Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Алкогольдегидрогеназа в алкогольной мотивации и поведении белых крыс (инверсная иммунорегуляция).

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Алкогольдегидрогеназа в алкогольной мотивации и поведении белых крыс (инверсная иммунорегуляция)."



МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. И. В. ЛОМОНОСОВА

БШЛ01 'ЯЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах ругаписи УДК; 612.017:577.175. 8

«кдорсач кпшл ияаяшш

Ахюгольдчэпдрогенава в алкогольной мотивации поведении белых крыс ( ни вере пап ишунорегуляцня).

(03.00.13 - физиология человека и животных)

Автореферат диссертадаш на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Шсква - 1993

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и швотяых Биологического факультета МГУ им. Ломоносова (еав. кафедрой - акад. РАМ. профессор Й- П. Ашарда).

Научные руководители: академик РАМН, профессор К. И Ашарм. кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Р. А. Дат лова

Официальные оппоненты; Ковалев И. Е. - доктор медицинских нау»

профессор.

Сухова Г. С. - кандидат биологических наук, доцент; .

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии Наук.

Защита диссертации состойся "^ЬдеЮлбря 1993 года на заседании специализированного Ученого Совета 11053.05,35 Биологического факультета МГУ мм. Ломоносова (117234, Шгква, Ленинские гори, МРУ, Биологический факультет).

Автореферат разослан ноября 1993 года.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета имени Ломоносова'

Учений секретарь специализированного совета кандидат-биологических наук

Умарова Б. А.

Обеая характеркстмса работы

Актуальность теш. В течение последнего десятилетии формируйся новая стратегия длительного изменения физиологического и биохимического статуса животного организма, активно разрабатываемая акад. И. И Ашмариным (см. обзоры Ашмарии, Го мазко в, 1689; Лшмарин, [рейдлин, 1989; АзИтапп, (Зотеекоу, 1992). Она основана на возможности активной иммунизации животного к определенным биорегуляторам и ключевым энзимам. При этом возможна иммунизация против иобого собственного, гомологичного биорегулятора (в том числе шзкомолекулярного), если он ковалентно сопрякен с гетерологичным отигеном-носителем. Активная иммунизация против гетерологичного Зиорегулятора (энзима) молет привести к появлению антител к собственному биорегулятору (ферменту), имеющему общие антигенные детерминанты с гетерологичным антигеном. Возникает длительный аутоиммунный процесс, в результате которого в течение многих меся-дав вырабатываются антитела, способные специфически связывать иэ-5ранный эндогенный регулятор, т.е. создавать ситуацию, когда перманентно снижается концентрация данного эндогенного регулятора. Три реиммунизации длительность такого состояния может измеряться 'одами.

Физиологическими (и биохимическими) следствиями такого состояния являются стойкие изменения ряда физиологических протестов, с которыми прямо или косвенно сопряжен избранный регулятор (фермент). Иммунизированное таким образом животное п ре летания ет собой весьма перспективный для исследования объект, в котором прицельно подавлена определенная система регуляции или одна га систем метаболизма (Солее прицельно, чем при таких операциях

как удаление желеа внутренней секреции, участков моага, применении ингибиторов ферментов). За исследованиями такого рода стоит и более отдаленная перспектива разработки иммунологических методов коррекции определенных физиологических процессов в организме больного человека, например, в случае хронического алкоголизма.

Известно, что активность ключевых ферментов метаболизма едкого ля, алкоголь- и адьдегиддегидрогеназы, во многом обуславливает чувствительность к этанолу, играя определенную роль в механизмах формирования алкогольной зависимости. Недостаточная разработка вопроса о роли алкогодьдегидрогеназы (АДГ) в этом процессе во многом объясняется отсутствием методов направленной и избирательной регуляции активности АДГ у подопытных животных. Широко использующиеся в экспериментах щ vitro ингибиторы аякогольдегиД-рогеназы не могут быть успешно применены в силу широкого спектра и кратковременности их фармакологического действия. Использование метода инверсной иммунорегуляции позволяет решить эту проблему.

Основные задачи исследования- Целью настоящей работы прежде всего являлась возможность получения в эксперименте длительной и избирательной регуляцик АДГ ir» vivo, используя метод инверсной иммунорегуляции, а таклк изучение влияния подобной регуляции на уровень потребления алкоголя животными в условиях свободного выбора между раствором этанола и водой. Конкретными задачами работы стали:

1. оценка влияния экзогенной АДГ на алкогольную мотивации белых крыс как при непосредственном введении ее в организм, так и путем активной иммунизации животных к гетерологичной АДГ.

2. выявление оптимальных условий для реализации аитиалко-голыюго действия гетерологичной АДГ с использованием различны) режимов иммунизации к алкоголизации экспериментальных животных i

последующим иммунологическим анализом.

3. изучение влияния однократного введения Фермента и иммунизации против него на поведение как нативных животных, так и со сформированным алкоголизмом,

4, определение изменений активности АДГ в печени крыс после введения гетерошгичной АДГ и активной иммунизации против фермента

Научная новизна В работе впервые: 1) показано наличие изменений в поведении (в первую очередь потреблении алкоголя) животных посла парентерального введения гомо- и гетерологичной алко-гольдегидрогеназы и активной иммунизации к этому ферменту; 2) продемонстрирована принципиальная возможность долговременной им-мунокоррекции биохимического и физиологического статуса организма Посредством метода активной иммунизации к ключевому ферменту метаболизма этанола - алкогольдегидрогеназе; 3)' выявлены оптимальные условия реализации антиалкогольного действия иммунизации; 4) обнаружено изменение активности эндогенного фермента при иммунизации к экзогенному энзиму.

Научно-практическая значимость. Предложенный подход применим для решения ряда проблем физиологии и патологии, в частности,' для изыскания новых путей лечения некоторых хронических заболеваний человека, в первую очередь алкоголизма, поскольку его преимущество состоит в длительности и стабильности эффекта при небольшом числе воздействий на организм и отсутствии побочных негативных явлений.

Апробация работы. Материалы диссертации дололеиы на Международном симпозиуме "Новые достижения в исследовании лекарственной зависимости и алкоголизма", г. Шсква, 1990 г., Международном патофизиологическом конгрессе, г. Москва, 1991 г., 7 съезде гее-

ческого общества нейронаук, г. Афины, 1991. Диссертация апроОиро вала на совместном заседании кафедр физиологии человека и живот ных и кистей нервной деятельности биологического факультета МГ им. Ломоносова По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура диссертации Диссертация состоит из введения, оС зора литературы, описания материалов и методов исследования, иа лояения результатов экспериментов и их обсуждения, заключения выводов и списка литературы. Список литературы включает 171 раОс ту, из них 61 отечественных и 110 зарубежных авторов. Работа иг ложена на 165 страницах машинописного текста, иллюстрирована с рисунками и одной схемой.

Штермал* и ывтоды »гс№»ован*я

Работа выполнена на белых беспородных крысах-самцах, массс 180-S50 г общим количеством порядка 1100. В работе использовалас АДГ (ЕС 1.1.1.1.) печени лошади производства фирм Reanal (Веш рия) и Sigma (США). Фзрмент фирмы Reanal подвергали дополнител! ной очистке с целью выделения SS-изозима; в опытах с гомодогичш АДГ использовалась АДГ, выделенная ив свежей печени крыс; ыодиф! кация АДГ моноыегоксиполиэтиленгликолем, как и предыдущие оаср< цки, проводилась в лаборатории им. Белозерского к. б. н. , ст. н. < Пшежецким А.Е с сотр. (Pshezhetsky et al., 1993).

В экспериментах с внутривенным введением экзогенной гомоли гичной и гегерологичной АДГ фермент в количестве 100-150 мкг ; животное вводили двукратно в хвостовую веку животных с интервал' в два дня. При изучении влияния такого воздействия на потреблен: алкоголя животными в некоторых случаях применяли повторные введ ния фермента череэ 20 или 40 дней после первого введения.

В опытах с активной иммунизацией животным триады с интервалом в 7-8 дней вводили подкожно АДГ печени лошади в 4 точки спины, первые два раза в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в соотношении 1:1. Доза вводимого антигена варьировала от 25 до 300 мкг на животное в разных сериях экспериментов обычно в объеме 0. 2 мл. Контрольные животные чаще всего получали физраствор (0.2 мл), в отдельных случаях, обговариваемых специально, - ПАФ в аналогичных количествах.

В экспериментах по пассивной иммунизации крысам в хвостовую вену вводили 500 miu (1.5 мг) раствора крысиных специфических антител к АДГ в физрастворе. Контрольным крысам вводили иммуноглобулины сыворотки крови контрольных крыс в той же концентрации.

Алкоголизация яивотных проводилась по методике свободного выбора (Буров, Ведерникова, 1985). Крысы находились в индивидуальных клетках размером 25x25x20 см, снабженных двумя поилками с 15t раствором этанола и водой соответственно. Регистрировали количество воды и этанола, выпитые каждой крысой за сутки. Полученные временные зависимости потребления этанола затем усреднялись.

Для измерения двигательной и ориентировочно-исследовательской активности использовался прибор "Родео-1", позволяющий раздельно фиксировать горизонтальную и вертикальную компоненты двигательной активности, со схемой регистрации на фотодиодах. Этот же прибор позволял оценит; ориентировочную и исследовательскую активность животных по числу еаглядызаний в нижние (метод "hole board") и верхние норки. Регистрации проводили в тишине и темноте в течение 5 минут. Оценка двигательной и ориентировочно- исследовательской активности производилась в условных единицах прибора.

Выработку условного рефлекса активного избегания (УРАЛ) про- •

водили, как правило, в течение двух или трех дней в специально оборудованной камере. Действие условного раздражителя (света) в течение 10 сек завершалось ударом электрического тока напряжением 25-60 V через решетку, закрывающую пол камеры. Крыса могла избежать удара током, если в течение указанного времени запрыгивала на полку, прикрепленную к стене камеры. При этом Фиксировали латентные периоды реакций избавления и избегания. В каждый день эксперимента предъявлялось по 10 сочетаний. Оценивалось число реакций избегания на свет, число сочетаний до первой реакции избегания.

Выработку пищедобывательного рефлекса проводили в У-образном лабиринте с двумя кормушками, в одной из которых животное могло получать подкрепление. Крысу помещали в стартовый отсек и фиксировали время побежки ее к подкрепляемой кормушке. После выполнения правильной реакции и получения подкрепления крысу возвращали в стартовый отсек. По истечении 15 минут или при выполнениии животным б подкрепляемых реакций ва более короткий промежуток времени опыт заканчивали. ПишедоОывателъный навык вырабатывали в течение 4 дней опыта 8а это время регистрировали число подкрепляемых реакций, в том числе беэ ошибок (без захода в неподкрепляемый луч лабиринта), ошибочные движения, латентный период реакции и общее время нахождения в лабиринте.

Склонность животных к развитию депрессивно-подобного состояния (ДОС) в тесте неиабегаемого плавания оценивали по классической методике Порсолта (РогеоН е1 а1.. 1973). Принудительное плавание изучали путем помещения отдельно кавдого животного на 10 мин в сосуд, заполненный водой до отметки на высоте 30 см. температура воды била 20-21 С. Опыты проводили два дня подряд. Регистрировли продолжительность активного (энергичны.? дъшаенип

всеми лапами) и пассивного (слабые гребки вадними лапами) плавания. а также неподвижности - иммобилизации.

Чувствительность к наркотической дозе этанола оценивалась по продолжительности Сокового положения после внутрибршинного введения тест-дозы этанола iChurh et al. . 1979; Woods. Lavertv, 1979). Доза вычислялась из расчета 4.5 г чистого этанола на 1кг веса и разводилась до 252 раствора Отсчет времени начинался с момента полной потери risin? рефлекса (рефлекса "вставания") и завершался при его восстановлении.

Определение активности АДГ в тканях животных проводилось в лаборатории им. Белозерского к. б. н. , ст. н. с. Пшетецким А. а с сотр. (Pshezhetskv et al. , 1993) спектрофотометрически по начальной скорости образования NADH в цитозольной фракции. Одну единицу ферментативной активности (ME) определяли как количество Фермента, катализирующее образование за 1 мин при 25 С 1 мга< NADH, пользуясь величиной молярного поглощения продукта на длине волны 340 им 6220 1/Мхси. Концентрацию белка в препарате определяли по методу Бредфорда с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта

Определение титров антител к AJ1P 6 лнтисыворотках животных. проводилось методом твердофазного иммуноферментного аналиаа ELISA в ин-те Нормальной <Хизиологии (к. б. н. . ст. н.с. Обухова М. Ф,) и реакцией пассивной гемагглютинации - РИГА - в ин-те Экспериментальной Медицины под руководством д. б. н., проф. •Зрейдлин И. С.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием t-критерия Стыодента и непараметрических критериев Вилкоксона и «июера (Гублер, Генкин, 1973). Также производилось вычисление коэффициента корреляции и достоверности разности средних величин с использованием компьютерных программ Statistical graphyc system.

Результаты исояедованжг.

I. Влияние экзогенной АДГ на потребление этанола.

Введение ЗЬ'-изофермента АДГ печени лошади в хвостовую вену алкоголизированным животным производилось в количестве 120-150 мкг/животное в 0.1 мл физраствора. Сроки предварительной алкоголизации до первой инъекции фермента варьировали от двух до восьми месяцев в разных сериях экспериментов. Животные, отвергающие алкоголь, отсеивались в процессе эксперимента, в опыте использовались крысы, потребляющие не меньше 4-5 мл 15% раствора этанола в сутки, что составляет примерно 3-4 г/кг веса чистого алкоголя. После введения нагивной гетерологичной АДГ печени лошади уровень потребления этанола у опытных крыс по сравнению с контролем в первые 10 дней не меняется статистически значимо (рис.1). Е дальнейшем (с 11 по 20 день) количество потребляемого алкоголя опьгг-ными животными снижается, достигая статистически значимых различий с контролем. В последующие 20 дней такое соотношение меаду опытными и контрольными группами либо сохранялось, либо продолжало несколько снижаться. Повторные введения нативной АДГ через 20 дней или через 40 дней после первых инъекций вызвали дальнейшее снижение потребления этанола, которое сохранялось до конца наблюдения (до 60 дней). В отдельных опытах после повторных инъекций уровень потребления этанола опытными крысами составлял всего 20-40% от контроля.

Таким образом, введение нативной АДГ печени лошади (ЗБ-изо-вим) в дозе 120-150 мот/гщв вызывает значительное снижение потребления растворов этанола животными со сформированной алкогольной мотивацией. Механизм этого явления не поддается простым

100

80

СО

40

20

% £ КОНТР,

-I-1_I ... ,1.

введения обозначены Стрелками

О - время первого введения

-20 -10' 0 10 20 30 40 СО ,<30 70

время /дни/

—■ *< .....2 "»"з серии '

Рис. 1. Потребление этанола после внутривенного введения • лошадиной АДГ.

ю ад/сутки

контроль

иммуниз ярованные животные

время

50 100 150 200

Рис.2. Потребление этаяола контрольными и предварительно иммунизированными к гетерологичной АДГ животными.

истолкованиям. Опьгг парентерального введения других энзимов показывает, что они, как правило, быстро элиминируются из русла крови, время существования их измеряется несколькими десятками минут, максимум - часами (РуаЬак е1 а1. , 1980). С другой стороны, если энзим гетерологичен в видовом отношении, то он может, особенно при. повторных введениях, вызывать образование, антител, которые могут в последующем влиять на активность эндогенной АДГ, имеющей общие антигенные детерминанты с экзогенной АДГ. Для оценки возможных механизмов действия гетерологичной АДГ производилось измерение уровня антител к АДГ. Б пробах сыворотки крови крыс, которым вводилась нативная АДГ, уровень антител к энзиму был невысоким, 1:160 - 1:320, но достоверно превышающим контрольные значения в два - четыре раза (р<0.05).

Стремясь преодолеть антигенность ферментов, предназначенных для медицинского применения, нередко используют модификацию их посредством ковалентного присоединения полимеров типа полиэти-ленгликоля, что позволяет увеличить время их циркуляции в русле крови до нескольких десятков часов (РуаЬак е1 а1. , 1980). Применение гетерологичной лошадиной АДГ, модифицированной полиэтилекг-ликолем (ПЭГ), в экспериментах с внутривенным введением животным с выраженной алкогольной мотивацией показало, что модифицированный фермент не вызывет такого отставленного и длительного снижения потребления алкоголя, как в опытах с нативной АДГ. Более того, наблюдался кратковременный эффект увеличения потребления до 150-2001 от уровня контрольных животных, которым вводили Физиологический рзсгвор, в первые двое-трое суток после инъекции. Механизм этого явления, судя по всему, связан с непосредственным проявлением активности фермента, что при введении натившго Фермента не регистрируется столь четко ввиду быстрой Элиминации его из

русла крови.

Внутривенное введение 150 мкг/животное гомологичной АДГ, выделенной из печени крыс, алкоголизированным крысам также вызывает значительное увеличение потребления растворов этанола по сравнению с контролем, причем эффект довольно продолжителен и сохраняется в течение двух - трех недель. Уже на второй день после инъекции наблюдается значительное увеличение поглощаемого этанола опытными животными, в дальнейиом достигающее 180£ от количеств, потребляемых контрольными крысами; различия статистически значимы со второго по 26 день. Повторное введение АДГ вызывает уже не такое выраэт?нное возрастание потребляемого алкоголя, как посл-э первого введения, хотя оно остается статистически достоверным в интервале с 45 по 56 дни после начала эксперимента (или с 3 по 14 дни после повторной инъекции).

Таким образом, в/в введение гомологичной АДГ. а также модифицированной гетеро.чогичной, которая по некоторым характеристикам (времени функшонорования в кровотоке, иммуногенность) приближается к гомологичной, сопровождается увеличением потребления алкоголя. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что увеличение активности АДГ в крови (молют быть в ее форменных элементах или в тканях, быстро связывающих АДГ) влечет за собой усиление влечения к алкоголю. Доволыю большая длительность наблюдаемого эффекта пока плохо поддается объяснению, ибо трудно представить себе длительную циркуляцию даже гомологичной экзогенной АДГ в крови. Кроме того, не ясно, каковы источники NAD, необходимые для проявления активности экзогенной АДГ в крови. В нашей работе показано, что добавление к гомологичной АДГ NAD не усиливает ее действия на потребление алкоголя, а даже несколько отставляет эффект усиления алкогольной мотивации . Характер эф-

факта (несколько пиков потребления, их продолжительность и степень выраженности) у животных с введением просто гомологичной АДГ и АДР в смеси с WAD очень схожи, что показано как для иитактньи животных, так и для крыс с выраженной алкогольной мотивацией: Логично предположить поэтому более сложный механизм возрастаний потребления алкоголя пос,ле введения гомологичной АДГ, чем npocio увеличение ферментативной активности АДГ в русле крови. На это указывают как продо&татедьносгь эффега-а, гак и его независимость от присутствия кофершнтд.

Иммунологический анализ сывороток крови животных показал, что, в отличие от гетерологичной АДГ, ни модифицированная полна-тиленгликолем АДГ, ни гомологичный фермент не проявляли антигенных свойств по этим тестам. Получешше факты дамп основание связать механизм антиалкогольного действия нативной гетерологичной АДГ с образованием антител к вводимой АДГ, юэторые могут влиять и на состояние эндогенной АДГ. Поэтому, в последующих работах более детально изучалось влияние активной иммунизации крыс к гетерологичной АИГ на уровень потребления этанола.

Показало, что предварительная иммунизация интшшшх крыс (трехкратное введение 150 ют АДГ на животное в сшси с полны:,! адъювантом Фрейида - ПАФ с интервалом 7-10 дней) на достаточно длительный период подавляет у крыс формирование эксперниентально-го алкоголизма в ситуации свободного предпочтения воды и 15% раствора этанола (рис. 2). Алкоголизация животных начиналась черее 1-2 недели после последней иммунизации. Различия между опытной и контрольной группами были статистически значимы (р<0.001) на протяжении всего периода наблюдения в течение 5 месяцев после начала иммунизации. Такой позитивный антиалкогольный эффега1 может боть получен и при использовании для иммунизации значительно меньшей

озы фермента - 50 мкг на крысу, однако пролонгированность ействия дозы АДГ 150 мкг на животное выше, чем 50 мкг.

В то же время активная иммунизация к АДГ уте алкоголизиро-1анных предварительно крыс не вызывает статистически значимых иа-¡енеиий в потреблении этанола Ш если «¡имуиизацию крыс - "алко-■оликов" проводить на фоне временного лишения их растворов этано-ш (что соответствует в некоторой степени условиям клиники при взчении заболевания у лядей), иммунизация становится эффективной, ¡¡ели до ишунизации контрольные и опытные тавотные потребляли ipra.se рно одинаковые количества раствора алкоголя, то после дувшая иммунизация против лошадиной АДГ-1 в количестве 150 мкг на животное резко снижает потребление этанола опытными животными, в то время как контрольные продолжают пить примерно на том же уровне, что и до депривации. Различия между группами достоверны в течение 1.5 месяцев после окончания депривации (р<0. 001).

Антиалкогольный эффект иммунизации против гетерологичной АДГ был подтвержден в опытах с пассивной иммунизацией алкоголизиро-вашшх крыс. Внутривенное введение специфических антител против АДГ печени лошади вызывает ужа на следующие сутки реакое (практически до нулевого уровня) снижение потребления алкоголя. Затем потребление постепенно возрастает и через 5-7 дней возвращается к к уровню потребления в контрольной группе животных. Временные сроки и характер иайдюдаеиого' эффекта полностью согласуется с представлениями о механизме действия препарата по принципу пассивной иммунизации.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что иммунизация животных против гетерологичной лошадиной АДГ-1 (как пассивная, так и активная) приводят к значительному снижению алкогольной мотивации, причем эффективны режимы иммунизации до на-

чала алкоголизации и на фоне депривации уже алкоголизировант животных.

II. Иммунологический анализ.

Полученные данные о титрах антител в сыворотке крови крыс иммунизированных АДГ печени лошади (SS изозим), по отношению этому ферменту, а таклк к двум изофорыам АДГ печени крысы АДГ-2 АДГ-3 свидетельствуют об образовании в сыворотке крови крыс nocj иммунизации к АДГ печени лошади в количестве 200 ыкг/жив устойч; вого и значимого титра антител по отношению к этому фермент (рис. 3). С другой стороны, в этих же сыворотках прослеживаете также высокий титр антител по отношению к АДГ-3 печени ¡cpuci Титр антител к АДГ-2 печени крыс статистически значимо не отлич? ется от контрольного уровня. Описанный эффект характерен для ш ыунмзированных АДГ крыс как со сформированной алкогольной завиа мостью, так и для интактных, причем в первом случае уровень ант! тел выше, а специфичность их слабее.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют ® том. чч в крови крыс после иммунизации их к АДГ печени лошади пеявляюте значимые титры антител против их собственной печеночной АДГ-í Изучение динамики иммуногенеза показало, что максимальные тит( антител регистрируются уде через 30 дней после начала иммунизаш

III. Изменения уровня активности АДГ.

В целях выяснения того, как отражается образование антит« на уровне активности АДГ в организме иммунизированных животнье была исследована специфическая активность этого фермента в ткаш различных органов через месяц после начала иммунизации. Иммунизг ция крыс против лошадиной АДГ в количестве 150 мкг на животж никак не отражается на уровне активности АДГ-1 в стенках желудкг а также АДГ-2 в печени или мозге. Удельные и суммарные активное!

800

te о-

i,/00■

гею-

о •

ш

i

а - антитела к лошадиной АДГ в - антитела к крысиной АЛГ-2 о - антитела к крысиной ЛЛГ-3

- контроль

т -

опыт

Рис. 3. Титры антител в сыворотках крови животных, имгунизи-шванных к лошадиной АДГ.

(mu/tvq)

09,

О ó

С А - Р

F

а - контроль в - контрольнне "алкоголики" с - "алкоголики". иммунизированные к лошадиной AJU'

ш-

— /дг—з

Рис. 4. Активность из оферентов АДГ э печени kctíc.

этих ферментов у контрольных и иммунизированных крыс пракгическ не отличаются между собой. В то же время уровень активности АДГ-иммунизированных крыс на 30 сутки после начала иммунизации снизке практически в два раза по отношению к контролю. Более того, вел* чина активности АДГ-3 в печени МАгуиизированных жлеотных хорои коррелирует (г-0. 95, Г-72. 3) с величиной титра антител к АДГ, к меренного в их сыворотке. Определение удельных активностей АДГ-и АДГ-3 (рис.4) у нативных животных и с выраженной алкогольж мотивацией (как контрольных, так и иммунизированных) показал! что уровень активности АДГ-2 в печени контрольных И иммунизир* ванных животных существенно не изменяется, слегка Повышаясь у ж вотных с алкогольной зависимостью. В то а® время, уровень акти ности АДГ-3 подвержен существенным изьюненияхк у га-вотных -"алк голиков" он увеличивается практически в два раза, а после иммун вацни против КЗ-АДГ уменьшается более чем на порядок.

IV. Влияние АДГ на некоторые поведенческие параметры.

Двигательная и ориентировочно-исследовательская активность

Внутривенное введение гетерояогичной АДГ в разных дозах ( '120 до 300 мкг на животное) во всех случаях в той иди иной стег ни оказывало стимулирующее действие на изучаемое параметры в рг ные сроки после воздействия - от * 1 часа до 38 суток.

В/в введение гомологичной АДГ печени крысы также оказывг слабое стимулирующее действие на животных, которое не исчез! после увеличения дозы фершкта от 400 мет до 1 ыг на кивотно< регистрируется на протяжен™ шести суток после введения (р<0.0.'

Активная иммунизация нативных животных против гетерологкч: АДГ разными дозами антигена вызывает большей частью повыше двигательной и ориентировочно-исследовательской активности жив ных, хотя эффект проявляется в различной степени в зависимости

дозы АДГ. При этом прямой корреляции между дозой и силой эффекта не наблюдается: так, иммунизация дозой 150 мкг на животное повышает горизонтальную двигательную активность почти в 2.5 раза (р<0. 005) на 3 и 17 сутки после начала иммунизации, в то время как доза 180 мкг на животное не вызывает столь выраженного стимулирующего эффекта Иммунизация животных со сформированной алкогольной зависимостью также повышает их двигательную активность.

Пищедобывательный рефлекс.

В/в введение гомологичной АДГ. выделенной из печени крысы, из расчета 400 мкг на животное улучшает выработку пищедобыватель-иого рефлекса, проводимую на 8-10 сутки после введения. Во все 4 цня эксперимента животные опытной группы совершает большее количество подкрепляемых побежек (р<0. 05); в последние два дня число 5езошибочных подходов к кормушке также достоверно больше !р<0.01). В/в введение гетерологичной АДГ сокращает время выпол-гения подкрепляемой побежки почти в три раза по сравнению с конт-золем. Интраназалыюе введение лошадиной АДГ, а также иммунизация ipoTim АДГ-I печени лошади незначительно меняла показатели выра-кэтки лабиринтного рефлекса у животных (обучение проводилось че-)ез 20 дней после начала иммунизации и на 5-9 сутки после и/н (ведения), хотя тенденция к облегчению обучения наблюдалась.

Показано, что иммунизация против гетерологичной АДГ-I (300

кг па животное) крыс с физической зависимостью от алкоголя через

»

[ва месяца после начала иммунизации облегчает выработку пищедоби-¡ательного рефлекса во все дни эксперимента. В первый день общее исло подкрепляемых побежек более чем в два раза выше (р<0. 05) в пыгиой группе по сравнению с контрольной, а во второй и третий ни иммунизированные крысы демонстрируют большую эффективность Сучения - у mix значительно повышается (р<0. 05) число бе^ошибоч-

ных реакций при том, что число подкрепляемых побежек увеличивается не в такой степени.

Условная реакция активного избегания (УРАИ).

Внутривенное введение 120 мкг на животное гетерологичной ло еадиной АДГ-1 облегчает выработку рефлекса с отрицательным подкреплением на второй и третий дни после введения. Уже в первьй день обучения опытные животные совершают почти в два раза больше условных реакций, чем контрольные, а во второй день различия увеличиваются и достигают статистической значимости (р<0.01).

Иммунизация нативных животных против АДГ-I лошади в дозе 15< и 60 ют/жив улучшает выработку УРАЛ через 1.5 месяца после нача да иммунизации, причем аффект более выражен после иммунизации до вой 60 мкг. Среднее количество реакций избегания на второй и тре тнй дни обучения почти в 3 раза выше у животных, иммунизировании этой дозой АДГ по сравнению с контрольными животными.

Введение гомологичной АДГ, выделенной из печени крысы. хвостоъую вену животных, а также иммунизация животных со сформи рованндо алкоголизмом против АДГ-1 лошади не влияет на выработк рефлекса: различия опытной и контрольной групп незначительны.

Тест неиэбегаемого плавания.

Внутривенное введение лошадиной АДГ-I в различных дозах (12 ц 300 мкг на животное) снижает обсее время иммобилизации в услс виях неизОегаемого плавания ва счет увеличения времени активног плавания через 20 дней и месяц после введения по сравнению »рнтролем (р<0.05).

Иммунизация крыс против АДГ-I лошади в разные сроки после € начала таюяе снижает об иге время иммобилизации животных. прич< эффе ктивны все изученные дозы: 25. 50 и 150 мкг/жив. Как показа! на рис.5, проведение теста Порсольта на 15 и 1& сутки после пе]

1'ис. Ь Изменения общего времени иммобилизации у иммунизированных животных.

ЕЗЭ коатрол* (п«10) ЕИ ЛДГ И к»г (п-в)

СП АДГ 160 К»р (п-9)

• - р<0 01. •• - р<0 006

Рис 6. Продолжительность этанолового наркоза у иммунизированных животных.

ш>еи*. мга

СИ) <ЦТ ЬОмтг (г.» 10) ЕШ АДГ 1в0изг (п»10)

' - р<ОС5

бой иммунизации против фермента в дозе 50 мкг, обнаруживает chi жение среднего времени иммобилизации более чем в два раза i сравнению с контрольной группой животных (р<0.01), а увеличен] дозы антигена до 150 мкг, жив приводит к различию с контролем по1 ти в 4.5 раза (р<0.005), т.е. эффект дозозависимый.

Иммунизация против АДГ-I снижает продолжительность иммобил эации не только у нативных животных, но и у крыс с физической з висимостыо от алкоголя, которые до начала иммунизации находили на протяжении 5.5 месяцев в условиях свободного выбора между эт полом и водой. Иммунизация дозой 300 мкг/иив (около 1 мг/к АДГ-I лошади приводит к уменьшению времени иммобилизации чер 2. 5 месяца после начала иммунизации почти в два раза по сравнен с контрольной группой жнвотных -"алкоголиков".

Тест "зтаноловый наркоз".

Внутривенное введение АДГ печени лошади в различных кол чествак (от 200 до 350 мкг/жив) увеличивает продолжительность с животных после внутрибршинной инъекции наркотической дозы этан ла на этапе иммуногенеза почти в два раза (р<0. 05).

Влияние иммунизации против изучаемого фермента на продолж тельность этанолового наркоза рассматривалась на разных срок после начала иммунизации и для разных доз фермента. Во всех сл чаях наблюдалось возрастание времени сна. На рис. 6 представле результаты проведения теста через 11 дней после начала иммуниз ции. Все три дозы антигена - 25, 50 и 150 ыкг/жив - почти в д раза увеличивают продолжительность наркоза, однако различия контролем статистически достоверны только у животных, которые б до проиммунизированы 150 мкг АДГ печени лошади на животное. Т ее эффект оказывает иммунизация против лошадиной АДГ на животн с Физической зависимостью от алкоголя. Одной кз возможных прич

наблюдаемого эффекта может быть снижение активности эндогенной АДГ печени у иммунизированных крыс. Полагают, что длительность эганолового наркоза находится в обратной зависимости от степени алкогольной мотивации (Ри1ег, ОютЬ. 1977; Ошг1ч а1. . 1979. Бурев, Ведерникова,1985). Увеличение времени этанолового наркоза живогных и меньшая длительность иммобилизации должны свидетельствовать о низком уровне алкогольной мотивации, что и подтверждается нашими экспериментальными данники: потребление алкоголя у животных после активной иммунизации и внутривенного введения лошадиной АДГ значительно ниже, чем у контрольных крыс.

Излаженные в настоящей работе результаты свидетельствует, во первых, об усилении алкогольной мотивации при введении гомологичной алкогольдегидрогеназы и, во вторых, о длительном снижении потребления этанола вследствие активной иммунизации к АДГ. Иммунологический и биохимический анализ последствий иммунизации говорит о том, что механизм подавления потребления алкоголя (по крайней мере, на первой стадии) связан с образованием антител к АДГ-3 изозиму (сооответствуюгаему человеческой АДГ-1) и снижением его активности в печени. Важно отметить, что такая иммунизация не оказывает каких-либо негативных влияний на поведение крыс. В ряде случаев отмечено повышение двигательной и ориентировочно-исследовательской активности (особенно на ранних этапах иммунизации) и облегчение выработки условных рефлексов с положительным и отрицательным подкреплением. Кроме того, во все изученные сроки наблюдается енгаение общего времени иммобилизации в условиях неизбега-емого плавания. Отсутствие негативных эффектов, и даже некоторое улучшение отдельных видов обучения указывает на относительную "мягкость" применяемых воздействий. Длительное подавляюще действие активной иммунизации к АДГ на потребление этанола и

отсутствие побочных эффектов на общее состояние животных свиде тельствутот о перспективности применения метода инверсной иммунс регуляции в терапии алкоголизма.

ВЬСОДс!

1. Внутривенное введение АДГ печени лошади (ЗЗ-иэоат крысам с выраженной алкогольной мотивацией вызывает значительнс снижение потребления раствора этанола в условиях свободного выб< ра между алкоголем и водой. Эффект начинает проявляться приблиз! тельно через 10 дней после введения и сохраняется на протяжен] двух - трех месяцев.

2. Внутривенное введение гомологичной АДГ, выделенной из № чещ крысы, а также модифицированной палиэтнденгликолеы гетерол гичной АДГ печени лошади, которая не обладает иммуногенны свойствами, сопровождается кратковременно усилением алкогольн мотивации сразу после введения.

3. Активная иммунизация кнвотньк против гетерологичной лош диной АДГ-I приводит к значительному снижению выраженности алк гольной мотивации на этапе иммунного ответа. Эффективны реет иммунизации до начала алкоголизации и на фоне алкогольной депр вацда уже алкоголизированных животных. Продолжительность антиг когольного действия активной иммунизации достигает 4-В месяце Аналогичный эффект, но более кратковременный, вызывает пассив? тасунигация животных крысиными антителами к 55-АДГ лошади.

4. Иммунологический анализ свидетельствует о появлению крови крыс после внутривенного введения им АДГ-1 печени лошади активной иммунизации к этому ферменту антител против 55-АЛГ ло1 ли и собственной печеночной АДГ-3.

5. Активность изофермента АДГ-3 (соответствующего АДГ-I ловли) в печени иммунизированных против АДГ-I животных через месяц юсле начала иммунизации снижена в два раза по сравнению с актив-юстыо контрольных животных.

6. Внутривенное введение гегерологичной АДГ-I и активная иммунизация против этого фермента не оказывает каких-либо негативна влияний на поведение крыс. В ряде случаев отмечено увеличение ¡мзической выносливости животных и облегчение условно-рефлектор-юй деятельности.

7. Активная иммунизация крыс к ключевому ферменту метаболизма этанола алкогольдегидрогеназе, подавляющая на длительное время течение к алкоголю, позволяет уточнить представления о роли это-'о энзима в становлении и поддержании влечения к этанолу и 8аслупив ает дальнейшего изучения как возможное средство терапии алкоголизма.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1, Ашмарин И. П. , Данилова Р. А. , Пшежецкий А. Е , Сагимбаевц Д. К , Федорова И. Ы. , Обухова М. Ф. , Швядас В. К Влияние гетеро- и гомологичной экзогенной алкогольдегидрогеназы на потребление этанола белыми крысами // Докл. АН СССР, 1991, т. 319, н. б. з. 1256-1259.

2. Ashmarin I.P. , Danllova R. А. , PsheEhetsky А. V.. Sagimbaeva Sh. К., Fedorova 1. M., Obukhova M. F. Influence of native and modified exogenous alcohol dehydrogenase on alcohol consumption in rats // Blomed. Scl. , 1991, v. 2, p. 308-310.

a Ashmarin LP., Danilova R. A. , .Pshezhetskv A. V. , Sajjimbaeva Sh. K. , Fedorova I. M. . Obukhova M. F. Influer со of of

homo- and heterologous alcohol dehydrogenase administration on albino rats craving for alcohol and on ADH isozyme activity in the liver. FEBS Letters. 1992 , 306. 38-40.

4. Pshezhetsky A. V.. Dan l lova R. A., Fedorova I.M.. Sagimbaeva Sh. K. , Pervushina S. V. , Obuchova M. F. . Svedas V. K. . Ashmarin I. P. Influence of the immunization against heterologous alcohol dehydrogenase on liver alcohol dehydrogenase isozymes and alcohol abus« of rats // Europ. J. Biochem.. 1093, v. 212, p. 757-761.