Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ СЕЛЕНА ПРИ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ К УСЛОВИЯМ ЗАСУХИ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ СЕЛЕНА ПРИ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ К УСЛОВИЯМ ЗАСУХИ"



На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ Василий Владимирович

ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ СЕЛЕНА ПРИ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ К УСЛОВИЯМ ЗАСУХИ

Специальность 06.01.04 - агрохимия и 03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре агрономической и биологической химии Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева и в Институте физиологии растений им К А. Тимирязева РАН

Научные руководители _

Доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН ¡Б А Ягодин] Доктор биологических наук, профессор В В Кидин Кандидат биологических наук В П Холодова

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, профессор С П Торшин Доктор биологических наук Е Б Кириченко

Ведущее учреждение - Биологический факутьтет Московски! о Государственного Университета им М В Ломоносова

Защита диссертации состоится 21 июня 2004 года в 14® на шеедании диссертационного совета Д 220 043 02 при Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Адрес 127550, Москва, ут 1имирязевская, 49 Ученый совет МСХА

С диссертацией можно ошахомиться в ЦНБ МСХА

Автореферат разослан « » мая 2004 1

Ученый секретарь диссертационного совета

В В Говорина

Общая характеристика работы

Актуальность темы. За последние два десятилетия в мире резко возрос интерес к селену, который в крайне низких концентрациях является важным микроэлементом бактерий, животных и человека. Селен способен не только повышать общую сопротивляемость организма к действию биопатогенов, но и оказывать протекторный эффект при некоторых видах онкологических заболеваний и даже при иммунодефиците. В основе защитного действия селена в животных клетках лежит функционирование ряда белков, активный центр которых содержит "селеновые" аминокислоты (селеноцистеин и селенометионин). Эти белки обладают , выраженным . антиоксидантным эффектом. Однако, по некоторым данным (Ермаков, Ковальский, 1974; Торшин, Ягодин с соавт., 1996; Голубкина, 1999), большинство почв России, а следовательно, и выращенный на них урожай бедны селеном, что ставит задачу обогащения сельскохозяйственной продукции этим элементом (Ягодин с соавт., 1992; Торшин с соавт., 1998; Дудецкий, 1998; Санькова 2001).

В настоящее время остается практически не исследованной и другая очень важная проблема - изучение механизмов действия селена, на продуктивность, а также на физиологические и биохимические процессы основных сельскохозяйственных культур, таких как пшеница. Выяснение биологических эффектов селена, особенно его защитного действия, исключительно важно для России, обширные территории которой имеют неблагоприятные условия для производства зерновых культур. Наибольшим негативным эффектом на растения обладает засуха, которая охватывает практически всю территорию страны и случается не реже одного раза в 3-4 года (Генкель, 1975). Логично допустить, что в растениях, так же как и в животных, селен. обладает защитным эффектом, который может реализоваться через функционирование селенобелков, в частности, защитных селенопероксидаз. Тем более в экстрактах многих видов растений была обнаружена активность глютатионзависимых пероксидаз, а из Aloe vera был выделен белок глютатионовой селенопероксидазы. Кроме того, получены доказательства наличия в клетках растений отдельных компонентов системы синтеза селенобелков, в частности UGA-декодирующей селеноцистеиновой тРНК. Однако селенопероксидаза растений имеет крайне низкую активность, а в ее активном центре до сих пор не обнаружены селеноаминокислоты. Все это оставляет открытым вопрос о важности селена как антиоксиданта для высших растений.

Не вызывает сомнения, что защитный эффект селена не ограничивается лишь его антиоксидантным действием, . а, очевидно, носит

• полифункциональный

характерц^н^^ет расщ юстранятъся на многие фонд научной литературы

№ „у.-у-у „

физиологические процессы растений и, прежде всего, на такие как, рост, развитие, адаптация и водный статус. Тем более нарушение водного статуса является одной из общих неспецифических реакций организма на действие различных стрессоров. Все это делает весьма актуальным исследование механизмов протекторного действия селена у растений в неблагоприятных условиях.

Цель и задачи исследования Цель диссертационной работы состояла в изучении биологических и физиолого-биохимических эффектов селена, в том числе защитного характера, при адаптации растений яровой пшеницы к засухе.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи (1) Выявить действие селена на ростовые процессы на разных стадиях развития растений в условиях оптимального и недостаточного увлажнения; (2) Исследовать влияние селена на показатели водного статуса растений; (3) Изучить действие селена на аккумуляцию протекторных соединений при водном дефиците; (4) Исследовать эффект селена на антиоксидантные ферменты растений в стрессорных условиях, (5) Изучить влияние селена на экспрессию гена липоксигеназы на уровне ее мРНК; (6) Выявить оптимальные концентрации селена, обладающие стресс-протекторным эффектом на растения яровой пшеницы в условиях водного дефицита, и изучить потенциальные возможности накопления селена в зерне

Научная новизна. Впервые проведено обширное исследование влияния селена на некоторые физиологические и биохимические процессы (рост, водный статус, аккумуляцию совместимых осмопротекторов, активность ангаоксидантных ферментов и др) в растениях яровой пшеницы в ходе онтогенеза при оптимальном увлажнении и в условиях длительной засухи Установлена важная защитная роль селена в поддержании водного статуса растений при засухе Выявлено участие сетена в регуляции уровня реактивных форм кислорода в условиях водного дефицита Впервые показана регуляция селеном экспрессии гена липоксигеназы на уровне аккумуляции ее чРНК Установлена способность растений пшеницы аккумулировать селен в зерне при засухе

Теоретическая и практическая значимость работы Впервые экспериментально подтверждена гипотеза об антиоксидантном действии селена у растений Протекторный эффект селена свидетельствует об его эссенциальности для растений Впервые продемонстрирована способность селена поддерживать более высокую оводненность тканей при стрессе, а также регулировать экспрессию гена липоксигеназы на уровне ее мРНК

Полученные результаты позволяют рекомендовать использование селена в стресс-протекторных концентрациях в виде удобрений с целью повышения

последующим ее встряхиванием (4 час) при комнатной температуре. Измерение [К4] осуществляли на пламенном фотометре ПФМ-У4.2; [Cl"] - с помощью прибора Ionalyzer 940 фирмы ORION RESEARCH (Швеция) с соответствующим ионселективным электродом. Для построения калибровочной прямой использовали стандартные растворы. Определение осмотического потенциала клеточного сока. Свежую массу' листьев (около 1 г) растирали в ступке, гомогенат центрифугировали при 5000g в течение 15 минут на центрифуге КМ-15200 фирмы "Kubota" (Япония). 200 мкл супернатанта помещали в микропробирку (1,5 мл) и измеряли его осмотический потенциал на осмометре Osmomat 030 фирмы «Gonotac». Осмотический потенциал выражали в МПа.

Содержание свободного пролина определял с помощью кислого нингидринового реактива по методу Bates et al. (1973) спектрофотометрически при 520 нм. Для построения калибровочной кривой использовали пролин фирмы «Serva». Содержание пролина выражали в мкмоль на 1 г свежей или сухой массы.

Определение активности супеуоксиддисмутазы (СОД) проводили по методу С. Чевари и др. (1985), основанному на способности нитросинего тетразолия (НСТ) конкурировать с СОД за супероксид анион, образующийся в результате аэробного взаимодействия НАДН и феназинметасульфата. Для построения калибровочной кривой использовали СОД фирмы «Serva» с удельной активностью равной 8963 ед/мг. Активность СОД выражали в единицах активности в расчёте на 1мг белка.

Определение активности растворимой и ион-связанной пеуоксидаэ проводили по методу Ridge and Osborne (1971), используя в качестве субстрата Н202, а в качестве донора водорода - гваякол ('Fluka", Швейцария). Активность фермента выражали в ммолях гваякола/мг белка в мин. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре SPEKOL 11 (Германия) при 470 нм. Определение активности каталазы проводили по методу Chance (1951). Оптическую плотность опытного раствори измеряли на спектрофотометре СФ-46 при 240 нм. Для расчёта активности каталазы использовали коэффициент экстинкции Н202, равный 0,067мМ"1«см"1.

Перекисное окисление липидов определяли по основному продукту реакции — МДА (малоновый диальдегид), используя для этого метод Heath и Parker (1968). Концентрацию МДА определяли спектрофотометрически, измеряя оптическую * плотность при 532 нм и вычитая из нее неспецифическое окрашивание раствора при 600 нм. Коэффициент молярной экстинкции МДА - 155мМ"1»смл. Содержание МДА выражали в мкмоль на г сухой массы.

Изучение экспрессии гена липоксигеназы (ЛОГ). При изучении экспрессии гена

ЛОГ тотальную РНК из растительного материала выделяли фенольным методом по Westhoffet al (1981) Для освобождения от ДНК препарат РНК (по 60 мкг) обрабатывали ДНКазой, свободной от РНКаз, 30 мин при 37°С, после чего ДНКазу удаляли фенольной депротеинизацией Обратную транскрипцию (образцы по 5 мкг тотальной РНК) проводили в соответствии с инструкцией фирмы Fermentas, применив ohgo(dT)21VN в качестве затравки ПЦР осуществляли с использованием Taq ДНК полимеразы. Были взяты следующие праймеры для гена ЛОГ 5*-cgacffcttcatgcctcacc-3' и S'-attctcagtgcgtgctcacc-S', для гена тубулгаа 5'-agacaccgtcgttgagccat-3* и 5'-cgctcgacttgacgttgttg-3' Электрофорез ДНК проводили в 1,3% агарозном геле в присутствии бромистого этидия

Определение содержания белка проводили по Bradford (1976) с использованием кумасси G-250 («Serva», Германия) Оптическую плотность измеряли при 595 нм, используя БСА в качестве стандарта

Определение содержания селена проводили в растительных образцах, высушенных при 35°С, флуорометрическим методом по Ермакову с 2,3 -диаминонафталином на приборе Hitachi - MPF - 4 (Япония) Нижний предел обнаружения 0,0000001%

Статистическая обработка полученных результатов проводилась при 4-6 кратной биологической повторности в вариантах опыта, используя одно- и многофакторный дисперсионный анализ, при помоши программы STRAZ

Результаты и обсуждение

Первой задачей нашей работы было выяснение концентрационной зависимости действия селена на рост и продуктивность растений пшеницы, поскольку был известен негативный эффект селена (Shift, 1969, Mikkelson et al, 1989), тогда как его протекторное действие не было установлено

Влияние селена на ростовые процессы и продуктивность растений

Изучение влияния селена на динамику появления всходов сортов Приокская и Саратовская 29 показало, что в низких и умеренных концентрациях (0,01-0,1 мМ) он не оказывал продолжительного негативного эффекта на прорастание и дальнейший рост проростков пшеницы В то же самое время при выращивании растений в присутствии максимальной из использованных концентраций селена (0,4 мМ), наблюдалось 30-40% ингибирование прорастания по сравнению с контролем. Действие 0,4 мМ селена на рост проростков было еще более сильным и достигало 80% от контроля. Однако селен не тормозил роста растений

-б-

.Как следует из данных, представленных в табл. 1, аналогичное влияние селен оказывал и на аккумуляцию биомассы. В течение 3 недель биомасса растений увеличилась более чем в 6 раз, при этом достоверного действия селена обнаружено не было при всех концентрациях, кроме максимальной (0,4 мМ), которая сильно тормозила накопление биомассы.

В условиях 12-дневной засухи (Табл. 1), которая приводила к снижению аккумуляции биомассы на 70-75%, селен в концентрации 0,05 мМ оказывал существенный защитный эффект. Он тормозил снижение биомассы при засухе на 43% по сравнению с биомассой растений, подвергавшихся только действию водного дефицита. Возобновление полива заметно усиливало рост растений. На этом фоне положительное действие 0,05 мМ селена сохранилось и составляло около 30%.

Влияние селена на урожай пшеницы оценивали, исходя из показателя массы зерна с одного сосуда (Табл. 2). В нормальных условиях увлажнения селен не оказывал существенного действия на урожай двух изучаемых сортов. В условиях 14-дневной засухи урожай с. Приокская снижался на 53% (с 10,84 до 5,04 г), а с. Саратовская 29 - на 56% (с 11,72 до 5,16 г). Это говорит о том, что на VI критическом в отношении влагообеспеченности этапе органогенеза засуха действительно обладала выраженным негативным эффектом на растения.

В условиях засухи селен существенно повышал урожай у обоих сортов (Табл. 2). При этом достоверный позитивный эффект был обнаружен только при концентрации селена 0,05 мМ, (с 5,04 до 6,57 г и с 5,16 до 6,71 г для с.Приокская и с.Саратовская 29, соответственно), что составляет около 30% при сравнении с вариантом, испытывавшим действие только засухи. Интересно, что в концентрации 0,25 мМ селен практически не влиял на урожай при засухе, тогда как при концентрации 0,4 мМ практически полностью блокировал образование полноценного зерна.

Аккумуляция селена в зерне

Можно было думать, что протекторный эффект селена при засухе будет способствовать его аккумуляции в зерне пшеницы, хотя нельзя было исключать нарушения при стрессе механизмов транспорта селена в корневую систему и его транслокации по растению. Для ответа на поставленный вопрос растения пшеницы выращивали в почвенной культуре, а созревшие зерновки анализировали на содержание в них селена. Следует указать, что в контрольных вариантах опыта фоновый уровень селена составлял 0,26 мг/кг почвы, тогда как в двух других вариантах с дополнительным внесением селена в почву его

содержание составило 0,01 мМ (0,79 мг/кг почвы) и 0,05 мМ (те 3,95 мг/кг почвы).

Таблица I

Влияние селена на биомассу растения пшеницы сорта Приокская в условиях оптимального увлажнения и действия засухи, г св. массы/растение

Вариант Продолжительность эксперимента, дни

0 8 12 19

Оптимальное увлажнение

Контроль 0,99 здз 4,04 6,60

+0,01 мМ ве 1,09 3,22 4,19 6,54

+0,05 чМ Бе 1,00 2,91 3,87 6,69

+0,10 мМ Бе 1,05 3,10 3,84 6,38

+0,40 мМ ве 0,18 0,65 0,89 1.71

Действие засухи Восстановление

Контроль 1,38 0,87 2,30

+0,01 мМ ве 1,20 0,84 2,16

+0,05 мМ ве 1,60 1,24 3,05

+0,10 мМ 8е 1,19 1,02 2,42

+0,40 мМ ве 0,62 0,84 1,19

НСРо, 0,23 0,32 0,30 0,65

Таблица 2

Влияние селена на урожай пшеницы, г зерна/сосуд

Вариант Сорт

Приокская Саратовская 29

Оптимальное увлажнение

Контроль 10,84 11,72

+0,05 мМ Яе 10,53 11,35

+0,10 мМ ве 10,17 10,94

Действие засухи

Контроль 5,04 5,16

+0,05 мМ Бе 6,57 6,71

+0,10 мМ Бе 5,24 5,40

НСР05 1,18 1,08

• Как видно из табл. 3, содержание селена в зерне пшеницы с.Приокская и с.Саратовская 29, выращенной без его дополнительного внесения в почву, было одинаковым и составляло 0,10-0,12 мг/кг зерна. Обогащение почвы селеном сопровождалось значительным увеличением его содержания в зерне. Так, при концентрации селена в почве 0,01 мМ (0,79 мг/кг почвы) его содержание в зерне повышалось до 2,5.- 2,8 мг/кг. При 0,05 мМ селена в почве его содержание в зерне составляло 10 — 11 мг/кг.

В условиях засухи содержание селена в зерне практически не изменялось. Однако при обогащении почвы до 0,79 мг селена на кг при засухе наблюдалось 14-22-кратное увеличение его содержания в зерне. Увеличение концентрации селена в почве до 3,95 мг приводило к дальнейшему 65-77-кратному обогащению зерна. Тем не менее, засуха несколько снижала процесс аккумуляции селена в зерне по сравнению с контрольными растениями при одинаковой концентрации селена в почве.

Таким образом, при внесении в почву в умеренных концентрациях селен накапливается в зерне в значительном количестве, причем в условиях не только оптимальной, но и недостаточной водообеспеченности растений.

Эффект селена на показатели водного статуса

Обнаруженное нами позитивное влияние селена на рост растений, аккумуляцию биомассы и урожай позволило нам высказать предположение, что селен позитивно влияет на водный статус растений в условиях засухи. Для проверки этого предположения представлялось важным оценить непосредственное влияние селена на изменение наиболее существенных показателей водного режима растений. С этой целью было проведено изучение оводненности тканей листьев, относительного содержания воды (ОСВ), осмотического потенциала клеточного сока и интенсивности транспирации.

В оптимальных условиях увлажнения селен не оказывал достоверного действия на уровень оводненности тканей (Табл. 4). Однако при засухе селен в двух использованных концентрациях (0,1 и 0,25 мМ) достоверно поддерживал оводненность листьев на более высоком уровне по сравнению с их оводненостью при засухе. Следует отметить, что при засухе наблюдалось падение оводненности листьев до 12% от контроля. Причем, заметное позитивное действие селена на оводненность листьев сохранялось и после возобновления полива и было характерно для растений обоих сортов.

Более точно характеризует водный статус растений относительное содержание воды (ОСВ), отражающее степень насыщенности тканей водой по сравнению с полной тургесцентностью. При оптимальном поливе не было обнаружено влияния селена на ОСВ. Однако в условиях засухи, вызвавшей

Таблица 3

Валовое содержание селена в пшенице сорта Приокская, мг-кг"1 зерна

Вариант Сорт

Приокская Саратовская 29

Оптимальное увлажнение

Контроль 0,12 0,10

+0,01 мМ Яе 2,80 2,54

+0,05 мМ ве 10,43 11,09

Действие засухи

Контроль 0,12 0,11

+0,01 мМ Бе 1.68 2,40

+0,05 чМ Бе 7,80 8,43

НСРо5 0,043 0,052

Таблица 4

Влияние селена на оводненность листьев пшеницы сорта Приокская в условиях оптимального увлажнения н действия засухи, %

Вариант Продолжительность эксперимента, дни

0 4 8 15

Оптимальное увлажнение

Контроль 81,89 81,15 1 79,04 77,25

+0,01 мМ Эе 82,17 81,84 80,70 78,57

+0,10 мМ Бе 81,83 81,64 80,80 80,80

+0,25 мМ ве 81,87 82,17 | 81,73 78,96

Действие засухи Восстановление

Контроль 73,66 67,42 73,00

+0,01 мМ ве 74,17 67,47 73,52

+0,10 мМ ве 76,82 70,47 74,69

+0,25 мМ ве 79,60 73,53 74,69

НСР05 0,65 0,84 | 0,96 0,90

падение ОСВ почти на 30%, селен оказывал заметное протекторное действие тургесцентость тканей при 0,05 мМ селене на 4,4%, а при 0,1 мМ - на 9,9% была выше, чем в контроле

Сильно проявилось защитное действие селена в условиях засухи на величине осмотического потенциала клеточного сока (Рис. 1). Не влияя достоверно на этот показатель при нормальном водообеспечении, селен заметно снижал падение осмотического потенциала при засухе. Селен в концентрациях 0,05 и 0,1 мМ поддерживал осмотический потенциал тканей на уровне, характерном для контрольных (хорошо увлажненных) растений.

Можно было ожидать, что продемонстрированная выше способность селена поддерживать на более высоком уровне оводненность тканей при засухе достигается за счет ингибирования интенсивности транспирации

Результаты одного из типичных экспериментов, в которых селен вносили непосредственно перед прекращением полива (Рис. 2), показывают, что в условиях оптимального увлажнения селен действительно сильно (и пропорционально внесенным концентрациям) ингибировал транспирацию растений, интенсивность которой на 10 день его действия составляла лишь 50% от контроля В условиях же засухи интенсивность транспирации резко снижалась, составляя через 5 дней лишь 24% от ее уровня у контрольных растений При этом селен не оказывал существенного эффекта на интенсивность транспирации (Рис 2)

Другам способом поддержания оптимального водного статуса мопо являться увеличение поглотительной способности корневой системы Результаты проведенных экспериментов показали, что при 14-дневной засухе происходило изменение соотношения биомассы надземной и подземной частей растений до 3,74 по сравнению с 2,99 в усчовиях оптимального увлажнения Селен (0,1 и 0,2 мМ) при засухе снижал это соотношение до вечичин 2,91 и 2,14, соответственно, и тем самым улучшал обеспечение надземной части растений водой

Таким образом, протекторный эффект селена на водный статус растений пшеницы при засухе обусловлен не ингибированием интенсивности транспирации, а усилением водопоглотительной деятельности корневой системы и улучшением водоснабжения листьев

Помимо стабилизирующего влияния селена на водный статус растений при засухе, селен мог оказывать защитный эффект в условиях стресса, проявляя свои возможные антиоксидантные свойства

Контроль +0,05 +0,1

Засуй +0,05

+0,1

Концентрация селена, мМ

¡□Контроль □ +0,05 □ +0,1 □ И Засуй ДД +0,05 ДЧ +0,1 |

Рисунок 1. Влияние селена на осмотический потенциал клеточного сока листьев пшеницы сорта Саратовская 29 в условиях оптимального увлажнения ■ 12 дневной засухи

К _ я > 5 г 500

§ а V и 400

300

б | в • аа ^ 200 100

| & 0

я

Контроль Засуха

- +0,05мМ Эс -+0,05мМ 8е

-+0,1мМ Яе -+0,1мМ ве

. Рисунок 2. Влияние селена на интенсивность транспврапии пшеницы Саратовская 29 в условиях оптимального н недостаточного увлажнения

Влияние селена на основные компоненты антиоксидантной защиты растения при стрессе

Система антиоксидаитной защиты многокомпонентна Она включает не только антиоксидантные ферменты, но и соединения органической природы, такие, например, как пролин, - один из универсальных совместимых осмолитов Он накапливается при стрессе, обладает выраженными антиоксидантными свойствами, проявляя при этом и осмопротекторный эффект.

Данные одного из типичных опытов, представленные иа рис. 3, показывают, что при оптимальном поливе уровень пролина в листьях пшеницы невысок (8-12мкмол г сухой массы) и не зависел от внесения селена в почву. Однако уже через 4 дня засухи концентрация пролина увеличивалась в 21 раз, а через 12 дней - в 39 раз В этих условиях 0,01 мМ селен не оказывал влияния на аккумуляцию пролина, но при всех более высоких концентрациях в почве подавлял этот процесс. Существенно, что спустя 7 дней после возобновления полива эффект селена сохранялся

450 400

■ 350

■

I 1 300

0 % 3 я

1 S 250 М «

2 гоо и i ■ 3

5 i £ **

I 100

6

$0 о

□ Контроль □ Засуха В+0,01 мМ Бе 0+0,05 мМ Эе (8+0,10 мМ Эе В+0,40 мМ Бе

Рисунок 3. Влияние селена яа аккумуляцию свободного пролина в листьях пшеницы сорта Прнокская в условиях оптимального увлажнения и при действии засухи

!

Действие засуха, дни

Таким образом, видно, что селен при засухе не только не стимулировал процесс аккумуляции пролина, а напротив, эффективно тормозил его синтез, сам проявляя, очевидно, выраженные антиоксидантные свойства и снижая уровень внутриклеточных АФК. -

Полученные данные по влиянию селена на аккумуляцию свободного пролина при засухе позволяли предположить, что селен может воздействовать на активность основных антиоксидантных ферментов, регулирующих в клетке уровни АФК, в частности супероксидрадикала и пероксида водорода.

Результаты проведенных экспериментов показали, что при оптимальном увлажнении селен не влиял на активность супероксиддисмутазы листьев пшеницы. При длительной засухе в отсутствие селена активность фермента возрастала на 19% по сравнению с контролем. В максимальной концентрации (0,4мМ) селен тормозил вызванный засухой прирост активности супероксиддисмутазы.

Близкий эффект селен оказывал и на другой антиоксидантный фермент - пероксидазу, отвечающую за регуляцию концентрации Н202 и пероксидов органических соединений. Данные, представленные на рис. 4, демонстрируют уровень активности двух изозимов пероксидазы - свободной и ион-связанной. Они показывают, что в . условиях 12-дневной засухи наблюдается 35% увеличение активности свободной, но не ион-связанной, формы пероксидазы. Селен в использованных концентрациях поддерживал активность исследованных форм пероксидазы на уровне, характерном для контрольных растений.

Активность каталазы, антиоксидантного фермента также ответственного за дезактивацию Н2Ог в клетке, при 12-дневной засухе увеличивалась на 30% по сравнению с контролем. Селен (0,10 и 0,40 мМ) в этих условиях поддерживал активность каталазы на уровне, характерном для контрольных растений, находившихся в условиях оптимального увлажнения.

Таким образом, представленные выше данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что селен, являясь антиоксидантом, снижает внутриклеточный уровень АФК При засухе, что и проявляется в его торможении стресс-стимулированной активации исследованных антиоксид антных ферментов : и резком ингибировании накопления индуцированного засухой пролина.

Для проверки этого предположения в дальнейшем исследовали процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) в растениях пшеницы, который индуцируется АФК и является одним из основных показателей повреждающего воздействия АФК на метаболизм.

а)

Концентрация селена, мМ

б)

3 о

о «

г

к

>ч

и

Концентрация селена, мМ

□ Контроль Ш Засуха Ш+0,01 Ш+0,05 Ш) +0,1 ПВ+0,4

Рисунок 4. Влияние селена на активность свободной (а) и ион-связанной (б) форм пероксидазы в оптимальных условиях увлажнения и при 12-дневной засухе

Регуляция селевом интенсивности перекисного окисления липидов и экспрессии гена липоксигеназы

Представленные результаты (Рис. 5) показывают, что 12-дневная засуха вызывала у растений значительное (на 78%) усиление интенсивности процесса ПОЛ по сравнению с контрольными растениями. В этих условиях селен в умеренных концентрациях (0,05 и 0,1 мМ) тормозил возрастание интенсивности ПОЛ на 20 и 35% соответственно, тогда как в максимальной концентрации (0,4 мМ) полностью предотвращал вызванное водным дефицитом увеличение интенсивности ПОЛ.

Контроль Засуха +0,01 +0,05 +0,10 +0,40 Концентрация селена, мМ

□ Контроль ■ Засуха Ш+0,01 ИР+0,05 Ш+0,10 В)+0,40 1

Рисунок 5. Влияние 8е иа содержание МДА в листьях пшеницы сорта Прнокская при оптимальном увлажнении и 12 дневной засухе

Одним из ключевых ферментов, участвующих в перекисном окислении липидов, является липоксигеназа (ЛОГ), катализируя окисление 1,4- -полиненасыщенных жирных кислот с образованием их гидропероксидов. Поскольку селен влияет на интенсивность ПОЛ, можно было ожидать, что его эффект проявится и на уровне регуляции экспрессии гена липоксигеназы.

Для ответа на поставленный вопрос использовали молекулярно-биологические методы оценки уровня мРНК данного фермента. Поскольку в литературе не было найдено работ по секвенированию гена ЛОГ, пшеницы, было необходимо, используя доступную базу данных РиЬМеё,

метаболизм Важно также подчеркнуть, что эффект селена реализуется не только на уровне активности фермента, но и на уровне ингибирования экспрессии гена липоксигеназы

Влияние селена на ростовые процессы проявлялось и на более поздних этапах онтогенеза. В условиях оптимального увлажнения селен в низких и умеренных концентрациях не влиял на биомассу растений В максимальной концентрации - 0,4 мМ он сильно ингибировал накопление биомассы Засуха также вызывала быстрое торможение аккумуляции биомассы Позитивный эффект селена особенно сильно проявлялся в промежуточных концентрациях и обнаруживался как во время засухи, так и на этапе восстановления В дальнейшем позитивный эффект селена в концентрациях 0,05 и 0,10 мМ сохранялся вплоть до созревания зерна, что выражалось в ощутимой прибавке урожая растений пшеницы по сравнению с растениями, испытавшими действие засухи без дополнительного внесения селена в почву.

Большая часть территории России находится в зоне недостаточного содержания селена в почве, и, как следствие этого, содержание селена в зерне пшеницы составляет в среднем 80-120 мкг/кг зерна при норме - 200-300 мкг/кг (Голубкина, 1999) Поскольку селен в организме человека является важным элементом системы антиоксидантной защиты, его недостаток приводит к резкому снижению иммунитета и усилению повреждающего действия неблагоприятных факторов В этих условиях крайне важно возместить недостающее количество этого микроэлемента в рационе человека, что может быть достигнуто с помощью обогащения селеном продуктов растениеводства Для этих целей хорошо подходит такая сельскохозяйственная культура как яровая пшеница, поскольку в нашей стране хлебные издечия потребляются широкими слоями населения в достаточно больших количествах Для решения этой задачи наиболее эффективно предпосевное внесение селена в почву

Выращивание растений пшеницы в почвенной культуре с валовым содержанием селена 0,26 мг/кг почвы в условиях оптимального увлажнения, без дополнительного внесения селена привело к накоплению его в зерне 0,10 -0,12 мг/кг почвы Эти значения характерны для большей части зерна получаемого в нашей стране. При выращивании растений на почве, обогащенной экзогенным селеном в концентрациях 0,01 и 0,05 мМ (0,79 и 3,95 мг/кг почвы) наблюдали пропорциональное использованным концентрациям увеличение содержание селена в зерне до 2,54-2,80 и 10,43-11,09 мг/кг зерна Следовательно, даже умеренные концентрации селена вызывали его достаточно интенсивное накопление в зерне Действие засухи в присутствии фонового содержания селена в почве практически не повлияло на его накопление в

урожае, тогда как внесение в почву экзогенного селена, так же как и в условиях оптимального водоснабжения, привело к его резкому накоплению в зерне.

Такое значительное обогащение зерна, селеном, даже в условиях недостаточного водоснабжения, свидетельствует о. перспективности выращивания пшеницы на почве с внесением соединений селена с целью восполнения его дефицита в продуктах питания. Стресс-протекторный эффект селена позволяет получать урожай пшеницы, обогащенной селеном, не только в оптимальных условиях выращивания, но и в регионах с недостаточным водоснабжением. ■

Выводы

1. Внесение селенита натрия в почву в концентрациях, не превышающих 0,25 мМ, при оптимальном водообеспечивании не вызывает значимых эффектов у растений пшеницы за исключением его регулирующего действия на транспирацию. Вместе с тем, селен в высоких концентрациях (0,4 мМ) ингибирует ростовые процессы на протяжении всего периода вегетации растений.

2. Одним из механизмов протекторного действия селена в условиях засухи является поддержание высокого уровня оводненности и осмотического потенциала клеток тканей листьев. Этому эффекту селена в условиях водного дефицита способствует изменение соотношения биомасс надземной и подземной частей растения в сторону его уменьшения, что приводит к лучшему обеспечению растения водой и снижению избыточной нагрузки на корневую систему.

3. Недостаточное водообеспечение вызывает у растений пшеницы окислительный стресс, что проявляется в активации ферментов антиоксидантной защиты клетки и, особенно, - в увеличении интенсивности перекисного окисления липидов, а также экспрессии гена липоксигеназы.

: 4. Антиоксидантный защитный эффект селена, по-видимому, обусловлен его способностью снижать уровень активных форм кислорода при стрессе, о чем свидетельствует падение : активности супероксиддисмутазы, пероксидазы и катал азы а также ингибированне аккумуляции стресс-индуцированного пролина, обладающего выраженными антиоксидантными свойствами.

5. В наибольшей степени протекторный антиоксидантный эффект селена в условиях водного дефицита проявляется в подавлении интенсивности ПОЛ и синтеза мРНК липоксигеназы.

6. При засухе предпосевное внесение селена в дозах 3,95 и 7,90 мг/кг почвы достоверно замедляет снижение биомассы растений и сокращает потери урожая яровой пшеницы изучаемых сортов.

7 В геохимических провинциях с низким содержанием селена и недостаточным водоснабжением рекомендуется внесение селена в почву (в дозах 0,79 - 3,95 мг/кг почвы) для получения зерна, которое может использоваться для обогащения этим микроэлементом урожая пшеницы, дефицитного по селену, с целью получения полноценных по химическому составу продуктов питания

8 Совокупность полученных данных позволяет говорить о множественности защитного действия селена при стрессе у растений, которое проявляется на уровне регуляции водного статуса организма, синтеза антиоксидантных органических осмолитов, активности ферментов антиоксидантной системы, торможения процесса перекисного окисления липидов и экспрессии гена липоксигеназы, следствием чего является повышение в условиях засухи обогащенного селеном урожая пшеницы

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1 Кузнецов Вас В , Хотодова В П , Кузнецов Вл В Ягодин Б А Селен регулирует водный статус растений при засухе / Доклады Академии Наук - 2003 - I 390, .V» 5 -С 713-715

2 Кузнецов Вас В , Хотодова В П, Ягодин Б А Протекторные эффекты селена при засухе </ Тезисы докладов V Съезда Общества физиологов растений России и Международной конференции * Физиология растений - основа фитобиотехнологии , Пенза, 2003 -295-296

3 Саркер У К Кузнецов Вас В, Рагутин В В, Холодова В П Анализ солетолерантности различных по засухоустойчивости сортов пшеницы И Тезисы докладов IV Съезда Общества физиологов растений России и Международной конференции Физиология растений — наука III тысячелетия \ Москва, 1999 -Т I - С 456

4 Kuznetsov Vas V, Kholodova V Р , Yagodin В A Protective Effect of Selenium dunng the Adaptation of Wheat to Drought (Протекторный эффект селена при адаптации пшеницы к засухе (англ ) // Abstracts of the Intern Symp * Plant Under Environmental Stress", Moscow, Publishing House of Peoples' Friendship University of Russia, 2001 - С 151-152

5 Kuznetsov Vas V , Kholodova V P , Yagodin В A Effect of selenium on growth of wheat plants and their adaptation to drought (Действие селена на рост растений пшеницы и их адаптацию к 3acvxe (ангт)) // Materials of the 3rd International Iran and Russia Conference "Agriculture and Vatural Resources Moscow, 2002 -P 391-396

Уел печ 1 I 16 Зак 225 Тираж 100 зкз

AHO «Издатечьство МСХА» 127550, Москва ул Тимирязевская, 44