Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЗАМОРАЖИВАНИЕ СЕМЕНИ ХРЯКА. ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА.

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ЗАМОРАЖИВАНИЕ СЕМЕНИ ХРЯКА. ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА."

Миь

всесоюзный научно-исследовательский институт

животноводства (виж)

На правах рукописи

Кононов Валентин Петрович

УДК 636.4.082,453.5

ЗАМОРАЖИВАНИЕ СЕМЕНИ ХРЯКА. ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА.

03.00,13 — физиология человека и животных (физиология сельскохозяйственных животных)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Дубровицы, Московская обл. 1982 г.

C&cc^LirCvr v fiV.-

OOCiCec

7-, ..е.: лг.v.; ■ у1"

Работа выполнена в отделе биологин воспроизведения и искусственного осеменения сельскохозяй- — ствениых животных Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института животноводства.

Официальные оппоненты:

— доктор биологических наук, профессор А.И.ЖУРАВЛЕВ. ,• • • . . '.у/ • • :

—доктор биологических наук, профессор ю. д. клинский у-

—'доктор биологических наук, профессор

ю. л. максимов

Ведущее учреждение—Всесоюзный шаучно-нс-следовательский институт разведения и генетики Т""

сельскохозяйственных^]Ж'ИВОТНЫХ. Г - > і

Защита диссертации состоится V ^ ■ ~ '"

198 ¿> г., в14 часов, на заседании специализированного совета<Д 020.16.02 «о защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Все- ^

союзном* научно-исследовательском^ институте жи-вотноводетва (ВИЖ).

Адрес .института: 142012, п. Дубровицы, Москов- V""

ской обл., Подольского р-на

С диссертацией можно ознакомиться в библио- , теке института. - а .. ^

Автореферат, разослан « ">,■'» rrr'.v v*. 1983 г.

Ученый секретарь специализированного совета \ . ' .' канд. бнол. наук

. . и. и. шмыгин ; v

ОБ Щ ЛЯХ А РА КТЕ Р И С ТИКЛР А БО ТЫ

^Актуальность^:Одним"из главных' путей решения ^ важнейшей V'.■"'■ ' 'народнохозяйственной задачи-1-интенсификация ;;животноводст- : ■■■ * т ва — является наиболее полная реализация, генетических ресурсов, ".-;: которую обеслечивает;зоотехнический;!метод искусственного осеме- .'.;."■ Ч: -'иеиия.'Этот метод,' зародившийся в лашей стране, и распространив. шине я по всему „миру; непрерывно развивался,*;, за'сравнительно небольшой - срок достиг." высокого биологического,1 технологическо-,; 1 '■.'■"■ го ;н экономического уровней;и;стал основным методом воспроиз- "'.;>■ ■ / ведения почти всех*видов сельскохозяйственных ЖИВОТНЫХ. , • V ^ / : *.*Особенно' значительным'достижением метода явилось открытие'7 ; ;

возможности «еограшгченно длительного сохранения семени живот-:, . ных в'глубокоохлажденном;состоя«ии (В;;К. Мнлованов, И, И.Со-> . коловская,^ И:'; В.1 См нрнов,-1947) г В; скотоводстве * это открытие , позволило'смаксимальной"эффективностью; реализовать' генетические ресурсы, ие'только,внутри страны; ло и в: глобальных" мае- = У,-штабах.значнтельно ,усовершенствовало"организацию племенной ■ работы; .позволило, применить'-"'высокоэффективную /крупномасштабную селекцию" и дало значительный ЛрЯМОЙ ЭКОНОМИЧеСКИЙ -: *: эффект.. ■ -'..,'...,.,..•;.•.;.';. * . ....; .., ' ' '

' Г,','.,' Не.,меньшее"', значение''это,'.открытие ;могло ;бы иметь в 'других отраслях^животноводства.в 1частнсм;ти,''в^свн!новодстве.10собенно ; это,важно е'связи , с .'.новым' этапом развития свиноводства —лере- ':.'." 1 : водом ! его',ца,;лромышленную„основу. когда*:резко.возрастает по- : , •:Требность в генетическом'материале, авысокие.продуктивные ка- :. чества стада становятся .обязательным условием рентабельности , производства. * В ;этой связи метод 'длительного 'хранения'; семени ' у -' ■ в замороженном,состоянии; мог бы;оказаться;весьма"своевремен-■ ным, для'столь необходимого обеспечения ' свиноводства; генетиче- • ; . ским материалом; •-' .■-'"■ "'■' -у-'-'" ■' ' " л . ■ - "" '

;'." ' Во-первых,' метод позволил бы реализовать, значительные генетические резервы племенных хозяйств и заводов, где,¡ценные;и вы-. ; ; Сдающиеся производители, в. сил у4 сл ожн вши хс я условий племенной ^ • работы,-попользуются,; для осеменения лишь; незначительного-чис-• л!а,*маток.' 3 а мор аж ив а н иесе м е!н и ;д а ствоз м ожность вс е - из л и ш кн" его ! доставлять', в;другие'хозяйства, что' в десятки* раз увеличит. ,■ .число »по том ко в; ценныхпр9(1зводителей ,и;соответственно шире \ -- р асл ростр а нит. ж е л ат ёл ьн ы еген от л п ывп о пул я Ш1 и ?; '

'"Во-вторых,; замораживание семени, хряка ^позволило бы довы-./ ■ ; •. сить эффект испытания; производителей по; качеству^ тух^у^г^а,. ,

ШошоаскоЯ орд. Лсглкд смадох Литт пл. к. л. э ,Ш|!раэем

. предоставив возможность накапливать его, и использовать "в соот-' ветствии с;результатами испытания. ■ "V >Л , ' ч ^ : .

.-. В-третьих, метод мог бы значительно повысить эффект Гйбри-Ч . дизацин в . свиноводстве./Возможность иметь резервы; семени от у .Ч большого числа 'Производителей,-сколь угодно далеко": разобщен- / ., ных/географически, могла бызначительно расширить пределы 7 оптимизации сочетаний пар.для .получения максимального эффек- -. • та гетерозиса. .¿х^ .—,,,, „/ •'• у ■'■-^Л/ • ■: Эти и . многие "'другие- возможности - повышения' эффективности ...у; • ; - свиноводства, / обуславливаемые , методом ;, длительного '.хранения л ' -семени;/со всей очевидностью/показали. целесбобразность и яеоб-: . 'ходимость его разработки.',; и. ' ;,.'. ::': %.;- V.''

4 Г "Цель »«'задачи; исследований. Цель; настоящих/ исследований

■ : . -состояла 'в /том.'/чтобы/поставнтьна вооружен и есвиководетва Ме-, - V

7 ;"тод длительного хранения семени хряка:; Первые успешные опыты, ;' ^ VI; , показавшие*.¡принципиальную. возможность\-получения/поросятот' ; • ' 'замороженного семени' (Ф. Л. Баранов;* 1972),~ не'дали, практиче-■С ',>. : ски приемлемой,технологии,':т. К.; разработанный' метод не.обеспе-..; ' у: ■ чнвал удовлетворительной,-"результативностиу,."осеменения:::около ./'■,' ' . . 8% опоросов.от числа .осемененных/Поэтому,для достижения це- , ■ 'Л*1и" было 'необходимо 'существенно развить" криобиологию/семени V V \ животных,/обеспечив теоретический фундамент лонсков-практиче-■' •*1 ских решений. В'связи с этим, были поставлены /следующие зада- / .-. ; .: чи как отдельные этапы решения проблемы в целом: . '.

-:<у*у— изучить" видовые 'биОЛОГИЧеСКие^СЛОбвННОСТИ "С^ в'; связи .с устойчивостью "живчиков *прй: замораживании, а/также / ■ ^: ' зависимость'этой устойчивости от1 зоотехнических,условий для ЖИ-: -'•'-; . вот)'шх; '■ ' 7 -"7*"- /' -' 7'*. у//

£...—'на базе результатов ..теоретических исследований, а также. -/..' : литератур н ы х, дан н ы хра з р а ботать' л р и ем ы, /Пов ыш аю щие устойчи- ■ - :

■ 7 </■-; вость живчйков'хряка при замораживаш1и; а"также ст10собы замо- 5

> '■■ 7 7- раживанияТи; оттаивания семени,'.обеспечивающие, минимум крио- / 1 / генных повреждений живчиков' и " достаточно высокую' результат .': • / тивность осеменения при ^^ использовании; / * ,7 7 /'; •„';>•' . 777" ■■ ■ 77 : /Л/^и з уч ить/. в озм ожность' компейсации сниж ени я / результатов ."'//

/'•• -". осеменения ослабленными замораживанием живчиками с.ломощью 1/ ,/разлнчных"способов повыщения эффективности/осемелення; ; ; у ■ 7 " — разработать ^практически . приемлемую : технологию^ замора--.■' ■ ■живання семени хряков. . .. V'^; ■'*

'.-*/•- Научная'новизна; . : : :

^'-'¿'7 Полученные ■; нами^ксперйМентальные. данные в м есте с' раз в и-■ тнем ранее/известных дандых.'по криобиологйи семенн позволили выдвннутьГлрннцкпиально новые экспериментально ^обоснованные / . ; ■-' положения Относительно биофизических, биохимических,;М0рф0Л0-* ; гических' и физиологических .факторов," ; определяющих"-устойчи-

> - вость живчиков/при'замораживании, криогенных'ловреждающнх ' 7':;- факторов, 'Криогенных шменений семеня П/ЖНВЧИК0В. + ; /^"'7' ■

. „'..: 1.: Впервые.выяснено/ччто,устойчивость . ж нвч ико в: и р и. замора- ' : *', жнвашшвзначительной-степенн; за в ней т'от,« ад молекулярной Я .

■/ > структуры /мембранных липидов~ а' именно -~ от параметра: их упо-".,. , ; рядоченности.^Снижение упорядоченности,', производимое различ- 7'-■';.■>. ными "факторами-^ включением "в липвдный; слой'отдельных'гид*: • ; *' - д рофобныхкомпонентов/снижением, поверхностного отрвцательно- " V - го заряда — повышает' устойчивость мембраи и живчиков в, цел ом 'У- при криогенных воздействиях. Видовые различия:живчиков'быков '' / "

• У и, хряков относительно устойчивости при-замораживании обуслов-У/- ' • лены их разной;способностью изменять надмолекулярную струк-гУ\~-

туру мембранных:липидов под.действием.-криопротективной обра-/">'*: ботки Осемени; Значительно ] более высокая;. /устойчивость бычьих • . '

■ ^ живчиков. связанаг.с ..тем,; что после: разбавления.параметр улоря- - ■ -

■ доченности /'липидов,; снижается -в несколько . раз енльнее.-чему У -V ;" живчиков-хряка, п';::!;; :■>:.:: Г"/ УУУ.;,' — • г -.Г ;

2.; Выяснен' новый фактор; снижающий-устойчивость живчиков У '-У.. при-^охлаждении—.уменьшение' концентрации -водородных1 ионов'" ' . -УУ вследствие диспропорционального подавления - охлаждением кон- „у " '

V сгант 'диссоциации: кислот и щелочей/ соли ко то рыхвходят в сос- , * -'. тав жидкой.части семенив '>сг.т:'.»"■;-',-л :. »•• •'• ,

■ ■"!''* 3.; Установлено,'что Криогенные: повреждения .могут-' быть -Обуг * -УУ.. ч-; словлены неодинаковым:тепловым расширением отдельных,'в раз- -У

пой степени гидратироваиных структур : живчиков при охлаждении „,'

п:*:■--:>-•;<,'::,■ ^ V .^У й;' - ~ У "" *У . ,л--4,.разра бота ны . но в ы е п р и ем ы л о выш ен и я' усто йчи востн ■ ж ивчи-' V 'У -ков при 'замораживании: специальные' среды, -предусматривающие~

■ •.снижение поверхяоетиого заряда, разупорядочивающиеструктуру -

м ем бр а шш х ."лип идов, ?~ста &и л и з нр у ющи еУрН/ п р н.У охл а ж д ен ни V у " и усредняющие степень/гидратации' отдел ьных: структур живчиков. У*У_'-' : Предложены новый;способ .оттаивания семенили" устройства Уд

дляего, осуществления, - обеспечивающиемаксимально • быстрый\ ' У подвод : тепла и отделение образующейся жидкой фазы от твердой. ; ; -, ; ; Применение этогостюсоба 'обеспечив аетболеевысокуювыж и вае;. _

• мость живчиков при оттаивании,в сравнении.с/традиционными.£ :■/ ; ' ■, ■ 6.:'Выяснено-решающее значение для' выживаемости живчиков УУ..

Упри замораживании'физиологических условий,'-особенно {частоты- у-*:.-; эякуляций производителей. Предложены ¡оптимальные- параметры С ■ Vэтих условий/, V.мл:' V .

7. Предложены орнгинальные технологии замораживания семе-, *г;■

V ни хряка/ обеспечивающие практическн- приемлемые-результаты > .' осеменения: ; '"."'.' " " V .' ; ,• \ . "

'Практическая; ценность1; работы;^ Разработанная-' технология' .>/'.'!'^длительного,';хранения семени^/хряков^^ в замороженном, состоянии- ;

■ позволяет значительно ltиитe«cифнциpoвaть,' использование'имею^ - ,, ; --; . щихся генетических ресурсов в свиноводстве, радикально ускорить; .; ^ г генетический прогресс и массовое 'повышение .шродуктивных и по-' / .. родных качеств животных.*,Кроме того, отдельные разработанные"

■ 2—3495 . '"■>. / ' /' 5_ ^ -

л КаГм»гэл ем ёнты\ технологий 1 могут; ; ,

быть;использованы Мя (ювершенс^вааия ^ ..'• ции семешг Йрупгх: видов; ^ -Ч

нами-метод сггтаивашя семени1 был успешно'использюван 'для се- - : .. мвни 'барана как 'значительно овышатощнй ^фзхраяность';биологи-|

- Ч£Жкой' полноценност11Ж|гвчиков;:1И'' соответственно'' результатнв-'~ • ; ность осеменения/- -

■ -^^;Реали»ацвя^1гаультатовгисследованийг.Разработанная^'¡нами ^ »'технология зам ор аж нвания; с ем ешг(хр як используется /для*эф- >

/ --фективного решения; отдельных 'задач жлеметюй ? работы ою -б ыст-■'•л'г рому.; генетичес^му-¡улучшению'¡стада.-В :к-зе:ии^ Мг В.'. Ф.рунзе . ;

Г-, Белгородской! области; она был а > и спал ьзов а н аг-.:; дл я гр азведения ■снужных'линий .уэльской породы беа завоза:производителей. Осеме-. .иеиие всего лишь 13 маток транспортированным в замороженном ,.;';.. ; . \ 'СОСТОЯНИИ: семенем. Хрякрв'лужмых ^ ЛИНИЙ дало ВрЯ'МоЙ .ЭКОНОМ1ГЧе- ' Л-/.;; СКИЙ4 эффектЛОЗ Я ЙСТВУ, Г на сумму; и' 15 ТЫС. / руб,(В. Я. Горин, '■*■'■-С. ¡Похрдня,.-.1978)Полученныйггенетический. эффбкт. иока^не- ;;'; ^^■ ^"' ВОЭМОЖИО; выразить. В рублях,; ИО он безусловно превышает ■„ при- ■ ^'■;*веденный<выше прямой эффект. В том же хозяйстве траиспорти-У:: ровжа замороженного .семенн ;с)большим эффектом,была^исполь--.

-У'-'зованаидля .оптимизации сочетаний »промышленномскрещиван.ии : . П оход н я,А.' Г-Н ар л ж н ын,1}982>1 В -племенных целях, яере>:

. возка ;замороженного семеии ценных' хряков* была'осуществлена ; из^Московской области в „ Армянскую , ССРГ (Э.г. Абра мян, А. На-

• • • рнжный, 1978), и;в • Грузинскую ^ :Хачапур1Цзе. 1979); ; ■

; : Т-Апробация » работь»Г-; Результаты - исследований, " изложенные - в " . ч . дггссерта ции, были ^доложеньп и' обсуждены: - 1) яа • Координацией-. V-:'•.-*•• ных;совёщаниях^сгранСЭВ в!!1975'ДОССР) ?в" 1981 ' '(СССР); "; :

• (НРБ);-'2) ежегодно на Всесоюзных Координационных-' -■>1:совещаниях: 1975—4982 гг.;;;3) "на'Международных'.научных^сим--

' : поаиумах"вИ978*гл (ГДР),- в Л981;.гГ*-(ЧССР);,~4) на''Всесоюзном 'V;. /. научиом 'симпозиуме в 1982 г:1; (Институт -биофиэики. АН СССР)/," ■-.'V;-у.1.Технология замораживания семени хрякаобсуждена;и утвержде-; :■ на:-1)на:Уче»ам- совете^ВИЖа 'в; 1976 г.;:2)-нагБюро отделения ' животноводства;ВАСХНИЛ в::1977 г.;:3) <на. Всесоюзном ;Коорди-■V; нациолном сов ещан ии: в р 1979. г*:; г,:' от;; 1С с:;; "'¡дм г.'/

■ ;*'.'■..;.. Публикация-результатов .исследований. По 'теме; диссертации V ^ .опубликовано'42 научные статьи - - 1' ^ -V-,'■;.

, .■ Объем работы."' Диссертация "; изложена *; на 475 - стр.,' текст : ■ •

:280 стр^ 74 таблицы,. 34 графика, 3.диаграммы, .4 схемы^Э^рк-' у ; ;,^сут1ков,'Л8 фотографи^СписокЧтитературы включает'559 источии:> 3 • ;"ков; ,из >каторых. 336 иностранных» 'Диссертация , состоит из разае-. • . лоа*., введение/, о бзо р литер ату ры.уце л кн. з ад ачи 1",иссл едов а н и йу ■ " методика исследований," результаты ^ и сследован и Й^^обсуж дел не ре- г зудьтатов.Гзаключекие^выводы, п ра кт и ческа епр едл ожен ня,"п р и-;

- .; ложенне; написана на русском языке." ''

- * - -,

-"'Ч..' • " л'•"•'•г-?: Методика иссЛедований"г"<; г:;! _

'"•»• '¿к •• •'.• Ч'—"-,-. | ■ ;' V;. <- -р-••Гг.с:-Л-'-' г'г.-^'г;; .V.

. ;:'Т-С; целью ^выяснения 'Причин-неодинаковой'устойчивости) семени -: хряков-и сбыков^при ^замораживании'было проведено/ сравнение . локализации ..'в -Живчиках ] важнейших ¿химических ^компонентов с • " помощью < г методов^''; гистохимиив флюоресцентных/« вариантах: 1 Кбел к ов —реакция с ФИТЦ (Ф;: Кубица, 1967); 2)г полнсахари-дов —реакция! ШИК (А;1:В.*'Зеленин/С 1967);;3)ДНК —реакция ; Фёльгена!:(А: В,' Зеленин,-]967);;лнпидов-^'реакция с; фосфн-ном ЗР. (Э^Пирс, 1962).' Кроме того, иммунофлюоресцентным ше-; тодом; выявляли локализацию: антигенов; после (Удаления готдель-' . ;«ых- 'Полимерных компонентов:.липидов,- (Полисахаридов, ^белков. Реакцию ¿иммунофлюоресценции; С : антиживчнковой I; сывороткой проводили непрямым1 методом; (Ф.;Кубица; 1967) ¿ V ^ ;.-■:.• ■■••: £ ,г-

'¡В''связи с особым' значением лшшдных компонентов мембран в криогенных повреждениях совместно с (сотрудниками,Централь-' ной) научно-исследовательской лабофаторшГ 2-го <Московскогоме-днцннского'' института ИМ.1Н.;: И:П н ро гова^ 1 О.-.А.'; Аз изово ГГи А. Г. Максиной; были/исследованы^видовые ^особенности иадмо-/ . лекулярной * структуры (мембранных: лшидов живчиков.; Для ¡этой V

ЦеЛ1Г-бЫЛ: Применен .метод/, ЭПРг СПеКТрОСКОПНИ; СПИНОВОГО г; зонда 10,-включенного вмембраны (В.;К.»Колътовер,11Э79)I Из 'полученных спектрограмм определяли параметр упорядоченности: ли-.

' ^¡■Тепловое -расширение.¡отдельных ■ структур живчиков„Упри, за; мораживашш: было изучено; с;применениемметода. микрЪдилато-^, - мегрйиг;Обоснованием;такого рода исследований служила рабочая'* гипотеза ~отдельные соседствующие структуры живчиков, .будучи обводненными в разной ^степени, при глубоком; охлаждении. рас- ■ ширяются с разными объемными^ коэффициентами, вследствие че-го;неизбежно;их взанмиоесмещекие, влекущее'; за собой механи-: . ческне/поврежден ля.Для, проверки этойгн потезыд и л ато м етр и- ■ ческим исследованиям былиподвергауты: цельноесемяхряков/ 'живчики,;отдельные 'структуры: живчиков,- а .также' растворы ,от- ■,

■ дельных;,веществ, используемых. в качестве ;компонентовсред и разбавителей/ 'V,'^'¿У-л-':-: '■./.■."."■*■':■ г

■■' В связи с особым значением нуклеиновых;кислот для биологической: полноценности-живчиков былотнсследованот их содержа- -

■ ние. в'семени 'И;в;живчиках)до и;яосле замораживания,; а также после последующей суточной-инкубации при 39° С,! Анализ.коли- -

, чества ДНК И'РНК-проводили го методу Р. Цанева и Г; Маркова (1961).: / .: •; . л-':.-;-.-; ' ■;. -• .

* Для изучения действия замораживания-оттаивания: на состоя- -

■ нне]'мембран живчиков1 была исследована'утечка*^аспарагинавой -/ и>ланиновой трансаминаз;(АСТ и АЛТ);:которую'определяли по

возрастанию активности, ферментов в жидкой части: семени,после ; той' или; иной - процедуры. 'Активность АСТУи. АЛ ^определяли; по. _ Т. СЛПасхиной (1959): х'.мч- "г;-.- г.: к'"; •

' Изменение факторов на раз- у

у-ных этапах обработки;.семени при^замораживанки изучали яо со- ,л . .■'; " держанию (перекисей,^выявляемых*:;реакцией; с^тиобарбщ-уродаой. . кислотой" (Р;? Джоне и ".Т." Манн, 1975), .'-которое::- выражали.как ■

тнобарбитуровое: число (ТБЧ); в условных ;единицах.: Кроме того,, : V" г.. ло 'ходу'-'замораживания-оттаивания была проанализирована, ди- -",'. ,, намикаестественных3 ;восстановителей:: аскорбиновой Д кнелоты

V .(П^ТР Лебедев, и др.;П976), редуцирующих Сахаров (Н.А..Суда; ко ви: д р „I975) ;су л ьф пщ р и л ьн ы хгр утл {В. ¿Ч.Проковцев.м др.,

Разработка сред для ¿разбавления .семени , перед: заморажива-

■ нием строводилась;с "учетом; хорошо;известных, данных о крнопро- -■'/

V ;тективном-и другом/защитном действии,отдельиых;1компонентов/ ■* -с учетом известных';« выясненных «ами механизмов повреждения

л '■ и 'повреждающих- факторов.; Оптимальное, соотношение;кошгонен-■/..'■ то вн а ходил и • м етод о м ^ а риф м ети ч еск и х' и геометрических рядов и , ' ч методом' треугольныхграфи ковло; В -К."' .М и ло в а нову. (1962): на /■- основании, подвижности,' живучести/после оттаивания,; сохранно-у -сти акросом и утечки АСТ в плазму семени.:-; • •/ . . . •

■ На основании: этих »же показателей; былиразрабогжны, методы ,

- ко нце нтр и ро в ааи я; семени: с: -частичным - или полным;:: удалением ; естественной » плазмы; семени после: осаждения . живчиков - центри*

. .фугированием; - - - 'V

Л .*.,-. Оптимальный режим1 охлаждения до 0°>С находили, «римеиив -; поэтапное"охлаждение,^а |также-выдержку. ;семен.и при;;разных . , ; /температурах разные сроки/Оптимальный; вариант,определяли по ; - наилучшей выживаемости гжнвчиков .при последующем л глубоком , ■=":..■ охлаждении,» которую, оценивали по под в ижности, отт а я няого' се* -/■ мен'и,5 сохранности ¿акросом н утечке 'АСТЛиз живчиков, г ¡г > - ; ' , • *•; Варьирование; режимов;глубокого охлаждения при изучении их г ; ./ значения'для1 выживаемостиживчиков.(Производили _ с. помощью ; ■ специально1 сконструированного устройства;:Запись,.температуры . /„ осуществляли с! помощью автоматических ¿самопишущих прнбо-- 'V- ров — уравновешивающего ■ мостаКСМ-4 ;н.поте нанометра- КСП-4 ; ■■т.'' й:соответствующих датчиков температуры — платинового-; сопро- -•• тивления и термопары, обладающих'предельно низкой и н ер дно н- " ^ :' ностью/ >у.\ г .; .г - г.у^/Ь -У Ч '*-,.=■-..'

- - Влияние -'режима'Оттаивания на выживаемость живчиков изу- 4 ,, чали,' варьируя;скорость подвода тепла изменением температуры :.>.'■■

в ультра тер мо ста те, вваннежоторого оттаивали,семя,,заморожент. , ! ное{ в' алюминиевых пакетах.¿В процессе оттаивания с помощью ./'. "';." платинового сопротивления- и КСМ-4 непрерывно регистрировали ■ ' -V ".*•' изменение температуры в образце.'. » . »V :

Л^.-. ■: Исследовал НЯ ПО изучению. ВЛИЯНИЯ -условий |КОрМЛеШ1Я. хряков , . на устойчивость живчиков при замораживании лроводилп совмёст-. .чу" - /-но:.слЛабораториейкомбикормов ■ ■ и ¡премиксов <* ВНИИФБнП '.(И. В. Хаданович.' В. ЯгЧерных. А. К. Маругин. Н. Я. Сорокина)., - С,| -ГБыло нспытаио 'действие «полнорацнеданых комбикормов,. разрабо- \

танных'в'лаборатории.-на характеристики■ эякулятов, на устойчн-. ; * ;: востьживчиков <при з а мо р ажи в а нииин а - резул ьтати в ность' осем е--. • . нения свиней семе^м, подвергнутым замораживанию. ' :■.-:' , 1,1 • • , ' - Научно-производственные опыты. В опытах использовали' хря-■ ков*крупной белой, лаедрас, уэльской,/Дторок, и. уржумской пород,^ -а также шомесей гемпшир-х-уэльс/ пьетрен х уэльс. Возраст хря-/-; ков колебался от 7 мес. до б лет л Испо л ьзо в а н н ые- х ря к и ^п рн на д-'-.'■, ; лежали Центральной станции:искусственного осеменения (п. Бы-' ■;,'"■■ ково'Московской! обл.), о/х «Украинка»^Харьковской обл.',; к-зу ; л им. М. В.' Фрунзе Белгородской обл. .' ■.■■■■;-. -- ^

; V / Осеменение маток яроводшшна свиноводческих фермах кол- ' , хозов им. М. В. -Фрунзе' и «Пролетарский Октябрь»-Белгородской -

■ области," э/х "Кленово-Ч-егодаево и^совхоза. Талдом Московской;

■ " области, колхоза «Аврора» "Липецкой'области,: совхоза Тарутин- ;

ский Калужской области,; Кроме'-тога, замороженное семя хряка'. . _ было переслано для использования в Армянскую ССР (и в Грузинскую ОСР. Во всех опытах использовали метод'искусственного осеменения свиней ВИЖа. В-испытании: отдельных вариантов' и; элементов технологии замораживания семени принимали' участие' Н. А.'Толышев, А.;Г. Нарижиый, Э.;Л, Хачапуридзе, -Г. С. Поход-; , ня.' Испытание отдельных разработанных ,нами методов было про-■;',.<■«; . ведено в'ГДР; Инстлтутом!искусственного осеменения■ в Шёнове,-. ''' в ЧОСР Ветеринарным институтом в'Брно.^ 1 ^Ч'":.-'Г: V/-. ^

'ч*.. ' -о. у ' ■ ■■, -

- ; 1 '" РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ; ; ; ; : :

" ■ ' ^ ' ^ ' : ' Биологические исследования

... ; "Гистохимическая': идентификация отдельных-:компонентов ■ под-

■ ' : твердила^хорошо известные данныегбелки; липиды содержатся во

всех'структурах ¡^живчиков,ДНК—-только : в ядре,': Вместе; с тем ..,- эти,анализы дали совершенно.новые сведения относительно лока-: лизацин таких компонентов .как полисахариды.-. Выяснено," что их'

много содержится в теле^(средней .части):живчиков,-а-в акросоме * \ , V ОНИ; НаХОДЯТСЯ ТОЛЬКО ;в:связаи«0м :виде'с^,белками, т. е. в . виде- ^

-. ч глпкопротеидов. ; Отсутствие существенных; видовых .различий; по ^ ' ^' этим характеристикам дает основание для заключения, что более \ - - высокая устойчивость живчиков быка при криогенных воздействи- ■ '} их в сравнении с хрячьимн не обусловлена какими-либо особен-иостями -химического и.антигенного состава отдел ькых, структур. • Попытка найти"вдиовые цитологические ¡различия,^сопряженные ' *' с разной устойчивостью.живчиков этих двух^видов, привела ,пока -; ; , } к одному, выводу, живчики хряка:обладают более массивной-акро-. , ■■ сомой, чем живчики быка. Возможно, отчасти с этим связана труд— < ; •. ность';'сохранения^ ее при; замораживании у хрячьнх -живчиков, ;-• ~ к. соответственно общепринятым положениям криобиологии л ю--. ; V бая гомогенная структура тем меньше ^подвержена * криогенным; • * * ' повреждениям, чем меньше ее размеры",(О. Смнт, 1963). ; -

¡Результаты. ЭПр спектроскопии сггинового-эонда в ■мембранных.' V л и пида х ж и вч и ков л р и в ед е н ы в .таб л ице,; 1 У- ~; "и: ;г г ¡г, ■, '--¿г • -

. г.:'. ,.'гг.Т' ог ¿^епй;^;^ 1.1г:о-*;;г». Ьн;^ггг' ^¡Т а блица 1 > .,"■ ;":;■ Видовыбратичия параметра упорядоченности мембран, . ; :

' у.. :* ли ли до в живчиков ¡.^ -.'г.-. '■■■/.г-'--;Л

'-иС' V- ■ - Г . ■. ' -; (г.'.п Шрикетр упорядоченности менбраянык лнпидов • , ' ' ' ! ."Живчиков ;;-,/*..".-:'

„из сеекееэяюго семени ■ ■..... ^ ■ I кз- разбавленного крно?а- ' • ,г шитаой средой /

ХрЯКЯ ■ '...'V 4 ■Г''' : 0,736±0,008 ^^^ 0.672±0,'00|' :

л-., -¡. ■ - - г- / - , - ■ -1 ■■■ г '■ - <

1 Быки! ... ,;0,750±0,005*.- ': ; о.218±о.оо2-.

• . ••.; ь гт'т ' ¡у. . • -••••ч г---;, :.-г- ■■■ ■ 4

Чг- Данные таблицы (показывают, что существуют значительные' :;: ; - различия; в "надмолекулярной ;структуремембранных липидовлщ-" • / : тактных живчиков в связи.с в н до во йпр-л н ад л ежностью — п а ра м етр . ^ ;; упорядоченности-лилидов живчиков.хряка был ¡значительно ^ниже, чем у, быков,-. Однако прямо противоположные, данные'бы ли'пол у-" I : ^^чены,относительногвидовых.различий этого «параметра ;у живчиков.

из семени,;разбавленного, кр.нопротективными средами. Кроме то- • го, разбавление само по себе снижает .параметр упорядоченности мембранных Л1ШНДОВ у живчиков^ быка, почти. три, раза, а у жив- ',/ • чнков хряка — примерно на' 9%, 'Поскольку 'суждение о более^ вы-—.'■ :сокой устойчивости живчиков, быка -было .сделано :на;основании- ■*■'. результатов .замораживания семени/ разбавленного криопротек-тивной средой^а также всвязнютем, что* разбавление семеня ра- ;; , V дикально повышает выживаемость живчиков;при; глубоком охлаж- • дешш, имеются -,1 все основания-для ^утверждения,-что .снижением /, г * ; параметра;упорядоченности мембранных липидов. повышает,устой-"

чивость живчиков при ¡глубоком охлаждении.а видовые различия . ". " живчиков хряков- и быков в этом отношении обусловлены способ-. ' ^ ностью 'последних1; отвечать:'более ;■ сильным V разулорядочнванием/ ■■[. "/ мембранных" липидов:в\ответ.*«а ;криопротектнвное4разбавление.:. :'.'У : *^> ^ - г:--; ; у > ^ ; г * >*>;■„'';■; 1, л.; ^

' . •Криогенные изменения в семени хряков*..'г : - V

; / . с ¿-¡ц.- ->> с*; ••''<•.•..;. ' ь, ■•'■:',/ :> • .• :- г >' . ••'•

•'Результаты дилатометрических измерений - отдельных структур : С

: : живчиков (Приведены В таблнце; 2.1 Г;ПУ'Г-М!" ■ !: Л'

; г'■■■:'Из'Д анн ы х.та б л н ц: 2вн д но ; что; жн в ч ИКН' без ~ акросо и при ох-.. , лаждении:действительно расширяются » меньшей степени,,чем ак-' / -Росомы, ноаТолько:.в .1 «растворе;хлористого натрия. Однако.в/-изотоническом растворе раффинозы различий не было. Объяснение. • " V этого .явления;слсдует; искать : в< зависнмостит степени ¡ набухания^ ! отдельных структур от окружающей, среды:; ОТ ^способности ее ком-;; ; ' . . ; поиентов. конкурентноТотннмать:воду от биологических полимеров. ;;

ч. ... ■■ Изменение объема отдельных структур жиачнков ,, 1 ^

при:о*лажденнн от До^ ~196вСГ в|¿вязи _р , составом г окружающей,среды ; ,

*">■ • • Объект анализа '' М .-'-У ;': )'.У. :.;.•;!■;, ;; Отношение! объема про —196е к. объему не» -+4° С -.'

в 18.6% растворе ваффнвоэы отиыты* •„ ■ - Г ;1 А 1% настворе хлористого' Г - иагрк» отмыты* - ■ : -1

Живчпки .' ' ' ^ Живчики без'амосом";'.'','!','' • АкрОСОМЫ ,, П.-Г^Г.' ли->. . е-' " • ^ 'ш^о.боб.,; • ; 1,07±0,01 ■ -1-' -.

-*> . • -ц ^С^'Лог}саЧ ■с' ::Т.* ? ?X

Изменение -объемовсемени, плазмы семени, живчиков --у ,4 ..

Т| - ».отдельных компонентов сред при охлаждении.. ■ 1 -..

■ ■:■....... ...г. ....„ - • -6т До —т*С ^' "Т ..: " С .

- ■ . Т ' < — 1т * ' г- ■ — |ЧЪ г "ТГ Г' - - Г » ■ . * ... .. — -.»ч ... ' -----. г ■, * . . ■ - ..

;■ Л/. ■■..-;■ . А .... ' ~ * ■ Коивеитоааия - к-.;*

.^."п" Объект анализа , молярная '.'. ', т Отношение объема при —196°С к Объему;. -у ■'т!-'".;» ПРИ +4* С '

" Вода |', . .4'. —~ 1ло±о,ш - ^

■;:■' '.Семя ' цельное ].<;; .г а , 4,08 ±0,003;-0

" Плазма ^меяи Живчмкк _ отмытые'!' » / ' Ги^'4 1 г 7 4,08±0,002 . 1,03±0,006'.-

- "Натрий "хлористый .' угт.';:^ * ■■*' ' !,О9±0,0О4 '

• Глюкоза . с о,зз. . .• 1,09±0,005 . - -

' - . Лактоза ' • : ■■. . 1 , | 0,33 С- : : ^1,08 ±0,005 'Л'.-

■ ; Раффиноза 1 ','' 'V _. '0,33 , ,, : 1,07 ±0,005 _ ■;* ■

; Тлицериа,.;. ..'.., ... - • 0,84 • 0,92±0,01 .

,. ■■■ ——....... '1^25,2 2,7 • • 7г\"-: ; 1,05±0,002 •• . ,

121б ^ •—1,35 • ^ 1,07 ± 0,004 • • ;

- Среда '- •• 1 ■ ■ < .'■'■■ ■ ^^^ " ] т" \ 1,07±0,004 . ■ . ;

: ■ . ■ ■ .■,:у ' " - ' "г '' ■ .ч. : '

1. У; неэлектролитов «связывание,/воды, осуществляется ГГОЛЯрНЫМ V взаимодейстбнем, которое значительно слабее,"чем ионное с белками и.другими полнмерамнДВ связи с этим.неэлектролиты способны притягивать 'лшнь^свободную воду, тогда как электролиты от*, «имают воду, связанную «е только полярными, «о и ионогеиными . группами. >.-, .^.-с?V■ * ■?.;.-';, .-'• . ;; .. п":

'■-.'. Чтобы выяснить, в какой мере отдельные компоненты сред .пре--, ; шятствуют расширению обводненных структур >лри Заморажй&анин,. , былипроведены дилатометрические исследования !их ■ растворов.; ,, : Данные таблицы 3 «показывают, что цельное семя, плазма се-

■I -Г.-:.

г^; г - -

меня!и*живчики.при охлажденни'ниже 4°Сувеличиваютсявобъ-; ■ . еме, но в меньшей'степени,5 .чем ; ЭТО-происходит, СВОДОЙ .ИЛИ ;.С ; V Ч- изотоническимн растворами сахаров^н хлорйстого. натрия. .Особен^ -: ' но значительно, отличается - степень! расширения живчиков —она: V ■ " статистически "достоверно ниже/чем -у /плазмы, семени дельного -»■ 1 .. ^ семени," среды и изотонических растворов сахаров^ "а также хлорн-. стого.натрия..Данны&.дилатометрии растворов Сахаров и глнцери- / •' на подтверждают зависимость;коэффициента теятлового расшире-:^

ния воды етрц замораживании Уот~соотн оше н и я свободной н связан*. ■ / - иой воды: при; одной и. той же »молярной концентрации Сахаров1с-Г-;., /-повышением 'Vполнмерности; коэффициент - теплового , расширения;: " , ; • ;снижался' так же, /как с (повышением концентрации . глицерина./ у - / Эти данные позволяют почновому объяснить «риозащитиое дейст-„ ;- вне глицерина и др.неэлектролитов. Растворяясь в наиболее об-:/ водненных структурах,* в ^момент концент ри ров анняр а ство рен н ы х • /веществ при замораживании,:'.они'понижают коэффициент теплово/ горасшнрення этих структур, чем предотвращатотся значительные . ':...■■' криогенные'разрушения, .'.. -у ■■■-=> ■">'■ - ;■'>■- У*1- ../''.,'. ■>■

■■ " г; у /V/; Морфологические изменения живчиков "... ; '

/ 3 на ч яте л ь и а я об водненность та ко й" структур ы^ж й вчиков,' "так; у - • > акросома/ и1 связанный с - этим; большой коэффициент теплового расширения при .замораживании обуславливают наименьшую ус- / Утойчивость ее ири глубоком охлаждении/ Анализ состояния акро-:/ сом, выявляемого фазово-контрастной^мнкроскопией,.;,® . связи с ■.;/* --воздействием;.разных условий "охлаждения," приведен в'таблице_

;/ ' ■ . ■■-■'■:■"■'. - ''/:■.' / -Ч; . / У / '■ . П.. :"-!-Л / :У

// ■. .- .' ...;' - ■ ; ,-../,.'■',.'- " -*'■'/,''■■■■, ■ . ■ Таблица.4 * •

1. ..Соотношение живчиков : с разным состоянием акросом - . ; . 1 "г ' ' ^ '■' ". •:.' V • в свази сразными условиями охлаждения . :/, , / '*•

.^-у /• у; -., ь■ ' Состояние акросомы ' ■ '-г.-.гл? ц ■ ■ ■ ■;-- % живчиков в семени'

' '. 1 -- ' 1 I: в емже- . вэяттом . ■ '■..■'-:: в охлвжденном ■',-.■

• % доО»С / до —1961° С ' ■ ^

без защиты ОТ ХОЛОДОВОГО . уд»ра. не к . разбавлен. - : '-гное • -Г'- с зашитой по технологии заиора--живвння ■ 'г : - вез за- . 1ДНТЫ, и« ■ раз бае-; - ленное с защитой по техно* логин морйжи- " . ваивя Г ^

Нормальная ;; -г-\ У». Поврежденная .. .. V' 'V Набухшая]' ' С V Г £ V ; ^ ■ Потерянная V V::/'; ''■.-'''"■"' -¿ъ г:гл^'Л., . и ■ 4 ±0,6 г ,1±0,5 ■ - *1 . : '■гу16±2// . . 59±4 • ' ' 67±2 : • ' 7б±г г1!- ■:■-- . >:-.-3±0,6 - . ■ [1 ' С - : ^:'. у"- о/; . 37±9,; ' в±1 '50±4'; Ч .,4....Л : 18±5 !. .30±5{!-' 3±1 -

12 :;•" :-/-:■;'у-

Из д а н н ыхгта б л ицы 4': видно,"что "охлаждение їсемени .хряка ,-снижает;ЧислогЖиотиков с нормалшыми^акросомами, а:велич«на |этого снижения, зависитіот условий охлаждения.; Если охлаждали - неразбавленное семя без защиты^то -большая часть живчиков нос-/ :ле;холодового-удара-н -все:,живчики после .замораживания имели ^поврежденные акросомы; Охлаждение, проведенное ■ после; разбав-,;ления защитной: средой,1®: условиях, предусмотренных технологией; 'замораживания семени,1, вызывает разрушение акрооом лишь утіо-■ ловины живчиков,: охлажденных до ^—>196° С и у- '/з —охлажден- . *ных до 0°С; V, -г-;..;. і/і":.'. . , .--О'.^ 1, - .• '-

_ І : Нуклеиновые кислоты"живчиков хрякапрн замораживании .'/ ,!

^-"О-' V. 2"'!г*г\.; V.::: - - .'; ■ . . -Таблица 5

'.. „•." , V Действие 24-часовой инкубации, семени при 39° С.

и предварительного замораживания на содержание " ' "" ' ' 'живчиков ДНК н РНК '-.■ -------.' -"■■* ■ • ■'"

-: 1 _ ^ :. ^ - : ' Кокцент- . - рения ■ (МЛК./МЛ) І. живчиков ■ , + -"' * » , І 1.. • ДНК : • ■ - ■-.■„.■■ РНК :.*

в цельном , сеневи, . ? (*Г%Р) в плазм* „■(мг% Р), в живчиках (иг Р 'нлрд.)^ В ЖВІ ¡_мг% р ічнках. 'мг Р . (млрд.)

Свежевзятое;' ■ ■ . 197±17 0,3±0,16 0,25± 1,144±: 1 0,066±

.. ;±о,4б-. * ..■ - ±0,016 ±0,14; ±0,01

..Сразу,после за- ■ *4,42±' :':о.зб±- 0,226± 1І09± ^ 0,062±

мораживанн я ^.Ц. ^! \ , ±0,24 \ ;±0,12 ' ±0,01; Ч±0,1 ±0,007

¡. Инкубированное ~144± 13 .Ї4.68± .0; 16± ; 0,ЗІ2± 0,6І'±0,1 " 0,041±

^ г; бет предвари- V '.Г.' ! - • • . ^ _' 4 П ;±0,36 ; ±0.06; ±0.15 ±0,008.,

Отельного замо-' ' ' ' ' "І.*' ■ ' - - '

" ражнвания' ." ^: І Г ; ■ г1 \ ^ '"л.

_ Инкубированное ^ "''"ІІМі^ 4 ^ 82 ±0,4 0,22± \0,439± 0.81 >0,076і

"■'-после замора-'т. "±0,06; ±0,022; ±0^16 , -0,014;

--'-живания и - ■ ^ , г г'1-'

оттаивания^- ЛР ' -

■ Данные таблицы 5 показывают, (постоянство содержания ДНК в живчиках. ^Общую, концентрацию, ее-ие изменили-ни заморажи-. ванне, ,гш последующая инкубация,' вопреки тому, что концентрация живчиков снизилась почти наполовину. Вследствие этого созидалось; впечатление, что количество'-ДНК. на. 1, млрд; живчиков. : повышается: за время инкубации.Эта иллюзия, вызвана тем, что > ^процессе: инкубации; разрушаются живчики," ¡но: не заключенные в , них - нуклеопротеиды: ядер. .Последние остаются , «е, разрушенными и не! растворенными даже;после того,.как живчики деградировали - настолько, что стал«;не узнаваемы под микроскопом. Это еще раз V подтверждает;' -известные •• данные , * (ИГ. И.!- Иванов' и /др^, 1967; В. П.,Кононов, 1967; А. Ананд и др.;:1967), что самая,устойчивая структура; живчиков— ядерный[ материал ■+*(нуклеопротеиды), ко-1 торый:разрушается; после гибели'гамет, в последнюю очередь. ;

'■.■','. »7-3495 " :'■'■'■;.."'■■ - ; ■*'."; ''.■'-'' '"*■■'. .:" ' ' • • .13

Во всех вариантах:опыта РНК обнаружена,нами только в доль: : " 7ном*'семени," но 1 не' в; плазм е.:, Это указывает; на .то, ; что в плазме • . • . ^содержатся ¡ферменты, ^которые/быстро ^полимеризуют, РНК,' «о ■I ■ только :после значительного разрушения^гамет, к.. содержание i РНК, рассчитанное: наз;Ьмлрд.- живчиков,-,остается;примерно по-' . ;стоянным:как^после,замораживания^так и .поеле.илкуСащш. Хотя ■У ¡'наши-данные' относительно ¡устойчивости:РНК прК;замораживании у~. ■}■■:''У 'не 'дают основаш1й сч1ггать.этйт;компонент,;живчиков;ответствен- ;

;йым- за'.утрату • ими'биолог'ической полноценности./видио все/же,-. ; : что РНК в живчиках более лабильна и Йолее-подвержена .измене- у,-Униям три внешних воздействиях, чем ДНК. у, ■ V ." " ■

• • HMf'i-.MiX'.rfl'TVfit >!';!! fi^nil^lhUtirciOfc fc-TL Vj Г. Э f! ч > «г а Г J (■ ? Л г w.v i f У .У"

... г Утечка отдельных компонентов из живчиков' ;' : ''> -, •

"'./.7,7. , /У ; ;;>-•." ...и при замораживании^ 4,,ur^.>rv \ • У j/7 У: . г; У . - - '.- У -t Ki'b.'KfJ-J, п нн на к ж.и; i >« s ?. ' (> j'iit.-<n, -- ^ j. ячпп, ■.'.' ■"'■' ' • У ; приведенных ^на^Диаграмме. данных видно; что выдержка л ■.. ' _ разбавленного семени вне: зависимости Гот'срокагв~предел ах *5ча-

- *" ~ совне< изменила/активности 7АСГ'в плазме, а-.активность АЛТ в ,/

это"время~снизилась; Выдержкам «/течение; 5;,часов: разбавленного " семени пример ко. вЗ ,раза повысил а/активность ACT в плазме, но... V ■ Сохранила;на.одном, уровне активность АЛТ. Следовательно, кон- У / ■ jraKT; живчиков с .естественной = плазмой~сем ен и при" 18—20° С - не ■ ■'/■УУ гнзменяет; состояння \мем бран ; и не'вызывает: утечки ферментов,-; в У. , ':* ; -,то,'.время;, как разбавление -семени; значительно усиливает дрони-, .' цае мость; iM ебр ан /,П осле /з амор а ж иваиня н оттаивания активность ■-< ACT,-в: жидкой части семени;еще -больше усиливается, что >указы- 7/ ■ ' ■ у' вает'ла' увеличение/утечкиг;этого/фермента'из' живчиков, ;однако V -7' активность АЛТ в плазме остается на одном уровне/ Следовательно/ разбавление семени, значительно повышающее устойчивость у " живчиков; также как охлаждение. усиливает. пролицаемость мем-' У бран. что очевидно является следствием^ разупорядочивающего ли- , ,

- • пвды действия разбавления (табл. 1), поскольку известно, что для

: у.; \ активного функционирования ' мембран; необходима высокая. упо-'. ■/■:. /рядоченность молекул лнпидного слоя. . : у у- . '" • ; У / J У ./v. "'.■■! -j ■■' ''• '- '.* " ' -77 :vr -."7 J./<> • ,-.У-

7 7 7ТУ/Дей ст виека л ьци e во го им а гни евого ионов на состоя н и е у' :" :*■'' ;77* /мембран/и' выживаемость живчиков призаморажнвании - 7

■ ^ ^ ,7 'Д анн ы е та блицы 6 показы ва ют/ что среда; включающая; каль- , ,7"7 :7;циевый,/,и '/магниевый; 'ко мл л ексои аты~ ЭД ТА, t сил ьн ее.з а щ н ща ет / ^живчиков^при замораживании н вместе с тем:значительно больше / '7 ! разу пор ядочйвает мембранные'липиды. Это ещераз подтверждает, - ¿что устойчивость :мем<5ран ¡при замораживання в'значительной сте-• ; , пенн^определяетс!!;'^^параметром! упоря доченн ости^мембр анны х ^л и --: 7 ; '„пидов;'илчто.снижение этого параметра является одним.иа приемов /7 '•:;'■'. ■' заШ11ТЫ живчиков7г!,:'-•• ::• • •; -о; : >./'." .С: -

; Для ^выяснгаия - ^еханйзма^^^^^ ;

л 7 магниевого ^комплексонатов ' ЭДТА1 на живчиков было t испытано ;

■ / Л '■■ ■"■ ; *.- Таблица 6 ■

Зависимость упорядоченности лнпндных компонентов мембран живчиков м нх выживаемости при замораживании 1 -• от присутствия ионов кальция и магния в среде . : - '

) ггэдектролнтиые компоненты среды

< Подвижность после оттаивании

Живчиков с иермрушея-кымн акро-. сомами после

оттаивания %

■1—

П ар а м ¿тр -* ' у поря до-; четкости липнлоа в. ; ' | жньчиках

"■.Г ':". .-Л.. ■

' : , 0,3. .

; - Г

41±2

п -

о

. . „ ■■...

\ 0,682± 0,002 : ] ' ■1

0,061+0,002 • . 0,73^0,009

л ■■

Дни атрий' ЭДТА+трис ..'-(XI)

Кальциевый и магниевый комп-' дексонаты-динатрневой ЭДТА-

<хш> | . ..

Неразбавленное семя

ил Ч-

влияние разных концентраций парамагнитного иона ферроцианида на -ширину низкопольной .компоненты спектра ЭПР. Ушнрение-.компоненты возможрно в том' случае, если парамагнитные ионы -: ; могут приблизиться к радикалам, т. е. проникнуть в ту структуру, -где ¿находится зонд. Данные графика 1 показывают, что-при сред- ; : них значениях концентрации ферроцианида, уширение компоненты значительно больше в живчиках, замороженных в среде'с комелек- , , сонатами- Это значит,.что присутствие'Ионов ^кальция и. маглия •обеспечивает более' высокую .доступность проникновения', ферро- ■ цианида к зонду-в лнпндах мембран. Это действие ионов^кальция ' и магния,1 видимо; можно объяснить следующим. Свободные двух- : валентные: катионы! дают с карбоксильными ■ группами ■белков и. ; , сиаловых; кислот 'на : .поверхности мембран ;слабодиссоциирующие ' соединения, нейтрализуя отрицательный заряд. Поскольку ферО роцианид] анион,! то таким образом ослабляется;или устраняется, главное препятствие для его-проникновения* в лнпиды -мебран и взаимодействия:с радикалом-зондом.' Вместе'с тем! более сильное разу поря до чявающее действие среды._с комплексонатамн кальция -/и магния:указывает наналичие связи между поверхностным:за-V рядом; и параметром упорядоченностимембранных лкпидов. Эту связь можно объяснить^ следующим образом. Основная; масса ли-пидов ".мебран представлена фосфолилидами;,включающими в состав органические основания холим, этаноламин и др. Это значит, что гидрофильный; конец, молекул,, заряжается за .счет.;аминной' гр у пп ы; ш о л ожит ел ьно.От р ицате л±,н ый ловерхностный 'заряд, притягивая'положительно заряженные гидрофильные концы молекул, - ориентируют их в плоскости мембраны строго раднально/ создавая^ жесткую жидкокристаллическую ^структуру; Потеря■ или снижение ■ поверхиостногозаряда осл а б л я етн атяжен иелипидных;мол екул и позволяет им за счет межмолекулярного взаимодействия принять более "хаотичную-структуру и придать'В'целом лшшдному слою ■ Солее аморфное состояние. *.У; .' С'.,

Диаграмма.: Активность ACT и АЛТ в плазме темени хряка на отдельных , u этапах обработки семени пря замораживании,'! — в свежевзятом семени; ' 2 — после аэробной' инкубации при 18—20°С неразбавленного в. течение 7 , " ; '1 .часа;-3 — после аэробной• инкубация при 18—2СС:в течение 6 часов;

.;■■-..'. 4 — после анаробной -инкубации, разбавленного в течение 6 часов;, 5— -. после замораживания и оттаивания" разбавленного с i предварительной анаэробной инкубацией в течение 6 часов. ■ ■-'■ .г

: лН1Д

■ !

7-—Г-г-г

0,2: 0,3 0,4 Л. 0,5

0,6 .,

' Концентрация ферроцианида калия (мМ) ; .. '

' График. 1. Влияние ионов;кальция и магния в среде для замораживания " . живчиков на ширину нвзкопольной компоненты, сигнала ЭПР, спин-эонда ■ в мембранах под действием ферроцианида калия.: * Vк - ''»т :

.. Живчики были заморожены в среде: 0_—с ЭДТА-трис; # < с кальциевым - к магниевым комплексонатами ЭДТЛ , -- : . . " ;-<; .

■е; и-1;11г^ Изменение концентрации водородных ионов- ' ?—1 -

■ По скол ькуконста нта~ д и сищи ацникнслот, (сол и-которых входят ■ в семяв высокой концентрации,;подавляется охлаждением,а;со-, ответствующих. щелочей ~ почти ■', не зависит, от -температуры,. ох-; * лаждение; должно. уменьшать: "в, не.«', концентрациюводородных -ионов. Л;-; . г ~V'"• • V

• ; - Данные прямых опытов, 'приведенные на графике 2; полностью

- подтверждают это. Действительно,' три охлаждении рН семени- на;Л . .-.несколько единиц повышается. ; Л' ■' ' '.' = '• ,

V лЛ; Для выяснения -того, в какой мере отдельны« вещества,- нсполь- ."'■ . > зуемыс как компоненты сред, могут действовать на'рН при охлаж- • -■

дении," был проведены; специальные,нсследовання,-которые пока* К - зали, -что из . большинства электролитов; используемых <в - средах,

\ - 9_

• 8-

-'•' -. 7 -

л-

•о

■ : 1Т'-Г

Т гн ' ' ? .. 1 * .

■ ■ . .Г"*': * '

■ I ч ; ;.

. . /¿о .. ■ /> зо . . -4о

, 1 .....■ • ■■'■■'. "^^.'температур- '

, " . График-2. Действие"текпературы на' коацеатрацаго.водородных; ионовг в ;

1 • ■ . лишь; аммонийные, соли сульфат ■ н (цитрат ■ способны стабилизнро-\ , вать -рН ■ при; охлаждении. Среды, включающие эти компоненты, -- та кже ;опособствуютгсохранениюуровн^ водородных:

йонов/ порой;даже в большей степени,' чем'однй стабилизирующие ; ;„ ;рН компоненты1Выяснилось^ что; уТсредЫ;* обеспечивающей ,наи- ; высшугореэультатнвность'осеменения з а морожённы м семеме м/ на и- . > . - более ярко выражена также; способность стабилизации рН.--'-'г ^

■.¿■с:","-*:'.-:«:!:.:.-Среды"для замораживания семени хряка! / ;у ■ . '

. ; Обобщая данные^мног^именных исследований;:можно сделать, ' ■ вывод,'- что'состав сред для. замораживания; семени хряков, соот-. V ветствует: классическим принципам ^ (Мил ованов, 1962), т. е. в сре-.-/ дыЧдолжны ''обязательно: входиты электролиты; и л неэлектролиты^ .

одновременно'и существует оптимум 'ИХ соотношения; обуславли^; , V ' 1 вающий строго определенную оптимальную ионмую; силу, среды. V , ) ; г Исследования неэлектролитиого состава сред ; выя вило, ^ что за- : . ■

щитные/свойства повышаются, от: .применения 'сочетания: моноса-, ' ■---'' ^ " харвдов (гексоз)- и днсахаридов. Неимело большого аначення ,какой ^ > : из;"шнкретных сахаридов*использовали: глюкозу,:л ибо. фруктозу,, ■ / либо галактозу; сахарозу.' либо лактозу/ ':: :: ;; -"'■■ /

-^«и) (.•.'.:■ ;>.'• V * '/С!'.'■'■''. ■'- ■.'.'

■-..- / вякца,-7: ,■ '.

'./; Vу- *1 Сосне синтетическихере д, раэработаняы х ^■ / ^!' ' - ■'■•-/

>.'.1*..■■у ■:'. для замораживания семени 'хряка ЯП'*'.

1,,л.'.1 г. ^.„"Содержание (г/лнтр) вереда*.

. " Компоненты ', ..... -Г' i : 1' л . ■

111 IV: ] \и. .X, XI ' XII *Х1П XIУ ,' * ,

' - - . - - - - Ч* «1 ...о* '- ^ ,. 1 (1: ? -

. Сахароза 'у '. 7 120 60 ' 84 | ;84 ¿34 * ^50 и 21 • , 50;

Лактоза ■ ./ . —, 60 . — -■ ■ -и г 50-'.

■ Глюкоза 1 . .;'/■" — в —- V — 25 8 ' 3 8 ' .

.Фруктоза ■ ■"Г г'6 ¿С ... ■ | - 8"

Галактоза. , - ■■ ■ 8

' ЭДТА/двунатрие-'г вая,1 двуводкая -'--".*". -.'¡л.-'. ■ ■ -..' V;1: ; . -

— -12 '12 'Г \УА з •''.4 . г: 3,2

.- Кислота лимонная-; ' —■ "-1, ; +т - ^. * V 1 М1 ц. 12

Оксид/кальция 0.6 о;е : г-! 1г. Г \ '-'ти ГГ ■ •''о,б'. ' 0.6 ' 0,4'!

Окснд магния 0.4 - 1 ' .. к- ч- * £ : 0.4:

Гндроксвд натрия/. -о^з ' о.'з;;

■ Ги дроке ид; калия '.V о,1;

" Аммоний сульфат —■ ' '»! 2 ■ • 2 !> 'у у; ' г-» •.

..Аммоний цнтрат," ' ' / ■ ' : ' - V • -¡--А :■■:/. г.-:

; трехэ а мешенный. Натрий цитрат;;'-'' 1 , ' . Ч- . » - 2,3 1 I'. 1 > 1; -г

;У,_; [ и

" трехзамещенный, / - г Т.' ! и'. г-. ' г ; 1 .V с. г,

5,5-водный 1'. *■„.:; Трнс (оксиметил^'-- ■ . г й . .. 3>! 1 Т- Г' ■ 4 - ■

' О " ' I....4 .-%'л -; 'у.Х.-и 1Л.'

амв но метан 0,6 г; 0,6 1;0,6. 0,6 .'■,23 л 1 1 * } •'

■ Гл]щерин;(мл) ' 1:4» мЬ- 40 ¡40 : а 40' ; 40 • ■г40': ';г40; ; 40 --

:, Желток куриного' : ■.л; 200 : г--., ч г; -! V" :1 ? ~

яйца (мд).^ чЧ .■ 60 50 ■50,: ¡- Бо : 50 50 •ао": 50 .

а:*: - л »^ Г : -■'Г.:".."1

/ V В, качестве электролитов было; испытано ^большое множество

■ компонентов, одним из свойств которых должна: была быть ело-"; собность стабилизации, рН шри-^охлаждении.Для ; придания этих

.;.- - свойств среде были- использованы-аммонийные .соли., сульфату и V;. ; ' ' цитрат.. Кроме'того^Ь качестве:"основных .компонентов в; средах• 1 / ; были использована :ЭДТА, «ейтрализованная,.лн^бо: органическим/:': У-.- г основанием трис, -либо -оксидами ? кальция ^ и-;магния,,-/дающимиУ

..... комплексонаты этих металлов.^:Гт7 ^;.• 1:: ■■: V:"' Ч1 '

Оптимальная ^концентрация водородных ; ионо-в ;в 'среде; , была -- найдена1 в специальных опытах,-' показавших, ;что наилучшие уело-» ■ ;. вйя для сохранности, а кросом обеспечивает средас,рН = 6,5,адля^ \ сохранности подвнжности — с ;:рН=6,8. После .добавления среды-"*; к семени, имеющему, как известно, слабощелочную среду, рН ста-'* - новится близким к нейтральному значению (6,9—7,1). Следова-. тельно.в конечном счете, оптимальные условия при заморажиза- • :,

■ ■-.; ■„ >■ нии для живчиков,обеспечивает нейтральная реакция окружающей: ..

; - среды, которая благоприятствует 'живчикам 'двух отношениях. Во-первых, рН=-7 одинаково далеко-удален от изоэлектрических,- ■ , -точек .кислых:и щелочных/белков,"что обеспечивает примерно оди-*■ гваковую.степеньтидратации тех и других.'Во-вторых,,рН=7 обес- .

■ :■ ;печивает минимальную электропроводность среды,' чем снижается , ■:/*' разрушительное действие ионов. " • • • . - -г^*■

':.-"■'.' . Состав наиболее широко испытанных вариантов сред из разра- . . ботанных нами приведен в таблице 7. '/г ..{ ■ ' . ; ...

Х,.* --V5 , Влияние окислительно-восстановительных факторов . . ..

1 - Данные таблицы 8 доказывают, что в процессе технологической-V " обработки семени происходит постепенное снижение, концентрации' , - ' ^аскорбиновой кислоты и редуцирующих Сахаров, однако содержа- ; ; : / ние1 сульфгидрильных, грулп (практически ^ - остаётся без "измене-^ V ... ' ннй; ■ Это.значит, что 'в, семени появляются1 факторы,*"способлые' • . ■ окислять" лишь; сильные восстановители, - такие как аскорбиновая! -■ кислота, сахара, но;не сульфгидр ильные группы. Концентрация В; семени перекисей, определяемая.величиной ТБЧ,.также существен-' , но.не изменялась в процессе подготовки семени;к замораживанию и при замораживании. - ■: ■ П ■;;/'- I--; V' Г

:,' уИсшытание отдельных редуцирующих веществ для защиты жив-:: . ;' чиков при глубоком охлаждении,выявило, что протектнвным свой-;: ' ' ством обладают "лишь ^ слабые, главным*; образом,., гидрофобные^;. г V а нтиоксн д а бт ы: бути локенто л уол, (Б ОТ) ; бути л окси а н изо л ( БО А) :

токоферол,. тогда как -сильные восстановители, , например, аскор-- л'-;*; . б и нова яки слота; такого: действия ле оказывают. Видимо, приме-. : . нение сильных антиоксидаатов в низких: концентрациях неэффек-. "1-тивно потому,- что они /быстро переходят в'окисленное:состояние и перестают;действовать как-восстановители, тогда, как'сла-бые' . ;; ; антиоксиданты.можно вводить в сравнительно.высокой концентра-; „

/*. Действие технологической обработки семени хряка при замораживании . -уу — на содержание в нем- ленсоокнсляющихся веществ *:---

; - .¡:.и ^ ¡.и-перекнсных соединенийс^у.и-.'у.:':^ "''1Л-.^¿их.

. /, ' / г. КОМПОНСНТЫ '' "— Число'. -анализов Свеже-П взятое : семя -.■ Чер« ■ I " -..' I- час 1 После^ аэробной 1: разбавления выдержки 1 ; ■ * ' % . ; ,После оттаявакня ,

■ * ■ - у. ■ }

ТБЧ. -, \ .и - : 3±о;Б 4±0,2

Аскорбиновая кислота;''-" *мг%." "-. : 1 ".14.: 0,540± ±0,04 4 !• ' 0,44б±* - ±0,04

Редуцирующие сахара. -/-1 14/ . 9,91±: ±1,16 - 8,55± • ±1,58г

Сульфгидрильные группы, - мкм/мл. >;... .. ;>г ," <)"■ 7 -. ;о,91±: ±0,17

; 2.4±0.Ш

0.32±0,03

- » • " . "

-.и С* . ••' , -.1,1±0,0б

' 2,3±0,05 о 35±о,оа-

1,06±0,1 ,

ДНИ II ОНИ' постоянно и устойчиво удерживают этот "не "сильный восстановительный режим. У- ■ •.•;•. ^ *

Среди множества испытанных антиоксндантов наиболее'эффективным - для защиты живчиков 'оказался: БОТ," вводимый в,среду, в"концентрации-60 мг.%7 ••''•• > '.:.■:■•' 1 ^

•^-Известно;, что"гексозы : (глюкоза, фруктоза,- галактоза и "др.) обладают : хорошо ' выраженными1 редуцирующими / свойствами и при использовании их в качестве компонентов сред : помимо1 всего( прочего несут функцию антиоксядантов, что,* как" выяснилось,' исключает необходимость/применения: дополнительных - средств .за-^ щиты живчиков отри замораживании ¡от окисляющих факторов.-"-^

у Степень разбавления семени при замораживании," V "

; "'"В любом случае лри заморажйвании.семеии без предварительного концентрирования живчиков можно было применить степень разбавления -только: 1: 1;-1 Поскольку - «после'замораживания .под-' вижность всегда снижается примерно наполовину, более высокие степени разбавления неизбежно привели бы к недостаточному для оплодотворения' числу подвижных живчиков - в оптимальном объеме дозы. у:'--'-.;.',-*-" . / ~ ''С' /■■ ■■:. ; -;

=-^Концентрирование^живчиков перед замораживанием"-/ ■ '.'г\

— Видовая особенность воспроизведения у свиней: большой объем вводимого семени .накладывает технические трудности на процедуру замораживания. и оттаивания семени,.требует' больших затрат, хладоагеитов и криогенных емкостей; В связи с этим; нами/наряду

с другими исследователями, были предприняты попытки сконцентрировать живчиков, чтобы при.замораживании, и оттаивании ма-' нилул иров ать\см алы ми' о бъем ами 1 П ерёд 1н опользо в а н ием се меди концентрация дшвчиков ¡могла быть-доведена до оптимальной до- ■■.' полнительным. разбавлением. - ......— - \--------

Испытание различных способов /концентрирования живчиков: фильтрации,- отстаиваниями др.," показало, что для этой цели при- ■? ем лемо 'лишь осаждение живчиков: центрифугированием." Были-вы-, яснены оптимальные условия центрифугирования, они оказались ; независимыми от состава среды,- степени разбавления и-др.-факторов и были—600 g, 10 мин; Выяснилось, что. лучшая выживаемость живчиков достигается, когда центрифугированию подвергают предварительно разбавленное семя!«; когда температура цент-рифугироваиня не .превышает)+15°!'-■'■' '.!;.. ■.- ■:;,!.!, .о";.

Наилучшим'оказался вариант обработки семени: разбавление; полного эякулята сразу после взятия в соотношении 1:1 ■—1:2 гл'ю- ■ козоцитратной средой следующего состава:- глюкоза — 50 г, «атрий, лимоннокислый трехзамешенный,'5,5-водный —4.8 г, лимонная кислота, 1-водная —0,18 г , ■ вода — 11 литр; инкубация в течение 3— 4 часов'При + 15"С,'осаждение живчиков центрифугированием при _ 1&° С; .ресуспеидирование .осадка живчиков в лактозной среде:.' ! лактоза —'11,5 ту глицерин гт 3 мл, желток — 20 мл,вода — 1СКЇмл," при соотношении осадок:' среда -7-1:3.. . г .' -, ; • ..//

і В случае обработкисемени .с концентрированием.живчиков. тре буется еще разбавление после оттаивания. поскольку в / связи, с. маточным типом" естественного ' осеменения у; свиней для высокой *оп'лодотворяемостіьішеет^значение,не только число введенных;под-вижкых\'живчик"ов(не.-'менеё^З'. млрд.), , но и. объем . дозы - (80——-100 мл) ." В связи -с .этнм! была разработана специальная среда, в определенной мере^ компенсирующая,ест'естеенную' плазму семени/ Она, им ее т - след у ю щи й Г соста в :.гл ю коза — 30 г,, «атрий лимонно-! кислый'; трёхзамещенный,-!5/5-водный — 4"г,; ЭДТА— 1 г, натрий ; пировинограднок!1адый^)0;г,;вода—. І литр. Для 'получения оптимального объема "'Дозы / оттаянное' концентрированное семя , необходимо разбавитьэтой средой,в 5 раз. - . Д^У;";-*

^л',!';*, Оптимальные режимы охлаждения и оттаивания .' '¡о-,:-*"/ Охлаждение до 0° С : :

'• " !ні;і '■;:'ГІІЇ'^.ІІ^Є:;«' Ї;'Я> „.-Опыты гпо .выяснению оптимального .режимаї охлаждения ;до , 4-15° С, . критической точки . фазового перехода основной массы мембранных липидов, показали, что в этих 'Пределах температур семя можно ¡охладить, быстро,, не .опасаясь унижения..структур ной ■■-. и функциональной устойчивости живчиков " при последующем глубоком охлаждении; От-режима охлаждения до ,4-16' С,не зависела сохранность подвижносги. акросом и утечка АСТ в ігроцеосе замо-ражнвання-оттаиваии'я. т -лії;агтгг> ^ і.;:і?;;-''

' Влияние.различных! режимов.охлаждения,семени ниже! 4-15® С

.-;.. на ¿последующую выживаемость'живчиков после' замораживания " -.'.7

приведено , на-: графике ¿3.Видно,,v-уто, ^еслн:.после достижения • • +15°С, семя-сразу подвергать глубокому-охлаждению,"то устой- .'-. чивость-живчиков^начительио ^зависиг-от-срока-лредварительной-' инкубации его при'Ч-15° С. : ^.''.-Л". ,...-:-.-. . ^.г,,;';'.--

t. * ^ мере -удл и н ени я /сро к а инкубации в пределах до 8 час. в - -V

- оттаянном семени повышается %"живчккоо с нормальными акро- V/. ■- сомамн'.и подвижных. Однако инкубация семени перед заморажи-; ванием - не'уменьшала-утечку ACT из живчиков. Если семя от i »"'.*':-+15° С~дог+5?С-охлаждать ^постепенно,^в;-теченне.2-х . часов, то. v 4 . выживаемость живчиков , при . последующем Чзамораживанни-от-. 'V' таиванни/также значительно -повышается^"Срок инкубацин",при; . . +15° С также, как и в предыдущем случае повышает, устойчивость. : акросом живчиков: при замораживании и оттаивании,.но'\положи-;•-*'. J тельное действие ее отдельных Сроков, менее контрастно. Это зна- ■ . чнт, что инкубация, семени' при + 15еС .усиливает' устойчивость;:" - - живчиков, главным образом к неблагоприятномудёйств1по;резк01Ч>^ 4 . охлаждениям зоне температур до' затвердевания^ т,' е'. от +15 до'.- : ' 0е С. V ; ч '•

: " Если семя после разбавления,постепенно, в течение двух ,часов,j v : охлаждали - до-J 5е С, iav затем- инкубировал»^ ^приУ+б? С разные^^ ' сроки, то защитное действие инкубации было наиболее сильным.. . : Наилучшая сохранность акросом у , живчиков была ; в вариантах;

; где семя1 выдерживали при^50С.в:теченне 5 часов/1но.оптималь^; /

-■„■ ный срок инкубации, для 'подвижности был 3—4 4aca.-..>.tTi:r ■■.'■ '•'" Укрепляющее»*действие ¡ инкубации :семени гпри - температурах, , . '. " ;*'■■ б ли з ки хк№ С ^ пр н-посл ед у ющем' замораживании было отмечено раньше.^ Исследователи "объясняют^механизм действияпэтого ;при-' , ема! тем, что ¡up и: инкуба цн и:глице ри нпро ни каст; в н у тр ь'ж и вчи- , ■■■;■■;"■■.' ков^пронсходит уравновешивание концентраций его внутри и вне : ; живчика,"такназываемая;зквилибраЩ1я./Вместе.'с.тем;- есть также

■ данные^'-показывающие,"что крио защитное действие-.глицерина /эк*?.-.: ■-; вилибрацня'-ие 'усиливает ' (Br"А;I Наук;': 1974) ."Чтобы внести - яс»

.... , ность в этот противоречивый :вопрос; мы :провели опыт; результаты - -которого приведены в 'таблице 9.' - -J <■ -:с:;о ' г; ;< ""г' •.; ',„

, ; Дадные таблицы1^показывают, .что выживаемость живчиков, оцениваемая как по структурным,.так к по функциональным <13-■ менениям;: совершенно не зависела от того, когда вводили глицерин в семя: до его инкубации; при.+ 15® С или после нее, непосред:л . ■ ственно перед замораживанием.. Вместе .с тем, обработка семени ; ' /вГоптимальном"режнме;:(выдержка 2 часа три ;+15° С и; 3 часа ..., '." • при-+5" С)-явно повшиала'выживаемость жнвчиков,й-.ге : ::г^;Ь ,л-"-—Действие инкубация семени: перед, замораживанием - на чвыжи* ваемость-'живчиков- было испытано и применительно «;технологии . . с'концентрированным семеиемл Выяснилось; что. в этом случае.нн-. .кубацня- семени: перед 'замораживаннем,также.положительно ден- ' -.', ■

■ ствует:на-устойчивость живчиков . при охлаждении, н0;только, если ;"..-■'.■• ■..' она пройёдена-до'отделения естественной плазмы и.полной замены У/

^ 'їі'у.'.""» -v і; "г •: ■ /• ;. V". Та б лица 9.

^Действие режима'обработкн семени и момента'введення глицерина :

':?'/ на устойчивостьживчвков призаморажкваник и оттаивании. // 1 V

■ ■ о- „Ъг;.1 С'"¿'.с -У Показатели качеств« ееыенв после 'е: оРГтаивання 1 ■ "

Режим овработкн темени' - Момекг введення. : глицерине ' . ; ._ , І . - ■': І і" . А 1 . : , ■»,,% живчиков , . , * ; • , . 1'

подвижных ' э норы«ль--- ними акро*,' сомами - «КТИЬНОСТЬ АСТ а пламе

Выдержано 2 часа' при +15°С и: З' часа при +5°С-после^ чего^замо-"-.рожено. > . <-•<• . і:,'■ перед заморажива-/ НИЄМ" г.** -20І5 _ .. . , , ч. ^ ет±и;/

•/Выдержано;, 6> час,/при +15° С, после чего замо- г ■: рожено ; • .' -"'.'Л '". перед заморажива-иием • ■: ^ г.: і. *■.. ; 23±3 / . , - -■/■V "34±2* •• • "г '" " : 65±С

, Выдержано/. 6 час. при .. +15° С, после , чего; заморожено - - . ч при ^ разбавлении .г ■ г,:-," Г 22±4: ; 35±6

ее синтетической средой

С увеличением ^сроков пребывания "жив-1 чиков. во 2-й среде, после центрифугирования, устойчивость их при .замораживании (понижается.Эти> данные со > всей -очевидностью показали, что положительное' действие . инкубации семени на живчиков так, или: иначе обусловлено взаимодействием их - с ■ плазмой семени.Излитературных.данных; известно; что живчики при контакте с .секретами ;добавочных половых желез активно адсорби-. руют катионные белки, которыми- богат, секрет пузырьковидных желез (Х.:;Мур.и др.*Л976). Очевидно,"адсорбция их ведет к ней" трализации поверхностного отрицательного заряда, создаваемого/, 'диссоциацией карбоксильных: групп поверхностных белков, и сна-ловых кислот.';Это, в свою очередь,- вызывает разупррядочнвание мембранныхглияидов, что способствует; механической ! прочности; лнпидного слоя н:мембран в целом. : < • . _ ;

- ■■ У'■ ' " -лI 7 Г:>;:;;¿Н /.:-.

.- *"• •'-''У-- -. Глубокое охлаждение' .-

■ ....•..... 1.;; -.у*,.■ V ;.. ■.■'.!"■■■::.- 'Л- / '

. ^ Зависимость выживаемости живчиков^от режима глубокого ох-'.

лаждения оказалась в < значительной : мере > связанной■ с глубиной ' " с лу ч а юще го ся: ¡пр и: это мп ер ео х лажд ения• (график 4). Чем меньше' проявляется; переохлаждение, тем .выше; выживаемость живчиков, ' ; наилучший .результат бывает,; когда переохлаждение совсем не возникает.* Отрицательное действие тереохлаждения связано с тем, / г. что ■ оно! вызывает: нерегулируемую/ общим режимом : охлаждения; . крайне разрушительную: мелкоструктурную. кристаллизацию. Из-

ттжштжт^щт

тІГь:тШ\ »

ІІІ 20

___________

r . Л? --

■ 1 -і '' і',: і о

Ч'Ї'Ш-х

W і

І 2 З 4 5 6 7 8

2 .", 4 5 6' 7 8 9 '

; ^ .чг;:. . Й-"

г ■ .■ ■ " — : ■■ " -1-1 ■■■■■■ - і ■

■': ; ■ Срок от момента разбавления (час)

^^УІІТІТП

о.

4 5 6 7.0 9

i-j

.- г^ ■

График 3. Действие режима охлаждения до 0°С на устойчивость живчиков хряка при. глубокой охлаждении. 1 — подвижность (а —сразу после оттаивания, б~ через суткн после оттаивания); 2 — % живчиков с нормальными акросомаын; 3— ак-

*•• тивноеть ACT в плазме оттаянного семеїкі - • '<'.' ?

to ЄР

Т^шературас-. '

\ У'. -■■■.,- 'г» -—: г

-Л,.

■'. ; " ■ " "Л" ?—Г" '..•'Время охлаждения (сек) ; . г'; "■'■ ■ График 4.* Действие различных режимов охлаждения семени на восстанов-. ,. лен не подвижности после оттаивания • • -"■■■ •' -Л . Процент живчиков, восстановивши* ■ подвижность после оттаиаання: ;:, ■ - ..у

' -1 : --------'Г '.і'г:1. ¿'т.- V"':'

................0 , . ■. -.1>:'- ; V,. ■

-.10-20 ■■>,'■■■»

. - 50-60.- . ..- 70-804 г

' вест-но/учто™в^^чннз", кристалл оЪ гпр)г'образованин^льда! зависит от скорости;; Ьтъвм а ^ те п л а ~ Ч ем^ б ыстре е ^отводите я ; тепло,/;тем ^мельче ^образующиеся кристаллыОднако* случающееся ттереох-" *л ажде ни е - мож ет значительно1 на руш ить^эту зав иен м ость,: Переох-."/лажденная-шЫкос^^

"."'то 1по я вл е н ия/п е рвого' *кр1 гсталлн к а1 л ьд а; и- будучи спосо бн ойм о-;-мёктально отнять.большое'количество'теплоты, независимо от об; V Ьцего^медленного 'режима' охлаждения всегда вызывает моменталь-, нуго, ::а-следовательно и1 мелкоструктурную 'Кристаллизацию..1* *; .

.¿.Тешеразура^ .о^ьлиСДЧП .Н' ут->

^¡¡г;^^^;!:-^.<>;.■ ■.■-п.". ^(¡ут^^.Г'п ■ 1?-

■.ггэмс' гм¿х^х^о;;: .•. •.•..>••..:л-:: '

.!, „ - !. т-л ... ____. ' . . . . .. л ' - ' " ' ". >Г

>Времз;иагревавзш;.(сек);<)■ ■ V,,,-.- —г■;■

• ^' г > График, 5.Действие реззша оттаивания семени на выживаемость

•'' *.. = .■ • "живчиков. т,...'... *■ -,-' • •

V- О'™

.'■■ Процент, живчиков восстановивших подвижность "■.* г'после оттаивания: • л 1

. Ж^т.^^тс, *;!;•/л,-.'уу^

— ч»Р1 -II | : г • т

■ -;10г20

5(>бо

• - 70-80 •.., . . .. •■..,.'.

■■г'" ' ' ■"■Ч-. ^ . '" Вместе с ,тем, данные показывают, что выживаемость живчиковV

■ з ав исит; н з о г, кр иво й; сн ижен ня.'.температуры — наилучшая: выжи •

■ ваемость':живчиков бывает,;;когда; охлаждение:идет равномерно. . .ускоренно ио кривой, близкой к параболе, и когда время охлажде-:

" ния от;+4 до_—196®С;не превышает 3:мин."В этом наши данные . ' пол ностью подтверждают : выясненную ранее ^зависимость выжива- -• емостй ^живчиков - от режима т" -'охлаждения (В."|-К.,;Милованов,;

■ /Ф,. А;; Баранов,, 1974)., Однако решающее значение переохлаждения Для выживаемости живчиков было'обна ружено вп ер в ые." . ..

- \ Одним , из.'средств ; предотвращения (переохлаждения ' является 4" , ^ а м ор а жн в ан и е, сем ениЧгр анул ам и' н а су хомл ь дуй л ин а охлажден-/

т ной поверхностй.,Переохлаждение здесь исключается тем, что нме-^ ' *£тся* болшюйперелад.температур* на ^границе; жидкой части: гра-; . .. нулы и холодной щоверхности.; В то .время, когда'основная масса , " ' -семени,имеет температуру выше точки затвердеваи и я,\ и а.холодной .

■ поверхности. образуется тонкая,пленка;льда, служащая!затравкой'-.. ~ при начале кр ист а л л иза ци и.З а м о р ажи ва ни еиа охлажденной фто- у

■ \ ропластовой пластине (по Н. П.Ющенко, 1968) на наш взгляд,'. .'■■"■. более приемлемо, т.- к. при этом имеется возможность варьирования. режимом снижения температуры - исоздания - оптимального."

.Для этого нами было сконструировано специальное устройство, * ' позволяющее лоддерживать постоянный; уровень азота в сосуде. .

- ; ЛОД охлажденной пластиной и таким образом'создавать стандарт-.

■■;: .(Ные условия охлаждения.^ : . *;; -У: ■

у •'• ! ."^Оттаивание семени'. • '51 \••- ~ ",

V! л." Специально 'прочведеиные исследования ^выявил и, .что для вы- :

■¿киваемости »живчиков: режим отта и ванн я.нм еет, «е, меньшее зна-г чение,'чем режим замораживания..' - " ^ -'

■ Данные- графика 5 показывают^ "что наивысшая выживаемость V создается," когда' обеспечивается максимально! быстрый; подвод тепла, но при уелови и , ' что темпер ату р а ; теп лоносите л я не л ре в ы- ; шает физиологических пределов; т. е. 42° С. : ; ; > ^ - . -

; При- оттаивании ^семенимыгобратилн : также внимание .на то, что^после расплавления первых порций семени в,сосуде длитель* • % иое время находились две фазы: ,жидкая и твердая (еще не рас- : ■таявший лед). Образовавшаяся жидкая фаза, служила теллоноси-; уел ем,коивекционно. перемещаясь от'нагретых стенок' сосуда к ;у • 'еще ¡нерастаявшему семени,' что неизбежно.связано :с многократным ее нагревом и охлаждением. •'..у " 7> / * ' ; ■-■■'.■V Кроме того, конвекционный1 перенос .теплоты замедляет нагрев : . > • в сравнении с контактной передачей/ Естественно, эти обстоятель- ^ , ;' ,ства отражаются неблагоприятно на;выживаемости живчиков,-вV связи.с чем/намд были сконструированы специальные устройства, . , обеспечивающие,в процессе таяния-семени.немедленное отделение \ .образующейся жидкой фазыот твердой, так что нагреванию по-.стоянно подвергалась только твердая фаза. '. •

; . Результаты осеменения свиней при испытании отдельных т. ' ' * элементов и вариантов метода замораживания семени : .

"■■ -.'.-Г;:-*"^","-',^-У*.;!'V ^ .¡'о ■.'Ь--;*' ■ ■ ■■:■■' ,■!./■'..

: Первоначально ,были сопоставлены результаты опоросов соя- ■.'■,. "; л од отво р я емостью. Сэто йцел ью было, осеменено 40'взрослых ма- 'у ,ггок, 20.из которых были убиты на 2-й и 8-й дни .после осеменения, '

а ! 20 доставлены: для опороса.: Результаты исследований половых путей-маток*, и опоросов приведены, в,таблице-10.' Опыты-проведены совместно с Н.-А,:Голышевым и Э. Л. Хачапурйдзе.^ ' ■ ; "■'

" ■- -: !-' " : • : •• '■',.■ Та блица- 10

-"к' . ~ л т ■ Действие осеменения замороженным, семенем ■ * •;*** » на оплодотворяем ость н эмбриональную выживаемость у свиней Д, -

Сроки от осеменения - до исследования -половых путей яла до опороса - Осеменено г *. маток .■ 1 -. 1 Супоросных. Среднее -число желтых тел и» матку Средне« число »итог, . мест имплантации -: ИЛИ Поросят ЦЛ ' у.'., м»тку ...

и ЧИСЛО

..л"'' ■ 1. 2^-'-10 . 114 : ' . 8 '.''Г 12 ■ , 20 '. ~ 7; . }'■■ ю . 87 : .83 ;зз.. :: ■ 14 : и - < - - г * .V .. • /,•/. 13* *. -. V* ' 8. о 'Г- ' - • V*

Данные таблицы 10 показывают, что'после осеменения замороженным семенем оплодотворение наступает у значительного числа маток>из осемененных '(87%) даже: при "использовании -метода^ который^обуславливает^ опоросы-лишь в-33% случаев. Следовательно, снижение - результативности 'наблюдается: лишь вследствие повышенной эмбриональной смертности/а не из-за отсутствия оплодотворений. Это тюдтверждает н тот факт, что среди вымытых зигот от двухматок.в,трех ^случаях зародыши .были с разрушенными бластомерами. Такие зиготы были,взяты от оплодотворенных яиц.; Это объясняет до "некоторой степени парадоксальность зультатов,-которая, по-видимому,^ обусловлена не ,только* сугубо статистической вариабильностью, : Процент оплодотворенныхг. яиц наЛО-й де ньок аз а лея; в ы ш е,.ч е м - н аЗ-й/ хотя и .у меньшего? числа маток. По-видимому, эмбриональная смертность на стадии зиготы встречается чаще (у животных с. низким ¡- процентом оплодотворен* = ных яиц, <т. к. только это .обстоятельство позволяет^предполагать, чтов оплодотворении -у - этих \ маток , участвуют. биологически. недостаточно. полноценные' живчики,.. дающие ■ также ; неполноценные зиготы, :В результате зиготной смертности.такие маткн становятся ХОЛОСТЫМИ, поэтому В стадии бластоцнты 'Процент; супоросных ОНИ*! .жается,; а среднее^число зародышей на матку повышается, ■■.. : • г:гВ. следующем опыте; шг результатам опоросовбылнсравнеиы различные способы замораживания и оттаивания семени.; . : ■<;> •Данные; таблицы - 11"показывают; что »результаты' осеменения почти в одинаковой'степени-зависят; как от способа1 замораживания, та« и-от способа оттаивания. Результаты от семени,'замороженного -гранулами, были значительно- выше, чем от сем е«и, замороженного в'пакетах: Особенно значительно результаты осеме-' нения'зависели от способа оттаивания/ предлагаемый - нами прин--цип'максимально 'быстрого'подводатепла^и, отделения,образую-

"■'' ' lí'ii'f Мш^Кй^ТлЗтт ij'ViTT.'ír.V!"^'"1 .ii'-^i r.V'',.: *: * *; Ta блица; 11.. -'/

, *.. ; Действие*различных ■способов'замораживания ■ и оттаивания ■': --- ' , /

семени хряка на результаты осеменения (среда V, раэ^впеяие :: I

CT-..S г;. -. : •: Т ;■'.-Способ эаиоражя-- вання * -Спосйв «ТТ»ИВв«ЯЯ ' 1 ■■ S V Опоросы 1 ' ~ Поросята

* ' - ы а « й-ж 2 ■ - Se as -

'ií Н r-í ■ - ЧИСЛО; ;у ■

. ■ -TV. V, -с.у.' ■ Грануламя в сухом В сосуде,' нагрева е- 19. ; - 9" i 47± 12 73*, 4 ": •

. льду■ • ' мом в'воде при i ''' ¿ 1 - V-.T" '

-42° С • ■ • • —

Yate же ís. '■■■ В • . специальном : 29 i9: 66 ±8 164. / Л '. 9 -

' ' ■ - г ' Л ¡ - V f ■ устройстве ^ «су- t-. ■. ': J '

ч яим» методом ' V * • ■ ;: ■1 • "'

В алюминиевых па- В Выстром. " токе ■:. 20 • 6 33±10 : S5:' '■. 0- 9

.. кетах с помощью' поды при темпе-

. слеп, устройства ратуре " ' ' " i,'-- ■".■ ■■

■.L

-' .Щейся; ^жидкой фазы ■от- твердой обуславливали.наивысшую^ ре-;, .-'г.; ' аультативность осеменения! При -сочетании оптимальных: вариантов ^ / замораживания; и оттаивания ' результативность была .• маивыс;'. , ; шей — 66±8% опоросов ОТ.первого осеменения! . ' - ' - V '1.-"

,',.'■"., .::.:. • .'»:>•>: .гг^'^г'-л'-гг --^" тгу;; «'■■'...v:

* ' ^■ ^Действие состава среды при замораживании семени у:\'., "у хряка иа результатыосеменемпя ' - ' !

: ■ оч Данные та^лицы "12 показывают, ч^'^результаты осеменения ■ маток,'в значительной степени ^'зависят от состава среды,.нсполь-: зуемой для разбавления. ВнДовая ^особенность семени!хряка 'про- . 'является'-'прежде всею'(¡в-том/?что;защитные ;-сво?ктва;: простой / среды?!(1),'состоящейиз сахарозы; желтка куриного яйца « тли-' ' ; церина ^см. табл.'Т) ; явно кедостаточны—^от семени, заморожен-" /:

■ ного ней, ■получен 'крайне виЭкий'результат осеменения. Извест- V ■'.'но,*'что:аналошчная1 среда^{лактозная^-'получяла^амое-широкое V

. распростраябкие^ри-замораживаитян^-семьни быка,"-как о беспечи- /','; ' > веющая'впалне достаточную 'защиту"живчиксв. ОчевнДно,' что для ' .

- семени -'хряка .необходимы ^ среДЫ,.обЛадак>щие' более широким"-

■ ■ спектромжриопротекгивного воздействия;на ;живчиков,.чем,у. про-

стой сахарозной средыл Данные показывают,' что результативность У

- осеменения, возрастает, когда в состав:среды для замораживания . ;. дополнительно вводятся ■ факторы, раз упорядочивающие - мембранные липиды.живчиковги.факторы: стабилизирующие Г рН при ох/ лаждении.{III, XII,.ЯШ,..XIV — см. та<5л., 7). Некоторое.

повышение, результативности осеменения "-достигается и-, введением , , В;среду(анпюксидантов; {ХУ), Имеется?также положительный .эф:; V '* фект « от сочетания моно^«-дисахаридов,[очевидно,¡учареднякице:-

30 ; ■.:*:".■;.У/;-'' У :;.- Ч"';'у У;

го гидратацию отдельных "структур живчиков', и уменьшающего

~ V ^У-'' '/Действие различных протекторов*для семени хряка - :- -. на результаты осеменения свиней замороженным.семенем . ";,.

I . ' - V ■. ^ . ' " і ■ ■ . Опоросы ■ : Поросята : і > ■

, 'Среды"; : '»г - 1- Основные компоненти среды . Осеменено маток число ч .' - ', . *' : і . п .. • Я ні : ЦТ . * Я

/ Сахароза Г."' ■'♦ . .""/' 30 23 ¿8 ' 59 - 7 У/'

. т. - III:.: ► Л "'".V І. ч -'//іу- • 'Л - 1 і "Ч" р- ■ г Сахарова, - глюкоза;' ЭД-; ТА,; оксиды |. кальция ^ и; ;нагния.^'. ' ! І Лактоза,*., фруктоза, с ЭД-. (.ТА, Vкальция ,нг магния -.'оксиды г;. ^л :22і ■Яігу-ь ^42 >: 'у.уЛЛ ІЗ' ЇЗО': Л ■ і кі / і. '■'(І V " Г 59ІІ0 *: 7І±7 ш- 250 * о', V 18Д: •т . ' > .', і" .

• •- г ' • і-^,.'. •;,• * г: VII; ч» г. - ; -¡Сахароза, - трис-ЭДТА/ ' сульфат , аммония /, /Сахароза/"!глюкоза, .ЭД-ТА-трнс.-, аммоний,, цят-. •'рат ; ' ' 190* ■Л'-І.У}-лі'и-Л ■100/: ■ і » • 101;' - і.1 ./¡.-'.і * 33 ' " - VI* ;''53±4 ; 884 ь у 1 ► її , 318'' .г; і'.-с '... • їіі.4

.. X. У+глюкоза/ /.. . . к<50 ^ ;15 ' 30±7. -136 , • 5;- Л» Г

"Г* XI.': У+глюкоза,фруктоза/ Тез' 53І5' Р.,- 7445 ' •'8,4. •

У' XII ■ ' Сахароза; - много> буфера трис-лимонная кислота 'ж: "І ^ • > - П ". 24±С ¡02'' и'. шш

• XIII . Сахароза, глюкоза, фрук-?■ тоза,., ЭДТА, і.... оксиды * кальция;и:магния,)нейт-, . рализация гидроксидама '. натрия и калия " . ; "•'. д'ііїі; Ї2€І!' ■І ■:*.■_!! "71''' : о:; '" 59±5 ' 665/ . , ■ ' " ґ 10 ' 9;4 .у,:;..;

¿-XIV : ; Как б:ХШ;;но .сахара:: ''лактоза, глюкоза/, галак* . . тоза / ^ '•// .".'./ ■*І4 "-V • / і; :0 : ' .-у.""; -9,6';

~ XI+антиоксид ант./. '74' ім; ГбС±7 ,457/; і'.і. ■ . .¡¡у!'.

У ./^/^Результативность осеменения семени,-замороженным.;'-^':':; в концентрированном состоянии^;

'■с .-'с г,^",'; г' г -.;: г. 7: ^: ■■ г. I•'/-■'^¿■•лт . •.;.->■. 'л'ху/Л

-Второй^ метод^заморажнвания/у-семенигс концентрированием,; включающий 3;Х^моментное7разбавлёние, ]был/ испытан;с;Ввёдени-} вo,^в тор у ю;. (л а к тозну ю),1Ср ед у ■ до п ол н и тел ь ных.ком поценто в: антиоксидантаг. ЦрТт н ласты' и

ОЭГ 1„/ широко , разреклам про ванной', . .на:Западе';в качестве «риопротектнвного. средства.////." /.. ; ^ "-:/;>■' ■ -г;Данные^ таблицы >13- по-каз'ывают,. что..' введённе5..БОТ.*©среду/ длягзаморажлвания концентрнровэнного семенн-не^оказывает,по-;

_ С':.;:;:;::^:. '^уг?; 'Таблица' 13:

,1 . • Действие введения БОТ н ОЭП в ереду ярн замораживании -; ; ' семени в концентрированном состоянии 1 "

''-Ч.-'5 с ''■*-. -V : на результаты осеменения . "■,■-'. '.: , I'г ....

Введенный в сре-— ду препарат

Конаентраадя 'г препаратов в сре-

Осеменено млток-

Опоросы " ' " I ."■ Поросята

число.

многопло-дне

бот. ' ', ; :

оэп-.

: ; 0. ~ > ... 30

О - -500 ■■

:53 55 •

1--22 27 V

| ^ 23" ^ • ; .25

.12 -12

' 43±7 46±7

1 55±10 44*10

I 226:

.'■■■ 223 "

- 130. 139 ~

^ 10'

: г;9

.12

ложительного эффекта -в противоположность тому,:что исшльзова^ ние его при замораживании семени ' без - концентрирования дает'" значительный эффект (А." Г, Нарижний, .1978). Такую разницу, в действии БОТ, видимо, можно ^объяснить, во-первых, высокий концентрацией желтка в среде,при. замораживании концентрированного семени, который .'конкурентно связывает БОТ своими липи--дами,1 не.позволяя таким образом,проникнуть в структуры мемб-* ран, во-вторых; меньшим ,; временем и низкой "температурой, при которых происходи контакт живчиков с БОТ.Известно/ что то и другое снижает интенсивность-'Проникновения БОТ ' в* мембраны .живчиков; ' . , , ... '.?' ' •.' '. ' •

Препарат ОЭП :-также, вопреки нашим ожиданиям''и данным! других исследований; (В; Пурсель.и др.; 1975; " П.'- Вестендорф,, ; 1975), не только не повысил результативности осеменения, но-даже понизил ее. ; ' - с5Л ' .'■'•.•

!: - Значение отдельных физиологических факторов; ■ : ■.;., . V. .'-*■■; ■" при замораживании семени. ■■

'...'■ Исследование влияния различных-физиологических "факторо»-на;устойчивость живчиков.при ' замор ажива-нии выявило, что решающее'значение при этом,'имеет.режим взятий семени от производителей. Удовлетворительная выживаемость- живчиков при ■' за— моражнвадии неконцентрированного , семени получалась = лишь :в . том случае,. если-.интервал - между .¡эякуляциями, был 5—6" дней. Особенно снижалась, устойчивость; живчиков * при, частых взятиях.* Вместе с тем, выяснилось также; что частые эякуляции/неблаго-, приятно'"влияют; на устойчивость' живчиков лишьгв том случае» если 'замораживание семени ;*проводится.:!в !неконцентрированшш; сбстоянии.'Предварительное концентрирование живчиков с полным удалением- естественной плазмы «полностью устраняло отрицатель-," ное влияние ^астых'эякуляций.' Этот факт, ■ а также прямые опыты " показали; - что: при напряженных: режимах.1 эякуляции, сущест-Ч венно "изменяется :состав' жндкой части семени: происходит возрас-

/тание.концентрации.электролитов, ^что,-видимо,обуславливает

снижение устойчивости живчиков. С;- -,л ; ^'" - • *; ,;

- .« - Второй.важнейший физиологический фактор, от которого.зави-; сит сохранение биологической . полноценности живчиков .при глубоком охлаждении, г—'это ^условия - лор мления,'.причем,", влияние - их" порой было не; меньше;: чем "отдельных технологических факторов,-Как правило, .высокая'"результати&ность*осеменення .замороженным* семенем г/получалась-в томсл у ч а е.когд акор м л ен и е .х р я ко в производили фнзиологачески^сбалансированнымн: полнорационны-, :;.' ми' комбикормами. ■ ■'.. ." Vі' .'-.V ".' -.V;*,";.'..■;■'■

; •, Действие рационов кормления хряков-чіроизводителей' на результаты осеменения1 маток' замороженным* семенем было испытано в шеци а л ьн ы х' опыта х, |где; сем я ^зам ор ажи вали с применением среды III. (табл. 7)." " " -- .. ..

::'Л ''*' Г ^-"'г';' '-.'.-^Л-

■¡-■„Г I. " !■■ і^:''' і..'..' "' ' ". Таблица 14

' Результативность осеменения свиней замороженным семенем ;;

' .* *■'■ 1 ;; ;.:*;г]! а связи с кормлением хряков ■._'..- ~ _ у I- V;*;.;'

,„.;... ... - - - Опоросы - -^ч-. Поросята - - -- -.. і. ™

- Ск«риливаемый.. .комбикорм._____ Осеиенеко _ меток.. ЧИСЛО -■■ ■ —-< живых "' всего ;" мертвы* ' И УРОДОВ нногопло- :,іДНЄ ;

КС-З.л . .;'•'. . ; -' * >7 19 Г. 7" 12 :• ю±и. ' ¡07" . '.'о. '.'эТ'"

К-57-2 . .:, . ■У 37 - 29 :. 78±7/ 244 ■ 12 ■ :8,4

Эксперимент ' 1 ВНИИФБиП \ ' ^ ~ -44 : 34 " 7Т±7 ; '292, ' ■ ! ■■'. з <-8,6

Всего_ ..1; ..І'іоо"' * 1„75: ;". . 15 . 8,6

* ' | • 'Ч- і •'

'.«¿'.-'Данные таблицы -14 показывают, что результативность осеменения в, связи с.составом, полнорационного.комбикорма для.хряков ;-"-■ одинаково ;- высокаяво всех, случаях. Видимо,'; для ^устойчивости,;: 'живчиков при замораживании .имеет .значение, "полноценность пи. тания -независимо отнопользуемых.инградиантов. ; >

* 'с'-I Испытание отдельных: антиоксидантов * в составе сред для'за- -; ' мораживания семени выявило некоторое защитное действие токо-* "'■,,-

ферола. Это послужило основ-аннем для изучения возможности по-■ "вышения концентрации ^токоферола: в живчиках путем. увеличения его в рационе хряков. Исследования,'-проведенные в зтом плане, С : показали, что7пятикратное-увеличение витамина Е'в рационе, хотя и не вызывает- статистически;достоверного повышения концент-. у рации его в: живчиках, но' приводит к существенному увеличению

их:живучести*и устойчивости «при замораживании. Г ^ П -

> -м*::-:- .. . - ^,.<-,>:чслаг . ->,.-??■-*•■ .-*» -.г.-. '.пгл-'

Ч-- — -..'- .. ... ; ■ . •. V, 33 ..

;„ Результаты испытаний' метода ■ ВНЖ Яркими; учреждениями * /

** Оптимальные' вар и а и'тыУ м етода ':з а м ор аж ива н и я н е концентр и-у У рова иного - семён й,и, 1гзложеяные'вышё':(разбавление'средами 'XI, -; ИI/V;'X!,гХ11Гохлажд ение'до-4-5°С в теч ение б'часов, заморажи-• ,У . ван негр акула м н1 н а 'суком льдуилитаа; охлажденной фторопласто-' У 1 вой ;'|Пласт5гне,,1;оттаиваняе"«сухнм» !способом)Чбыли испытаны: в сравнении ¿'-методами'других авторов в разных научных-учрежд е- -- 'ниях как в нашей стране,' так я за рубежом.1' 'Г.-'".

■^ЧЧ": "У" Ул'']Ч ^^.Уот^с^с^г-.у ;УУ:-;Ус;У:; ее :У'!Ч: ■ <У --т.£ ®ЛV

Ч V * '»* 1* Ч''; л*.!•] 5 1 Сравиение- результатов: осеменения семеием 0 7-. ^ 4 Ч .,:;■' ..'Ч-.^ г/сг.'.'Уг*. замороженным различными методами . 1. •;,.,, *,. "

\ - ' ' ■ , ч •■ . Опоросы ■ .v. i ; . i . л*

JA п/п V; ..ü J- . ' ч ; Метод .. r.i .-. Г" '' • ■ Осемеие» 110 Н1-Г0К - число . % ■ Источник информации," j публикация .

1 / ВИЖ '■■"-:- .;.',' ВШШРГЖЧ . _ uAÍ.'-I- •■: гМ 7 -А у; .":. ::"7Ó'±j5' _52±н; п" -■ Т - - ■•---l'í - ■■ ■ Н. В. Корбан и соавТч 1Э77.._.. . _

427 вижуу. ~ ;120 г / 76 7 - 63±4.. Д. Шмидт, (ГДР), 1979

^иж у уу.. V: l.y : 5S ; : ео±5 К. Мудра, (ГДР), 1978У

" ' 4". :'■. f, Б«лтсвилский (США) . ... 528-.: .:! '•'Г|- - ; 33±2' Д.; Шмидт и соавт.Л- ГТ.;" 1980 - .

Гюльсенбергскнй. (ФРГ) - . У ; 55 ; 36 - .. 65 i6 ■ ' ■ У.,;

виж. • ' 120 ■ • 76

■ • • 5 виж - . ..; 79- 58±6 Я-'Коцумплнк, (ЧССР), 1980 - • ...

Ч:. "-*■;■ Изн данных, таблицы:- видно,г что^ по нашему: методу у .-других, авторов-получается "результативность осеменения на одном: уровне ; • с-методом ВНИИРГЖ и Гюльсенбергскнм,: но значительно- лучше: ,у„ в;гсравненииус 'белтсвилскнм- (США);;.-Это „вполне подтверждает> У ' • наши собствен« ые д а ни ы еоп р а ктич ески' n р нем л ем о йр езул ьта т ив - > , i . ;■■ ностн.осеменения, которая ^вполне восяроизводима . В : опытах -Дру- : ■ .• • . • гнх исследователей,; _.• ..V , ">:,.Г , .Ч ...ЧУ-У,:'-'/..'- .

'- : • .-: Качество потомства от замороженного семени.; . _ .

'У,, ; - Широкое практнч еское- исп ольз ов ани е , м етод а з а м ор аж ива н ия -\ семени, хряка требует гарантии,,что полученное,при этом потомст-'У во -- интактно - в . физиологическом, и , генетическом У; отношениях. , " •В связи с;зтим:в';самых.первых адотах/мы'-фавннлй.массу^поро- Ч сят, полученных от свежевзятого и- замороженного семени: при • ;

ГП'У

рождении и в возрасте И мес.' Выяснилось,'!что поросята от замо*. ' ; роженного' семени были 'даже тяжелее* при р ож д єн нн: (У ,4 9 кг про- У

• " тив'1,3-1) нЛучше-развивались (масса в'Ф мес' возрасте*'5,51:< кг- *

- і против 5,01)Л ■ 'i-w.^s'-.i. і.'ї.гїл.уґ.і:, /<;:>с.,-::' ■■■■.. ■. ■-

„ • ,'" '".¿і'."Кроме .ТОГОІ1 С ЭТОЙs же целью было* отобрано 10 хрячков среди-;.. -."..■ потомства, -1"; полученнога - от^ - за мороженного гсемени - !в т- к-эе- :

• ' нм. М. &:• Фрунзе Белтородской"областн, которых'в.'4мес.*возра-' V сте'перевезли на ЦСИО в Московскую область.-У-7! хрячков уда;- лось "выработать ''условный' половой рефлекс - на < чучело'свиньи ■ V

у.:- к от них в течение'2 лет брали семя,'используя вг опытах. В про^ ■ ' . цессе работы с ними!было выяснена,'ЧТо хряки обладали-высокой, ■ / '

воспроизводительной; способностью,; по ^показателям j которой - они. ,': не. отличались ,"от',і своих , отцов^ и ' других ;хряков,., полученных ;'.от..-.,-■ Г естественного спаривання./0цеыка:71сэякулята; от,'7 хряков, дала * .*" следующне,;характеристики!эякулятов:-о^ . .

•"> цектрацня живчиков—* 285 ±:20 млц/мл^живучесть^разбавленнога . при:16т-18° С— ,50±5;>якулятов,>меющих:тюсле 'замораживания - / > не менее 30% подвижных живчиков—6%;. супоросность/от> • 1-го „осеменения^ замороженным, семенем—52±9%, Соответствую--' ' ' щие ? показатели" эякулятов : хря>ков,,:полученных от'ёстественнога

• л спаривания 'были:*" 200dr6 мл, 245±6 млн/мл','' 65+8,'54±8%; •

■'""■■50"±4ЧЬ*'',J 1 ** "і':.:*'";«'^'-'-^J;-»: V-ЇЧ . -

- .Таким образом, очевидная ннтактность, одной .из важнейших.: , -, ■ функций — воспроизводительной и нормальное развитие'в эмбрио- — нальный; период и впервый. месяц'жизни не"оставляют!сомнений.. -. осноснтельно пол шценностипотомства, :пол учен ного'отзаморожен-- / ■ . ного: селі єни,0 во "всех 1д ругих отношениях.' 'і^чіг^-;-'

-■■ <-pup. v vu;-:," ' .; ■■■••■

' - ;: гг;і-і ..". г.-4.-';.:'- н^гллг-,. J.1 ; : і:е.. > .ч;. •..:',' " -

, V •., ;ВЫВОДЫ • і

1 . Длительное>сохранение биологической, -полноценности; жив^ ' чиков"хрякаможет-, быть;осуществлено с. прнмененнец! технология, замораживания, учитывающей видовые особенности, семенив,'лк''• : Устойчивость живчикові при зам ораж ив анад. значительно за-. / ' ;

( / : висит "от надмолекулярной .структуры, мембранных л!іпидов:"она" ; :'" v повышается, со' снижениеы .'параметра! упорядоченности лнпидов.

Упорядоченность Д мембранных , "липндов снщкается*: после " Y ; криопротективного разбавления семени, «о у живчиков хряков зна-; ' чительно меньше* в сравнении с бычьими, чем очевидно обусловь ' ' ' лена меньшая устойчивость первых при заморамиваїщн. ^ -

: - Упорядоченность'мембранных "л ни : с' умень-, ,>:• ;

• шеііием поверхностного 'отрицательного'заряііа .живчиков.'В !свя;; .

■ ; зн с- этим компоненты- среды; *; 'деионизіірующие" карбоксильные-,

н др. анионвые группы поверхностиыхЧголнмеров,: например ионы кальциямагния/ повышают устойчивость?живчиков^^ прц-эамо-^ '; . ражнвашш. / ./ - -■„■>■■■ 4 v* •

■ '■. У:.':- ■■■Д .,35.' •

' '.с Охлаждение вызывает снижение ^концентрации водородных лонов в^жндкой части семени н^ ; * ления;,снижением /температуры констант - диссоциации кислот. и ": ; щелочей, соли которых входят в семя' в. высокой концентрации.! ■ Такое ,изменение рНотрицательноотражается на.устойчивости живчиков при заморажнвании.поскольку смещение реакции сре- : * ■ ды (В ^щелочную ■ сторону повышает ^поверхностный - отрицательный * >

- заряд,-а следовательно;и упорядоченность: мембранных липидов.1'- :

V ' В связи .с этим, для усиления защигиыхсвойств среды, в нее еле-

дует в вод нть: компоненты гСтабилизирующие'рН .яри, охлаждении^ "''I / например, ^аммонийные соли; сульфат или цитрат., -'¿.у г >">■

■ : 6;-В .разной степени гидратированные структуры живчиков при

V охлаждении ниже -М'С расширяютсяс разными объемными коэф- •

. фициентами, что является одной: из'причин« криогенных разруше-" ; • - V- иий: живчиков.' В этой - связи ' защитное 'действие "неэлектролитов, ■ * особенно-глицерина,'.отчасти'обусловлено их способностью усред-,;.^

- нять объемное расши^нне отдельных структур живчиков"пр11 ох- :

" /V' ;; лаждении ниже- +4°С."V- 4 ум. . :. г. '.. , •.'*. ..С':.- ;;,'

■ ^процессе технологической'обработки 'замораживания семе--ни хряка в нем снижается .содержание активных восстановителей:,-;

- - аскорбиновой;кислоты," редуцирующих Сахаров; ,что ослабляет-за-

У ." щиту живчиков от окисляющих факторов. В связи с этим введение; ";■ " "'" в среду слабых антиоксидантов:- Б ОТ, ; Б О А, то кофе р о л аид рпо-;

- ■ ■■ вышает выживаемость живчиков при замораживании. 'л: ' 1 1; ;;.; •

/ , 8.,Олтнмальные условия для.выживаемости живчиков создают; быстрый'режим замораживания ^обязательным,предотвращением ''V; явления переохлаждения; способ оттаивания с максимально быст-У

■ рым' подводом тепла - и. с - немедленным отделением • жидкой . фазы . - ' по мере ее образования от твердой. ч' • ' • / . . - , ; . ;

" -9, Сбалансированное .кормление:'хряков, а также увеличение

. ; Витамина^Е;в; их:рационе, повышают, устойчивость живчиков при ;

■ ■ - глубоком.охлаждении и:соответстаенно результативность осемене- „ -. ния 'замороженным семенем. ;й! : ^Лло^лг.У У ^'УЛ-'УУ ■/,

0.П ом ере'у м еньшеи И я ¡1 нтер в а л а', меж дуэя кул я ци я м и в пре- '

- делах;' 5. и менее !дней" снижаются живучесть," резистентность 'и ■',*■ к. особенно устойчивость'жив-чйвдв при замораживании; чтсГвызвано -У;

- существенными';изменениями ^химического состава жидкой- части .

; семени," плавным 'образом;.нарастанием концентрации гэлектроли- ; '■■.■■ тов.'-з-':--о г':;'}: .! л;>,'.'. ;; - • •• •.•",•.•.• •

^ 11-, Потомство,; полученное; отз а мороженного * семени,^ хряка',

Г обладаеУ нормальной воспроизводительной способностью л полно- / ■ .ценно во.всех'другнх отношениях.' У''у " : ': .

л ; * . 12.* Разработанная-технология .замораживания, семени.хряка с; ' ;; ■ высокой , эффективностью ¿может -быть исто ■■

- работе. " -V '-;■-;-V-,'; '»V:. ;"л-; : *

>:'Гиг£.{;я::т7с : ' гЛиго. Практическиепредложеиня ■

' -" V* ;' чГТСсО -. -у^У;.. < ий Л-' 4 - ^ Г, - -'' - " з ^ ;

./г;.1,.Для.ускорення;,генетического отрогресса „и ..массового" ловы-. V шення продуктивных'качеств^санней предлагаем нспользовать ме-- тод длительного храненияЧеменн хряков'в замороженном состоя-V .. нии.

¿с;- 2,!;:Для /повыщення;в*ыжнваемЬстн жнвчйков- пргг заморажива- / ; . нии и оттаивании ' предлагаем;новыеэффективные средства ;и;при^":'

■ емы: в качестве компонентов'криопротективных' сред использовать'

' /■ оксиды' кальция й магния, .лимоннокислый, аммоний,смесь--моно- .'■'/ 'Г.^'Жяясахар^

■ ; инкубациюживчиков ; перед замораживанием' в /присутствий ■

разбавленной не более - чем в2—3 .раза естественной плазмы'в

• • течение 3 часов при 15в С н последующих/2-х1 часов -при- +5° С;

• Ц способ оттаивания замороженного семенимаксимально быст- .. ; рым подводом.тепла.и с.отделением образующейся жидкой' фазы;',,

от твёрдой, а";таюке устройств а с позв ол я ющие : о су ществить этот . -V.;- способ. •';.•/ ' . <:' V-/. V. •••■'

' ' .-„.-. 3.: Для обеспечения: высокой;;: устойчивости живчиков • хряков ■/ при замораживании и.оттаивании предлагаемоптимальный; режим использования производителей:,-ритмичное-взятиехеменй с интер-./■. валом_между.эякуляцнямн/5—7 дней. ; ' .'л .'. •'..- .

Публикации; в,которых изложено.основное ;,;:-.^ '■¿..■лех': содержание диссертации :, .!;;

/,■.■-,': 1*.';Антигенные* свойства1живчиков бЫков. • Докла д ы, ВАСХНЙЛ,1; 1971 IК Соавтор А.*К.- Бутаков/. •".'. \; /^ .. .. ■¿¿..'^Л;/^.

2. Действие, срокОвтлранения: семени:хряков;«а: биологическую , - полноценность: живчиков:, «Технология, искусственного; осеменения ;/„\ и ' биология; воспроизведёния./с/х: животных»,:/«Колос»;. М., 1972. .

:3."Локализация антигенов разной химической..природы в жив- \ *' чнках быков. Доклады ВАСХНИЛ, 1973,'№ 8. «;•'• ''•'.*•-••- ; 7 .-- :';

; - 4./ П ор ося т г^ют з а м орож е н ного " се м ен н. Жнв'о гн овод ства'/ 1973, ' /№ 9. Соавторы: Н. А.Голыыгев, Хачапуридзе.;/ 5лЛ . . 5. ■ Новое в . .технологии замораживания" семени I хряка/" Живот/ , новодство, 1974; №/ 12./Соавторы::В.;К.'"Миловаиов, Н. "А. Голы-.

шев.' Э.' Л.' Хачаиуридзе," В., В. Летяго,/ Г. С; По'ходня. Г / •'.' 1 6. ^ Пробл ема/э ксл е рнмейт ал ьного получен и яо дн оя й цовыхб л и з-

/ нецов." Доклады' ВАСХНЙЛ,1974, №12. Соавтор:И.;И,/Соколов-■ "•;?/ (жая.-^^к^^/ л/',^.":., . -.м/г,:; /гг'";п::> : ^ - - ': '

1 7.- Оборудование для глубокого охлаждения и'оттанвайия спер; мы, „Свиноводство,^ 1975, № 6, Соавторы:; Н. А1 Голыше в, ЭГЛ;,Ха- / .- . чапуридзе. г^Н Л ''.ЛЧготе^сС* .0: (/. - ^

Среды - для :'замораживания . спермы.- Свиноводство/ '/•■' 1975, .//. № 1Ь.Соавторы НА.- Го л ышев,* Л .Л .X ачаш ур идзе. - ^' -

"■'.""'ч*/:■■ ^■'■^^'■'■У-'-} * . / .'"* / 37

.9; Оптимальные режимы .глубокого охлаждения и оттаивания семени хряка. Доклады ВАСХНИЛ, 1975, №' 8. Соавтор Э. Л; Ха- ,

чапурндзс, ...... \>Ч_л../;.чЧ Vi..... ;V .

.10. Характеристика, семени хряков в связи.с устойчивостью при " з ам ор аж и вании' : Доклады * ВАСХНИЛ,"'1 Í978,'№- 8. ' Соавтор : . Э."Л. ХачапуридзеЧ Ч j • ? . : ' 'Y- • .. Ч; ;

V,. 1Влияние ..лолнорациошшх;,- комбикормов, наустойчивость ; . спермйев ;к1глубЬкомул охлаждениюГ ^Животноводство, ,1976, :№ ,7. - Соавторы:' И^ВЧХадаи0вич,ЧВЧЯ^Чер~ных,'^А? К.'Маругин,^ЧЧЧ,ЧЧЧ: * Н.я.'Сорокина;' Н.' -

' V 12 Ч Д е йсгв иетех но л оги ч ескойо б р аботки семей и .пр и -з а м о р аж и-.'., вании на морфологию.живчиков хряка. ,С.х.биология,"*1976,,т.XI, * ;

13. Действие -замороженного .семенн на -эмбриональную, выжи- - ; ваемость у:,свиней.' Вестник с/х науки, 1977, № 2.-;Соавторы^ Y4-.;; ■. Н. А. Голышев.-Э. Л; Хачапуридзе.;:„.V..^ : . ;v. ••. '

■ í 14. Значение слабоднссоциирующих катионов^шри охлаждении ■ семени. Доклады ВАСХНИЛ, 1977,'№ 2.- \V.-.-v\ : ; ■ : . ; v v 5 i- :; 15.: Продукция спермы-ухряков.при* скармливании различных ,. 1 ■ по:составу,полнорациошшхкомбикормов.:Сб. «Физиология нбио-*химия моногастричных животных».:: Научные трудыгВНИИФБиП, Ч Боровск,. 1977, т.17. Соавторы:г, В.'Я::; Черных, ;А.*К.:Маругин, ; .И..В. Хаданович, И. Я. Сорокина", Н. А. Голышев. ! ^ "Ч 16. Устойчивость живчико® к'глубокому ^охлаждению в зави- _

- симостн от :содержания • витамина Е /в: рационе хряка. Животно* ~ Ч водство, 1978, № 1. Соавторы: А. Г. Нарижный, В. Я. Черных v. .

17.'.Выход'трансаминаз из'живчиков';прйгохлажденнн 'как показатель сгал-Ьдотворяющей"способности.биология,-.-1978, "':'.¿ ■ ; т/XIII, № 1; Coa вторы: :Н. А. Голыш ев, А:; Г.Нарижный;;:'1;.." -. :. 18;- Распределение: спермиев гио ; иммунологическими свойствам ' *, в".связн''с: качеством спермы, быков.-Доклады; ВАСХНИЛ,- 1978, .. • №6-;ч.л: i:.;-'.4": ••..:.• :v Ч '■ ■. 4

;.,.., ^ ■ 19. Биохимические причины низкой устойчивости живчиков;хря- .

;Чка.и меры.ее усиления. Вестник с/х науки, 1979, Кг 8. Соавторы:" „■;' А.-Г. Нарижный/гВ-'Я.Черных. ,i< .у

.„ 20г Совершенствование, й^внедрение в"прак™ мораживания*и 'длительного" 'хранения , семени';и организация;.не;; ■ кусственногЬ осеменения замороженным ^семенем;, Краткие; итоги ' ; ■

- научных исследований :;за '1978 год'(Бюллетень научных;'работ, выяГ;59)Г'Дубровнцы/i 1979." СоавторЬ; !Н:"Ад:Голышев,-А^ Г.'На- ■•.

' рнжный,' Я. П.-Брутганс. • 1 г- " 'V Ч *••"- •' " ;Ч ''

21. Нуклеиновые кислоты слермиевхряков' приЧзаморажнва-нни.-ДокладыгВАСХНИЛ;Л980, J4e 7;-Э\;г,т. г.я: . ■

; - , -14,224 Замораживание семени "хряка в концентрированном: состоя-■ ' - нии. Живоггноводство,"; 1981, № 10, Соавтор А. Г. Нарижный.. * : Исследование^ криогенных ¡ повреждений :живчиков) с? по-

мощью 'электронно-парамагнитно-резонансной, спектроскопии; спи- ;

V38 ■■ чч ■ .''ч . .- .^^Ч'ч:-; ч*'-'! '■*: Ч ч ^ч'Ч'.'ч

новых зондов в мембранах. Доклады ВАСХНИЛ, 1981, № 10. Соавторы: В. К. Милованов, О. А. Азнзова, А. Г. Максина.

24. Повышение функциональной н морфологической устойчивости живчиков хряка при замораживании. С.х. биология, 1980, т. XV, № 6.

" 25. Содержание отдельных витаминов в крови н в семени хряков в связи с частотой эякуляции. С.х. биология, 1981, т. XVI, № 5. Соавторы: В. Я. Черных, Н. Я. Сорокина, А. Г. Нарнжный.

26. Тепловое расширение в сперме при замораживании. Доклады ВАСХНИЛ, 1982, № 5.

27. Защитное действие антиоксидантов три замораживании семени хряка. Вестник с/х науки, 1982, № 5. Соавтор А. Г. Нарнжный.

28. Среда для разбавления и замораживания семени с/х животных. Авторское свидетельство № 549143, кл. А61 7/02. Бюллетень ВНИИГПЭ, 1977, № 9. Соавтор Н. А. Голышев.

г >

Л-П5907. Подп. в печ. 10.01.83 г. Зак. 3495. Тираж 100 экз. Тип. НИИмаш, г. Щербинка, Мое. обл., ул. Типографская, д. 10.