Долговременное действие пептидных регуляторов-индукторов тревожности: отложенные и инверсные эффекты

Рудько, Ольга Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Долговременное действие пептидных регуляторов-индукторов тревожности: отложенные и инверсные эффекты
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Долговременное действие пептидных регуляторов-индукторов тревожности: отложенные и инверсные эффекты"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

Рудько Ольга Игоревна

ДОЛГОВРЕМЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДНЫХ РЕГУЛЯТОРОВ - ИНДУКТОРОВ ТРЕВОЖНОСТИ: ОТЛОЖЕННЫЕ И ИНВЕРСНЫЕ ЭФФЕКТЫ.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук специальность 03.00.13 - физиология

МОСКВА 2008

003452748

Работа выполнена на кафедре высшей нервной деятельности Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, Р.А.Данилова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, Р.У. Островская

кандидат биологических наук А.А. Мартьянов

Ведущая организация:

Институт Высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита состоится 1 декабря 2008 г. в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 31 октября 2008 г.

Ученый секретарь совета доктор биологических наук

Б.А. Умарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди эндогенных факторов тревожности и страха важную роль играют агонисты широко представленных в мозге рецепторов холецистокинина (ХЦК) типа В (также называемых ХЦК2 рецепторами). Наибольшее внимание привлекает самый меньший из обнаруживаемых в мозге С-концевых фрагментов холецистокинина тетра-пептид Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-4). Большое количество клинических данных указывает на особую анксиогенную активность именно ХЦК-4, вызывающего у людей, изначально не страдающих паническими расстройствами, сильные панические атаки. Пациенты, страдающие паническими расстройствами, более реактивны к анксиогенному действию ХЦК-4 и других агонистов ХЦК-В рецепторов. (Bradwejn J et.al, 1991). Показано, что анксиогенное влияние ХЦК-4 опосредовано стимуляцией некоторых отделов дофаминергической системы через ХЦК-В рецепторы (Crawley JN, 1995). Однако способность ХЦК-4 и особенно его малоизученных аналогов оказывать анксиогенное действие на животных нуждается в дальнейшем углубленном изучении, так как имеющиеся на сегодняшний день в литературе результаты не лишены противоречий.

Мишенью наших исследований помимо ХЦК-4 были его структурные аналоги - ранее не изученный ХЦК-3 (HCl-Met-Asp-Phe-NH2) и пентагастрин в двух модификациях: ßAla-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ПГ) и N-tert-butyloxycarbonyl-ßAla-Trp-Met-Asp-Phc-NI 12 (БОК-ПГ); влияние их на психоэмоциональный статус крыс и биохимические изменения в мозге, сопровождающие эти эффекты. Особый интерес представляет исследование мало изученного феномена долговременности эффектов пептидов как на поведенческом, так и на биохимическом уровне.

Широкое распространение в клинической практике тревожных состояний, в том числе сопровождаемых приступами панических атак, определяет большой интерес не только к механизмам этих явлений, но и к методам их купирования. До сих пор проблема коррекции патологической тревожности и депрессий далека от успешного решения, методы купирования таких состояний на длительное время отсутствуют. Наши исследования, основанные на идее, выдвинутой академиком И.П.Ашмариным (Ашмарин И.П., Гомазков O.A., 1989), направлены на разработку принципиально нового подхода к длительной коррекции тревожных и панических состояний путем иммунокоррекции. Нами использовался метод инверсной иммунорегуляции -активной иммунизации к конъюгатам ХЦК-4 и его структурного аналога с антигеном-носителем.

В течение последних двух десятилетий опубликовано большое число работ, в которых исследовались эффекты иммунизации к широкому кругу_

соединений, близких по структуре или даже идентичных соединениям реципиента, в том числе и к регуляторным пептидам (Ашмарин И.П., Гомазков O.A., 1989, Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. и др., 1991, Евсеев В.А., Трекова H.A. и др., 1995, Данилова P.A., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. и др., 1988.). Активная иммунизация животных гетерологичным или гомологичным биорегулятором, индуцируя образование аутоантител к нему, ведет к длительным изменениям активности соответствующего биорегулятора и физиологических функций, с которыми он связан (как правило противоположной направленности). Прицельность подавления определенных систем регуляции позволяет успешно использовать такой подход для изучения механизмов патологического поведения и обосновать возможность его иммунокоррекции. Опыт, накопленный в исследованиях с использованием метода инверсной иммунорегуляции, позволяет нам расценивать такой подход, как наиболее направленный, длительный и стабильный в плане вызываемых физиологических изменений. Несмотря на наличие ряда работ по активной иммунизации к регуляторным пептидам, исследования по иммунизации животных к ХЦК-4 и его аналогам как в отечественной, так и в зарубежной литературе не опубликованы. Поэтому были необходимы исследования для оценки возможности и эффективности иммунизации к конъюгатам ХЦК-4 и ХЦК-3, а также изучение корреляции поведенческих эффектов иммунизации с биохимическими изменениями в мозге.

Одной из важных проблем в плане применения метода иммунокоррекции в клинике является подбор допущенных к применению на людях антигенов-носителей и адъювантов. При положительных эффектах иммунизации на животных это может позволить без предварительной проверки на безвредность перейти к испытаниям описанного подхода к коррекции тревожных и панических состояний у людей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение кратковременных и долговременных (отставленных и инверсных) поведенческих и биохимических эффектов пептидных регуляторов -индукторов тревожности - ХЦК-4 и его аналогов. В работе были поставлены следующие задачи:

• Оценка эффективности и направленности действия аналогов ХЦК-4 -ХЦК-3, .¿>(Ж-пентагастрина и пентагастрина, и сопоставление их действия с анксиогенными эффектами ХЦК-4.

• Изучение долговременности вызываемых ХЦК-4 и его аналогами эффектов на поведенческом и биохимическом уровнях после однократного парентерального введения.

• Для получения особо длительных инверсных эффектов - проведение активной иммунизации белых крыс синтезированными конъюгатами ХЦК-4 и ХЦК-3 с антигенами-носителями.

• Оценка эффективности иммунизации на:

- иммунологическом

- поведенческом

- биохимическом уровнях.

• Сравнение направленности и длительности поведенческих и биохимических эффектов пептидов при однократном парентеральном введении и при использовании метода инверсной иммунорегуляции.

• В случае анксиолитического действия иммунизации - проведение исследований с использованием антигенов-носителей и иммуностимуляторов, допущенных к применению в клинике.

Научная новизна. Впервые оценено влияние на поведение белых крыс структурного аналога ХЦК-4 - HCl-Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-3), который был впервые синтезирован в институте Молекулярной генетики Л.А.Андреевой.

Выявленный нами анксиогенный эффект ХЦК-3 позволяет говорить, что среди агонистов рецепторов ХЦК В, играющих важную роль в этиологии тревожных состояний, наряду с аналогом ХЦК-4 - пентагастрином и аналогом ХЦК-8 - церулеином, является и трипептид ХЦК-3. Выявлен очень важный феномен отставленных эффектов анксиогенных олигопептидов: эффекты ХЦК-4 и ХЦК-3, идентичные по характеру ранним, наблюдаются до 14 суток после однократного парентерального введения, как на поведенческом, так и на биохимическом уровне. Известно, что анксиогенные олигопептиды характеризуются коротким периодом полураспада in vivo (менее 15 минут), поэтому факты пролонгированных эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3 заслуживают особенного внимания. Данные по изучению отставленных анксиогенных эффектов ХЦК-4 и синтезированного нами аналога ХЦК-3 как по физиологическим, так и биохимическим показателям на сегодняшний день в литературе отсутствуют.

Впервые проведено ковалентное связывание ХЦК-4 и ХЦК-3 с антигеном-носителем (М.Ф.Обухова) и исследования по активной иммунизации крыс с оценкой функционального состояния иммунизированных крыс. Полученные данные о длительном (месяцы) анксиолитическом и антидепрессивном эффекте иммунизации, позволили показать принципиально новую возможность направленной и длительной иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности, страха и депрессий. Помимо этого, впервые показано изменение уровня биоаминов в стриатуме после иммунизации к ХЦК-4 и -3, направленность которого, особенно по содержанию дофамина и серотонина, противоположна прямому действию исследуемых пептидов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные факты о долговременных отложенных эффектах анксиогенных пептидов ХЦК-3 и ХЦК-4 соответствуют концепции пептидного функционального континиума,

предложенной академиком И.П. Ашмариным (1986) и значительно ее расширяют. Значение этого явления принципиально важно как в фундаментальном аспекте для развития представлений о функции регуляторов центральной нервной системы, так и в прикладном плане - открывается возможность разработки регуляторов тревожности весьма длительного действия.

Несмотря на большие успехи современной медицины и существующее огромное количество анксиолитических и антидепрессивных препаратов, коррекция тревожных и депрессивных расстройств до сих пор продолжает оставаться весьма актуальной проблемой, а методы долговременной (в том числе иммунологической) коррекции таких состояний на длительное время отсутствуют. Показанная нами успешность иммунизации к пептидам-анксиогенам, а также подбор антигена-носителя (столбнячный анатоксин) и иммуномодулятора (полиоксидоний), широко применяемых в клинической практике, открывают возможность практического применения метода инверсной иммунорегуляции в целях коррекции патологического состояния тревожности и депрессии. Основное его преимущество состоит в длительности и стабильности вызываемых эффектов при небольшом числе воздействий. Такой подход в терапии ряда хронических болезней, таких как алкоголизм и психические нарушения, может позволить избежать многократного систематического введения лекарственных препаратов, обладающих кратковременным действием.

Апробация работы. Апробация результатов представленного диссертационного исследования успешно прошла на конференции молодых ученых по проблемам ВИД, посвященной 90-летию со дня рождения Л.Г.Воронина (Москва, 1998), Международной конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 1999), Международной медицинской конференции «Medicine at the turn of Millenia» (Люблин, 2000), II-й Российской конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001), 6-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2002), Международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина» (Высокие Татры, 2003), XI российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), XIX съезде Физиологического Общества Им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), Втором Международном Междисциплинарном Конгрессе «Достижения нейронауки для современной медицины и психологии» (Судак, 2006), XII и XV международной конференции и дискуссионного научного клуба IT + ME (Гурзуф, 2004 и 2007), а также на заседаниях кафедры высшей нервной деятельности Биологического факультета МГУ.

По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения в двух главах, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах, содержит 39 рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает 204 источника, из них 34 отечественных. Диссертация изложена на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на крысах-самцах линии Вистар и беспородных крысах массой 200-300 грамм общим числом порядка 1000. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Минздрав СССР, 1977). Используемые вещества.

• Холецистокинин-4 — Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-4), производства ICN Biomedical Inc.

• Холецистокинин-3 — HCl-Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-3), синтезированный в НИИМГ РАН с.н.с., к.б.н. Л.А. Андреевой.

• Пентагастрин — P-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ПГ), наиболее близкий по структуре к ХЦК-4 и пентагастрин N-t-BOC- p-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ВОС-ПГ), оба пептида фирмы «SIGMA».

• Адъювант Фрейнда (ПАФ), производства ICN Biomedicals Inc.

• Полиоксидоний (ПО), синтезированный в Институте иммунологии Минздрава РФ.

• Столбнячный анатоксин (СтА), получен в ГосНИИ Стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича, культура Closridium tetani, штамм Копенгаген.

Парентеральное введение ХЦК-4 и его аналогов. Опытной группе внутрибрюшинно вводился исследуемый пептид. В разных сериях опытов дозировка составляла для ХЦК-4 100 и 400 мкг/кг; для ХЦК-3 - 10 мкг/кг, для ПГ - 40 и 100 мкг/кг; для БОК-ПТ 100 мкг/кг. Контрольным группам вводился физиологический раствор в том же объеме. Поведенческие тесты проводились в разные сроки, в интервале от 1 часа до 12 суток после введения пептида.

Синтез конъюгатов. Конъюгирование ХЦК-4 и ХЦК-3 с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и столбнячным анатаксином (СтА) с молярным соотношением 1:100 проводилось в Институте нормальной физиологии в.н.с., к.б.н. М.Ф. Обуховой. В качестве связующего агента использовался М-этил-М'З-диметиламинопропил карбодиимид солянокислый (КДИ).

Активная иммунизация крыс. Крыс иммунизировали три раза, с

интервалом 7-8 дней, в четыре точки спины; доза по белку составляла 150 мкг на крысу (800-1000 мкг/кг), первые два раза с полным адыовантом Фрейнда (в объемном соотношении 1:1) в качестве иммуностимулятора, общий объем вводимого раствора - 0,2 мл. Контрольной группе вводили физиологический раствор (первые два раза с ПАФ). В случае использования полиоксидония (ПО) препарат вводился также первые два раза, в дозе 200 мкг/крысу (1000 мкг/кг).

Оценка физиологического статуса проводилась в разные сроки: в интервале от 1 часа до 12 суток после парентерального введения пептидов и через три-четыре недели (до 10-ти недель) после начала иммунизации с использованием следующих поведенческих тестов.

• Для оценки двигательной и ориентировочно-исследовательской активности использовался прибор "Родео" (автоматизированное открытое поле). Тестирование проводили в течение 5 или 10 минут как с использованием стрессирующего раздражителя - звука, так и без него.

• Для оценки уровня тревожности и страха в поведении иммунинизированных крыс, использовался приподнятый крестообразный лабиринт (Pellow, 1985) и темно-светлая камера.

• Склонность крыс к возможному развитию депрессивно-подобного состояния в тесте неизбегаемого плавания оценивали по классической методике Порсольта (Porsolt, 1978).

Иммунологический анализ. По окончании опытов крыс декапитировали и отбирали кровь для иммунологического анализа. Пробы крови выдерживали два часа при комнатной температуре, центрифугировали для отделения сгустка 30 минут со скоростью 3000 об/мин. Титры антител методом твердофазного иммуноферментного анализа ELISA определялись в.н.с., к.б.н. М.Ф. Обуховой М.Ф. Обуховой

Биохимический анализ стриатума крыс проводился в Институте Патфизиологии РАМН. Животных декапитировали, извлекали мозг, рассекали его в дорзовентральном направлении сразу же за зрительным перекрестом, выделяли слоистые структуры стриатума и замораживали в жидком азоте. Далее гомогенизировали, гомогенат центрифугировали на скорости 30000 об/мин, отбирали супернатант. Полученные образцы анализировали методом ВЭЖХ, определяя уровни ДА, ДОФУК, ГВК, 5-ОТ и 5-ОИУК.

Статистическая обработка полученных данных выполнялась с использованием непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни и Фишера. Для построения графиков и гистограмм использовалась программа EXCEL 7.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Эффекты парентерального введения пептидов.

Кратковременные эффекты.

Тестирование через 1 час после однократного парентерального введения ХЦК-4 в дозах от 100 до 400 мкг/кг показало изменение большинства параметров поведения, свидетельствующих о повышенной тревожности крыс. В крестообразном лабиринте (рис. 1А) у опытных животных значительно снизилось число выходов на открытые лучи (32% контроля); время пребывания на открытых лучах (45% контроля); количество посещений закрытых лучей 45% (р<0,05); суммарное количество переходов 43% (р<0,05); число выглядываний на открытые лучи (50%, р<0,05) и количество стоек (70%); увеличилось время замирания. В темно-светлой камере (рис. 1Б) уменьшился латентный период первого ухода из светлого отсека (42% контроля), также снизилось число выходов на свет и общее время пребывания в светлом отсеке.

При тестировании в «РОДЭО» на фоне стрессирующего раздражителя -звука у опытной группы наблюдались признаки острой панической реакции в ответ на раздражитель (число пробежек 165% контроля, стоек 170%), далее сменявшиеся спадом двигательной и ориентировочно-исследовательской активности до конца эксперимента. Подобные изменения свидетельствуют о значительном снижении устойчивости крыс к стрессу, связанному с анксиогенным эффектом парентерального введения ХЦК-4.

Рис. 1.

Показатели поведения крыс через 1 час после введения 400 мкг/кг ХЦК-4 (п=20) (% контроля, п=20). А. Крестообразный лабиринт Б. Темно-светлая камера

% 120

Б.

во

1 1 ' I 1, г ■ ■ 'и'и'

^л * *

1234567 89 10 *" Р<0,05.

1- выходы на открытые лучи; 2 - время на открытых лучах; 3 - выглядывания; 4 - переходы по закрытым лучам; 5 - суммарное количество переходов; 6 - стойки; 7 - время замирания; 8 - латентный период ухода в темный отсек; 9 - число выходов на свет; 10 - время в светлом отсеке.

Кроме того, представляется важным наличие депрессивных компонентов в поведении крыс - статистически значимое увеличение времени иммобилизации (180% контроля, р<0,05) и снижение доли активного и пассивного плавания до 88% и 72% (р<0,05) соответственно, наблюдавшееся в тесте Порсолта (рис. 2).

Рис. 2.

** Показатели поведения крыс

~ в тесте неизбегаемого плавания

- через 1 час после введения 400 мкг/кг ХЦК-4 (п=40) (% контроля, п=40). 1 - активное плавание

- 2 - пассивное плавание 3 - иммобилизация *- р<0,05; **-р<0,01.

Тестирование синтетического деривата ХЦК-4 - ХЦК-3 показало близкое сходство прямых эффектов аналогов, заключающееся в наличии выраженных анксиогенных и депрессивных компонентов в поведении животных. У опытных животных в крестообразном лабиринте вдвое снизилось число выходов на открытые лучи (49%); время пребывания на открытых лучах составило 67% контроля; суммарное количество переходов - 77%; соотношение числа выходов на открытые лучи к суммарному количеству переходов составило 54% от контроля. Также по сравнению с контролем уменьшилось число выглядываний на открытые лучи (59%); снизилось количество стоек (84%). Одновременно время замирания опытных животных превысило контрольное на 24%, количество дефекаций составило 127% контроля. Данные темно-светлой камеры были также сходны с результатами тестирования ХЦК-4 - латентный период первого ухода из светлого отсека уменьшился до 36% контроля, снизилось количество выходов на свет и общее время пребывания в светлом отсеке (69% и 87% соответственно).

Однако в действии исследуемых препаратов наблюдались некоторые различия. Так, при значительном сходстве прямых поведенческих эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3, последний оказался эффективен в значительно меньших дозах, чем ХЦК-4: минимальная эффективная доза ХЦК-4 составляла 100 мкг/кг, а ХЦК-3 - 10 мкг/кг.

Исследование двух форм пентагастрина (рис. 3) показало ХЦК-4— подобные анксиогенные эффекты ПГ в дозе 100 мкг/кг - в крестообразном лабиринте наблюдалось снижение всех параметров двигательной и ориентировочно-исследовательской активности и увеличение времени замирания (145% контроля) и дефекаций (179%). Соотношение числа выходов на открытые лучи к суммарному количеству переходов составило 53% от контрольных значений.

Внутрибрюшинное введение 100 мкг/кг БОК-ПГ не оказывало анксиогенного действия. Более того, полученные результаты указывали скорее на наличие анксиолитического эффекта и снижение уровня тревожности

экспериментальных животных при тестировании в крестообразном лабиринте: у крыс статистически значимо увеличилось число посещений открытых лучей (236% контроля, р<0.01) и время пребывания на них (230%, р<0.05), усилилось поведение риска (147%, р<0.05), и, в то же время снизилось время замирания (83%) и число дефекаций (40%). Соотношение числа выходов на открытые лучи к суммарному количеству переходов составило 231% контроля (р<0.01). Некоторые из опытных животных прыгали с открытых лучей на пол, передвигались по бортикам закрытых лучей лабиринта, очень быстро бегали по лучам.

Рис. 3.

Показатели поведения крыс в крестообразном лабиринте через 1 час после введения ПГ (темные столбики, п=10) и БОК-ПГ (светлые столбики, п=10) в дозе 100 мкг/кг (% контроля, п=10).

*- р<0,05, **-р<0,01.

1- выходы на открытые лучи; 2 - время на открытых лучах; 3 - суммарное количество переходов; 4 - соотношение числа выходов на открытые лучи к общему количеству переходов; 5 - количество поведения риска; 6 - время замирания; 7 - количество дефекаций

Таким образом, в опытах на крысах нами подтвержден анксиогенный и депрессивный эффект ХЦК-4 и ПГ, и впервые показан анксиогенный эффект синтезированного в НИИМГ РАН ХЦК-3. Нами также обнаружено, что один и тот же пептид, но в разных модификациях (ПГ и БОК-ПГ), оказывает противоположное влияние на поведение животных.

Отставленные эффекты.

При тестировании крыс в более поздние сроки было показано значительное сходство в большинстве показателей поведения крыс через I час и 5 суток после однократного введения ХЦК-4, причем на 5-е сутки анксиогенный эффект не только не уменьшился, но стал сильнее (рис. 4А). В опытной группе полностью отсутствовали выходы на открытые лучи (р<0,05), достоверно снизилось число эпизодов поведения риска (12% контроля, р<0,05); общее количество переходов было значительно меньше, чем в контроле (27%, р<0,05). Все эти изменения свидетельствовали о наличии компонентов тревожности в поведении опытных крыс. Данные тестирования в ТСК также указывали на проявления тревожности - уменьшался латентный период

= 150 а

Я -

1 2 3 4 5 6

первого ухода из светлого отсека (27%) и в три раза снижалось общее время пребывания в светлом отсеке (31%, р<0.05).

150 125

£ 75 о 50 -Н

г? 25

150

1 О 100 р.

£ 75 - § 60 ^ 25 О

Б.

гп

** ** * * * *

12 3 4

Рис. 4. Показатели поведения крыс в крестообразном лабиринте через 5 дней после введения:

А. 100 мкг/кг ХЦК-4 (п=12); Б. 10 мкг/кг ХЦК-3 (п=10). (% контроля, п=10) *- р<0,05, **-р<0,01, ***-р<0,005

1- выходы на открытые лучи; 2 - время на открытых лучах; 3 - выглядывания;

4 - соотношение числа выходов на открытые лучи к общему количеству переходов; 5 -количество поведения риска; 6 - время замирания.

Отставленный анксиогенный эффект ХЦК-3 носил более выраженный и статистически значимый характер, чем сразу после введения. В крестообразном лабиринте профиль изменений совпадал с ХЦК-4: нами отмечалось снижение всех параметров двигательной и ориентировочно-исследовательской активности и увеличение времени замирания (рис. 4Б). Тестирование в ТСК также продемонстрировало наличие статистически значимых изменений в поведении крыс, носящих анксиогенный характер (табл. 1).

Табл. 1. Показатели поведения крыс в тесте «Темно-светлая камера» через

5 дней после введения 10мкг/кг ХЦК-3.

Латентный период Число вых. на свет Время в св. отсеке

контроль п=20 22,41 ±22,14 2,35 + 0,71 67,53 ± 23,73

опыт п=19 11,5317,53 р<0.05 1,44 ±0,42 р<0.05 26,06 ± 9,44 р<0.01

Пентагастрин демонстрировал сохранение анксиогенного действия через 3 дня после введения 100 мкг/крысу: крысы опытной группы меньше выходили на открытые лучи (33% контроля) и находились на них (14%), было достоверно меньше эпизодов поведения риска (15% контроля, р<0,05). Также значительно меньше, чем в контроле, было общее количество переходов (61%, р<0,05). Время замирания составило 125% контроля, число дефекаций 130%. Изменения в поведении, носящие анксиолитическую направленность после введения БОК-ПГ сохранялись до 48 часов.

5100

^ 50

Рис. 5.

Показатели поведения крыс в тесте неизбегаемого плавания через 5 дней после введения 100 мкг/кг ХЦК-4 (светлые столбики, п=10) и 10 мкг/кг ХЦК-3 (темные столбики, п=10) (% контроля, п=10).

*- р<0,05

Активное плавание

Иммобилизация

При изучении краткосрочных эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3 наряду с повышением тревожности нами было показано наличие депрессивных компонентов в поведении крыс (см. рис. 2) - увеличение времени иммобилизации и снижение времени активного плавания в тесте Порсолта. Через 4-5 суток после введения ХЦК-4 и -3 эти изменения сохранялись, и были статистически значимыми (Рис. 5). Менее выраженные изменения в поведении крыс были отмечены на 10-12-й день после введения ХЦК-3 и ХЦК-4. Они отражали ту же самую тенденцию, что и на 5-й день, но уровень значимости был ниже. На 20-й день не было выявлено различий между опытными и контрольными группами.

Биохимические эффекты

Анксиогенный эффект ХЦК-4 сопровождался изменениями на биохимическом уровне. Полученные данные свидетельствуют о значимом снижении уровня метаболитов ДА и их сотношении к ДА (Рис. 6). В то же время отмечалось небольшое, но статистически значимое повышение уровня 5-ОТ.

% 125

100

1-ДА;

2-ДОФУК;

3-ГВК;

4-ДОФУК/ДА;

5-ГВК/ДА;

6-50Т;

7-ОИУК;

8-0ИУК/50Т

50 -I 1 2 3 4 5 6 7

Рис. 6. Биохимические последствия однократного парентерального введения 400 мкг/кг ХЦК-4 (п=18), (% контроля, контр.- п=20). Светлые столбики - через 1 час после введения, темные - через 5 суток. *- р<0,05, **-р<0,01, ***-р<0,005

Через 5 дней (рис. 6) после однократного введения ХЦК-4 наблюдаемые изменения в уровне ДА, его метаболитов и отношения их к ДА имели ту же направленность, что и через 40-60 минут после введения и были гораздо более выраженными. Уровень 5-ОТ и его метаболита - ОИУК при этом статистически значимо снижались.

Через час после введения ХЦК-3 изменения по всем исследуемым параметрам биоаминов и их метаболитов не носили статистически значимого характера (табл. 2). Через 5 суток отмечалось снижение уровня дофамина (74% от контроля, статистически не значимо) и статистически значимое снижение ГВК (67%), повышение соотношения ДОФУК/ДА (123% контроля), а также уменьшение соотношения ОИУК/5-ОТ (87%).

Табл. 2. Влияние введения 10 мкг/кг ХЦК-3 на содержание дофамина, серотонина и их основных метаболитов (в нг/мг ткани) в стриатуме крыс через 1 час и 5 суток после введения.

Группа ДОФУК ДА ГВК ДОФУК/ ДА ГВК/ ДА 5-ОТ ОИУК ОИУК/ 5-ОТ

Контроль п=15 0,68 ± 0,11 6,09± 0,10 0,51 ± 0,09 0,113 5 ± 0,0071 0,0835 ± 0,0109 0,41 ± 0,03 0,54 ± 0,04 1,3144 ± 0,0953

Опыт (1 час) п=8 0,73 ± 0,16 6,33± 1,19 0,62 ± 0,19 0,1150 ± 0,0173 0,0958 ± 0,0154 0,41 ± 0,04 0,55 ± 0,07 1,3219 ± 0,1194

Опыт (5 дней) п=8 0,67 ± 0,17 4,77± 0,84 0,35 ± 0,10 р<0,05 0,1392 ± 0,0241 р<0,005 0,0713 ± 0,0107 0,44 ± 0,07 0,49 ± 0,06 1,1478 ± 0,2005 р<0,05

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о способности анксиогенных олигопептидов ХЦК-4, ранее не исследованного аналога ХЦК-3 и, в меньшей степени, пентагастрина индуцировать пролонгированные эффекты, наблюдающийся не только в пределах нескольких часов, но и на сроки до 12 суток после однократного парентерального введения, как в поведении крыс, так и на биохимическом уровне.

2.Эффекты иммунизации.

Иммунологические эффекты

Другим важным аспектом наших исследований является демонстрация долговременных эффектов, смоделированных путем активной иммунизации против эндогенных анксиогенных пептидов - ХЦК-3 и ХЦК-4. Полученные нами результаты показали, что иммунизация сопровождается формированием антител к ХЦК-4 и к ХЦК-3 (табл. 3), показана взаимореактивность антител к ХЦК-3 и ХЦК-4.

Табл. 3. Результаты иммунологического анализа сывороток крови крыс, иммунизированных конъюгатом ХЦК-3 с БСА и ХЦК-4 с БСА

^—— Титры антител

К ХЦК-3 К ХЦК-4

Контроль п=10 1 : 320 1 : 320

Иммунизация к ХЦК-3 с БСА п=8 1 : 12800 р<0,001 1 : 1600 р<0,001

Иммунизация к ХЦК-4 с БСА п=10 1 : 12800 р<0,001 1 : 6400 р<0,001

Влияние иммунизации на поведение.

Результаты поведенческого тестирования свидетельствовали о том, что иммунизация крыс к ХЦК-4 вызывает ряд глубоких и длительных изменений в поведении. При тестировании в приподнятом крестообразном лабиринте (рис.7А) в поведении крыс, иммунизированных к ХЦК-4, отмечено статистически значимое увеличение таких показателей, как число выглядываний на открытые лучи (295%, р<0,05), увеличение числа переходов (180%, р<0,01), увеличение поведения риска (193%, р<0,01) и снижение времени замирания по сравнению с контрольной группой(20%, р<0,005). Используя темно-светлую камеру, мы наблюдали увеличение числа выходов иммунизированных крыс в светлый отсек (181%) и времени пребывания там (137%, р<0,05) (рис.7Б). Эти изменения можно рассматривать как имеющие анксиолитическую направленность и противоположные прямому действию пептида.

зо^ * А Б Рис. 7. Показатели поведения крыс

250 200 150 100 50 о

чш

после иммунизации к ХЦК-4 (п=50) (% контроля, п= 50). А. - крестообразный лабиринт Б. - темно-светлая камера

*- р<0,05; **-р<0,01; ***-р<0,005

1 2 3 4 5 6 7

1- выглядывания на открытые лучи; 2 - переходы по закрытым лучам; 3 -суммарное количество переходов; 4 - время замирания; 5 - количество поведения риска; 6 - число выходов на свет; 7 - время в светлом отсеке.

Тестирование крыс, иммунизированных к ХЦК-3 также продемонстрировало наличие анксиолитического эффекта: в крестообразном лабиринте время замирания составило 76% контроля; в полтора раза возросло число выглядываний на открытые лучи, число переходов по открытым лучам

составило 125% контроля, до 117% выросло общее количество переходов, соотношение числа выходов на открытые лучи и суммарного количества переходов также было выше, чем в контроле (113%). Тестирование в темно-светлой камере показало увеличение количества выходов в светлый отсек почти вдвое (181%, р<0,05), а также значительное увеличение периода пребывания на свету (171%, р<0,05).

При изучении прямых эффектов ХЦК-4, и -3, в тесте Порсольта нами отмечалось развитие у опытных крыс депрессивно-подобного состояния. Наблюдаемое нами у крыс, иммунизированных к ХЦК-4, увеличение времени активного плавания (121%) и значительное снижение иммобилизации (69%, р<0,01) позволяют говорить об антидепрессивной направленности иммунизации, противоположной прямым эффектам пептида, которая может объясняться снижением его уровня в организме вследствие связывания эндогенного пептида вырабатываемыми антителами. В случае иммунизации к ХЦК-3 результаты теста также противоположны эффектам прямого введения пептида: снижение периода иммобилизации (40 % контроля) и небольшой рост времени пассивного плавания (116% от контроля), позволяют говорить об отсутствии депрессивных элементов в поведении крыс. Следует отметить, что, иммунизация конъюгатом ХЦК-3 вызывала менее выраженный

Рис. 8. Показатели поведения крыс в тесте неизбегаемого плавания, светлые столбики-иммунизация к ХЦК-4 (п=30); темные столбики -иммунизация к ХЦК-3 п=10) (% контроля, п=30). *- р<0,05 **-р<0,01

Данные изменения наблюдались достаточно длительное время - более месяца после окончания иммунизации, в то время, как максимальный зарегистрированный срок действия ХЦК-4 при прямом введении не превышает нескольких суток.

Биохимические эффекты.

Биохимический анализ стриатума мозга крыс, иммунизированных коньюгатом ХЦК-4 с БСА, выявил наличие ряда изменений в содержании биоаминов и их метаболитов, направленность которых по ряду параметров была противоположна изменениям после однократного введения ХЦК-4 (в первую очередь, это касается ДА и его метаболитов). Нами наблюдалось

антидепрессивный эффект, чем к ХЦК-4.

150 125

75 -

Пассивное

Иммобилизация

статистически значимое повышение уровня ДА, снижение метаболита ДА -ГВК и соотношения ГВК/ДА и ДОФУК/ДА. Уровень 5-ОТ не менялся (Рис. 9).

Некоторые различия по сравнению с иммунизацией к ХЦК-4 были выявлены при биохимическом анализе мозга крыс, иммунизированных к ХЦК-3. Так, отмечено, что содержание ДА не меняется, но наблюдается статистически значимое снижение содержания ГВК и снижение соотношения ГВК/ДА. В то же время отмечено статистически значимое снижение уровня 5-ОТ и его метаболита - 5-ОИУК. Также, как и при иммунизации к ХЦК-4, направленность наблюдаемых у иммунизированных крыс изменений, особенно по содержанию ДА и 5-ОТ, противоположна тем, которые мы наблюдали после однократного парентерального введения ХЦК-3, где содержание ДА

снижалось, а уровень 5-ОТ не менялся. %

125

100

.па,

гР

"Я

1-ДА;

2-ДОФУК;

3-ГВК;

4-ДОФУК/ДА;

5-ГВК/ДА;

6-50Т;

7-ОИУК;

8-0ИУК/50Т *- р<0,05, **-р<0,01, ***-р<0,001

1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 9. Биохимические последствия иммунизации (% контроля, контроль п=12). светлые столбики - конъюгат ХЦК-4 с БСА (п=13); темные столбики - конъюгат ХЦК-3 с БСА (п=13).

Если сравнить биохимические следствия иммунизации к ХЦК-3 и ХЦК-4 (табл.4), то можно отметить, что при иммунизации к ХЦК-3 наибольшие изменения наблюдаются в системе серотонина, а при иммунизации к ХЦК-4 - в системе дофамина. Межгрупповые различия по содержанию 5-ОТ и метаболита ДА - ГВК статистически значимы. Возможно, именно снижением уровня 5-ОТ обусловлен факт меньшего антидепрессивного действия иммунизации к ХЦК-3, чем к ХЦК-4.

Таким образом, ХЦК-3 и ХЦК-4, ковалентно связанные с антигеном-носителем, вызывают длительный (в течение двух месяцев и более) анксиолитический и антидепрессивный эффект. Наряду с этим показаны изменения уровня биоаминов в стриатуме, направленность которых, особенно по содержанию ДА и 5-ОТ, противоположна прямому действию исследуемых пептидов.

Табл. 4. Влияние иммунизации к ХЦК-4 и ХЦК-3 на уровень катехоламинов в мозге.

Группа ДА ДОФУК гвк ДОФУК/ ДА гвк/ ДА 5-НТ ОИУК ОИУК /5-НТ

Иммунизация к ХЦК-4 т р<0.01 100% 1 р<0.05 р<0.05 р<0.001 100% 100% 100%

Иммунизация к ХЦК-3 100% 100% 1 100% 4- р<0.05 1 р<0.05 4 1

Подбор режима иммунизации, возможного к применению в клинике.

Показанная нами эффективность иммунизации к пептидам-индукторам тревоги и ее анксиолитическая направленность позволяют положительно оценить перспективность данного направления в плане длительной иммунокоррекции патологических состояний тревожности. Однако, используемый нами при иммунизации иммуностимулятор (ПАФ) и антиген-носитель (БСА) не рекомендованы для применения на людях. Поиск разрешенного в клинике адъюванта для иммунизации к ХЦК-4 заставил нас обратить внимание на полиоксидоний (ПО), созданный в Институте иммунологии Минздрава РФ. Препарат широко применяется в клинике как иммуномодулятор, детоксикант, пролонгирующий носитель фармакологически активных соединений (НекрасовА.В., и др., 2000). В качестве высокомолекулярного антигена-носителя мы использовали столбнячный анатоксин (СтА).

Иммунизация крыс конъюгатом ХЦК-4 с СтА сопровождалась формированием аутоантител к ХЦК-4, причем титр антител был даже несколько выше, чем при иммунизации ХЦК-4 с БСА (1/6400 - 1/12800). На поведенческом уровне также отмечался достоверный анксиолитический и противодепрессивный эффект во всех используемых тестах. Направленность биохимических изменений при оценке уровня дофамина, серотонина и их метаболитов была близка к описаной выше для иммунизации конъюгатом ХЦК-4 с БСА.

Иммунизация конъюгатом ХЦК-4 с БСА с использованием ПО в качестве иммуномодулятора, показал его эффективность (титр антител к ХЦК-4 1/3200). При оценке поведения иммунизированных крыс было показано снижение уровня тревожности, сходное с эффектами иммунизации с ПАФ.

И, наконец, на заключительном этапе, нами была показана эффективность иммунизации к ХЦК-4 при использовании столбнячного анатоксина и полиоксидония одновременно, о чем свидетельствовал как иммунологический анализ (титр 1/6400), так и выраженный анксиолитический эффект в поведении крыс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Задачей настоящего исследования было изучение кратковременных и отложенных эффектов пептидных регуляторов - индукторов тревожности. Мы обнаружили значительное сходство прямых поведенческих эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3. Традиционно считается, что минимальный биологически активный фрагмент гастрина/холецистокшшна - это С-концевая амидированная тетрапептидная последовательность (Morley JS et.al, 1965). Согласно гипотезе, высказанной Ренфельдом (Rehfeld JF, 2000) в реализации основных биологических эффектов ХЦК4 большая роль принадлежит строению N-терминали тетрапептида. Было показано, что наиболее важным для узнавания молекулы рецептором является гидрофобное взаимодействие, в данном случае взаимодействие с участием боковых радикалов двух ароматических аминокислот ХЦК-4 - фенилаланина и триптофана, причем важность триптофана в качестве фармакофорной группы несомненна (Гудашева Т.А. и др., 2007). Например, эндогенные пептиды ХЦК-8 и ХЦК-5, обладающие анксиогенными свойствами (Harro J et.al., 1990, Rex A et.a.,1 1994), представляют собой расширения N-терминали ХЦК-4.

Основываясь на этом, разработка веществ, способных взаимодействовать с ХЦК-В рецепторами шла в направлении усложнения дизайна молекулы тетрапептида (Horwell et al., 1991; Анохина И.П. и др., 1998; Проскурякова Т.В. и др., 2005; Гудашева Т.А. и др., 2007). Однако, впервые выявленный нами анксиогенный эффект ХЦК-3, позволяет предположить, что среди агонистов рецепторов ХЦК В, играющих важную роль в этиологии тревожных состояний, наряду с аналогом ХЦК-4 - пентагастрином и аналогом ХЦК-8 - церулеином, является и ХЦК-3.

Сравнительная оценка дериватов пентагастрина показала, что разные модификации пептида оказывают противоположное влияние на поведение животных. ПГ оказывал анксиогенное действие, а БОК-ПГ - анксиолитическое. Однако, скорее всего, одного добавления БОК-структуры недостаточно для столь кардинального изменения свойств пептида: известно, что эффекты модифицированного тетрапептида БОК-ХЦК-4 идентичны действию ХЦК-4 во всех используемых тестах и носят ярко выраженный анксиогенный характер (Rex A et.al 1994; Koks S, et.al., 1999 и др.). Как уже отмечалось, коммерческий препарат пентагастрина не идентичен эндогенному ХЦК-5 (Gly заменен на Ala). Возможно, именно это объясняет, почему эффекты БОК-пентагастрина не всегда идентичны анксиогенному действию ХЦК-4 (Palmour RM et.al 1992, Rupniak NMJ et.al, 1993), а иногда (как в нашем случае) имеют анксиолитическую направленность.

Весьма важным является впервые выявленное нами существование отставленных во времени изменений как в поведении крыс, так и на

биохимическом уровне после однократного введения ХЦК-4 и ХЦК-3. Проблема объективной оценки длительности действия регуляторных пептидов (РП) и путей продления их эффектов имеет особое значение для их использования в качестве лекарственных средств. Нестабильность большинства регуляторных пептидов в организме (т Уг < 20 мин) побудила к созданию очень большого числа аналогов, но лишь немногие из них вышли на предклинические и клинические испытания. Основными их недостатками остаются низкая биодоступность и нежелательные побочные эффекты.

Полученные нами данные свидетельствуют о способности анксиогенных олигопептидов ХЦК-4, ХЦК-3 и, в меньшей степени, пентагастрина индуцировать не только поведенческие, но и биохимические пролонгированные эффекты, идентичные по характеру ранним эффектам этих пептидов в течение 1-12 суток.

Объяснить этот феномен прямым действием исследуемых пептидов на ХЦК-В рецепторы вряд ли возможно. Периоды полураспада ХЦК-4 в грубой синаптосомальной фракции составляет 3 мин (ОсБсЬоЛ-Ьапсктап М., й а1., 1981а), в плазме крови - 13 мин (КоиШЬег Б., е1 а1., 1982), и, следовательно, уже к 10-15 часу после парентерального введения можно полагать их отсутствие в организме (Ашмарин И.П. и др., 2004, Ашмарин И.П. и др., 1996).

Однако уже давно была установлена способность РП не только вызывать прямые эффекты, но и индуцировать выход других регуляторов, в том числе других РП, нейротрофинов, гормонов и регуляторных соединений (Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., 1986; Королева С.В., Ашмарин И.П., 2006), что ведет в ряде случаев к возникновению гораздо более длительных опосредованных эффектов.

Например, многочисленные рилизинг-факторы гипоталамуса способны вызывать непосредственно быстрые физиологические эффекты и одновременно регулировать выход значительно более устойчивых гормонов. Проблема в том, что процессы такого типа характеризуются существенными отличиями быстрых начальных и последующих длительных эффектов. Для лабильных пептидов - таких, как холецистокинины-3 и -4, такой механизм длительных эффектов, представляется маловероятным. Поздние и начальные эффекты этих пептидов, представленные выше, весьма сходны.

С другой стороны представляется вполне вероятным объяснить эффекты, продолжающиеся до 12 суток с момента однократного введения, предположив возможность включения механизмов, сходных с теми, которые функционируют при формировании оперативной или долговременной памяти. Можно предположить, что наблюдаемый нами феномен может бьггь следствием длительного изменения чувствительности рецепторов после кратковременного воздействия пептида, обусловленного существованием некоторой цепной реакций или индукции процессов, аналогичных процессам консолидации

памяти. Наличие отставленных биохимических изменений в мозге подтверждает это предположение.

Для восприятия предложенного нами объяснения (Ашмарин И.П. и др., 2007), необходимо иметь в виду, что, при тестировании тревожности или депрессивности животных в используемых тестах возможен выброс эндогенного ХЦК-4, действующего на рецепторы обычного уровня чувствительности. Если же до тестирования животное уже подвергалось воздействию вводимых извне агонистов ХЦК-В рецепторов, то возможно повышение чувствительности, гиперсенситизация рецепторов. В результате, при тестировании на 1-12 сутки после введения ХЦК-4 или ХЦК-3, секретируемый эндогенный ХЦК-4 воздействует на гиперсенситизированные рецепторы, что и объясняет явление пролонгированного анксиогенного эфекта. Однако это предположение требует проверки на биохимическом уровне.

Публикаций об отставленных эффектах регуляторных пептидов очень немного. По-видимому, общее положение о нестабильности РП в организме являлось "психологическим тормозом" для исследования отставленных во времени вторичных эффектов. Полученные нами результаты согласуются с данными по применению церулеина (Харро Дж. и др., 1989, Harro,J. et al, 1990) на мышах, где показано, что через 30 мин после внутрибрюшинного введения анксиогенный эффект отсутствовал, а при тестировании через 72 часа наблюдался. В 1983-1984 гг. было показано изменение уровня серотонина и активности МАО на 3-5-й дни после введения аналога энкефалина (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH2) (Узбеков М.Г, 1983; Доведова Е.Л., 1984). В 1989 г. была показана способность ХЦК-8 и церулина оказывать длительное (до Зх суток) воздействие на ГАМК-эргическую систему мозга мышей (Nagahama Н., 1989).

Другим важным аспектом наших исследований является демонстрация долговременных инверсных эффектов, смоделированных путем активной иммунизации против эндогенных анксиогенных пептидов - ХЦК-3 и ХЦК-4.

Иммунизация крыс синтезированными ковалентными конъюгатами ХЦК-4 и ХЦК-3 с антигеном-носителем сопровождалось формированием антител к ХЦК-4 (титр 1:6400) и ХЦК-3 (титр 1:12800). Направленность вызванных иммунизацией длительных поведенческих эффектов была противоположна прямому действию ХЦК-3 и ХЦК-4. В поведенческих экспериментах у крыс отмечался выраженный анксиолитический эффект. Более того, показано и наличие атидепрессивного эффекта. Наряду с долговременным антидепрессивным и анксиолитическим действием иммунизации к ХЦК-4 и ХЦК-3, нами впервые показаны изменения уровня биоаминов в стриатуме, направленность которых, особенно по содержанию ДА и 5-ОТ, противоположна прямому действию исследуемых пептидов. Полученные нами результаты, показавшие, что иммунизация к ХЦК-3 и ХЦК-4 сопровождается

биохимическими изменениями в мозге, дают основание предполагать, что образующиеся в результате иммунизации антитела к ХЦК-3 и ХЦК-4 проходят через ГЭБ. В настоящее время ревизован ряд представлений о непроницаемости ГЭБ для аутоантител и крупных пептидов (Meeker M.L. et al., 1987; Ашмарин И.П. и др., 1997; Крыжановский Г. Н., Магаева С. В., 1990; Марьянович А. Т., Поляков Е. А., 1991; Passaro Е Jr et al., 1982b; Reiber H et al., 1988; Reiber H et al., 1984).

Выполненные нами исследования по активной иммунизации крыс с использованием эндогенного регуляторного пептида ХЦК-4 и его аналога ХЦК-3, являющихся анксиогенами, позволили впервые показать возможность направленной и длительной (месяцы) иммунокоррекции патологических состояний тревожности и страха и, возможно, депрессий.

Полученные данные, и опыт, накопленный в исследованиях, выполненных на кафедрах ВИД и ФЧЖ Биофака МГУ, свидетельствуют о том, что инверсная иммунорегуляция - иммунизация ковалентными конъюгатами эндогенных регуляторов с антигенами-носителями, - представляется весьма перспективным путем долговременной коррекции ряда патологических состояний. Развитие этого метода может привести к созданию практичных способов долговременной коррекции различных форм хронических психических заболеваний - методов, которые не требуют систематического введения лекарств.

Показанная нами возможность и эффективность использования при иммунизации разрешенных для применения к клинике столбнячного анатоксина в качестве антигена-носителя и иммуномодулятора - полиоксидония, расширяют возможности такого направления. Полученные нами данные о возможности направленной и длительной иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности и страха, в том числе и с использованием столбнячного анатоксина и полиоксидония, в настоящее время не имеют аналогов ни в России, ни за рубежом.

Таким образом, проведенные в рамках нашей работы исследования позволили не только уточнить роль ХЦК-4 в этиологии тревожных и панических состояний, но и впервые выявить анксиогенные свойства его меньшего структурного аналога - ХЦК-3. Данные по изучению отставленных анксиогенных эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3 как по физиологическим, так и биохимическим показателям на сегодняшний день в зарубежной литературе отсутствуют. Также получены принципиально новые данные о возможности направленной и длительной (месяцы) иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности и страха иммунизацией ковалентными конъюгатами этих пептидов.

выводы

1. Сравнительный анализ эффектов ХЦК-4, обладающего анксиогениыми свойствами, и его аналогов выявил значительное сходство прямых поведенческих эффектов ранее не исследованного меньшего структурного аналога ХЦК-4 - трипептида ХЦК-3 (НО-Мй-Ахр-РЬс-Му и пентагастрина (рАЬ-Тгр-Ме^АБр-РЬе^Нг).

2. Выявленный анксиолитический эффект деривата пентагастрина - Бок-пентагастрина (К-^ВОС-РАк-Тгр-Ме^АБр-РЬе-ЫНг) свидетельствует о том, что один и тот же пептид в зависимости от модификации может оказывать разнонаправленное действие на поведение животных.

3. Продемонстрирован весьма важный факт отставленных во времени изменений как на поведенческом, так и на биохимическом уровне, наблюдающихся не только в пределах нескольких часов, но и нескольких суток после однократного введения.

4. Показана возможность и эффективность активной иммунизации крыс не только к фрагменту ХЦК (30-33), но и ХЦК (31-33) (ковалентно связанных с БСА), которая вызывает долговременные анксиолитические изменения в поведении крыс, по своей направленности противоположные анксиогенному действию самих пептидов. Иммуноферментный анализ свидетельствует о наличии антител к ХЦК-4 и ХЦК-3 в сыворотках крови иммунизированных крыс.

5. Инверсные эффекты иммунизации как к ХЦК-4, так и ХЦК-3, направленность которых противоположна тем, что наблюдаются после однократного парентерального введения этих пептидов, выражаются не только в поведении, но и в содержании биоаминов и их метаболитов в мозге крыс.

6. Наличие анксиолитических компонентов в поведении иммунизированных крыс, их длительность, а также разработанный режим иммунизации с использованием наиболее оптимальных и эффективных для людей антигенов-носителей и иммуностимуляторов, разрешенных к применению в клинике указывает на перспективность развития данного направления в плане длительной иммунокоррекции патологических состояний тревожности.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Данилова P.A., Рудько О.И., Федорова И.М., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. Индукторы и ингибиторы тревожности: дифференциальное действие пентагастринов на поведение белых крыс. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 1998, т.84, №10, стр. 1100-1107.

2. Федорова И.М., Рудько О.И., Кушнир Е.А. Дифференциальное действие пентагастринов на поведение белых крыс. Конференция молодых ученых по проблемам высшей нервной деятельности, посвященная 90-летию со дня рождения Л.Г.Воронина. Тезисы докладов М., 1998, стр. 36.

3. Данилова P.A., Рудько О.И., Короткова Т.М., Федорова И.М., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. Длительные изменения поведения белых крыс при иммунизации к холецистокинину-4. Международная конференция «Механизмы функционирования висцеральных систем». Тезисы докладов, Спб., 1999, стр. 109.

4. Korotkova Т.М., Rudko O.I. Correction of panic states and other effects of active immunization Against cholecystokinin-4 in rats. 2-nd International Medical Conference "Medicine at the turn of Millenia". Abstracts, Lublin, Poland, 2000, P.84.

5. Данилова P.A., Рудько О.И., Короткова T.M, Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. Влияние иммунизации к фрагменту ХЦК 30-33 на поведение белых крыс. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2000, т.86, № 9, стр. 1167-1174.

6. Рудько О.И., Короткова Т.М. Коррекция поведения тревожности и страха иммунизацией к холецистокинину-4. П-я Российская конференция молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины". Тезисы докладов М., 2001, т.1. стр. 281.

7. Рудько О.И. Влияние иммунизации к фрагменту ХЦК (30-33) на болевую чувствительность белых крыс. 6-ая Пущинская конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". Тезисы докладов, Пущино, 2002, т.1. стр. 133-134.

8. Климов Е.А., Рахманалиев Э.Р., Рудько О.И., Кушнир Е.А. Изучение экспрессии гена холецистокинина у белых крыс с алкогольной зависимостью. 6-ая Пущинская конференция молодых ученых "Биология -наука XXI века". Тезисы докладов, Пущино, 2002, т.1. стр. 255-256.

9. Рудько О.И. Эффекты прямого введения и активной иммунизации к синтетическому аналогу фрагмента ХЦК 30-33 на поведение белых крыс. Научная конференция молодых ученых, Институт ВНД РАН. Тезисы докладов, М., 2002, стр. 13.

10.Danilova RA, Rud'ko 01, Korotkova TM, Obukhova MF, Ashmarin IP. The effects of immunization against cholecystokinin fragment 30-33 in the behavior of white rats. Neurosci Behav Physiol. 2002, v 32(2), PI89-94.

11.Белопольская M.B., Рудько О.И., Данилова P.A., Ашмарин И.П. Моделирование дезрегуляторной патологии. Иммунологические подходы к созданию долговременных моделей депрессивных и тревожных состояний и их коррекции. "Дизрегуляционная патология", М., «Медицина» 2002, стр. 483-505.

12.Ашмарин И.П., Данилова Р.А., Рудько О.И., Обухова М.Ф., Белопольская М.В. Долговременная иммунологическая коррекция состояний тревожности и страха. Международный междисциплинарный семинар «Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина», Словакия, Высокие Татры. Тезисы докладов, М., 2003, стр. 21.

13.Ашмарин И.П., Данилова Р.А., Рудько О.И., Обухова М.Ф., Андреева Л.А. Долговременное действие пептидных регуляторов, отложенные и инверсные эффекты холецистокинина -4 и -3. Медицинский академический журнал, 2004, т. 4, №1, стр. 4-13.

14.Кушнир Е.А., Рудько О.И., Ловать М.Л.,.Обухова М.Ф, Данилова Р.А., Ашмарин И.П. Полиоксидоний как адъювант при активной иммунизации к алкогольдегидрогеназе и холецистокинину-4 с целью коррекции патологии поведения. XI российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов, М., 2004, стр. 218.

15.Ashmarin LP., Rud'ko О.I., Danilova R.A., Andreeva L.A. Postponed effect of cholecystokinin fragments 30-33 (CCK-4) and 1-33 (CCK-3) on albino rats behavior. Neuroscience research communications v.34 (3), P 165-173

16.Рудько О.И., Данилова P.A., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. Оценка эффективности новых схем активной иммунизации к ХЦК-4 с целью долговременной терапии тревожных расстройств в клинике. Материалы XII международной конференции 1Т+МЕ'2004 (Гурзуф, Украина) в журнале «Успехи современного естествознания», 2004, №6, Приложение 1, т. 1, стр. 56-57.

17.Рудько О.И., Данилова Р.А., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. Отставленные эффекты нейропептидов - индукторов тревожности. Материалы XIX съезда Физиологического Общества Им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004 в Российском физиологическом журнале им. И. М. Сеченова, 2004, т.90, № 8, стр. 86.

18.Ashmarin IP, Danilova RA, Rud'ko OI, Belopolskaya MV, Obukhova MF, Shmalgausen EV. An immunochemical approach to model and long-term suppression of depressive and anxiety behavior. Span J Psychol. 2006 Nov; 9(2):219-27.

19.Ashmarin I.P., Danilova R.A., Rudko O.I., Amelchenko E.M. Postponed effects of short-living anxiogenic peptides. Second international interdisciplinary congress "Neuroscience for medicine and psychology" Sudak, Crimea, Ukraine 2006 (Abstracts P.55-56).

20.И.П. Ашмарин, P.A. Данилова, M.B. Белопольская,О.И. Рудько, М.Ф. Обухова, Е.В. Шмальгаузен. Индукция аутоиммунитета к эндогенным нейрорегуляторам изатину и холецистокинину - путь к моделированию и коррекции депрессивного поведения. Нейрохимия 2006, №23, стр. 228-233.

21.Ashmarin IP, Danilova RA, Obukhova MF, Rud'ko 01, Andreeva LA. Long-lasting Changes of Albino Rats Behavior and Brain Bioamines Content After Immunization Against Cholecystokinin-3 and -4. Neurochem Res. 2007, 32:395399

22.E.A. Климов, JI.A. Коробейникова, O.M. Рябинина, Ю.Э. Азимова, О.И. Рудько. Полиморфизм гена ССК и тревожные расстройства. Материалы XV международной конференции и дискуссионного научного клуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (IT + М&Ес'2007)". Украина, Гурзуф, 2007, стр. 32-34.

23.Ашмарин И.П., Данилова Р.А., Рудько О.И. «Исследование пролонгированного действия короткоживущих анксиогенных олигопептидов на крысах», Биомедицина, 2007, №6, стр. 103-110.

24.Ashmarin I.P., Danilova R.A., Rudko О. I., Belopolskaya M.V., Obukhova M.F., Shmalgausen E.V. "Induction of autoimmunity against endogenous neuroregulators isatin and cholecystokinin as a method of modeling and correction of depressive behavior". Neurochemical Journal, 2007, v.l, N 2, p.133-137.

25.Рудько О.И., Амельченко E.M., Зятикова М.Ю., Сергеева Н.И., Данилова Р.А., Андреева JI.A., Ашмарин И.П. Влияние пептидов - индукторов тревожности на поведение белых крыс, феномен совместного введения. Материалы XV международной конференции и дискуссионного научного клуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (IT + М&Ес'2007)". Украина, Гурзуф, 2007. стр. 114-115.

Заказ №266/10/08 Подписано в печать 29.10.2008 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таП: ¡nfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рудько, Ольга Игоревна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Характеристика тревожно-фобических расстройств

2. Теории возникновения тревожно-фобических расстройств.

3. Холецистокининергическая система, рецепторы, агонисты 18 и антагонисты.

4. Роль агонистов ХЦК-В рецепторов в этиологии тревожных 27 расстройств.

5. Метод инверсной иммунорегуляции

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Прямые эффекты пептидов

1.1 Кратковременные эффекты пептидов

1.1.1 Холецистокингш

1.1.2 Холецистокинин

1.1.3 Пентагастргш

1.2 Отставленные эффекты пептидов

1.2.1 Холецистокгшин-4 через 24 часа

1.2.2. Холецистоканин-3 через 24 часа

1.2.3. Пентагастргш через 24 часа

1.2.4 Холецистокинин-4 через 5 дней

1.2.5 Холецистокинин-3 через 5 дней

1.2.6 Пентагастрин через 3 дня

1.3 Биохимические эффекты пептидов

1.4 Обсуждение результатов

2. Инверсные эффекты пептидов

2.1 Иммунизация конъюгатом ХЦК-4 с Б С А 81 2.1.1.Поведенческие эффекты иммунизации.

2.1.2 Влияние иммунизации на болевую чувствительность 86 крыс.

2.1.3 Влияние иммунизации на алкогольную мотивацию 87 крыс.

2.1.4 Иммунологические последствия иммунизации

2.1.5 Биохимические последствия иммунизации.

2.2 Эффекты иммунизации к ХЦК

2.2.1 Поведенческие эффекты иммунизации.

2.2.2 Иммунологические последствия иммунизации

2.2.3 Биохимические последствия иммунизации

2.3 Подбор веществ, способных эффективно заменить БСА и 97 ПАФ.

2.3.1 Использование столбнячного анатоксина в качестве 99 антигена-носителя.

2.3.2 Использование полиоксидония в качестве 102 иммуност имулятора

2.3.3 Эффекты иммунизации к ХЦК-4 конъюгированному 103 со СтА, с использованием иммуномодулятора полиоксидония.

2.4 Обсуждение результатов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Долговременное действие пептидных регуляторов-индукторов тревожности: отложенные и инверсные эффекты"

Раскрытие внутренних нейрохимических механизмов, контролирующих эмоции тревожности и страха, и возможность коррекции патологических проявлений этих состояний является одной из важных проблем физиологии и медицины и требует изучения многочисленных эндогенных химических индукторов и ингибиторов этих форм поведения.

Среди эндогенных факторов тревожности и страха важную роль играют агонисты широко представленных в мозге рецепторов холецистокинина (ХЦК) типа В. В последнее время наибольшее внимание привлекает самый меньший из обнаруживаемых в мозге С-концевых фрагментов холецистокинина тетра-пептид Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-4) {Crawlley JN, Corwin RL, 1994; Fink H et al., 1998). Большое количество клинических данных указывает на особую анксиогенную активность именно ХЦК-4, вызывающего у людей, изначально не страдающих паническими расстройствами, сильные панические атаки. Пациенты, страдающие паническими расстройствами, более реактивны к анксиогенному действию ХЦК-4 и других агонистов ХЦК-В рецепторов. (Bradwejn J et.al, 1991). Показано, что анксиогенное влияние ХЦК-4 опосредовано стимуляцией некоторых отделов дофаминергической системы через ХЦК-В рецепторы {Crawley JN, 1995). Однако способность ХЦК-4 и особенно его малоизученных аналогов оказывать анксиогенное действие на животных нуждается в дальнейшем углубленном изучении, так как имеющиеся на сегодняшний день в литературе результаты не лишены противоречий.

Мишенью наших исследований помимо ХЦК-4 были его структурные аналоги - ранее не изученный ХЦК-3 (HCl-Met-Asp-Phe-NH2) и пентагастрин в двух модификациях: pAla-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ПГ) и N-tert-butyloxycarbonyl-(3Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (Тэ^Ж-ПГ); влияние их на психоэмоциональный статус крыс и биохимические изменения в мозге, сопровождающие эти эффекты.

Особый интерес представляет исследование мало изученного феномена долговременности эффектов пептидов как на поведенческом, так и на биохимическом уровне.

Широкое распространение в клинической практике тревожных состояний, в том числе сопровождаемых приступами панических атак, определяет большой интерес не только к нейрохимическим механизмам этих явлений, но и к методам их купирования. Несмотря на применение большого количества анксиолитических и антидепрессивных препаратов, проблема коррекции патологической тревожности и депрессий далека от успешного решения, методы купирования таких состояний на длительное время отсутствуют. Наши исследования, основанные на идее, выдвинутой академиком И.П.Ашмариным {Ашмарин И.П., Гомазков О.А., 1989), направлены на разработку принципиально нового подхода к длительной коррекции тревожных и панических состояний путем иммунокоррекции. Нами использовался метод инверсной иммунорегуляции - активной иммунизации к- конъюгатам ХЦК-4 и его структурного аналога с антигеном-носителем.

В течение последних двух десятилетий опубликовано большое число работ, в которых исследовались эффекты иммунизации к широкому кругу соединений, близких по структуре или даже идентичных соединениям реципиента, в том числе и к регуляторным пептидам {Ашмарин И.П., Гомазков О.А. 1989, Ашмарин И.П. и др., 1991, Евсеев В.А. и др., 1995; Мартьянов А.А. и др., 1998; Данилова Р.А. и др., 1988). Активная иммунизация животных гетерологичным или гомологичным биорегулятором, индуцируя образование аутоантител к нему, ведет к длительным изменениям активности соответствующего биорегулятора и физиологических функций, с которыми он связан (как правило противоположной направленности). Прицельность подавления определенных систем регуляции позволяет плодотворно использовать такой подход для изучения механизмов патологического поведения и обосновать возможность его иммунокоррекции. Опыт, накопленный в исследованиях с использованием метода инверсной иммунорегуляции (активной иммунизации к алкогольдегидрогеназе, психостимулятору сиднофену, ингибитору МАО паргилину), позволяет нам расценивать такой подход, как наиболее направленный, длительный и стабильный в плане вызываемых физиологических изменений. Несмотря на наличие ряда работ по активной иммунизации к регуляторным пептидам {Pekas JC, 1991, Zhang К et.al, 2007 и др.), исследования по иммунизации животных к ХЦК-4 и его аналогам как в отечественной, так и в зарубежной литературе не опубликованы. Поэтому были необходимы исследования для оценки возможности и эффективности иммунизации к конъюгатам ХЦК-4 и ХЦК-3, а также изучение корреляции поведенческих эффектов иммунизации с биохимическими изменениями в мозге.

Целью настоящего исследования являлось изучение кратковременных и долговременных (отставленных и инверсных) поведенческих и биохимических эффектов пептидных регуляторов — индукторов тревожности - ХЦК-4 и его аналогов.

В работе были поставлены следующие задачи

1. Оценка эффективности и направленности действия аналогов ХЦК-4 -ХЦК-3, £(Ж-пентагастрина и пентагастрина, и сопоставление их действия с анксиогенными эффектами ХЦК-4.

2. Изучение долговременности вызываемых ХЦК-4 и его аналогами эффектов на поведенческом и биохимическом уровнях после однократного парентерального введения.

3. Для получения особо длительных инверсных эффектов - проведение активной иммунизации белых крыс синтезированными конъюгатами ХЦК-4 и ХЦК-3 с антигенами-носителями.

4. Оценка эффективности иммунизации на: иммунологическом поведенческом биохимическом уровнях.

5. Сравнение направленности и длительности поведенческих и биохимических эффектов пептидов при однократном парентеральном введении и при использовании метода инверсной иммунорегуляции.

6. В случае анксиолитического действия иммунизации - проведение исследований с использованием антигенов-носителей и иммуностимуляторов, допущенных к применению в клинике.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Рудько, Ольга Игоревна

VI. выводы

1. Сравнительный анализ эффектов ХЦК-4, обладающего анксиогенными свойствами, и его аналогов выявил значительное сходство прямых поведенческих эффектов ранее не исследованного меньшего структурного аналога ХЦК-4 - трипептида ХЦК-3 (HCl-Met-Asp-Phe-NH2) и пентагастрина (|3Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2).

2. Выявленный анксиолитический эффект деривата пентагастрина - Бок-пентагастрина (N-t-BOC-|3Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2) свидетельствует о том, что один и тот же пептид в зависимости от модификации может оказывать разнонаправленное действие на поведение животных.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поиск возможных путей направленной и долговременной модуляции функций мозга с помощью экзо- и эндогенных регуляторов - одна из важнейших задач современной нейрофизиологии. Исследования в этом направлении представляют интерес как в фундаментальном аспекте для развития представлений о функции регуляторов центральной нервной системы, так и в практическом для создания наиболее совершенных моделей патологических состояний и обоснования новых принципиальных подходов к длительной коррекции патологического поведения.

Задачей настоящего исследования было изучение кратковременных и отложенных эффектов пептидных регуляторов-индукторов тревожности. Основными объектами наших экспериментов послужили С-концевые тетра-и трипептидные фрагменты ХЦК. Существует много данных о физиологической активности ХЦК-4 и его взаимодействии с В-рецепторами мозга. Предполагается, что именно изменения в активности ХЦК системы, будь это гиперчувствительность В-рецепторов к внутриклеточным ответам, связанным с этими рецепторами, и/или нарушения в обороте ХЦК, могут быть нейробиологической основой панических атак {Bradwejn J, et al., 1994 a; Shlik J, et al., 1997 b). В то же время биологическая активность более короткого фрагмента Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-3) недостаточно исследована in vivo. Имеются только отдельные данные об эффектах ХЦК-3 в тканевых препаратах {Steigerwalt RW, Williams JA, 1984, Knight M., et.al 1984), причем было показано значительно меньшее сродство пептида к рецептору, чем у ХЦК-4 и пентагастрина.

Синтез структурного аналога ХЦК-4 - ХЦК-3 и оценка его влияния на поведение крыс ранее не проводились.

Мы обнаружили значительное сходство прямых поведенческих эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3. Причем, ХЦК-3 оказался эффективен в значительно меньших дозах, чем ХЦК-4. Традиционно считается, что минимальный биологически активный фрагмент гастрина/холецистокинина это С-концевая амидированная тетрапептидная последовательность (Morley JS et.al, 1965). Согласно гипотезе, высказанной Ренфельдом (Rehfeld JF, 2000) в реализации основных биологических эффектов ХЦК4 большая роль принадлежит строению N-терминали тетрапептида. Например, эндогенные пептиды ХЦК-8 и ХЦК-5, обладающие анксиогенными свойствами {Наг г о J et.al., 1990, Rex A et.a.,l 1994), представляют собой расширения N-терминали ХЦК-4. Было показано также, что наиболее важным для узнавания молекулы рецептором является гидрофобное взаимодействие, в данном случае взаимодействие с участием боковых радикалов двух ароматических аминокислот ХЦК-4 - фенилаланина и триптофана, причем важность триптофана в качестве фармакофорной группы несомненна (Гудашева Т.А. и др., 2007).

Основываясь на этом, разработка веществ, способных взаимодействовать с ХЦК-В рецепторами шла в направлении усложнения дизайна молекулы тетрапептида. Известные селективные агонисты этих рецепторов ВС 197 и ВС264 - структурные производные ХЦК-8 (Noble F, Roques BP, 2002), также как и некоторые антагонисты - (Анохина И.П. и др., 1998; Проскурякова Т.В. и др., 2005). Среди антагонистов рецепторов В-типа есть и дипептоидное производное ХЦК-4 - синтетический дериват а-триптофана PD-134,308 (CI-988) (Horwell et al., 1991), который отличается высокой афинностью к ХЦК-В рецептору. Совсем недавно была синтезирована и изучена новая серия дипептидных соединений, базирующихся на структуре ХЦК-4 и являющихся его L- и D-изомерами (Гудашева Т.А. и др., 2007). Однако, впервые выявленный нами анксиогенный эффект ХЦК-3, (в структуре которого триптофан отсутствует) позволяет предположить, что среди агонистов рецепторов ХЦК В, играющих важную роль в этиологии тревожных состояний, наряду с аналогом ХЦК-4 — пентагастрином и аналогом ХЦК-8 — церулеином, является и ХЦК-3.

Сравнительная оценка дериватов пентагастрина показала, что один и тот же пептид в зависимости от модификации оказывает противоположное влияние на поведение животных. Пептид со структурной формулой рА1а-Тгр-Met-Asp-Phe-NH2 оказывал ХЦК-4-подобное анксиогенное действие, в то время, как эффекты БОК-ПГ носили анксиолитическую направленность.

Как уже отмечалось, коммерческий препарат пентагастрина не идентичен эндогенной С-концевой пентапептидной последовательности гастрина и ХЦК (Gly-Trp-Met-Asp-PheNH2). Возможно, именно эта модификация объясняет, почему эффекты БОК- пентагастрина не всегда идентичны анксиогенному действию ХЦК-4 как было показано, например, в опытах на обезьянах (Palmour RM et.al 1992, Rupniak NMJ et.al, 1993), a иногда (как в нашем случае) имеют анксиолитическую направленность (Данилова и др. 1998). Однако, скорее всего, одного добавления БОК-структуры недостаточно для столь кардинального изменения свойств пептида: известно, что эффекты модифицированного тетрапептида (БОК-ХЦК-4, N-t-Boc-Trp-Met-Asp-PheNH2), идентичны действию ХЦК-4 во всех используемых тестах и носят ярко выраженный анксиогенный характер (Rex A et.al 1994; Koks S, et.al., 1999). Трудно пока предложить удовлетворительное объяснение указанному феномену, скорее всего основную роль в нем играет характер взаимодействия пентагастрина с рецепторами ХЦК В-типа.

Весьма важным является впервые выявленное нами существование отставленных во времени изменений как в поведении крыс, так и на биохимическом уровне после однократного введения ХЦК-4 и ХЦК-3 (см. гл. 1.3). Проблема объективной оценки длительности действия регуляторных пептидов (РП) и путей продления их эффектов имеет особое значение для их использования в качестве лекарственных средств. Нестабильность большинства регуляторных пептидов в организме (т ^ < 20 мин) побудила к созданию очень большого числа аналогов. Приходится однако признать, что подавляющее большинство из них приобретали не только повышенную стабильность, но также те или иные побочные негативные активности за счет вводимых для стабилизации D-аминокислот или дополнительных радикалов иной природы. Невелики успехи и на пути создания так называемых пептоидов - непептидных соединений с конформацией близкой к РП. В этом случае также не удается избежать побочных нежелательных эффектов.

Представленные нами данные свидетельствуют о способности анксиогенных олигопептидов ХЦК-4, ХЦК-3 и, в меньшей степени, пентагастрина индуцировать не только поведенческие, но и биохимические пролонгированные эффекты, идентичные по характеру ранним эффектам этих пептидов в течение 1-12 суток.

Объяснить этот феномен прямым действием исследуемых пептидов на ХЦК-В рецепторы вряд ли возможно. Период полураспада ХЦК-4 в грубой синаптосомальной фракции составляет 3 мин (Deschodt-Lanckman М., et al., 1981а), в плазме крови - 13 мин (Koulisher D., et al., 1982), чуть более стабильными (до 3-х часов) являются его аналоги - Вос-ХЦК-4 и Аос-ХЦК-4 (Deschodt-Lanckman М., et al., 1981а), и, следовательно, уже к 10-15 часу после парентерального введения можно полагать их отсутствие в организме (Агимарин И.П. и др., 2004, Ашмарин И.П. и др., 1996). Возможно, именно такая нестабильность является причиной отсутствия внимания исследователей к долговременным эффектам ХЦК-4: длительность описываемых в литературе наблюдений эффектов пептида (выраженные эмоции страха у людей и крыс) невелика - минуты-часы (Crawley J. N., CorwinR. L., 1994; Koszycki D., rt al., 1998).

Всесторонне изучены быстрые воздействия тиролиберина на эмоциональный статус, двигательную активность, кровообращение мозга и дыхание при одновременной индукции выхода тиротропина, который, в свою очередь, стимулирует выход гормонов щитовидной железы (Hildebrand A et.al, 1989, Kadar et.al, 1992). Гонадолиберин оказывает быстрое стимулирующее действие на половое поведение, индуцируя при этом выход лютеинизирующего и фолликулстимулирующего гормонов, обеспечивающих овуляцию и сперматогенез (Nakajima S et.al, 1989). Процессы такого типа характеризуются существенными отличиями быстрых начальных и последующих длительных эффектов. Для лабильных пептидов - таких, как холецистокинины-3 и -4, такой механизм длительных эффектов, идентичных начальным представляется маловероятным. Поздние и начальные эффекты этих пептидов, представленные выше, весьма сходны.

Опубликованы исследования, в которых показано возрастание в плазме крови концентраций адренокортикотропина, кортизола и С-белка после введения ХЦК-4 (Strdhle A et al., 2000, Radu D et.al, 2002). Однако период, в течение которого это наблюдается, не превышает 1-2 часа. Кроме того, эти соединения в физиологических концентрациях не обладают анксиогенным действием, которое можно было бы сопоставить по интенсивности и ряду особенностей с ХЦК-4. Это не позволяет считать описанный механизм основным объяснением пролонгированного действия ХЦК-4 и -3, хотя, в принципе, нельзя исключить индукцию каких-либо других долгоживущих регуляторных соединений и, наконец, «запуск» последовательной многоступенчатой индукции многих различных регуляторов (Roscetti G et al., 1988).

С другой стороны представляется вполне вероятным объяснить эффекты, продолжающиеся до 12 суток с момента однократного введения, предположив возможность включения механизмов, сходных с теми, которые функционируют при формировании оперативной или долговременной памяти. Можно предположить, что наблюдаемый нами феномен может быть следствием длительного изменения чувствительности рецепторов после кратковременного воздействия пептида, обусловленного существованием некоторой цепной реакций или индукции процессов, аналогичных процессам консолидации памяти.

Общепринятое понятие памяти в поведенческих экспериментах подразумевает воспроизведение первоначального поведения. Мы же изучали отставленные эффекты ХЦК-3 и ХЦК-4 на крысах без каких-либо предварительных воздействий на поведение; кратковременное действие этих пептидов исследовалось на других группах. Поэтому, отставленные эффекты не могут быть охарактеризованы как обычное воспроизведение. Можно лишь предположить, что цепь биохимических и физиологических реакций, обусловленных введением ХЦК-3 и ХЦК-4, сходна с действием систем памяти. Такое предположение не противоречит и отмеченным изменениям биохимических показателей на 5-й день наблюдения.

Для восприятия предложенного нами объяснения (Ашмарин И.П. и др., 2007), необходимо иметь в виду, что, при тестировании тревожности или депрессивности экспериментальных животных в приподнятом крестообразном лабиринте или при неизбегаемом плавании возможен выброс эндогенного ХЦК-4, действующего на рецепторы обычного уровня чувствительности. Если же до тестирования животное уже подвергалось воздействию вводимых извне агонистов ХЦК-В рецепторов, то возможно повышение чувствительности, гиперсенситизация рецепторов. Этот процесс сходен с реакциями проторения синапса, формирования кратковременной или оперативной памяти, длительность которой может измеряться сутками. Они рассмотрены в большом числе исследований последних трех десятилетий и включают, например, такие реакции, как аутофосфорилирование протеинкиназ, демаскирование резервных рецепторов и т.п. В результате при тестировании на 1-12 сутки после введения ХЦК-4 или ХЦК-3, секретируемый эндогенный ХЦК-4 воздействует на гиперсенситизированные рецепторы, что и объясняет явление пролонгированного анксиогенного эфекта. Однако это предположение требует проверки на биохимическом уровне.

Публикаций об отставленных эффектах регуляторных пептидов очень немного. По-видимому, общее положение о нестабильности РП в организме являлось "психологическим тормозом" для исследования отставленных во времени вторичных эффектов. Полученные нами результаты согласуются с данными по применению церулеина (Харро Дж. и др., 1989, Harro,J. et al, 1990) на мышах, где показано, что через 30 мин после внутрибрюшинного введения анксиогенный эффект отсутствовал, а при тестировании через 72 часа наблюдался. В 1983-1984 гг. было показано изменение уровня серотонина и активности МАО на 3-5-й дни после введения аналога энкефалина (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH2) (Узбеков М.Г., 1983; Доведова Е.Л., 1984). В 1989 г. была показана способность ХЦК-8 и церулина оказывать длительное (до Зх суток) воздействие на ГАМК-эргическую систему мозга мышей (Nagahama Н., 1989).

Иммунизация крыс синтезированными ковалентными конъюгатами ХЦК-4 и ХЦК-3 с антигеном-носителем сопровождалось формированием антител к ХЦК-4 (титр 1:6400) и ХЦК-3 (титр 1:12800). Направленность вызванных иммунизацией длительных поведенческих эффектов была противоположна прямому действию ХЦК-3 и ХЦК-4. В поведенческих экспериментах у крыс отмечался выраженный анксиолитический эффект. Более того, показано и наличие атидепрессивного эффекта. Наряду с долговременным антидепрессивным и анксиолитическим действием иммунизации к ХЦК-4 и ХЦК-3, нами впервые показаны изменения уровня биоаминов в стриатуме (см. стр 108-109), направленность которых, особенно по содержанию ДА и 5-ОТ, противоположна прямому действию исследуемых пептидов. Биохимические изменения в мозге дают основание предполагать, что образующиеся в результате иммунизации антитела к ХЦК-3 и ХЦК-4 проходят через ГЭБ.

В настоящее время ревизован ряд представлений о непроницаемости ГЭБ для аутоантител и крупных пептидов. Было показано, что существуют участки поверхности мозга, проницаемые для достаточно крупных молекул, а также не изолированные гематоэнцефалическим барьером (например, гипофиз), и что иммуноглобулины способны проникать из крови в мозг при помощи ретроградного аксонального транспорта (Meeker M.L. et al., 1987). Важной является также способность избирательного проникновения антител в цитоплазму нейронов, содержащих комплиментарный им антиген. Эти процессы могут быть также усилены при колебаниях давления крови (в интервалах близких к физиологическим) и при введении иммуноадъювантов (Ашмарин И.П. и др., 1997; Крыжановааш Г. Н., Магаева С. В., 1990; Марьянович А. Т., Поляков Е. А., 1991; PassaroEJretal., 1982b;ReiberHetal., 1988; Reiber Н et al., 1984).

Полученные данные, и опыт, накопленный в исследованиях, выполненных на кафедрах ВНД и ФЧЖ Биофака МГУ, свидетельствуют о том, что инверсная иммунорегуляция — иммунизация ковалентными конъюгатами эндогенных регуляторов с антигенами-носителями, представляется весьма перспективным путем долговременной коррекции ряда патологических состояний. Развитие этого метода может привести к созданию практичных способов долговременной коррекции различных форм хронических психических заболеваний - методов, которые не требуют систематического введения лекарств. В настоящее время такой подход уже получил в принципе основательную клиническую апробацию для решения проблем долговременной контрацепции - иммунизацией к конъюгатам фрагментов хорионгонадотропина {Stevens VS, 1996, Cui С et al, 2007). Иммунизация к крупному пептиду - бета-амилоиду - рассматривается сейчас как один из возможных путей терапии болезни Альцгеймера {Lemere СА, et.al., 2004, Buttini Мet.al, 2005; AsuniAA, et.al 2006). Во П стадии находится клиническая апробация подавления влечения к кокаину {Foxetal., 1996; KantakKMet al., 2001, Випсе CJetal., 2003; Kosten T, Owens SM, 2005). Несмотря на наличие ряда работ по активной иммунизации к регуляторным пептидам, исследований по иммунизации животных к ХЦК-4 и ХЦК-3 в зарубежной литературе не опубликовано.

Показанная нами возможность и эффективность использования при иммунизации разрешенных для применения к клинике столбнячного анатоксина в качестве антигена-носителя (вместо БСА) и нового иммуномодулятора -полиоксидония, созданного в Ин-те иммунологии Минздрава РФ, (вместо ПАФ, запрещенного Минздравом России для применения на людях) расширяют возможности такого направления. Полученные нами данные о возможности направленной и длительной иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности и страха, в том числе и с использованием столбнячного анатоксина и полиоксидония, в настоящее время не имеют аналогов ни в России, ни за рубежом.

Таким образом, проведенные в рамках нашей работы исследования позволили не только уточнить роль ХЦК-4 в этиологии тревожных и панических состояний, но и впервые выявить анксиогенные свойства его меньшего структурного аналога - ХЦК-3. Данные по изучению отставленных анксиогенных эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3 не только по физиологическим, но и биохимическим показателям на сегодняшний день в зарубежной литературе отсутствуют. Также получены принципиально новые данные о возможности направленной и длительной (месяцы) иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности и страха иммунизацией ковалентными конъюгатами этих пептидов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рудько, Ольга Игоревна, Москва

1. Александровский Ю.А. Пограничные психические расстройства. Учебное пособие 3-е издание, Москва, «Медицина» 2000 г. 496 стр.

2. Анохина И.П., Беспалова Ж.Д., Проскурякова Т.В., Панкратова Н.В., Палькеева М.Е., Петриченко О.Б Оценка психотропной активности аналогов тетрапептида холецистокинина. Бюл.эксперим.биологии и медицины. 1998; 125(6):647-650.

3. Ашмарин И.П., Гомазков О.А. Длительное изменение физиологического и биохимического статуса организма посредством иммунизации эндогенными регуляторами. Изв. АН СССР. Сер. биол. 1989. № 1. С. 1118

4. Ашмарин И.П., Данилова Р.А. ГЬцежецкий А.В., Сагимбаева Ш.К., Федорова И.М., Обухова М.Ф., Швядас В.К. Влияние гетеро- и гомологичной экзогенной алкогольдегидрогеназы на потребление этанола белыми крысами. Докл. АН СССР, 1991, 319 (2): 1256-1259

5. Ашмарин И.П., Данилова Р.А., Рудько О.И. «Исследование пролонгированного действия короткоживущих анксиогенных олигопептидов на крысах», Биомедицина, 2007, №6, стр. 103-110.

6. Ашмарин И.П., Данилова Р.А., Рудько О.И., Обухова М.Ф., Андреева JI.A. Долговременное действие пептидных регуляторов, отложенные и инверсные эффекты холецистокинина -4 и -3. Медицинский академический журнал, 2004, 4(1):4-13

7. Ашмарин И.П., Данилова Р.А., Федорова И.М. и др. Роль алкогольдегидрогеназы в формировании алкогольной мотивации Нейрохимия. 1997. Т.14. Вып. 1. С. 3-13.

8. Ашмарин .И.П., Кустова Е.В., Данилова Р.А. Действие на некоторые функции мозга белых крыс иммуностимулятора полного адъюванта Фрейнда. Биол.Науки №3, 1992;

9. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. Регуляторные пептиды. Функционщ-непрерывная совокупность. Биохимия. 1986;51(4):531-45.

10. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., Мартьянов А.А. и др. Активная иммунизация к экзогенным и эндогенным антидепрессантам. Образование антител к биогенным амнам и пептидным регуляторам. Биол. Науки. 1991. N3. С. 15-24.

11. Ашмарин И. П. В кн.: чтения им. А. Д. Сперанского. М. 1984.С. 7-9

12. Брагин Е.О., Батуева Н.Н., Котов А.В. Толпыго С.М., Бурбаева Г.Ш. Сравнительный анализ роли системы бета-эндорфинов механизмах различных видов анальгезии. Бюл.эксперим.биологии и медицины. 1987, 104(10):394-6.

13. Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н. Нейрохимия и фармакология алкоголизма М. Медицина. 1985. 240 с.

14. Вейн А. Вегетативные расстройства. Медицинское информационное агентство М.2003 752 с. ISBN 5-89481-121-Х

15. Герштейн JI.M., Доведова E.JL, Узбеков М.Г., Голикова Т.Л., Сергутина А. В., Ашмарин И.П. " Пролонгированное действие тетрапептидамида на особенности обмена белков и медиаторов в отдельных микроструктурах мозга" Нейрохимия, 1984, т. 3(3);236-243

16. Гудашва Т.А., Кирьянова Е.П., Колик Л.Г., Константинопольский М.А., Середенин С.Б. Дизайн и синтез дипептидных аналогов холецистокинина-4 с анксиолитической и анксиогенной активностью. Биоорганическая химия, 2007; 33(4):413-20.

17. Данилова Р.А., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. и др. Длительное изменение эмоционального статуса и обучаемости белых крыс после иммунизации коньюгатом сиднофена с серумальбумином. Докл. АН СССР.1988. Т.ЗОЗ. N6. С. 1512-1514

18. Данилова Р.А., Федорова И.М., Рудько О.И., Кушнир Е.А., Ашмарин И.П. Индукторы и ингибиторы тревожности: Дифференциальное действие пентагастринов на поведение белых крыс. Физиол.журн. СССР им.Сеченова. 1998. Т.84. N10. С 1100-1107.

19. Иванова А.С. и др. Экспериментальное доклиническое изучение безопасности применения полимерного иммуностимулятора полиоксидония. М.- 1986

20. Карамян А. И., Панков Ю. А., Кофман И. Л., соллертинская Т.Н., Бурбаева Г.Г., Дустов С.А. Эффекты конъюгата бета-эндорфина с БСА на условный пищевой рефлекс ежей. Докл.АН. СССР.1987;293(3):755-9

21. Королева С.В., Ашмарин И.П. Разработка и применение экспертной системы анализа функционального континуума регуляторных пептидов. Биоорганическая химия, 2006;32(3):249-257

22. Крыжановский Т.Н., Магаева С.В. Нейроиммунные процессы в механизмах недемиелинизирующей патологии ЦНС. Итоги науки и техники. Нейроиммунология: молекулярные и клинические аспекты, ВИНИТИ, Москва, 1990 25:121168

23. Мартьянов А.А., Емельянова Т.Г., Обухова М.Ф., Волкова Н.В., Рябинина М.А., Вакулина О.П., Сахаров И.Ю., Ашмарин И.П. Физиологические эффекты активной иммунизации крыс трийодтиронином. Бюл.эксперим.биологии и медицины. 1998 Nov; 126(11):497-501.

24. Марьянович А. Т., Поляков Е. А. Нейропептиды и гематоэнцефалический барьер. Успехи физиол. наук. 1991; 22(2):33-51.

25. НекрасовА.В., Пучкова Н.Г., Иванова А.С. Химические аспекты создания полиоксидония. Иммунология. 2000; №5:19-23

26. Орликов А.Б.Нейрохимия тревоги. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 1991;91(11): 116-20.

27. Проскурякова Т.В., Беспалова Ж.Д., Палькеева М.Е., Петриченко О.Б., Панкратова Н.В., Шохонова В.А., .Анохина И.П. Биологическая активность аналогов холецистокинин-(30-33)-тетрапептида. Биоорганическая химия. 2005; 31 (2): 130-139.

28. Узбеков М.Г. Отставленный эффект тетрапептида tyr-D-ala-gly-phe-NH2 на содержание серотонина в синаптосомах мозга кролика. Бюл. экспер.биол., мед., 1983, т. 95, №2, стр. 38-40.

29. Соллертинская Т.Н. Нейропептилная компенсация нарушенных функций мозга в восходящем ряду млекопитающих. Взаимодействие нервной и иммунной систем. Физиол.Человека. 2001;27(1):55-64).

30. Харро Дж, Полд М, Визар И. Участие ХЦК-В-эргических механизмов в регуляции эмоционального поведения у грызунов. Журнал ВНД. 1989; 39(5):877-83.

31. Abelson J.L., Nesse R.M. Colecystokinin-4 and panic. Arch.Gen.Psychiatry 1991; 47:395

32. Abelson,J.L., Nesse,R.M. Pentagastrin infusions in pacients with panic disorder I. Symptoms and cardiovascular responses. Biol.Psychiatry 1994; 36:73-83.

33. Abelson,J.L., Nesse,R.M., Vinik,A.I.Pentagastrin infusionsin pacients with panic disorder II. Neuroendocrinology.Biol.Psychiatry 1994; 36:84-96.

34. Angst J. Comorbidity of anxiety, phobia, compulsion and depression.Int Clin Psychopharmacol. 1993 Sep;8 Suppl 1:21-5.

35. Ashmarin I.P., E. Buzinova, M. Vinogradova, M. Potier, A. Pshezhetsky. Learning disability in rats induced by the immunosuppression of cathepsin A in blood plasma. Neuroscience Research Communications 1997, 21(2): 153162

36. Benkelfat C, Bradwejn J, Meyer E, Ellenbogen M, Milot S, Gjedde A, Evans E. Functional neuroanatomy of ССК-4-induced anxiety in normal healthy volunteers. Am J Psychiatry 1995;152: 1180-4.

37. Bertoglio LJ, Zangrossi H Jr.Involvement of dorsolateral periaqueductal gray cholecystokinin-2 receptors in the regulation of a panic-related behavior in rats .Brain Res. 2005 Oct 12;1059(l):46-51.

38. Bi S, Chen J, Behles RR, Hyun J, Kopin AS, Moran TH. Differential body weight and feeding responses to high-fat diets in rats and mice lacking cholecystokinin 1 receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2007 Jul;293(l):R55-63. Epub 2007 Apr 4.

39. Bock MG, DiPardo RM, Evans BE, Rittle KE, Whitter WL, Veber DE, Anderson PS, Freidinger RM.Benzodiazepine gastrin and brain cholecystokinin receptor ligands: L-365,260.J Med Chem. 1989 Jan;32(l):13-6.

40. Boissy A. Fear and fearfulness in animals. Q Rev Biol. 1995 Jun;70(2):165-91.

41. Boulenger J-P et al. Plasma neuropeptide Y reactivity to cholecystokinin challenge in panic disorders and normal controls. Biol Psychiatry 1997; 42: 48S.

42. Bradwejn J, Koszycki D, Annable L, Couetoux-du-Tertre A., Reines S., Karkanias C. A dose-renging study of the behavioral and cardiovascular effects of CCK-tetrapeptide in panic disorder. Biol.Psychiatry 1992; 32(10):903-12.

43. Bradwejn J, de Montigny C. Benzodiazepines antagonize cholecystokinin-induced activation of rat hippocampal neurons. Nature, 1984; 312:363-364

44. Bradwejn J, Koszycki D, Bourin M.Dose ranging study of the effects of cholecystokinin in healthy volunteers. J Psychiatry Neurosci. 1991 Jul;16(2):91-5.

45. Bradwejn J, Koszycki D, Materissan G. Colecystokinin tetrapeptide induces panic attacks in patients with panic disorder. CanJ.Psychiatry. 1990; 35(1):83-5 & 1991; 48(7):603-10.

46. Bradwejn J, Koszycki D, Paradis M, Reece P, Hinton J, Sedman A. Effect of CI-988 on cholecystokinin-tetrapeptide induced panic symptoms in healthy volunteers. Biol Psychiatry 1995; 38: 742-6.

47. Bradwejn J, Koszycki D, Shriqui C. Enhanced sensitivity of panic disorder to cholecystokinintetrapeptide: Clinical and behavioral results. Arch Gen Psychiatry 1991; 48: 603-10.

48. Bradwejn J, Koszycki D. Comparison of the panicogenic effect of cholecystokinin 30-33 and carbon dioxide in panic disorder.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 1991;15(2):237-9.

49. Bradwejn J, Koszycki D. Imipramine antagonism of the panicogenic effects of cholecystokinin-tetrapeptide in panic disorder patients. Am J Psychiatry 1994; 151:261-3.

50. Brambilla F, Bellodi L, Perna G, Garberi A, Panerai A, Sacerdote P. Lymphocyte cholecystokinin concentration in panic disorder. 1993. Am J Psychiatry 1993; 150: 1111-3.

51. Brawman-Minzter O. Lydiard RB, Bradwejn J, Villarreal G, Knapp R, Emmanuel N, Ware MR, He Q, Ballenger JC. Effects of cholecystokinin agonist pentagastrin in patients with generalized anxiety disorder. Am J Psychiatry 1997; 154: 700-2.

52. Bunce CJ, Loudon PT, Akers C, Dobson J, Wood DM.Development of vaccines to help treat drug dependence.Curr Opin Mol Ther. 2003 Feb;5(l):58-63.

53. Charney DS, Heninger GR.Abnormal regulation of noradrenergic function in panic disorders. Effects of clonidine in healthy subjects and patients with agoraphobia and panic disorder.Arch Gen Psychiatry. 1986 Nov;43(l 1): 104254.

54. Chen DY, Deutsch JA, Gonzalez MF, Gu Y. The induction and suppression of c-fos expression in the rat brain by cholecystokinin and its antagonist L364,718. Neurosci Lett. 1993 Jan 4;149(l):91-4.

55. Clerc P, Saillan-Barreau C, Desbois C, Pradayrol L, Fourmy D, Dufresne M.Transgenic mice expressing cholecystokinin 2 receptors in the pancreas.Pharmacol Toxicol. 2002 Dec;91(6):321-6. Review.

56. Crawley JN, Corwin RL.Biological actions of cholecystokinin.Peptides. 1994;15(4):731-55.

57. Crawley JN. Interactions between cholecystokinin and other neurotransmitter systems. In: Bradwejn J, Vasar E (eds), Cholecystokinin and anxiety: from neuron to behavior. 1995; Austin: Springer Verlag-R.G. Landes Co., 33-56.

58. Cui С, Stevens VC, Schwendeman SP.Injectable polymer microspheres enhance immunogenicity of a contraceptive peptide vaccine.Vaccine. 2007 Jan 5;25(3):500-9.

59. De Leeuw AS, den Boer JA, Slaap BR et al. Pentagastrin has panic inducing properties in obsessive-compulsive disorder. Psychopharmacology 1996; 126: 229-37.

60. Deakin J.F.5HT2 receptors, depression and anxiety.Pharmacol Biochem Behav. 1988 Apr;29(4):819-20.

61. Denavit-Saubie M, Hurle MA, Morin-Surun MP, Foutz AS, Champagnat J. The effects of cholecystokinin-8 in the nucleus tractus solitarius. Ann NY Acad Sci 1985; 448: 375-84.

62. Depot M, Merani S, Bradwejn J, Mukherjee J, Caille J, Gutkowska J, Caille G.Effect of oral ondansetron on total cholecystokinin plasma levels following CCK-4 panic challenge procedure in healthy men.J Psychiatry Neurosci. 1998 Nov;23(5):298-304.

63. Deschodt-Lanckman M, Bui ND, Noyer M, Christophe J.Degradation of cholecystokinin-like peptides by a crude rat brain synaptosomal fraction: a study by high pressure liquid chromatography.Regul Pept. 1981 Apr;2(l):15-30.

64. Deschodt-Lanckman M, Bui ND. Cholecystokinin octa- and tetrapeptide degradation by synaptic membranes. I. Evidence for competition with enkephalins for in vitro common degradation pathways. Peptides. 1981;2 Suppl 2:113-8.

65. Dockray GJ.Immunochemical evidence of cholecystokinin-like peptides in brain. Nature. 1976 Dec 9;264(5586):568-70.

66. Dufresne M, Seva C, Fourmy D. Cholecystokinin and gastrin receptors.Physiol Rev. 2006 Jul;86(3):805-47.Review.

67. Ebenezer I.S., Parrott R.F. The effects of central administration of the CCK-B receptor agonist pentagastrin on feeding and Cortisol release in sheep. Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 1996; 18:235-238.

68. Enna SJ.Role of gamma-aminobutyric acid in anxiety.Psychopathology. 1984;17 Suppl 1:15-24. Review.

69. Ervin FR,Palmour RM, Bradwein J. A new primate model of panic disorder. Biol. Psychiatry. 1991; 29:430S

70. Evans BE, Bock MG, Rittle KE, DiPardo RM, Whitter WL, Veber DF, Anderson PS, Freidinger RM. Design of potent, orally effective, nonpeptidalantagonists of the peptide hormone cholecystokinin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Jul;83(13):4918-22.

71. Faris PL, McLaughlin CL, Baile CA, Olney JW, Komisaruk BR. Morphine analgesia potentiated but tolerance not affected by active immunization against cholecystokinin. Science. 1984 Dec 7;226(4679):1215-7.

72. Faris PL. Role of cholecystokinin in the control of nociception and food intake. Prog Clin Biol Res. 1985;192:159-66.

73. File S.E., Deakin JF.Chemical lesions of both dorsal and median raphe nuclei and changes in social and aggressive behaviour in rats.Pharmacol Biochem Behav. 1980 Jun;12(6):855-9.

74. Fink H, Rex A, Voits M, Voigt JP.Major biological actions of CCK~a critical evaluation of research findings.Exp Brain Res. 1998 Nov;123(l-2):77-83.

75. Flint AJ, Koszycki D, Vaccarino FJ, Cadieux A, Boulenger JP, Bradwejn J.Effect of aging on cholecystokinin-induced panic. Am J Psychiatry. 1998 Feb;155(2):283-5.

76. Fox B.S., Kantak K.M., Edwards M.A. et al. Efficacy of a therapeutic cocaine vaccine in rodent models. Nat. Med. 1996; 2(10): 1129-1132

77. Fraser KA, Davison JS. Meal-induced c-fos expression in brain stem is not dependent on cholecystokinin release. Am J Physiol. 1993 Jul;265(l Pt2.:R235-9.

78. Gardner C.R.Potential use of drugs modulating 5HT activity in the treatment of anxiety.Gen Pharmacol. 1988;19(3):347-56. Review.

79. Gigoux V, Clerc P, Sanchez D, Coll MG, Corominola H, Leung-Theung-Long S, Penicaud L, Gomis R, Seva C, Fourmy D, Dufresne M.Reg genes are CCK2 receptor targets in ElasCCK2 mice pancreas.Regul Pept. 2008 Feb 7; 146(13.:88-98. Epub 2007 Aug 31.

80. Graeff FG. Anxiety, panic and the hypothalamic-pituitary-adrenal axis.Rev Bras Psiquiatr. 2007 May;29 Suppl l:S3-6. Review.

81. Gross C, Santarelli L, Brunner D, Zhuang X, Hen R.Altered fear circuits in 5-HT(1A) receptor КО mice.Biol Psychiatry. 2000 Dec 15;48(12):1157-63. Review.

82. Harro J, Vasar E, Bradwejn J. CCK in animal and human research on anxiety. Trends Pharmacol Sci 1993; 14: 244-9.

83. Harro J, Vasar E, Koszycki D, Bradwejn J. Cholecystokinin in panic and anxiety disorders. In, J. Pankseep (ed), Advances in Biological Psychiatry,

84. Connecticut; JAI Press Inc. 1995: 235-62.

85. Harro J, Vasar E. Evidence that CCK-B receptors mediate the regulation of exploratory behavior in the rat. Eur. J.Pharmacol. 1991; 193:379-381.

86. Harro J., Pold M., Vasar E. Anxiogenic-like action of caerulein, a CCK-8 receptor agonist, in the mouse: influence of acute and subchronic diazepam treatment. Naunyn Schmie-debers Arch. Pharmacol. 1990; 341(l-2):62-67.

87. Huston JP, Schildein S, Gerhardt P, Privou C, Fink H, Hasenohrl RU. Modulation of memory, reinforcement and anxiety parameters by intra-amygdala injection of cholecystokinin-fragments Boc-CCK-4 and CCK-8s. Peptides. 1998; 19(1): 27-37

88. Innis RB, Snyder SH.Distinct cholecystokinin receptors in brain and pancreas. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Nov;77(l 1):6917-21.

89. Innis RB, Synder SH.Cholecystokinin receptor binding in brain and pancreas: regulation of pancreatic binding by cyclic and acyclic guanine nucleotides.Eur J Pharmacol. 1980 Jul 11;65(1): 123-4.

90. Itoh S, Takashima A, Igano K, Inouye K.Memory effect of caerulein and its analogs in active and passive avoidance responses in the rat.Peptides. 1989 Jul-Aug;10(4):843-8.

91. Javanmard M, Shlik J, Kennedy SH, Vaccarino FJ, Houle S, Bradwejn J. Neuroanatomic correlates of ССК-4-induced panic attacks in healthy humans: a comparison of two time points. Biol Psychiatry 1999; 45: 872-82.

92. Jerabek I, Boulenger JP, Bradwejn J, Drumheller A, Lavallee YJ, Jolicoeur FB.CCK4-induced panic in healthy subjects II: neurochemical correlates.Eur Neuropsychopharmacol. 1999 Jan;9( 1-2): 157-64.

93. Jerabek I, Boulenger JP, Bradwejn J, Lavallee YJ, Jolicoeur FB.CCK4-induced panic in healthy subjects I: psychological and cardiovascular effects.Eur Neuropsychopharmacol. 1999 Jan;9(l-2): 149-55.

94. Johnson NJ, Rodgers RJ.Ethological analysis of cholecystokinin (CCKA and CCKB) receptor ligands in the elevated plus-maze test of anxiety in mice.Psychopharmacology (Berl). 1996 Apr;124(4):355-64.

95. Kadar T, Telegdy G, Schally AV.An LH-RH antagonist inhibits the behavioral effects of the agonist D-TRP-6-LH-RH in mice.Pharmacol Biochem Behav. 1992 Apr;41(4):665-8.

96. Kantak KM, Collins SL, Bond J, Fox BS.Time course of changes in cocaine self-administration behavior in rats during immunization with the cocaine vaccine IPC-lOlO.Psychopharmacology (Berl). 2001 Jan;153(3):334-40.

97. Katzman M, Bradwejn J, Koszycki D, Vaccarino F, Richter M. The effect of CCK-4 in social phobia and OCD. American Psychiatric Association, 150th Annual Meeting, San Diego, California, ppl05, May 17-22, 1997.

98. Kellner M, Yassouridis A, Jahn H, Wiedemann K. Influence of clonidine on psychopathological, endocrine and respiratory effects of cholecystokinin tetrapeptide in patients with panic disorder. Psychopharmacology 1997; 133: 55-61.

99. Knight M, Tamminga CA, Steardo L, Beck ME, Barone P, Chase TN.Cholecystokinin-octapeptide fragments: binding to brain cholecystokinin receptors.Eur J Pharmacol. 1984 Oct l;105(l-2):49-55.

100. Koks S, Soosaar A, Voikar V, Bourin M, Vasar E. BOC-CCK-4, CCK(B)receptor agonist, antagonizes anxiolytic-like action of morphine in elevated plus-maze.Neuropeptides. 1999 Feb;33(l):63-9.

101. Koks S, Soosaar A, Voikar V, Volke V, Ustav M, Mannisto PT, Bourin M, Vasar E.Opioid antagonist naloxone potentiates anxiogenic-like action of cholecystokinin agonists in elevated plus-maze.Neuropep tides. 1998 Jun;32(3):235-40.

102. Kopin AS, Lee YM, McBride EW, Miller LJ, Lu M, Lin HY, Kolakowski LF Jr, Beinborn M.Expression cloning and characterization of the canine parietal cell gastrin receptor.Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Apr 15;89(8):3605-9.

103. Kopin AS, McBride EW, Schaffer K, Beinborn M.CCK receptor polymorphisms: an illustration of emerging themes in pharmacogenomics.Trends Pharmacol Sci. 2000 Sep;21(9):346-53. Review.

104. Kosten T, Owens SM. Immunotherapy for the treatment of drug abuse. Pharmacol Ther. 2005 Oct;108(l):76-85.

105. Koszycki D, Bradwejn J, Bourin M. Comparison of the effects of colecystokinin-tetrapeptide and carbon dioxide in health volunteers. Eur.Neuropsychopharmacol. 1991; 1(2):137-41.

106. Koszycki D, Bradwejn J, Zacharko. Influence of personality on behavioral response to cholecystokinin-tetrapeptide in patients with panic disorder. Psychiatry Res 1996; 62: 131-8.

107. Koszycki D, Zacharko RM, Le Melledo JM, Young SN, Bradwejn J. Effect of acute tryptophan depletion on behavioral, cardiovascular and hormonal sensitivity to cholecystokinintetrapeptide challenge in healthy volunteers. Biol Psychiatry 1996; 40: 648-55.

108. Koszycki D, Zacharko RM; Le-Melledo JM; Bradwejn J. Behavioral, cardiovascular, and neuroendocrine profiles following CCK-4 challenge in healthy volunteers: a comparison of panickers and nonpanickers. Depress/Anxiety. 1998;8(l):l-7

109. Koulischer D, Moroder L, Deschodt-Lanckman M. Degradation of cholecystokinin octapeptide, related fragments and analogs by human and rat plasma in vitro. Regul Pept. 1982 Aug;4(3): 127-39.

110. Lattmann E, Billington DC, Poyner DR, Howitt SB, Offel M.Synthesis and evaluation of asperlicin analogues as non-peptidal cholecystokinin-antagonists. Drug Des Discov. 2001 ;17(3):219-30.

111. Le Melledo J-M, Bradwejn J, Koszycki D, Bichet F, Bellavance F. The role of beta adrenergic system in CCK-4 induced panic symptoms. Biol Psychiatry 1998; 44: 364-6.

112. LeMelledo J-M, Bradwejn J, Koszycki D, Bichet F. Premenstrual dysphoric disorder and response to cholecystokinin-tetrapeptide. Arch Gen Psychiatry 1995; 52:605-6.

113. Lydiard RB, Ballenger JC, Laraia MT, Fossey MD, Beinfeld MC. CSF cholecystokinin concentrations in patients with panic disorder and in normal comparison subjects. Am J Psychiatry 1992; 149: 691-3.

114. Mardh G, Luehr С A, Vallee BL.Human class I alcohol dehydrogenases catalyze the oxidation of glycols in the metabolism of norepinephrine. Proc Natl Acad Sci USA. 1985 Aug;82(15):4979-82.

115. McCann UD, Slate SO, Geraci M, Roscow-Terrill D, Uhde TW. A comparison of the effects of intravenous pentagastrin on patients with social phobia, panic disorder and healthy control. Neuropsychopharmacology 1997; 16: 229-37.

116. McCann UD, Slate SO, Geraci M, Uhde TW. Peptides and anxiety: A dose-response evaluation of pentagastrin in healthy volunteers. Anxiety 1995; 1: 258-67.

117. Meeker M. L., Meeker R.B., Hayward J.N. Accumulation of circulating endogenous and exogenous immunoglobulins by hypothalamic magnocellular neurons. Brain Res., 1987, V. 423, N 1-2, P. 45-55.

118. Meijler MM, Matsushita M, Wirsching P, Janda KD.Development of immunopharmacotherapy against drugs of abuse.Curr Drug Discov Technol. 2004 Jan;l(l):77-89.

119. Mercer JG, Lawrence CB.Selectivity of cholecystokinin (CCK) receptor antagonists, MK-329 and L-365,260, for axonally-transported CCK binding sites on the rat vagus nerve.Neurosci Lett. 1992 Mar 30;137(2):229-31.

120. Micevych PE, Eckersell CB, Brecha N, Holland KL. Estrogen modulation of opioid and cholecystokinin systems in the limbic-hypothalamic circuit Brain-Res-Bull. 1997; 44(4): 335-43

121. Miyasaka K, Funakoshi A. Cholecystokinin and cholecystokinin receptors. J Gastroenterol. 2003;38(1):1-13.

122. Moran TH, Robinson PH, Goldrich MS, McHugh PR.Two brain cholecystokinin receptors: implications for behavioral actions.Brain Res. 1986 Jan l;362(l):175-9.

123. Morley JS, Tracy HJ, Gregory RA.Structure-function relationships in the active C-terminal tetrapeptide sequence of gastrin.Nature. 1965 Sep 25;207(5004): 1356-9.

124. Muller JE, Straus E, Yalow RS. Cholecystokinin and its COOH-terminal octapeptide in the pig brain. Proc Natl Acad Sci USA. 1977 Jul;74(7):3035-7.

125. Mutt V, Jorpes E.Hormonal polypeptides of the upper intestine. Biochem J. 1971 Dec; 125(3):57P-58P.

126. Nagahama H. Acute and long-lasting effects of peripheral injection of caerulein and CCK-8 on the central GABAergic system in mice. Peptides. 1989 Nov-Dec; 10(6): 1247-51

127. Nakajima S, Komuro T, Shimamura M, Hazato T. Enkephalin-binding protein in human blood.Biochem Int. 1989 Sep;19(3):529-36.

128. Noble F, Roques BP. CCK-B receptor: chemistry, molecular biology, biochemistry and pharmacology. Prog Neurobiol. 1999 Jul;58(4):349-79. Review.

129. Noble F, Roques BP. Phenotypes of mice with invalidation of cholecystokinin (CCK(l) or CCK(2)) receptors. Neuropeptides. 2002 Apr-Jun;36(2-3): 157-70.

130. Parks C.L., Robinson PS, Sibille E, Shenk T, Toth M.Increased anxiety of mice lacking the serotoninlA receptor.Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Sep l;95(18):10734-9.

131. Passaro E Jr, Debas H, Oldendorf W, Yamada T. Rapid appearance of intraventricularly administered neuropeptides in the peripheral circulation. Brain Res. 1982 Jun 10;241(2):335-40.

132. Pekas JC Effect of cholecystokinin immunization, enhanced food intake and growth of swine on lean yield and carcass composition. J. Nutr. 1991 Apr; 121(4): 563-7

133. Pell JM, Aston R. Active immunization with a synthetic peptide region of growth hormone: increased lean tissue growth. J Endocrinol. 1991 Oct;131(l):Rl-4.

134. Pellow S, Chopin P, File SE, Briley M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods. 1985 Aug; 14(3): 149-67.

135. Porsolt RD, Anton G, Blavet N, Jalfre M. Behavioural despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments. Eur J Pharmacol. 1978 Feb 15;47(4):379-91.

136. Radu D, Ahlin A, Svanborg P, Lindefors N. Anxiogenic effects of the CCK(B) agonist pentagastrin in humans and dose-dependent increase in plasma C-peptide levels. Psychopharmacology (Berl). 2002 Jun; 161(4):396-403. Epub 2002 Apr 17.

137. Rehfeld JF. Accurate measurement of cholecystokinin in plasma.Clin-Chem. 1998 May; 44(5): 991-1001

138. Rehfeld JF. Cholecystokinin and anxiety, an overview. In: Dourish CT, Cooper SJ, Iversen SD, Iversen LL, editors, Multiple cholecystokinin receptors in CNS, Oxford University Press, 1992, pp. 117-20.

139. Rehfeld JF. How to measure cholecystokinin in tissue, plasma and cerebrospinal ?uid. Regul Pept 1998;78:31-9.

140. Rehfeld JF. The measurement of cholecystokinin. J Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol). 1978; 8: 26-30.

141. Reiber H, Kitze B, Link M, Wagner R. Cellular immune reactions and blood cerebrospinal fluid barrier dysfunction in guinea pigs. Neurochem Res. 1988 May;13(5):463-6.

142. Reiber H, Suckling AJ, Rumsby MG The effect of Freund's adjuvants on blood-cerebrospinal fluid barrier permeability.J Neurol Sci. 1984 Jan;63(l):55-61

143. Reum T, Schafer U, Marsden CA, Fink H, Morgenstern R.Cholecystokinin increases extracellular dopamine overflow in the anterior nucleus accumbens via CCK(B) receptors in the VTA assessed by in vivo voltammetry. Neuropeptides. 1997 Feb;31(l):82-8

144. Roscetti G, Venturelli F, Roda LG.Enkephalin binding systems in human plasma. Ill: Comparative protection of different peptides.Neurochem Res. 1988 Mar;13(3):221-4.

145. Rupniak NMJ, Schaffer L, Iversen SD. Failure of intravenous pentagastrin challenge to induce panic-like effects in Rhesus monkeys. Neuropeptides 1993;25:115-9.

146. Saito A, Sankaran H, Goldfine ID, Williams JA. Cholecystokinin receptors in the brain: characterization and distribution. Science. 1980 Jun 6;208(4448):1155-6.

147. Savasta M, Palacios JM, Mengod G. Regional distribution of the messenger RNA coding for the neuropeptide cholecystokinin in the human brain examined by in situ hybridization. Brain Res Mol Brain Res. 1990 Feb;7(2):91-104.

148. Schenk D, Barbour R, Dunn W, Gordon G, Grajeda H, Guido T, Ни K, Huang

149. Schneier FR, Liebowitz MR, Abi-Dargham A, Zea-Ponce Y, Lin SH, Laruelle M. Low dopamine D(2) receptor binding potential in social phobia. Am J Psychiatry. 2000 Mar;157(3):457-9.

150. Schubert ML, Shamburek RD.Control of acid secretion.Gastroenterol Clin North Am. 1990 Mar;19(l):l-25. Review.

151. Shlik J, Vasar E, Bradwejn J. Cholecystokinin and psychiatric disorders: Role in aetiology and potential of receptor antagonists in therapy. CNS Drugs 1997;8: 134-52.

152. Simmons RD, Blosser JC, Rosamond JR. FPL 14294: a novel CCK-8 agonist with potent intranasal anorectic activity in the rat. Pharmacol Biochem Behav. 1994 Mar;47(3):701-8.

153. Singh L, Field MJ, Hughes J, Menzies R, Oles RJ, Vass CA, Woodruff GN.The behavioural properties of CI-988, a selective cholecystokininB receptor antagonist.Br J Pharmacol. 1991 Sep;104(l):239-45.

154. Singh L., Lewis A.S., Field M.G., Hughes J., Woodruff G.N. Evidence for an involvement of the brain cholecystokinin В receptor in anxiety. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1991; 88(4):1130-3.

155. Sitthisomwong P, Weiner S, Levin L, Reisman S, Siegel A.The effect of a cholecystokinin agonist on masseter muscle activity in the cat.J Dent Res. 2000 Oct;79( 10): 1823-8.

156. Slaap B.R., Westernberg H.G. et al. Pentagastrin has panic-inducing properties in obsessive compulsive disorder. Psychopharmacology Berl; 1996; 126:339344.

157. Smith GP, Gibbs J. Are gut peptides a new class of anorectic agents? Am J ClinNutr. 1992 Jan;55(l Suppl):283S-285S. Review.

158. Spencer GS. Immunization against cholecystokinin decreases appetite in lambs. J.Anim. Sci. 1992 Dec; 70(12): 3820-4

159. Steigerwalt RW, Williams JA. Binding specificity of the mouse cerebral cortex receptor for small cholecystokinin peptides.Regul Pept. 1984 Jan;8(l):51-9.

160. Stevens VC.Progress in the development of human chorionic gonadotropin antifertility vaccines.Am J Reprod Immunol. 1996 Mar;35(3): 148-55. Review.

161. Strohle A, Holsboer F, Rupprecht R. Increased ACTH concentrations associated with cholecystokinin tetrapeptide-induced panic attacks in patients with panic disorder. Neuropsychopharmacology. 2000 Mar;22(3):251-6.

162. Toth M.5-HT1A receptor knockout mouse as a genetic model of anxiety .Eur J Pharmacol. 2003 Feb 28;463( 1-3): 177-84. Review.

163. Van Megan HJGM, Westenberg MGM, den Boer JA Effect of the selective serotonin reuptake inhibitor fluvoxamine of ССК-4-induced panic attacks. Psychopharmacology 1997; 129: 357-64.

164. Van Megen H.J., Westenberg H.G., Den Boer J.A., Haigh J.R., Traub V. Pentagastrin induced panic attacks: enhanced sensitivity in panic disorder patients. Psychopharmacology Berl. 1994; 114:449-455.

165. Van Vliet IM, Westenbert HGM, Slaap BR, den Boer JA, Ho Pian KL. Anxiogenic effects of pentagastrin in patients with social phobia and healthy controls. Biol Psychiatiy 1997; 42: 76-8.

166. Vanderhaeghen JJ, Signeau JC, Gepts W.New peptide in the vertebrate CNS reacting with antigastrin antibodies. Nature. 1975 Oct 16;257(5527):604-5.

167. Van-Kampen J; Stoessl A J. The effects of CCK-4 on dopamine D1 agonist-induced grooming are blocked by a CCK(A) receptor antagonist: evidence for a novel CCK receptor subtype? Neuropharmacology. 1997 Nov-Dec; 36(11-12): 1679-88

168. Wang H, Wong PT, Spiess J, Zhu YZ.Cholecystokinin-2 (CCK2) receptor-mediated anxiety-like behaviors in rats.Neurosci Biobehav Rev. 2005;29(8): 1361-73 .Review.

169. Webb JK, Rupniak NM, Boyce S.Inhibition of pentagastrin-induced pressor response in conscious rats by the CCK-B receptor antagonist CI-988 and chlordiazepoxide.Regul Pept. 1996 Jan 16;61(l):71-6.

170. Wettstein JG, Bueno L, Junien JL. CCK antagonists: pharmacology and therapeutic interest. Pharmacol Ther. 1994;62(3):267-82. Review.

171. Wilson J, Watson WP, Little HJ. CCK(B) antagonists protect against anxiety-related behaviour produced by ethanol withdrawal, measured using the elevated plus maze.Psychopharmacology-Berl. 1998 May; 137(2): 120-31

172. Wise CD, Berger BD, Stein L. Evidence of -noradrenergic reward receptors and serotonergic punishment receptors in the rat brain. Biol Psychiatry. 1973 6(1):3-21.

173. Wolkowitz OM, Gertz B, Weingartner H, Beccaria L, Thompson K, Liddle RA. Hunger in humans induced by MK-329, a specific peripheral-type cholecystokinin receptor antagonist. Biol Psychiatry. 1990 Jul 15;28(2):169-73.

174. Wu LJ, Ко SW, Toyoda H, Zhao MG, Xu H, Vadakkan KI, Ren M, Knifed E, Shum F, Quan J, Zhang XH, Zhuo M.Increased anxiety-like behavior and enhanced synaptic efficacy in the amygdala of GluR5 knockout mice.PLoS ONE. 2007 Jan 24;2(l):el67.

175. Zacharko R, Koszycki D, Mendella P, Bradwejn J. Behavioral, neurochemical, anatomical and electrophysiological correlates of panic disorder. Multiple transmitter interactions and neuropeptide colocalization. Prog Neurobiol 1995; 47: 371—423.

176. Zhang K, Yuan Z, Bing Y, Chen X, Ding X, Chen D.Effects of active immunization against cholecystokinin 8 on performance, contents of serum hormones, and expressions of CCK gene and CCK receptor gene in pigs.Endocrine. 2007 Dec;32(3):338-44

Информация о работе

Рудько, Ольга Игоревна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.13

Диссертация

Долговременное действие пептидных регуляторов-индукторов тревожности: отложенные и инверсные эффекты - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы