Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол"

На правах рукописи

Золотарева Наталья Владимировна

Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол

03.01.04 - биохимия

4845487

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МАЙ 2011

ТВЕРЬ 2011

4845487

Работа выполнена на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений Тверского государственного университета

Научный руководитель Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Лапина Галина Петровна

доктор биологических наук, профессор Рабинович Галина Юрьевна

кандидат биологических наук, доцент Карцова Софья Владимировна

Ведущая организация

Самарский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится « 12 » мая 2011 года в 14 00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.263.08 при Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70/1Б, корп. 5, ауд. 318.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета по адресу: 170100, г. Тверь, ул. Володарского, 44 а.

Автореферат разослан « <8> » апреля 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одна из наиболее актуальных в физико-химическом аспекте проблем биохимии алкоголизма - регуляция активности алкогольдегидрогеназы (АДГ). В ряде исследований (Островский Ю.М., Сатановская В.И., Садовник М.Н., 1969; White, A.M., 1998; Нужный В.П., 2002 и др.) установлено, что в качестве субстрата фермента наиболее часто используется этанол. Достаточно полно изучен физиологический аспект действия этанола на организм человека (Бурков Ю.В., Иванова H.H., 2008), а также исследован ферментативный механизм утилизации этанола в организме человека (Груздева К. Н., 2001 и др.) при участии фермента алкогольдегидрогеназы. Однако вопросы регуляции ферментативной активности алкогольдегидрогеназы изучены недостаточно.

Алкогольдегидрогеназа - фермент класса оксидоредуктаз (1.1.1.1), катализирующий процессы окисления никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) первичных алифатических спиртов в соответствующие альдегиды (Диксон М., Уэбб Э., 2005). Алкогольдегидрогеназы найдены в тканях животных (печени лошади) (Xie Р., 2005), растениях (томатах и картофеле), грибах, дрожжах, бактериях (Авилова Т.В., 2001) и др. Наиболее изученными ферментами являются алкогольдегидрогеназы, выделенные из дрожжей, а также печени лошади (Сапожников Г.П., Лозитнова А.Б., 2004; Лапина Г.П., Золотарева Н.В., 2006 - 2008).

Алкогольдегидрогеназы являются недостаточно исследованными биокатализаторами с точки зрения использования различных фармпрепаратов, применяемых для лечения больных хроническим алкоголизмом (Буров Ю.В., Ведерникова H.H., 2002). До настоящего времени актуальным является поиск специфических эффекторов фермента алкогольдегидрогеназы, окисляющих этанол, с целью регулирования концентрации этанола и ацетаяьдегида в организме, что важно в изучении молекулярных основ биохимии алкоголизма (Буров Ю.В., Ведерникова H.H., 1984; Марри Р., Греннер Д., 1993; Goldberg L., Rudberg U., 2004).

Вопросы изучения и установления молекулярных механизмов такого рода эффекторов (активаторов или ингибиторов фермента) относятся к перспективным направлениям современной энзимологии и обсуждались на Symposium of A.I. Oparin: «Biochemistry of the twenty-first century: problems and frontiers», 1994; а также в работах (Бонитенко Е.Ю., 2003; Zidoni Е., Kreter М., 2004 и др.). Поиск решения поставленной задачи и определяет актуальность данной работы.

В практической медицине довольно широко используются фармпрепараты Пирацетам и Зорекс (Wyllie М. G., Paciorec Р. М., 2001; Waterfall J. F., 2003). Физиологические основы действия данных регуляторов известны: Пирацетам, являясь ноотропным фармпрепаратом, изменяет метаболические и биоэнергетические процессы в нервной клетке, улучшает, функции, головного мозга, усиливая кровоток (Руденко Г. М., 1996; Benzi G„ Pastoris О., 1997); Унитиол, в свою очередь, в составе Зорекса способствует восстановлению

обмена веществ в нервных клетках и выведению продуктов распада этанола из органов и тканей (Ostrovskaja R. U., Hoffmann W., Molodawkin G. M., 1993; RoglevM., 2001).

Эффективное использование этих фармпрепаратов базируется на информации о молекулярно-кинетическом характере их действия на фермент АДГ, который в полной мере не изучен.

Цель работы: исследование молекулярно-кинетического механизма действия фармакологических препаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола (составной части Зорекса) на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы в условиях in vitro. Задачи исследования:

1.Выделить и очистить алкогольдегидрогеназу из пекарских дрожжей по методу Г.А. Кочетова. Определить субстратную специфичность фермента в группе этанол-бутанол-изопропанол и рассчитать его основные ферментативные параметры и выявить оптимальную концентрацию специфичного субстрата. Сравнить ферментативные показателей алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей и алкогольдегидрогеназы печени лошади.

2. Разработать многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в присутствии регуляторов и оптимизировать его:

рассчитать значения важнейших ферментативных параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади для системы контроля;

- выявить влияние Пирацетама и никотинамидадениндинуклеотида на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы. Найти их оптимальные концентрации;

- определить действие Зорекса и Унитиола на активность биокатализатора.

3. Установить тип регулирования (активации или ингибирования) алкогольдегидрогеназы в присутствии Пирацетама, Зорекса и Унитиола.

4. Для изученных ферментативных систем построить геометрический «портрет» в трехмерной Км' V1 - системе координат и на этой основе

рассчитать дополнительный ферментативный параметр (длину pla0) -,

р!а(2)-, р!ат - векторов).

Научная новизна результатов исследования

Разработан многоэтапный научно-методический подход по изучению влияния фармакологических препаратов Пирацетам, Зорекс и Унитиол на каталитическую активность АДГ.

Впервые выявлены типы активации АДГ при действии на фермент фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола и установлена эффективность функционирования биокатализатора на основе векторных построений данных ферментативной кинетики в трехмерной Km'V' - системе координат, позволивших впервые получить визуализацию хода ферментативного процесса с участием АДГ в присутствии Пирацетама,

Зорекса и Унитиола и рассчитать новый ферментативный параметр - длину вектора, характеризующего интенсивность активации фермента и отражают щего суммарную эффективность функционирования биокатализатора.

Теоретическая и практическая значимость работы. Работа носит фундаментальный характер и направлена на изучение молекулярно-кинетического поведения алкогольдегидрогеназы.

Полученные данные в рамках разработанного в данной работе многоэтапного научно-методического подхода расширяют и развивают теоретические представления об эффективности регулирования биокатализа в присутствии различных добавок.

Разработанная схема изучения типа регулирования (активации или ингибирования) АДГ для фармакологических препаратов (Пирацетам, Зорекс и Унитиол), направленная на поиск оптимальных условий течения ферментативной реакции, может служить моделью для изучения других фармпрепаратов, действующих на фермент утилизации этанола - алкогольдегидрогеназу - с целью устранения последствий интоксикации организма.

Часть полученных данных и сделанные выводы использованы при выполнении проекта № 2.1.1/1897 «Исследование взаимосвязи структурно-динамических свойств ферментов с их функциональной активностью и разработка новых биокатапизаторов на основе иммобилизованных окислительно-восстановительных ферментов для биомедицинской и пищевой промышленности», выполняемого по аналитической ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)». (Заказчик проекта - Министерство образования и науки Российской федерации, Федеральное агентство по образованию).

Научные результаты, выносимые на защиту:

1. Максимальная субстратная специфичность выделенной и очищенной из пекарских дрожжей алкогольдегидрогеназы среди спиртов различного строения наблюдается к этиловому спирту. Рассчитаны значения важнейших ферментативных параметров биокатализатора (Кгп, Ушах и Ккат). Выявлена оптимальная концентрация специфичного субстрата - этанола, равная 1,5-ЮЛМ.

2. Разработанный многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы позволил установить, что фармпрепарат Пирацетам как активатор алкогольдегидрогеназы обладает большей эффективностью в сравнении с Зорексом и Унитиолом.

3. Пирацетам, Зорекс и Унитиол по-разному активируют алкогольдегидрогеназу, а именно в случае Пирацетама - двухпараметрически рассогласованный тип активации (Иа-тип, Крупянко В.И., 1994), для Зорекса и Унитиола - двухпараметрически согласованный тип активации (1а-тип, Крупянко В.И., 1994) фермента.

4. Расчет дополнительного ферментативного параметра - значения длины вектора - на основе векторного построения геометрического «портрета»

алкогольдегидрогеназной реакции подтвердил наибольшую эффективность фармпрепарата Пирацетама в сравнении с Зорексом и Унитиолом.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Полученные результаты соответствуют пункту 4 паспорта специальности 03.01.04 «Биохимия (биологические науки)».

Апробация и реализация результатов диссертации

Основные положения и выводы диссертации апробированы в выступлениях на научных конференциях. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на V и VII научных конференциях аспирантов и студентов химического факультета (Тверской государственный университет, Тверь, 2006 и 2008); на XVI и XVII Региональных Каргинских чтениях «Физика, химия и новые технологии» (Тверской государственный университет, Тверь, 2009 и 2010); на Международной конференции «Состояние воды в биологических и модельных системах» (Тверская государственная медицинская академия, Тверь, 2007); Всероссийской научной школе для молодежи «Приборное и научно-методическое обеспечение исследований и разработок в области каталитического превращения бифункциональных органических соединений» (Тверская государственная сельскохозяйственная академия, Тверь, 2010), а также на научных семинарах кафедры физико-химической экспертизы биоорганических соединений ТвГУ и при выполнении дипломных работ, в которых соискатель был научным руководителем дипломников.

Полученные результаты по выявлению особенностей ферментативного поведения алкогольдегидрогеназы печени лошади и оптимизации метода выделения фермента из пекарских дрожжей используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре физико-химической экспертизы биоорганической экспертизы ТвГУ: в курсе лекций, при подготовке курсовых и дипломных работ студентов.

Публикации. Результаты исследования отражены в 9 публикациях, 3 из которых в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 182 источника, из которых 70 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 68 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

- Алкогольдегидрогеназа печени лошади - очищенный гомогенный коммерческий препарат фирмы «ЯеапаЬ (Венгрия).

- Алкогольдегидрогеназа пекарских дрожжей (выделен по методу Г.А. Кочето'ва).

- Фармакологический коммерческий препарат Пирацетам (2-оксо-1-пирролидинилацетамид) фирмы ОАО «Фармстандарт - УфаВита» (Россия) (в ампулах).

- Фармакологические коммерческие препараты Зорекс (Унитиол-2,3-димеркаптопропансульфонат натрия и кальция пантотенага) (в капсулах) и Унитиол - фармпрепараты фирмы «\/'а1еЩа» (Россия) (в ампулах).

- Сывороточный альбумин человека (САЧ) коммерческий препарат, лиофилизованный из человеческой сыворотки, фирмы «Кеапа1» (Венгрия).

В работе использованы следующие методы: - Метод выделения и очистки АДГ (метод Г.А. Кочетова, 1998) с некоторыми собственными изменениями методики (с использованием буферных растворов рН 6,0 и 7,5; тепловой обработки при 35°С). Схема выделения и очистки АДГ дана на рис.1. Выделение фермента АДГ из пекарских дрожжей вели в течение трех недель.

Подготовка исходного материала

/--

Фракционирование ацетоном

(-5°С)

Кристаллизация

(СМ-и^ол

и*

Перекристаллизация

«мад^о,) .__^

Рис.1. Схема выделения и очистки АДГ из пекарских дрожжей по методу Г.А. Кочетова с собственными модификациями

- Метод калибровочного графика, построенного по белку-стандарту -коммерческому препарату сывороточный альбумин человека (рис.2), применяли для оценки и расчета концентрации ферментативно-активного белка.

- Метод определения ферментативной кинетической активности АДГ.

При окислении этилового спирта образуется восстановленный НАД, количество которого определяли фотометрически.

АДГ

С2Н5ОН+НА Д + СНзСНО + НАДН + н+

Измеряли увеличение значения оптической плотности (Э) при длине волны 340 нм во времени (1). Контрольная кювета не содержала субстрата. Активность рассчитывали исходя из данных, полученных в течение 15—45 с хода ферментативной реакции.

- Метод Лайнуивера-Берка для обработки данных ферментативной кинетики и расчета важнейших ферментативных параметров: Кт -константы Михаэлиса, Утах - максимальной скорости реакции и Ккат -константы каталитической. В ходе ферментативной реакции рассчитывали начальные скорости реакций по зависимостям оптической плотности (О) во времени (г), строили прямые в координатах Лайнуивера-

Берка (1/У и 1/[Б]) и вели расчет важнейших ферментативных параметров -Кш, Ушах и Ккат.

— Метод векторных диаграммных построений. В трехмерной Км'У-системе прямоугольных координат каждая ингибируемая или активируемая ферментативная реакция получает свое векторное представление -конкретный трехмерный вектор Ь этой реакции. При этом длина данного вектора характеризует интенсивность протекания ферментативной реакции: положение Ь вектора в системе координат - тип изучаемой реакции, направление смещения - тенденцию к смене типа реакции, а траектория, описываемая подвижным концом вектора, - геометрический «портрет» изучаемой реакции.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изученные ферментативные системы:

Ферментативная система-1 (система контроля): АДГ печени лошади (2,41-10"4М), С2Н5ОН (1,5-10"2М), НАД различных концентраций (5,0; 4,5; 4,0; 3,5; 2,5; 1,5)-(10"2М).

Ферментативная система-2 состоит из АДГ печени лошади (2,41-Ю^М), этанола С2Н5ОН (1,5-10"2М), НАД (1,5-10"2М) при различных концентрациях Пирацетама (0,5^,5)(10'2М).

Ферментативная система-3, включающая фермент АДГ печени лошади (2,41-Ю^М), этанол С2Н5ОН (1,5-10"2М), Пирацетам (1,5-102) при варьировании концентрации НАД (0,5-4,5)-(10'2М).

Ферментативная система-4 состоит из АДГ печени лошади (2,4Ы0~4М), этанола С2Н5ОН (1,5-10'2М), Зорекса (5-10"2М) при варьировании концентрации НАД (1,5-5,0)-(10"2М).

Ферментативная система-5: фермент АДГ печени лошади (2,41-Ю^М), этанол С2Н5ОН (1,5-10"2М), Унитиол (5-10'2М) (как составная часть Зорекса) при варьировании концентраций НАД (1,5-5,0)-(10'2М).

Первый этап работы, изложенный в пункте 4.1 диссертации, посвящен выделению и очистке АДГ из пекарских дрожжей (рис. 1) по методу Г.А. Кочетова с собственными изменениями. Изучена субстратная специфичность АДГ в группе различных субстратов (этиловый, бутиловый и изопропиловый спирты). Определены важнейшие ферментативные параметры - Кт, Утах и Ккат, найдена оптимальная концентрация этанола.

По калибровочной зависимости (рис. 2) рассчитали содержание ферментативно активного белка в полученных экстрактах. Для значения величины оптической плотности (Э), равной 0,50 опт. ед., по калибровочной кривой нашли значение концентрации фермента, составившее 8,42-10'5 г белка /г сырой массы дрожжей или 2,41 -10"4М.

<00 480

С, мг/Юмл

Рис. 2. Калибровочная зависимость оптической плотности ф)от концентрации белка (С) сывороточного альбумина человека («Г1еапа1», Венгрия)

Для изучения субстратной специфичности использовали водные растворы различных бутанола-1, концентрации которых

субстратов: этанола, изопропанола и

меняли в интервале (1,5-6,0)- 10"2М. Далее определяли кинетику течения биокаталитической реакции по изменению величины оптической плотности (Б) во времени (I). В качестве примера на рис. 3 представлены зависимости 1Э~1 для водного раствора субстрата этанола концентраций и (-10"2М) 6,0 и 1,5.

Рис. 3. Засимости оптической плотности (Б) во времени (1) окисления субстрата-этанола водным раствором АДГ (2,41*10"4М) печени лошади для концентраций (-Ю^М) субстрата: а - 6,0 и Ь -1,5

На основе кинетических зависимостей (рис. 3) рассчитывали начальные скорости АДГ-зависимых ферментативных реакций (У0), которые спрямляли в координатах двойных обратных величин (координатах Лайнуивера-Берка) (рис. 4).

w. -то"

MWmhh 2,85

2,66

Рис. 4. Зависимость обратных величин начальных скоростей от обратных величин концентраций субстратов этанола - (•) и НАД - (») для водного раствора АДГ дрожжевой (2,41*10"4М)

-о ¿5

0,0

1/[fe], 10 моль

На основе рис. 4 провели расчет значений Кш, Ккат и Vmax для водного раствора фермента (2,41-10"4М), которые составили, соответственно, (2,85 ± 0,19)-10"5М; (9,23 ± 0,18)-10"2с"' и (3,86 ± 0,18>10-5опт.ед./с. Полученные характеристики корректно согласуются с данными литературы (Xie Р., Parsons S.H., Speckhard D.C., 1997), что указывает на достоверность полученных данных.

По вышеприведенной схеме определены ферментативные параметры для двух других субстратов: бутанола-1 и изопропанола (табл.1). В ряду субстратов-спиртов (этанол, бутанол-1 и изопропанол) численные значения Кш возрастают в 3,2 раза и уменьшаются в 1,6 раза значения Vmax. Это означает, что в изученной группе субстратов АДГ: этанол - бутанол-1 -изопропанол, - сродство их к ферменту постепенно снижается. Для этанола найдена максимальная активность АДГ дрожжевой (Vmax), минимальная -для изопропанола.

Таблица 1

Рассчитанные параметры ферментативной активности АДГ дрожжевой

Субстрат Km,-10"SM Vmax,-Ю-5 опт.ед./с Ккат,-10"2 с"1

Этиловый спирт 2,85±0,19 3,86±0,18 9,23±0,18

Бутиловый спирт 6,67±0,21 2,47±0,21 6,19±0,21

Изопропиловый спирт 9,09±0Д0 1,49±0,20 3,47±0,20

Активность (Ккат) по бутанолу-1 и изопропанолу уменьшается в 1,5 и 2,5 раза по сравнению со скоростью окисления этанола. Таким образом, обнаружено, что с различными субстратами биокатализ идет по-разному, что свидетельствует о наличии субстратной специфичности АДГ дрожжевой. Выявлен наиболее оптимальный субстрат - этанол, для которого значение Ккат максимально и составляет (9,23±0,19)-10"2с'.

Следует отметить, что изучение ферментативного процесса, катализируемого АДГ, при варьировании концентрации второго компонента субстрата -

НАД - позволило получить значения Km и Vmax близкие к тем, что были рассчитаны для ферментативной системы при варьировании второго компонента субстрата-этанола.

Полученные данные согласуются с (Hurley T.D., Bosron W.F., Stone C.L., 1994), где определена субстратная специфичность для АДГ, выделенной из других природных источников (растений и грибов), что подтверждает универсальность полученных результатов.

На первом этапе исследовательской работы разработаны собственные эффективные модификации метода выделения и очистки фермента. Освоен и применен кинетический метод определения ферментативных параметров алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей, а также изучена и установлена субстратная специфичность АДГ дрожжевой, т.е. оптимизированы условия для выполнения последующих этапов дальнейшей работы.

На втором этапе работы определены кинетические параметры каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в системе контроля (сравнения), включающей АДГ печени лошади (2,4М0"*М), С2Н5ОН (1,5-10"2М), но при варьировании концентрации НАД (0,5-5,5)- 10'2М (ферментативная система-1). В ходе определения активности АДГ печени лошади построены кинетические зависимости изменения оптической плотности (D) во времени (t) в системе контроля для следующих концентраций НАД (0,5-5,5)-10"2М. Кинетические зависимости имели стандартный вид кривых с насыщением. По освоенной схеме построены спрямленные кинетические зависимости в координатах Лайнуивера-Берка и рассчитаны параметры Km, Ккат и Vmax для ферментативной системы-1, включающей АДГ печени лошади (табл. 2).

Таблица 2

Показатели ферментативной активности АДГ пекарских дрожжей и АДГ печени лошади при использовании водного раствора

Km,-10"5 М Vmax,-10"5 опт.ед./с Ккат,-Ю'с"1

АДГ пекарских дрожжей 2,85±0,19 3,86±0,18 9,23±0,18

АДГ печени лошади 2,51±0,17 3,51 ±0,17 8,94±0,17

По особенностям построения первичной, вторичной, третичной и четвертичной структур (Рогб!« А., 1995) а также по механизму каталитического действия (Курганов Б.И., 2008) эти два фермента (АДГ дрожжевая и АДГ печени лошади) практически идентичны. Близкие значения ферментативных параметров АДГ дрожжевой и АДГ печени лошади позволили провести исследование по влиянию эффекторов (Пирацетама, Зорекса и Унитиола) на АДГ печени лошади (коммерческий препарат) в модельных системах.

На третьем этапе исследовано влияние фармакологического препарата Пирацетама на каталитические параметры АДГ печени лошади в ферментативной системе-2, содержащей АДГ печени лошади (2,41-КИМ), С2Н3ОН (1,5-10"2М), Пирацетам (1,5-10'2М) при варьировании концентрации НАД (0,5—4,5)-10"2М и в ферментативной системе-3, включающей АДГ печени лошади (2,4Н0""М), С2Н5ОН (1,5-10'2М), НАД (1,5-10'2М) при различных концентрациях Пирацетама (0,5-4,5)-10"2М. Для сравнения кинетических параметров в ферментативной системе-2 и ферментативной системе-3 применили три способа изучения ферментативных характеристик биокатализатора:

1. Оценочный по выявлению возможного влияния и Пирацетама, и НАД (при варьировании их концентраций) на каталитическую активность АДГ печени лошади посредством анализа кинетических кривых БЧ. На кривых 04 определяли Ушах и строили зависимости в координатах Ушах -концентрация Пирацетама.

2. В рамках классической энзимологии строили кинетические зависимости БЧ. К начальным участкам полученных кривых проводили касательные и определяли начальные скорости (У0). Экспериментальные данные обрабатывали, используя способ, предложенный Лайнуивером-Берком, и рассчитывали важнейшие ферментативные параметры Ушах, Кгп иКкат.

3. Построение геометрического «портрета» изучаемой реакции, катализируемой АДГ, в трехмерной Км'У - системе прямоугольных координат для расчета дополнительных ферментативных параметров (длин

Р1ат-, Р1а(2)-, р/я(3)-векторов).

Для ферментативной системы-2 в рамках 1-го способа находили концентрацию Пирацетама, при которой активность АДГ максимальная. Для этого посредством изучения кривых 0-4 рассчитали значение Ушах и строили экспериментально полученную зависимость в координатах Ушах -концентрация Пирацетама (рис.5).

Рис. 5. Влияние

концентрации Пирацетама на скорость ферментативной реакции (Ушах), катализируемой АДГ

(2,41-10"*М), кинетика

которой описывается

уравнением Михаэлиса -Ментена

Обнаружили, что концентрация Пирацетама влияет на активность АДГ печени лошади, причем оптимальной является концентрация эффектора,

равная 1,5-10~2М, при которой значение Ушах составляет (19,80±0,32) •10"3опт.ед./с.

Обработка экспериментальных данных по 2-му способу с использованием координат Лайнуивера-Берка позволила получить следующие значения биокаталитических характеристик для ферментативной системы-2: Кт = (8,47 ± 0,37)-10"5 моль/л; Утах = (20,01 ± 0,37)-10"5 опт.ед./с; Ккат = (8,71 ± 0,3 7)-10'V.

Таким образом, обнаружена корреляция значений ферментативных параметров Ушах, рассчитанных при использовании 1-го и 2-го способов, а именно значение Ушах по 1-му способу равно (]9,80±0,32)-10'5 опт.ед./с, а по 2-му- (20,01±0,37) -10'5 опт.ед./с (табл.3).

Итак, введение Пирацетама ухудшает связывание фермента с субстратом (значение Кт на 71 % больше, чем в системе контроля), но улучшает течение каталитической реакции, а именно в 5,7 раз возрастает значение Ушах при использовании 1-го и 2-го способов.

Таблица 3

Рассчитанные каталитические характеристики фермента АДГ печени лошади (2,41-10"4М) для концентрации Пирацетама 1,5,10"'М при рН 6,0

Ферментативные параметры 1-й способ 2-й способ Система контроля

Km, -105М - 8,47±0,37 2,51±0,17

Vmax, -10"5 опт.ед./с 19,80±0,32 20,01±0,37 3,51±0,17

В результате введения в ферментативную систему Пирацетама (1,5-10"2М) повышается активность АДГ, что, зозможно, может привести к усиленному окислению этанола в организме человека и, следовательно, к уменьшению его интоксикации (Consalvi V., 1998; Gough W.H., 2001).

В связи с тем, что важная роль в биокаталитической реакции принадлежит НАД, необходимо определить оптимальную концентрацию этого компонента в модельной ферментативной системе. Для этого изучали возможное влияние различных концентраций НАД на активность АДГ печени лошади посредством анализа кинетических кривых D~t. Это позволило построить зависимость начальной скорости реакции (Уо) от концентрации НАД (рис.6).

Рис 6. Зависимость максимальной скорости реакции от

концентрации НАД для ферментативной системы-3

-^— Значение концентрации НАД,

[нам. ю'м составляющей 1,5-10'2М, является

оптимальным для ферментативной еистемы-2, поскольку зависимость имеет вид кривой с насыщением (рис. 6).

Рассчитали следующие значения Кш, Ккат и Ушах для ферментативной системы-3 (рН 6,0), содержащей АДГ печени лошади (2,41-Ю^М), Пирацетам (1,5-10"2М), С2Н5ОН (1,5-10"2М) и НАД (0,5-4,5)- 10"2М и сравнили с полученными кинетическими параметрами для ферментативной системы-2 (табл. 4).

Таблица 4

Кинетические параметры ферментативной реакции (Кт и Ушах) для водных растворов АДГ, рассчитанные по двум способам (1-й и 2-й) для ферментативной системы-2 и ферментативной системы-3

Кт,-10"5 моль/л Ушах, -Ю"5 опт.ед./с

1-й способ 2-й способ 1-й способ 2-й способ

Ферментативная система-2 - 8,47±0,39 19,80±0,32 20,01±0,39

Ферментативная система-3 5,89±0,39 5,03±0,39 11,78±0,38 12,01±0,38

Система контроля 2,51±0,17 3,51±0,17

Обнаружена корреляция ферментативных параметров Кш и Ушах, рассчитанных 2-мя способами. Значения Кш, полученные при использовании 2-го способа, в ферментативной системе-3 ниже в 1,5 раза в сравнении с ферментативной системой-2. В случае параметра Ушах наблюдали так же, как и в предыдущем случае, снижение этой характеристики в 1,7 раза при применении и 1-го, и 2-го способов. Кроме того, выявлено, что кинетические параметры активности АДГ печени лошади (Кш и Ушах) зависят от концентрации и Пирацетама, и НАД.

Обращает на себя внимание, что для концентраций и Пирацетама, и НАД, равных 1,5-10'2М, скорости ферментативного процесса максимальны и в случае ферментативной системы-2, и для ферментативной системы-3.

Таким образом, изучив ферментативную систему-2 и ферментативную систему-3, нашли оптимальные условия окисления этилового спирта (1,5-10"2М) при концентрациях компонентов модельной системы: АДГ печени лошади - 2,41-Ю^М, Пирацетама - 1,5-10'2М и НАД - 1,5-10"2М в условиях рН 6,0.

Используя найденные изменения параметров Кш и V в ферментативной системе-3 при сравнении с системой контроля, выявили тип активации.

Прямая 2 располагается ниже прямой 1 системы контроля (ферментативная система-1), что, согласно классификации В. И. Крупянко, соответствует двухпараметртески рассогласованной активации, т.е. Па-типу активации АДГ.

1/131, 10. моль

Рис. 7. Зависимости обратных величин начальных скоростей от обратных величин концентраций субстрата НАД для водного раствора АДГ (2,41 -Ю"4 М) в ферментативной сиетеме-1 (прямая 1) и ферментативной системе-3 (прямая 2)

На четвертом этапе определяли влияние фармакологических добавок Зорекса и Унитиола на каталитическую активность АДГ печени лошади при изучении влияния различных концентраций НАД, осуществляющих биокатализ в ферментативной системе-4 и ферментативной системе-5. Ферментативная система-4 включала следующие компоненты: АДГ печени лошади (2,41-ЮАМ), С2Н5ОН (1,5-Ю'2М), Унитиол (5,0-10^). Кинетические зависимости ЕМ строили при варьировании концентрации НАД (1,5-5,0) •10"2М. Ферментативная система-5 состояла из АДГ печени лошади (2,41-Ю^М), С2Н5ОН (1,5-10"2М), Зорекса (5,0-10"4М) и включала различные концентрации НАД (1,5-5,0) -Ю^М.

При построении экспериментальных кинетических зависимостей в координатах Лайнуивера-Берка определили важнейшие кинетические параметры для изучаемых систем (табл. 5).

Таблица 5

Рассчитанные данные по ферментативной кинетике для ферментативной

Кгп, •10"5 М Ушах,-105 опт.ед./с Ккат, •10-2с-' Тип активации

Система контроля (ферментативная система-1) 2,51±0,17 3,51±0,17 8,94±0,17 -

Зорекс (ферментативная система-4) 2,03±0,17 6,62±0,17 1,63±0,17 1а

Унитиол (ферментативная система-5) 2,42±0,16 6,34±0,16 1,48 ±0,16 1а

Видно, что введение в ферментативную систему фармпрепаратов Зорекса

и Унитиола (табл. 5) приводит к снижению значения Кш на 16 - 20 %, и следовательно, улучшается взаимодействие фермента (АДГ печени лошади) и субстрата (С2Н5ОН) в сорбционном участке активного центра фермента. Этому могут способствовать особенности строения активного центра АДГ печени лошади (Крупянко В.И., 1994).

Наблюдали значительное уменьшение значений константы Ккат (табл. 5) и в ферментативной системе-4, и в ферментативной системе-5. Это свидетельствует о том, что в фармпрепарате Зорекс составляющая часть -Унитиол (ферментативная система-5) - действительно играет доминирующую роль в регуляции каталитического поведения АДГ, усиливая практически в 2 раза каталитическое действие фермента. На основе полученных закономерностей в изменении важнейших ферментативных параметров АДГ по классификации В. И. Крупянко установили тип активации - двухпараметри-чески согласованная активация - 1а-тип активации АДГ.

В условиях оптимального соотношения концентраций всех компонентов реакционной среды, а именно АДГ, этанола, НАД, Пирацетама, Зорекса и Унитиола, рассчитаны ферментативные параметры (табл. 6).

Таблица 6

Значения каталитических характеристик АДГ при введении

фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола

Ферментативные системы Эффекторы Молекулярная масса Кт, •10"5М Ушах, -10"4 опт.ед./с Тип активации

1 Контроль - 2,51±0,17 3,51±0,17 -

3 Пирацетам 142,16 5,03±0,39 20,01±0,39 На

4 Зорекс 630,09 2,03±0,17 6,62±0,17 1а

5 Унитиол 124,23 2,12±0,16 6,34±0,16 1а

Пирацетам в большей степени влияет на образование фермент-субстратного комплекса. Суммарный наблюдаемый эффект - ослабление взаимодействия фермента и субстрата при введении Пирацетама. Именно в этих условиях активность алкогольдегидрогеназы максимальна. Следовательно, при добавлении Пирацетама этанол с участием АДГ утилизируется наиболее эффективно.

Рассчитанные ферментативные параметры и соответственно типы активации фермента для фармпрепаратов Пирацетам, Зорекс и Унитиол в ферментативных системах имеют разнонаправленный характер изменений: в случае Пирацетама - тип активации На, а в случае Зорекса и Унитиола - тип активации 1а. Это не позволило провести сопоставление найденных значений ферментативных параметров АДГ, так как типы активации различны. Поэтому наряду с первым и вторым способами определения ферментативных параметров был применен ещё один способ анализа значений ферментативных параметров - это метод векторного построения полученных экспериментальных данных в Км' V'- системе координат.

На основе данных табл. 6 построили кривую течения - геометрический «портрет» ферментативной реакции, катализируемой АДГ печени лошади (рис. 8).

Рис.8. Пространственная кривая АДГ-реакции в трехмерной Км' V' — системе координат, активируемой фармпрепаратами Зорекс (3), Уннтнол (1) и Пирацетам (2)

На основе рис.8, рассчитали дополнительный ферментативный параметр -интенсивность активации для трех обсуждаемых ферментативных систем и сравнили длины р!ат рТат -, р!а0) -векторов (табл. 7). Именно этот интегральный параметр несет обобщенную количественную информацию об интенсивности активации фермента.

Таблица 7

Значения длин р!а(1)-, р1а{1) -, р!а{1) -векторов

Ферментативные системы Длины р - векторов, у.е.

Пирацетам 3 2,50

Зорекс 4 0,48

Унитиол 5 0,39

Самым действенным для АДГ среди изученных фармпрепаратов является Пирацетам (2,50 у.е.). Эффективность фармпрепаратов Зорекс и Унитиол в сравнении с Пирацетамом в 5,2 раз ниже. Кроме того, данные табл. 7 указывают на преобладающий вклад компонента Зорекса в сравнении с Унитиолом. Обращает на себя внимание то, что при введении в ферментативную систему изученных фармпрепаратов (Пирацетама, Зорекса и Унитиола) меняются не только тип активации, но и механизм изучаемой каталитической реакции, а также её интенсивность.

Таким образом, впервые разработанный и апробированный многоэтапный научно-методический подход позволил детально изучить ферментативное

поведение АДГ при добавлении Пирацетама, Зорекса и Унитиола и может служить основой для изучения других фармпрепаратов.

ВЫВОДЫ

1. Выделена и очищена алкогольдегидрогеназа из пекарских дрожжей. Рассчитано содержание фермента, изучена субстратная специфичность и исследованы важнейшие ферментативные параметры биокатализатора. Выявлена максимальная субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы дрожжевой к этанолу.

2. Разработан многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы в модельной ферментативной системе в присутствии регуляторов каталитической активности:

• для системы контроля определены значения важнейших ферментативных параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади: Кш = (2,51 ± 0,1 !)■ 10"5 моль/л; Ушах = (3,51 ± 0,17)-10'5опт.ед./с; Ккат = (8,94 ± 0,17)-10'2 с'1. Найдено удовлетворительное соответствие ферментативных показателей алкогольдегидрогеназы печени лошади и алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей;

• введение Пирацетама ухудшает связывание фермента с субстратом (значения Кт больше на 71 %, чем в системе контроля), но улучшает течение каталитической реакции (в 5,7 раз возрастает значение Ушах) при использовании 1-го и 2-го способов. Наибольшее влияние на алкогольде-гидрогеназу найдено для концентрации Пирацетама, составляю-щей 1,5-10"2М;

• наиболее эффективное течение ферментативного процесса наблюдается для концентрации никотинамидадениндинуклеотида равной 1,5-10"2М;

• каталитическая активность алкогольдегидрогеназы возрастает в 2,6 раза при добавлении Зорекса в модельную систему, а в случае с Унитиолом найдено двукратное возрастание активности биокатализатора. Введение в ферментативную систему Зорекса и Унитиола на 16 - 20 % улучшает взаимодействие фермента (алкогольдегидрогеназы печени лошади) и субстрата (С2Н5ОН) в сравнении с системой контроля.

3. При введении в модельную ферментативную систему Пирацетама установлен тип активации - На-тип (двухпараметрически рассогласованная активация). При использовании Зорекса и Унитиола алкогольдегидрогеназа активируется по 1а-типу (двухпараметрически согласованная активация).

4. Построена и проанализирована пространственная кривая течения кинетической реакции для алкогольдегидрогеназы, её геометрический «портрет», при добавлении в ферментативную систему Пирацетама, Зорекса и Унитиола. Установлено, что введение изученных фармпрепаратов в модельную систему с алкогольдегидрогеназой меняет не только интенсивность, но и тип и механизм изученной ферментативной реакции. Рассчитан дополнительный ферментативный параметр - длина вектора, показавший, что наиболее эффективным для активации алкогольдегидрогеназы является фармпрепарат Пирацетам. •

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Сметанникова Н.В. Ферментативные характеристики алкогольдегидрогеназы // Сб. тез. V научной конференции аспирантов и студентов химического факультета, посвященной 35-летию Тзерского государственного университета. -Тверь: Твер. гос. ун-т, 2006. - С. 30.

2. Лапина Г.П., Сметанникова Н.В. Регуляция активности алкогольдегидрогеназы печени лошади Пирацетамом // Тез. докл. I Междунар. конф. «Состояние воды в биологических и модельных системах» Тверская гос. мед. академия. - Тверь, 2007. -С. 173.

3. Лапина Г.П. Золотарева Н.В. Регуляция активности алкогольдегидрогеназы печени лошади Пирацетамом // Тез. докл. VII науч. конф. аспирантов и студентов химического факультета Тверского государственного университета. -Тверь: Твер. гос. ун-т, 2008. - С. 25.

4. Золотарева Н.В. Воздействие Пирацетама на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы печени лошади /У Тез. докл. XVI Региональные Каргинские чтения «Физика, химия и новые технологии». - Тверь: Твер. гос. ун-т, 2009. - С.39.

5. Золотарева Н.В. Геометрический «портрет» ферментативной реакции, катализируемой алкогольдегидрогеназой, в присутствии различных эффекторов // Тез. докл. XVII Региональные Каргинские чтения «Физика, химия и новые технологии». - Тверь: Твер. гос. ун-т, 2010. - С.34.

6. Золотарева Н.В. Создание научно-методических основ исследования влияния фармакологических препаратов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы печени лошади // Материалы конференции. Всероссийская научная школа для молодежи «Приборное и научно-методическое обеспечение исследований и разработок в области каталитического превращения бифункциональных каталитических превращений». - Тверь: ТГСХА, 2010. - С. 5-7. Рецензируемые научные журналы, включенные в перечень ВАК:

7. Лапина Г.П., Золотарева Н.В. Пирацетам - регулятор каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади И Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология. - 2009. - Вып.11, №2. -С.56-62.

8. Лапина Г.П., Золотарева Н.В. Оптимизация течения ферментативной реакции с участием алкогольдегидрогеназы печени лошади при варьировании концентрации никотинамидадениндинуклеотида // Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология. - 2009. Вып.13, №14. - С.85-90.

9. Лапина Г.П., Золотарева Н.В. Анализ данных ферментативной кинетики с использованием трехмерной Км'У' - системы координат // Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология. - 2010. - Вып. 17, №. 16. - С.71 -76.

Технический редактор A.B. Жильцов Подписано в печать 31.03.2011. Формат 60 х 84 V16. Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ № 120. Тверской государственный университет Редакционно-издательское управление Адрес: Россия, 170100, г. Тверь, ул. Желябова, 33. Тел. РИУ: (4822) 35-60-63.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Золотарева, Наталья Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. Обзор литературы.

2.1 .Физико-химические особенности строения алкогольдегидрогеназ.

2.2. Катализируемые реакции и субстратная специфичность различных классов алкогольдегидрогеназ.

2.3. Выделение и очистка алкогольдегидрогеназ из различных источников.

2.4. Кинетика ферментативных реакций, катализируемых алкогольдегидрогеназами.

2.5. Изучение влияния типов ингибиторования на каталитическую активность биокатализаторов.

2.6. Эффекторы алкогольдегидрогеназ различной химической природы.

3 .ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Используемые в работе вещества.

3.2. Посуда, приборы и оборудование.

3.3. Методы исследования.

3.3.1. Метод Г.А. Кочетова для выделения и очистки алкогольдегидолгеназ.

3.3.2. Определение концентрации белка по методу биуретовой 60 реакции.

3.3.3. Метод определения ферментативной кинетической 61 активности алкогольдегидрогеназы.

3.3.4. Метод Лайнуивера - Берка для обработки данных 62 ферментативной кинетики.

3.3.5. Метод векторных диаграммных построений.

3.3.6. Программное обеспечение Microlab Origin.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Выделение, очистка и определение субстратной специфичности 70 алкогольдегидрогеназы.

4.2 Определение молекулярно-кинетических параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в 81 системе контроля (ферментативная система-1).

4.3. Изучение влияния Пирацетама на каталитические параметры алкогольдегидрогеназы печени лошади (ферментативная система-2).

4.4.Выяснение действия НАД на ферментативные параметры алкогольдегидрогеназы печени лошади (ферментативная система-3).

4.5. Исследование влияния препарата Зорекс на ферментативные параметров АДГ печени лошади (ферментативной системы-4).

4.6. Выяснение влияния Унитиола на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы печени лошади (ферментативная система-5).

5. Анализ данных ферментативной кинетики с использованием трехмерной Км'У' - системы координат.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол"

Актуальность исследования

Одна из наиболее актуальных в физико-химическом аспекте проблем биохимии алкоголизма - регуляция активности алкогольдегидрогеназы (АДГ). Действующее начало в любом алкогольном напитке - этанол [68; 71; 174]. Достаточно полно изучен физиологический аспект действия этанола на организм человека [18], а также исследован ферментативный механизм утилизации этанола в организме человека [27; 41; 47] при участии фермента алкогольдегидрогеназы. Однако вопросы регуляции ферментативной активности алкогольдегидрогеназы изучены недостаточно.

Алкогольдегидрогеназа - фермент класса оксидоредуктаз (1.1.1.1), катализирующий процессы окисления никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) первичных алифатических спиртов в соответствующие альдегиды [31]. Алкогольдегидрогеназы найдены в тканях животных (печени лошади) [92; 177], растениях (томатах и картофеле), грибах, дрожжах, бактериях [1] и др. Наиболее изученными ферментами являются алкогольдегидрогеназы, выделенные из дрожжей, а также печени лошади [60; 82; 87].

Алкогольдегидрогеназы являются недостаточно исследованными биокатализаторами с точки зрения использования различных фармпрепаратов, применяемых для лечения больных хроническим алкоголизмом [19; 44; 78]. До настоящего времени актуальным является поиск специфических эффекторов фермента АДГ, окисляющих этанол, с целью регулирования концентрации этанола и ацетальдегида в организме, что важно в изучении молекулярных основ биохимии алкоголизма [91; 127].

Вопросы изучения и установления молекулярных механизмов такого рода эффекторов (активаторов или ингибиторов фермента) относятся к перспективным направлениям современной энзимологии и обсуждались на Symposium of A.I. Oparin: "Biochemistry of the twenty-first century: problems and frontiers 1994, а также в научных работах [14; 182]. Поиск решения поставленной задачи и определяет актуальность данной работы.

В практической медицине довольно широко используются фапмпрепараты Пирацетам и Зорекс [2; 84; 106; 108; 176]. Физиологические основы действия данных регуляторов известны: Пирацетам, являясь ноотропным фармпрепаратом, изменяет метаболические и биоэнергетических процессы в нервной клетке, улучшает функции головного мозга, усиливая кровоток [81; 106]; Унитиол, i в свою очередь, в составе Зорекса способствует восстановлению обмена веществ в нервных клетках выведению продуктов распада этанола из органов и тканей [149; 159]. Эффективное использование этих фармпрепаратов базируется на информации о молекулярно-кинетическом характере их действия на фермент АДГ, который в полной мере не изучен.

Цель диссертационной работы: исследование молекулярно-кинетического аспекта действия фармакологических препаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола (составной части Зорекса) на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы в условиях in vitro. Задачи исследования:

1. Выделить и очистить алкогольдегидрогеназу из пекарских дрожжей по методу Г.А. Кочетова. Изучить субстратную специфичность фермента в группе этанол-бутанол-изопропанол и рассчитать его основные ферментативные параметры и выявить оптимальную концентрацию специфичного субстрата. Сравнить ферментативные показателей алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей и алкогольдегидрогеназы печени лошади.

2. Разработать многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в присутствии регуляторов и оптимизировать его: рассчитать значения важнейших ферментативных параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади для системы контроля;

- выявить влияние Пирацетама и никотинамидадениндинуклеотида на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы. Найти их оптимальные концентрации;

- определить действие Зорекса и Унитиола на активность биокатализатора.

3. Установить тип регулирования алкогольдегидрогеназы в присутствии Пирацетама, Зорекса и Унитиола.

4. Для изученных ферментативных систем построить геометрический «портрет» в трехмерной Км' V' — системе координат и на этой основе рассчитать дополнительный интегративный ферментативный параметр длину р1ат -, р1а{2) р1а{%) - векторов.

Научная новизна результатов исследования

Разработан многоэтапный научно-методический подход по изучению влияния фармакологических препаратов Пирацетам, Зорекс и Унитиол на каталитическую активность АДГ.

Впервые выявлены типы активации АДГ при действии на фермент фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола и установлена эффективность функционирования биокатализатора на основе векторных построений данных ферментативной кинетики в трехмерной Км'У -системе координат, позволивших впервые получить визуализацию хода ферментативного процесса с участием АДГ в присутствии Пирацетама, Зорекса и Унитиола и рассчитать новый ферментативный параметр -длину вектора, характеризующего интенсивность активации фермента и отражающего суммарную эффективность функционирования биокатализатора.

Теоретическая и практическая значимость работы

Работа носит фундаментальный характер и направлена на изучение молекулярно-кинетического поведения алкогольдегидрогеназы.

Полученные данные в рамках разработанного в данной работе многоэтапного научно-методического подхода расширяют и развивают теоретические представления об эффективности регулирования биокатализа в присутствии различных добавок.

Разработанная схема изучения типа регулирования (активации или ингибирования) АДГ для фармакологических препаратов (Пирацетама, Зорекса и Унитиола), направленная на поиск оптимальных условий течения ферментативной реакции, может служить моделью для изучения других фармпрепаратов, действующих на фермент утилизации этанола -алкогольдегидрогеназу - с целью устранения последствий интоксикации . организма.

Часть полученных данных и сделанные выводы использованы при выполнении проекта № 2.1.1/1897 «Исследование взаимосвязи структурно-динамических свойств ферментов с их функциональной активностью и разработка новых биокатализаторов на основе иммобилизованных окислительно-восстановительных ферментов для биомедицинской и пищевой промышленности», выполняемого по аналитической ведомственной целевой программе "Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)". (Заказчик проекта — Министерство образования и науки Российской федерации, Федеральное агентство по образованию).

Научные результаты, выносимые на защиту

1. Максимальная субстратная специфичность выделенной и очищенной из пекарских дрожжей алкогольдегидрогеназы среди спиртов различного строения наблюдается к этиловому спирту. Рассчитаны значения важнейших ферментативных параметров биокатализатора (Кш, Ушах и

Ккат). Выявлена оптимальная концентрация специфичного субстрата -этанола, равная 1,5-10"~М.

2. Разработанный многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы позволил установить, что фармпрепарат Пирацетам как активатор алкогольдегидрогеназы обладает большей эффективностью в сравнении с Зорексом и Унитиолом.

3. Пирацетам, Зорекс и Унитиол по разному активируют алкогольдегидрогеназу, а именно в случае Пирацетама — двухпараметрически рассогласованный тип активации (lía-тип, Крупянко В.И., 1994), для Зорекса и Унитиола - двухпараметрически согласованный тип активации (la-тип, Крупянко В.И., 1994) фермента.

4. Расчет дополнительного ферментативного параметра — значения • длины вектора на основе векторного построения геометрического «портрета» алкогольдегидрогеназной реакции подтвердил наибольшую эффективность фармпрепарата Пирацетама в сравнении с Зорексом и Унитиолом.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Полученные результаты соответствуют пункту 4 паспорта специальности 03.01.04 «Биохимия (биологические науки)».

Апробация и реализация результатов диссертации

Основные положения и выводы диссертации апробированы в выступлениях на научных конференциях. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на V и VII научных конференциях аспирантов и студентов химического факультета (Тверской государственный университет, Тверь, 2006 и 2008); на XVI и XVII Региональных Каргинских чтениях «Физика, химия и новые технологии» (Тверской государственный университет, Тверь, 2009 и 2010); на Международной конференции «Состояние воды в биологических и модельных системах» (Тверская государственная медицинская академия,

Тверь, 2007); Всероссийской научной школе для молодежи «Приборное и научно-методическое обеспечение исследований и разработок в области каталитического превращения бифункциональных органических соединений» (Тверская государственная сельскохозяйственная академия, Тверь, 2010), а также на научных семинарах кафедры физико-химической экспертизы биоорганических соединений ТвГУ и при выполнении дипломных работ, в которых соискатель был научным руководителем дипломников.

Полученные результаты по выявлению особенностей ферментативного поведения алкогольдегидрогеназы печени лошади и оптимизации метода выделения фермента из пекарских дрожжей используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре физико-химической экспертизы биоорганической экспертизы ТвГУ: в курсе лекций, при подготовке курсовых и дипломных работ студентов.

Публикации

Результаты исследования отражены в 9 публикациях, 3 из которых в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 182 источника, из которых 80 иностранных. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 68 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Золотарева, Наталья Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Выделена и очищена алкогольдегидрогеназа из пекарских дрожжей. Рассчитано содержание фермента, изучена субстратная специфичность и исследованы важнейшие ферментативные параметры биокатализатора. Выявлена максимальная субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы дрожжевой к этанолу.

2. Разработан многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы в модельной ферментативной системе в присутствии регуляторов ферментативной активности:

• для системы контроля определены значения важнейших ферментативных параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади: Km = (2,51 ± 0,17) -10"5 моль/л; Vmax = (3,51 ± 0,17) -10"5 опт.ед. /с; Ккат = (1,45 ± 0,17) -10"' с1. Найдено удовлетворител ьное соответствие ферментативных показателей алкогольдегидрогеназы печени лошади и алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей;

• введение Пирацетама ухудшает связывание фермента с субстратом (значения Km больше на 71 %, чем в системе контроля), но улучшает течение каталитической реакции (в 5,7 раз возрастает значение Vmax) при использовании 1-го и 2-го способов оценки активности биокатализатора. Наибольшее влияние на алкогольдегидрогеназу найдено для концентрации Пирацетама, составляющей 1,5-10"2М;

• наиболее эффективное течение ферментативного процесса наблюдается для концентрации никотинамидадениндинуклеотида равной 1,5Т0~2М;

• каталитическая активность алкогольдегидрогеназы возрастает в 2 раза при добавлении Зорекса в модельную систему, а в случае с Унитиолом найдено двукратное возрастание активности биокатализатора. Введение в ферментативную систему Зорекса и Унитиола на 16 — 20 % улучшает взаимодействие фермента (алкогольдегидрогеназы печени лошади) и субстрата (С2Н5ОН) в сравнении с системой контроля.

3. При введении в модельную ферментативную систему Пирацетама установлен тип активации - Па-тип (двухпараметрически рассогласованная активация). При использовании Зорекса и Унитиола алкогольдегидрогеназа активируется по 1а-типу (двухпараметрически согласованная активация).

4. Построена и проанализирована пространственная кривая течения кинетической реакции для алкогольдегидрогеназы, её геометрический «портрет», при добавлении в ферментативную систему Пирацетама, Зорекса и Унитиола. Установлено, что введение изученных фармпрепаратов в модельную систему с алкогольдегидрогеназой меняет не только интенсивность, но и тип и механизм изученной ферментативной реакции. Рассчитан дополнительный интегральный ферментативный параметр — длина вектора, показавший, что наиболее эффективным для активации алкогольдегидрогеназы является фармпрепарат Пирацетам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Золотарева, Наталья Владимировна, Тверь

1. Авилова Т.В., Егорова O.A., Новикова Т.В. Условия биосинтеза, выделение и свойства NAD-зависимой алкогольдегирогеназы // Биохимия. 2001. - Т.51, Вып. 10. - С. 1673-1681.

2. Авруцкий Г. Я., Нисс А. И. Фармакология ноотропов. — М.: Медицина, 2001.-С. 112-118.

3. Антропов В.К. Химия протеализа. М.: Наука. - 1999. - 321 с.

4. Артеменко А.И., Такунова И.В., Малеванный В.А. Справочное руководство по химии. М.: Высшая школа, 2003. - 367 с.

5. Ашмарина И.П. Алкогольдегидрогеназа млекопитающих объект молекулярной медицины.-М.: Медицина, 2003. - С. 145-178.

6. Ашмор П., Катализ и ингибирование химических реакций: пер. с англ. -М.: Наука, 1966-320 с.

7. Бардина JI. Р., Сатановская В. И., Пронько П. С. Системы обмена этанола и ацетальдегида печени коротко и долго спящих крыс //Пробл. соврем, наркологии: Респ. сб. науч. тр. / РСФСР. 2-й Моск. гос. мед. ин-т. -М., 1991.-С. 105-107.

8. Березин И.В., Варфоломеев С.Д. Биокинетика. М.: Химия, 1979. -392 с.

9. Березин И.В., Клесов А.А Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: Мир, 1998. - 320 с.

10. Ю.Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.: Высшая школа, 1977. - 432 с.

11. П.Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. — 3-е изд. — М.: Медицина, 1998.-398 с.

12. Бернхард С. Структура и функция ферментов. — М.: Мир, 2003. 379 с.

13. Биохимическая термодинамика / под ред. М.Р. Джоунса. М.: Мир, 2001.-456 с.

14. М.Бонитенко Е.Ю., Бабаханян Р.В., Есаян A.M. Влияние ингибиторов алкогольдегидрогеназы на биохимические и гистологические изменения при экспериментальных отравлениях // Нефрология. 2003. - Т.7, № 3. -С. 60-66.

15. Бонитенко Е.Ю., Бонитенко Ю.Ю. Влияние совместного применения этанола и ингибитора алкогольдегидрогеназы на токсичность этиленгликоля // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезв. ситуациях. 2009. - № 4. - С. 42-47.

16. Бреслер С.Е. Ерусалимский Б.Л. Физика и химия макромолекул. М.: Наука, 2000. - С. 58-94.

17. Брухман Э.Э. Прикладная биохимия: пер. с нем. М.: Высшая школа, 1981.-С. 152-291.

18. Бурков Ю.В. Иванова H.H. Последствия интоксикации организма алкоголем. — М.: Медицина, 2008. С. 325.

19. Буров Ю.В., Ведерникова H.H. Нейрохимия и фармакология алкоголизма. М.: Медицина, 1995. - 237 с.

20. Буров Ю. В., Меткалова С. Е., Давыдова JI. Е. Поиск новых лекарственных средств для выведения из острой алкогольной интоксикации //Вопр. наркологии. 1994. - № 4. - С. 50-56.

21. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс.

22. М.: ФАИР ПРЕСС, 2007. - С. 13-27.

23. Варфоломеев С.Д., Зайцев C.B. Кинетические методы в биохимических исследованиях. — М.: Химия, 1982. 219 с.

24. Векуа М.Г. Кинетика мембранных транспортных ферментов. М.: Мир, 2004.-106 с.

25. Волькенштейн М.В. Физика ферментов. — М.: Наука, 2003. — 616 с.

26. Говорова Т.П. Физико-химические свойства алкогольдегидрогеназы // Биохимия. Якутск. - 2004. - Т.2. - С. 14-19.

27. Гребенщикова О.Г., Алексеева А.Е., Потапкина Т.А. и др. // Биохимия. -1994.-Т 59.-С. 509-515.

28. Груздева К. H., Высокогорский В. Е., Купор В. Г. Ферменты окисления этанола и его метаболитов при острой алкогольной интоксикации и иммобилизационном стрессе // Вопр. наркологии. 2001. - № 4. — С. 2-9.

29. Гуртовенко В.М. Влияние алкогольной интоксикации на активность ферментов окисления этанола и аргиназы печени крыс // Вопросы медицинской химии. 2008. - Т. 9, №4. — С. 51-55.

30. Давид Р. Введение в биофизику. М.: Мир, 2002. - 205 с.

31. Дженкс Б. Катализ в химии и энзимологии. М.: Высшая школа, 1972. -459 с.

32. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир. - 2005. - Т.З. - С. 167-189.

33. Досон М. Элиот Д. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. - 543 с.

34. Еремин А.Н., Метелица Д.И. Регуляция каталитической активности пероксидазы в смешанных мицеллах ПАВ // Биохимия. 2001. - Т.50. №7.-С. 102-108.

35. Жмаева Е.В., Бычков П.В., Шеховцева Т.Н. Ферментативный метод определения неорганических и органических ингибиторов алкольдегидрогеназы // Журнал аналитической химии. — 2006. Т. 55, №8. - С. 869-878.

36. Золотарева Н.В. Воздействие Пирацетама на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы печени лошади // Тез. докл. XVI Региональные Каргинские чтения «Физика, химия и новые технологии». Тверь: Твер. гос. ун-т, 2009. - С.40.

37. Исакова О.П., Тарасевич Ю.Ю., Юзюк Ю.И. Обработка и визуализация данных физических экспериментов с помощью пакета Origin. М: Книжный дом «ЛИБКОМ», 2009. - С. 136.

38. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. — М.: Мир, 1990. — 342 с.

39. Кершенгольц Б.М., Рогожин В.В. Влияние межсубъединичного взаимодействия в алкогольдегидрогеназе из печени лошади на кинетику окисления этанола // Биохимия. 1998. - Т. 44, №4. — С. 656—671.

40. Кершенгольц Б. М., Серкина Е. В. Некоторые методические подходы к изучению метаболизма этанола // Лабор. дело. — 1998. — № 2. С. 126.

41. Клесов A.A., Березин И.В. Ферментативный катализ. — М.: Изд-во МГУ, 2002. 264 с.

42. Кож Ф. Регуляция ферментативной активности. М.: Мир, 2004. -244 с.

43. Кожемякин Л.А., Зеленин К.Н., Бонитенко Ю.Ю. и др. Ингибиторы алкогольдегидрогеназы и их влияние на основные ферментативные системы // Вопросы мед. химии. 2003. - Т.36, Вып. 3. - С.61-79.

44. Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия. М.: Дрофа, 2004. - 456 с.

45. Кононский А. И. Биохимия животных. 3 изд., перераб. и доп.— М.: Колос, 1992.-526 с.

46. Коноплицкая К. Л., Мышенко Т. П., Запашун Т. Е. Ферменты обмена этанола печени крыс с различной алкогольной мотивацией при острой алкоголизации //Укр. биох. ж. 1993. - Т. 65, № 4. - С. 33-39.

47. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. — М.: Химия, 1982.-234 с.

48. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1998.-267 с.

49. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. М.: Мир, 1997 - 391 с.

50. Крупянко В.И. Векторный метод представления ферментативных реакций. М.: Наука, 1999. - 154 с.

51. Курганов Б.И. Коферментная и регуляторная функции никотинамидадениндинуклеотидов, кинетический аспект // Коферменты. М.: Медицина, 2003. - С. 83-112.

52. Курганов Б.И. Физико-химические механизмы регуляции активности ферментов. М.: Мир, 2008. - 412 с.

53. Куценко A.C., Кузнецов Д.А., и др. Картирование активного центра алкогольдегидрогеназы низкомолекулярными лигандами // Биоорганическая химия. 2000. - Т.23, №3. - С. 17-183.

54. Кучеренко Н.Е. Биохимия. Киев: Высшая школа, 1988. - 297 с.

55. Лапина Г.П., Золотарева Н.В. Анализ данных ферментативной кинетикис использованием трехмерной kmv системы координат // Вестник ТвГУ. Сер. «Биология и экология». - 2010. - Вып. 17, №.16 - С.71-76.

56. Лапина Г.П., Золотарева Н.В. Пирацетам регулятор каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади // Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология. - 2009. - Вып. 11, №2. — С.56-62.

57. Лапина Г.П., Сметанникова Н.В. Регуляция активности алкогольдегидрогеназы печени лошади Пирацетамом // Тез. докл. I Международной конференции «Состояние воды в биологических имодельных системах», Тверская гос. мед. академия. — Тверь, 2007. — С.173-174.

58. Лапина Г.П. Элементы кинетики ферментативных реакций. — Тверь: Твер. гос. ун-т, 1998 64 с.

59. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. - 260 с.

60. Лурье Ю. Ю. Справочник по аналитической химии — 6-е изд., перераб. и доп. М.: Химия, 1989. - 448 с.

61. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: в 2 Т. -М.: Мир, 1993. Т. 1. - 384 с.

62. Мецлер Д. Биохимия. М.: Высшая школа, 1997. - Т.2. - С. 136-214.

63. Мищенко И.Н., Узиенко А.Б., Ясников A.A., Михайловский C.B., Стрелко В.В. Алкогольдегидрогеназная реакция на углях // Украинский биохимический журнал. 2003. - Т.61, №5. - С. 99-109.

64. Мотавкин П.А. Охотин В.Е. Еременко П.С. и др. Локализация алкоголь- и альдегиддегидрогеназы в спинном и головном мозге человека // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 2004. - Т. 94, №11. -С. 32-38.

65. Островский Ю.М., Сатановская В.И., Садовник М.Н. Биологический компонент в генезисе алкоголизма. Минск: Наука и техника, 1986. - С. 293.

66. Петков В. Д. Фармакология ноотропов. М., 1989. - С. 20-25.

67. Полторак С.М., Чухрай Е.С. Физико-химические основы ферментативного катализа. М.: Высшая школа, 1971. — 234 с.

68. Попечителов Е.П., Старцев O.A. Аналитические исследования в медицине, биологии и энзимологии. М.: Высшая школа, 2007. - 279 с.

69. Практикум по биохимии / под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. -М.: Моск. гос. ун-т, 2007. 288 с.

70. Привалов П.Л. Энергетика структуры белковых молекул // Биофизика. -2003. Т.32, №3. - С. 98-113.

71. Пронько П. С., Кузьмич А. Б., Зиматкин С. М. Концентрация ацетальдегида в крови у интактных крыс при алкогольной интоксикации и действии ингибиторов альдегиддегидрогеназы // Вопр. наркологии. -1993. -№3.- С. 40-54.

72. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. Ростов н/Д: Феникс, 1999. -167 с.

73. Рогожин В.В., Говорова Т.П. Очистка и некоторые свойства алкогольдегидрогеназы растений // Этанол и его метаболизм в высших организмах. Якутск, 1995.-С. 14-19.

74. Руденко Г. М. Клинические значения ноотропных препаратов. Симпозиум. -М.: Медицина, 1996. С. 71-78.

75. Сапожников Г.П., Лозитнова А.Б. Активность алкогольдегидрогеназ субклеточных фракций дрожжей, выращенных на глюкозе и гексадекане // Микробиология. 2004. - Т.47, №4. - С. 682-688.

76. Северин Е.С. Биохимия. 2-е изд., испр. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. -784 с.

77. Скоупс Р. Методы очистки белка. М.: Мир, 1985. - 213 с.

78. Сладков А.З. Таблицы буферных растворов // Заводск. лаб. 1997. Т. 35, №9.-С. 1146-1148.

79. Современные проблемы биокинетики / под ред. С.Д. Варфоломеева. -М.: Химия, 1987.-319 с.

80. Степанов В. М. Структура и функции белков. М.: Высшая школа, 1996.-321 с.

81. Судовцов В.Е. Исследование активности алкогольдегидрогеназы из цитоплазмы клеток некоторых дрожжей // Прикл. биохимия и микробиол. 1995. - Т.27, № 1. - С.61-67.

82. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. М.: Мир, 1998. -356 с.

83. Фершт С. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир, 2002. -389 с.

84. Филлипович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Дрофа, 2003. - 432 с.

85. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М.: Мир, 1980 — 453 с.

86. Хазипов Н. 3., Аскарова А. Н., Тюрикова Р. П. Биохимия животных с основами физколлоидной химии. М.: Мир, 2010.-371 с.

87. Химическая энциклопедия. М.: Наука, 1995. — Т. 5 - 589 с.

88. Шеховцова Т.Н Ферменты: их использование в химическом анализе // Соросовский образовательный журнал. 2000. — Т. 6, №1. - С.44-48.

89. Шпикитер О. В. Методы исследования биополимеров с помощью аналитической ультрацентрифуги // Современные методы в биохимии. -М.: Химия, 1994. С 203-224.

90. Щорс Е.С., Либинзон Р.Е. Биохимические аспекты алкоголизма // Химико-фармацевтический журнал. 1978. - №7. - С. 3—13.

91. Элиот В., Элиот Д. Биохимия и молекулярная биология. М.: МАИК «Наука/Интерериодика», 2005.-445 с.

92. Янг И., Жоу X. Влияние ионов цинка на конформационную стабильность дрожжевой АДГ // Биохимия. — 2001. Вып. 1. — С. 61-70.

93. Яцимирский К.Б. Кинетические методы анализа. — 2-е изд. М.: Химия, 2005. - 200 с.

94. Agarwal D. P., Harada S., Goedde Н. W. Role of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase isozymes //Alcohol.: Clin, and Exp. Res. — 1981. -Vol. 5,№ l.-P. 12-16.

95. Andersson P., Kvassman J., Oldn B. Synergism coenyme and alcohol binding to liver alcohol dehydrogenase // Eur. J. biochem. 1994. - Vol. 12. -P.-482.

96. Ashmarin I.P., Danilova R.A., Obukhova M.F., Moskvitina T.A., Prosorovsky V.N. // FEBS Lett. 2003. - Vol. 486. - P. 49-51.

97. Ashmarin I.P., Pshezhetsky A.V., Fedorova 1.М., Benzi G., Pastoris O., Villa R. F., et al. // Biochem. Pharmacol. 2004. - Vol. 34, № 9. - P. 14771483.

98. Bergmeyer H. U. Methoden der enzymatische analyse in enzymology and related areas of molecular biology. 1989. - Vol. 1 - P. 45.

99. Billardon M. et al. // J. Intern. Medecine. 1997. - Vol. 257, Suppl. P. 115-118.

100. Bonnichsen R. K., Wassen A.M. Crystalline alcohol dehydrogenase from horse liver. // Arch. Biochem. Biophys. 1984. - Vol. 18. - P. 361.

101. Boyer P., Lardy H. Myrback K. The Ensymes. New-York-London: Akademie Press. - 1983. - Vol. 11. - P.103.

102. Buhler R., Hess M., Wartburg Y.P. Immunohistochemical localization of human liver alcohol degydrogenase in liver tissue cultured fibroplasts and Hela cells. // Amer. J. Path. 2003. - Vol. 108. - P. 89-99.

103. Cheng Li-Yao FEBS Lett. 2004. - Vol. 300. - P. 251-253.

104. Cheung C., Smith C.K., Hoog J.-O., Hotchkiss S.A.M. et. al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - Vol. 261. - P. 100-107.

105. Coleman P.L., Weiner H. Simultaneous binding of competive ligands to horse liver alcohol dehydrogenase // Biochem. 1989. - Vol. 12. - P. 1705— 1709.

106. Coles B., Beale D., Miller D., Lay J., Kadlubar F., Aitken A., Ketterer B. et. al. // Chemico-Biological Interactions. 1998. - Vol. 64. - P. 181-192.

107. Consalvi V., MDrdh G., Vallee B.L. // Biochem. biophys. res. commun. -2002.-Vol. 139.-P. 1009-1016.

108. Creigliton D. J., Flajdu J., Mooser G., Sigman D. S. Model dehydrogenase reactions // J. Amer. Chem. 2004. - Vol. 95 - P. 6855-6867.

109. Dawidek-Pietryka K., Szozepaniak S., Dudka J., Mazur M. // Arch. Toxicol. 1998. - Vol. 72. - P. 604-607.

110. Drdh G., Vallee B. Biochemistry, 1996. Vol. 25. - P. 7279-7282.

111. Dworschack R.T., Plapp B.V. Kinetics of native and activated isozymes of horse liver alcohol dehydrogenase // Biochemistry. 1997. - Vol. 17 - P. 111116.

112. Eklund H., Branden C.I. Biological macromolecules and assemblies. New York, 1987.-P. 73-143.

113. Eklund H., Branden C. Structural differences between apo- and holoenzyme of horse liver alcohol dehydrogenase // J. Biol. Chem. 1998. -Vol. 254.-P. 3458.

114. Evans S.A., Shore J.D. The role of zinc-bound water in liver alcohol dehydrogenase // J.Biol. Chem. 1980. -Vol. 255. - P. 1509.

115. Farres J., Moreno A., Crosas B., Peralba J.M., Allali-Hassani A., Hjelmqvist L., Jornvall H., Pares X. Structure of enzymes // Eur. J. Biochem.1994. Vol. 224(2). - P. 549-557.

116. Forsht A. Enzyme structure and mechanism. — London: Academic Press,1995.-P. 27-47.

117. Frey W.A., Vallee B.L. Human liver alcohol dehydrogenase an enzyme essential to the metabolism of digitalis // Biochemical and biphysical research communications. - 1979. - Vol. 91(4). - P. 1543-1548.

118. Goldberg L., Rudberg U. Inhibition of ethanol metabolism in vivo by administrator of pyrasole // Biochem. Pharmacol. — 2004. Vol.18. -P. 1749-1762.

119. Goldstein B.M., Li H., Jones J.P., Bell J.E., Zeidler J., Pankiewiez K.W., Watanabe K.A. et. al. // J. Med. Chem. Vol. 37. - P. 392-399.129:Gough W.H., VanOoteghem S., Sint T.,Kedishvili N. // J. Biol. Chem. -2001. Vol. 273.-P. 1978-1985.

120. Greens R. W., MeKay R. H. Behavior of horse liver alcohol dehydrogenase in guanidine hydrochloride solution // J. Biol. Chem. 1969. Vol. 244. - P. 5034-5043.

121. Haselbeck R., Duester G. Developmental dynamics alcohol degydrogenase.- 1998. Vol. 213. - P. 114-120.

122. Hayes J., Velick S. Yeast alcohol degydrogenase. Molecular weight,coenzyme binding and reaction equilibrium. // J. Biol. Chem. 1994. - V. 207.-P. 225-244.

123. Hurley T.D., Bosron W.F., Stone C.L. //J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 239(3). -P. 415-429.

124. Irwin A. J., Jones J. B. Regiospecific and enantioselective horse liver alcohol dehydrogenase catalyzed oxidations of some hydroxycyclopentanes // J. Amer. Chem. Soc, 1999. Vol. 98. - P. 1625-1630.

125. Irwin A. J., Jones J. B. Stereoselective horse liver alcohol dehydrogenase catalyzed oxidoreductions. // J. Amer. Chem. Soc. 1998. — Vol. 98. - P. 8476—8482.

126. Jomvall H. Horse liver alcohol dehudrogenase. On the primary structure of the isozymes // Eur. J. biochem. 1998. -Vol. 16. - P.25-32.

127. Jornvall H., Hempel J., Bahr-Lindstrom H., Hoog J.O., Vallee B.L. // Alcohol Alcohol. 1987. - Suppl.l. - P. 13-23.

128. Jornvall H., Hoog J.O., Persson B., Pares X. Pharmacogenetics of the alcohol dehydrogenase system // Pharmacology. 2000. - Vol. 61, № 3 - P. 91-184.

129. Kedishvili N., Gough W.H., Davis W., Parsons S., Li T.-K., Bosron W.F. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - Vol. 249. - P. 191-196.

130. Kemper R.A., Elfarra A.A., Myers S.R. // Drug Metab. Dispos. 2001. -Vol. 26.-P. 849-914.

131. Keung W.M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - Vol. 174. - P. 701-707.

132. Krebs H. A., Perkins J. R. The physiological role of liver alcohol dehydrogenase // biochem. J. 1970. -Vol. 118. - P. 630-644.

133. Langeland B.T., McKinley-McKee J.S. // Archiv. Biochem. Biophys. -1997. Vol. 308. - P. 367-373.

134. Lehmann J. // Biochem. 1997. - Bd.272. - P. 95.

135. Li T.-K., Bosron W.F. et. al. // Annals New York Academy Sci. 1998. -Vol. 492.-P. 3-15.

136. Lowe J. N., Ingraham L. L. An introduction to biochemical reactions mechanisms. New Jersey, 1974. - P. 345-386.

137. Mezey E., Potter J. J. Rat liver alcohol dehydrogenase activity // Endocrinolol. 1979. - Vol. 104. - P. 1667-1673.

138. Miwa K., Okuda H., Ogura K., Watabe T. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - Vol. 142. - P. 993-998.

139. Ostrovskaja R. U., Hoffmann W., Molodawkin G. M. // Dr. Pharmazie. -1993.-Vol. 38.-P. 251-253.

140. Page R.A., Kitson K.E., Hardman M.J. // Biochem. 1991. - Vol. 278. - P. 659-665.

141. Park D.H., Plapp B.V. Interconversion of E and S Isoenzymes of horse liver alcohol dehydrogenase // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 11. - P. 55275533.

142. Plane R.A., Theorell H. et. al. // Acta Chem. Scand. 2001. - Vol. 1 5. - p^ 1866-1871.

143. Plapp B.V., Green D.W., Sun H.W., Park D.H. Substrate sheciflcity o^alcohol dehydrogenases // Adv. Exp. Med. Biol. 1993. -Vol. 328. - P.391.400.

144. Potapov A. S. Synthesis of mixed-ligand copper(II) complexes containin.<^-bis(pyrazol-l-yl)methane ligands / A. S. Potapov, A. I. Khlebnikov /y Polyhedron. 2006. - Vol. 25, Is. 14. - P. 2683-2690.

145. Potter J. J., MacDougald O. A., Mezey E. Regulation of rat alcohox dehydrogenase // Arch, biochem. biophys. 1995. - Vol. 321, № 2. — p.335.

146. Rasherd N., Rabin B. Inhibition of yeast alcohol dehydrogenase alkylating agents // Eur. J. Biochem. 1995. - Vol. 50. - P. 475-481.

147. Raskin N.H. Alcogol dehydrogenase in brain a toxicologic role // Ajtltx N.Y. Acad. Sci. 2005. - Vol. 215. - P. 49-53.

148. Reid M. F., Fewson C.A. Molecular characterization of microbial alcotiQ>j dehydrogenases // Crit. Rev. Microbiol. 1994. - Vol. 20. - P. 13-56.

149. Roglev M. // Med. Biol. Inf. 2001. - Vol. 3. - P. 15-17.

150. Sachan D. S., Cha Y. S. Acetylcarnitine inhibits alcohol dehydrogenase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - Vol. 203, № 3. - P. 1496-1501 .

151. Satre M.A., Zgombic-Knight M., Duester G. The Complete structure human class IV alcohol dehydrogenase (retinol dehydrogenase) determined from the ADH gene // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269, № 22. - p. 1560g 15612.

152. Schindler J.F., Berst K.B., Plapp B.V. // Med. Chem. 1998. - Vol. 41 ^ P. 1696-1700.

153. Scopes R. K. An iron-activated alcohol dehydrogenase // FEBS Letters 1983. Vol. 156. - P. 303-306.

154. Smith M. // Biochem. soc. transactions. 1999. - Vol. 16. - P. 227-230.

155. Spirm A.S. On macromolecular structure of native high-polyme^ribonucleic acid in solution // Journal of Molecular Biology. 1960. - Vol. 2.1. P. 431-446.

156. Svensson S., Lundsjo A., Cronholm T., Hoog J.-O. // FEBS Letters. 199 <5* -Vol. 394.-P. 217-220.

157. Sytkowski A.I. Coenzyme Binding, and Zinc and Cobalt Exchange highly purified yeast alcohol dehydrogenaze // Arch. Biochem. Biophys. 2006.-Vol. 184,No. 17.-P. 505-510.

158. Theorell H., McKinley McKee J. S. // Acta chem scand. 1961. - Vol. 1 -P. 1811-1833.

159. Tompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. // Nucl. Acids Res. 1994. -V^ 22. -P. 4673-4680.

160. Vallee B. L. Zinc in horse liver alcohol dehudrogenase // J. Biol. Cher^-^ 1957. Vol. 226. - P. 185-195.

161. Vallee B.L., Sellin S., Holmquist B., Mannervik B. // Biochemistry. --Vol. 30.-P. 2514-2518.

162. Wallenfels K., Summ H.D. // Klin, wochshr. 1987. - Bd. 35. - P. 849.

163. Wallenfels. K., Sund H. // Biochem. 2004. - Bd. 329. - P.48.

164. White, A.M. Alcohol, memory blackouts, and the brain // Alcohol Researx^j^ & Health. 1999. - Vol. 27(2) - P. 186-196.

165. Witter A. //Acta Chem. Scand. 1990. - Vol. 14. - P. 1717-1725.

166. WyHie M. G., Paciorec P. M., Waterfall J. F. // Biochem. Pharmacol^ 1981.-Vol. 30.-P. 1605-1612.

167. Xie P., Parsons S.H, Speckhard D.C., Bosron W.F., Hurley T.D. et. al. // Biol. Chem. USA. 2004. - Vol. 272, No. 30. - P. 18558-18563.

168. Yasunami M., Chen C.-S., Yoshida A. // Biochem. Genetics. 1990. — voj 28.-P. 591-599.

169. Yin S.J., Bosron W.F., Magnes L.J., Li T.K. Human liver dehydrogenase: Purification and kinetic characterization // Biochemistry 1984. Vol. 23, № 24. - P. 5847-5853.

170. Zgombic-Knight M., Ang H.L., Foglio M.H., Duester G. // J. Biol. Cherry USA. 1995. - Vol.270,No. 18.-P. 10868-10877.

171. Zhmaeva E.V., Bychkov P.V., Shekhovtsova T.N. Enzymatic determination of inorganic and organic inhibitors of alcohol dehydrogenases // Abstracts of vith international Symposium «Kinetics in analytical chemistry» -Romania. Bucharest, 2001. P. 145.

172. Zidoni E., Kreter M. L. // Arch. Biochem. Biophys, 2004. P. 161.Jpi\