Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности мутагенного действия излучений с разной ЛПЭ на клетки SALMONELLA TYPHIMURIUM в условиях влияния радиомодификаторов

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности мутагенного действия излучений с разной ЛПЭ на клетки SALMONELLA TYPHIMURIUM в условиях влияния радиомодификаторов"

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ

На правах'рукописи

19-91-472

БАША Сергей Григорьевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ МУТАГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ИЗЛУЧЕНИЙ С РАЗНОЙ ЛПЭ НА КЛЕТКИ SALMONELLA TYPHIMURIUM В УСЛОВИЯХ ВЛИЯНИЯ РАДИОМОДИФИКАТОРОВ

Специальность: 03.00.01 - радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических: наук

Обнинск 1991

Работа выполнена в Объединенном институте ядерных исследований, Дубна.

Научный руководитель:

Ведущая организация - Институт цитологии АН СССР, Ленинград.

заседании специализированного совета по радиобиологии А 120.81.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии Госкомиссии СССР по продовольствию и закупкам (Москва, Волков переулок, д. 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии. Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 249020, Калужская обл. , г. Обнинск, ВНИИСХР, Спецсовет.

доктор биологических наук, профессор Е.А.Красавин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.Г.Петин кандидат биологических наук С.А.Гераськин

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного С

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, в связи с глобальным ухудшением экологической обстановки, возникновением радиоэкологических аномалий проблема малых доз облучения в настоящее время приобрела особую остроту. Одним из подходов к решению этой проблемы является изучение закономерностей и механизмов мутагенного действия излучений, различающихся по физическим характеристикам, на клетки различного генотипа. Установлено, что специфика мутагенеза, индуцированного излучениями с различной линейной передачей энергии (ЛПЭ), обусловливается влиянием факторов физической и биологической природы. Важнейшим биологическим фактором являются системы репарации повреждений ДНК, физическим -пространственное распределение энергии в генетических структурах клеток. Наиболее полно механизмы репарации ДНК и их роль в мутационном процессе изучены у бактериальных клеток. С учетом этого обстоятельства можно полагать, что специфику мутагенного действия излучений широкого диапазона ЛПЭ детально можно установить прежде всего в исследованиях на клетках прокариот, особый интерес в этой связи представляют штаммы с известной молекулярной природой нарушений структуры генов, обусловливающих мутантный фенотип (тест-штаммы Эймса).

Одним из подходов к установлению механизмов действия ионизирующих излучений на генетический аппарат клеток являются исследования закономерностей индуцированного радиацией мутагенеза в условиях влияния модифицирующих факторов. Показано, что важную роль в формировании генных мутаций у прокариот при действии ионизирующих излучений разного качества играют "комплексные повреждения" ДНК, восстанавливаемые лишь в процессе гесА-1ехА-зависимой репарации (Козубек С. и соавт., 1989). Выход таких повреждений с ростом ЛПЭ увеличивается, а их модифицируемость различными химическими радиомодификаторами, судя по результатам летального действия излучений на клетки, снижается (Амиртаев К. Г. и соавт.,1985). С учетом изложенного представляется важным изучить влияние различных радиомодифицирующих агентов (протекторов и сенсибилизаторов) на индукцию мутаций у штаммов с различной природой премутацион-ных нарушений в генах при действии ионизирующих излучений, различающихся по физическим характеристикам. Однако такие исследования до последнего времени проведены не были.

Цель и задачи работы. Исходя из изложенного, целью настоящей работы являлось изучение влияния радиопротекторов различных классов, аноксии и аноксического сенсибилизатора на индукцию мутаций у различных штаммов Salmonella typhimurium при действии ионизирующих излучений, различающихся по ЛПЭ в широком диапазоне. Для реализации указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

-изучить закономерности летального действия излучений с разной ЛПЭ на клетки S. typhimurium в условиях влияния различных радиомодификаторов ;

-изучить закономерности модифицирующего действия радиопротекторов на частоту образования мутаций у различных штаммов s.typhimurium при облучении ионизирующими излучениями, различающимися по ЛПЭ;

-исследовать влияние аноксии на частоту образования мутаций у штаммов с различной молекулярной природой премутационных повреждений при r-облучении и действии ускоренных тяжелых ионов;

-изучить закономерности модифицирующего влияния аноксического сенсибилизатора на частоту образования мутаций у различных штаммов S.typhimurium при действии излучений с разной ЛПЭ.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных исследований впервые получены следующие новые факты, которые выносятся на защиту:

-установлено, что зависимость эффективности мутагенного действия ионизирующих излучений от величины ЛПЭ определяется характером премутационных повреждений ДНК;

-выявлено, что модифицирующее влияние глицерина и цистеамина на радиационно-индуцированный мутагенез у клеток S. typhimurium, различно. Глицерин уменьшает мутагенное действие у-излучения, цистеамин является малоэффективным агентом;

-показано, что с ростом ЛПЭ излучений, защитное действие глицерина на частоту мутирования клеток снижается;

-установлено, что модифицирующее влияние аноксии на у-индуциро-ванный мутагенез клеток S. typhimurium определяется характером премутационных нарушений ДНК. Реверсии, обусловленные заменами в Т-А и G-C парах оснований, являются соответственно зависимыми и независимыми от кислорода;

-показано, что аноксический сенсибилизатор TAN, вызавает резкое повышение частоты мутирования клеток при у-облучении в условиях аноксии. Степень сенсибилизации зависит от характера нарушений, определя-

кщих мутантный фенотип. С повышением ЛПЭ излучения сенсибилизирующее влияние TAN снижается.

Материалы, полученные при выполнении диссертационной работы, имеют важное значение для радиобиологии и радиационной генетики. Они могут быть использованы при дальнейшей разработке вопросов механизма мутагенного действия излучений разного качества, проведении оценок генетической опасности ионизирующих излучений с различными физическими характеристиками.

Збъем работы

диссертация состоит из введения, 4-х глав и выводов; изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками и 9 таблицами. Список литературы содержит 159 наименовений, из них 39 -работ на русском языке. Апробация

Материалы диссертации доложены: на Биофизических семинарах ОИЯИ [Дубна, 1989, 1990, 1991), Международном рабочем совещании по генетическому действию корпускулярных излучений (Дубна, 4-6 октября 19S9), Международном рабочем совещании по исследованию механизмов эадиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК (Дубна, 12-14 •поня 1990), 9-м Конгрессе по радиационным исследованиям (Торонто, 7-12 июля 1991), 4-м Рабочем совещании по биологическому действию тяжелых заряженных частиц (Дармштадт, 23-25 сентября 1991).

Диссертационная работа апробирована на Биофизическом семинаре )бъединенного института ядерных исследований (18 июня 1991 г.) и на :еминаре ВНИИ сельскохозяйственной радиологии Госкомиссии СССР по про-ювольствию и закупкам (15 сентября 1991 г.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гсточники ионизирующих излучений

В экспериментах применяли ионизирующие излучения широкого диапа-юна ЛПЭ. Были использованы ионы дейтерия, гелия и углерода, получен-ше на изохронном двухметровом ускорителе многозарядных ионов У-200 >бъединенного института ядерных исследований. В качестве "стандарт-

137"

юго" источника применяли у-излучение Cs. Физические характеристики [злучений представлены в табл.1.

Таблица 1. Физические характеристики использованных излучений

вид Энергия, лпэ, Мощность Источник

излучения Мэв/нуклон кэв/мкм дозы, Гр/с

у-излучение - 0,3 0, 4 1 37_ Cs

2d 7,5 5 3,2 у-200

2d 6,3 8 5,1 -

4 Не 8,3 20 9,3 -

4 Не 5,2 38 5,4 -

4 Не 4,7 40 6,2 -

4 Не 2,8 50 7,6 -

4 Не 1,5 80 12,9 -

12С 7,6 220 1,5 -

Штаммы

В работе использовали тест штаммы Эймса Salmonella typhimurim ТА98, TAioo, таю2. Штаммы были получены от Б.Эймса (отдел биохимю Калифорнийский университет, Беркли, США).

Тест штаммы Эймса имеют his" фенотип с различными типами мутащ в гистидиновом опероне (Marón, Ames, 1983). Так, штамм ТА98 несе мутацию hisD3052 в гене hisD. Этот штамм сконструирован для выявлен! мутагенов, действие которых обусловлено сдвигом рамки считывания последовательности, состоящей из 8 оснований -GC-. Мутация his&. штамма тА100 предназначена для выявления агентов, вызывающих заме! G-C пары оснований. Штамм TAI О2 несет ochre мутацию в hisG гене отличается от остальных штаммов тем, что мутация hisG428 введена плазмиду pAQl, в результате чего в клетке имеется в среднем 30 кош мутантного гена. Штаммы ТА98 и ТА100 являются дефектными по эксциз! онной репарации. Все использованные штаммы несут плазмиду ркто: содержащую гены тшсА и тисВ, кодирующих синтез белков, аналогичш белкам итиС и umuD клеток E.coli.

Среды

Клетки S.typhimurium выращивали в питательной среде Oxoid No2 Для ресуспендирования, разведения и облучения клеток использовали М! буфер (19,7 тМ ИН4С1, 43,7 тМ Na2HP04, 23,2 шМ КН2Р04, 1 тМ MgS04, О тМ СаС12, 9 тМ NaCl, pH 7,6). Тестирование обратных мутаций осущест: лялось на чашках с "минимальным" агаром (15 г/л агар-агара, 0,5 мг.

¡атрий лимонокислый и 50 мл/л 407. глюкозы).на поверхность "нижнего" irapa заливали "верхний" агар (6 г/л агар-агара и 5 г/л NaCl) с сус-1ензией тестируемых клеток (Marón, Ames, 1983).

'адиомодификаторы

В качестве радиопротекторов в работе использовали два класса сое-шнений: цистеамин - представитель класса аминотиолов и глицерин -федставитель класса многоатомных спиртов. Цистеамин (fi-меркапто->тиламин) производства фирмы Sigma применяли в концентрации 2-10~2М, •лицерин (фирма Serva) - в концентрации 1 М. В качестве аноксического :енсибилизатора использовали нитроксильный стабильный радикал TAN 2,2,6,б-тетраметил-4-пиперидон-М-оксил), полученный из института :имической физики АН СССР г. Москва. TAN применяли в концентрации

-3 9

0 М, при концентрации клеток в суспензии 10 кл/мл. 1етодика выявления реверсий у. клеток S.typhimurium

Культуру клеток выращивали в питательной среде Oxoid No2 при >7°С и интенсивной аэрации до плотности (2-3)■109клеток/мл. Для [редотвращения потери плазмид в питательную среду добавляли 25 мкг/мл .мпицилина и 2мкг/мл тетрациклина (та102). После выращивания клетки жаждали центрифугированием и ресуспендировали в М9 буфере. Перед |блучением к части образцов добавляли радиомодификатор и инкубировали течении 20 мин при 37°с. облучение на у-установке проводили при |°С. Для достижения аноксии суспензию клеток в течении 20 мин барбо-ировали азотом.

облучение ускоренными ионами проводили на лавсановых фильтрах производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ) с диаметром пор -0,5 [км. Для достижения аноксии при облучении многозарядными ионами примерли специально разработанную методику, позволяющую облучать клетки в успензии. После барботации азотом 10 мкл клеточной суспензии наносили стеклянные камеры глубиной 300 мкм, затем камеры накрывали лавсано-ой пленкой толщиной 15 мкм и уплотняли гайкой с резиновой прокладкой, се операции проводили в боксе в атмосфере азота. После облучения вотируемые клетки смывали М9 буфером. Параллельно проводили экспери-енты в идентичных условиях на у-установке.

понтанний мутагенез у. тест штаммов S.typhimurium

Количество спонтанных ревертантов в наших экспериментах опреде-яется двумя слагаемыми: числом спонтанных ревертантов, возникающих в роцессе роста ночной культуры в суспензии (NSi) и в процессе роста ультуры на чашках после облучения (Ns ). Суммарное количество

спонтанных ревертантов можно определить при подсчете ревертантны колоний на чашках, не подвергавшихся облучению. Значение Nsz определя ется методом подсчета ревертантных колоний на чашках после облучени дозой летальной, для всех имеющихся в суспензии ревертантов, но и вызывающей гибели достаточного для дальнейшего размножения числа аук сотрофных клеток.

Расчет выхода индуцированных ревертантов

Величину выхода индуцированных ионизирующим излучением ревертантов (Nm) определяли по формуле:

Nm(D) = M(D) - NySfD) - Ns , (1)

где M(D) - общее количество ревертантов на чашку, S(D) - выживаемость, Ns] и Ns2 - количество спонтанных ревертантов, возникающих I ппрцессе роста ночной культуры в суспензии и в процессе роста культу; на чашках после облучения, соответственно.

Методы статистического анализа

Частоту мутирования клеток определяли как отношение числг индуцированных мутантов Nm(D) к количеству выживших клеток No-S(D) Полученные результаты подвергали статистической обработке. Зависимость Nm/N(D) апроксимировали степенной функцией:

Hm/N(D) ~ k-D* , (2)

где D - доза облучения. Параметры ае и к определяли методом миними зации суммы квадратов отклонений экспериментальных и теоретически: величин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Летальное действие излучений с разной ЛПЭ на клетки S.typhimurium

На рис.1 представлены результаты экспериментов по летально действию различных типов ионизирующих излучений на клетки S.typhim rium ТА98 и TA10Q. Значения радиочувствительности у штаммов ТА98 ТАЮО при облучении различными типами излучений совпадают, посколь используемые штаммы изогенны. Зависимость D"1(L) описывается кривой максимумом (рис.2), это связано с тем, что с ростом ЛПЭ излучен выход прямых двунитевых разрывов (ПДР), являющихся летальными повре дениями для клеток с одной хромосомой, резко возрастает, между тем к выход энзиматических двунитевых разрывов ОДР) ДНК снижается (Красав Е.А., 1989). Максимальное значение ОБЭ составило 1,4+0,3 при облучен

онами гелия (Ь=50 кэВ/мкм)

О 100 300

Доза.Гр.

Рис.1. Кривые выживания клеток Я. ЬурЫтиг1ит ТА98 (А) и ТА100 (И) при облучении различными типами излучений: у-лучи (а), ионы дейтерия 5 кэВ/мкм (б) и 8 кэВ/мкм (в), ионы гелия 50 кэВ/мкм (г) и 80 кэВ/мкм (д), ионы углерода 220 кэВ/мкм (е). По оси абсцисс: доза облучения, Гр. ; по оси ординат: фракция выживших клеток, отн. ед.

о

'О

а

- "Ч

-(- .......1 \ 1 ! 1 (Г 1» 1 11

. 10 ЛПЭ, кэВ/мкм

100

Рис.2. Зависимость радиочувствительности ) клеток З.ЬурЫти-ггиш та9в и та100 от ЛПЭ излучений. По оси абсцисс: ЛПЭ, кэВ/мкм; по оси ординат: радиочувствительность, Гр"1.

Мутагенное действие излучений с разной ЛПЭ на клетки Б.СурМтигхшп

Использование штаммов Эймса с различной природой нарушений структуры генов, обусловливающих мутантный фенотип, оказалось весьма эффективным при анализе закономерностей мутагенного действия ионизирующих излучений с разной ЛПЭ. На рис.3 представлены зависимости относительной генетической эффективности (ОГЭ) для штаммов та98 и таюо от ЛПЭ излучений. Видно, что для штамма та98 наблюдается ниспа-

дающая зависимость ОГЭ(Ю, для таюо - зависимость с максимумом. Зависимость ОГЭ(Ь) с максимумом является следствием того, что премутацион-ным повреждением для клеток таюо являются комплексные повреждения (КП) днк (Козубек с. и соавт., 1989), выход которых увеличивается с ростом ЛПЭ. Выявлено, что такие повреждения являются также БОЭ-индуцирующими. Эти обстоятельства объясняют характер зависимости ОГЭ от ЛПЭ с локальным максимумом. Для штамма та98 ниспадающий ход зависимости связан с тем, что премутационными повреждениями в этой случае являются повреждения оснований (ПО) ДНК, выход которых с ростом ЛПЭ снижается.

Модифицирующее влияние радиопротекторов на выживаемость и мутагенез клеток Я. гурЫтигхит при действии излучений с. разной ЛПЭ

В работах ряда авторов было установлено, что в условиях влияни* перехватчиков ОН"-радикалов существенно снижается выход радиационно-индуцированных повреждений ДНК (А1рег, 1979), часть которых може1 являться премутационными. В связи с этим представляется важным изучит) специфику модифицирующего влияния перехватчика ОН°-радикалов - глицерина на мутагенез штаммов Эймса при действии излучений с разной ЛПЭ.

На рис.4 представлены зависимости радиочувствительности изогенны:

Рис.3. Зависимость огэ от ЛПЭ для клеток Б.1уръ1тиг1ит та98 (А) и таюо (■). По оси абсцисс: лпэ, кэв/мкм; по оси ординат: огэ, отн. ед.

д _I I 11 щ|_I_« ' ' м и) > .1.

1 10

ЛПЭ, кэВ/ихм

100

'О 1

О 1 Г +

О

Ulli 1

10

ЛПЭ, кэВ/мкм

-LUl

100

Рис.4. Зависимость радиочувствительности (Б-1) клеток

о

Я. £урЫтиг1ит ТА98 и ТА100 от ЛПЭ при облучении с глицерином (А) и в нормальных условиях (в) По оси абсцисс: ЛПЭ, кэВ/мкм; по оси ординат: радиочувствительность, Гр~'.

-1

гаммов ТА98 и ТАЮО от ЛПЭ при облучении с глицерином и в нормальных :ловиях. Видно, что защитное действие глицерина наиболее эффективно юявляется при облучении частицами с ЛПЭ, не превышающими значения ) кэВ/мкм. Это может объясняться снижением числа однонитевых разрывов 3P) ДНК за счет перехвата ОН°-радикалов глицерином, которые в обычных :ловиях в процессе репарации трансформируются в ЭДР ДНК. При больших 1Э определяющую роль в гибели клеток играют ПДР ДНК, поэтому защитное гйствие глицерина уменьшается.

Результаты экспериментов по мутагенезу клеток s. typhimurium при элучении многозарядными ионами свидетельствуют о том, что зависимость 'Э(Ь) для штамма ТАЮО в присутствии глицерина описывается кривой с 1ксимумом, сдвинутой в область меньших ЛПЭ по отношению к кривой, элученой в нормальных условиях (рис.5), по-видимому, это связано с зм, что при облучении с глицерином меняется спектр индуцированных звреждений ДНК.

Рис.5. Зависимость ОГЭ от ЛПЭ излучений при облучении клеток ТАЮО с глицерином (А) и в нормальных условиях (а) . по оси абсцисс: ЛПЭ, кэВ/мкм; по оси ординат: ОГЭ, отн. ед.

0 —I I м I п!-1—I I I I щ|_I_I I I 11 п|

1 10 10 ЛПЭ, кэВ/мкм.

100

Рис.6, зависимость огэ от Л излучений при облучении клет ТА98 с глицерином (А ) и нормальных условиях (Ш). оси абсцисс: ЛПЭ, кэВ/мкм; оси ординат: ОГЭ, отн. ед.

10 100 ЛПЭ, кзв/икы.

Наличие глицерина в момент облучения клеток штамма ТА98 фактически влияет на значения ОГЭ при различных ЛПЭ излучений (рис.6). Вероят! модификация спектра первичных повреждений ДНК за счет перехвата глш рином ОН°-радикалов не приводит к изменению числа ПО, которые являю" премутационными повреждениями для данного штамма.

Помимо глицерина в качестве представителя другого класса рад] протекторов в нашей работе был использован цистеамин. В отличие многоатомных спиртов, проявляющих радиопротекторные свойства первичном физико-химическом уровне, при введении аминотиолов в клет происходит, как показано многими авторами, изменение активности р

10 100 Доза, Гр.

Рис.7, зависимость частоты мутирования клеток З-гурЫтиг^ив дозы 7-облучения: ТА98 (а), ТА100 (б) и ТАЮ2 (в) при облучен: цистеамином (Д) и в нормальных условиях (И). По оси абсцисс: , облучения, Гр.; по оси ординат: частота мутирования, отн. ед.

ферментов, участвующих в репарации повреждений ДНК (Бреслер С.Е., Нос-кин Л.А., 1978). Изменение баланса между ферментативными системами клеток, отвечающих за деградацию и ресинтез ДНК, снижает выход энзима-тических ДР ДНК и тем самым обусловливает защитное влияние цистеамина от летального действия ионизирующих излучений.

Как видно из рис.7 модифицирующее влияние цистеамина на у-индуци-рованный мутагенез клеток Б.ЬурЬ1тиг1ит фактически отсутствует. Это связано с тем, что ферменты, активность которых изменяется благодаря влиянию цистеамина, по-видимому играют незначительную роль в мутагенной репарации, закрепляющей определенный класс повреждений ДНК в мутации.

влияние кислорода на радиочувствительность и индуцированный мутагенез у клеток сурЫтиг!ит

Известно, что одним из наиболее эффективных радиомодификаторов является кислород. Ионизирующие излучения индуцируют широкий спектр первичных повреждений, которые в зависимости от их модифицируемости кислородом можно разделить на кислородзависимые и кислороднезависимые повреждения ДНК (Эйдус Л.х. Корыстов ю.Н., 1984).

На рис.8 представлены кривые выживания при г-облучении в нормальных условиях и в аноксии. Видно, что кислородный эффект для всех использованных штаммов Б. ЬурЫтиггит составляет =»2. Представленные на рис.9 зависимости частоты мутирования от дозы у-облучения в нормальных

Рис.8. Кривые выживания клеток S.typhimurium ТА98 (а), ТА100 (б) И ТАЮ 2 (В) при г - облучении в нормальных условиях (□), в аноксии (Д) и в аноксии в присутствии TAN С А). По оси абсцисс: доза облучения, Гр. ; по оси ординат: фракция выживших клеток, отн. ед.

о 200 400 0 200 400 0 200 400

Доза, Гр.

100 100 100 Доза, Гр.

Рис.9. Зависимость частоты мутирования клеток Э. typhiпкIrium ТА98 (а), ТАЮО (б) и ТАЮ2 (в) от дозы зг-облучения в аноксических (Ж) и в нормальных условиях (В)• По оси абсцисс: доза облучения, Гр.; по оси ординат: частота мутирования, отн. ед.

условиях и в аноксии свидетельствуют о том, что влияние аноксии на ■аг-индуцированный мутагенез у ТА98 и ТАюо штаммов отсутствует, ФИД штамма ТАЮ2 составляет величину 1,б±0,2.

Как отмечалось выше, замена в-С пары оснований у штамма ТАЮО, происходит в результате образования премутационного повреждения типа КП ДНК. в работе (Амиртаев К.Г. и соавт., 1985) было показано, что КП ДНК являются кислороднезависимыми повреждениями. Это обстоятельстве объясняет отсутствие модифицирующего влияния кислорода на т-индуци-рованный мутагенез штамма ТАЮО. Молекулярной основой инсерции одногс нуклеотида, приводящей к сдвигу рамки считывания в гистидиновоы опероне у штамма ТА98, является ПО. Известно (Теои1, 1987), что среди продуктов радиолиза оснований существуют как кислороднезависимые так и кислородзависимые повреждения. Отсутствие кислородного эффекта у штамма ТА98 свидетельствует о том, что премутационными событиями в данной случае являются кислороднезависимые повреждения оснований.

Модифицирующее влияние аноксии на ^-индуцированный мутагенез у штамма ТАЮ2 (рис.Эв), по-видимому, связано с участием в мутагенезе продуктов радиолиза тимина, возникающих только в присутствии кислорода

oui, 1987). Наличие подобных повреждений, вероятно, приводит к ене А-Т пары оснований, тестируемых штаммом ТА102. Поскольку дратичная зависимость частоты мутирования штамма ТА102 свидетель-ует о двухударном механизме мутагенеза, можно полагать, что возник-ение мутации в íiis-опероне происходит в результате двух повреждений :: одно повреждение формирует премутационное событие (в данном 'чае повреждение тимина в -Таа- нонсенс кодоне штамма ТА102); другое >апускает SOS - систему. Показано, что SOS - индуцирующие поврежде-[ являются кислороднезависимыми. Таким образом, кислородный эффект у 1мма ТА102 связан с характером молекулярного нарушения ДНК, обуслов-5ающего мутантный фенотип.

При облучении штамма ТА100 ионами гелия с ЛПЭ=38 кэВ/мкм модифи-эующее действие аноксии на мутагенез отсутствует (рис.Ю). Это, по-цимому, связано с тем, что при действии заряженных частиц с большей роятностью индуцируются кислороднезависимые премутационные поврежде-я днк.

Рис.Ю. Зависимость выживаемости С а) и частоты мутирования (б) клеток ТАЮО от дозы облучения ионами гелия (L = 38 кэв/мкм). облучение проводили в нормальных условиях (□), з аноксии (И) и в аноксии в присутствии TAN (Д) По оси абсцисс: доза облучения, Гр. ; по оси ординат: (а) фракция выживших клеток, отн. ед., (б) частота мутирования, отн. ед.

пияние аноксического сенсибилизатора TAN на индукцию мутаций злучениями с разной ЛПЭ

Известно, что в условиях аноксии ряд агентов химической природы ффективно сенсибилизирует клетки к летальному действию излучений, становлено, что нитроксильные стабильные радикалы способны образовы-ать ковалентные связи с радикалами азотистых оснований, что меняет

Ю-'1-' 'i''! ' ' i .

О 100 200 ЗОС 100

Доза, Гр.

исходную структуру повреждений ' и препятствует репарационному синте: ДНК (Hohman et al., 1976). С учетом этого нами было выдвинуто предт ложение о том, что представитель группы N-оксилов - TAN (2,2,6,1 тетраметил-4-пиперидон-Н~оксил) может существенно модифицирова-мутационный процесс.

На рис.8 представлены кривые выживания использованных штаммов п у-облучении в нормальных условиях, в аноксии и в присутствии анокс: ческого сенсибилизатора. Видно, что TAN оказывает на выживаемое клеток ТА98 и ТА100 выраженное сенсибилизирующее действие. Для штам ТАЮ2 сенсибилизирующее влияние меньше, величина ФИД равна 1,3+0, Различная степень сенсибилизации, по-видимому, обусловливается те что клетки штаммов ТА98 и ТА100 являются дефектными по штВ-зависим эксцизионной репарации.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что у-индуци рованный мутагенез у аноксических клеток S.typhimurium в значительн мере зависит от присутствия TAN в процесе облучения (рис.11). Модиф цируемость у-индуцированного мутагенеза у различных штаммов Эйм аноксическим сенсибилизатором TAN объясняется влиянием двух факторо Во-первых, TAN в условиях аноксии, взаимодействуя с радиационно

100 ЮО ЮО

Доза, Гр.

Рис.11. Зависимость частоты мутирования клеток S.typhimurium та (а), таюо (б) и таю2 ■ (в) от дозы y-облучения в аноксии (В) и аноксии в присутствии TAN (4). По оси абсцисс: доза облучени Гр. ; по оси ординат: частота мутирования, отн.ед.

дуцированными радикалами днк, образует аддукты с основаниями ДНК, ежде всего с пиримидинами (Frank et al., 1985). Причем, эксцизионная 2Л-зависимая репарация ДНК не в состоянии восстановить повреждения кого типа, и в этом случае требуется индукция медленной мутагенной парации. Во-вторых, известно, что TAN резко увеличивает SOS - ответ оксических клеток E.coli при у-облучении (Комова О. В. и соавт., 90). Модификация радиационно-индуцированных радикалов пиримидина и тивация ошибочной репарации в присутствии TAN, по-видимому, ведет к ¡ачительноиу увеличению мутагенеза у штаммов ТЛ98 и ТАЮО.

Существенно меньшее влияние TAN на y-индуцированный мутагенез [еток ТАЮ2 (ФИД!=2,1±0,2) связано, по-видимому, со свойствами мишени ¡вертирования, ведущей к замене A-T пары оснований. Известно, что ■оксилы эффективно взаимодействуют с радикалами тимина, причем, ¡которые повреждения тимина, ведущие к замене A-T пары оснований •идропероксиды тимина и продукты их деградации), могут возникать >лько в присутствии кислорода (Teoule, 1987). Участие таких поврежде-1й в мутагенезе подтверждает наличие КЭ у штамма ТАЮ2. Таким обрати, небольшой модифицирующий эффект у—индуцированного мутагенеза у гамма ТАЮ2, обусловленный TAN, связан с характером конкретного злекулярного нарушения ДНК.

Сравнивая модифицирующее влияние TAN на мутагенез штамма ТАЮО ри действии у-лучей и ионов гелия (рис.10) выявлено, что величина при увеличении ЛПЭ излучения уменьшается, что повидимому, свиде-зл'ьствует об увеличении выхода повреждений слабо модифицируемых TAN. ак мы указывали, данными повреждениями могут быть комплексные повреж-ения ДНК, которые сами по себе, без модификации TAN, являются пре-утационными событиями.

Таким образом, совокупность полученных нами материалов свидетель-твует о том, что специфика мутагенного действия ионизирующих иэлуче-ий с различными физическими характеристиками на клетки прокариот пределяется характером премутационных повреждений ДНК. Это обстоя-ельство в свою очередь находит подтверждение в особенностях модифици-ующего влияния агентов различной природы.

выводы

1. Зависимость эффективности мутагенного действия ионизирукшш излучений от величины ЛПЭ определяется характером премутационньп повреждений ДНК.

2. Модифицирующее влияние глицерина и цистеамина на радиационно-индуцированный мутагенез у клеток S.typhimurium различно. Глицери1 уменьшает мутагенное действие r-излучения, цистеамин является малоэффективным агентом.

3. С возрастанием ЛПЭ излучений защитное действие глицерина нг частоту мутирования клеток снижается.

4. модифицирующее влияние аноксии на r-индуцированный мутагенез j клеток S.typhimurium определяется характером премутационных нарушени{ ДНК. Реверсии, обусловленные заменами в А-Т и G-C парах оснований, являются соответственно зависимыми и независимыми от кислорода.

5. Аноксический сенсибилизатор TAN вызывает резкое повышение частоты мутирования клеток при у-облучении в условиях аноксии. Степень сенсибилизации зависит от характера нарушений, определяющих мутантны? фенотип. С повышением ЛПЭ излучений сенсибилизирующее влияние TAí снижается.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Козубек е., Красавин Е.А., Амиртаев К.Г., Баша с.Г., Токарова Б. Мутагенное действие излучений с разной ЛПЭ на клетки салмонеллы (штаммы Эймса) I.Индукция ревертантов у клеток S.typhimurium при у-облучении.// Труды рабочего совещания по генетическому действик корпускулярных излучений. Дубна. ОИЯИ. Д19-89-143. 1989. С.15-27.

2. Козубек е., Красавин Е.А., Амиртаев К.Г., Баша С.Г., Токарова Б. Мутагенное действие излучений с разной ЛПЭ на клетки салмонеллы (штаммы Эймса) IX.Индукция ревертантов у клеток S.typhimurium при действии тяжелых ионов.// Труды рабочего совещания по генетическому действию корпускулярных излучений. Дубна. ОИЯИ. Д19-89-143. 1989. С. 28-39.

3. Баша С.Г., Красавин Е.А., козубек е., Амиртаев К.г. Влияние глицерина на r-индуцированный мутагенез у клеток S.typhimurium.// Радиобиология. 1990. Т.30. Вып.2. С.185-189.

Баша С. Г., Красавин Е.А., Козубек е., Амиртаев К.Г. Модификация у-индуцированного мутагенеза у тест-штаммов Эймса. I.Влияние радиопротекторов на мутагенез у клеток S. typhimurium.// Труды рабочего совещания по исследованию механизма радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК. Дубна, оияи. Д19-90-457. 1990. С.30-38. Баша с.Г., Красавин Е.А. , Козубек е., Амиртаев К.Г. Модификация г-индуцированного мутагенеза у тест-штаммов Эймса. II.Влияние TAN на мутагенез у клеток S.typhimurium.У/ Труды рабочего совещания по исследованию механизма радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК. Дубна. ОИЯИ. Д19-90-457. 1990. С.39-45.

Krasavin Е.А., Basha S.G., Kozubek s. The modification of mutagenesis indused by heavy ions in Salmonella tester strains.// Extended abstracts fourth workshop on heavy charged particles in biology and medicine. GSI-91-29 Report. September 1991. ЕЮ. P.1-3. Basha S.G., Krasavin E.A., Kozubek S. The effect of anoxic radiosensitizing agent TAN on induction of revertants by r-reys and helium ions in Salmonella tester strains. //Mutat.Res. 1991. (принято в печать).

Basha S.G., Krasavin E.A., Kozubek S. Radioprotective action of glycerol and cysteamin on inactivation and mutagenesis in Salmonella tester strains after gamma and heavy ions irradiation.// Mutat.Res. 1991. (принято в печать).

Kozubek S., Krasavin E.A., Horneck G., Amirtaev K.G., Tokarova В., Basha S.G., Komova O.V., Ogievetskaja M.M., Soska J. A radiobiological model on cellular damage induced by ionizing radiation and its repair in bacteria.// Mutat.Res. 1991. (принято в печать).

ЛИТЕРАТУРА

Амиртаев К.Г. и соавт. Studia boiphisica. 1985. Т.106. с.131-142. Бреслер с.е., Носкин л.а. Радиобиология. 1978. Т.18. с.548-555. Комова 0. В. и соавт. Труды рабочего совещания по исследованию механизма радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК. Дубна. 1990. с.49-58.

Красавин Е.А. Проблема ОБЭ и репарация ДНК. М. Энергоатомиздат. 1989.

Эйдус Л.X., Корыстов Ю.Н. кислород в радиобиологии. М. Энергоатомиздат. 1984.

6. Alper T. Cellular radiobiology. Cambridge- L.- N. I.- Melbourn. Cambridge University Press. 1979.

7. Frank E.H. et al. Can. J. Cheirt. 1985. Vol.63. No.15. P.15-23.

8. Hohman W.F. et al. Int. J. Radiat. Biol. 1976. Vol.30. No.3. P.24'

261.

9. Maron D.M., and Ames E.N. Mutation Res. 1983. Vol.113. P.173-215

10. Teoul R. Int. J. Radiat. Biol. 1987. Vol.51. P.573-589.

Рукопись поступила в издательский отдел 31 октября 1991 года.