алкилирование гадролизата фермента показало очень низкую реакционную способность замаскированных SH-rpynn, что исключает возноепость ТЕог-дисульфгдного обмена в процессе выделения пептидов. Инертность замаскированных SH-групп подтверадается тагске результата® сравнительного анрлиза ашерокэортгеского титрования нитратом серебра lía" -АТФ-азы до триптического гидролиза, спустя I ч с момента начала гидролиза ( условия гидролиза описана выше ) и аналогичной порции гадролизата , выдерганной в течении 24 ч при +4° С (табл.1).

Таким образом, полученные данные позволяют отказаться от тактики блокирования всех свободных SH-групп и пойти по пути выделения дисульфздсодергащиг пептидов из неалкилированного гидролнзета.

ГУ. Анализ циствнсодергащих пептидов и цистеинилаептидов тииш'цчзского гидролизата На!- ,в?" -АТФ-азы без предварительного алкилирования.

1.Наделение цистинсодэтжащих Фрагментов.

Для выделения дасульфвдсодержащих фрагментов -субьединицы использовали тот жв тришгаческий гидролизат На+,к+-АТФ-азы,что и в эксперименте, описанном выше, только без предварительного алкилирования свободных SH-групп. Разница заключалась лишь в том, что после 1ч гидролиза смесь сразу подвергали центрифугированию. Как было показано выше,в процессе триптического гидролиза количество дисуль$идных связей и свободных SH-групп практически не менялось, а в результате центрифугирования гадролизата в

Рис.2. Разделение водорастворимых пептидов триптического гадролизата ка+,к+-АТ©-аэы без предварительного алкили-рования методов ВЭНХ на колонка ( 0,46 х 25 см) с носителем Нио1еоай ( градиент концентрации ацето-нитршта в 10 мЫ анноний-бикарбонатном буферном растворе, . рН 5,65 ). Скорость элшрования I мл / мин. Г - XII - объединенные фракции, по две гшке ся амперометрнческому титровании нитратов серебра. Б-з - отмечены дисульфадсодернащие фракции.

течение 2 ч происходило их расврздзлешо, при атом в сунэрнатаяте Сзеи обяаруЕЭни практически все свободные SE-rpyn-ш и два дасуа^здагз селзи, а в осадке тагтдялясь оставшиеся три дасульфэдазг шейка .

Дальнейшее йжздаоЕзровашзе супэрпатснта проводили штодом B32Z sa .талояш с обратится фазой с носктелгы líuoboeü. Cg с ишшьзовгшнаа градноата коздэзгграцаа ацатагшрана в 10 еи-моняй-ацэтагшз ijygapsoa рагавэрз, с pH 5,65. Дозэкщш проводаш щн даняз вахт 210 ни. Есэ ой^адшашна фраащш { тглс.2 ) подвергалась Еиюргэ^тшчэЕк^у па-разшав ¿¡гратам сарзс'ра длл опрэдакаша в eu сгоЗодаЕ БЭ-грзшп ■ п даоулыйгщах caacsß. FacíS'. ЧЕсага. ss-rpgES с яяс&т&щгх. сйнео-З ocsouisaacsi на шрадздоша isocçaossa сарзбра, саашааазэгосз в працасоо киро-вагая сначала es сзоСодаа^х, а загеи с шогосаздаыз^ася прг судь^дкаше ЕЗ-грэпп в шрэквэе на I какь шгжздесго tarcjaa-ла. РсзультэЕ рвварадаяаеЕ ЕН-гругг: п дадаЁЭДЕЩ связзй по сс'ьздаавыги i^s^T^.ra^cz-anssz^ ъ tzCsss S. Massst ¿oss-

32M, чяс'еrpjise вжшадшзиш''ензксщзлэ-

кулипЕск гцц^сда&пи шшщга, - шваруэкк^ в процессе ЕЕПЭсеэда. БоеSZIZZZ2Z сэдертаь: егазгжжоьашзаз -'ЕН-гр^шпа.

Лксугшзксодер^^-шшЕда ear* во (jpasuaaz • V л тп

причем фракцца V содержала b-S-i-oc^:.. a ßpsТЕ

-два. Одшакок» содзрзаЕЕЭ ss-rpyzr г: .с-з^'я^:^—.: свйзэа до с послз разк-жатгт£ п^ролизата иато&рн: E3ZZ сзцхз-гэльсгЕЭ'ог о ток, что прсц'-ü ЁрапсяэЕЗ^: ез к сготр Eâssv^oro

материала, рззз^г&з: тигровые Еосет кодчаствеп:-^: sapssasp.

¿налгэируя içassos cyjffigsscutssa, -кшео огкоазаь разкнчня- в чувствстельЕооЕ: даЬульЗзгис свя&г£ i: Босгтгагггатах:. Ute:, во фракц^п т, paçss s-s-связн пропсходгл практически сразу поело ввадэшл; сушфга Еатргз ц ЗЕшпнвалея к 3-Е ira. {Зраздая та ойвадале сакьпШ устойчЕвостьа, воссташаганай юсиго стусенча-тн2 характер, сминалось с 3-й iza и аакставагось на 13 кап". Такш образа:,"tasso зскязчеть, çto 2 д^сухызддазз евгзг различается кездг ссОсй по ' рзшасгоЕнсй ссособлоста. Давпо£шя работа была ШЕргшлза нг солучеше гокогенних дясуяьфэдсодерна-пда: тптвдов. G sïcû целью баш щюЕэлсни рз2рга:атогр£^з

ТоЗлииа 3

Распрелеление SK—групп и дисульсркакь« связей FT о фракциям тркпгимеского гидре— лкзога Wat К^-АТФ-аэк, полученном методом 33 ЖХ

{__JH—гпугсг«, ноль/изяь Se-nta

N <npa>aiKK глпго доступицо роьамкиа '-•KCRCCJoríSQ-SMK3 при chutee ка/жчестгзо

0 « 55' 77 0 7.37

! о'"" 1,38 О 1,38

а 0,36 0,3с

ш а 0 с 0

IV а 0,72 О 0,72

V 0 2,04 1,73 3,82

Vi а С О 0

VE! 0 1.2 2,71 3,91

VW 0 1,33 0 1,38

¡X 0 1,27 0 1.27

Л 0 1,03 0 1,03

и 0 0 О о

jai ■ 0 0,4 0 - 0,41

Сумма "Г /9 6,56 29 U,55 51 4,49 4,20 22,60

Номера фракция соответствуют нумерации рис.2

О* — фракция пептидов.з/юируемая □ процессе нанесения

гилролмэата на колонку * %*« — за 100% принимали общее количестзо Sit—групп

фракций v и та на колонке с обращенной фазой с носителем. Nucieosil Cjg соответствупцими градиентами концентрации ацето-нитрила в 0,1 % растворе ТФУ. Результаты хроматографии, представленные на рис.З ( а,б ), свидетельствовали о гетерогенности исходных фракций v и "Ш и, требовали дополнительного поиска цистивсодержащах фракций. С помощью амперометрического титрования были обнаружены дисульфидсодеркятпиа фракции v-1, vn-1, ш-2. Наличие дисульфэдных мостиков в этих фракциях было подт-вервдено также результатами аминокислотного анализа по образовании цистеиновой кислоты после окислительного расщепления s-s-груш надмуравьиной кислотой ( данные анализа не приведены ).

Вобшееы два альтернативных пути локализации' остатков цистеина, участвуадих в образовании дасульфвдных связей : первый заключается в непосредственном определении аминокислотной последовательности цистинсодержащих пептидов и их идентификации на основе знания первичной структуры ; второй - в получении цисте-инилпептидов из дасульфидсодержащих фракций, что является бесспорным доказательством участия их в ковалентном взаимодействии. Кавднй путь имеет как преимущества , так и недостатки. В нашем случае целесообразно было использование обоих вариантов исслэдования ( см. схему!), поскольку изучаемые фракции помимо s-s-связей содержали замаскированные SH-группы.

2. Аминокислотная последовательность цистивсодетшащих пептидов Y-1, УП-1. ТП-2

Первичную структуру смеси пептидов определяли с помощью газофазного секвенатора. Вследствие одновременного присутствия s-s-мостиков и замаскированных SH-груш необходимо поэтапное исследование остатков цистеина. в связи с этим остатки цистеина подвергались модификациям, которые включали алкилирование исследуемой смеси непосредственно на фильтре секвенатора в течение 1ч 4 ыМ 4-винилпиридином ( 4 v.p.) или 4 мМ 4-( аминосульфонил) - 7- флуоро- 2,1,3 -бевзоксвдиазолом ( ABD-? ) в присутствии или отсутствие восстановителя 2 мМ трибутилфосфина ( ТБР). Применение различных алиилирующих реагентов позволило вести контроль фанилтиогидантоинов ( РТН ) аминокислот не только мето-

20 30 i.0 50 60 мин

Рис.3. Рэхроматографм фракций триптического гидролязата (см.

рис. 2 ), а - фракция Y , б - фракция то , методом ВЭШС на колонке ( 0,46 х 25 см ) с ' носителем lfucleo3ïl c^gi градиент концентрации ацетонитрила в 0,1 % TORT ). Скорость элшрованпя I мл / мин.

дом ВЭЕХ, по с всздьв флуоресцентного ааагааа, которое подвергалась 1/3 часть обрсзушшхся ЕЗК- произведши:.

Азадте (уа;цгт г- 1 ■ показал, что ose предетЕ&шзт coöoii гомогенный езеткд, опрздзлзнае структуры которого бзз восстановителя трис/ля*&эс£гна пввогикао ¡ленду того, что н-кокцевш.! остатков язллзтся цгстенз, очеБкда£ участвук^й» - в образовании ковалеатксй связи ( табл. 4 )'. Апалгз а*СТ03Е&ьотиз2 последовательности позволял соога&стн дантй: <£рапгзет с ^чгстксу яолипептадной цепи <£■ - субыданнца с ксордшгсакн 452 - 461. Определение второго остатка цгстзша, участвующего в кобзлзетеой связи, ослспачкосг; нелЕ'-агем с данной пептиде ещо двух остатков цистенна б гююЕзаияг 456 и 457 , г^оде^вдЕруеьах в процесса пссстЕновлоЕЕЯ.ТакЕм copasc«, для локадззогкп гдсульСйдда£' сеяве иалзчиз трзх остатков цгетепяа з шютдв ipsöye? посладзЕстель-еого алкЕллроваыш их р&злияшшп реагентами да я поста сзссяа-повланЕЯ. * . ■

Анадкз ffpeagm тп-1 представляла сьгесь шптвдоз с и-кощэ-шиа оетатксаш Tel к Но. 3 стлешз от ёрагцо; V-1./.D £з$зздех УП-1 блокгрэЕшга . процесса ;деградаций Бачпнглось посла чкзар-•еого вага, ¿лкнйгооагажз поптядав отеутешш ttxatzsssscasa пэ

ш8сло дс2юлшщ!£ыю£

Установлвшге структуры пептидов {рзнздш ш-1 до яотыгоадца-того аага оказалось вззжшгэд только теле обработки сазса трибутш^осфшод. ДлкклзроЕанго в процесса госсташплэкля дасульфздЕоа связи позволило обнаружить при анализе РШ- производных на пятой кате мод^фацарованЕна остаток цистенна, что подтвердило нашчнэ дасульфздаого - мостика. Сопосташганга результатов секвэшрованшг с агзгЕсжксаютной посдадозательностьи

- субьеданкцы, позволило отвести эти поптидо к участкам голп-полипептидвой цепи ( 545-558 ) и

I-Ir-D-H-C-S-E-I-Xr-I-H-G-E (507-519) (ТаОя.4;? сге;га 2).

Такт образом, фракция VH-1 вхлвчала два Срагнэпта паштеп-•гадноЗ цепи. Длина одного hs них с п-концевым остатка« es507 на вызывала сомнений. Длша второго с остатком Vai5^ на 1Г~кснцэ, представляла определенный шггерэс, поскольку в соответствен со специфичностью тршггпческого расщепления С-кснцэвыы остатков это-

табяияа 4

Лшшохзслэтаэя яоедазкпигевярсгь цясгаясгдсрззгщп псхггядоз

Opsaçtu Успокет Ддддюяиспотнзл посягяегзтгяыяхпъ {р:сср/£!ятт даны по геиу)

Qp.Vrl Еяз Hsyjstjswcaçoi abdf •5-V.JJ, WF+ASDF из устгксаягкэ »г усгсигзлка яг успзгес-ып CJEUTCSSWC {452-461}

üS3 «^еевециЯ т/щ:- ¡1ЕЛ-

A3DF VUE?- ÜJT™-

Op-VH-l- TBF+A2DF VICFCHIHPDEQF {545-553} ¡U3HC7S3IUHGÍ Í5C7-519)

IBF + 4-v.p. VLGFCrHWPDEQF !U3RD*SS!UHGK (545-53S) ¡507-519)

bei VL£F'- ora— 1-fVEl_

A2DF VLC?- nun- LCFVSL

(Dp.V!!-2 •'-v.p. VtGr- ¡LDR- LO"P.'GL (57S-581)

ТСг + ÄBDF CTHLCCGSVK VLGFCHUTPDEQF ildrpss'.lihsc LCFVGl (452-461) ¡545-55S) (507-5 IS) (57&-581)

ТВУ+ДЕЭУ-гякежрэшаше остатка цясгеяпа (¡пторесделтл* еутфяданпьиыы реагеятом

f AED F) в грксугстлда восстановится

■jpuSynujissajKn (üW)

рззия

С* S- пирздияяяэткддистг.чи

го фрагмента должен быть Arg53^ и, таким образом, пептид долкен состоять из 55 аминокислотных остатков с двумя остатками цистеина в положениях 549 и 577. Поскольку деградация фракции VH-1 прекращалась - после четырнадцатого шага, ответ на вопрос, какие именно остатки цистеина участвуют в образовании дасуль-фидной связи пли .какова причина присутствия

в этой смеси фрагмента i-lr-D-R-c-s-s-l-b-l-H-G-K ( 507-519 ) с устойчивой к действию трипсина связью Arg*10, можно получить только после выделения индивидуальнцх пептидов.

Анализ фракции тп-2 показал, что она представляет сложную смесь, не годдапвдЪся дальнейшему разделению, с Ы-концевыми остатками Val, leu, Па( см. табл.4 )..Идентификация аминокислот ных последовательностей .осложнялась, поскольку на кавдой ступвшг деградации, вклшая четвертый шаг .выявлялось по 3 аминокислотных остатка, далее спектр их резко сужался и деградация прекращалась на 6 шаге. Алкилирование без восстановителя не изменило характера сиквекирования, но позволило обнаружить остаток цистеина на втором шаге. Обработка фракции трибутилфосфином в присутствии одного из ашшлирущих реагентов ( 4- v.р.или ABD-F ) позволило идентифицировать четвертую последовательность с модифицированным остатком цистеина на н-конце, которая в предыдущих условиях не выявлялась.

В результате анализа восстановленной фракции тп-2 на первом, втором, пятом, и шестом шагах были обнаружены алкилированные остатки цистеина. Соотнесение анализа аминокислотной последовательности фракции тп-2 с участком полшюптидной цепи ai -субъе-дишщы, позволило установить координаты 4-х.пептидов ( табл.4 ): С—I-E-L-C—C-G-S-V-K _ ( 452- 461 )

I—Ir-D-R-C—S-S-I-L-I-H-G-K ( 507- 519 ) Н

Т-ЫЗ-Р-С-Н-Ьг-Г-Ь-Р-и-Б-О-У ( 545- 558 ) Ъ-С-У—V-O—I ( 576- 681 )

Таким образом, анализ фракции 7П-2 . внес дополнительную информации о существовании пептида с координатами ( 576- 581 )-продукта неспецифического расщепления трипсином, включапцего остаток Cys^^ на втором EEire, предположительно не участвующего

в образовании я-Б-связи, поскольку этот остаток модифицировался как в присутствии, так и в отсутствии восстановителя. Для подтверждения достоверности илинокислотных последовательностей, определенны! при анализе фракции 711-2, а такз;з свободных остатков цистеинз, не участвуюцих в образовании дисульфидов связи, необходимо получение цястезшилпептидов с алкшшроваЕными остаткам цистеинв рсзлнчншли реагентами до и поело восстановления дисульфидах связей.

3. Выделение и анализ цистэишишептидов фракций т-1,ТП-1,7П-2

По результатам, ошеаннш выше, ыокно прэдпологить, где находятся две дасульфздныэ связи в Л - субъэдпница. Уточнению их локализации путем анализа цистеннилпептидов, полученных . в результате восстановления дисульфидах связей фракций т-1, УП-1 и "га-2, посвящен следущиг этап исследований. Учитнзая,-что кавдая фракция помимо дисульфздных связей содервала свободные СН-грутшы, необходимо было предварительно блокировать последние.

Фракция 7-1.. Аиоыгарованив свободных БН-групп. Общепринятая методом кодафакнцли сульфгидряльшх групп белков считается "ыетод карбоксикетилирования иодуксуспой кислотой, либо иодацетамидом. В нашем случав алкЕлированзв свободных БН- груш проводилось радиоактивно меченной иодуксусной кислотой в 0,1 М ашоний-би-карбонатноы ' буферном растворе рН 8,0, содержащем 2 мМ ЭДТА и 8 М мочевину, в течение 20 мие при комнатной температуре в тешоте. Реакция прекращалась быстрым обессоливангем. на колонке т-Ьто Рао а5К-юоо зте, уравновешенной 0,1 М аммоний-бикарбонат-ным буферным раствором, рН 7,0.

Для дополнительной очистки и выхода модифицированного пептида обессоленная фракция подвергалась ВЭЖХ в микроколоночном варианте ( Милихром ) на колонке с носителем Нио1еозИ С^. Элшрование проводили градиентом концентрации ацетонитрила в 0,1 % ШГ. Вкличениэ радиоактивности во фракции снидетельствова-ло о наличии в данном пептиде свободных БН-груш. Величина радиоактивности отмечена на гистограмме ( рис.4 А ) заштрихованным прямоугольником.

«гга Е

<020-

\ffi-1

КНзСМ.%

—Л-

Б' УП-1 а б

3' 1

О И 30 1С

Ю 20 X 40 мин

Рис.4. Разделение пептидов триптического гидродизата ( без предварительного алкшшрования ) катодов ВЭИС ( Мшшхром) на носителз Иис1еопЦ 5 с^ в ступенчатом градиенте аце-токитрзла.( Буферы : I - 0.1 % Т®У, В - 90 % с^сн в 0,1 2 ТФУ ). Высота черных столбиков соответствует величине радиоактивности во фракциях. Высота незаитрихо-ваиных столбиков соответствует величине флуоресценции (волна возОувдения света 385 нм. аыиссзоного свата 520ны) а,Б,В - пептида алкилировеаные радиоактивно меченной иод-уксусной кислотой до восстановления дисульфадной связи. а,Б,В - пептиды, алкилированные авю-у после восстановления дисульфадной связи. АА1- хроматография фракции V -л, ББ'- хроматография фракции тп-1. ВВ'- хроматография фракции УП-2.

Восстановление дпсульфпдной связи и апгоиированяе г.асвобогг;2ктах.ся сульфгидриль'дд груш.

Известно, что вссстаиовлешшэ ЗЯ-группн рзакцнснноспособны. Для предотвращэшя их реокисловия необходимо» их быстрое апкшгп-ровапаз .Наиболээ пзСиратольгам я зф^екттятан методом расцепления 5-5-сзязи явхяется Еосст&Есвлспие с ио:дз!1»ьв трпбутштфосфзяа, которое п слабс^елотзой срсде идет стахтгзгрзиэсхи прт: зебольигом ¡¿ольпем избыта) ксссуаггоситоля ( з расчэтэ за з-з- езлзь ), с высокой скоростью, избирательно и почти количественно. Волыиии прзЕыущзстЕо;.! лапизтея вознсиность вэдзита алкалирозапгтя обрззукгяхея БИ -Групп В присутствия данного ЕОССТгПОЕПТЭЛЯ.

Учитывая, что нерзоэ алкиларсвашю, т.е. свободах ЕЯ-груш, было проведано радеоазтазно гачашоЗ яодуксуснсС :-етлотсЯ, то з качестве второго анх&ЯЕрухтгаго рзагектя был выбрал шсокоспеци-фгчесгсЕЗ флуоресцентно изчоншгЗ препарат ¿пз-у . Всестгшовлеяиэ трибутивфосфпкгл с одаонре;зяЕпм агкаяировшлем £ВВ-? зэлось в 0,1 Н атаонЕйнйжврбонатшм растворе при ри 7,0 в присутствии 2 Ш ЭДСЙ. • н 8 И кочзвзан в точэниа I 1 пра 60° С в • атыос?эрэ азота. Реакция враэтзгцодась попоерэдотзвЕкпа непзеенкем реакционной скэси на колопкэ с зостевлвм Пийеоай о^; 'Раздающие щюводааось датодом ВЗЗХ ( йизпрам ) Еналоггшм ступзнчатш градиентом эцетонатрлла в 0,1 Я ТШ, описанным шшэ( рас. 4 А* ). Сравнительный анатзз хрекатограта показал, что Еосстановленчэ пептида не привело к образовали*) двух отдельных фрагментов, как это отмечается в' бальпппстве случаев при рззрнвэ з-з-связеЗ. Однако бапзчэшв сэлэктзбиой флуоресцентной иэтки свидетельствовало о появлении сульфгадрильзах групп в результате разрыва ковалентной внутрпцепочечкой связи.

' Определение аминокислотной последовательности моднфзцирован-ного пептида 7-ь-а с помощь» секвенатора позволило соотнести его с участком полппзптддяой цепи Л - субьедашцн с координатами 452-461 ( табл. 5 ). В процессе езквепирования среди РТН-прокз-водяых были обнаружены алкнлировашыо остатки цистеина.: на первом и пятом шагах- - флуоресцентно неченше авв-р , а на шестом шаге - радиоактивно меченной иодуксусной кислотой. Таким образом, полу тонные результаты позволяет утверждать, что пептид т-1-а

Таблица 5

Аминокислотная последовательность модифицирование цкстекньшсодержзщ'их пептидов

Фракции Аминокислотная последовательность (координаты.даны по гену)

v-1-a ^dlellíc^gsvk461 ' Р '

vii-1-a -^ildiäsiuhgk519

vii-1-6 ^lgJÍhlplpdeqf53

vii—2—а 576lgfvJl521

vii—2—б ^CIElSc^gsvk461

vii—2—в 507ildf^psiuhgk519

vii—2—г 545vlgfghlflpdeqp5a

С*- см-Cys радиоактивно меченный 14[С]-кар5оксиметил (*см) цистеин С' - 4-{аминосульфонш1}-2>1|3-бензоксидиазол-цистеин

иызот дисульфнднув связь мевду остатками щстеина 452 и 45Б, при этом свободная SH-грулпа принадлзжят остатку щстеина з положении 457. Полученные результаты позволяют обьяснить невозможность секвенирования цистинсодерзсащей фракции 7-1, описанное ше, без предварительного восстановления, поскольку N-концевым остатком является цистеин, участвующий в образовании дисульфядкой связи.

' Наш результаты по локализации дирульфздной связи между остатками цистенна 452 и 456, а такте существование свободного остатка цистеина в- положении" 457 не противоречат ямещннся в литературе данным по На+,к+-АТФ-азе .

Показано селективное связывание остатка цистеина 457 с иодедет-амидфлуорэсцеинси, ведущее к ингибнрованив ферментативной активности. Цри этом отсутствие связывания алгазлирущегоргагента с близлегащими остатками Суз152 и Суз456, с нашей точки зрения, согласуется с участием последних в образовании дасульфаднсй связи.

Кзучаа'.ий нами фрагмент ( Cye^-iys*®1) представляет несомнений интерес. Он состоит из 10 аминокислотных остатков, три из которых является остатками цистеина,содержит уникальнув последовательность Сув45б-Сув457, часто встрвчатщуюся в белках. Как правило, 2 соседних остатка не образует мезду собой дасульфздной сзязн, поскольку геометрия пешвдного звена препятствует этому, но,оба ати остатка способны образовывать дисул1фвднне мостики с другими остатками цистенна, сйпгвая тем самым-трп сегмента цвпз. Однако в с- субьэдншце в образования дасульфидной связи участвует только один из этих остатков Сув456, взаимодействуя с остатком цистеина в положении 452. Второй жэ реакционноспособний остаток цистеина - сув^ остается своСоднем. Наличие вблизи дисульфэдноа связи свободного остатка цистеина позволяет допустить существование молекулярного механизма регуляции структурно-диншяичэских свойств полипептидной цепи возможно за счет тиол-дисульфздного обмена, либо за счет взаимодействия реакционЕО-способного остатка цистепна с другими функциональными группами полипептидной цепи.

Фракшг; уп-1 и VH-2. Для анализа фракций 7П-1 и та-2 и, s-s-свяоей была применена та ге тактика исследования, как и

при рассмотрении фракции : последовательнее злкшшровзние сульшгадрнлькых групп, сначала всех свободных -радиоактивно меченной иодуксусной кислотой, а затем высвобоадащихся в процессе восстановления дисульфидпой связи - флуоресцентно меченным реагентом ÁSD-?. Процедуры карбоксикетширования, удаления избытка реагентов, восстановления днеульфидных связей с одновременным аянпларованием ¿bd-f . разделения цистаннишептидов кетодом ВЭЯХ в ышфоколоночнои: варианте ( Ыилизром }, а твкге анализ аминокислотной последовательности полученных фрагментов было аналогично описанным вкша для фракции Y-1.

Фракция 711—1, как отмечалось ранее _содержит два пептида с Н-козцевнмь" остатками ' Ile^07 и Tal5745 . Поскольку истиннзя длина второго пептида неизвестна, то теоретически, согласно условия.! триптического расщепления,' он мог включать два остатка цистеина в положениях 549 и 577. Несмотря на отсутствие свободных сульфгццрильных групп при титровании этой фракции, тем не менее, была проведена попытка поиска свободного остатка цистеина путем алкллирования радиоактивно меченной иодуксусной кислотой. После удаления избытка реагентов и дополнительной очистки, фракции методом ВЭЖХ ( Шишхрои ) не было обнаружено включение радиоактивности в пептид ( рис. 4 Б ). Фракционирование восстановленной трибутшфосфшок и алкилированной ABD-I" фракции тп-1 привело к образованию двух гомогенных пептидов тп-1-а, тп-1 -б, обладающих интенсивной флуоресценцией ( рис. 4 Б'). Структура выделенных пептидов ( табл.5 ) была идентична аминокислотной последовательности, определенной ранее . при секвенировании сне се вой фракции то-1 (табл. 4 ) :

I-L-D-R—C^-S-S-I—L-I—H-G-K ( . 507-519 )

V-L-G-P-^-a-Ir-F-Ir-P-D-B-a-r . ( 545-558 ) Пептид ти-1-6 представляет собой укороченный фрагмент, состоящий из четырнадцати аминокислотных остатков, и является очевидно, продуктом неспецифического расщепления и, таким образом, не содержит Cys^77. Подтверадением участия двух пептидов vn-1-а и YH-1-б в образовании цистинсодергащего пептида является идентификация в каждом из них на пятом шаге флуоресцентно меченного остатка цистеина. Таким образом, уста-

новлэна вторая дисулъфидная связь, образованная незду Суз571 -

Фракция 711-2, представляла сложную многокомпонентную смесь пептидов и содержала как свободные БН- группы, так и дисульфидные связи. Несмотря на то, что были выявлены все дисульфаднае мостики ( как предполагалось, их должно быть два ), фракция 713-2 такге подвергалась аналогичному исследованию. Первое алкилирование радиоактивно меченной иодуксусной кислотой привело к включению метки в пептида, однако не способствовало разделению смеси ( рис. 4 В ). При повторном фракционировании восстановленной тер и алкилирозанной смеси пептидов авб-р были получены четыре компонента : один из которых - УП-2-а включал только радиоактивность, два - тп-2-в , тп-2-г только флуоресцентный зонд, а фрагмент тп-2-б - и то и другое ( рис.4 В'). Последовательность всех четырех пептидов не противоречила полученным вше результатам по локализации дисульфидах связей ( табл.5 ).' Более того, обнаружение пептида ь-с-У-У-б-х с координатами ( 576 - 581 ), имеющего на втором шаге радиоактивно меченный остаток цистеша, убездает в том, что этот остаток Су^77 не участвует в образовании Бревнам, а сам пептид является результатом неспецифического расцепления трипсином. Таким образом, подтверждается существование дисульфвдной связи меяду остатками Повторное выявление остатка Суз457 в пептиде 711-2-6, идентичном У-1-а , в числе свободных , так как он метился радиоактивно меченной иодуксусной кислотой, еще раз свидетельствует о наличии дисульфвдной связи мезду остатками Сув452 и. Суз456 ( табл. 5 ).

Суммируя результаты исследований двух независимых альтернативных путей локализации дисульфидных связей водорастворимых фрагментов триптического гидролизата иа+ ,К+-АТФ-азы ( анкетированного и неалкилированного 4-винилпаридином ) можно заключить, что в обоих случаях были получены идентичные пэптпды Л - субъединицы, содеркащио дисульфидные связи между Сув452- Суз456 и Су^11- Су^9.

Локализованная наш дисульфвдная сеязь мазду остатками

Суп511 к Суз542, приводящая к образования петли из 33 аминокислотных остаткоз, представляет несомненный интерес, поскольку она расположена в наиболее изученном участке нуклео-тпдсзязцващвго центра. Несмотря Еа значительное число работ по изучении о той области сС - субъэдвнщи , среда псслодуемох фрагментов не бшга обнаружены пептиды, содержащие остатки цистеина , с координата:,я 511 и: 549. Наличие днсульЗвдной связи кззду остаткаш Сус?11 н Су^49, придает устойчивость связи ¿rg^10- Сув^11 к действию трипсина и существзнно модулирует чувствительность полипеотидной цеплеб-субъэдинЕпи. Сущоствованко этой дисулвфадной сзязн моезт иметь несколько предназначений : придавать уникальность ¡информации вблизи луклеотидсвазывЕвдаго центра, способствовать сближению отдаленных участков полипептидной цепи ( ) с активным центром.

Функциональная роль днсульфядаых связей в íía+ ^К-АТФ-аза, пока не установлена. Тем на менее, разрыв дасульфэдннх связей приводит к инактивации фермента.

Таким образом, локализация двух дасульфэцдаых связей мецду остатками цистеяна Cys4S2- Суп456 и Суз511- суп549 в «£• -субье-динице Ва+,Е+-АТФ-азы могэт послужить основой для уточнения структурно-функциональной модели Иа+,к+-АТФ-азы.

ВЫВОДЫ

I- В результате комплексного анализа с применением различных методических подходов установлено наличие в молекуле На.+ ,К+-ЛТФ-азы пята дисульфндных связей (два дисульфпдных мостика в сб- субъединице и три - в ¡Ъ - субъединице). Показано, что большинство кз 20 остатков цистеина относится к разряду замаскированных.

2. Определено, что полное аяхялировзяис свободных ян-грушт иохет быть достигнуто только после предварительного гидролиза кембропно-связанной на+,Х+-АТФ-азн. Установлено, что дксульфиднне мостин в «Л -субъединице располояенн в гидрофильно:.: пртоплазмзтическом домзнэ фермента.

3. Из вяшлироБЕЕпого гидролизата Иа+ ,к+-АТ©-езя выделены фракции дасульфадсодергацих петзтдов, включеза-ле трл фрагмента полипэптщрой цепи сб -субъедлнкщ: с Сув452-1-уз461,' Не507- Т.7С519, Та!545- Ииг58.Устаяэзлэъо, что есэ эта пептида содержат.остатки цистеина, участвуйте

в образовании двух д*суль£пдних связей.

4. Нз трнптичзского гидролизата нативной Ка? ,к+-АТ"~азн, не подЕсргзБпэгося прздварптелько.му а^х^шгхр-оваЕЕЗ.ЕНделеш дка цкстязсодэргезгх гоьтидз. Определена аминокислотная последовательность выделениях пептидов до к после зосетанов-енкл дасульфидЕнх связей, с зстапьзовэЕЕем различных ыгтсдов ХЕзяческой модификации БН- групп, в том числе непосредственно в годэ ана.тоа на секвзнаторе.

5.В результате разработанных подходов п методов исследований установлено положение двух дасульфвдннх связей в полипептидной цепи об -субъединицы На+,к+-АТ5-азы мезду остатками Суз452- Суз456 и Суз5"- Суз5'*9.

Основные результаты диссертации опубликованы в следупцих печатных работах

1. Арзамазова Н.М., Аристархова Е.А., Гевондян Н.М., Назимов И.В., Гаврильева Е.Е., Алданова H.A., Модянов H.H. Первичная структура ck-субьедишщы Ыа+,к+-АТФ -азы почек свиньи. Анализ продуктов тршгшческогб гидролиза иммобилизованного белха.

- Биоорганическая химия, 1987, т.13, N I, стр.1-13.

2. Арзамазова Н.М., Аристархо&а Е.А., Гевондян Н.М. Гаврильева Е.Е., Азизова Г.И., Чертова E.H., Модянов H.H. Двухстадийный ограниченный протеолиз мзмбранно - связанной На!" .¿"-АТФ-азц. Детализация модели пространственной организации субьединиц.-Биологические мембраны, 1987, т.4, H S, с.590-599.

3. йодянов H.H., Арзамазова H.H., Аристархова Е.А.Гевондян Н.М.,. Гаврильева Е.Е., Двандаугазян К.Н.. Луценгсо C.B., Чертова E.H., Шафиева Г.И., Лунева Н.М. Структурные исследования Ыг?" .К^-насоса. СССР-Зал î Берлин симпозиум " Рецептор! и ионные каналы " Тезисы докладов. Ташкент. 1986, с.62. ^

4.Uodyanov H.H., Arzamazova H.K., Arystarohova E.A., Gevondyan U.U., Gavrilyeva E.B., Dzhandzhugazyan K.N. .lutsenko S.Y. .Luneva

H .Ii., ShaÜeva О Л., Chertova E.H. Ыа , l£ - pump : structural organization. In OvohinEitov Yu.A. ,Hußh.o F. (ейз) : Receptors and. Ion Channels, Berlin,Вей York: Walter de Gruyter.1987, p.287-294-

5. Chertova B.N., Gavrilyeva E.E. .Gevondyan H.H., Arystarkbova

5.A., Arzamazova H.H. Analysis ot topography Ol ß-subunit ot

1 I. xy. w

Na , К - ATPase — 14 International Congrees oi Bioohemystry, Prague, 198B, Ih-393.

6. Геводдян Н.М., Гевондян B.C., Гаврильева E.E., Модянов H.H. Анализ сульфгидрилъных групп и дасульфидвих связей Ва+,К+-АТФазы.

- Биологические мембраны 1989, т.6, 5 9., с.939-945.

7. Gevondyan H.II., Gevondyan Y.S., Gavxilyeva. S.B. Analysis of iree crotbidxyl groups and disulfide bound in Hef , K*" -iTPase.

- ÏEBS lEMEBS, 1989, v.255, H 2, p. 265-268.

8. Гевондян Н.М., Гаврильева Е.Е, Гевондян B.C., Модянов H.H. Анализ дисульфвдных связей На+ ,К+-АТФ-азы.- Биологические мембраны 1992, т. 10 , ( принята к печати ).

Материалы диссертации были доложены на СССР-Зал. Берлин

симпозиуме " Рецепторы и ионные каналы « ( Ташкент, 1388 ), на 12ом Всесоюзном совещании по транспортным АТФазвы. ( Иркутск,

1987 ), на ХГ7 Международном Биохимическом Конгрессе ( Прага,

1988 ), на Всесоюзном симпозиуме по химии белков ( . Тбилиси, 1990), на хх Ыевдународном симпозиума ФЕБО ( Будапешт, 1990 ).