Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инверсная иммунорегуляция, моделирование и коррекция патологического поведения

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Данилова, Раиса Александровна

4. Исследовать возможность коррекции судорожной активности крыс иммунизацией конъюгатом сиднофена, используя модель коразолового киндлинга и однократное введение коразола.

5. Изучить возможность индукции депрессивного состояния у крыс иммунизацией разными вариантами ковалентных конъюгатов ингибиторов МАО - паргилина и депренила, а также эндогенного ингибитора МАО — изатина; провести биохимические исследования активности МАО в органах и тканях иммунизированных крыс, а также уровня биогенных аминов в стриатуме. 6. Выявить возможность иммунизации крыс к конъюгированному фрагменту холецистокинина (ХЦК-4) и получения анксиолитического эффекта; провести сравнение эффектов иммунизации с действием самого ХЦК-4.

Научная новизна. Показано, что активная иммунизация крыс к основному ферменту метаболизма, этанола - гетерологичной алкогольдегидрогеназе печени лошади в разработанном режиме оказывает длительное подавляющее влияние на формирование экспериментального алкоголизма и не оказывает негативных влияний на поведение. Биохимическими следствиями иммунизации являются снижение активности АДГ в печени и надпочечниках. Показана возможность использования для активной иммунизации и повышения ее эффективности нового иммуностимулятора полиоксидония.

Обоснован иммунный механизм феномена подавления алкогольной мотивации иммунизацией к АДГ посредством выявления цепи реакций: быстрого связывания экзогенной АДГ лейкоцитами, индукции синтеза антител к АДГ после переноса этих лейкоцитов другому животному, и, наконец, подавления влечения к алкоголю у реципиентов лейкоцитов.

Разработан новый подход к углубленному изучению роли АДГ, а именно, эпитопов АДГ, ответственных за антиалкогольный эффект; установлено, что АДГ 265-276 является эпитопом, ответственным за подавление алкогольной мотивации, вызываемой целой молекулой АДГ.

Обосновано представление о том, что роль АДГ в формировании алкогольной мотивации не может быть связана с ее участием в образовании ацетальдегида. Наиболее вероятна связь через метаболизм некоторых нейромедиаторов и гормонов, в которых участвует АДГ.

Впервые показана возможность и эффективность использования для активной иммунизации лекарственных препаратов (сиднофен, паргилин, депренил), не являющихся эндогенными регуляторами, путем ковалентного связывания их с антигенами-носителями.

На модели коразоловых судорог и коразолового киндлинга показано, что иммунизация крыс к аналогу фенамина сиднофену оказывает противосудорожный эффект.

Выявлена эффективность модуляции активности МАО методом инверсной иммунорегуляции, которая вызывает длительные изменения как на биохимическом уровне, так и в поведении экспериментальных животных.

Индукция длительного состояния депрессии при таких воздействиях рассматривается как новая долговременная модель для фундаментальных исследований механизмов и патогенеза патологических состояний, связанных с нарушениями в системе МАО.

Исследования по активной иммунизации с использованием эндогенного регуляторного пептида ХЦК-4 позволили не только уточнить роль ХЦК-4 в регуляции поведения тревожности и страха, но и получить новые данные об анксиолитическом эффекте иммунизации и возможности направленной и длительной иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности и страха, а также депрессии.

Положения, выносимые на защиту. Иммунизация белых крыс к ферменту метаболизма этанола гетерологичной лошадиной АДГ вызывает длительное подавление процесса формирования алкогольной мотивации и не оказывает негативного влияния на ряд функций ЦНС, динамику веса и выживаемость.

Активная иммунизация к гетерологичной АДГ вызывает длительную продукцию антител, которые связывают и собственную эндогенную АДГ, изменяя ее активность в печени и надпочечниках.

Фрагментом АДГ, ответственным за антиалкогольный эффект иммунизации, является эпитоп АДГ 265-276, не связанный непосредственно с энзиматической активностью АДГ.

Роль АДГ в механизмах формирования влечения к этанолу не сопряжена (по крайней мере непосредственно) с метаболизмом этанола и образованием ацетальдегида. Более вероятно участие АДГ в метаболизме нейромедиаторов и гормонов, что подкрепляется биохимическими данными об изменении уровня ряда биоаминов в плазме крови и мозгу белых крыс.

Иммунизация ковалснтным конъюгатом психостимулятора и антидепрессанта сиднофена вызывает в отличие от активирующего действия самого препарата выраженные седативные эффекты. Последние коррелируют с противосудорожным эффектом иммунизации к сиднофену.

Следствием иммунизации крыс к ингибиторам МАО является повышение активности МАО в органах и тканях иммунизированных крыс и изменение уровня биогенных аминов. На поведенческом уровне это выражается в индукции долговременной депрессии.

Активная иммунизация к индуктору панических и тревожных состояний ХЦК-4 вызывает анксиолитические эффекты, противоположные действию самого пептида, а также оказывает антидепрессивное действие.

Полученные методом инверсной иммунорегуляции данные могут быть использованы для долговременной экспериментальной иммунологической коррекции и моделирования таких форм патологических состояний, как алкоголизм, депрессия, повышенная судорожная готовность, тревожность и страх.

Практическое значение. Иммунологические подходы в настоящее время находят широкое применение в клинике. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что инверсная иммунорегуляция - иммунизация ковалентными конъюгатами эндогенных регуляторов с антигенами-носителями или гетерологичными ферментами, определяющими метаболизм эндогенных регуляторов, - представляется наиболее перспективным путем долговременной коррекции ряда патологических состояний. Основное преимущество его состоит в долговременности вызываемых эффектов при небольшом числе воздействий. Такой подход в терапии ряда хронических болезней, таких как алкоголизм и психические нарушения, позволяет избежать многократного систематического введения лекарственных препаратов, обладающих кратковременным действием.

Длительное подавление алкогольной мотивации и отсутствие негативных побочных эффектов в поведении иммунизированных АДГ крыс указывает на относительную «мягкость» применяемых воздействий и дает основание рассматривать его как принципиально новый подход к снижению алкогольной мотивации, который может быть рекомендован для исследований в клинической практике, особенно для лечения тяжелых форм алкоголизма. Результаты иммунизации с использованием нового иммуномодулятора - полиоксидония позволяют избежать" применения не разрешенного для использования в клинике адъюванта Фрейнда.

Индукция длительного депрессивного состояния при иммунизации к сиднофену и ингибиторам МАО может быть рекомендована для исследований, имеющих целью терапию маниакальных и агрессивных состояний, а также, имея в виду результаты с иммунизацией к сиднофену, для купирования повышенной судорожной готовности. Помимо этого, сама модель депрессии может служить инструментом для более глубокого изучения патогенеза и выявления наиболее перспективных антидепрессантов.

Перспективы долговременных воздействий связаны также с иммунизацией к регуляторным пептидам. Полученные нами данные об анксиолитическом эффекте иммунизации конъюгатом

ХЦК-4 крыс с исходно высоким уровнем тревожности могут быть рассмотрены в плане возможной в будущем практической реализации - коррекции патологических состояний тревожности и страха у людей.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 31 Международном конгрессе по физиологическим наукам (Хельсинки, 1989); 28 Совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Ленинград, 1989); Международном симпозиуме «Сигнальные молекулы и поведение животных» (Пущино, 1989); Международном симпозиуме по проблемам иммунофармакологии (Тбилиси, 1990); Конгрессе международного общества патофизиологов (Москва, 1991); Международной конференции по психонейроэндокринным механизмам адаптации (Италия, 1991); Конференции Балканских стран по алкоголизму и наркотической зависимости (Белград, 1995); Международной конференции по нейрохимии и фармакологии наркотической зависимости и алкоголизма (Санкт-Петербург, 1996); 1 Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996); 2 съезде Биохимического общества (Москва, 1997); Международном симпозиуме по алкоголизму (Гродно, 1998); Международной конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 1999); Всероссийской конференции по нейроиммунопатологии (Москва, 1999); Международной конференции «Медицина в следующем веке» (Польша, 2000); 30 Всероссийском совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Санкт-Петербург, 2000); 18 съезде физиологического общества (Казань, 2001); Междун. конфер. по эксперт, биол. Америк, общ-ва фармак., экспер. терапии (США, 2000); на заседаниях кафедр высшей нервной деятельности и физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

ОСНОВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на белых беспородных крысах - самцах, а также крысах линии Wistar, Maudsley reactive (MR) и Maudsley nonreactive (MNRA).

Использованы следующие препараты: АДГ из печени лошади фирмы Sigma (США), фармакологические препараты -сиднофен (З-ф-фенилизопропил)-сиднонимина гидрохлорид), паргилин (N-benzyl-N-methyl-2-propynylamine, «Sigma»), депренил (М-диметил-N [2-пропил] бензенэтанамин гидрохлорид) (ICN Biomedical Inc, США), изатин (2,3 диоксииндол), синтезированный в Ин-те биологической медицины, а также пептид ХЦК-4 (ICN Biomedical Inc, США).

Синтез ковалентных конъюгатов

1. Синтез конъюгата паргилина с БСА (как и синтез ряда других конъюгатов) был осуществлен М.Ф. Обуховой, многолетнее сотрудничество с которой явилось непременным условием реализации основных этапов программы настоящего исследования. Он проводился как с использованием глутарового альдегида, так и с использованием в качестве'связующего агента карбодиимида-1 (N-3thji-N З-диметиламинопропил карбодиимид солянокислый (КДИ)) в различных молярных соотношениях (1:50, 1:100 и 1:500). Предварительно с помощью меченого паргилина была оценена степень связывания препарата с белком, оптимальная продолжительность реакции и устойчивость конъюгата при хранении.

Меченый [G-3H] паргилин с общей активностью 0.3 mCi, специфической активностью 0.5 Ci/mmol был синтезирован в Ин-те молекулярной генетики РАН (ВЛ.Шевченко); чистота меченого паргилина составляла >95%. Показано, что изменение молярного соотношения БСА и паргилина от 1:50 до 1:100 вызывает увеличение связывания препарата и составляет 14-19 молекул на 1 молекулу БСА.

Дальнейшее повышение содержания паргилина в реакционной смеси существенно не изменяло степени его включения.

2. Конъюгирование сиднофена с бычьим сывороточным альбумином (БСА) проводили с помощью 1%-ного глутарового альдегида (фирма Serva, Германия) при молярном соотношении белок/сиднофен 1:80 в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,5-8,0. Конъюгат, полученный при таком молярном соотношении компонентов реакции, после диализа содержал от 18 до 27 молей сиднофена на 1 моль белка. Количество связанного сиднофена определяли спектрофотометрически по поглощению при 310 нм.

3. Синтез ковалентных конъюгатов депренила и изатина с БСА в молярных соотношениях 1:100 и 1:200, а также фрагмента ХЦК (30-33) с молярным соотношением 1:100 проводился аналогичным образом с использованием КДИ.

4. Синтез и конъюгация эпитопа АДГ (265-276) с гемоцианином был проведен В.Н. Прозоровским (Ин-т биомедицинской химии РАМН) при помощи 25%-ного глутарового альдегида в 0.1М фосфатном буфере, рН 7.0. Соотношение белка с пептидом составляло 1:30. Там же были получены и любезно предоставлены нам антитела к трем фрагментам АДГ печени лошади: 265-276 (титр антител - 1/12000), 93-115 (титр - 1/15000) и 1-14 (титр -1/20000), которые использовались для пассивной иммунизации.

Иммунизация крыс конъюгатами или препартом АДГ проводилась три раза, с интервалом в 7-8 дней, в четыре точки спины; первые два раза с использованием в основной части экспериментов иммуностимулятора адъюванта Фрейнда (ICN Biomedical Inc, США) в объемном соотношении 1:1. В отдельных сериях в качестве иммуностимуляторов были использованы вакцина БЦЖ, оксид алюминия, гуанилмюрамил дипептид и полиоксидоний. Дозы иммунизации, как правило, были выбраны из расчета 600-800 мкг белка конъюгата на кг веса. В качестве контроля использованы группы с введением 1) физраствора,

2) адъюванта Фрейнда и 3) БСА, обработанного глутаровым альдегидом, с адъювантом Фрейнда.

При пассивной иммунизации используемые агенты вводились в хвостовую вену.

Иммунологический анализ сывороток крови контрольных и опытных животных проводился с использованием твердофазного иммуноферментного метода (ELISA); фосфатный посадочный буфер рН 7,5 (М.Ф.Обухова).

Поведенческие исследования проводили через три - четыре недели после начала иммунизации и в более поздние сроки с использованием следующих тестов.

1. Двигательная и ориентировочно-исследовательская активность оценивалась в автоматическом приборе «РОДЭО» как в обычных условиях, так и при наличии стрессового раздражителя -прерывистого звукового сигнала. Общее время тестирования составляло 5-10 минут.

2. Для выявления компонентов тревожности и страха в поведении крыс был использован приподнятый крестообразный лабиринт (Pellowetal., 1985).

3. Склонность крыс к развитию депрессивно-подобного состояния оценивали по методике Порсольта в тесте неизбегаемого плавания (Porsolt et al., 1978). С использованием компьютерной программы регистрировали продолжительность активного (энергичные движения всеми лапами) и пассивного (слабые гребки задними лапами) плавания, а также иммобилизации - неподвижности животного.

4. Для оценки способности крыс к обучению использована модель пищедобывателыюго условного рефлекса в У-образном лабиринте и условного рефлекса активного избегания (УРАИ).

5. Порог болевой чувствительности определяли в тесте «tail-flick» по времени отдергивания хвоста при помещении его в сосуд с нагретой до 55° водой. Измерения проводились 4 раза с интервалом 10 минут (каждое измерение - не дольше 30 секунд).

6. Оценка судорожной готовности крыс проводилась с использованием однократного подкожного введения пороговой дозы коразола (60 мг/кг веса) в течение 30 минут от момента введения. Для формирования модели фармакологического киндлинга коразол вводился в подпороговой дозе (30 мг/кг) ежедневно в течение 21 дня.

7. Алкоголизация животных проводилась по методике свободного выбора между 15%-ным этанолом и водой (Буров, Ведерникова, 1985) в индивидуальных клетках с регистрацией количества этанола и воды, выпитые каждой крысой за сутки.

8. Чувствительность к наркотической дозе этанола оценивалась по продолжительности бокового положения после внутрибрюшинного введения 25%-ного раствора этанола из расчета 4,5г чистого этанола на ю- веса (СЬигЬ е1 а1., 1979).

Биохимические исследования.

Для определения активности АДГ (исследования осуществлены при сотрудничестве с Ин-том Биомедхимии сотрудниками А.В.Пшежецким и Т.А.Москвитиной) мозг, печень и надпочечники после иммунизации дважды гомогенизировались в 0.1 М фосфатном буфере; рН 7.4. Гомогенаты центрифугировались при 105000g в течение 1.5 часов. Осадки отбрасывались, супернатанты фильтровались и использовались для определения активности АДГ. Активность АДГ определялась спектрофотометрически в 8 мМ ИАБН и 60 мМ этанола (Ое^е1 й а1., 1996), используя спектрофотометр Shimad7.ii Ц\/-240 с термостатированной кюветой при 37°С (340 пш). Концентрация белка определялась по Лоури.

Для определения активности эндогенных изоферментов МАО (Т.А.Москвитина) у контрольных и опытных крыс выделяли печень, сосуды и замораживали при I —20° С. Выделение митохондриальной фракции проводилось по общепринятой методике дифференциального центрифугирования из 10% гомогената. Осадок после центрифугирования при

§ несколько раз промывали 0,05 М К-Ыа фосфатным буфером, рН 7,4, хранили не более 3-х суток при г -20°С. Белок определяли по методу Лоури, активность МАО - радиометрически (модифицированный радиометрический метод определения активности аминооксидаз), используя в качестве субстратов для МАО А и МАО Б, соответственно, серотонин (100 иМ, С14, 4 Кю/моль) и фенилэтиламин (50 иМ, С14,5 Кю/моль).

В опытах по ;; определению общей активности МАО (Е.В.Шмальгаузен) активность измеряли по накоплению окрашенного продукта (450нм) в ходе окисления п-нитрофенилэтиламина при 25° С. Реакционная смесь содержала 950 мкл 50 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, 25 мг тритона Х-100, 50 мкл суспензии митохондрий и 0,1 мМ п-нитрофенилэтиламина. Изменение поглощения на 0,01 соответствует образованию 0,33 нмоль N114+.

Уровень моноаминов и их метаболитов (в сотрудничестве с М.Л.Цирениной и Е.И.Мельником, а также И.И.Афанасьевым и Э.А.Андяржановой) определялся с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией.

Для статистической обработки полученных данных использовали U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, t-критерий Стьюдента, двухфакторный дисперсионный анализ из пакета статистических программ "Stadia", а также пакет статистических компьютерных программ Excel и Statistica.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Физиологические и биохимические эффекты иммунизации к фермептам - алкогольдегидрогеназе и ацетальдегиддегидрогеназе.

1.1. Иммунизация к алкогольдегидрогеназе.

Алкогольдегидрогеназа (АДГ) является одним из ключевых ферментов метаболизма этанола. В отличие от ацетальдегиддегидрогеназы (АцДГ), ингибирование которой широко используется для формирования аверсии к этанолу, роль АДГ в биохимических механизмах формирования влечения к алкоголю далеко не ясна.

Мы использовали активную иммунизацию беспородных белых крыс и крыс линии Wistar гетерологичной лошадиной АДГ (первый изозим АДГ -АДГ1) для направленной и избирательной регуляции активности. АДГ у подопытных животных in vivo с последующей оценкой разных форм поведения (и, прежде: всего, алкогольной мотивации) и активности эндогенной АДГ. С целью выявления оптимальных условий для реализации действия гетерологичной АДГ были использованы различные методы иммунизации и экспериментальные режимы.

Было обнаружено, что иммунизация интактных крыс (трехкратное введение 150 мкг АДГ в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) с интервалом 7-10 дней) на достаточно длительный период (до 2 месяцев) подавляет у крыс формирование экспериментального алкоголизма в ситуации свободного предпочтения воды и 15%-ного раствора этанола (Рис.1).

Активная иммунизация предварительно иммунизированных крыс эффективна только в том случае, когда она проводится на фоне временного лишения крыс алкоголя (по аналогии с обычными клиническими условиями лечения алкоголизма). Менее сильные и продолжительные эффекты были отмечены при снижении дозы иммуногена до 50 и 25 мкг на животное.

Рис. 1. Среднесуточное потребление 15%-ного раствора этанола (мл) крысами после иммунизации против лошадиной АДГ, проводимой до начала алкоголизации (а) и после предварительной алкоголизации и на фоне депривации (б). Период депривации и иммунизации соответствует пробелу на кривых. Различия между опытными (сплошная линия) и контрольными группами в период с 1-го по 170-й дни (а) и с 1-го по 70-й (б) дни статистически значимы (р < 0,001).

Следует подчеркнуть, что подавление алкогольной мотивации имело место в сопоставлении с двумя типами контрольных животных — интактными (введение физраствора) и инъецированными адъювантом Фрейнда.

Степень выраженности антиалкогольного эффекта иммунизации сильно зависит от исходной алкогольной мотивации подопытных крыс, которая может значительно варьировать как среди крыс разных экспериментальных серий, так и в пределах одной серии. Поэтому, для получения стабильного и наиболее выраженного эффекта иммунизации и возможного выявления метаболических особенностей, обуславливающих различную выраженность подавления алкогольной мотивации, были проанализированы несколько других линий крыс - August, MR (Maudsley reactive) и MNRA (Maudsley nonreactive). Согласно данным литературы крысы линии MNRA менее тревожны и обладают большей устойчивостью к неизбегаемому острому и хроническому стрессу по сравнению с крысами линии MR (Commissaris et al., 1996). У крыс MNRA больше чувствительность тормозных альфа-адренергических нейронов мозга, меньше содержание катехоламинов в структурах положительного подкрепления, а также ниже стресс-реактивность этой системы (Sara et al., 1993).

Сравнение линий крыс по количеству потребляемого этанола показало, что крысы линии MNRA потребляют больше 15%-ного раствора этанола по сравнению с остальными линиями, а также быстрее достигают высокого уровня среднесуточного потребления этанола. Результаты исследований с активной иммунизацией к АДГ показали, что наиболее стабильное и эффективное подавление алкогольной мотивации наблюдается именно у «многопьющих» крыс линии MNRA по сравнению с другими линиями (Рис. 2). сутки алкоголизации

Рис. 2. Потребление 15%-пого этанола крысами линии MNRA (в % к контролю) после иммунизации к АДГ. Различия между контролем и опытом статистически значимы при р< 0.005.

Иммунологический анализ (ELISA) свидетельствовал о наличии в сыворотке крови иммунизированных к АДГ лошади крыс устойчивого и значимого титра антител к этому ферменту (Рис.3). Эти антитела обладали значительной реактивностью по отношению к одной из изоформ АДГ печени крысы - АДГ-3 (соответствующей АДГ-1 человека). Способность антител крыс против АДГ реагировать с АДГ-3 печени крысы была продемонстрирована и методом иммуноблотинга. Титр антител к АДГ-2 печени крысы статистически значимо не отличался от контрольного уровня (М.Ф.Обухова, А.В.Пщежецкий).

Рис. .1 Гис.ч

Рис.3. Титры антител в' сыворотках контрольных (светлые столбики) и иммунизированных АДГ (темные столбики) крыс: а - против АДГ печени лошади, б - АДГ-2, в - АДГ-3 печени крысы.

Рис. 4. Активность (ти на мг белка в супернатанте) различных АДГ-изозимов в тканях контрольных крыс (светлые столбики) и после иммунизации к лошадиной АДГ (темные столбики); а - АДГ-3 в печени, б -АДГ-2 в печени, в - АДГ-1 в слизистой желудка, г - АДГ-2 в мозге.

Таким образом, показано, что активная иммунизация к гетерологичной АДГ вызывает длительную продукцию антител.

Исследование специфической активности этого фермента в тканях различных органов показало, что иммунизация крыс АДГ печени лошади не отражается на уровне активности изоферментов АДГ-1 в стенках желудка, а также АДГ-2 в печени и мозге. В то же время уровень активности АДГ-3 в печени иммунизированных крыс снижен практически в два раза по отношению к контролю (Рис.4).

Антиалкогольный эффект иммунизации против гетерологичной АДГ был подтвержден в опытах с пассивной иммунизацией алкоголизированных крыс. Внутривенное введение выделенных специфических антител против АДГ печени лошади вызывало такие же изменения в потреблении алкоголя, как после активной иммунизации, однако, продолжительность подавления была много меньше, около 2-3 суток.

Иммунная основа механизма подавления влечения к этанолу в опытах с активной иммунизацией к АДГ была продемонстрирована и в совместных опытах с Л.А.Ляпиной (лаб.крови каф. физиологии человека и животных) с переносом лейкоцитов. Для этого через 1 сут после внутривенного введения крысам АДГ из крови их извлекались лейкоциты и вводились внутривенно интактным крысам. Аналогичная операция без АДГ проводилась с контрольными крысами. Выбор срока извлечения лейкоцитов диктовался как общими соображениями о динамике иммунопоэза, гак и полученными данными о динамике элиминации АДГ из плазмы. Через 10 дней крысы, получившие лейкоциты от животных, у которых развивались начальные стадии иммунопоэза после введения АДГ, демонстрировали достоверное снижение уровня потребления этанола (Рис. 5). мл

Рис. 5. Среднесуточное потребление 15%-ного этанола (мл) крысами после внутривенной инъекции фракции лейкоцитов: 1 - от контрольных крыс; 2 - от крыс, получивших АДГ.

Высокий уровень иммуноспецифичности эффекта и отсутствие какой-либо взаимосвязи между энзиматической активностью АДГ в препаратах, используемых для иммунизации, и последующим подавлением алкогольной мотивации показан в исследованиях с иммунизацией крыс энзиматически неактивными фрагментами АДГ-1, известными как эпитопы АДГ (ОггеЬепзЫкоуа с1 а!., 1994), любезно предоставленными нам В.Н.Прозоровским.

Большое число эпитопов в молекуле АДГ (Уи-ЭДа! Но е1 а1., 1991) требовало выяснения вопроса о том, какой именно из них является ключевым для развития феномена подавления алкогольной мотивации.

Фракции антител против эпитопов АДГ 1-14, 93-115 и 265276, полученные в исследованиях В.Н.Прозоровского, были использованы для пассивной иммунизации предварительно алкоголизированных крыс. Только антитела против эпитопа 265276 вызывали значительное подавление алкогольной мотивации в течение 3 дней после введения. Поэтому, в дальнейших экспериментах с активной иммунизацией был использован эпитоп 265-276. Поскольку размер эпитопа АДГ 265-276 относительно невелик, для эффективной иммунизации был использован его ковалентный конъюгат с гемоцианином в качестве антигена-носителя. Иммунизация фрагментом АДГ 265-276 продемонстрировала значительное снижение уровня потребляемого этанола. Это свидетельствует о том, что АДГ 265276 является эпитопом, ответственным за подавление алкогольной мотивации, вызываемой иммунизацией к целой молекуле АДГ.

Таким образом, все представленные выше данные указывают на иммунную основу длительного снижения алкогольной мотивации у крыс, иммунизированных гетерологичной лошадиной АДГ. Этот феномен, в принципе, согласуется с подавлением алкогольного влечения некоторыми препаратами, являющимися ингибиторами АДП, такими, например, как 4-метил-пиразол и метронидазол (Се<1егЬаит ег а1., 1982; 1№ге»£апс1,1982). Однако, иммунизация к АДГ обеспечивает гораздо более длительный и глубокий эффект. Механизм этого феномена мало изучен. При его рассмотрении выявляется ряд противоречий с современными представлениями о роли АДГ в алкогольной мотивации:

1) подавление АДГ-I у алкоголизированных животных должно выражаться в уменьшении образования ацетальдегида, который, как хорошо известно, является аверсивным фактором при потреблении этанола; следовательно, подавление АДГ-1 должно, напротив, увеличивать потребление этанола;

2) подавление АДГ-I активности в печени (основном органе, содержащем АДГ-I) у иммунизированных крыс показано, но степень торможения достаточно умеренна; вероятно, существуют какие-либо другие мишени для анти АДГ-антител.

Возможный ответ на эти вопросы заключен в гипотезе о существовании других форм участия АДГ-I в регуляции поведения, которые не связаны с образованием ацетальдегида. Имеется достаточно большое число публикаций, указывающих на участие АДГ-I в метаболизме ретиноидов (Napoli, 1999), стероидов (Gough et al., 1991) и биоаминов (Raskin et al., 1970; Tabakoff et al., 1970; Mardh et al., 1985; 1976; Consalvi et al., 1986; Doo-Hong Park et al., 1991). Среди регуляторных систем организма, связанных с потреблением этанола, биоамины являются одними из наиболее признанных регуляторов (Diamond et al., 1997).

Основным органом, содержащим АДГ-I, является печень. Но АДГ-I широко представлена и в других периферических органах, доступных для антител. Однако, лишь немногие из них могут рассматриваться как возможные участники в синтезе веществ, регулирующих алкогольную мотивацию в масштабах целого организма. Поэтому, мы сосредоточили внимание на эндокринных органах, которые могут реализовать быстрое и сильное влияние на поведение. Исходя из этого, мы решили исследовать надпочечники, как один из ведущих периферических эндокринных органов, синтезирующих биоамины и содержащих значительное количество АДГ-I (Julia et al., 1987; Estonius et al., 1996).

Изменения активности АДГ-I в надпочечниках и печени иммунизированных к АДГ и контрольных крыс (выполнено Т.А.Москвитиной) представлены в табл.1. В соответствии с литературными данными активность АДГ-1 в надпочечниках намного меньше, чем в печени. Однако, как показывают результаты экспериментов, степень подавления АДГ после иммунизации намного выше, чем в печени, - практически полная (более чем в 50 раз, принимая во внимание максимальную чувствительность определения фермента).

Таблица

Активность АДГ в печени и надпочечниках контрольных крыс и после иммунизации АДГ-1 печени лошади.

Активность АДГ (пМ/т^пйп) % к

Органы контрольные крысы иммунизированные крысы контролю

Печень 512,2+67,1 281,7+73,7 55+

Надпочечники 31,8 ± 15,

Развиваемое представление о том, что роль АДП в формировании влечения к этанолу непосредственно не сопряжена с метаболизмом этанола, а более вероятно участие АДГ в метаболизме нейромедиаторов и гормонов, подкрепляется биохимическими данными об изменении уровня ряда биоаминов в плазме крови и мозгу белых крыс (Рис.6).

Рис. 6. Содержание биоаминов в плазме и мозге крыс (% к контролю) после введения АДГ. * - р < 0,05; ** - р < 0,01.

Однократное внутривенное введение 150 мкг АДГ I без адъюванта существенно снижало уровень серотонина в плазме крови и мозге и норадреналина в плазме крови.

1.2. Иммунизация к ацетальдегиддегидрогеиазе.

Ацетальдегидцегидрогеназа (АцДГ) обеспечивает снижение концентрации ацетальдегида, и подавление активности АцДГ, ведущее к накоплению последнего, должно снижать влечение к алкоголю. Именно этот эффект лежит в основе действия таких фармакологических средств, как тетурам и его аналоги, которые подавляют активность апетальдегиддегидрогеназы (АцДГ) и повышают таким образом уровень ацетальдегида, образующегося при окислении экзогенного этанола. Ацетальдегид вызывает тяжелые субъективные ощущения и индуцирует аверсию к этанолу опосредованно, формируя негативный рефлекс на прием алкоголя. Иммунизация к АцДГ встречает дополнительные препятствия - главный изозим АцДГ находится внутри митохондрий, доля АцДГ в цитоплазме клеток сравнительно невелика. Воздействие антител на митохондриальные ферменты возможно, по-видимому, лишь на стадии сборки митохондрий и синтеза их компонентов.

В наших исследованиях показано, что иммунизация крыс разными дозами гетерологичной дрожжевой АцДГ сопровождается формированием антител к АцДГ и снижением влечения крыс к этанолу, но этот эффект был менее значительным и менее продолжительным, чем в опытах с иммунизацией к АДП. Иммунизация крыс к двум ферментам одновременно (АДГ и АцДГ) вызывала более значительное и длительное (до 2 месяцев) уменьшение потребления этанола, чем иммунизация к АцДГ. Трактовка этих результатов представляется более простой по сравнению с аналогичными данными для АДГ. В этом случае вероятны повышение уровня ацетальдегида и его аверсивное действие. Тем не менее, и здесь нельзя исключить роль АцДГ в других метаболических процессах. Учитывая мягкость режима иммунизации к АцДГ, трудно предполагать значительное подавление активности фермента, основная ацетальдегид-расщепляющая форма которой локализована в митохондриях.

1.3. Влияние иммунизации к АДГ на поведение крыс.

Влияние иммунизации к АДГ на алкогольную мотивацию является следствием и/или спутником изменений других высших функций мозга. Действие аутоантител к АДГ1 на алкогольную мотивацию и вообще на функции мозга может осуществляться именно через непрямые, косвенные влияния, так как в самом мозге АДГ1 отсутствует и можно лишь допустить миграцию биорегуляторов через ГЭБ при изменении их уровня вне мозга.

Изучение психо-эмоционалыюго статуса крыс, иммунизированных АДГ, выявило следующие моменты. В большинстве случаев у иммунизированных крыс, как интактных, так и предварительно алкоголизированных, отмечено повышение двигательной и ориентировочно-исследовательской активности.

Использование теста Порсолта для оценки возможной поведенческой депрессии в условиях неизбегаемого плавания показало, что иммунизация крыс против лошадиной АДГ I в разные сроки после ее начала статистически значимо снижает время иммобилизации животных, причем эффективны все исследованные дозы иммуногена — 25, 50 и 150 мкг на крысу. Как видно (Рис. 7), иммунизация 50 мкг АДГ более чем в два раза снижает время иммобилизации по сравнению с контрольной группой животных (р<0.01), а увеличение доза антигена до 150 мкг увеличивает эти различия почти в 4.5 раза (р<0.005), т.е. эффект дозозависимый.

Аналогичный эффект наблюдается и при иммунизации предварительно длительное время (5-6 месяцев) алкоголизированных крыс.

Время, с Ш\

Рис.7. Время иммобилизации (в тесте Порсолта) у контрольных (1) и иммунизированных 50 (2) и 150 мкг (3) АДГ крыс. *- р < 0,01; **- р< 0,005.

Позитивные эффекты иммунизации отмечены и при формировании у иммунизированных крыс условных рефлексов с положительным и отрицательным подкреплением.

В тесте этанолового наркоза (при введении наркотической дозы 25%-ного раствора этанола) отмечено увеличение продолжительности сна в 1,5 — 2 раза как после активной иммунизации нативных крыс АДГ, так и при однократном введении АДГ (р<0.01). Иммунизация предварительно алкоголизированных крыс не приводит к изменениям продолжительности сна в среднем по группе, но процент «короткоспящих» животных в опытной группе значительно меньше, чем в контрольной алкоголизированной группе (р<0.05). Полученные факты могут быть следствием снижения активности эндогенной АДГ печени у иммунизированных крыс.

Таким образом, показано, что иммунизация крыс ферментами метаболизма этанола и, прежде всего, АДГ сопровождается образованием аутоантител к этим ферментам, снижением активности АДГ в печени и надпочечниках иммунизированных крыс и вызывает длительное снижение процесса формирования экспериментального алкоголизма.

Отсутствие негативных побочных эффектов и даже некоторое улучшение показателей поведения при иммунизации белых крыс к АДГ и его эффективность в плане алкогольной мотивации дает основание для разработки метода иммунокоррекции тяжелых случаев алкоголизма у людей. По степени гетерологичности, различиям последовательностей составляющих аминокислот АДГ1 крысы, лошади и человека близки друг к другу.

Однако, этот подход встречал зйачительное затруднение для использования в клинике - применяемый в эксперименте адъювант Фрейнда не разрешен Минздравом для применения на людях.

Проводимые нами исследования с использованием других адъювантов, таких как вакцина БЦЖ, оксид алюминия, гуанилмюрамил дипептид, свидетельствовали о меньшем антиалкогольном эффекте по сравнению с адъювантом Фрейнда.

В последних исследованиях мы использовали новый иммуномодулятор полиоксидоний (созданный в Ин-те иммунологии Минздрава РФ) - сополимер N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазина бромида, который в настоящее время с успехом применятся в клинике. Антиалкогольный эффект при иммунизации крыс к АДГ вместе с полиоксидонием по своей эффективности не уступает аналогичной процедуре с адъювантом Фрейнда.

Кроме того, на основании полученных данных был предложен еще один подход для иммунокоррекции алкогольной мотивации. Известно, что хроническое потребление алкоголя приводит к модификации различных белков за счет образования ацетальдегид-аддуктов (Lin, Lumeng, 1990, Worrall et all, 1994). Наиболее уязвимыми мишенями такого связывания являются АДГ и АцДГ, в непосредственной близости от которых находится образующийся ацетальдегид. Вследствие такой модификации они могут приобретать аутоиммуногенные свойства и вызывать образование аутоантител. Однако без иммуностимуляции, вследствие низкой общей иммунореактивности больного алкоголизмом, подобная аутоиммунизация выражена очень слабо. Повышение иммунного статуса организма различными иммуйомодуляторами на стадии алкоголизма, когда можно ожидать появления иммуномодифицированных АДГ и АцДГ, с целью усиления собственного образования антител к ферментам обмена этанола - АДГ и АцДГ могло бы привести к снижению алкогольной мотивации, как в случае с иммунизацией к АДГ.

Исследования, направленные на оценку возможности применения эйфйрола, препарата, содержащего полиненасыщенные жирные кислоты и обладающего свойствами иммуномодулятора (В .А.Исаев), свидетельствуют о снижении алкогольной мотивации и некоторой коррекции поведения предварительно алкоголизированных крыс в период депривации от этанола. У алкоголизированных крыс после курсового применения эйфйрола отмечено появление антител к АДГ и небольшое снижение активности АДГ в печени.

2. Влияние иммунизации к психотропному агенту -сиднофену на физиологический и биохимический статус крыс,

Иммунокоррекция физиологического статуса не требует обязательного использования биорегуляторов, идентичных эндогенным регуляторам, как в случае с АДГ. Изучение механизмов действия фармакологических средств показывает, что многим из них соответствуют в организме те или иные эндогенные аналоги-регуляторы или их комплексы. ЬСовалентное присоединение фармакологических средств к антигенам-носителям и иммунизация этими конъюгатами приводит к образованию антител к фармакологическим средствам. Эти антитела могут связывать не только используемые для иммунизации фармакологические агенты, но и их эндогенные аналоги-регуляторы, вызывая длительные изменения физиологического статуса. Мы обратились к некоторым антидепрессантам и психостимуляторам, рассчитывая на то, что образующиеся антитела могут связывать их эндогенные аналоги и формировать длительные состояния, сходные с эффектами агентов нейролептического характера. Был использован сиднофен (3-( Р -фенилизопропил) сиднонимина гидрохлорид) - психостимулятор с антидепрессивной активностью, родственный по структуре фенамину.

2.1. Анализ поведения и обучаемости крыс через 1-2 месяца после иммунизации показал, что в отличие от активирующего действия самого сиднофена иммунизация конъюгатом сиднофена вызывает в поведении животных выраженные седативные эффекты. Об этом . свидетельствует снижение показателей двигательной и ориентировочно-исследовательской активности в открытом поле (Рис. 8). О подавлении ориентировочно-исследовательской активности у иммунизированных крыс свидетельствует и снижение показателей в тесте "hole board", а также при помещении крыс в 3-лучевой лабиринт с регистрацией числа заходов в каждый рукав (р<0.05).

15В - * •

- ♦ я

• « • • » !

1221—ИКаPwfилУ/А

113 i

Рис. 8. Показатели поведения крыс после иммунизации конъюгатом сиднофена с БСА (в % по отношению к контрольной группе). 1 - число подкрепляемых реакций при выработке пищедобывательного рефлекса, 2-3 -количество запаздываний в нижние и верхние норки в открытом поле, 4-5 -время иммобилизации в ситуации неизбегаемого плавания в 1-й и 2-й опытные дни. - статистически значимые различия при р < 0,05; ** - при р < 0,01.

Наиболее выраженные изменения отмечены при выработке у иммунизированных животных условно-рефлекторного пищедобывательного навыка - достоверное ухудшение по всем показателям обучения: число подкрепляемых реакций (р<0.01), число безошибочных реакций (р<0.01) и время выполнения реакции (р<0.01). Доля "плохо обучающихся" крыс (выполняющих менее 50% подкрепляемых реакций) составляла в группе иммунизированных животных 73% против 9% и 38% крыс после введения только ПАФ и физиологического раствора соответственно. У 15% животных выработка условно-рефлекторного навыка оказалась невозможной. Для большинства животных, иммунизированных конъюгатом сиднофена, при помещении их в экспериментальную среду характерны низкий уровень ориентировочно-исследовательской активности, неподвижность, оцепенение. Отмечается настораживание, пугливость, боязнь взять корм из кормушки; двигательная активность чаще проявляется импульсами. Все это сопровождается признаками вегетативного возбуждения (частая дефекация, уринация). Такое поведение крыс в экспериментальной обстановке можно охарактеризовать как пассивную форму поведения с признаками тревоги. В результате формирование пищедобывательного навыка у них оказывается сильно затрудненным, а иногда и вообще невозможным. В значительной мере это связано с подавлением ориентировочно-исследовательской активности и появлением депрессивно-подобного состояния. Эффект иммунизации в этом случае прямо противоположен действию самого сиднофена, который способствует повышению обучаемости (Белозерцев, 1984), причем улучшение показателей обучения связано именно со стимуляцией преимущественно эмоциональной сферы и двигательной активности (Виноградов, Гречко, 1982).

Об этом свидетельствуют и данные, полученные при использовании классического теста Порсолта, позволяющего оценить депрессивные компоненты в составе поведения в условиях неизбегаемого плавания. По типу реагирования в ситуации неизбегаемого плавания (Батурин и др., 1990) до 90% иммунизированных крыс относятся к пассивному (преобладание пассивного плавания) и иммобилизационному (выраженная неподвижность в динамике плавания) типам, в то время как крысы контрольной группы предпочитают активное плавание. Для оценки полученных данных мы использовали также «индекс депрессивности» (Щетинин и др., 1989), отражащий соотношение числа самых коротких периодов иммобилизации к количеству периодов активного плавания. По данным этих авторов этот показатель при депрессогенных воздействиях выше 0.98 и, напротив, ниже этих значений при действии антидепрессантов. «Индекс депрессивности» у иммунизированных сиднофеном крыс составлял 1.84, в то время как в группах с введением физраствора и ПАФ - 0.82 и 0.68 соответственно.

Достоверное превышение времени иммобилизации у иммунизированных животных по сравнению с контролем, характер изменения структуры иммобилизации, увеличение коэффициента иммобилизации и индекса депрессивности однозначно указывают на наличие выраженного депрессогенного эффекта у крыс, иммунизированных конъюгированным сиднофеном - психостимулятором с антидепрессивными свойствами.

Наблюдаемые изменения в поведении иммунизированных крыс носили длительный характер - максимально развиваются через 2-4 недели после иммунизации и сохраняются до 1.5-2 месяцев.

Таким образом, иммунизация конъюгатом сиднофена с БСА позволила получить длительное изменение эмоционального статуса - депрессию поведенческой активности белых крыс. Обнаруженные изменения сходны в некоторых элементах с эффектами, вызываемыми нейролептиками, а их направленность противоположна тому, что наблюдается при действии самого сиднофена.

2.2. Судорожная активность. Известно, что сиднофен -психостимулятор со свойствами ингибитора МАО - оказывает провоцирующее влияние на судорожную активность и потенциирует эффекты судорожных агентов (Чугунов, 1976; Лаврецкая, 1985). Использована коразоловая модель судорог при однократном введении пороговой дозы (60 мг/кг) и модель нарастающей судорожной готовности при повторных воздействиях подпороговых доз коразола (30 мг/кг), т.е. модель фармакологического кинддинга (Шандра и др., 1983).

В группе иммунизированных крыс при введении коразола на 35-40-й день после начала иммунизации (период наиболее выраженных поведенческих изменений) отмечено статистически значимое увеличение латентного периода наступления судорожных припадков по отношению к контрольным группам, Кроме того, существенно уменьшилась доля крыс (в 4 раза) с высокой чувствительностью к коразолу (с латентным периодом наступления припадка через 10 и менее минут после введения конвульсанта) и более чем в 4 раза увеличилась доля крыс, у которых в течение 30 мин не наблюдалось припадков с падением животного на бок, а наблюдались лишь слабые вздрагивания головы или отдельных мышц туловища (Рис.9А ).

Рис.9. Показатели судорожной активности контрольных крыс (1) и после иммунизации коньюгатом сиднофепа с БСА (2). А - число животных (в %) с латентным периодом наступления судорожного припадка <10 мин (белые столбики) и с отсутствием его в течение 30 мин (черные столбики) после однократного введения коразола (60 мг на кг веса), Б - динамика судорожных проявлений при ежедневном введении коразола (30 мг/кг веса); по оси ординат - число животных в %. * - статистически значимые различия при р<0,05, ** - при р<0,01.

Процесс формирования нарастающей судорожной готовности (киндлинг) у иммунизированных крыс также отличался от контрольных - проявление первых судорожных реакций начиналось позже (с 8-го дня, в контроле - с 5-го) и у значительно меньшего числа (20%, в контроле - 50%) животных (Ри,с.9Б). О замедленном нарастании судорожной готовности у опытных крыс свидетельствует . также латентный период наступления судорожных реакций и их средняя тяжесть. Однако наиболее выраженные и статистически значимые различия наблюдались только на ранних этапах формирования киндлинга (до 11-го дня), что отмечается и при воздействиях других эффективных антиконвульсантов (Post et al., 1981). Обнаруженная способность иммунизации конъюгатом сиднофена повышать порог судорог служит дополнительным подтверждением наличия в поведении иммунизированных крыс седативных компонентов, поскольку антагонизм с коразолом является одним из признаков, сопутствующих седативно-гипнотическому действию фармакологических веществ (Раевский, Батулин, 1963; Вихляев, Клыгуль, 1965).

Одновременные изменения эмоционального статуса и судорожной готовности являются, по-видимому, следствием комплекса изменений в регуляторных системах организма.

2.3. Иммунологический анализ. Иммуноферментный анализ сывороток крови животных, иммунизированных конъюгатом сиднофена с БСА (выполненный М.Ф.Обуховой), показал, что в крови крыс появляются антитела, связывающиеся с сиднофеном. Концентрация таких антител невелика, но статистически значима и определяется средним титром 1/1024. Титры антисиднофеновых антител в сыворотке крови контрольных групп (введение физраствора, ПАФ и БСА) характеризуются значительно более низкими значениями (1/80 -1/160).

Помимо определения концентрации антител к сиднофену проведено исследование реактивности сывороток с рядом других лигандов. Показано, что иммунизация крыс конъгатом сиднофена с БСА индуцирует образование антител довольно широкого спектра: к норадреналину, дофамину, серотонину, ГАМК, веществу П, динорфину, бета-эндорфину и вазопрессину. Титры антител к норадреналину и дофамину были сопоставимы с титрами антител к самому сиднофену, что можно объяснить структурным сходством сиднофена с катехоламинами. В то же время не образуются в определяемых титрах антитела к ряду пептидов и опиоидов, что позволяет исключить феномен широкой поликлональной активации. Принимая во внимание представления о постоянном присутствии малых концентраций аутоантител к некоторым эндогенным биорегуляторам в крови человека и животных (Закс, Быкова, 1977; Ашмарин, Фрейдлин, 1989 и др.), можно предположить, что мы не воспроизводим патологическое аутоиммунное состояние, а лишь. инициируем усиление уже существующей иммунологической регуляции физиологических состояний. Таким образом, обнаруженные изменения титров антител к некоторым биорегуляторам являются, скорее, своего рода показателем того, на какие системы организма оказывает влиние иммунизация животных конъюгированным сиднофеном. Заслуживает внимания тот факт, что животные, иммунизированные конъюгатом сиднофена, демонстрировали сильное подавление эмоционального поведения, в реализации которого, как известно, принимают участие и катехоламины, и серотонин, и ГАМК (Кулагин, Болондинский, 1986).

2.4. Биохимический анализ. Исследования уровня норадреналина в плазме крови и дофамина в мозге иммунизированных конъюгатом сиднофена крыс (М.ЛЦиренина, Е.И.Мельник) свидетельствуют о существенно меньшем уровне норадреналина в крови на 32-47-й день после начала иммунизации по сравнению с контрольными животными и дофамина в мозге (Рис.10). Характерно, что наибольшие различия были выявлены в группах крыс, у которых исходный уровень норадреналина был достаточно высоким - превышал 4.5 нг/мл плазмы. Дефицит адреналина в крови, как следствие иммунизации, был менее выраженным. Динамика изменений биохимических показателей состояла в некотором начальном повышении уровня норадреналина и адреналина в крови и мозге на 12-15 сутки после начала иммунизации и дальнейшем значительном снижении концентрации норадреналина и менее значительном снижении концентраций адреналина в крови на 32-47 сутки после иммуниазции. Концентрация дофамина снижалась, уже начиная с 12-го дня, но существенное снижение наблюдалось к 32-47 дню. Именно в этот период отмечались наибольшие изменения в поведении животных. г г 3 г г з

Рис. 10. Изменение уровня катехоламинов в плазме и мозге крыс после иммунизации конъюгатом сиднофена с БСА: а - среднее значение содержания норадреналина в плазме (нг/мл) контрольных крыс (1), иммунизированных БСА (2) и конъюгатом сиднофена с БСА (3); б - среднее значение содержания дофамина в мозге (мкг/г ткани) - группы те же. - уровень значимости р<0,01 по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, иммунизация крыс конъюгатом сиднофена с БСА приводит к длительным изменениям состояния белых крыс как по биохимическим - снижение уровня катехоламинов, так и по физиологическим признакам - поведение, судорожная активность. Направленность этих изменений была противоположна действию самого сиднофена.

3. Долговременные изменения биохимического и физиологического статуса крыс иммуномодуляцией активности моноаминооксидазы.

Система биогенных аминов мозга в значительной мере сопряжена с моноаминооксидазами (МАО). Глубокие нарушения активности МАО обнаруживают при таких психических заболеваниях, как депрессия, шизофрения и паркинсонизм. Поэтому, а также учитывая полученные данные с иммунизацией к сиднофену, представляла интерес возможность длительной модуляции биохимического и физиологического статуса животных путем регуляции активности МАО. Для этой цели были использованы экзогенные ингибиторы МАО — паргилин и депренил, различающиеся по своей селективности воздействия на разные формы МАО, и эндогенный ингибитор МАО В - изатин.

Данных об эндогенной регуляции активности МАО относительно немного. Эндогенные ингибиторы, такие как изатин и трибулин, были недавно идентифицированы в мозге (Рапоуа ег а1., 1997). Вопрос о роли Р-карболинов как эндогенных регуляторов МАО остается пока спорным. Трибулин представлен в ряде тканей человека и животных и в биологических жидкостях. Изатин это молекулярный компонент трибулина. Известно также, что в физиологических концентрациях изатин связывается с рецепторами натриуретического пептида. Пока, однако, трибулин и изатин не сопоставимы по эффективности с фармакологическими ингибиторами МАО. Это обстоятельство и отсутствие исчерпывающей информации о системе эндогенных ингибиторов МАО побудило нас пойти по пути индукции антител к таким высокоэффективным синтетическим соединениям как паргилин и депренил. Мы полагали, что они могут иметь конформационное сходство с наиболее мощными эндогенными ингибиторами.

Можно было предположить, что образующиеся в организме антитела к паргилину и депренилу могут ингибировать некоторые родственные по структуре эпитопов эндогенные супрессоры и, соответственно, активировать МАО. Поскольку все используемые фармакологические препараты являются низкомолекулярными соединениями, мы использовали для активной иммунизации их ковалентные конъюгаты с БСА.

3.1. Иммунизация к паргилину. Паргилин (N-benzyl-N-methyl-2-propynylamine) - это один из хорошо изученных антидепрессантов и классический ингибитор МАО типа В. Было синтезировано (М.Ф.Обуховой) 6 вариантов конъюгата паргилина с БСА с использованием в качестве связующих агентов глутарового альдегида (Гл) и карбодиимида (КДИ) в различных молярных соотношениях (1:50, 1:100 и 1:500).

Поведенческий анализ. При оценке двигательной и ориентировочно-исследовательской • активности у иммунизированных животных наблюдалось небольшое снижение показателей горизонтальной активности (на 10-25% по сравнению с контролем) и более выраженное изменение показателей ориентировочно-исследовательской активности (по количеству стоек и заглядываний в верхние норки). Однако выраженность этих изменений была различной в группах крыс, иммунизированными разными вариантами конъюгатов. В ответ на предъявление стрессирующего воздействия (звук) во время нахождения крысы в автоматизированном открытом поле эффект подавления активности особенно сильно проявлялся в группе с введением коньюгата КДИ-100; достоверными были различия по горизонтальной активности (р<0,005) и числу заглядываний в нижние норки (р< 0,05).

Результаты теста неизбегаемого плавания указывают на уменьшение времени активного плавания и увеличение времени иммобилизации у крыс всех опытных групп по сравнению с контрольной (Табл.2); здесь также имела место разная выраженность эффекта при иммунизации разными конъюгатами.

При тестировании в крестообразном лабиринте у всех иммунизированных крыс наблюдалось снижение тех показателей, которые характеризуют компоненты тревожности и страха.

Результаты двухфакторного дисперсионного анализа свидетельствуют об отсутствии влияния фактора дозы в испытанном интервале и достоверном влиянии фактора иммунизации, особенно по таким показателям, как время иммобилизации (Р(2,42)=9,849; р<0.001), активного плавания (Р(2,42)=10,65; р<0,001) в тесте Порсолта и время замирания в крестообразном лабиринте (Р(2,42)=4,796; р<0,05). По уровню достоверности и силе эффекта лучше всего себя проявили конъюгаты со связующим агентом КДИ. При сравнении средних внутридисиерсионного комплекса со связкой КДИ оказалось, что наиболее ярко выраженный депрессивный эффект наблюдался в группе с введением КДИ-100.

Таблица

Показатели неизбегаемого плавания в разные сроки после иммунизации крыс конъюгатом паргилина с БСА.

Условия эксперимента Длительность иммобилизации (в сек) Длительность активного плавания (в сек) через 3 нед. через 6 нед. через 3 нед. через 6 нед.

Контроль 64,7+6,9 82,8+12,4 255,0+21,0 227,0+42,

КДИ-50 127,0+15,7** 69,3+11,2 155,0+10,3*** 187,5+38,

КДИ-100 161,5+33,6*** 162,7+23,2** 162,5+29,0* 131,3+24,5*

КДИ-500 124,5+33,3 125,5+17,6 179,5+11,4* 190,7+5,

Гл-50 113,7+38,4 133,5+65,6 163,0+31,6* 173,5+33,

Гл-100 133,2+13,7*** 118,5+34,1 189,0+41,1 145,2+30,

Гл-500 109,7+19,0* 126,2+19,6* 163,0+31,2* 181,0+35,

Выработка условных рефлексов с положительным и отрицательным подкреплением не выявила различий в скорости обучения между контрольными и иммунизированными крысами. Однако латентный период выполнения шнцедобывательной реакции у иммунизированных крыс был существенно больше на 2, 3 и 4-й дни обучения (р<0,05).

Тестирование судорожной готовности при введении пороговой дозы коразола выявило некоторую тенденцию к возрастанию судорожной активности, что выражалось в снижении латентного периода наступления четвертой стадии судорожного припадка (падение животного на бок, контроль - 1063,6+6,2 сек; опыт - 840,7+5,1 сек), а также увеличении числа животных с наличием четвертой стадии и повторных приступов. В отличие от сиднофена паргилин значительно облегчает тяжесть судорожных припадков, вызванных введением пропранолола, и потенциирует противосу дорожные эффекты DL-Tpeo-3.4дигидроксифенилсерина (Amabeoku, Syce, 1997). Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что при иммунизации к паргилину подобный эффект не наблюдается, более того, имеется тенденция к противоположной направленности эффекта.

Учитывая данные о взаимосвязи между депрессивными состояниями и болью мы оценивали болевую чувствительность иммунизированных паргилином крыс в тесте «tail -flick». Результаты указывают на достоверное снижение болевой чувствительности у иммунизированных крыс - повышении болевого порога на 20-30% (р<0,01).

Таким образом, результаты тестирования поведения показывают, что иммунизация крыс антидепрессантом и ингибитором МАО паргилином вызывает ряд глубоких и длительных изменений: снижение двигательной и ориентировочно-исследовательской активности, снижение времени активного плавания и' увеличение длительности иммобилизации в тесте Порсолта, увеличение тревожности в крестообразном лабиринте. Эти изменения можно рассматривать как компоненты депрессивного состояния с элементами тревожности и страха. Они носят длительный характер и наблюдаются как на 21-23-й день после начала иммунизации, так и в более поздние сроки (40-45-й дни).

Иммунологический анализ показал, что иммунизация крыс конъюгатом паргилина с БСА ведет к образованию антител к паргилину (М.Ф.Обухова). Однако достоверных различий в титрах между группами животных иммунизированных разными конъюгатами, не наблюдалось — средняя величина титра составляла 1/3200-1/6400 (контроль- 1/160).

Биохимический анализ. Для того чтобы оценить возможные последствия иммунизации, мы в первую очередь измеряли активность изозимов МАО А и МАО В в митохондриальных фракциях печени и мозга контрольных и иммунизированных крыс. Представленные в табл. 3 данные (Т.А.Москвитина) свидетельствуют о том, что иммунизация оказала неодинаковое влияние на МАО А и МАО В мозга и печени экспериментальных животных: примерно в 2,5 раза возросла активность мозговой МАО А, а активность печеночной МАО В несколько снизилась.

Таблица

Активность МАО А и МАО Б (в % от контроля) после иммунизации крыс конъюгатом паргилина с БСА.

Мозг Печень

МАО А 254 + 5,6 (р<0,001) 118,8+ 11,1 (р<0,02)

МАО Б 93,2+13,7 77,2 ± 3,4 (р<0,001)

Принято считать, что паргилин является ингибитором главным образом МАО В, хотя строгой избирательностью не обладает. Известно, что in vivo в мозге паргилин ингибирует МАО А на 50%, а МАО В на 100%. In vitro в печени паргилин блокирует и МАО А и МАО В полностью (Горкин, 1985). Сдвиг активации в сторону МАО А в наших опытах, возможно, является результатом структурных различий между свободным паргилином и антигенными детерминантами конъюгата паргилина с БСА, которые могут изменить специфичность формирующихся антител. Наблюдаемое увеличение активности МАО в мозге не противоречит многочисленным данным о возможности прохождения антител через ГЭБ и даже в нейроны в случае их длительной циркуляции, особенно если для иммунизации используются адыованты (Meeker et al, 1987; Burlet et al., 1987Reiber et al., 1988; Podulso et al., 1994;).

Исследование уровня дофамина, серотонина и их метаболитов (выполненное совместно с И.ИАфанасьевым и Э.А.Андержановой) показало, что следствием модуляции активности МАО является значительное снижение уровня основного метаболита дофамина - ДОФУК, а также возрастание оборота дофамина в стриатуме иммунизированных конъюгатом паргилина крыс (Табл.4 и Рис.11).

Таблица

Влияние иммунизации конъюгатом паргилина с БСА на содержание дофамина, серотонина и их основных метаболитов (в нг/мг ткани) в стриатуме крыс.

Группы Контроль Введение ПАФ Иммунизация

Дофамин 7.75+1.14 10.69±1.58 *** 9.14+2.

ДОФУК 0.98±0.15 1.3±0.22* 0.69+0.24** (+)

ГВК 0.2±0.04 0.23±0.05 0.23+0.

Дофамин/ ДОФУК 8.15±1.34 8.77±2.26 22.79±11.51**** (+)

Серотонин 0.16±0.05 0.19±0.09 0.21±0.

5-ОИУК 0.2810.03 0.27±0.04 0.28±0.

Серотонин/5-ОИУК 0.57±0.16 0.65±0.27 0.82±0.

Примечание. *-р<0,05, **-р<0,01, ***-р<0,005, ****-р<0,001 по сравнению с контролем; (+) - р<0,001 - критерий достоверности отличий от значений в группе с ПАФ.

Интересно отметить, что в группе животных, которым вводили только адъювант, уровень дофамина и ДОФУК в стриатуме заметно возрастал по сравнению с соответствующими значениями у нативных животных, что согласуется с имеющимися в литературе данными о влиянии ПАФ на содержание катехоламинов в мозге крыс (Ашмарин, Еропкин, 1978). Однако при этом величина оборота исследуемых моноаминов в стриатуме этих животных, в отличие от иммунизированных крыс, практически не менялась по сравнению с соответствующими значениями у контрольных крыс. Это дает основание предполагать, что наблюдаемые нами биохимические последствия иммунизации являются специфическими для данного воздействия. Наблюдаемые биохимические изменения коррелируют с указанными депрессивноподобными изменениями в поведении иммунизированных конъюгатом паргилина крыс, что согласуется с имеющимися в литературе данными об определяющей роли нарушений активности дофамин- и серотонинергической системы в патогенезе депрессии (Анохина, Гамалея, 1980; Арушанян, 1987; Blier, 1994 и др.).

Дофамин

ДОФУК

Оборот дофамина

Рис.11. Изменение уровня дофамина, ДОФУК и дофамин/ДОФУК в стриатуме крыс после иммунизации конъюгатом паргилина с БСА (в % к группе с введением только ПАФ). * - р<0,01.

Более того, показано наличие аутоантител к серотонину и дофамину у крыс с экспериментальным дофамин-зависимым депрессивным синдромом (Крупина и др., 2000).

Таким образом, полученные данные указывают на эффективность модуляции активности МАО методом инверсной иммунорегуляции, которая вызывает длительные изменения как на биохимическом уровне, так и в поведении животных. Длительность этих изменений позволяет оценить перспективность такого подхода для использования в качестве экспериментальных моделей патологических состояний, связанных с нарушениями в системе МАО, и их иммунокоррекции.

3.2. Иммунизация к депренилу. В следующих сериях для возможного моделирования депрессивного состояния была использована активная иммунизация крыс коньюгатом другого ингибитора МАО В - депренила - с антигеном-носителем -бычьим сывороточным альбумином. Деиренил (Ы-диметил^ [2-пропил] бензенэтанамин гидрохлорид) является сильным необратимым ингибитором МАО В, по химической структуре близок к фенилэтиламину. Применяется при лечении депрессий различного генеза, болезни Паркинсона в сочетании с Ь-дофа (леводопа) и болезни Альцгеймера. Синтез конъюгата проводили с использованием в качестве связующего агента карбодиимида-1 (КДИ-1). Было синтезировано (М.Ф.Обуховой) два типа конъюгата с разным молярным соотношением БСА/антиген - 1: 100 и 1: 200.

Иммунологический анализ сывороток крови крыс после иммунизации показал наличие антител к депренилу (М.Ф.Обухова). Титр антител у крыс, иммунизированных коньюгатом с соотношением 1:100, составлял - 1/1600-1/3200, а у иммунизированных коньюгатом с соотношением 1:200- 1/32001/6400 (в контроле - 1/160).

Поведенческий анализ. Показано, что в тесте неизбегаемого плавания (основной метод для выявления депрессивных компоненов в поведении) крысы, иммунизированные разными конъюгатами депренила, демонстрировали статистически значимое снижение времени активного плавания и увеличение длительности иммобилизации, как на ранних сроках (3 недели после начала иммунизации), так и на поздних сроках (2 месяца от начала иммунизации) (Табл.5).

Эти данные однозначно указывают на наличие депрессивных компонентов в поведении иммунизированных крыс. Увеличение времени иммобилизации можно расценивать, на основании литературных данных, как развитие у крыс состояния «поведенческого отчаяния», которое может служить аналогом состояния безнадежности и неактивности в клинической картине проявления депрессии.

Таблица

Влияние иммунизации крыс к депренилу на показатели неизбегаемого плавания (в % к контролю)

Ранние сроки Активное Пассивное Иммобилизация плавание плавание

Конъюгат депренила 58,6% 78,4% 373,0 %

1:100 р<0.05 р<0.05 р<0.

Конъюгат депренила 66,5% 98.2% 208 %

1:200 р<0.05 р<0.

Поздние сроки

Конъюгат депренила 51,0% 88,75% 229,0 %

1:100 р<0.005 р<0.

Результаты тестирования иммунизированных крыс в приподнятом крестообразном лабиринте указывают на увеличение компонентов тревожности и страха, отмеченных, в частности, по снижению числа выходов на открытые лучи (33,3% от контроля), общего числа переходов (70%) и поведения риска (18,2%).

В процессе выработки условного рефлекса активного избегания у иммунизированных конъюгатом депренила крыс наблюдалось достоверное увеличение латентного периода выполнения реакции за весь период обучения, уменьшение числа реакций избегания и межсигнальных реакций по сравнению с крысами контрольной группы.

Таким образом, иммунизация крыс конъюгатом ингибитора МАО В депренилом вызывает длительные изменения в поведении крыс с выраженными компонентами депрессии.

Биохимический анализ. Представленные в таблице 6 данные (полученные Т.А.Москвитиной) свидетельствуют о том, что иммунизация приводит к статистически значимому увеличению активности МАО В во всех исследуемых фракциях (кроме цитозольной) как при использовании в качестве субстрата бензиламина, так и фенилэтиламина. В цитозольной фракции печени отмечено небольшое, но статистически значимое снижение активности МАО В. Следует отметить также, что иммунизация приводит и к увеличению активности МАО А в микросомальной и цитоплазматической фракциях печени.

Таблица

Аминооксидазная активность в субклеточных фракциях печени, сосудах и плазме крыс, иммунизированных депренилом (удельная активность % к контролю)

МАО А МАО В Общ. МАО

Субстрат Серотонин ФЭА БА Тирамин

Митохондрии печени 92,5+6,7 110+3 р<0,05 135+1,3 р<0,01 145+

Микросомы печени 163,7+10 р<0,002 122+16 137+5 р<0,01 169+13 р<0,

Цитозоль печени 181+13 р<0,002 89+2 . 85+5 р<0,05 179+

Сосуды 166+4,4 р<0,

Плазма 132+

На 53% увеличивалась активность МАО в мозге (р < 0.05) (Табл.8). Следствием повышения активности МАО в мозге было наблюдаемое снижение уровня серотонина (р<0.05) в стриатуме и его метаболита 5-оксииндолил уксусной кислоты (р<0.05). Снижение уровня дофамина и ДОФУК было менее выраженным.

Таким образом, проведенные исследования показали, что иммунизация крыс к фармакологическим препаратам - паргилину и депренилу, являющимся ингибиторами МАО, сопровождается формированием антител к ним и активацией МАО. На поведенческом уровне это выражается в индукции депрессивного состояния, более выраженного при иммунизации к депренилу, являющимся селективным ингибитором МАО В. Далее представляло интерес оценить направленность изменений при иммунизации к одному из эндогенных ингибиторов МАО.

3.3. Иммунизация к изатину. Иммунизация крыс конъюгатом изатина с БСА, синтезированным аналогичным образом, при сравнении с иммунизацией крыс к депренилу показала, что в целом изменения в поведении крыс носят такой же характер -депрессия поведенческой активности. Однако, эти изменения имеют даже более выраженный характер. Это хорошо иллюстрируется представленными. в табл.7 показателями поведения крыс в тесте неизбегаемого плавания.

Таблица

Показатели теста Порсолта у крыс, иммунизированных конъюгатами депренила и изатина (в % к контролю).

Активное плавание Пассивное плавание Иммобилизация

Депренил 77,97 р<0,05 88,37 197,26 р<0,

Изатин 54,1 р<0,001 87,04 248,00 р<0,

Титр антител при иммунизации конъюгатом изатина также выше и составляет 1/13440. Биохимические исследования свидетельствуют о более выраженном увеличении активности МАО в мозге после иммунизации изатином (Табл.8).

Таблица

Активность МАО (нмоль ИН4+/мин) после иммунизации крыс конъюгатами депренила и изатина

Печень Мозг

Контроль 0,166+0.015 0,1+0,

Депренил 0,192+0,007 (116%) 0,153+0,011 (153%) <0,

Изатин 0,145+0,009 (87,3%) 0,186+0,02(186%) р<0,

На основании результатов проведенных исследований можно сделать вывод об эффективности такого воздействия на аминооксидазные системы как активная иммунизация к ингибиторам МАО, вызывающая длительные изменения как на физиологическом, так и на биохимическом уровне.

Кроме того, полученные данные свидетельствуют о перспективности развития данного направления в плане получения долговременных изменений в поведении, а именно депрессивноподобных состояний на животных путем активной иммунизации к ингибиторам МАО.

4. Влияние иммунизации к фрагменту холецистокинина (30-33) на физиологический в биохимический статус крыс.

Эффективность представленных выше иммунологических подходов к воздействию на депрессивные и тревожные состояния побуждают, естественно, к поискам новых объектов применения этих методов. Такая возможность наметилась после выявления ряда эндогенных факторов тревожности. Наиболее эффективным из них представляется тетрапептид холецистокинин-4 (ХЦК-4) -Trp-Met-Asp-Phe-NH2. являющийся фрагментом более сложных регуляторных пептидов - холецистокинина-8 и холецистокинина -33. Один из самых малых фрагментов холецистокинина-33 является специфическим агонистом рецепторов типа В (Crawlley, Corwin, 1994; Fink et al., 1998), широко представленных в мозге, и проявляет в дозах порядка 25-50 мкг/кг определенное анксиогенное действие на белых крыс. Внутривенное введение его (или его аналога — пентагастрина) в клинических условиях здоровым людям-добровольцам вызывает сильные эффекты: более чем у 15% испытуемых возникали не только состояния страха, но даже паники в гораздо меньших дозах - 0,3-0,6 мкг/кг (De Montigny, 1989; Koszycki et al., 1998). Пациенты, страдающие паническими растройствами, еще более реактивны к анксиогенному действию агонистов рецепторов ХЦК-В.

Поскольку данные об анксиогенном влиянии ХЦК-4 на экспериментальных животных неоднородны, наши исследования с иммунизацией к синтезированному конъюгату ХЦК-4 с БСА проводились параллельно с прямым введением ХЦК-4 и его аналогов.

Показано, что внутрибрюшинное введение ХЦК-4 и его аналога - пентагастрина в дозе 20 мкг на крысу вызывало незначительное изменение показателей двигательной и ориентировочно-исследовательской активности при тестировании в обычных условиях. Однако, при добавлении стрессорного звукового раздражителя происходит резкое угнетение всех показателей (горизонтальной активности, количества стоек, числа заглядываний в верхние и нижние норки), которое продолжается и даже усиливается после прекращения действия раздражителя, в отличие от контрольной группы, активность которой быстро восстановилась. Это говорит о неустойчивости опытной группы к действию стрессорного раздражителя, связанному с анксиогенным эффектом ХЦК-4. При тестировании же в «Родэо» крыс, иммунизированных конъюгатом ХЦК-4 с БСА, не было зафиксировано такого эффекта на воздействие стрессорного раздражителя.

Тестирование в крестообразном лабиринте через два часа после внутрибрюшинного введения ХЦК-4 в дозе 20 и 100 миг на крысу показало изменение большинства параметров поведения, свидетельствующее о повышенной тревожности крыс: снижение числа выглядываний и выходов в открытые лучи, уменьшение времени пребывания на открытых лучах и числа переходов между лучами, снижение поведения риска, увеличение времени замирания, увеличение числа дефекаций. При аналогичном тестировании иммунизированных крыс, напротив, обнаружен ряд изменений в поведении, свидетельствующих не только об отсутствии компонентов тревожности и страха, но и снижении тревожности у иммунизированных животных (Рис.12). Так, происходит увеличение числа выходов и выглядываний на открытые лучи, поведения риска и снижение времени замирания не только по сравнению с крысами, которым вводили ХЦК-4, но и с контрольными животными.

350 -,

I * * * — зоо 4-в--—р-,-

250 --■-Н- -

200 т-Н-■- -—-

150--1- ■ -В-

100 1г 1 ьг ' ■ 1 1 ■ ■

50--■—

Рис. 12. Показатели поведения крыс в крестообразном лабиринте ( в % к контролю) после парентерального введения ХЦК-4 (светлые столбики) и после иммунизации конъюгатом ХЦК-4 с БСА (черные столбики).

1 - число выходов на открытые лучи; 2 - число выглядываний на открытые лучи; 3 - время неподвижности; 4 - поведение риска; 5 - число дефекаций. * -р<0,05; **-р<0,01; ***-р<0,005. * * *

В тесте неизбегаемого плавания после парентерального введения ХЦК-4 обнаружено достоверное увеличение времени иммобилизации (причем при увеличении дозы ХЦК-4 от 20 до 100 мкг продолжительность иммобилизации также возросла - при дозе 20 мкг она составляла 138% от контрольного значения, р<0,05* , а при дозе 100 мкг - 180%, р<0,005***) и снижение времени активного плавания. У иммунизированных конъюгатом ХЦК-4 крыс показатели в этом тесте имели прямо противоположную направленность - время активного плавания увеличивалось, а время иммобилизации достоверно снижалось и составляло всего 40% от контрольного уровня.

При формировании у иммунизированных конъюгатом ХЦК-4 крыс рефлекса с положительным подкреплением (пищедобывательный условный рефлекс) отмечено небольшое увеличение числа подкрепляемых реакций (до 130% в третий день обучения, р< 0.05) и снижение латентного периода выполнения реакций, которое к четвертому дню обучения составляло 45% по сравнению с контрольными крысами.

Полученные данные однозначно указывают на анксиогенный эффект парентерального введения ХЦК-4 и < подтверждают данные литературы об участии ХЦК-4 в патогенезе тревожных и панических состояний (Анохина и др., 1998). В то же время иммунизация крыс конъюгатом ХЦК-4 с ВСА не только не приводила к анксиогенному действию, но и в большинстве тестов вызывала изменения в поведении, носящие анксиолитическую направленность. Анксиолитическйй эффект иммунизации наблюдался не только при иммунизации обычной выборки крыс, но и предварительно отобранных крыс с исходно высоким уровнем тревожности, что свидетельствует о возможности иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности и страха.

Заслуживают внимания также и данные об участии ХЦК в модуляции ноцицепции. Существует ряд работ, указывающих на снижение анальгетического эффекта опиатов агонистами ХЦК и потенциирование его антагонистами (Иапраап-Не1ккПа е1 а1., 1997).

В тесте <ЛаН-Шск» было обнаружено достоверное увеличение порога болевой чувствительности у иммунизированных крыс по сравнению с контрольными, причем в процессе эксперимента разница между болевым порогом у контрольной и опытной группы увеличивалась, что, возможно, говорит о большей сенсибилизации иммунизированных животных к болевому воздействию. Поскольку данный эффект противоположен действию самого пептида, можно предположить, что снижение ХЦК порога болевой чувствительности опосредуется не только А-, но и В-подтипом рецепторов ХЦК, агонистом которых является ХЦК-4.

Иммунологический анализ сывороток крови иммунизированных крыс свидетельствует о наличии антител к ХЦК-4 с титром 1/3200 — 1/6400. Анализ уровня моноаминов в стриатуме выявил небольшое (114,0% по сравнению с контрольной группой), но статистически значимое (р<0,05) увеличение уровня дофамина (ДА), небольшое снижение уровня гомованилиновой кислоты (ГВК) и более существенное снижение (74,2% по сравнению с контрольной группой) отношения ГВКУДА (р<0.5).

Таким образом, нами показана возможность иммунизации крыс к конъюгированному пептиду ХЦК-4, которая сопровождается образованием антител к ХЦК-4 и вызывает эффекты, которые по своей направленности противоположны действию самого ХЦК-4.

Так как эффекты активной иммунизации крыс к ХЦК-4 противоположны эффектам, опосредуемым ХЦК-В рецепторами, расположенными именно в мозге, можно предположить, что сформировавшиеся в результате иммунизации антитела к ХЦК-4 проникают в головной мозг. Известно, что в последние годы представления о крайне ограниченной проницаемости гематоэнцефалического барьера подвергли существенному пересмотру. Обнаружено несколько систем избирательного транспорта пептидов через гематоэнцефалический барьер (Banks, Kastin, 1987). Для некоторых пептидов показано многократное повышение способности проникновения в мозг через ГЭБ после их модификации, например, полиаминами (Poduslo, Curran, 1996). Кроме того, есть данные, что циркулирующие в крови иммуноглобулиныобнаруживаются в цитоплазме нейронов нейрогипофиза (Meeker et al., 1987). Небольшие количества иммуноглобулина могут проникать из крови в мозг даже после однократного внутривенного введения (Poduslo, Curran, 1994). Кроме того, известно, что мозг содержит ряд участков, не изолированных ГЭБ. Одной из таких структур является гипофиз. Имеются данные о проникновении иммуноглобулинов в ЦНС при помощи ретроградного аксонального транспорта. Выявлен также ряд физиологических состояний (умеренный стресс, колебания давления крови и др.), повышающих его проницаемость для белков (Banks, Kastin, 1987). Иммунизация с применением адъювантов также является подобным фактором, т.к. ПАФ способен обратимо открывать ГЭБ (Reiber, Kitze, 1988). Таким образом, в условиях активной иммунизации, когда антитела циркулируют в организме в течение многих месяцев, велика вероятность возникновения условий для их прохождения через ГЭБ и связывания с регулятором, против которого была проведена иммунизация, в структурах головного мозга (Крыжановский, Магаева, 1990).

Наличие анксиолитических компонентов в поведении крыс, иммунизированных конъюгатом ХЦК-4 с БСА, противоположных действию самого ХЦК-4, и их длительность позволяют положительно оценить перспективность данного направления в плане иммунокоррекции патологических состояний тревожности, страха и, возможно, депрессии.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Данилова, Раиса Александровна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что активная иммунизация крыс к основному ферменту метаболизма этанола - гетерологичной алкогольдегидрогеназе печени лошади оказывает длительное подавляющее влияние на формирование экспериментального алкоголизма и не оказывает негативных влияний на поведение. Иммунизация сопровождается формированием антител к АДГ и снижением активности эндогенной АДГ в печени и надпочечниках.

2. Доказан иммунный механизм феномена подавления алкогольной мотивации иммунизацией к АДГ посредством выявления цепи реакций: быстрого связывания экзогенной АДГ лейкоцитами, индукции синтеза антител к АДГ после переноса этих лейкоцитов другому животному и, наконец, подавления влечения к алкоголю у реципиентов лейкоцитов.

3. Разработан новый подход к углубленному изучению роли АДГ, а именно, эпитопов АДГ, ответственных за антиалкогольный эффект; полученные данные по снижению алкогольной мотивации иммунизированных конъюгатом эпитопа АДГ 265-276 крыс свидетельствуют о том, что АДГ 265-276 является эпитопом, ответственным за подавление алкогольной мотивации, вызываемой целой молекулой АДГ.

4. Анализ полученных данных позволил заключить, что роль АДГ в формировании алкогольной мотивации не может быть связана с ее участием в образовании ацетальдегида. Наиболее вероятна связь через метаболизм некоторых нейромедиаторов и гормонов, в метаболизме которых участвует АДГ.

5. Оценены эффекты иммунизации крыс ко второму ключевому энзиму обмена этанола - АцДГ и выявлены оптимальные экспериментальные режимы иммунизации и алкоголизации, при которых иммунизация к АцДГ и к сочетанию АДГ и АцДГ вызывает эффект подавления алкогольной мотивации.

6. На основании экспериментальных данных предложен принципиально новый подход снижения алкогольной мотивации и рекомендации для комплекса формализованных предклинических и клинических исследований этого метода.

7. Иммунизация крыс конъюгатом антидепрессанта и психостимулятора сиднофена с БСА сопровождается формированием антител к сиднофену и вызывает длительное изменение физиологического статуса, характеризующееся депрессией поведенческой активности. Биохимическим следствием иммунизации является изменение содержания катехоламинов.

8. На модели коразоловых судорог и коразолового киндлинга показано, что иммунизация крыс к аналогу фенамина сиднофену оказывает противосудорожный эффект.

9. Активная иммунизация белых крыс к ингибиторам МАО -паргилину, депренилу и изатину индуцирует образование антител к ним и вызывает значительную активацию МАО и снижение уровня биогенных аминов в мозге. Биохимические изменения коррелируют с глубокими и длительными изменениями в поведении иммунизированных крыс, которые указывают на состояние депрессии.

10. Возможность длительной модуляции как биохимического, так и физиологического статуса крыс посредством инверсной иммунорегуляции активности моноаминооксидаз представляется перспективной для использования в качестве модели патологических состояний, связанных с нарушениями в системе МАО, и их иммунокоррекции.

11. Показана возможность иммунизации крыс к фрагменту ХЦК (30-33), которая вызывает длительные анксиолитические изменения в поведении крыс, по своей направленности противоположные анксиогенному действию самого ХЦК-4. Иммуноферментный анализ свидетельствует о наличии антител к ХЦК-4 в сыворотке крови иммунизированных крыс. Полученные данные представляют интерес в плане коррекции патологических состояний тревожности и страха.

12. Полученные данные по долговременной экспериментальной иммунологической коррекции и моделированию таких форм патологических состояний, как алкоголизм, депрессия, повышенная судорожная готовность, тревожность и страх, демонстрируют как фундаментальную, так и прикладную результативность и перспективность использования метода инверсной иммунорегуляции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Данилова, Раиса Александровна, Москва

1. Длительное изменение эмоционального статуса и обучаемости белых крыс после иммунизации конъюгатом сиднофена с серумальбумином. //Докл. АН СССР, 1988, т. 303, № 6, с. 1512 1514 (соавт. — Обухова М.Ф., Ашмарин И.П., Машковский М.Д.).

2. Иммунизация белых крыс ковалейтным конъюгатом сиднофена с серумальбумином подавляет хроническое потребление этанола. //Бюлл. экспер. биол. мед., 1989, № 12, с. 695 697 (соавт. - Ашмарин И.Р., Машковский М.Д., Обухова М.Ф., Сагимбаева Ш.К.).

3. Иммунокоррекция физиологического статуса белых крыс конъюгатами сиднофена с бычьим сывороточным альбумином. // Биологические науки, 1989, № 3, с. 63 -69 (соавт. Обухова М.Ф., Сагимбаева Ш.К., Машковский М.Д., Ашмарин И.П.).

4. Инверсная регуляция памяти. // Тез. докл. 28 совещ. по проблемам ВНД, Ленинград, 1989, стр. 49 (соавт. Ашмарин И.П., Мельник Е.И., Обухова М.Ф., Сторожева З.И., Сагимбаева Ш.К., Циренина М.Л.).

5. Влияние гетеро- и гомологичной экзогенной алкогольдегидрогеназы на потребление этанола белыми крысами. // Докл. АН СССР, 1991, т. 319, № 2, с. 1256 1259 (соавт. - Ашмарин И.П., Пщежецкий А.В., Сагимбаева Ш.К., Федорова И.М., Обухова М.Ф., Швядас В.К.).

6. Судорожная активность белых крыс после иммунизации конъюгатом сиднофена с серумальбумином. // Бюлл. экспер. биол. мед., 1991, № 2, с. 137 139 (соавт. - Кустова Е.В., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П.).

7. Immunoregulation of nonimmunological function in the organism. //Abstr. Const. Congress Internat. Soc. for pathophisiology, Moscow, 1991, p. 186 (in cooperation: Ashmarin I.P., Martianov A.A., Obukhova M.F., Kustova E.V., Sagimbaeva Sh.K.).

8. Influence of native and modified exogenous alcohol dehydrogenase on alcohol consumption in rats. // Biomedical Sci., 1991, v. 2, p. 308 -310 (in cooperation: Ashmarin I.P., Pshezhetsky A.V., Sagimbaeva Sh.K., Fedorova I.M., Obukhova M.F.).

9. Действие на некоторые функции мозга белых крыс иммуностимулятора полного адъюванта Фрейнда. // Биологические науки, 1992, № 3, с. 97 -103 (соавт. - Кустова Е.В., Ашмарин И.П.).

10. Influence of the immunization against heterologous alcohol dehydrogenase on liver alcohol dehydrogenase isozymes and alcohol abuse of rats. // Eur. J. Biochem., 1993, v. 212, p. 757 -761 (in cooperation: Pshezhetsky A.V., Fedorova I.M., Ashmarin I.P.).

11. Нарушения фибринолиза и гемостаза под действием адъюванта Фрейнда. П Вестник Моск. Ун-та, Сер. 16, Биология, 1993, № 1, с. 11 14 (соавт. - Лютова Л.В., Карабасова М.А., Андреенко Г.В., Подорольская Л.В.).

12. Инверсная иммунорегующия поведения и проблема существования регуляторных аутоантнтел. // Успехи физиол. наук, 1994, т. 25, № 1, с. 3 22 (соавт. - Ашмарин И.П.).

13. Гетерогенность белых крыс по изменениям периферической адренорецепции после иммунизации к антидепрессанту -сиднофену. // Вестник Моск. Ун-та, Сер. 16, Биология, 1994, № 1, с. 31 36 (соавт. Бабская Н.Е., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П.).

14. Влияние иммунизации к алкогольдегидрогеназе на поведение белых крыс. II Бюлл. экспер. биол. мед., 1994, № 10, с. 349 -351 (соавт. Федорова И.М., Ашмарин И.П.).

15. Развитие метода подавления экспериментального алкоголизма активной иммунизацией крыс к алкогольдегидрогеназе // Вопросы наркологии, 1994, № 4, с. 39 43 (соавт. - Ашмарин И.П., Федорова И.М.).

16. Autoimmune processes and new perspectives in treatment of alcoholism. // Abstr. Confer, of the Balkan countries on alcoholismand drag dependence, Beograd, 1995 p.4 (in cooperation: Ashmarin I.P., Obukhova M.F., Pshezhetsky A-V., Fedorova I.M.).

17. Поведенческие и гемодинамические эффекты хронического потребления малых доз этанола. // Вестник МГУ, 1997, № 1, с. 15-18 (соавт. Ашмарин И.П., Ловать М.Л., Тарасова О.С.).

18. Полифункциональность алкогольдегидрогеназы. //Тез.докл. 2 Биохим. общ-ва, Москва, 1997, с. 44 (соавт. Ашмарин И.П., Ловать М.Л., Обухова М.Ф., Прозоровский В.Н., Федорова И.М.).

19. Роль алкогольдегидрогеназы в формировании алкогольной мотивации (концептуальный обзор). // Нейрохимия, 1997, т. 14, вып. 1, с. 3 13 (соавт. - Ашмарин И.П., Федорова И.М., Обухова М.Ф., Ловать М.Л.).

20. Моделирование длительного состояния депрессии у белых крыс иммунизацией к паргилину. // Тез.докл. конфер. мол. ученых по проблемам ВНД, Москва, 1998, с. 583 (соавт. -Белопольская М.В.).

21. Индукторы и ингибиторы тревожности: дифференциальное действие пентагастринов на поведение белых крыс. // Рос. физиология, журн., 1998, № 10, с. 1100 -1107 (соавт. -Федорова И.М., Рудько О.И., Кушнир Е.А., Ашмарин И.П.).

22. The experience of inverse immunoregilation development for long-term suppression of alcohol abuse. // Abstr. East-West Sympos. on Biomedical Res. of alcohol- related diseases, Grodno, 1998, p. 4 (in cooperation: Ashmarin LP.).

23. Индукция длительного состояния депрессии ( с компонентами тревожности и страха) иммунизацией крыс к паршлину. // Вестник РАМН, 1998, № 8, с. 27 -32 (соавт. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., Белопольская М.В.).

24. Коррекция поведения иммунизацией к энзимам и нейротропным агентам. // Тез. докл. Всерос. конфер. «Нейроиммунопатология», Москва, 1999, с. 8 (соавт. -Ашмарин И.П., Обухова М.Ф.).

25. Pargyline conjugate-induced long-term activation of monoamine oxidase as an immunological model for depression. // Neurochemical Res., 1999, v. 24, N 9, p. 1149 1153 (in cooperation: Moskvitina T.A., Obukhova M.F., Belopolskaya M.V., Ashmarin I.P.).

26. GABA-induced changes of the tissue-specific peptide pool of white rat brain.// J. Pept. Sci., 2000, N 6(4), p. 168 -174 (in cooperation: Karelin A.A., Philippova M.M., Strizkov B.N., Ivanov V.T., Ashmarin I.P.).

27. Immunological model of long-term depression. // Abstr. Internal. Med. Confer. "Med. at the turn of Millenia, Lublin, 2000 p. 119 (in cooperation: Moskvitina T.A., Obukhova M.F., Rayevsky K.S., Belopolskaya M.V., Kushnir E.A., Ashmarin I.P.).

28. Влияние иммунизации к фрагменту холецистокинина (30-33) на поведение белых крыс. // Рос. физиол. ж., 2000, т.86, № 9, с. 1167 1174 (соавт. - Рудько О.И., Короткова Т.М., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П.).

29. Main ethanol metabolizing alcohol dehydrogenase (ADH I and ADHIY): biochemical function and the physiological manifestation // FEBS Letters, 2000, v. 486, p. 49 -51 (in cooperation: Ashmarin 1.Р., Obukhova M.F., Moskvitina T.A., Prosorovsky V.N.).

30. Биохимические и физиологические следствия иммунизации крыс конъюгатом ингибитора МАО паргилина с БСА. // Тез.докл. 30 Всерос. совещ. по пробл. ВНД, Санкт-Петербург, 2000,т.1,с. 181.

31. The effect of active immunization against cholecystokinine (30-33) on rats behavior. // FASEB J., 2001, v. 15, N 4, p. F913 ( in cooperation: Fedorova I.M.).

32. Действие нелетальных доз латротоксина на поведение белых крыс.//Докл. РАН, 2001, т. 376, № 3, с. 1 3 ( соавт. - Гришин Е.И., Бочарова Н.Е., Рудько О.И., Ашмарин И.П.).

33. Иммунизация к ингибитору МАО В депренилу как средство долговременного изменения поведения крыс. // Тез.докл. 18 съезда физиол. общ. им. ШХПавлова, Казань, 2001, с. 29 (соавт. - Белопольская М.В., Обухова М.Ф.).

34. Алкогольная мотивация и поведение белых крыс после введения эйконола комплекса полиненасыщенных жирных кислот. // Тез.докл. 18 съезда физиол. общ. им. И.П.Павлова, Казань, 2001, с. 140 (соавт. - Ловать М.Л., Кушнир Е.А., Исаев В. А.).

35. Длительная коррекция функций мозга, перспективы иммунологических подходов. // Вестник РАМН, 2001, № 4, с. 27 -30 (соавт. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф.).

36. И.П.Ашмарин постоянно оказывал нам консультативную и организационную помощь.