Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности мутагенного действия излучения с разной ЛПЭ на клетки SALMONELLA TYPHIMURIUM в условиях влияния радиомодификаторов

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности мутагенного действия излучения с разной ЛПЭ на клетки SALMONELLA TYPHIMURIUM в условиях влияния радиомодификаторов"

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ

На правах рукописи

19-91-472

БАША Сергей Григорьевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ МУТАГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ИЗЛУЧЕНИЙ С РАЗНОЙ ЛПЭ НА КЛЕТКИ SALMONELLA TYPHIMURIUM В УСЛОВИЯХ ВЛИЯНИЯ РАДИОМОДИФИКАТОРОВ

Специальность: 03.00.01 - радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск 1991

Работа выполнена в объединенном институте ядерных исследований, Дубна.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Е.А.Красавин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.Г.Петин кандидат биологических наук С.А.Гераськин

Ведущая организация - Институт цитологии АН СССР, Ленинград.

Защита диссертации состоится "_"_1991 года на

заседании специализированного Совета по радиобиологии А 120.81.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии Госкомиссии СССР по продовольствию и закупкам (Москва, Волков переулок, д.4).

С диссертацией мсгпс ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии. Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 249020, калужская обл., г. Обнинск, ВНИИСХР, Спецсовет.

Автореферат разослан "_"_1991 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Н.И.Санжарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, в связи с глобальным ухудшением экологи-¡еской обстановки, возникновением радиоэкологических аномалий пробле-1а малых доз облучения в настоящее время приобрела особую остроту. Хдним из подходов к решению этой проблемы является изучение законо-«ерностей и механизмов мутагенного действия излучений, различающихся то физическим характеристикам, на клетки различного генотипа. Уста-ювлено, что специфика мутагенеза, индуцированного излучениями с 1азличной линейной передачей энергии (ЛПЭ), обусловливается влиянием факторов физической и биологической природы. Важнейшим биологическим рактором являются системы репарации повреждений ДНК, физическим -гространственное распределение энергии в генетических структурах кле-'ок. Наиболее полно механизмы репарации ДНК и их роль в мутационном фоцессе изучены у бактериальных клеток. С учетом этого обстоятель-:тва можно полагать, что специфику мутагенного действия излучений шрокого диапазона ЛПЭ детально можно установить прежде всего в [сследованиях на клетках прокариот. Особый интерес в этой связи гредставляют штаммы с известной молекулярной природой нарушений :труктуры генов, обусловливающих мутантный фенотип (тест-штаммы 1ймса) .

Одним из подходов к установлению механизмов действия ионизирующих [злучений на генетический аппарат клеток являются исследования законо-[ерностей индуцированного радиацией мутагенеза в условиях влияния юдифицирующих факторов. Показано, что важную роль в формировании ген-[ых мутаций у прокариот при действии ионизирующих излучений разного ачества играют "комплексные повреждения" ДНК, восстанавливаемые лишь процессе гесА-1ехА-зависимой репарации (Козубек С. и соавт. , 1989). ыход таких повреждений с ростом ЛПЭ увеличивается, а их модифицируе-:ость различными химическими радиомодификаторами, судя по результатам етального действия излучений на клетки, снижается (Амиртаев К. Г. и оавт.,1985). С учетом изложенного представляется важным изучить влия-ие различных радиомодифицирующих агентов (протекторов и сенсибилиза-оров) на индукцию мутаций у штаммов с различной природой премутацион-ых нарушений в генах при действии ионизирующих излучений, различа-щихся по физическим характеристикам. Однако такие исследования до оследнего времени проведены не были.

Цель и задачи работы. Исходя из изложенного, целью настоящей работы являлось изучение влияния радиопротекторов различных классов, аноксии и аноксического сенсибилизатора на индукцию мутаций у различных штаммов Salmonella typhimurium при действии ионизирующих излучений, различающихся по ЛПЭ в широком диапазоне. Для реализации указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

-изучить закономерности летального действия излучений с разной ЛПЭ на клетки S. typhimurium в условиях влияния различных радиомодификаторов ;

-изучить закономерности модифицирующего действия радиопротекторов на частоту образования мутаций у различных штаммов S.typhimuriun при облучении ионизирующими излучениями, различающимися по ЛПЭ;

-исследовать влияние аноксии на частоту образования мутаций у штаммов с различной молекулярной природой премутационных повреждений при эг-облучении и действии ускоренных тяжелых ионов;

-изучить закономерности модифицирующего влияния аноксического сенсибилизатора на частоту образования мутаций у различных штаммов S.typhimurium при действии излучений с разной ЛПЭ.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных исследований впервые получены следующие новые факты, которые выносятся на защиту:

-установлено, что зависимость эффективности мутагенного действия ионизирующих излучений от величины ЛПЭ определяется характером премутационных повреждений ДНК;

-выявлено, что модифицирующее влияние глицерина и цистеамина на радиационно-индуцированный мутагенез у клеток S. typhimurium, различно. Глицерин уменьшает мутагенное действие зг-излучения, цистеамин является малоэффективным агентом;

-показани, что с ростом лпэ излучений, защитное действие глицерина на частоту мутирования клеток снижается;

-установлено, что модифицирующее влияние аноксии на г-индуциро-ванный мутагенез клеток S. typhimurium определяется характером премутационных нарушений ДНК. Реверсии, обусловленные заменами в Т-А и G-C парах оснований, являются соответственно зависимыми и независимыми от кислорода;

-показано, что аноксический сенсибилизатор TAN, вызавает резкое повышение частоты мутирования клеток при r-облучении в условиях аноксии. Степень сенсибилизации зависит от характера нарушений, определя-

эщих мутантный фенотип, с повышением ЛПЭ излучения сенсибилизирующее ¡лияние TAN снижается.

Материалы, полученные при выполнении диссертационной работы, шеют важное значение для радиобиологии и радиационной генетики. Они югут быть использованы при дальнейшей разработке вопросов механизма (утагенного действия излучений разного качества, проведении оценок •енетической опасности ионизирующих излучений с различными физичес-:ими характеристиками.

)бъем работы

Диссертация состоит из введения, 4-х глав и выводов; изложена на 20 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками и 9 аблицами. список литературы содержит 159 наименовений, из них 39 -абот на русском языке. пробация

Материалы диссертации доложены: на Биофизических семинарах оияи Дубна, 1989, 1990, 1991), Международном рабочем совещании по енетическому действию корпускулярных излучений (Дубна, 4-6 октября 989) , Международном рабочем совещании по исследованию механизмов адиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК (Дубна, 12-14 юня 1990), 9-м Конгрессе по радиационным исследованиям (Торонто, -12 июля 1991), 4-м Рабочем совещании по биологическому действию яжелых заряженных частиц (Дармштадт, 23-25 сентября 1991).

Диссертационная работа апробирована на Биофизическом семинаре бъединенного института ядерных исследований (18 июня 1991 г.) и на еминаре ВНИИ сельскохозяйственной радиологии Госкомиссии СССР по про-овольствию и закупкам (15 сентября 1991 г.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

гточники ионизирующих излучений

В экспериментах применяли ионизирующие излучения широкого диапа-эна ЛПЭ. Были использованы ионы дейтерия, гелия и углерода, получение на изохронном двухметровом ускорителе многозарядных ионов У-200 бъединенного института ядерных исследований. В качестве "стандарт-

137

это" источника применяли у-излучение Cs. Физические характеристики »лучений представлены в табл.1.

Таблица 1. Физические характеристики использованных излучений

вид Энергия, ЛПЭ, Мощность Источник

излучения МэВ/нуклон кэВ/мкм дозы, Гр/с

г-излучение - 0,3 0,4 1 37 Cs

2d 7,5 5 3,2 У-200

2d 6,3 8 5,1 -

4 Не 8,3 20 9,3 -

4 Не 5,2 38 5,4 -

4 Не 4,7 40 6,2 -

4 Не 2,8 50 7,6 -

4 Не 1.5 80 12,9 -

12с 7,6 220 1,5 -

Штаммы

В работе использовали тест штаммы Эймса Salmonella typhimuriu; ТА98, TAlOO, ТА102. Штаммы были получены от Б.Эймса (отдел биохими Калифорнийский университет, Беркли, США).

Тест штаммы Эймса имеют his~ фенотип с различными типами мутац в гистидиновом опероне (Marón, Ames, 1983). Так, штамм ТА98 нес мутацию hisD3052 в гене hisD. Этот штамм сконструирован для выявлен мутагенов, действие которых обусловлено сдвигом рамки считывания последовательности, состоящей из 8 оснований -GC-. Мутация hisG штамма ТА100 предназначена для выявления агентов, вызывающих заме G-C пары оснований. Штамм ТА102 несет ochre мутацию в hisG гене отличается от остальных штаммов тем, что мутация hisG428 введена плазмиду pAQl, в результате чего в клетке имеется в среднем 30 коп мутантного гена. Шгамми ТЛ9я и ТАЮО являются дефектными по эксциз онной репарации. Все использованные штаммы несут илазкиду ркМЮ содержащую гены тисА и тисВ, кодирующих синтез белков, аналогичн белкам итиС и umuD клеток E.coli.

Среды

Клетки S.typhimurium выращивали в питательной среде Oxoid No2 Для ресуспендирования, разведения и облучения клеток использовали N буфер (19,7 mM NH4Cl, 43,7 тМ Na,,HP04, 23,2 тМ КН.,Р04, 1 тМ MgS04, С тМ СаС12, 9 тМ NaCl, pH 7,6). Тестирование обратных мутаций осущест лялось на чашках с "минимальным" агаром (15 г/л агар-агара, 0,5 мг

штрий лимонокислый и 50 мл/л 407. глюкозы).На поверхность "нижнего" trapa заливали "верхний" агар (6 г/л агар-агара и 5 г/л NaCl) с сус-шнзией тестируемых клеток (Marón, Ames, 1983).

'адиомодификаторы

В качестве радиопротекторов в работе использовали два класса сое-шнений: цистеамин - представитель класса аминотнолов и глицерин -1редставитель класса многоатомных спиртов. Цистеамин (/3-меркапто->тиламин) производства фирмы Sigma применяли в концентрации 2-10~2М, -лицерин (фирма Serwa) - в концентрации 1 М. В качестве аноксического :енсибилизатора использовали нитроксильный стабильный радикал TAN [2,2,6,б-тетраметил-4-пиперидон-Н-оксил), полученный из Института :имической физики АН СССР г. Москва. TAN применяли в концентрации 0"3М, при концентрации клеток в суспензии ю9кл/мл. 1етодика выявления реверсий у. клеток S.typhimurium

Культуру клеток выращивали в питательной среде Oxoid No2 при »7 °С и интенсивной аэрации до плотности (2-3 ) ■109клеток/мл. Для [редотвращения потери плазмид в питательную среду добавляли 25 мкг/мл .мпицилина и 2мкг/мл тетрациклина (ТА102). После выращивания клетки жаждали центрифугированием и ресуспендировали в М9 буфере. Перед ¡блучением к части образцов добавляли радиомодификатор и инкубировали течении 20 мин при 37°С. Облучение на ^-установке проводили при |°С. Для достижения аноксии суспензию клеток в течении 20 мин барбо-■ировали азотом.

Облучение ускоренными ионами проводили на лавсановых фильтрах производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ) с диаметром пор =0,5 :км. Для достижения аноксии при облучении многозарядными ионами приме-яли специально разработанную методику, позволяющую облучать клетки в успензии. После барботации азотом 10 мкл клеточной суспензии наносили стеклянные камеры глубиной 300 мкм, затем камеры накрывали лавсано-ой пленкой толщиной 15 мкм и уплотняли гайкой с резиновой прокладкой, се операции проводили в боксе в атмосфере азота. После облучения естируемые клетки смывали М9 буфером. Параллельно проводили экспери-енты в идентичных условиях на у-установке.

понтанный мутагенез у. тест штаммов S.typhimurium

Количество спонтанных ревертантов в наших экспериментах опреде-яется двумя слагаемыми: числом спонтанных ревертантов, возникающих в роцессе роста ночной культуры в суспензии (Ns^ и в процессе роста ультуры на чашках после облучения (Ns ) . Суммарное количество

спонтанных ревертантов можно определить при подсчете ревертантны колоний на чашках, не подвергавшихся облучению. Значение Ns определя ется методом подсчета ревертантных колоний на чашках после облучени дозой летальной, для всех имеющихся в суспензии ревертантов, но н вызывающей гибели достаточного для дальнейшего размножения числа аук сотрофных клеток.

Расчет выхода индуцированных ревертантов

Величину выхода индуцированных ионизирующим излучением ревертантов (Nm) определяли по формуле:

Nm(D) = M(D) - NyS(D) - Ns2 , (1)

где M(D). - общее количество ревертантов на чашку, S(D) - выживаемость, Nsj и Nsz - количество спонтанных ревертантов, возникающих i ппрцессе роста ночной культуры в суспензии и в процессе роста культу{ на чашках после облучения, соответственно.

Методы статистического анализа

Частоту мутирования клеток определяли как отношение числг индуцированных мутантов Nm(D) к количеству выживших клеток No-s(D) Полученные результаты подвергали статистической обработке. Зависимость Nm/N(D) апроксимировали степенной функцией:

Nm/N(D) = it-D® , (2)

где D - доза облучения. Параметры gß и к определяли методом минимизации суммы квадратов отклонений экспериментальных и теоретически: величин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Летальное действие излучений с разной ЛПЭ на клетки S. typhimurium

На рис.1 представлены результаты экспериментов пс летально действию различных типов ионизирующих излучений на клетки S.typhim rium ТА98 и ТАЮО. Значения радиочувствительности у штаммов TA9S TAI00 при облучении различными типами излучений совпадают, посколь используемые штаммы изогенны. Зависимость D"1(L) описывается кривой максимумом (рис.2), это связано с тем, что с ростом ЛПЭ излучен выход прямых двунитевых разрывов (ПДР), являющихся летальными повре дениями для клеток с одной хромосомой, резко возрастает, между тем к выход энзиматических двунитевых разрывов ОДР) ДНК снижается (Красав Е.А., 1989). Максимальное значение ОБЭ составило 1,4±0,3 при облучен

энами гелия (Ь=50 кэВ/мкм)

О 100 300

Доза, Гр.

Рис.1. Кривые выживания клеток Э. ЬурЫтиг1ит ТА98 (А) и ТА100 (Я) при облучении различными типами излучений: г-лучи (а), ионы дейтерия 5 кэВ/мкм (б) и 8 кэВ/мкм (в), ионы гелия 50 кэВ/мкм Г г) и 80 кэв/мкм (д), ионы углерода 220 кэВ/мкм (е). По оси абсцисс: доза облучения, Гр. ; по оси ординат: фракция выживших клеток, отн. ед.

1 . 10 100 ЛПЭ, кэВ/мкм

Рис.2. Зависимость радиочувствительности ) клеток Э.ЬурЫти-г1ит ТА98 и ТА100 от ЛПЭ излучений. По оси абсцисс: ЛПЭ, кэВ/мкм; по оси ординат: радиочувствительность, Гр"1.

Мутагенное действие излучений с разной ЛПЭ на клетки Э.ЬурЫтиг1ит

Использование штаммов Эймса с различной природой нарушений структуры генов, обусловливающих мутантный фенотип, оказалось весьма эффективным при анализе закономерностей мутагенного действия ионизирующих излучений с разной ЛПЭ. На рис.3 представлены зависимости относительной генетической эффективности (ОГЭ) для штаммов та98 и таюо от ЛПЭ излучений. Видно, что для штамма та98 наблюдается ниспа-

«2

Е1

о

Рис.3, зависимость огэ от лпэ для клеток Э. ЬурЫтигхит та98 (А) и таюо (■). По оси абсцисс: лпэ, кэВ/мкм; по оси ординат: ОГЭ, отн. ед.

10 100 ЛПЭ, кзВ/мхм

дающая зависимость ОГЭ(Ь), для таюо - зависимость с максимумом. Зависимость ОГЭ(Ю с максимумом является следствием того, что премутацион-ным повреждением для клеток таюо являются комплексные повреждения (КП) ДНК (Козубек С. и соавт., 1989), выход которых увеличивается с ростом ЛПЭ. Выявлено, что такие повреждения являются также БОБ-индуцирующими. эти обстоятельства объясняют характер зависимости ОГ2 от ЛПЭ с локальным максимумом. Для штамма та98 ниспадающий ход зависимости связан с тем, что премутационными повреждениями в этом случае являются повреждения оснований (ПО) ДНК, выход которых с ростом лп; снижается.

Модифицирующее влияние радиопротекторов на выживаемость и му гагецсз клеток ЬурЫтигхит при действии излучений с разной ЛПЭ

В работах ряда авторов было установлено, что в условиях влиянш перехватчиков он°-радикалов существенно снижается выход радиационно-индуцированных повреждений ДНК (А1рег, 1979), часть которых може-являться премутационными. В связи с этим представляется важным изучит] специфику модифицирующего влияния перехватчика ОН°-радикалов - глицерина на мутагенез штаммов Эймса при действии излучений с разной ЛПЭ.

На рис.4 представлены зависимости радиочувствительности изогенны:

10 100 ЛПЭ, кэВ/ихн

Рис.4. Зависимость радиочувствительности клеток Б. ЬурЫтиг1ит ТА98 и ТА100 от ЛПЭ при облучении с глицерином (А) и в нормальных условиях (П) По оси абсцисс: ЛПЭ, кэв/мкм; по оси ординат: радиочувствительность, Гр"1.

аммов ТА98 и ТА100 от ЛПЭ при облучении с глицерином и в нормальных :ловиях. Видно, что защитное действие глицерина наиболее эффективно юявляется при облучении частицами с ЛПЭ, не превышающими значения | кэв/мкм. Это может объясняться снижением числа однонитевых разрывов >Р) ДНК за счет перехвата ОН°-радикалов глицерином, которые в обычных ■.ловиях в процессе репарации трансформируются в ЭДР ДНК. При больших [Э определяющую роль в гибели клеток играют ПДР ДНК, поэтому защитное 'йствие глицерина уменьшается.

Результаты экспериментов по мутагенезу клеток 5. 1урЫгг.иг1ит при ¡лучении многозарядными ионами свидетельствуют о том, что зависимость 'Э(Ь) для штамма ТА100 в присутствии глицерина описывается кривой с .ксимумом, сдвинутой в область меньших ЛПЭ по отношению к кривой, 1лученой в нормальных условиях (рис.5). По-видимому, это связано с !М, что при облучении с глицерином меняется спектр индуцированных 1вреждений ДНК.

Рис.5. Зависимость ОГЭ от ЛПЭ излучений при облучении клеток ТАЮО с глицерином (А) и в нормальных условиях ( В ) . по оси абсцисс: ЛПЭ, кэв/мкм; по оси ординат: ОГЭ, отн. ед.

10 100 ЛПЭ, кэВ/икм.

1 10 100 ЛПЭ, КЭВ/UKM.

Рис.б. Зависимость огэ от ЛП излучений при облучении клето тл98 с глицерином (А ) и нормальных условиях (Ш)- П оси абсцисс: ЛПЭ, кэВ/мкм; п оси ординат: ОГЭ, отн. ед.

Наличие глицерина в момент облучения клеток штамма та98 фактически н влияет на значения ОГЭ при различных ЛПЭ излучений (рис.6), вероятна модификация спектра первичных повреждений ДНК за счет перехвата глице рином ОН°-радикалов не приводит к изменению числа ПО, которые являютс премутационными повреждениями для данного штамма.

Помимо глицерина в качестве представителя другого класса радис протекторов в нашей работе был использован цистеамин. В отличие с многоатомных спиртов, проявляющих радиопротекторные свойства ^ первичном физико-химическом уровне, при введении аминотиолов в клетке происходит, как показано многими авторами, изменение активности ря.1

10 100 Доза, Гр.

Рис.7. Зависимость частоты мутирования клеток S.typhimurium i дозы 7-облучения: та98 (a), taioo (б) и та102 (в) при облучении цистеамином (А) и в нормальных условиях (■). По оси абсцисс: до облучения, Гр.; по оси ординат: частота мутирования, отн. ед.

ерментов, участвующих в репарации повреждений ДНК (Бреслер С.Е,, Носин Л. А., 1978). Изменение баланса между ферментативными системами леток, отвечающих за деградацию и ресинтез ДНК, снижает выход энзима-ических ДР ДНК и тем самым обусловливает защитное влияние цистеамина 1Т летального действия ионизирующих излучений.

Как видно из рис.7 модифицирующее влияние цистеамина на у-индуци-юванный мутагенез клеток Я.ЬурЫтиггит фактически отсутствует. Это :вязано с тем, что ферменты, активность которых изменяется благодаря лиянию цистеамина, по-видимому играют незначительную роль в мутаген-юй репарации, закрепляющей определенный класс повреждений ДНК в [утации.

1лияние кислорода на радиочувствительность и индуцированный 1Утагенез х клеток В. ЬурЫтигйлт

Известно, что одним из наиболее эффективных радиомодификаторов [вляется кислород. Ионизирующие излучения индуцируют широкий спектр [ервичных повреждений, которые в зависимости от их модифицируемости :ислородом можно разделить на кислородзависимые и кислороднезависимые ювреждения ДНК (Эйдус л.х. корыстов ю.Н., 1984).

На рис.8 представлены кривые выживания при у-облучении в нормаль-шх условиях и в аноксии. Видно, что кислородный эффект для всех (спользованных штаммов З.гурЫтигхит составляет =<2. Представленные на тс.9 зависимости частоты мутирования от дозы у-облучения в нормальных

Ю"

(А). По оси абсцисс: доза облучения, Гр. ; по оси ординат: фракция выживших клеток, отн. ед.

Рис.8, кривые выживания клеток S.typhimurium ТА98 (а), ТА100 (б) И TAI О 2 (В) при у - облучении в нормальных условиях (Q), в аноксии (Д) и в аноксии в присутствии TAN

0 200 400 0 200 400 0 200 400

Доза, Гр.

100 100 100 Доза, Гр.

Рис.9, зависимость частоты мутирования клеток Б. typhiIшriцлl та91 (а), таюо (б) и та102 (в) от дозы эг-облучения в аноксических (А) и в нормальных условиях (В). По оси абсцисс: доза облучения, Гр.; по оси ординат: частота мутирования, отн. ед.

условиях и в аноксии свидетельствуют о том, что влияние аноксии не 7-индуцированный мутагенез у та98 и таюо штаммов отсутствует, ФИД1 штамма таюг составляет величину 1,б±0,2.

Как отмечалось выше, замена Э-С пары оснований у штамма таюо, происходит в результате образования премутационного повреждения типг КП ДНК. В работе (Амиртаев К.Г. и соавт., 1985) было показано, что КГ ДНК являются кислороднезависимыми повреждениями. Это обстоятельстве объясняет отсутствие модифицирующего влияния кислорода на г-индуци-рованный мутагенез штамма таюо. Молекулярной основой инсерции одногс нуьлестида., приводящей к сдвигу рамки считывания в гистидиновок опероне у штамма та98, является ПО. Известно (Теои!, 1357), что срр;и продуктов радиолиза оснований существуют как кислороднезависимые так I кислородзависимые повреждения. Отсутствие кислородного эффекта у штамма та98 свидетельствует о том, что премутационными событиями в данноъ случае являются кислороднезависимые повреждения оснований.

Модифицирующее влияние аноксии на г-индуцированный .мутагенез у штамма та102 (рис.9в), по-видимому, связано с участием в мутагенезе продуктов радиолиза тимина, возникающих только в присутствии кислороде

íouI, 1987). Наличие подобных повреждений, вероятно, приводит к !ене A-T пары оснований, тестируемых штаммом тлю2. Поскольку ьдратичная зависимость частоты мутирования штамма та102 свидетель->ует о двухударном механизме мутагенеза, можно полагать, что возник-)ение мутации в his-опероне происходит в результате двух повреждений С: одно повреждение формирует премутационное событие (в данном /чае повреждение тимина в -таа- нонсенс кодоне штамма TAI02); другое аапускает SOS - систему. Показано, что SOS - индуцирующие поврежде-I являются кислороднезависимыми. Таким образом, кислородный эффект у шма та102 связан с характером молекулярного нарушения ДНК, обуслов-зающего мутантный фенотип.

При облучении штамма та100 ионами гелия с ЛПЭ=38 кэВ/мкм модифи-рующее действие аноксии на мутагенез отсутствует (рис.10). Это, по-цимому, связано с тем, что при действии заряженных частиц с большей роятностью индуцируются кислороднезависимые премутационные поврежде-а ДНК.

s ю

Ю-

Ю '

100 200 ЗОС

Доза, Гр.

Рис.10. Зависимость выживаемости (а) и частоты мутирования (б) клеток таюо от дозы облучения ионами гелия (L = 38 кэВ/мкм). облучение проводили в нормальных условиях (О), з аноксии (И) и в аноксии в присутствии TAN (Д) По оси абсцисс: доза облучения, Гр. ; по оси ординат: (а) фракция выживших клеток, отн. ед., (б) частота мутирования, отн. ед.

-«

ияние аноксичаского сенсибилизатора ТА1£ на индукцию мутаций лучениями с. разной ЛПЭ

Известно, что в условиях аноксии ряд агентов химической природы :фективно сенсибилизирует клетки к летальному действию излучений, тановлено, что нитроксильные стабильные радикалы способны образовы-ть ковалентные связи с радикалами азотистых оснований, что меняет

исходную структуру повреждений и препятствует репарационному синте ДНК (Hohman et al., 1976). С учетом этого нами было выдвинуто предп ложение о том, что представитель группы N-оксилов - TAN (2,2,6, тетраметил-4-пиперидон-^оксил) может существенно модифицирова мутационный процесс.

На рис.8 представлены кривые выживания использованных штаммов п 7-облучении в нормальных условиях, в аноксии и в присутствии анокс ческого сенсибилизатора. Видно, что TAN оказывает на выживаемое клеток ТА98 и ТАЮО выраженное сенсибилизирующее действие. Для штам ТА102 сенсибилизирующее влияние меньше, величина ФИД равна 1,3±о, Различная степень сенсибилизации, по-видимому, обусловливается те что клетки штаммов ТА98 и ТАЮО являются дефектными по uvrB-зависим эксцизионной репарации.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что г-индуци рованный мутагенез у аноксических клеток S. typhimurium в значительн мере зависит от присутствия TAN в процесе облучения (рис.11). Модиф цируемость r-индуцированного мутагенеза у различных штаммов Эйм аноксическии сенсибилизатором TAN объясняется влиянием двух факторо Во-первых, TAN в условиях аноксии, взаимодействуя с радиационно

100 юо ЮО

Доза, Гр.

Рис.11. Зависимость частоты мутирования клеток S.typhimurium Ti (а), ТАЮО (б) и ТАЮ2 (в) от дозы r-облучения в аноксии (В) и аноксии в присутствии TAN (А). По оси абсцисс: доза облучени Гр.; по оси ординат: частота мутирования, отн.ед.

аудированными радикалами ДНК, образует аддукты с основаниями ДНК, ежде всего с пиримидинами (Frank et al., 1985). Причем, эксцизионная 1л-зависимая репарация ДНК не в состоянии восстановить повреждения кого типа, и в этом случае требуется индукция медленной мутагенной парации. Во-вторых, известно, что TAN резко увеличивает SOS - ответ оксических клеток J5. cold при у-облучении (Комова О. В. и соавт., 90). Модификация радиационно-индуцированных радикалов пиримидина и тивация ошибочной репарации в присутствии TAN, по-видимому, ведет к ачительному увеличению мутагенеза у штаммов та98 и та100.

Существенно меньшее влияние TAN на у-индуцированный мутагенез еток таю2 (фид =2,1+0,2) связано, по-видимому, со свойствами мишени вертирования, ведущей к замене А-Т пары оснований. Известно, что оксилы эффективно взаимодействуют с радикалами тимина, причем, ^которые повреждения тимина, ведущие к замене А-Т пары оснований ■идропероксиды тимина и продукты их деградации), могут возникать 1Лько в присутствии кислорода (Teoule, 1987). Участие таких поврежде-[й в мутагенезе подтверждает наличие КЭ у штамма та102. Таким обра-IM, небольшой модифицирующий эффект у-индуцированного мутагенеза у •амма та102, обусловленный TAN, связан с характером конкретного >лекулярного нарушения ДНК.

Сравнивая модифицирующее влияние TAN на мутагенез штамма та100 1И действии у-лучей и ионов гелия (рис.10) выявлено, что величина 1Д при увеличении ЛПЭ излучения уменьшается, что повидимому, свиде-¡льствует об увеличении выхода повреждений слабо модифицируемых TAN. iK мы указывали, данными повреждениями могут быть комплексные повреж-;ния ДНК, которые сами по себе, без модификации TAN, являются пре-'тационными событиями.

Таким образом, совокупность полученных нами материалов свидетель-:вует о том, что специфика мутагенного действия ионизирующих излуче-1й с различными физическими характеристиками на клетки прокариот 1ределяется характером премутационных повреждений ДНК. Это обстоя-эльство в свою очередь находит подтверждение в особенностях модифици-^ющего влияния агентов различной природы.

выводы

1. Зависимость эффективности мутагенного действия ионизирукшш излучений от величины ЛПЭ определяется характером премутационньи повреждений ДНК.

2. Модифицирующее влияние глицерина и цистеамина на радиационно-индуцированный мутагенез у клеток Я.ЬурЪхтиг^ия различно. Глицери! уменьшает мутагенное действие г-излучения, цистеамин является малоэффективным агентом.

3. С возрастанием ЛПЭ излучений защитное действие глицерина нг частоту мутирования клеток снижается.

4. Модифицирующее влияние аноксии на у-индуцированный мутагенез ) клеток Э. ЬурЫтиг1ит определяется характером премутационных нарушени! ДНК. Реверсии, обусловленные заменами в А-Т и й-С парах оснований, являются соответственно зависимыми и независимыми от кислорода.

5. Аноксический сенсибилизатор ТАК вызывает резкое повышение частоты мутирования клеток при г-облучении в условиях аноксии. Степень сенсибилизации зависит от характера нарушений, определяющих мутантны( фенотип. С повышением ЛПЭ излучений сенсибилизирующее влияние ТАЗ снижается.

по теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Козубек е., Красавин Е.А., Амиртаев К.Г., Баша С.Г., Токарова Б. Мутагенное действие излучений с разной ЛПЭ на клетки салмонеллы (штаммы Эймса) I.Индукция ревертантов у клеток 3^урЫтиг1ит при у-облучении.// Труды рабочего совещания по генетическому действш корпускулярных излучений. Дубна. ОИЯИ. Д19-89-143. 1989. С.15-27.

2. Козубек С., Красавин ь.а., Амкртасг К.Г ; Баша С.Г., Токарова Б. Мутагенное действие излучений с разной ЛПЭ на клетки салмонеллы (штаммы Эймса) II. Индукция ревертантов у клеток З.ЬурЫтиг1ит пр1 действии тяжелых ионов.// Труды рабочего совещания по генетическом) действию корпускулярных излучений. Дубна. ОИЯИ. Д19-89-143. 1989. С.28-39.

3. Баша С.Г., Красавин Е.А., Козубек С., Амиртаев К.Г. Влияние глицерина на у-индуцированный мутагенез у клеток З.ЬурЫтиг1ит./, Радиобиология. 1990. Т.ЗО. Вып.2. С.185-189.

Баша с.Г., Красавин Е.А., Козубек е., Амиртаев К.Г. Модификация у-индуцированного мутагенеза у тест-штаммов Эймса. I.Влияние радиопротекторов на мутагенез у клеток S.typhimurium. // Труды рабочего совещания по исследованию механизма радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК. Дубна. ОИЯИ. Д19-90-457. 1990. С.30-38. Баша С. Г., Красавин Е.А., Козубек е., Амиртаев К.Г. Модификация у-индуцированного мутагенеза у тест-штаммов Эймса. II.Влияние TAN на мутагенез у клеток S.typhimurium.// Труды рабочего совещания по исследованию механизма радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК. Дубна. ОИЯИ. Д19-90-457. 1990. С.39-45.

Krasavin Е.А., Basha S.G., Kozubek S. The modification of mutagenesis indused by heavy ions in Salmonella tester strains.// Extended abstracts fourth workshop on heavy charged particles in biology and medicine. GSI-91-29 Report. September 1991. ЕЮ. P.1-3. Basha S.G., Krasavin E.A., Kozubek S. The effect of anoxic radiosensitizing agent TAN on induction of revertants by y-reys and helium ions in Salmonella tester strains. //Mutat.Res. 1991. (принято в печать).

Basha S.G., Krasavin Е.А., Kozubek S. Radioprotective action of glycerol and cysteamin on inactivation and mutagenesis in Salmonella tester strains after gamma and heavy ions irradiation.// Mutat.Res. 1991. (принято в печать).

Kozubek S., Krasavin E.A., Horneck G., Amirtaev K.G., Tokarova В., Basha S.G., Komova O.V., Ogievetskaja M.M., Soska J. A radiobiological model on cellular damage induced by ionizing radiation and its repair in bacteria.// Mutat.Res. 1991. '(принято в печать).

ЛИТЕРАТУРА

Амиртаев К.Г. и соавт. Studia boiphisica. 1985. Т.106. С.131-142. Бреслер С.е., Носкин л.а. Радиобиология. 1978. т.18. С.548-555. Комова О. В. и соавт. Труды рабочего совещания по исследованию механизма радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК. Дубна. 1990. С.49-58.

Красавин Е.А. Проблема ОБЭ и репарация ДНК. М. Энергоатомиздат. 1989.

Эйдус Л.Х., Корыстов Ю.Н. Кислород в радиобиологии. М. Энергоатомиздат. 1984.

6. Alper T. Cellular radiobiology. Cambridge- L.- N. I.- Melbourn. Cambridge University Press. 1979.

7. Frank E.H. et al. Can. J. Chem. 1985. Vol.63. No.15. P.15-23.

8. Hohman W.F. et al. Int. J. Radiat. Biol. 1976. Vol.30. No.3. P.24"

261.

9. Maron D.M., and Ames E.N. Mutation Res. 1983. Vol.113. P.173-215.

10. Teoul R. Int. J. Radiat. Biol. 1987. Vol.51. P.573-589.

1'yKonncb riocTyiiHjia u H3flaTejjbCKni'i oTflen 31 OKTH6PSI 1991 roHa.