Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические следствия иммунизации крыс ковалентными коньюгатами тиролиберина с белками-носителями

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологические следствия иммунизации крыс ковалентными коньюгатами тиролиберина с белками-носителями"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕ!ПШП УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В. ЛОМОНОСОВА . • Биологический факультет

На правах рукописи

МАРТЬЯНОВ АНДРЕИ АЛЕКСАНДРОВИЧ 1

УДК 577.17.05:591.18:612.017

. ШЗИОЛОГИЧЕСКЙЕ СЛЕДСТВИИ ИММУНИЗАЦИИ КШС КОВАЛЕЯПШМН КОНЬПГАТАМИ ТИРОЛИБЕРИНА С БЕШИНЮатШИИ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание учрной степени кандидата биологических паук

Москва - 1992

Работа

выполнена на кафедрэ физиологии человека и вивотшц. Биологического факультета ШУ

(зав. кафедрой - Академик АШ СССР И.П.Ашмарин)

Научный руководитель: доктор биологичэских наук, профессор С.А.Чепураов

Официальные оппоненты: И.С.Зрайцдлин - доктор медицинских

наук, профессор С.А.Титов - доктор биологических наук, ведущий н.с. Ведущее учревдение: Институт высшей нервной деятельности ■ и нейрофизиологии АН СССР.

8ащита состоится - 1992 г- в 15 чао- 30 мин-

ца заседании Специализированного Совета Д.053.05.35 в Московском государственной университете по адресу: Москва, П389Э,; Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией ыакно ознакомиться в библиотеке Биологаческогр факультета ЦРУ. .

Автореферат разослан

1992 г.

Учений секрете^« Совета кандидат биологических наук

Р,

Т Б.А.Умарова

Актуальность проблемы.в настоящее время наряду с k..jcch4oc-кпж методами-п изучении физиологии эндогенных регуляторов, среди когорше важное место.занимают рогуляторные пептида, используются принципиально новые приемы: иммунопейтрализация эндогенпых регуляторов путем введения антител к ним (пассивная иммуклзация) п активная аутоиммушзация (шпзерсная иммунорегуляциЯ) против изучаемых регуляторов с помощью инъекций ковалептных копьюгатов эндогопного гаптена с чужеродными белками <АШ8рин, Гомазков, 1989; Смирнов.Шлейкин, 1990). При атом пассивная иммунизация является обратимым и лишь пемногим более длительным воздействием, чем введение рэгуляторного фактора извнз. Активная аутоиммуниза-. ция, в отличие от пассивной, позволяет изменить физиологический статус организма на значительное время. Причем достигается 'этот эффект сравнительно небольшим количеством инъекций. Это делает зазванный методический подход особенно ценным при исследовании таких функций, которые недоступны для изучения при кратковременном изменении содержания регулятора в организме.

В качестве объекта исследования в настоящей работе шбран гироляберин (ТЕГ) - гнпоталашческий рилизингтгормон Помимо гормонального действия - стимуляции- секреции тиреотропина и npoj.-к-пша из гипофиза, -/он облад ет весьма обширным спектром иных физиологических эффектов ;Среди известных - общеактивирупцво влияете на центральную нервнув . систему, действие на вегетативные Еункции, что вполне соответствует распространению ТРГ в нервной зистеме, а также в периферических тканях (norita ot ai.,i98G; litsuna et p.i., 198G). Рол тиролиберина в организме выражается в регуляции психических процессов, поведения, различных вегетативных функций: кровообращения, дыхания, пищеварения, обмена глюкозы I др. (Plotnikoff,1972; Клуша,1984; Koskinen,19^.3; Griffiths,1987; Ушарт1,1983; Harubashi,i988). Наличие широкого круга известных звойств делает тиролиберин интересной мишенью для исслрцоваь^л î ото дом инверсной кшулорегуляции. В литературе есть лишь данныо эб активной аутоиммунизацил против ТЕГ для изучения подавления гормонального действия тиролиберина; для этого использовали очень ттенсивнне режимы иммунизации, ведущие к глубокому изменению •тироидной оси-, к зш. лтельпому снижепию уровня тиреовдных горюнов (Fraser, Mo Hailly,1803). В ЭТИХ УСЛОВИЯХ ТРУДНО ОЦбНИТЬ

фямые влияши процесса иммунизации на поведение и ряд других фи-шологических функциГ- Комплексное изучение изменогптй в организме

животных, иммунизированных к ТЕГ, должно углубить понимание механизмов аутоиммунных процессов и, вместе с тем,- может расширить, наши знания о физиологической роли тиролиберина.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование иммунологических и {изиологических изменений, развивающихся у белых крыс вследствие активной иммунизации к тиролибе-рину, в условиях, когда не происходит блокирования "тироидной оси". ■ f. . '

В гчсоте решались следующие задачи: в) исследовать нммунореактивиость сшороток крови крыс, яммупизи-ровашшх к ТРГ;

б) оценить влияние иммунизации к тиролиСорину на содержание тире-оидшх гормонов (трийодтиронина'- Т3 и тироксина - Т^) в icpoiui животных;

в) исследовать изменения поведени и алкогольной мотивации у крыс вследствие иммунизации к ТЕР;

г) исследовать физиологические показатели (артериальное давление - АД, частоту сердечных сокращеше - ЧСС, частоту дыхания - ЧД, концентрацию глюкозы в 1срови и температуру тела) у иммунизированных к ТРГ крыс в состоянии покоя и при иммобшшзациошгам стрессе.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное изуче-■ ние изменений различных физиологических функций организма icpucu после активной аутоиммузшзации против тиролиберина в режиме, когда не происходит блокирования -тироидной оси-. Поведенческие изменения вследствие иммунизации коньюгатом ТРГ-БСА включают увели- чеш!в вмоционалыгого напряжения и алкогольной мотивации экспериментальных животных. Исслодуемые физиологические показатели: АД, ЧСС, ЧД, 'содержание Т3, Т4 и глюкозы в крови, а также, температура тела у подвергнутых иммунизации животных в норме практически не отличались от контрольных значений, но при.. иммобшшзвционном стрессе большинство исследуемых показателей изменялись иначе, чем в контроле и после введения тиролиберина извне. Главным образом изменения были обратными эффектам вкзогенного тиролиберина. Одаа-, ко часть из них имела другой характер,, отражая более сложный характер влияния иммунизации. Показаны проявления длительного изменения статуса организма в сложных форм^ поведения и мотиваций, что выгодно отличает данное воздействие от введения изучаемого эндогенного регу,...тора извне. «

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследова-

пий подтверздавт регуляторнув роль тиролиберина в отнотеГ л ряда физиологических функций иегормонального характера. Помимо известных свойств ТРГ, таких как участие ' в регуляции кровообращения, метаболизма гллкозн, терморегуляции, показано его участие в формировании сложных психоэмоциональных состояний животны;. усиление эмоционального напряжения и алкогольной мотивации у иммунизированных крыс.

Практическая значимость работа заключается в отработке методических подходов для создания длительных экспериментальных моделей, полезных для изучения эндогенных регуляторов, патологических состояний. В перспектива такой'подход монет быть использован и в практической медицине: для коррекции патологических изменений, например, шгертиреоидиых состояний в случае иммунизации к ТРГ.

Апробация работы. Материала диссертация доложены на конференции молодых ученых Биологического факультета МГУ (Москва, 1989), на симпозиуме -Физиологическое и клиническое значение пептидов" (Горький, 1990), на Учредительном съезде патофизиологов (Москва, 1990), на заседании кофодры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ (Москва, 1990). Г: материалам диссертации опубликованы 4 научные работы.

Структура диссертации. Диссертация изложена на /-5'2 страницах и . состоит из введения, обзора литературы, списания методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, вклшавдего ¡37- наименований, в том числе /Г-?- на иностранных язшсах, иллюстрирована ./7- рисунками и // таблш и. -

МАТЕРИАЛЫ И ГЛЕТОЛЫ ИССУВДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на белых беспородвых крысах-самцах с весом в начале экспериментов 150-200 г.

Ковалонттзв коньдгпты тиролиберина с белка,та получали, используя гемоциатш и бычий сывороточный альбумин и приме;. :я . различные сшивающие агенты: глутаровый альдегид, произволе кор' бодгошида, дифтординитробепзол. В результата серии опытов с иммунизацией крыс различными копьгагатами для дальнейших исследований был вкбран коньюгат ТРГ-БСА,' получонпый с помощью 1-этил-3(3-дшэгалашнолрогш Зодиимнда нс1 (ЩТ), обладавший наибольшей яммуногоппостьга. Синтез данного коньюгата проводили по следующей схеме: молярное соотношение тиролиберина с белком было 1:100, а ТРГ и КДИ соотносил ч'ь как 1:10. Реакшта проводили в 0,1 ы; фоо-

фатно-буферном растворе (ФБР), перемешивая, в течение 2 часов • при комнатной температуре .далее до истечения суток - при 4°С Очистку проводили диализом в течение 2-х суток при 4°С протш дистиллированной вода (3-4 смены) и 0,15 Ы Had (2 смены).

Иммунизация крыс коньюгатом ТРГ-БСА. Первичная иммунизаци заключалась в подкожном введении коныогата (600 мкг белка/кг ве са), эмульгированного в полном адъюванте фрейнда (АФ)(Caibiochen США) (объемное соотношение коньюгат:АФ было 1:1), в четыре точк спины. Спустя три недели проводили поддерживающую иммунизаця подкожным введением иммуногена в той ке дозе, с неполным АФ, : еще через 7-10 дней проводили вторую поддерживающую иммунизацию По сравнению с описанными в литературе режимами (Fraser HcUellly, 1883; Houa, Oeffard.1987) Избранная СХема ШМуНИЗгЩИ является нештенешшой, "мягкой", рассчитанной.на торможение, не полную блокаду ТРГ и его еффек? т.

Кровь для анализа антител, Т3 и Т4 брали спустя 8-10 дне после иммунизации из хвостовой веш надрезанием кончика хвоста ; Сыворотки получали центрифугированием (15 мин при 5000 об/мин крови, инкубированной при комнатной температуре в течение 2 ч.

Содержание антител к ТРГ выражали в величине титра, нолуча емой с помощью икмунофарментного анализа (ИФА). ИФА проводил следующим образом: 96-ячеисше . планшеты (Títertek Linbrо/т iter tek.США) сенсибилизировали антигеном (ТЕГ в концепт рации 50 ыкг/мл) в ФБР (рн6,5) в течение 12ч при 4°С. Далее поел отмывки планшеты заполняли 0,1% раствором желатина и ¡шкуОирова-1: -1-1,5 ч при 37°С для блокирования не специфиче ского связывания па верхностыо ячейки. Затем после промывания планшета ячейки .зопол няли 100 мкл разведенной сыворотки. Для каждой сыворотки готовш ряд разведений, как правило, от 1/20 до 1/10000. Перед" внесение сывороток в ячейки раствор сыворотки в первом разведении пнкубг ровали с 1$ БСА при 37°С в точешю I ч для истощения анти-БСА ai тител. Следующий этап состоял в наносешш -вторичных" антикрыга пых антител, меченных перокевдазой хрена, инкубацию проводили I t при 37°С. После каждой из вышеназванных иняубаций планшет промь вали трижды буферным раствором'следующего состава: 58 г Nací 1,21 г трис «ci, 0,2 мл твин-20 на I л раствора с наи3 в качесч ве консерванта. Этот же буфер использовали для приготовления все растворов, кроме ^ .ециально оговоренных. После этого в ячей! вносили раствор субстрата: 30 иг ортофенилецдиашда и 60 мкл 3Í

ffj02 в 20 мл 0,1 М ФБР (Рн 6,0). Оптическую плотность растворов окрашенного продукта реакции измеряли при 490 пм с помощь» автоматического фотометра "Tltertek" (США).

Концентрации Т3 п Т4 в пробах крови определяли радиоиммунологическим методом с использованием наборов реактивов, изготовленных Опытным производством Института биооргаиичвской химии АН БССР (г. Минск).

Изучение поведения крыс методами ОП и НК проводили индивидуально в течение 2 мин. При этом оценивали следующие показатели: ориентировочно-исследовательскую активйость (ОИА) - по количеству переходов, вертикальных стоек, заходов в центр (только в ОН), обследованных норок (только в НК): эмоциопальную активность (ЭА) - ш количеству, актов груминга (умывания) и дефекаций. Кроме того, для оценки ОИА'использовали отношение : величины горизонтальной активности к сумме вертикальных стоек и обследованных норок - коэффициент ОИА, предложенный А.В.Вальдманом (Вальдман,'1984).

Алкогольпуи мотивацию у крыс оценивали индивидуально по количеству алкоголя, потребляемого животными в условия: свободного выбора между 10% раствором этанола и водой в одночасовнх ежедьив-пых сеансах (Linsnan. 1087). В остальное время суток крысы имели неограниченный доступ к пище и воде и находились в общих хслотках.

Исследование физиологических показателей у крыс в пормо и при эмоциональном стрессе проводили следуюцим образом. За два дня до опыта крыс оперировали под эфирным наркозом, вживляя катетер (peso) в общую сонную api, ^ий и датчик дыхательных движений (резиновая трубочка, заполненная графитовым порошком и включенная в электрическую цепь) подкожно вокруг грудной клетки с выведением и фиксацией катетера и электродов датчика на кожу спины в межлопаточной области. '. АД регистрировали с. помощью електроманомет"а • statham р 23АА (США), ЧСС определяли подсчетом пульсовых колеоа-ний АД. Температуру тела определяли ректалыго электротермометром. Периодически из катетера забирали пробы крови для определения концентрации глюкозы ортотолуидановнм методом с использованием стандартных медицинских наборов реактивов. В конце опыта забирали кровь и для определена содержапия тиреоидных гормонов.

Регистрацию показателей проводили в течение 15-мин пред-стрессового периода, в течение 2-часовогр'•иммобилизацяонного стресса (привязываю. на столике бршнг"* стороной - лор!), а затем

- в течение одного часа после прекращения иммобилизации. Исследовали влияние введения экзогенного ТРГ и иммунизации крыс коньюга-том ТРГ-БСА.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью t-критерия Стьвдента, непараметрического критерия Манна-Уитни-Вилкоксона и факторного анализа (f- критерия Фишера), а текке программы repeated measures ahova из пакета статистических программ solo.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Имм> нохимичеокий анализ сывороток крови крыс. ИФА сывороток крови животных опытной и контрольных групп (введение в дай иммунизации физиологического раствора или БСА,обработанного сшивкой, с АФ) показал,что иммунизация крыс коныогатом ТРГ с БСА, полученным с помощью КДИ, приводит к образованию анти-ТРГ антител с титром I/1280-1/2560. Учитывая высчий уровень чувствительности ИФА, следует считать ети титры свидетельством умеренного уровня иммунизации к ТРГ.

Интересные результаты были получены нами при проведении ИФА сывороток крови крыс, иммунизированных коньюгатом ТРГ-гемоциашн. Помимо анм/гел к ТРГ (титр I/I280) мы обнаружила, что сыворотки крови крыс опытной группы проявляют реактивность и в отношении других гаптенов, а именно: квтехоламинов, серотонина, и, в меньшей степени, лей-энкефалина и окситоцина. Наиболее выраженной была реакция сывороток к серотоншом, причем антитела, хотя и в несколько меньших титрах, были обнаружены и в сыворотках крови -крыс, иммунизированных белком-носителем (гемоциашшоы).

Такая сложная реакция сывороток вследствие иммунизации коньюгатом ТРГ-гемоциашш моает иметь несколько объяснений. Во-первых, нельзя исключать наличия на поверхности сложного иммуш-гена (гемоциашш-очень крупный белок + молекулы ТРГ) антигенных детерминант, подобных по конформацки каким-то из ендогошшх гаптенов, в частности, серотонину. Во-вторых, при индукции аутоанти-телогонеза в организме дотла происходить сложная перестройка ра-( Соты ишушгой систош, особенно Т-супрессорпых лимфоцитов, а так-ко других регуляторных механизмов, в первую очередь - в составе нервной системы. Для полноценного ответа лмунная система долгая частично преодолеть механизм толерантности, начать продуцироват! аутоантитела (Скс вд,Í986), и, icajj следствие, общее состояние организма может при атом соответствовать таковому при стрессе,

Возможно, срыв толерантности связан именно с вовлечением моно-оминергических систем, играющих важную роль в процессах неспеци-фнческой адаптации организма (Розен, 1984). В этих условиях, когда концентрации эндогенных галтенов в крови изменены, нельзя исключить включения регуляторных процессов со стороны иммунной системы (аутоиммунных по своей природе) не только против ТЕР, но и против других галтенов. Все это соответствует также ряду публикаций последних лет о существовании аутоантител к некоторым регуляторам в норме. Концентрация аутоантител могут возрастать при изменении физиологического статуса организма (Анохина и др.,1987; Ашарин,Фрейндлин,1989). Тагам'образом, наличие антител иной специфичности лишь внешне выглядит парадоксальным.

Анализ содержания пгреоидкых гормонов в крови крыс опытной группы (иммунизация коньюгатом ТРГ-БСА) и контрольных групп (введение физиологического раствора и иммунизация БСА) показал, что у . крыс опытной группы содержание Т3 имеет выраженную тенденцию к ешкению (0,757+0,025 против 0,824+0,034 и 0,830+0,030 ачоль/л соответственно), а го содержанию Т4' различий не выявлено (52,4+2,0 против 51,9+1,6 и 56,0+1,6 шоль/л соотвеа. ¿венно). Это соответствует приведенному выше заключению о том, • что пзбра^шй ••щадящий" розшм имлупизац: ■■ не блокирует полностью Функций -тиреоидпой оси", а лшь несколько тормозит их.

Помяло измерений в условиях спокойного состояния крыс концентрации тарэоидных гормонов в крови 1фнс измеряли через I час после 2-часового тздзбялизационного мресса. У крыс контрольных групп концентрация Т3 не ...сличалась от таковой в норме, тогда как у иммунизированных коньюгатом ТРГ-БСА она увеличилась и стала рашой 0,879+0,093 шоль/л (р<0,05). Содержание Т4 у всех трех групп значительно снизилось (почтя вдвое), ьч различий между группа!® выявлено не было. Таким образом, у иммунизированных крыс обнаружено незначительное снижение содерхания Т3 в крови - отличная от контрольных крыс реакция этого показателя на яшобилизациопный стресс.

Поведешэ крыс в НК п ОП.

I) Ориентировочно-исследовательская активность (ОИА). 'Результаты изучения поведения крыс, иммунизированных к ТРГ, в НК представлены в табл.1. Исходно 1фысн была разделены на группы то-ким образом, что средние показатели поведения-для разных групп не различались мааду сс эй. Повторное тес-гровашга .тя-огных этим ме-

Таблица I. Поведение крыс, иммунизировании коньюгатом ТЕГ с БСА (ТРГ-БОА), а также животных, которым в дни, иммунизации вводили БСА, (БСА), в -норковой камере-. В скобках указано число крыс в экспериментальных группах.

Группы - Показатели поведения

крыс переходы стойки норки груминги дефекации

До иммунизации •

БСА (21) 21,3+1,6 12,3+1,2 4.9+0,7 1,5+0,3 2/4+0,6

ТЕГ-БСА (23) 21,9+1,6 11,5+1,0 4,7+0.6 1,3+0,3 2,5+0,5

Из них: высокоактивные

БСА (9) 28,4+1,4 15,6+1,7 6.7+1,1 1,9+0,8 1,9+0,8

ТРГ-БСА (14) 26,4+1,5 12,9+1,3 ',9+0,8 1,2+0,3 2,6+0,8

низкоактивные

БСА (12) 15,9+0,9 9,8+1,3 3,5+0,6 1,5+0,4 2,8+0,9

ТРГ-БСА (9) 15,0+1,3 9,4+1,1 4,6+1,0 1,6+0,5 2,3+0,6

П о еле им м у Н И 3 а ц и и

БСА (21) 6,3+1,2 3,2+1,0 1,3+0,5 0,5+0,2 3,3+0,6

ТРГ-БСА (23) 8,9+1,2 2,6+0,5 1,8+0,4 0,8+0,2 5,3+0,4**

Из них: высокоактивные

БСА (9) 9,6+2,0 5,6+2,0 1,6+0,6 0,9+0,5 2,3+0,5

ТРГ-БСА. .(14) 9,9+1,3 2,7+0,5 1,7+0,4 0,9+0,3 5,9+0,5**'

- низкоактивные

БСА (12) 3,9К1,2 1,5+0,6 1,2+0,7 0,2+0,2 4,1+0,9

ТРГ-БСА (9) 7,3+2,2 2,4+1,0 2,0+0,8 0,8+0,3 , 4,2+0,7

** р<0,01 «и* р<0,001 по сравнению с БСА

тодом после ¡окончания цикла иммунизации обнаружило, что показатели ОЫА у крыс контрольной (БСА) и опытной (коныогат ТРГ-БСА) групп значительно снизились, что, вероятно, было в значительной степени обусловлено возрастными изменениями. Различий между группами практически не было, лишь горизонтально 1 активность у крыс опытной группы была несколько выше, чем в контроле. Помимо срав-. нешя средних значе. 1 для всей группу мы проводили разделение крыс в каадой группе на две подгруппы: высоко- и низкоактивных по

показателю горизонтальной активности. Оказалось, что повышение показателей ОИА относительно контроля характерно для подгруппы низкоактивных животных опытной группы. Так как наблюдалась значительная вариабельность всех показателей, а абсолютное значения были невелики, достоверных различий даже при почти 2-кратном повышении всех трех показателей ОИА у низкоактивных крыс опытной группы не выявлено.

Сравнение коэффициентов ОИА (Вальдман, 1984) у этих животных выявило следующее: при исходных равных коэффициентах (1,35 у крыс опытной группы против 1,24 в контроле) после иммунизации коэффициент значительно повысился у зерне опытной группы (2,02) при почти неизменном в контроле (1,40). Возрастание коэффициента почти на 50% было характерно и для высоко-, и для низкоактивной подгрупп крыс опытной группы. Увеличение этого коэффициента связывают с анксиогенным действием исследуемого фактора, а уменьшение -наоборот, свидетельствует об анксиолитическом действии (Соколов, 1987).

Изучение поведения крнс методом ОП проводила после окончания цикла иммунизации в двух ситуациях: бесстрессовой (слабый красный свет, тишина) и стрессовой (яркий свет и сильный звук). В среднем по всем исследуемым параметрам ОИА различий меззду крысами ш было ни в бесстрессовом, ни в стрессовом варианте метода. Ко разделение крыс на высоко- и шзиоактивных, что у высокоактивных животных горизонтальная активность достоверно снижена, а у низкоактив-нш. - наоборот, повышена относительно бесстрессовой ситуации.

Обобщая данные исследования ОИА, отметим, что повышение коэффициента ОИА у крыс опытной группы после иммунизации свидетельствует об'уменьшении исследовательского компонента.двигательной активности и увеличения локомоторного. Изменения характера поведения крыс опытной'группы в стрессовой ситуации .свидетельствует о повышенной лабильности ориентнровочно-исследовательского поведения.

2) Эмоциональные показатели .поведения. У иммунизированных к ТЕГ крыс в первую очередь изменялось количество дефекаций в тестах ПК и ОП, - наблюдалось увеличение этого показателя относительно такового в контроле и относительно исходного уровня. Обнаружена также тенденция к увеличению количества грумингов. Все вто в совокупности свидетельствует о повышении эмоционального напряжения у иммунизированных коныогатом крыс. Анализ наблюдаемых изменений показателей поведения для разных подгрупп показал, что

увеличение количества дефекаций характерно в основном для высокоактивных животных. ; ., ,

Тагам образом, обобщая данные о поведении крыс в НК и ОП мокко сделать вывод, что в результате иммунизации против ТРГ у крыс наблюдается повышение эмоциональной напряженности, снижение ориентировочно-исследовательского компонента двигательной актив-вости и увеличение локомоторного, т.е. угнетение поисково-актз1ВлЧого поведения к усиление эмоционального.

Алкогольная мотивация у крыс, иммунизированных коньюгатом ТРГ-БСА, изучавшаяся нами в длительном эксперименте, включавшем 83 ежедневных питьевых сеанса, значительно возросла относительно исходного весьма стабильного уровня и относительно контроля (введение БСА в те сроки) (рис.1). Так как в эксперименте использовали крыс с разной величиной алкогольной мотивации, при анализе результатов нам представлялось целесообразным разделенно популяции крыс по уровню потребления алкоголя на два подгруппы: условно - -пьющие- и -непьющие", выбрав критическим среднее потребление алкоголя 0,07 г/кг/час. Оказалось, что увеличение потребления алкоголя крысами опытной груши обусловлено, главным образом, увеличением этого показателя приблизительно в два раза у крыс из подгруппы -пьюйдах-, тогда как у -непьющих- гявотных усиление алкогольной мотивации хотя и наблюдалось, но в гораздо меньшей сте-

" ...... ................

к и

. о.оо г г

0 00 -1—.-1-1-1-1-1—I—.-1—I— •—I—1—I ;

С 1 2 3 4 5 С 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Бремя, недели

Рис.1. Динамика потребления алкоголя крысами, иммунизирован ними коньюгатом ТРГ-БСА (п=12)(темные кружки, сплошная линия) и Бел (п=П) (светлые кружки, пунктир). Стрелками отмечены дни им-/низации. * р<0,05 ** р<0,01 относительно данных для 8-й недели ькспстимента.

пени. В другом эксперименте введение ТРГ в раз.гх догах (I и 5 мг/кг для однократного введения или 0,1 и Г мг/кт для курсового в течение 5 дней, впутрибрвшинно за 30-40 минут до начала питьевого сеанса) перед питьевым сеансом было неэффективным и не изменяло потребления алкоголя.

• Так как алкоголь обладает антидепрессявным влиянием на психику а в малых дозах оказывает активирующее влияние на центральную нервную систему, можно предположить, что . иммунизация к ТРГ оказывает депрессоподобный эф$ект, что вызывает у крыс усиление алкогольной мотивации. Это согласуется с изложенными вше данными по изучению поведения, показывающими увеличение эмоционального напряжения у иммунизированных к ТРГ крыс.

Влияние иммунизации на вегетативные показатели и обмен глюкозы исследовали у 4-х групп животных: а)интактные крысы, которым за 15 мин до стресса вводили тиролиберин - 5 мг/кг, в/а, в 0,2 мл 0.9% ИаС1 (ГРГ-группа); б)интактнне крысы (ФР-группа);

в)крысы, иммунизированные коньюгатом ТРГ-БСА (ТРГ-БСА-группз);

г)крысы, которым в дни иммунизации вводили БСА, обработанный КДЯ, с АО (БСА-груша). Крысам трех последних груш перед стрессом вводили 0,2 МЛ 0,9% Нас1.

Введение тиролиберина вызывало быстрое увеличение АД (рис.2), что согласуется с данными литературы (Kondoh, 1989). Повышение АД было кратковременным, к 10-й минуте посла введения оно пормализовывалось, но на протяжении всей иммобилизации АД у ■ ТРГ-групш было вше, чем у ФР-групш. После .отвязывания АД у крыс ФР-грутш падало ивке исходного значения, у ТРГ-гругаш оно сшка--. лось медленней, чем. в контроле. У крыс БСА-грушш АД в норме побыло изменено, но во время и после стресса оно было выше, чем у ФР-группы. У ТРГ-БСА крыс в состоянии покоя АЦ не отличалось от такового у БСА- я ФР-груш. Вместе с тем АД во время иммобилизации у ТРГ-БСА крыс было шпкэ, чем у ЕСА-группьг. Таким образом, иммунизация к ТРГ но влияла на АД в норме, но изменяла его динамику при иммобилизационном стрессе, причем в направлении, противоположном эффектам экзогенного тиролиберина.

Средние значения ЧСС у всех 4 групп в норме не различались мевду собой и находились в 1феделах 365-380/мин-. Введение ТРГ но оказавало на ЧСС внразюшого елияяия. При . иммобилизационном стрессе ЧСС у герце всех групп-значительно увеличивалась, при ьтом в группах ТРГ-БСА и БСА повышение било достоверно большим» чем в

ФР-группе: на 2-й минуте стресса до 524+6/мин и 516+8/мин Против 487+ЮЛзш соответственно. Меаду собой ТЕГ-БСА и БСА-группы практически не различались. Отличие их значений ЧСС от ФР-грушш сохранялось на протяжении всей иммобилизации и в течение часа после не о. Тагам образом, в наших экспериментах ни ТРГ, ни иммунизация не влияли на'ЧСС, наблюдалось только неспецифгееское повышение реактивности на стресс после иммунизации (коньюгатом или БСА).

Сродние значения ЧД у крыс трех груш (ФР-, БСД-, ТРГ-БСД-) на протяжении всего эксперимента (норма, иммобилизационный стресс, восстановление после стресса) мевду собой почти не различались и почти не претерпевали изменений. Их средние величины колебались в пределах 85-100/мин. Введение ТРГ быстро повышало Щ приблизительно на 50% (р<0,001), но этот эффект бал кратковременным и через 10 han значения ЧД у_крыс этой группы не отличались

150 140 130 120 110 100 S0

иммобилизация

о-—

-15 0 15 30 45 60 75 00 105 120 135 150 165 1С0 185

Бремя, мин

Рис.2. Динамика изменения среднего артериального давления в те«енио 15~минутного периода, предшествующего стрессу, при ¿~ ™¿o™n иммобилизации ir в течениечаса после прекращешгястресса. С-етл-е KOV .си, сплошная линия - ТРГ-группа ввеАенив ТРГ за 15 Ä до лтГвосаГв/а в дозе 5 мг/кг, п=8); светце круши. nvin-^OT - ФР-группа (введение физиологического раствора, n=iö), те vine кружки, сплошная линия - ТРГ-БСА-группа (иммунизироватше копмгатом, n=II); томные кружки, пунктир - БСА-группа (введение ЕСА в ети ¡¡ммунизации, п=12% Стрелкой отмечен момент введения ТТ.*'р<0,05** p<o,oi *** p<o,ooi по сравнению с ФР-группой; * р<о,05 по сравнению с БСА.

от контрольных. Во время иммобилизации у ТРГ-группы была т.^кой же, как п у остальных трех груш.

Тпрожберип известен своим гипертермичоским действием, обнаруживаемым при введении в высоких дозах: 40 мг/кг (aansinath ot al.,1387). В пашем эксперименте (введение ТРГ в дозе 5 мг/кг) гипертермического влияния ТРГ выявлено не было. Вместе с тем при иммобилизации ТРГ оказывал выраженное ацтигитатзрмичэсксо действие (рис.3). У крыс этой группы теипэратура тела сохранялась постоянной на протяжении 2-часовой иммобилизации, тогда как у крыс ' ФР-группы к 120 минуте иммобилизации она снизилась на 1°С. Температура. тела у крыс БСА-группы при иммобилизации претерпевала наибольшие изменения и в конце иммобилизации, была ниже исходной почти па 2°С. Динамика изменений температуры тела у крыс ТРГ-БСА-групш была очень близкой к таковой у крыс ОР-групш. Температура тела у крыс ТРГ-БСА-группы на 120 минуте иммобилизации была достоверно выше, чем у БСА-групгш (37,51+0,18 против 36,83+0,17°С, р<о,05). Тагам образом, иммунизация к ТРГ оказывала однонаправленное по сравнению с введением тиролкберина знтигипо-термическсе действие, хотя и выраженное в меньшей степени.

Результаты опытов по измерению содержания глюкозы в крови у крыс представлены на рис.3. В норме различий по этому показателю мевду группами не обнаружено, введение ТРГ через 15 минут вызывало достоверное увеличение содержания глюкозы, что согласуется с даННЫМИ литературы (МагиЬазЫ et al., 1988; Ishlkawa et al., 19SO).' При стрессе у крыс всех групп уровень глюкозы в крови значительно, повысился, при этом в течение 2-часоЕой иммобилизации и в период1 восстановления обнаружились различия между группами. У крыс ТРГ-' группы уровепь глюкозы при стрессе возрастал в. меньшей . степени,'-чем у крыс ФР-группы, и в течение восстановительного периода он снижался быстрее. Это вполне согласуется с двухфазным влиянием ТРГ на обмен глюкозы (Marubashl,193В). Содержание глюкозы у ТРГ-БСА крыс при стрессе возрастало так же, как и у ФР- и БСА-группы, по быстрее, чем у крыс этих групп начинало снижаться, приближаясь к значениям, характерным для ТРГ-группы. Можно сделать вывод, что иммунизация крыс коньюгатом ТЕГ-БСА оказывает на содержание глюкозы в крови э<ЗНект, обратный первой фазе действия экзогешо вводимого ТРГ.

Разнообразив показателей, изученных в этой серии эксперимеп-тов, а также многообразие полученных эф&эктов иммунизации против

Бремя, мин '

Рис.3 Динамика изменения ректальной температуры (вверху) и. концентрации глюкозы в крови (внизу) в течение. 15-минутяого периода, предшествующего стрессу, при 2-часовой иммобилизации и в течешь часа после прекращения стресса, Обозначения как но рис.2.

ТРГ делают затруднительным однозначное объяснэшо полученных результатов. Эффекты иммунизации крыс копьюгатом ТРГ-БСА в основном обратны влиянию вводимого извне ткролиборша. Вместе с тем, некоторые физиологические показатели. подвернет двухфазному действию Т?Г( например, концентрация глюкозы в крови крыс) и в таком случае э^кт тчушзации . цротиз ТРГ : шаге т быть противоположным только одной из них. Мы выявили, что следствием иммунизации к ТРГ является о гонение изменений уровня глюкозы при строссо, обратное первой (гипергликемической) фазе влияния тиролиберина.Влияние иммунизации копьюгатом ТРГ-БСА на изменение температуры тела при пшотермическом состоянии наиболее слоят для истолкования и для однозначного объяснения нузадаются в дальнейшем исследовании.

На рспованш имеющихся результатов мокно предполоялть, ■ что при эмодаопальпом стрессе активность центральных тиролибериновых регуляторных систем у крыс, - иммунизированных коньюгатом, выше, чем в контроле. В нормальном состоянии организма центральный пул ТЕГ за счет повышенного.сиптэза гармонично сбалансирован периферическими анти-ТРГ антителами. При остром стрессе такая сбалансированность нарушается, - что обусловлено повышением содержания центрального тиролиберина и, как следствие, - наблюдается изменение физиологических показателей, которые находятся под контролем • тиролибериновых систем промежуточного мозга: содержание глюкозы понижается, а.содержание Т3 и температура тела повышаются, что соответствует прямым эффзктам ТРГ, как эндогенного, так и ОКЗОГОПНОВВОДИМОГО <Soha.Uy, Redding, 1SB7; Widdowson, 1987; îiori et ni.,1088; Harubashi et al.,1988). ПОДГВерДОНИвМ ЭТОМУ служит обратное вводимому извне тиролиберину влияние иммунизации к нему на регуляцию АД, которое находится под контролом тиролиберкп-оргических систем продолговатого мозга (xoskinen, îaoD). Следует отметить, что развитие исслодоваш'Л в этом направлении тробуот в будущем следующего методического шага - определеш1Я концентраций самого ТРГ в крови и тканях иммунизировашшх к ТРГ зиевотшх, а также ряда других нейромедиаторов и нейрорегуляторов, антитела к которым выявлены после имлунизащш к ТРГ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая результаты изучения физиологических следствий иммунизации крыс коньюгатом ТРГ-БСА, необходимо прежде всего отметить. многообразие наблюдаеглых эффектов такой иммунизации. Изменения . поведения и большинства вегетативных показателей били в основном обратнц действию окзагвтю вводимого тиролиборшга, что позволяет говорить о некотором оОщеугнетащем влиянии аутоиммунизации к ТРГ в противоположность общеактивирующему действию самого тиролибери-на. Однако следует отметить, что только этим нельзя объяснить все наблюдаемые эффекты. Среди последних есть такие, которые позволяют поставить вопрос о некоторых неизвестных ранее эффектах эндогенного ТРГ, например об его участии в регуляции алкогольного влечения. „

. вызэдьг , ■'. ;

1. Иммунизация крыс ковалентншяг коньюгагами тиролибернна с чужеродными белками индуцирует образование специфических антител к ТРГ, а таюке к ряду других эндогенных лигандов, что свидетель- . ствует о сложных следствиях нарушения иммунотолерантнооти при иммунизации к эндогенному 'биорегулятору.

2. Содержание трийодтиронкна в крови иммунизированных к ТРГ крыс было незначительно сниненным, содержание тироксина нэ изменялось. Пр:т кйлббшшз'ациошюм стрессе содержание трийодтиронина увеличивалось. •

3. Иммунизация к ТРГ приводила к уменьшении поискового компонента поведения и увеличению эмоциональной напряженности.

4. В состоянии покоя у иммунизированных к ТРГ крыс не выявлено изменений .вегетативной-регуляции.. .При ишабилнзациошом стрессе иммунизация к тлролиберину, в противоположность экзогенному ТРГ, тормозила повышение давления крови и аналогичэно экзогенному ТРГ - оказывала антигипотермическое и антигипергликеми-ческоэ действие. • - .

5. При иммунизации крыс коньюгатом ТРГ-БСА наблюдалось значительное усиление алкогольной мотивации.

6. Сложные следствия нарушения'Еммуноталёрантности при иммунизации к собственному биорегулятору-(на примере ТРГ) определяют неоднозначность физиологических аффектов.;Это явление должно учитываться ео всех последующих исследованиях, связанных с активной. иммунизацией к эндогенным регуляторам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации. .

I.Мартьянов A.A. Влияние тиролибернна на алкогольную мотивацию у крыс.// Проблемы совр. биологии: Тр. 20 научн. конф. мол. учекьас Б.тол. ф-та МГУ, Москва, 24-28 апр.,198Э:в 2ч./ МГУ.-М.- 1989.- 4.1.- С. 17-21.

2.Чепурнов С,А., Мартьянов A.A., Кузнецова Н.В.,Обухова Ц.Ф., Ашмарин И.П. Иммунизация крыс тиролибервд-белковыми коньвгатами // -Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов. прыгай, 27-29 ноября 1990 г./ 1990.- Лунина.- C.IS3.

З.Аимаран И.П., Обухова М.Ф., Мартьянов A.A., Данилова P.A., Бабская Н.Е., Сторожена З.И., Гречко Г.К., Кузнецова Н.В. •Активная-иммунизация к экзогенным к эндогенным антидепрессаитам.

Образование антител к биогенным аминам и пептидаих регуляторам.// Бкол. пауки.- 1991.- из.- С. 15-24.

4.ДзЬааг1п. I.P. .DaniloVa Е.А. , Martjanov А.А..Obuchova M.F., Kustova В.V., Saginbaeva Sh.K. lomunoragulation oi notiltMKmologic&l function In the organism. ' // Const. Congress 'Internet. Soo. for Pathophysiology.- Moscow.- 1991.- P. 106.

Выражаю искреннюю благодарность моим учителям екадемику АМН СССР И.П.Ашмарину и ст.н.о. М.Ф.Обуховой, а также А.А.Гусевой и О.О.Тарасовой за помощь и поддержку в работе. '

Подписано в печить 2'5». 12.91. Форинт 60x84/jg Объем 1.0 п.л. _________ Тир»л 100 экз. 3*хчэ У' OS..____________

Рвтапринт НИИСО я УК АПН. 103062, Мвскви, Лядип п., д. За.