Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические следствия иммунизации крыс ковалентными конъюгатами тиролиберина с белками-носителями

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологические следствия иммунизации крыс ковалентными конъюгатами тиролиберина с белками-носителями"

МОСКОВСКИ! ОРДЕНА ЛЕШИА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕН&. ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕШШ УШ-1ПШЖЕТ им. и.В. ЛОМОНОСОВА БиолопгозскнЯ факультет

На правах рукописи

МЛРТШЮВ АНДРЕИ ЛЛЕКСАШСРОВОТ )

УД1{ 077.17.05:591.18:612.017 «

«'ШИОДОГИЧШЖИЕ СЛЕДСТВИЯ ИММУНИЗАЦИИ кию КОШШЗШЗШМ ШШЮГАТАМИ ШРОЛИБШШ С БЕШУДИЮСНТЕДШ

03.00.13 - 'йизяодогая человека и животных

Автореферат дассорташш на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Москва - 1992

Работа

выполнена на кафедра физиологии человека и ешотнщ. , Биологического факультета 1ЯУ

(зав. кафедей - Академик АШ СССР И.П.Ашыарш)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор С.А.Чэпуршв

Офщиальшэ' оппоненты: И.С.ФрзЯпдлш - доктор биологических

наук, профессор С.А.Титов - доктор бшлогнчаских наук, ведущий н.с. Ведущее, учраздание: Институт высшей нервной деятельности

и нейрофизиологии АН СССР.

Васдата состоится -2 - 1992 г. в 1Б час. 30 шн.

ыа заседании Специализированного Соната Д.053.05.35 в Московском государственном университете по адресу: Москва, И98Э9,-Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологическогр факультета МГУ.

Автореферат разослан - 1992 г.

Ученый секретаре, Совета кандидат биологических наук

Б. А.Уварова

Актуальность проблемы.В настоящее время параду с к-.-юскчес-ктйх'Мтодамг в изучении физиологии эндогенных регуляторов, среди г'щщЦ ввшое место, занимают рогуляторные пептида, используются принципиально повыэ приемы: ишунопейтралязация эндогешшх регуляторов путем введения антител к ним (пассивная иммуьлзация) и активная оутоиммунизация (инверсная тмунорегуляцкя) против изучаема: регуляторов с помощью инъекций ковалентшх коныогатов эндогенного гаптена с чужеродными белками <Ашарин, Гомазков, 1989; Смирнов,Шлейнин, 1990). Яри этом пассивная иммунизация является обратимым и лишь пекногам более длительным воздействием, чем введение регуляторного фактора извне. Активная аутоиммуниза-ция, в отличие от пассивной, позволяет изменить . физиологический статус организма на значительное время. Причем достигается этот эффект сравнительно небольшим количеством инъекций, Это делает названный методический подход особенно ценным при исследовании таких функций, которые недоступны для изучения при кратковременном изменении содержания рогулятора в организме.

В качестве объекта исследования в настоящей работе выбран тпролиборин (ТРГ) - гишталомичзский р1Ш13инг7гормон Помимо гормонального действия - стшулящта се1фоцш1 тароотропша и прочитана из гипофиза, -. он облад ег весьма обшрнш спектром иных физиологических д^ф'люв. Среди извостпых - общеоктивирувдее влия-гшо на центральную нервнуй систему, действие на вегетативные функции, что вполне соответствует распространению ТРГ в нервной сисгемо, а такко в периферических тканях (iiorita ot ai. ,1886; Hitsuna et , 19SG). Рох таролиберина в организме вырааается в регуляции психических процессов, поведения, различных вегетативных функций: кровообращения, дыхания, пищеварения, обмена глюкозы И др. (Plotnikoff, 1972; Клуна,1984; Koskinen , IS, J;Griff iths, 1987; Ашар;ш,1Э83; Harubashi,i986). Наличие пшрокого круга известных свойств делает тироляберин интересной кгавэныо для исследовав,л методом инверсной ишунорегуляцил. В литературе есть лишь данные об активной вутоикмугою ащш против ТРГ для изучения подавления горкональпого действия тиролибершш; для этого использовали очень интенсивные ренимы иммунизации, водущие к глубокому измененшо ••тлроидной оси", к зш. лтэлыюму снижению уровня тиреоидшис гормонов (Fraser, Но Heiiiy,i983>. В этих условиях трудно оценить прямые влияния процесса иммунизации на поЕв^екие и ряд других физиологических функця".1 Комплексное изучите изменений в организме

животных, иммунизированных к ТРГ, должно углубить понимание механизмов аутоиммунных процессов и. вместе с том,- может расширить, наши знания о фенологической роли тиролиберина.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работа явилось исследование иммунологических и физиологических изменений, развл-ващихся у белых крыс вследствие активной шмунизвции к тиролибе-/ рину, в условиях, когда не происходит блокирования "тироидпой оси-.

В г^боте решались следующие задачи:

а) исследовать ишунореактивность сывороток крови крыс, иммунизированных к ТРГ;

б) оценить влияние иммунизации к тиролиберялу на содерканио тиро-оидшх гормонов (грийодтирошша - Г3 и тирогссина - Т^) в крови животных;

в) исследовать изменения повед&ни и алкогольной мотивации у крыс вследствие иммунизации к ТРГ;

г) исследовать физиологические показатели (артериальное давление - АД, частоту сердечных сокращение - ЧСС, частоту дыхания - ЧД, концентрацию глшози в 1фови и температуру тола) у иммунизированных к ТРГ крис в состоявши покоя и при иммобилизоциошом стрессе.

Научная новизна работы. Ваорвие проведено комплексное изучение изменений различных физиологических функций организма крысы после активной аугсшмуниэации против тиролиберина в режима, когда не происходит блокирования ■• тироидпой оси-. Поведенческие изменения вследствие иммунизации коныогатом ТРГ-БС1 включают увеличение эмоционального напряжения и алкогольпой мотивации экспериментальных животных. Исследуемые физиологические показатели: АД, ЧСС, ЧД,'содержание Т3, Т4 и глюкозн в крови, а тага®, температура тела у подвергнутых иммунизации гзшояшзс в норма практически пэ отличаюсь от контрольных значений, но при иымобшяззационном стрессе Оольшшство исследуемых показателей изменялись иначе, чем в контроле и после введения тиролиберина извне. Главным образом .изменения были обратными эффектам вкзогошого тиролиберина. Однако часть из них имела другой характер,, отражая более слогшый характер влияния иммунизации. Показаны проявления длительного изменения статуса организма в слокных форм1л поведения и мотиваций, что выгодно отличает двнноэ воздействие от введения изучаемого 8ндогенного регу....тора извне, ,

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследова-

пей подтверждают регуляторнуга роль тиролибарина в огнопш л ряда физиологических функций негормонального характера. Помимо известных свойств ТРГ, таких кок участие ' в регуляции кровообращения, метаболизма глюкозы, терморегуляции, показано ого участие в формировании сложных психоэмоциональных состояний животны;. усиление эмоционального напряжения и алкогольной мотивации у иммунизированных крнс.

Практическая значимость работы заключается в отработке методических подходов для создания длительных экспериментальных моделей, голезшпс для изучения авдогеншх регуляторов, патологических состояний. В перспективе такой подход монет быть использован я в практической медицине: доя коррекции - патологических изменений, _ например, гшертиресидгшх состояний в случае иммунизации к ТРГ.

Апробация роботи. Материала диссертации долозшпы на конференции колодах учоша Биологического факультета МГУ (Москва, 1989), на сишозиуш "Физиологическое и клиническое значение пептидов- (Горький, 1990), га Учредительном съезде патофизиологов (Москва, 1990), па заседании кофедрц физиологии человека и живот-ннх Биологического факультета Ь?ГУ (Москва, 1990). I7'. материалам диссертации опубликованы 4 научные работы.

Структура диссертации. Тиссортацяя изложена на /5"2 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методов лсслэ-дования, результатов собственных исследований и их обсуздения, заключения, выводов и списка литературы, включающего /9% наименований, в том числе /5? па иностранных языках, иллюстрирована . рисунками и // табли- ш.

МАТЕРИАЛЫ И 1Ш0ДЦ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на белнх беспородных крысах-самцах с весом в начало экспериментов 150-200 г.

Ковзлоитнкв коньдгатн щзолибергаш с белками получали, .используя гошциагош п бычий сшгароточный альбумин и приме, :я .различные шиваещгаэ огептн: глутаровый альдегид, произволом кар' бодпимида, дяфтордшттробензол. В результате серки опытов с иммунизацией крыс различными коньюгаташ для дальнейшие исслодованкй • бил выбран конызгат ТРГ-БСА, получошшй с помощью 1-этл-3(3~ дгаюимаминопропил)!«, Зодшшда ис1<КДИ>, обладавший наибольшей иммуногонностыэ. Синтез данного коньвгата проводили по следотаей схеме: молярное соотношение тиролиборша с белком было 1:100, а ТРГ и ИДИ соотносил как 1:10. Реакцию проводили в 0,1 Н,' <1оо-

фагно-буфериом растворе (ФБР), перемешивая, в течение 2 часов -при комнатной температуре /далее до истечения суток - при 4°С. Очистку проводили диализом в течение 2-х суток при 4°С протиг дистиллированное воды (3-4 смени) и 0,15 M HaCi (2 смени).

Иммунизация крыс коньюгатом ТРГ-БСА. Первичная иммушзацш заключалась в подкожном введении коньюгата (600 №сг белка/кг веса), эмульгированного в подлом адьюванте ФреИвда (A®)(caibioehen, США) (объемное соотношение хоньюгат:АФ было 1:1), в четыре точю спиш. Спустя три недели проводили годцертвавдуп иммунизацш подкожным введением шмуиогеив в той же дозе, с неполным АФ, i еще через 7-10 дней проводили вторую тоддеришаиаую.иммунизацию; По сравнению с описанныш в литературе режимами (Praser, Hotiellly, 1383; Houa, Ceffard, 1S87) ИЗбраШШЯ Схема ИшуНИЗаЩЯ

является неинтенсивной, -мягкой-, рассчитанной на торлояеше, i m полную блокаду ТРГ и его эффект ч.

Кровь для анализа антител, Т3 и Т^ брали спустя 8-10 дне] пооле иммунизации из хвостовой вены надрезанием кончика хвоста Сыворотки получали центрифугированием (35 мин при 5000 оОЛош крови, инкубированной при комнатной температуре в течение 2 ч.

Содержание антятэл к ТЕГ выракали в величине тиара, далуча еыой с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Шк проводил следующим образом: 95-ячэистые планшета (ritertek linbro/Titertek.CUlA) сенсибилизировали антигеном (ТРГ в концент рации 50 ккг/мл) в ФБР (рн6,5) в течение 12ч при 4°С. Далее шел отмывки планшеты заполняли О,IX раствором келаиша и инкубировал -1-1,5 ч при 37°С для блокирования не специфического связывания по верхностью ячейки. Затем после промывания планшета ячейки зааол пяли 100 мкл разведенной сыворотки. Для каждой сыворотки готовил ряд разведений, как правило, от 1/20 до I/IQ0Q0. Перед" внесение сывороток в ячейки раствор сыворотки в первом разведении инкуби ровали с 1% БСА при 37°С в течение I ч для истощэния анти-БСА ан тител. Следующий этап состоял в нанесении -вторичных- антикрыси них антител, меченных пероксидазой хрена, инкубацию проводили I ( при 37°С. После каждой из вшеназванных шиубаций планшет прош вали триады буферным раствором'следующего состава: 58 г наС1 1,21 г трис НС1, 0,2 мл твин-20 па I л ра_гвора с Hat¡3 в качест Be консерванта. Этот та бу$ер использовали для приготовления все растворов, кроме >. .ециально оговорелных. После этого в ячейв вносили раствор субстрата: 30 мг ортофенилевдиамида и 60 шел 32

JljOjj в 20 мл 0,1 Ы ФБР Срн 6,0). Оптическую плотность растворов окрашенного продукта реакции измеряли при 490 да с помощью автоматического фотометра "Tltertek" (США).

Концентрации Т3 и Т4 в пробах крови определяли радиоиммуда-логическим методом с использованием наборов реактивов, изготовленных Опытным производством Института биоорганической химии АН БССР (г. Минск).

Изучение поведения крыс методами ОП и НК проводили индивидуально в течение 2 мин. При этом оценивали следующие показатели: оргепигровочно-исследовательскуи акгивйость (ОИА) - по количеству переходов, вертикальных стоек, заходов в центр (только в ОП), обследованных норок (только в НК); эмоциональную активность (ЗА) - го количеству, актов грумилга (умывания) и дефекаций. Кроме того, для оценки ОНА'использовали отношение, величины горизонтальной активности к сумме вертикальных стоек и обследованных норок - коэффициент ОНА, предложенный А.В.Вальдманом (Вальдман,- 1934).

Алкогольяуи мотиваций у крыс оценивали индивидуально по количеству алкоголя, потребляемого животными в условля, свободного выбора между 10% раствором втанола и водой в одпочасовых екодливши сеансах (Linsnan, юз?). В остальное время суток крысы ¡мели неограниченный доступ к пища и воде и находились в общих метках.

- Исследование физиологических показателей у крыс в норма и при эмоциональном стрессе проводили слодуадим образом. За два дня до опито крыс оперировали под.эфирным наркозом, вживляя катетер (РК50) в общую сонную api. ¿m и датчик дыхательных двиганий (резиновая трубочка, заполненная графитовым порошком и включенная в электрическую цепь) подкояно вокруг грудной клетки с выведением и фиксацией катетера и электродов датчика па коку спины в моклопа-точной области. АД регистрировали с немощью электроманомэт^а statham Р 23АЛ (США), ЧСС определяли подсчетом пульсовых колооа-пий АД. Температуру тела определяли ректально электротермоштром. Периодически из катетера забирали пробы крови для определения концентрации глюкозы ортотолуидиновнм методом с использованием стандартных медицинских наборов реактивов. В конце опыта забирали кровь и для определена содоряания тиреоидзых гормонов.

Регистрацию показателей проводили в течение 15-мип пред-стрессового периода, в тпчение 2-часовогр' • иммобиизацяоштого стресса (привязывает, на столика Cpranr"- стороной -лорх), а затем

- в течение одного часа посла прекращения иммобилизации. Исследовали влияние введения экзогенного ТРГ и иммунизации крыс коньюгатом ТРГ-БСА.

Статистическую обработку результатов проводили с гомопц>ю t-критерия Стыодента, непараметрического 1сритерия Манва-Уитни-Вилкоксона и факторного анализа (F- критерия Фишера), а также программы repeated measures ahova из пакета статистических программ solo.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ шдмгтеский анализ сывороток крови крыс. ИФА сывороток крови животных опытной и контрольных груш (введение в дни иммунизации физиологического раствора или БСА,обработанного сшивкой, с АФ) показал,что иммунизация крыс коньюгатом ТРГ с БСА, полученным с помощью КДИ, приводит к образованию анти-ТРГ антител с титром I/I280-I/2560. Учитывая выс-чий уровень чувствительности КФА, следует считать ети титры свидетельством умеренного уровня иммунизации к ТРГ.

Интересные результата были получены наш при проведении ИФА сывороток крови крыс, тмунизированных коньюгатом ТРГ-гемоциашп. Помимо антител к ТРГ (титр I/I2B0) мы обнаружили, что сыворотки крови крыс опытной группы проявляют реактивность и в отношении других гаптенов, а именно: катехоламинов, серотошша, и, в меньшей степени, лей-энкефалина и оксигоцина. Наиболее выраженной была реакция сывороток к серотошшом, причем антитела, хотя и в насколько меньших титрах, были обнаружены и в сыворотках крови -крас, иммунизированных белком-носителем (гекоциашшом).

Такая сложная реакция сывороток вследствие иммунизации коньюгатом ГРГ-геыоцианин может иметь несколько объяснений.- Во-пэрвых, нельзя исключать наличия на поверхности слокнйго иммуно-гена (гемоцианин-очень крупный белок + молекулы ТЕГ) антигенных детерминант, подобных по конформации каким-то из эндогенных гаптенов, в частности, серотошну. Во-вторых, при индукции аутоанти-телогенэза в организме должна происходить сложная перестройка paJ боты ¡гшушюЗ систеш, особенно Т-супрессорных лимфоцитов, а также других регуляторных механизмов, в первую очередь - в состава первной системы. Для полноценного ответа шуття система должна частично преодолеть механизм толерантности, начать продуцировать аутоантитела (Сис вд,19В8), и, ¡щ следствие, общее состояние организма ыозкет при этом соответствовать таковому при стрессе.

6 . • .

<

Возмогло, срыв толерантности связан именно с вовлечение моно-аминергических систем, игр вида важную роль в процессах неспецифической адаптации организма (Розен, 1984). В этих условиях, когда концентрации эндогенных гаптенов в крови изменены, нельзя исключить включения регуляторных процессов со сторога иммунной системы (аутоиммунных по своей природе) па только против ТРГ, но и против других гаптепов. Все это соответствует таю® ряду публикаций последпих лат о существовании аутоантител к некоторым рогуля-торам в норме. Концентрации аутооптлтал могут возрастать при изменении физиологического статуса организма (-Анохина и др. ,1987; Ашмарин,<1роЯпдлзш,1989). Таким обрезом, наличие антител иной специфичности лишь внешне выглядит парадоксальным.

Анализ содержания тиреоидзнх гормонов в крови крыс опытной группы (иммунизация коньюгатом TFT-БСЛ) и контрольных групп (введение физиологического раствора и иммунизация БСА) показал, что у крыс оштпой группы содержание Т3 имеет выраженную тенденцию к снижению (0,757+0,025 против 0,824+0,034 я 0,830+0,030 пмоль/л соотватствошю), а по содержании различий пе выявлено (52,4+3,0 против 51,9+1,6 и 56,0+1,6 шоль/л соответ. свенно). Это соответствует приведенному вше заключению о том,- что пзбра;^шй -щадящий- ронял яимунпзад не блокирует полностью Функций -тиреоидяой осии, а лишь несколько тормозит их.

Помимо измерений в условиях спокойного состояния крыс концентрации тиреолдаых гормонов в крови крыс измеряли через I час после 2-часового »¿мобилизационного стресса. У крыс контрольных групп концентрация Т3 пе ..сличалась от таковой в норме, тогда как у иммунизированных коньюгатом ТРГ-БСА она увеличилась и стала равной 0,879+0,033 гагалъ/'л (р<0,05). Содержание Т4 у всех трех i-руш значительно сшздлось (почти вдвое), ы различий мевду группами выявлено не было. Таким образом, у иммунизированных крыс обнаружено незначительное снижение содеряания Т3 в крови отличная от контрольных крыс реакция этого показателя на икмобилизвциошшй стресс.

Поведение крыс в НК и ОП. -,

I) Ориентировочно-исследовательская активность (ОИА). Результаты изучения поведения крыс, иммунизированных к ТРГ, в ffit представлены в табл.1. Исходно крысы были развалены на группы таким образом, что средние показатели поведения' для разных групп на различались мевду et ой. Повторное тес-гроваше яи-отдах ятим ме-

Таблица I. Поведение крыс, иммунизированных коньвгатом ТРГ с БСА (ТРГ-БСА), а такие яивотннх, которым в дай. иммунизация вводили БСА. (БСА), в -норковой камере". В скобках указано число крыс в экспериментальных грушах.

Груши • Показатели поведения

крыс перехода стойки норки груминги дефекации

До иммунизации •

БСА (21) 21,3+1,6 12,3+1,2 4,9+0,7 1,5+0,3 2,'4+0,6

ТРГ-БСА (23) 21,9+1.6 11,5+1,0 4,7+0,6 1,3+0,3 2,5+0,5

Из них: высокоактивные

БСА (9) 28,4+1,4 15,6+1,7 6,7+1,1 1,9+0,8 1,9+0,8

ТРГ-БСА (14) 26,4+1,5 12,9+1,3 ',9+0,8 1,2+0,3 2,6+0,8

низкоактивные

БСА (12) 15,9+0.9 9,8+1,3 3,5+0,6 1,5+0,4 2,8+0,9

ТРГ-БСА О) 15,0ь1,3 9,4+1,1 4,6+1,0 1,6+0,5 2,3+0,6

П о еле им м у н и 3 а ц и и

БСА (21) 6,3+1,2 3.2+1,0 1,3+0,5 0,5+0,2 3,3+0,6

ТРГ-БСА (23) 8.9fl,2 2,6+0,5 1,8+0,4 0,8+0,2 5,3+0,41

Из них: вцсокоакт15вше

БСА (9) 9,6+2,0 5,6+2,0 1,6+0,6 0,9+0,5 2,3+0,5

ТРГ-БСА, ,(14) 9,9+1,3 2,7+0,5 1,7+0,4 0,9+0,3 5,9+0,5'

~ низкоактивные

БСА (12) 3,9+1,2 1,5+0,6 1,2+0,7 0,2+0,2 4,1+0,9

ТРГ-БСА (9) 7,3+2,2 2,4+1,0 2,010,8 0,8±0,3 , 4,2+0,7

р<0,01 к** р<0,001 по сравнению с БСА

тодом после ^окончания цикла иммунизации обнаружило, что показатели ОИА у крыс контрольной (БСА) и спитдой (коньюгат ТРГ-БСА) групп значительно снизились, что, вероятно, было в значительной степени обусловлено возрастными изменениями. Различий мевду группами практически не было, лишь горизонтальн. 1 активность у крыс опытной группы была несколько вше, чем в контроле. Помимо срав-. иешя средних знача 1 для всей группу ш проводили разделенно крыс в каадой группе на дао подгруппы: высоко- и шзкоактившх по

показателю горизонтальной активности. Оказалось, что повышенно показателей ОНА относительно контроля характерно для подгруппы низкоактиввнх животных опытной группы. Так как наблюдалась значительная вариабельность всех показателей, а абсолютные значения были невелики, достоверных различий даке при почти 2-крагном повышении всех трех показателей ОШ. у низкоактивных крыс опытной группы не выявлено.

Сравнение коэффициентов ОИА (Вальдошн, 1984) у этих животных выявило следующее: при исходных равных коэффициентах (1,35 у крыс опытной группы против 1,24 в контроле) после иммунизации коэффициент значительно повысился у крыс опытной группы (2,02) при почти неизменном в контроле (1,40). Возрастание коэффициента почти на 5056 было характерно и для высоко-, и для низкоактивной подгрупп крыс опытной группы. Увеличение зтого коэффициента связывают с ашссиогеншш действием исследуемого фактора, а уменьшение -наоборот, свидетельствует об ашссиолитическом действии (Соколов, 1987).

Изучение поведения крнс методом ОП проводили после окончания цикла иммунизации в двух ситуациях: бесстрессовой (слабый красный свет, тишина) и стрессовой (яркий свет и сильный звук). В среднем по всем исследуемым параметр™ ОИА различий мезду крыса;.® не было ни в бесстрессовом, ни в стрессовом варианте метода. Ко разделение крыс на высоко- и гогакоактивных, что у высокоактивных животных горизонтальная активность достоверно снижена, а у низкоактивных - наоборот, повышена относительно бесстрессовой ситуации.

Обобщая данпые исследования ОИА, отметим, что повышение коэффициента ОИА у крыс опытной группы после иммунизации свидетельствует об уменьшении исследовательского компонента.двигательной активности и увеличения локомоторного. Изменения характера поведения крыс опытной группы в стрессовой ситуации свидетельствует о повышенной лабильности ориентировочно-исследовательского поведения.

2) Эмоциональные показатели поведения. У нммушзиравшпшх к ТРГ крыс в первую очередь изменялось количество дефекаций и тестах Ш и ОП, - наблюдалось увеличение зтого показателя относительно такового в контроле и относительно исходного уровня. Обна- ' ружепа также тенденция к увеличению количества грумингов. Все это в совокупности свидетельствует о повышении эмоционального напряжения у иммунизированных коньюгатом крыс. Анализ наблюдаемых изменений показателей поведения для разных подгрупп показал, что

увеличение количества дефекаций- характерно в основном для высокоактивных животных. .' ..

Таким образом, обобцая данные о поведении крыс в НК и ОП молено сделать вывод, что в результате иммунизации против ТИ1 у крыс наблюдается повышение эмоциональной напряженности, снижение орпвнтироЕочко-исследовательского компонента двигательной активности и увеличение локомоторного, т.е. угнетение поисково-активкого поводения к усиление эмоционального.

Алкогольная мотивация у крыс, иммунизированных кояьюгатом ТРГ-БСА, изучавшаяся ками в длительном эксперименте, включавшем 83 ежедневных питьевых сеанса, значительно возросла относительно исходного весьма стабильного уровня И относительно контроля (введение БСА в те жо сроки) (рис.1). Так как в эксперимента использовали крыс с разной величиной алкогольной мотивации, при анализе результатов нам представлялось целесообразным разделение популяции крыс по уровню потребления алкоголя на два подгруппы: условно - -пьющие" и непьющие -, выбрав критически среднее потребление алкоголя 0,07 г/кг/час. оказалось, что увеличение потребления алкоголя красами опытной груши обусловлено, главным образом, увеличением этого показателя приблизительно в два раза у крыс из подгруппы -пьющих", тогда как у "Евпьодпс" животных усиление алкогольной мотивации хотя и наблюдалось, но в гораздо меньшей сто-

< " '..............". "\

с. к \

-О.СО

го

2 0.50

3

® 0.40 аз

0.30

<и «

>о ® 0.20 р.

с о.ю

0.00

л**

/ ^ч*

'л

н

' V

I 1

0 1234507

6 9 10 И 12 13 14 15

Бремя, недели

Рис.1. Динамика потребления алкоголя крысами, иммунизирован кымн кояьюгатом ТРГ-БСА (п=12) (темные кружки, сплошная линия) и Есл (п=П) (светлые коужки, пунктир). Стрелками отмечены дни ш-/7ИЗации. * р<о,05 ** р<0,01 относительно данных для 8-й недели &ксповимента. .

пепи. В другом эксперименте введение ТРГ в раз^'х дозах (Г и 5 мг/кг для однократного введения или 0,1 и I мг/кг для курсового в течение Б дней, внутрибршинно за 30-40 минут до начала питьевого сеанса) перед питьевым сеансом было неэффективным и не изменяло потребления алкоголя-

Так как алкоголь обладает антадепрессивным влиянием нз психику и в малых дозах оказывает активирующее влияние на центральную нервную систему, можно' предположить, что иммунизация к ТРГ оказывает депрессоподобный эффект, что вызывает у крыс усиление алкогольной мотивации. Это согласуется с изложенными вше данными по изучению поведения, показывающая увеличение эмоционального напряжения у иммуннзиров внных к ТРГ зерне.

Влияние иммунизации на вегетативные показатели и обмен глюкозы исследовали у 4-х групп животных: а)ин?актные крысы, которым за 15 мин до стресса вводили тиролиберш - 5 мг/кг, в/а, в 0,3 мл 0,92 HaCl (ТРГ-группа) ; 0)интактше крысы (ОР-групла) ;

в)крысы, иммунизированные копыогатом ТРГ-БСА (ТРГ-БСА-группо);

г)крнсы, которым в дай иммунизации вводили БСА, обработанный КДИ, с АФ (БСА-группа ). Крысам трех после днях груш перед стрессом вводили 0,3 мл 0.9S HaCl.

Введение тиролиберина вызывало быстрое увеличение АД (рис.2), что согласуется с донными литературы (Kondoh. хазЭ). Повышение АД было кратковременным, к 10-Я минуте поело введения оно нормализовывалось, по на протяжении всей иммобилизации АД у ТРГ-грушш было вше, чем у ФР-группы. После отвязывания АД у кркс ФР-группн падало вике исходного значения, у ТРГ-группы оно сшпса-: лось медленней, чем в контроле. У крыс БСА-грутш АД в норме побыло изменено, но во время и после стросса оно было выше, чем у ©Р-грулпы. У ТРГ-БСА крис в состоянии покоя АД на отличалось от такового у БСА- и ФР-групп. Вместе с тем АД во время иммобилизации у трг-БСА крыс было нике, чем у БСА-грутш. Таким образом, иммунизация к ТРГ но влияла на АД э норме, по изменяла его динамику при иммоСшщзациошгом стрессе, причем в направлении, противоположном эффектам экзогенного тиролибэркяа.

Средою значошгя ЧСС у всех 4 груш в норме не различались между собой и находились в пределах 365-330/гяпг. Введошю ТРГ но оквзавало на ЧСС вырозюшгаго влияния. При кммобилазационном стрессе ЧСС у крыс всех групп-значительно увеличивалась, при огш в группах ТРГ-БСА и БСА повышение Сило достоверно большим, чем в

Ф?-группе: на 2-й минуте стресса до 524+6/шш и 516+8/мин против 487+10/мин соответственно. Между собой ТРГ-БСА и БСА-грушш практически не различались. Отличие их значений ЧСС от ФР-группы сохранялось на протяжении всей иммобилизации и в течение часа поело нет. Таким образом, в нашх экспериментах ни ТЕГ, ни - иммунизация не влияли на'ЧСС, наблюдалось только не специфическое повышение реактивности на стресс после иммунизации (ксньюгатом или БОА).

Сродни© значения ЧД у крыс трех групп (®Р-, БСА-, ТРГ-БСА-) на протяжении всего эксперимента (норма, ташбнлизяциопшй стрэсс, восстановление после стресса) мезду собой почти не различались и почта не претерпевали изменений. Их средние величины колебались в пределах 85-100/мин. Введение ТРГ быстро повышало приблизительно на БОЖ (р<0,001), но этот эффект бил кратковременным и через 10 мин значения Чй у_кркс этой группы не отличались

150 -

Е*

О

90 -1-1-1-1-1-1-'-1-1-1-1 ' 1 г

-15 0 15 30 45 СО 75 00 105 120 135 150 165 100 195

Время, мин

Рис.2. Динамика изменения среднего артериального давления в течение 15-мзшутного периода, предшествующего стрессу, при 2-чесоеой иммобилизации и в течение часа после прекращения стресса. Свотл:е кр1'...си, сплошная линия - ТРГ-групга (введение ТРГ за 16 минут до стресса, в/а в дозе 5 мг/кг, п=8); светлые кружки, пунктир - ФР-группа (введение физиологического раствора, п=18); темные кгадош, сплошная линия - ТРГ-ВСА-группа (иммунизированные коньюгатом. п=П); томные кружки, пунктир - БСА-группа (введение ВСЛ в дни иммунизации, п=12). Стрелкой отмечен момент введения ,;,РГ. * Р<0,05 ** Р<0,01 *** р<о,оо1 ш сравнению с ФР-группой; 1 р<о,05 по сравнению с БСЛ.

от контрольных. Во время иммобилизации НИ У TFT-групш бала такой же, как и у остальных трех груш.

Тиролиберин известен- своим гипортермическим действием, обнаруживаемым при введении в Высоких дозах: 40 МГ/КГ (Bansinath ot ai.,1387). В нашем эксперименте (введение ТРГ в дозе 5 мг/кг) ги~ пертермического влияния ТРГ выявлено не было. Вместе с тем при иммобилизации ТРГ оказывал выраженное антигяпотермичэсксе действие (рис.3). У крыс этой группы температура тела сохранялась по- ( стоянной на протяжении 2-часовой иммобилизации, тогда как у крыс ФР-группы к 120 минуте иммобилизации она снизилась на 1°С. Температура тела у крыс БСА-группы при иммобилизации претерпевала наибольшие изменения и в конце иммобилизации была ниже исходной почти на 2°С. Динамика изменений те,-шоратуры тела у крыс ТРГ-БСА-групш была очень близкой к таковой у крыс ffiP-групш. Температура тела у крыс ТРГ-БСА-грушш на 120 минуте иммобилизации бала достоверно вше, чем у БСА-групш (37,51+0,18 против 3S,88+0,I7°C, р(0,05). Гагам образом, иммунизация к ТРГ оказывала однонаправленное по сравнению с введением тиролибэрина антигшо-термическое действие, хотя и Еыражениое в меньшей степени.

Результаты опытов по измерению содержания глюкозы в крови у крыс представлены на рис.3. В норме различий по этому показателю между группами пе обнаружено, введение ТРГ через 15 минут вызывало достоверное увеличение содержания глюкозы, что согласуется -с данными литературы (Harubaahi et al.,1903; Ishikawa et al.,1930). При стрессе у крыс всех групп уровень глюкозы в крови значительно, повысился, при атом в течение 2-часовой иммобилизации и в период: восстановления обнаружились различия между группами. У крыс ТРГ-' группы уровень глюкозы при стрессе возрастал в . меньшей . степени,' чем у крыс ФР-группы:, и в течение восстановительного периода он снижался быстрое.'Это вполне согласуется с двухфазным влиянием ТРГ па обмен глюкозы (narubashi,1988). Содержание глюкозы у ТРГ-БСА крыс при стрессе возрастало так не, как и у <ЗР- и БСА-группы, по быстрее, чем у крыс этих групп починало снижаться, приближаясь к значениям, характерным для ТРГ-групш, Можно сделать вывод, что иммунизация крыс коньюгатом ТРГ-БСА оказывает на содержание глюкозы в крови эффект, обратный первой фазе действия экзогешю вводимого ТРГ.

Разнообразие показателей, изученных в этой серии экспериментов, а также многообразие полученных эффектов иммунизации против

О о

&30 >»

frei Ov

g 38 §

03 .

37

>4 jt""

+ --

иммобилиэация

0 15 30 45 . 75 . 105

133 . 105 .135 Время, мин

175

s

al50

ro

о

а

s

£100 t»

к 0)

175

иммобилизация

0 1С

45

75

L35 . . . 195 Время, мин

Рис.3 Динамика изменения ректальной температуры (вверху) и концентрации глюкозы в крови (внизу) в точение. 15-минутного периода, предшествующего стрессу, при 2-часовой ш.мобилизации н в течешь часа после прекращения стресса. Обозначения как но рис.3.

ТРГ далаит затруднительным однозначное обьяснешто получепзих результатов. здазкты иммунизации крыс коньюгатом ТРГ-БСД в основном обратш влиянию вводимого иззно таролиборияа. Вместе с тем, некоторые физиологические показатели подвернет двухфазному действию ТРГ( например, концентрация глюкозы в крови крыс) и в таком случае эффект иммунизации против ТРГ ' может быть противоположным только одной из них. Ш выявили, что следствием иммунизации к ТРГ является о глояенш изменений уровня глюкозы при стрессе, обратной первой (глпоргликемической) фазо влияния тиролибершю.Влияние иммунизации коньюгатом ТРГ-БСА на изменение температуры тела при птотормичоском состоянии наиболоо слозгаш для истолкования и для однозначного объяснения нуждаются в дальнейшем исследовании.

На основании имеющихся результатов можно првдполояить, что при эмоциональном стрессе активность центральных тиролкбериновых рогуляторных систем у крыс, - иммунизированных коньотатом, выше, чем в контроле. В нормальном состоянии организма центральный пул ТРГ за счот повышенного сгатеза гармонично сбалансирован периферическими анти-ТРГ аптителами. При остром стрессо такая сбаланси-ровашгость нарушается, что обусловлено повышением содержания центрального тироллбершш и, как следствие, - наблюдается изменение физиологических показателей, которые находятся под контролем ■ * тиролибериновнх систем промежуточного мозга: содержание глюкозы понижается, а содержание Т3 и температура тела повяиаотся, что 'соответствует прямым з<1фзктам ТРГ, как ондогеиного, так и

ОКЗСГОННОВВОДИМОГО (Schally, Rociding, 1SS7¡ Widdowsori, 1387; Kori at al. , 1956 ¡ Marubashí et al., 13S0) ПОДГВврДОНКеМ ЭТОМУ СЛУЖИТ

обратное вводимому извне тиролиберину влиягага иммунизации к пеку па регуляцию АД, которое находится под контролем тиролибергаь ергических систем продолговатого мозга (Koskinen, issc). Следует отметить, что развитие исследований в этом направлении требует в будущем следующего методического иага - определения концентраций самого ТЕГ в' крови и тканях иммунизированных к ТРГ кивотных, а также ряда других нэйромэдипторов и нейрорегуляторов, антитола к которым выявлены посла иммунизации к ТРГ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая результаты изучения физиологических следствий иммунизации крыс копыегатом ТРГ-БСА, необходимо правде всого отметить, многообразие наблюдаемых. зффэктов такой иммунизации. Изменоция поведения и большинства вегетативных показателей были в основном обратил действию экзогенко вводимого тиролиберина, что позволяет говорить о некотором общеугиотавдем влиянии аутошмунизащи к ТРГ в противоположность обда активирующему действии самого тиролибери-на. Однако следует отметить, что только этим нельзя объяснить все наблюдаемые эффекты. Среди последних ость такие, которые позволя-- ют поставить вопрос о некоторых поизвостных ранее эффектах эидо-гещхого' ТРГ, например об его участии в регуляции алкогольного влечения.

15

* " •.*-•,* ¿ г • ^д'тич-п» V*" 7* >т т-г> \- ti

j

вывода i ' ■

1. Иммунизация крыс ковалентными коньюгатами тиролиберина с чужеродными белками индуцирует образование специфических . антител к ТРГ, а такка к ряду других эндогенных лигандов, что свидетельствует о сложных следствиях нарушения иммунотолерантнооти при иммунизации'к эндогенному'биорегулятору.

2. Содержание тркйодтиронкна в крови иммунизированных к ТЕГ крыс было незначительно сниженным, содержание тироксина не изменялось. Црк иммоогмизационном стрессе содержание трийодтирошша увеличивалось. ;

3. Иммунизация к ТРГ приводила к уменьшению поискового компонента поведения и увеличении эмоциональной напряженности,

4. В состоянии покоя у иммунизированных к ТРГ крыс не выявлено изменений вегетативной регуляции. При ишобшшзационном стрессе иммунизация к тлролкберину, в противоположность экзогенному ТРГ, тормозила повышение давления крови и шэлогичено экзогенному ТРГ - оказывала актигапотермическое и антигшерглшгами-Ч8СК08 действие. • ,

5. При иммунизации крыс коньюгатом ТРГ-БСА наблюдалось значительное усиление алкогольной мотивации.

6. Сложные следствия нарушения иммуиоталерантпости при иммунизации к собственному биорегулятору (на примере ТРГ) определяют неоднозначность физиологических аффектов. Это явление должно учитываться ео всех последующих исследованиях:, связанных с активной иммунизацией к эндогенным регуляторам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

I.Мартьянов A.A. Влияние' тлролибэрша на алкогольную мотивацию у крыс.// Проблемы совр. биологик: Тр. 20 научн. конф. мол. учеккх Биол. ф-та МГУ, Москва, 24-28 впр.,1989:в 2ч./ МГУ.-Ы.- 1989.- 4.1.-С.17-21.

2.Чэпурков С.А., Мартьянов A.A., Кузнецова Н.В.,Обухова ПЛ., Ашмарин И.П. Иммунизация крыс тиролкберин-белковыш коньюгатами // -Физиологическое и клиническое значение регуляторных .пептидов. *jpbKtfi, 27-29 ноября 1990 г./ 1990.- Пущина.- C.IS3.

З.Аямарин И.П., Обухова M.ö., Мартьянов A.A., Данилова P.A., Бабская Н.Е., Стороу.эез З.И., Гречко Г.Н., Кузнецова Н.В. Активная иммунизация к экзогенным и андогенним антидепрессантам.

Образованна антител к биогенным аминам и пептидным регуляторам, ff ■ Биол. науки,- I99I.- иЗ.- С. 15-24.

4.Aahaarin, I.Р..DaniloVa H.A., Martjanov A.A..Obuchova M.F., [

Eustova В.7., Sagimbaeva Sb.K. Imounoregulation of j

noniomunolosical function In tbo organism.' // Const. Congress 'Internat;. Soo. for Pathophysiology.- Moscow.- 1991,- P. 186. !

Выражав искреннюю благодарность моим учителям академику АШ < СССР И.П.Ашмарплу и ст.н.с. М.Ф.Обуховой, а также А.А.Гусевой и О.С.Тзрасовой за помощь и поддораыу в работе.