Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Популяционный и медико-генетический анализ рестриктного полиморфизма генов каталитической субъединицы Na,K-АТФазы человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Популяционный и медико-генетический анализ рестриктного полиморфизма генов каталитической субъединицы Na,K-АТФазы человека"

и и» - •

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНЫЙ МЕДИКО-ГЕНГГИЧгСКИЯ ЦКНТР

На права* рукописи УДК 599.9:577.2:576.316

ПЯТРОНИС Артурлс, Альгиманто

ПОПУЛЯЦИОННЫй И НЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЯ АНАЛИЗ РЕСТРИКТНОГО ПОЛИНОРФИЗНА ГЕНОВ КАГАЛИТИЧЕСКОЯ СУВЬЕЛИНИЦЫ \а,К-АТФаии ЧЕЛОВЕКА

(13.00.15 - "Генетика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медициьских наук

Носква - 1991

, - / / / ( ' ; •

Работа пиполнена в лаборатории нолекулкрноЛ генетики Научмо-исслодопатольсксго института мозга АНН СССР.

Маучний руководитель: доктор биологических наук, про$. [2.Н.Гинлилкс.

0{ииичдьнис опчонемти': лектор пчдииинских наук Е.И.Ппари доктор биологических мл/г. и.А.Спицин.

Вс£>«ео учри*д«нио: Институт о6п<-<1 генитики АН СССР.

Запита диссертации состоится - 40 - ^М 1991 г

час на заседании Спицналиаироианного совета IД-001.16 .01)

Осесосэного научного педико-гикатнчоского центра АНН СССР (по адресу: 11^478, Москва, ул.Москворечье, 1).

С лмсссртдиисй нсщю (имлюкктис« о библиотеке Осесосэного научного нсдкко-гсиетичсского центра АНН СССР.

Автореферат разослан " ^ " ** 1991 года.

Учений сокрптдрь Специализированного сэсота доктор биологических наук

Л.0.Курило

ОЕЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАГ.ОТН

1 - •

I ^ .....:

| " .

}»иссартгции 1

—-Нагм-оявая работа относится к области функциональной анатомии гомона человека и пссвяцена изучении молекулярного полиморфизма о пределах генои каталитической альфа-субьолинииы .Ча , К-АТФази. Обцебиологический аспект ис<-««лопанви связан с задачами »волюци-онно-генетического анализа мультигемного сомейстмл одного из ключевых ферментов клеточных мембран, который обеспечивает поддержание ионных градиентов в живых клетках. Прикладной аспект исследования связан с эадачлни использовании молекулярного полиморфизма геноь как инструмента идентификации генетического сцепления в исследованиях гю картирование генома человека <ВоЬаЬе1п еЬ а!., 1980; Гиндклио, Ачаньес, 1982; 198-1).

Работа проведена с применением комплекса методов современной молекулярной биологин м генетической инженерии с целью выявления полиморфизма длимы рестриктных Фрагментов (ПДРФ) альф'-гинов Иа.К -АТФазы человека и использования этих ПДРФ в популяцнонно - гено-• тическом и семейном анализе. »

Актуальность проблемы.

Интенсивное накопление данных о разнообразии и популяциомной частоте различных ПДРФ в пределах того или иного хромосомного яо-куса, особенно значительное в геномных исследованиях последних лет, обусловлено двумя главными причинами. Прежде всего, о исследованиях по функциональной анатомии генома человека эти данные являотся основой накопления разнообразных коллекций колекулярно-гвнетичо-ских маркеров, предназначенных для реиения ряда важных задам картирования генома. Среди таковых можно выдалить как обцие, например, параметризации региональных генетических карт, так и прикладные), связанные с идентификацией и выделением геноо, ответственных за развитие тех или иних наследственных заболеваний. Эти задачи ре-

вается на основе анализа сцепления полосу лирни* маркеров (ПДРф) как мевду собой, так и с исследуемой наследственной патологией, и обычно использует накопленные ранее даннио о паранетрнэопанних генетических картах конкретных хроносон человека. Наконец, d попу-ляционно-генатических исследованиях данмио о ППРФ все чане и вире используется для реконструкции иикроэволвцмонных процессов. [1рн •той, выбор конкретной генетической снетепы для исследования характеризующих со ПДРФ определяется и ранних лабораториях разными причинами! нко*-да удобством того или иного гена или нуяьтигонного

г

семейства как модельном системы, но ча«о первичным интересом к анализу молекулярных механизмов регуляции конкретных физиологнче-оких процессов или дьториннаиин конкретных «ори патологии.

D случае настоящего исследования выбор семейства генов каталитической (ааьфа) субьединицы Ха.К-АТОазы человека САТР1-А1. -А2 и -АЗ гены! для поиска и характериэации ПЛРФ представлялся нам актуальный rto совокупности причин. Преядо всего, «то связано с возможный вовлечением функциональной недостаточности Ка,К-АТФаэы в гдиа-льных и кейроиальиых клетках коры головного мозга в механизмы раз-еития некоторых судоровнык состояний, на что указывали результаты подученные фиэиолого-биохиническиии методами (Крыяанооский, 1980; Woodburry et «1.. 1984; Grimr, 19661. Одно из исправлений в -исследовании «того вопроса как раз и состоит о использовании ПЛРФ альфа-гемо» Ма,К-ЛТфаэм для веряфмклиим лредлолоаемий о возможной генетической связи мевду недостаточностью данного фермента и некоторыми формами сулоровных заболеваний, О »топ смысле настоакая работ* полностьв соответствовав* основному плану фундаментальных исследований Института мозга АНН СССР. С яругой стороны, ко прении» планирований иастоявой работы фактические данные о иолекулярмом полиморфизме альфа-генов Ка.К-АТФазы были крайне фрагментарными,

а систем,этические популяционно-генетическио и семейные исследования случайно найденных полиморфных вариантов отсутствовали. С »той точки зрения целенаправленный поиск новых ЛЛРФ и дальнейшая их ха-рактсризация на популяционнои н семейной уровне рассматривалась нами как актуальная задача п райках нацнонлльной и обкемировой прог-ракпы "Геном человека". Наконец, уместно указать такле н на ТОТ немаловажный факт, что гонкая система На,К-АТФлэы человека была одним из еве немногих пока примеров, когда первичная физическая идентификация гена у челопека и его секвенироваиио осуасствлоны впервые ■у нас в стране (Овчинников, Свердлов и др., 1985-87), что существенно облегчало перпичнуи экспериментальнуо разработку вопроса о ПДРО указанных генов на основе оригинальных коллекций ДНК-эондов.

Цель и задачи работы.

Основная цель настояпей работы состояла в создании коллекции молекулярно-генетических маркеров мультигенного семейства каталитических альфз-субьедиинц \'.1,К-АТФазы человека и в попзгяяционно-геио-•тической параметризации выявленных маркеров. О соответствии с этой целью били обоснованы следуспие конкретные задачи исследования:

Создание холлекции ДИК-эондэв (как -кДНК-вых, так И генспеци-фических несодержапих ДНК-птэвторов геномных фрагнентов) для идентификации различных участков альфа-1,2,3 генов Ыа,К-АТФаэы человека.

2. Обоснование методических условий верификации истинных ал-лельных вариантов ПДРФ, исключавшие артефакты, обусловленные пополним гидролизом генонной ДНК, релаксационной активностьи эндоиуклоаз рестрикции и перекрестной гибридизацией кДНК- и гДНК-зондоа с разными генами одного мультигенного семейства.

3. Создание коллекции популяционних и семейных тост-панелей индивидуальных образцов геномной ДНК для идентификации и схринирозв-ния ПДРФ, к определение принадлежности обнаруженных ПДРФ к конкр®?-ному представители мультигенного семейства.

4. Определение по.'у ««ционних частот аялельнмх иариантов ПЛРФ, принадлсхапих альфа-1,2,3 гонам Н.», К-АТСапи человека, и тестирование возможной ассоциации этих генов с парциальными формами судороя-иых состояний (височной эпилепсией) как на популяционном, так и на сснсйнон натеркал«.

Научна« копиэка результатов.

Рид ррэудьтатог. настоиксго исслсвоиянна получены ьпприио и могут мспользоьатьск дли г.ослевуовмх оболвоний в области популицион-ЛОк анатомии генома чплоаска. Так, однозначно доказана принадлежность РчЧ-ПЛР» к 3'— облает и адифа-З гена ^,К-АТ«аэы человека. Так«« однозначно отвергнута иринаслпкность Ес1 13С II-ПДРФ к любому из альфа-1,?.3 грноо. Этот <-а.*т в совокупности с литературными данники й хромосомно-« локализации указанных геноь и Ес1-ПДРФ цозвоа«ет выдвинуть единое преаподокение о иядичии в геноме чадо-пек* (в частности, в хромосома 14) еки одного гена иди псовдогека каталитической субьеаинииы Ка.К-АТваэы (или возмоамо иных эволо-иионно родственных 6е*ков - Сл-АТ$»зи или Н,К-ЛТ4аэы). Показано, что ранее описанным п зарубежной литература ЕсоНХ-ПДРФ адьфа-1 геи* обусловлен недорострикииой гДИК и квдиотс« докипи. На собственном магормадл (лолудяииЬ и сенек) получена оиемхп лэпудаиион-кых частот адлельмых вариантов разных ГШ4«, примдлдевапих к уникальным ДНК-последолатсдьиостаи сдошного нуяьтигеиного самсйстьа. Впервые и» осмоьо прямого кояекулшрио-гснстмчоского анализа показано отсутствие ассоциаций П2Р0 в продажах «яьфа-1,2,3 генов Кл.К-АТО-вэи человека с парциальными «орлами судорожных состояний.

Практическая ценность работы.

Непосредственный практическим результатом работы кпдо-тсн создание комплекс* методических приемов и коллекций ДНК-оАразио» длк

детального изучения молекулярного полиморфизма нескольких генов мультигенного семейства каталитической субьсдиниии Иа,К-АТФаэи. Созданы, и частности: коллекция ДНК-эондое на различные участки альфа-1,2,3 генов (18 клонированных кДНК и гДНК фрагментов); по-пуляиионная коллекция индивидуальных образцов геномной ДНК человека (п* 30); коллекция популяционных тест-панелей блот-гибридизации многократного использования (для идентификации ПДРФ любого гена человека) для 27 видов эмдонуклеаз рестрикции (в отдельных панелях число индивидуальных образцоп гЛНК варьирует в пределах 9-60); иа-"бор семейных тест-панелей блот-гибридиэации многократного использования (23 образца гДНК для 4х рестриктаэ); коллекция индивидуальных образцов геномной ДНК больных парциальными формами эпилепсии (п= 25); предложен оригинальный метод отбора генспеиифкческкх пов-торнесодержацих ДНК-фрагментов из геномных клонов. Настоядая работа является практически первым и пока единственным в СССР прниерон

систематического исследования ПДРФ, принадлежащих нескольким уни-

«

кальнын.генам одного семейства, в популяционно-семейном и кямнико-генетическом аспектах.

Апробация работы.

Результаты работы доложены на VII Осесооэной около молодых психиатров (г. Суздаль, апрель 1^90г.), на VII съезда орачей Литовской Республики (г. Каунас, и«>нь 1990г.), на Первой Псесопзкой конференции "Геном человека" (г. Переслазль-Залеский, октябрь 1990г.), ма I -ом сьеэде невропатологов и психиатров Литии (октябрь 1990г.), на Второн сьеэде медицинских генетиков (г. Ална - Лта, декабрь 1990г.), на заседании Ученого совета НИИ мозга АНН СССР (март 1990г.).

Структура и обьем диссертации.

Диссертация изложена на 100 страницах нашшописного токста, включая рисунки, таблицы и список литературы. Состоит из пводопня.

и 4-х глав: обзора литературы, описания натсрналов и нетодои, собственных результатов, обсуждения, заклечения и выводов. Работа со-дерамт И таблиц и 17 рисунков. Библиография включает 111 источников, из них 20 отечественных и 91 зарубеяных авторов.

МАТЕРИАЛУ И МЕТОДЫ.

Обьекты исследования.

О качество объектов исследования п настоящей работе использованы образцы геномных ЛИК от здоровых индивидов (ri-СО). от больных височной »пилепсиий <п«25; обо группы из "московской" популяции) и ДНК 4-х литовских семой с повторными случаями эпилепсии (п«23). Группа больных височной апилепсией московской выборки детально обследована в ранках совместного исследования в нсьрологической клиника Московского медицинского стоматологического института (зав.ка-•фодрой меримых болезней про».В.А.Карлов, ассистент Г.А.Коваленко).

Материалы исследован*« .

Геномные клоны RS 30. SAGA 1, ARS 14. сов 1016. ВМ 1. R3-2, R85-1 «льфа-гимов t.'a, К-АТ+аэы человека, поянораэиарной кДИК вль-♦а-Х геи« свиньи |дСС 35, геиоспеци*ически* фрагмент 3*-конца аяь-♦а-1 геи« рО 7 дкбеэмо предоставлены Н.Е.Б^оуде и К.Е.Потрухинын из Нм-та Биооргаммческой химии ми.Вен«кмне АН СССР. Подиораэипр-маа кДНК адьфа-1 тема человека лвбозно предоставлен R.kcvenaon (Яадьскнй Университет, СБА). Подморазиермыа кДНК альфа-1,-2 и -3 гамоа Ма.К-ЛТФаэы крысы, « так«« ДНК-эонек. ьмавдавама ПЛРЭ и прадедах глиоа «дьфа-1 м -2, были предоставлены J.Lingrel «. C.Shull (Иадмииискаа вкояо Университета Цинциннати, СЯА).

Методы исследования.

. Ганоинуа ДНК из крови м органов выделяли по методикам, описанным ■ руководстве Наииатиса и др. (19S4) с частными модификациям.

Плаэмидчую ДНК выделяли по методу Birnboin a. Doly (1979) о отдельными модификациями, предложенными С .С.Скрябиным (1986). ДНК рокок-бинантных фагов выделяли по методике Забаровского и Турииой (1989).

Перенос ДНК осунествляли по Саузкрму о соответствии с те*микой вакууиного блотинга (Зайцев, Яковлев, 1983) п наше* модификации.

Немение ДНК до иысокой удельной активности (10"8*-10~9имп• /иии. мкг) проводили применяя случайную затраьку (Feinberij, Vogelsteln, 1903 >.

При подборе условий гибридизации нуклеиновых кислот и последу' соей отмывки использовали методику, предложенную Маниатис и др. (1984), Law et al. (1984) и обзор по теории гибридизации нуклеиновых кислот на твердой подложке (Meinkoth, Wahl, 1983).

ЛНК-фингерпрннты семейных тест-пан.елей получали по иетодика Vassart et al. (1987) с частными модификациями.

D статистическом анализе отдельных результатов ис: эльзовали стандартные методы обработки дискретных распределений н хи-квадрат •критерий (Урбах, 1964). •

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Исследование рестриктного полиморфизма геиов каталитической альфа-субьединицы Na,K-AT®a3u человека.

Трудности поиска ПДРФ, прииадлежацих отдельный элементан мультигенного семейства, особенно когда поиск основан на использовании клонированных полноразмерных кДНК, обусловлены наличием гомологии родственных нк-последовательностей и потону возможной перекрестной гибридизацией. Это требует определения принадлежности обнаруженного ПДРФ к конкретной? представителю семеЛства. Воэноклп и другая стратегия: сначала конструн, ится геи-специфическио фрагменты ДНК (несояеряааие ДН".-повтороз генонные или короткие кДНК-фрагнонти) И

затеи прополите« поиск ПДРФ. Применение той или другой стратегии зависит от конкретной задачи. При поиске ПДРФ генов мультигонного семейств« инаот смысл подобрать сначала информативные рестриктазы м выявить полиморфизм как таковой, а затем идентифицировать его прииадлекность к тону или иному элементу семейства. Напротив, при поиске ПДРФ конкретного гена в составе семейства выбор информативны* рестриктаз следует проиодить после отбора ген-специфических ДНК-зондов.

1.1. Поиск ПДРФ АТР1Л1 гот с генслеиифическим кЛНК-эондои (>В7.

ДНК-зоне pD-7 представляет собой генспеиифический З'-концевой 0.65 Кб фрагмент «ЛИК альфа-1 Ген* N*.К•АТФаэы свиньи. D работе с •тмм зондом вы использовали диагностическую тест-панель гидролиза-тов индивидуальных образцов гДНК, содерааввуе не немее 9 образцов, что поэволаат регистрировать с вероятностью Р > 9S4 полиморфный аллоль, популлцмонмла частота которого ие миле 0.1$. IU информативность проворены следуивие рестриктазы (всего 21)1 Alw44 I. ВаЫМ, f>911. Ii.jlll, 0ь|,К X , CI г 1 3 2. ЕсоШ , Есо32 I, Есо1<7 I, Ее 1136 XI, Hindi, Hindi 11, Kprtl. M»pl , Mval, Pad, P»tl, PvuII. Sau3A I. TaqI и Xbal. Ни с одно* из них не удалось выавить рест-риктиыб полиморфизм в предоллх алкфа-1 гон« человек«. Однако получении« результаты рассматривались манн «ав и с точки зрении одного из контроле* и« полноту рестрикции индивидуальных образцов геномной ДНК, поскольку на радиоавтографах выявлялись 1-2 (реке 3) но-иоиорфиие поноси гибридизации.

1.2. Поиск ППР» АТР1А1 гена с использованном генспецифически* ловториесодсраааих геиоинмк £ХК-зои*ов.

Сдедувак* »тап исследования состоад в попытке идентифицировать (ШФ С поиоаьв специфических к альфа-1 гону и несодервлвих повто-

рявжихся элементов ДНК-эондоь, выделенных из геномных клонов аяь-фа-1 гена человека RS 30 и SAGA 1. Эти два клона охватывает примерно 2/3 гена, начина* со 2-го экзона. (Первый «кэон ««много гена содержит всего лишь 9 нп, за ним следует длимый 10 Кб имт^он). Вставка в составе клона SAGA 1, покрываемая средиво часть гена протяженностью 18 кб, содержит на своем З'-концв участок длиной 8.4 кб, совпадаввий с V-концевым участком вставки в клоне RS 39, обаая длина которой составляет 15.4 кб (см. рис.1а,16).

Как известно, отбор ген-специфических ДНК-зондов, несодержа-•вих повторов, традиционно реализуется в несколько этапов (Shull et al., 1989; 1990). Сначала ДНК фрагменты (претенденты на ген-специфические зонды) проверяется на отсутствие в них повторяв-вихся нк-последовательмостей, для чего испольэувт результаты гибридизации этих фрагментов с меченой тотальной геионмой ДНК человека. Затем, отобранные повторнесодержавие ДНК-зонды гибридиэуотса с тест-панелями, содержавими полмув ДНК всех клонированных генов .соответствуюдего семейства с иельв проверки на генспоиифичиость. Ны считаем, что такой подход является недостаточно строгим, поскольку сегодня уже хоропо известно, что для больаой части гонов геном человека содержит доовльно много родственных последовательностей и часто не все они оказывается клонированными, что додает сомнительным выпод о генспецифичностн. Правда, последупио Сяот-гибрндизаиин с различными тест-панелями являотся своого рода проверкой ген-специфичности того или иного ДНК-эоидп. Так, наличие на автографе единственной полосы гибридизации (т.о. гонозиготноо сочетание аллелей) хотя бы для одного кндпанда и хотя бп на примере одной рестриктази является таким подтперздонлеп. Однако об-сее число проверочных этапоп при указанно» подходе окяечаат, как правило, не менее двух-трех нез^оисиннх влот-гибрндаэацпЛ, а в иных случаях и более.

Предлоиеннаа в я immoA работе стратеги« отбора генспецифичсс-ких ловторнвсодерваких ДКК-эондов является, на мая взгляд, и бола« быстрой (экономной), и более инфорнативной. Она состоит d следуввеи. Рестриктные фрагменты рег.оибинантных клонов фракционируется алектрофоразом в IV легкоплавкой лглроза. Отдельные фракции выделенных из агароэы «рагиеитов ДНК метили I321P с использованием случайной затравки, а эатеп проводили гибридиэаиио с тсст-паияляим, содарвааини по 3-4 образца фракционированных генонных ДНК-рестриктоя, полученных с той яе рестриктазо*. что и рестрикт-ные фрагменты роконбинантных клонов. Наличие на р.»диоаптогра{е единственной полосы гибридизации слуяило показателен гсмсппиифич-иости ДНК-зоида, а отсутствие 'внира* (сигнала гибридизации по всей длине доровки гДНК) позволяло считать, что соотвитствуваие ДНК-фрагионты роконбинантных клонов не содерват повторявкихся нук-леотмдных последовательностей. Таким образом, мы реваям задачу де-текиии ген-споиифических ДНК-зондов практически в один «тап, если считать их по чисяу бяот-гибридизаций.

На основа издоясммой методики были проверены EcoRI и Hindi II фрагменты выаеугюнянутых рекоибииаитмых кяомов ATPlAl-гена - HSJ8 п SAGA I. Геиспеиифичаскини и повтормчсодоряаяими среди них оказались сдедувзво фрагменты (рис.1*.б): для SAGA I каоиа четыре ГсоЩ фрагмента - 0.9. 1.3« 1.4 и 1.7 кб (они ие только почти подмосты покрывает, ко с S'-комца даяе перекрывает 4.6 кб HindiII фрагмент (АСА I кдоиа); a*« RS 38 кяона один EcoRI фрагмент 1.2 кб и три Hindi!! фрагмент« - 1.0. 2.0 и 2.1 к«; яда SAGA 1 каона - Hindi И фрагмент 2.0 кв. При «тон. последим* в обои« клонах явяаетсв под-иостьа идеитйчмым а силу «ж полного перекрывай«« как раз а данной овдаотк.

Рис.1. Отбор генспецифических посторнесолержаигя ДНК-фрагмонтов гена АТР1А1 человека.

(1а): Клон RS 38

З'-конец гона

II Н II II Н Н U П

////•••:......:---:-:.............................:-----:-/////

0.9 2.1 5.9 2.0 1.8

ЕЕ Е Е ___________1_____________' _____/////

4.2 1.2 5.2 3.7

(16): Клон SAGA 1 II II II Н 5'-коней гена

f I / ___________________1 1_____/ f [

3.9 0.С 2.0 4.6 5.6

Е Е Е Е Е Е Е

////•------------------------:-----:-----: - :•»»•• •••••///

3.8 3.7 0.9 1.3 1.4 1.7

Обозначения:

//// - плечи вектора (бактериофаг лямбда);

- сайт рестрикции определенной рестрижтазы, где Н - Hind III и Е - EcoR I;

•*** - фрагмент ДНК содержаний повторяющиеся последовательности; . _ - фрагмент ДНК, несодержапий повтороп.

Под каждой из 4х схем цифрами указаны длины фрагментов ДНК (о хС), После того как были установлены ген-специфические не содарва-аие повторов ДНК-фрагменты, все они были проверены а качестве зондов на детекцио ПДРФ. При этом, вез ч фрагмента из клона SAGAI метили изотопом и гкбр:зд:*зор,али з составе oSseft снеси (одна серия), з 4 фрагмента клона RS 33 - г з?угоЛ серии. Далее, с фрагномтапп клона SAGA I как с зондами на :;ифор!:атианость проварены слодуввиа растриктазы (всего 21): Älul, Г, Ег.тЛЛ, Bcnl, Dgll, Dglll,

BspRI, Cf г 13 I, Ecll3S II, Eco32 I, EcoH7.I, aincll, Kpnl, ИврГ, Mval, Pael, PntI, PvuII, £г,еЗА I, я Xbi.I; а о фрггязнтоня ess

клона RS 33 почти гнагогнчнкй кгЗс-? рввтриктаэ (псаго 23)8 BanHI. Bgll, Bglll, BooSi, 3sul20, Cfrl3 3» Drei, ScliSS 13, 2co£7 Z,

Ecol 47 I, HlncII. Vjml , M»j>I , Ncol , Ndel, Pael, Patl. PvuII, Sau3A I, TaqI и Xbal (в обоих capii« подчеркнуты зндонкясазы, использовании* только в одно* из двух серий). Do всех 43-х опытах какие-либо полиморфные рестрикты • пределах изучаемого АТР1А1 гена не выявлены (и как обычно в данной работе, каиаая из диагностических тест-паиеяей бяот-гиьридизауии содеряала на немее 9 образцов индивидуальной ГОНЮ .

1.3. Поиск ЛЛРФ альфа-генов К*,К-АГФаjy с использованием кЛИК-ATf'lAl зонда.

Как указывалось пыяе, трудности интерпретации картин гибридизации с кДНК-эоидон на какой-либо из iеиов, принадлеяаяих одному нультигенноиу семейству, саазани с потенциально возможной перекрестной гибридизацией. Однако и «тот подход моает быть продуктивным, когда в наличии имеются к локированные ЛНК-пос. ледовательмости 1как В виде полноразиерних кЛНК, так и ■ вид« «»ионных клонов) других родственник! геном. Иначе говор«, если все яти ДНК-зоиди используется как взаимные контроли. Так, в случаях, когда по предвари-Теяьным данный установлены признаки полииорфизиа, варьируя условиями баот-гибрианзяции и отиывки фильтров с разными меченными кднк-эоиданн, по усиление-ослабление полиморфных полис ноямо сделать предварительны* выводы о возновноя прииадаеяиости полиморфного фрагмента к тону или ииону мз яяеиемтов семейства. Посяедуваее использование коротких субкяоиврооаиых фрагментов кЛИГ. в качестве ДНК-зоида. гибридизумого на тек ве фильтрах, позволяет дать окончательный я однозначный ответ и* вопрос, в какому гсиу относится сь-иаруаеииы* рестрнктмый полиморфная.

Аналогичный образом иоаио применять и геномные кдоиы. I«дрояи-аатн исходных ДНК-клонов генов нееяедуеиого семейства «полученные

после обработки информативной для предполагаемого ПДРФ рестрикта-эой) Фракционируются гиль-электрофорезои и отбираются те ДНК-фраг-иеиты, дчима которых соответствует длине полиморфных полос на радиоавтографе. После введения изотопной метки в такие фрагнонты они *

используются п качестве ЛНК-эондои для гибридизации на фильтрах с гидролизлтами гДНК, получинныли обработкой информативной рострикта-зой. D случае успноного 1>ибора ДНК-эонда на радиоавтографе ожидается картина с одной полосой гибридизации » альтернативных гомозиготных сочетаниях или с диунц полосами в гетерозиготном варианте.

Руководствуясь изложенными соображениями, мы попытались обнаружить ПДРФ и АТР1А1 г«гн«, используя в качостим ДНК-зонда полнораэ-пернув кДНК »того ггна из генома свиньи (г.лои f>GC 35). к ДНК-вставка »того клона имеет протяженность 3.2 кб и обладает 90\ гомологией с соответствувяей послелонатпльностьв кДНК человека. Для поиска полиморфизма использовали следуюпии рестриктазы (всего 27)i AluI, Alw44I ПаЫИ, Boni, íi.jll, H.jlII. Unj.ni. Cfrl3I, Dral, EcoRI, Eco33I, Eco47¡,

Ecol 4 7 I, Fe 1136 II. HincII. HindUI, K(>nl. M«pl, Uval, Ncol, Ndel,

>>

Pj«?I , Patl, Pvull, Sau ЗА I, Та>|! и Xbal, а также стандартнув диагностическую тпет-панеяь гидролизатов индивидуальных образцов ГДНК. Ни п одном из исследованных случаев полиморфизм по какой-либо из мажорных полос, мрчдподо«нто*ьно принлдлежаних Гену АТР1Л1, на был обиару жен.

Однако в двух случаях после более длительной (4-х суточной) экспозиции радиоаптографов тест-панели гидролизатов ГДНК, полученных с рестрмктаэаии Cell 36 II и Pntl, выявили минорные полиморфные полосы, >нли] принадлежности которых к определенному гену изучаемого семейства явился самостоятельным этапом работы.

1.3.1. Верификации обнаруженных НДРФ.

За истинность полученных ПДРФ свидетельствуют три основные группы фактов.

1. Полноту рестрикции индивидуальных образцов гДНК в тест-панелях проверили по гибридизации с несколькими описанными выпе ген-специфическини ДНК-эондани на АТР1Л1 ген: клон рВ7 и по 4 фрагнен-та иэ клонов БАСА I и КЭ .38; во всех этих случаях на радиоавтографах выявлены одна или две (реке три) мононорфние полосы.

2. Результаты оказались поспроизьодиными в двух отновениях:

а) при гидролизе одних и тех же образцов гДНК в меняваихся условиях рестрнктаэной обработки параметры полиморфных (как и констант-") ных) полос гибридизации остается неизменными;

б) картины полиморфиана в диагностических и популяционных тест-панелях были идентичны (в случае популяинонной тест-панели исследовали не ненее 30 индивидуальных образцов гДНК).

3. Было показано кодоминантное наследование полинорфных аллелей в 4-х семьях с тремя поколениями. При этом все сепьн были предварительно тестированы на исключение ложного отцовства методом ДНК.-фин-герпринтов с нннисателлитнын ДНК-эоидом - нативнын фагон Н13. В случае Рв11-полииорфиэма информативными для установления кодонинантно-го наследования оказались все четыре семьи, а в случае Ес1136 II

-ПДРФ - три сеньи.

1.3.2. Определение принадлежности Рв^- и Ес1136 Н-ПДРО.

Определение принадлежности установленных ПДРО проводияи в несколько этапоа, последовательно исключая различные элементы иесяг-дуеного культигенного семейства.

1. С поновдыэ полнораэнерного кДНК-эонда гена АТР1А1 человека былг исключена с большой вероятностью принадлежность обоих поля-

норфизнов К аЛЬфа-1 гену, поскольку U ИеСТКИХ условиях отмывки фильтров полиморфны*; полосы г ипри л и заци и исчезали.

2. Использовали т а к к е доступные геномные клоны альфа-2- н аль-фа-3 генов (соя RC 1010 и AHS 14 для ATР1Л2 гона и клони RC 5". 1 , ЯМ 1 и R 3-5 алы ЛТР1ЛЗ ге н а; по втором случая три клона ня охпа-TuiijTuiiaoT ливь 1/С часть и З'-кошичюй области гена - с 19-го по 23-й экзчн>. Предварительно РнС1- и Гг!13Г> I I-гидролииаты ДНК из этих клонов фракционировали re л ь-5 лек г рофороэом и с учетом рест-риктной гарты нативмого вектора отбирали фрагменты (Л7Р1Л-встав-ки) с длиной, coo гветствуьаси полиморфным аллелям ПЯРФ. Эти фрагменты исоользопали пагем как ДНК-зонды для 6лот-гибридизании с гДНК в Pit t- и t'.;113<> 11-диагностических тест-панелях. Проведенные данным образом контрольный опыты показали, что исследуемые фрагменты ал».фа-2 и альфа-З генов лапт сигналы на радиоавтографах, соотво7ствунаи« номоморфмыи фрагментам, а не ранее обнарухем-ным п >:ой работе: полиморфным аллелям Го! 2 36 II и P«t 1-ПЯРЬ.

Таким образом, данные второго »тапа позволяет с определенной вероятностью исклпчить такае и «дьфа-2 ген в качестве вознохного элемента, с которым сцеплены выявленные нами P»tl- и Ес1136 II-ПЛРФ. Однако альфа-3 ген в этом отиовении "нельзя исключить с такой во стгпены) уверенности, поскольку использованные геномные клоны не охватывали его полностьо.

3. Следуппий »ran состоял в использовании полноразмерных кДНК-клэноп адьфа-2 и альфа-3 генов №а,К-АТФазы крысы. Однако прекда, мен перемти в описание эксперимента и обсукдемио его результатов, уностио обратиться к работе lUrley et al. (1980), о которой с по-моаьо клонированной АТР1АЗ-кД|1К человека были идентифицированы по-видимому идентичные Patl- и SacI-ПДРФ, которые использовались затем для проверки воэиоиногс генетического сцепления Гама адьфа-З

субьединиии Na,К-ЛТФаоы'с генон мистонической дистопии. Предпосылкой для такой постановки залами служили данные о теснон сцеплении локуса НД с некоторыми молекулирно-генетическини наркерами 19-й хромосоны и, с другой стороны, данные о локализации гена АТР1АЗ в той же хромосоме. D ходе исследования авторы обнаружили два диал-лельных полиморфизна: РяП-ПДРФ с аллелями А1> 2.0 кб (популяцион-ная частота р- 0.4) и А2- 1.5 кб <ч = 0.6), а также SacX-ПДРФ (изо-яизомер нашей ЕсПЗб II) с аллелями D1 ' 2.5 кб <р = 0.7) и £32« 1.3 кб (cj = 0.3). Несмотря на многочисленость полос гибридизации на ра-'дноавтографах в обоих случаях ПДРФ, т.е. очевидную перекрестную

гибридизаций, авторы не проиодили специальную оерификацив принад-

)

лекности найденных^ПДРФ к конкретному представителе нэучаеного се-сеиейства, считая, что их принадлежность к альфа-3 гену доказывается послед'увыин анализом сцепления с генон ниотонической дистонин и другими наркерани 19-й хромосомы. При этом, оказалось, что оба ПДРФ обнаруживает значимо различнув степень сцепления с ДНК-марке-рани в этой хромосомной участке. Однако очевидно, что, если оба полиморфизма относятся к одному гену, то степень сцепления их с одними и тени же маркерами должна быть практически одинаковой. Правда, авторы указывает на тот факт, что'SacI-ПДРФ D исследованном ини сенейном материале оказался мало информативным, что ногло занизить оценку величины сцепления. Между тем, вызывает сомнение прежде Dcero сана стратегия исследователей - подтверждение принадлежности ПДРФ к альфа-3 гену анализом сцепления. Таковое является ливь вероятностным, не говоря уже о тон, что в генетической окрестности данного локуса могут находится eue и другие, пока невия»-ленние, близкородственные представители семейства, в пределах ко-орих ногут локализоваться один или оба найденные ПДРФ.

Учитывая изложенные факты и соображения, ни полагали необходи-

huh осувествить детальную верификацию принадлежности обсуждаеных ПЛРФ. Bo-nepnux, нм гибридизовлли Pstl- и Пс1136 II (SacI)- тост-панели гЛНК с полноразнернцни кДКК-эонлаин альфл-2 и альфа-3 генов крысы. Оказалось, что кДНК альфа-2 гена не выявляет полиморфных полос гибридизации в обеих панелях, что исключает принадлежность об-сукдаоиых ПЛРФ к данному гону. Такой ко результат - отсутствие полиморфна.ча - имел место и в случае гибридизации EcI13C II тост-панели с кЛНК альфа-3 гена крысы.

Лмш» на радио.hit'.»графе Pat I-т^ст-панели выявились те же самые 'полиморфнцо полосы гибридизации, что и в первоначальном случае, когда в качестве ЛНК-зонда ми использовали печенную кЛНК альфа-1 гена свиньи . Г>тот результат позволял предположить, что PntI-ЛЛРФ действительно принадлежит ЛТР1АЗ гену в 19-й хроносоие. Окончательное доказательство атому было получено после проведения сории гибридизаций на топ же фильтре, когда в качество ДНК-зонда ни использовали клонированные субфрагненти кЛНК альфа-3 гена. D частности, меченный 0.4 кб РиН-Dg 111 фрагнент ДНК с 3'- конца этого гена оказался гем-спеиифичискин зондом, выявляюцин pktI-ПЛРФ: в зависино-сти от гомозиготного или гетерозиготного сочетания аллелей на радиоавтографе выявляется одна или две положи гибридизации.

Что же касается ЕсНЗб IZ-ПЛРФ, то его принадлежность остается невыясненной. Совокупность фактов об этой полиморфизме (локализация в 19-й хроносоие, но наличие линь слабого сцепления с альфа-3 геноп, а также неидентичность ого какому-либо нэ известных генов каталитической суб».едииицы Na,К-АТФази> с больной вероятностью указывает на возможное существование в той хе 19-й хроносоие спс одного пока «'.¡идентифицированного гена (или псевдогена), при-мадлеиаяего сснейству каталитических субьединнц данного фермента.

1.4. Исследование ЕсоЯ1 -"г.олн¡юрфизна" АТР1А] генй.

Ранее СЬеЬаЬ еЬ ! . (1987), исг.ольэуя 2.2 кб субфрагмент кДНК АТР1А1 гена человека, идентифицировали и ЕсоГП-тест-панели гДНК полиморфную 6.5 кб полосу гибридизации (у одних индивидов она присутствовала, у других отсутствовала). "Полиморфизм" сочетался с тремя константными Фрагментами: 1.5, 3.6 и 5.0 Кб. Поскольку строган верификация обнаруженного факта, как и стандартный семейно-ло-пуляционная параметризация полиморфизма, авторами не проводились, мы считали необходиним сначала верифицировать описанный полимор-фиэи. С ¿тон целью использовали изготовленные нами популяцнонные

и семейные тест-панели ЕссШ-гидролиэатов гДНК и гибридиэоваг.и их,

>

с неспецифическим Д)!к-зондом - полноразмерной кДНК АТР1А1 гена человека. Оказалось, что после полного гидролиза образцов гДНК (с длительностью гидролиза не менее 1С часов и с 10-кратным увеличением нагрузки рестриктаэой), полинорфная 6.5 кб полоса гибридизации исчезает, хоти в некоторых случаях выявляются "следы" этой полосы. Не было обнаружено 6.5 кб полосы на радиоавтографах и се-нейных тест-панелей. Таким образом, можно утверждать, что описанный а работе СЪеЬаЬ еЬ (1988) ЕсоШ-полиморфизм АТР1А1 гена является скорее всего артефактным, возникаюаим по причине неполного гидролиза гДНК. В ходе настояцего исследования мы также встретились с фактами ложного.полиморфизма, возникающего по другим причмнан, а именно е> связи с так называемой релаксационной активностью некоторых рестриктаэ, в частности, для эндонклуаэы ЕсоШ.

1.5. Популяционно-генетическая параметризация ПДРФ, принадлежащих альфа-1/2/3 генам ^,К-АТФаэы.

На этом этапе работы мы репали две самостоятельные, хотя и частично свяэаные между собой, задачи: (1) определение нолуляционних

- 1-5 -

частот аллелей каждого ил выявленных здесь или описанных ранее мо-лииорфилмои трех альфа-генов N.i, К-ЛТФа эи человека (на материале "нос конской" популчции; и (21 ср.тмен.ие аллслышх частот ПЛРФ в выборках ллорпиих индивидов и больних вигочнои лпилепсией (вторая группа также и» " им-кшн' к -н" популяции). Гели первая ил лтих задач Имеет При И.ЧО I Ой Ii'.'м [ .ПИИГИН ГиН^ПШЛ »CC.lf.VtlMHilr! в основном JKJ-дсиичсскии интерес k.ik ;,i;.i.ii(*iiari: расширение г, тичс: кой блли в области популяционний .пмтопки гином.1 человека, то !>с втором случае ки преследовали чист.-- "p.i к т ичес; к уь иель - г.^имип, возможную ассоциацию какого-то hj п."»'-1? то:'и или иного a.ibv.i-retui с вис.очной л:н-лппсийй. Понятно, ч г о I, ■ I м но f. е <> ii факт уста моилення Такой ассоциации еие нр'.;иает лначмо прс-^л^ии возможном генетической спиЛИ наруяений N'a . К-АТС-.jи г; височном »пилепении. Однако его наличие ногло бы послужить Питии 'iKCneptmuHTu л ьной основой длд последующего нолику Л Я рно-г Iill-T И ЧеСКОГО аНаЛИЛа ЛТОИ патологии.

I) таблиц»: 1 приш лыми получении« ними jaimui: о распределении

гонотипов и аллелышх частот нескольких [;ДРФ-систеи изучаемых Ге-

■ г

нов в группах здоровых » больных височной эпилепсией.

Как следует ил результатов статистического оценивания (данные последнего столбца), для 4-х исследованных ПДРФ трех альфа-генов Na, К-ЛЮалы по крайней пере в "московской" популяции фактические различия нежду группами здоровых и больных височной эпилепсией по алледьнын частотам изученных ПДРФ-систем не являются значимыми: для 1-ой строки прямая оценка вероятности нулевоЛ гипотезы по формуле вивера (для модифицированного хи"2 критерия при налых частотах) дает значении р - 0.20, что явно выое граничного значения р» 0.01, л в трех остальных случаях величина хи~2 статистики явно моиьяе се 954-граничного значения 3.04, что также соответствует j>(Ho) определенно бот.ас 0.05. Слсяопательно, с позиций маднко-

го -

Таблица 1. Распределение генотипов и аллельных частот ПДРФ альфа-генов <\'а, К-ДТФазы среди здоровых и больных височной эпилепсией.

Распределения индивидов; контроль/эпилепсия

! по генотипам ! частоты всего ! 1-1 1-2 2-2 .' аллелей

хи-квадрат или Р(Но)

АТР1А1 Од 1 И-ПДРФ: 29/24 26/23 2/1 1/0

АТР1Л2 Пд1 11-Л ПДРФ: 30/26 19/19 11/7 0/0

АТР1Л2 Од 1 II-В ПДРФ: 30/26 24/18 6/0 0/2

АТР1АЗ Ра1 I-ПДРФ: 43/23 25/12 14/8 4/3

р(1)-- 0.93/0.98 Т(2I= 0.07/0.02

р<1> = 0.82/0.87 Ч<2) = 0.18/0.13

р(1)=0.90/0.81 4(2)=0.10/0.19

Р<1>=0.74/0.70 ч<2)=0.26/0.30

р (Но) = 0.2

хи~2 = 0.92

хи"2 = 1.32

хи"2 = 0.15

генетической цели анализа нокно Ъделать вывод об отсутствии значимых ассоциаций изученных ПДРФ структурных генов фермента с рассматриваемой патологией.

В ранках иной цели анализа - популяционно-генетической - целесообразно провести объединение индивидов'иэ двух групп, поскольку по аллельным частотан изученных ПДРФ эти группы можно рассматривать как выборки из Одной генеральной совокупности. В таблице 2 представлены сумнарные данные о популяционних аллельних частотах изученных ПДРФ и соответствующие ин величины показателя информационной "мощности" полиморфизма (показатель Р1С; Е^8Ье1п еЬ а1., 1980).

Из представленных данных следует, что с позиций картирования генома человека и задач анализа сцепления не все из этих ПДРФ является вполне эффективными маркерами. К таковым нокно отнести по-

Таблица 2. Популяционные частоты аллельных вариантоп ПЛРФ трех альфа-генов N'a , К-АТФази человека,

ПДРФ Аллели - кб Полу ляииомн.) я

Геи (псего (число частота PIC

хромосом) хромосом)

АТР1А1 D<j III -Л Л1 - ■ 14 . 0 <101) 0 . ,9'>3 0, .086

5'- конец » (106) л 2 - • 11. г ( 5 ) 0 . 047

АТР1А2 Dcjl I I -Л Л1 • - 8, . 0 ( 94 ) 0 . 8 39 0 , .252

5'- конец (112) Л 2 - • 3. ,3 ( 18 ) а. 161

AT Р1Л 2 Dy 111 - В U1 - . 3 ( 061 0. 857 0 , 4 °

3 * - конец (112) П2 - ■ 10, г , J : if>) 0. 143

АТР1ЛЗ Pst!-Л Л i - . ;> ( 96) 0. 727 0. ,318

3'-конец (132) Л 2 - 1, ,3 ( 36) 0. 273

АТР? Ее 1 1 30 -S.ICI AI - , 5 ( 39 ) 0. 0 . 358

" ( 6 2) л: - 1 ,7 ( 23) 0 . 371

* исследована толигс группа злороиих

сути лит. те, у которых знамени*! покупатели ¡'1С npeuuy.uit величину 0.3, г.в 2 из 5 изученных. Это PscI-naPî и З'-области АТР1АЗ гена (PIC- 0.32) и S.icî-ПЛРФ (PIC' 0.36) с неизвестной принадлежность» к какому-то локусу ипроятно и той хо 10-Й хромосома. Опрп-дслонно попсе зф4е*"; ипныни является оба 0<jlII-ЛДРФ на разных концах А7Р1А2 Гена IPIC г» пределах 0.20-0.25), н явно мало эффективным - l>9III-ПЛРФ о 5 ' -области ATl'IAl гена (PIC' 0.09).

Следует tjkh'j отмитнгь, что лля всех изученных ПДРФ ни было обнаружено значимых отклонении частот генотипов от теоретически олизаемих для pjunciirrrtiod популяции I по закону Хардм-Оайнберга ) .

D зак.-пченио считаем полезным привести здесь в таблице 3 суммарные данные о коллакцн* использованных или сконструированных в ходе настояаей работы ЛНК-.юндоо на семейство альфа-гемов каталитической субьекинииы Na.К-AT^aju челоапка.

i.iiwiiui.i У. Коллекции клонен ДНК-эсндси на ATPlA-гени человека

I ен , обьект, область Клон Источник No Характеристики ДНК-зондов

альфа-1 АТР1- ген человека

">' -область АТР1 Л 1 Shu 11 &: (1) гДНК 1.0 кб

40-1-7 Genomics (), Sau3A/EcoRI

451-460, 1990

средня я SAGA I Свердлов и др ( • ) гДНК 18 кб

часть i ИСОХ АН СССР) SalCI

Пятронис и др i 2) SA-EI/ГДНК 0, ,9 Кб

I- наст . исслед . ) (3) ЗА-Е2/ГДНК 1. .3 Кб

( 4 ) SA-ЕЗ'гДНК 1, . 4 Кб

( 5 ) SA-E4/гДНК 1, ,7 Кб

3'-область RS 38 Свердлов и др ( • ) гДНК 15.4 кб

Í ИЕЗОХ АН СССР) Sa 1GI

Пятронис и др ( 6 ) RS-E)/гДНК 1 . .2 Кб

(наст.исслед. ) (7) RS-iU/гДНК 1, .6 Кб

(8) RS-H2гДНК 2. ,0 Кб

(9) RS-НЗ/гДНК 2, ,1 Кб

цолноразмер- ЛТР1Л1 Emanuel £.: (10) кДНК 3.3 кб

н.,я к ДНК Mol Cellul Biol HindIII i

0 9, 3744-49, 1989

<»льфа-1 АТР1- ген свиньи: •

полноразмер- f.GC 3 5 Монастырская и (11) кДНК 3.4 кб

ная кДНК др, Биоорг.хим. Pstl

N1, 20-26, 1987

31-область рВ 7 Свердлов и др (12) кДИК 0.65 кб

(ИБОХ АН СССР) Pstl

альфа-2 АТР1- ген человека: .

5'-область cosRCl6-10 Свердлов и др (») гДНК 37 кб

3'-область ARS 14 - " - ( * ) гДНК 15.3 кб

(оба SalG I)

5'-область АТР1А2 Shull &: (13) гДНК 2.5 кб

6-2-3 J Biol Chen,264 , EcoRI

3'-область АТР1А2 17532-17543, "I 14) гДНК 0.6 кб

30-2-6 1989 EcoR I

альфа-.З АТР1- ген человека:

5'-область RS 5.1 Свердлов и др С) гДНК 17.8 кб

средняя часть RM 1 - и — (*) гДНК 12.4 кб

3'-область R 3-2 - и - (*) гДНК 15.8 кб

(все SalG I)

ДТР1-гены крысы:

полная кДНК АТР1А1 Shull &: Bio- (15) кДНК 3.6 кб

полная кДНК АТР1А2 chemistry , 25, (16) кДНК 5.0 кб

полная кДНК АТР1АЗ 8125-32, 1986 (17) кДНК 3.5 кб

(все Pst I)

3'-область АТР1АЗ Пятронис и др (18) кДНК 0.4 кб

(наст.исслед.) PstI/BglII

В последнем столбце цифрами в (. зованные в данной работе, и (*) торами, требующие реконструкции

.) обозначены все ДНК-зонды, исполь-- клонированные фрагменты с ДНК-пов-для применения, их б качестве зондов.

пиполи

1. На примере исследования маги ПДРФ, принадлехааих. трем ко-дируюяич генам иг» семейства каталитических альфа-субьсдиииц N'a,K-АТФазы человека, разработана совокупность методических приемов поиска и иернфикаиии ПЛРФ уникальных генов, пходяцих и мультнгемное семейство:

1.1. Обнаружены дна оригинальных диаллельных ПДРФ: по ре-стриктазам Pst. I и Kcl 13G II; при зтом , о,- на нами дока принадлежность PstI-ПДРФ к j'-области АТР1ДЗ гена и искличена принадлежность Кс i : 36 I I-ПДРФ >. паьопу из ДТР1Л1/2/3 гкиол;

1.2. Учитывай литературные данные о хромосомно.! локализации SacI( Eel 136 I:)-ПДРФ и 15-й хромосоме; и собственные результаты, что jtct полиморфизм lie otiiochtcí к ДТР1Д1 / 2' 3 генам, хоти бил идентифицирован с помощью ДНК-зондои на ЛТР1А-гены, выдвинуто предположение о иаличии ь этой хромосоме ese одного гена (или псеодсге-на) альфа-субьединниы Sa, К-АТСа.'ш или иных эиолицисннэ родственных белков (С.ч-АТФази, И , К-АТФазы i ;

1.3. Показано, что описанный и литературе EcoRI-ПДРФ ДТР1А1 гена является с бодьаой вероятностью ложным, будучи результатом неполной рестрикции гДНК, а 'также показана роль релаксационной активности ЕсоГ<1~эндсмуклеази в симуляции других EcüRI-подиморфизмов.

2. Дли "московской" популяции впервые определены популчцион-ике частоты адлельных вариантой г.ятн ПДРФ, арннадлеханих трем альфа-гонам Sa , К-л'фа эи человека; д.- я этого нультигенного семейства Г.одуччиниг neny г. í циомно-:чне г ичесг и с характеристики ПЛРФ является наиболее полными и надежными » сравнении с фрагментарными литературными данными по другим поп улацик и.

3. На основе сравнительного анализа распределений аллельних частот ь группах jsop(mux и больных височной эпилепсией показано

отсутствие ассоциации ПДРФ, иринадлажацих альфа-1/2/3 генам Na,K-АТФаэы человека, с височной формой эпилепсии.

4. Соэданч коллекции популыииониых (и семейных) тест-панелей индивидуальных образцов геномной ДНК человека по 27 различными ре-стриктаэан (отдельные панели содержат от 9 до 60 образцов гДНК), пригодных для идентификации и скринирования ПДРФ любых уникальных генов человека.

5. Создана коллекция ДНК-эондов как кДНК-вых, так !i в виде ген-специфических несодеркацих ДНК-повторов геномных фрагментов (всего 18 ДНК-npoP) для идентификации ПДРФ в различных областях трех альфа-генов Na,К -АТФаэы человека.

>

4

На эаанту выдвигаются следующие положения:

1. Выявлен t>stI-nflP$, относящийся к 3'- области АТР1АЗ гена, а для выявленного Ес1136 II-ПДРФ исключена принадлежность его к любому иэ АГР1А1/2/3 генов.

2. В хромосоме 19 кроме АТР1АЗ гена сувествует еве один, ген или псевдоген альфа-субьединицы Na.K-АТФаэы или иных эволюционно родственных белков (Са-АТФаэи, (I,К-АТФаэы).

3. Для "московской" популяции иэ известных на ссгодняании- день нолекулярно-генетических маркеров на ATPlA-гены наиболее эффективными являются PstI-ПДРФ в 3'- области АТР1АЗ гена (Р1С= 0.32) н ЕсПЗб XI-ПДРФ с неизвестной принадлежностью (Р1С = 0.36), средне-эффектив-ныни - оба BglII-ПДРФ на разных концах АТР1А2 гена (PIC в пределах 0.20-0.25) и надо эффективным - BglII-ПДРФ D 5'- области АТР1А1 гена (PIC« 0.09).

4. В изученной популяции ассоциации ПДРФ, принадлежащих альфа-1/2/3 генам Na,K- АТФазы, с височной эпилепсией не выявлены.

Список работ, опубликованных по тене диссертации:

1. Пятроиис A.A. Молекулчрмо-генетические подходы к исследовании наследственных зг.нлепсий // Тезисы докладов 1-ого сьезда невропатологов и психиатров Литвы.- Каунас. 1990. - С.89-91.

2. Пятронис A.A., Муслинов H.A., Зеликович А.Д., Щукин H.H., Гиндилис D.H. Исследовании молекулярного полиморфитма гена каталитическом альфа-1 субьединицы Ха.К-ДТОазы человека // Тезисы докладов 11-ого Ococoddho.-o сьезда медицинских генетиков».- Алиа - Ата,1990. - С.3 66-367.

3. Лягроннс A.A. Популиционнио исследования рестрикт!ЮГО полиморфизма геноа каталитической альфа - субьединицы N'a.K- АТФазы // Тезисы докладов VII-ого сьезда врачей Литвы.- Каунас, 1990.- С.175.

4. Лигроине A.A., Нуслимов H.A., Гиндилис D.M. Поиск ПДРФ в мультигеннэи семействе на примере альфа-генов N'a,К-АТФазы человека // Первач Всесоюзная конференция "Геном человека".- Москва, 1990.- С.178-179.

I •

'.ахял n:i Т*;ыж ICC