Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности морфогенеза нервных сплетений в культуре изолированных нейронов

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности морфогенеза нервных сплетений в культуре изолированных нейронов"

г г о ОД - з те ИР"

На правах рукописи

ЧИСТЯКО ВА Ирина Александровна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОРФОГЕНЕЗА НЕРВНЫХ СПЛЕТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ НЕЙРОНОВ

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология 14.00.02 - анатомия человека

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН, Сан кг- П етербу р г

Научный руководитель: доктор биологических наук,

проф. О.С.Сотников

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Е.И.Чумасов, доктор биологических наук, иед. науч. сотр. Н.И.Чалисова

Ведущее учреждение: 11аучпо-исследовательский институт

экспериментальной медицины РАМН

Защита диссертации состоится « &__» О &__2000 г. и___часов

на заседании Диссертационного соне 1а Д 084.12.03 Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии (194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2).

С диссертацией можно ознакомиться 11 библиотеке Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии.

Автореферат разослан «_ »_____^^______2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор мед. наук, проф. О.С.Кульбах

Е391Л, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Методы культивирования изолированных нейронов, начиная со времени разработки первых из них (Hintzsche,1954; Nakai,1956), широко используются в нейробиологии для решения самых разнообразных фундаментальных и прикладных задач. Особое место в этих исследованиях занимает изучение механизмов и регуляции роста нервных отростков, а также образования специфических синантических связей между нейронами, то есть процессов, лежащих в основе формирования специфических нервных сетей. Интерес к рассмотрению этих вопросов в культуре объясняется тем, что полученные результаты могут быть использованы для раскрытия механизмов формирования нервной системы in vivo - в эмбриогенезе и при ее регенерации после повреждения. Несмотря на большое количество работ в этой области, другие клеточные процессы и общие закономерности морфогенеза нервных сплетений, образуемых нейронами в различных культурах, остаются недостаточно изученными.

Хорошо известно, что нейротрофические факторы, нейротрансмитгеры и субстрат селективно модулируют интенсивность, характер и направление роста отростков. Но также известно, что не меньшую роль в регулировании нейритного роста и формировании нервных сетей в культуре , играют контактные реакции нервных клеток. Однако в исследованиях взаимодействия нейронов внимание уделяется преимущественно сннаптогепезу и контактному торможению роста нервных отростков . Другие контактные реакции изучены слабо. И сегодня сохраняется точка зрения, что нервные отростки in vitro проявляют две модели поведения: фасцикуляторное, когда нейриты объединяются в пучки, и нефасцикуляторное, проявляющееся контактным торможением роста отростков (Dunn, 1971; Trinkaus, 1985). Вопрос о разнообразии и селективности контактных реакций между нейронами в культуре, поднятый Sh.Nakajima (1965), остался открытым. В биологии развития постепенно накапливаются данные о том, что межклеточные контакты способны инициировать реакции специфической клеточной дифференцировки в одной пли обеих контактирующих клетках (Гилберт,!995). В последнее время в работах на культурах нервных клеток появляются отдельные находки и других селективных клеточных реакций на контакт (Kaplliammer et al.,1986; Cooper et al., 1992; Femandez-de-Miguel,Vargas, 1997). Однако остается неясна возможная роль этих процессов в морфогенезе нервных сетей как in vitro, так и in vivo.

В культуре нейронов взрослых моллюсков методом цейтраферной микрокиносъемки была показана способность клеточных тел нейронов к направленному и избирательному движеншо (Костенко,Третьяк,!978; Архипов,Костенко, 1981; Костенко, 1985). Было обнаружено, что перемещение

клеточных тел нейронов происходит внутри собственных отростков (Сотников, 1985). Аналогичные процессы миграции нейронов очевидно имеют место и в агрегациониых культурах (Maar et al.,1997). Однако такой способ движения остается не только неисследованным, но, по-видимому, и мало известным. Тем не менее он играет существенную роль в структурной перестройке, идущей внутри сплетений, и, таким образом, является частью процесса формирования систем нейронов в культуре. Что вызывает такую перестройку и какие закономерности ей присущи остается неизвестным.

Существует точка зрения, что нейротакеис в эмбриогенезе не является специфичным (Trinkaus, 1985). В то же время исследования в культуре изолированных нейронов показали, что конусы роста нейритов способны селективно реагировать на иейрочрансмитгеры, выделяемые соседними нейронами (McCobb ei al., 1988) или вводимые с помощью микропипетки в среду (Zheng et al., 1994). В связи с наличием в литературе таких разноречивых мнений и фактов вопрос О специфичности нейротаксиса в культуре и его вкладе в морфогенез нервных сплетений становится мало понятным и требует дальнейшего изучения.

Вне поле зрения остаются обычно и вопросы, касающиеся способов образования нервных отростков и первичных пучков нейритов, а также особенности созревания и способы элиминации отростков.

Длительное наблюдение за поведением изолированных нейронов, формирующих нервные сети а культуре, вероятно, позволит глубже понять клеточные механизмы, лежащие в основе образования таких сетей. Изолированные нейроны моллюсков являются хорошо изученным и удобным объектом для подобных исследований. Модель локальных сплетений является, по нашему мнению, наиболее подходящей для исследования морфогенеза нервных сетей в культуре, так как позволяет наблюдать отдельное сплетение целиком.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы явилось изучение общих закономерностей и клеточных механизмов морфогенеза нервных сплетений в культуре изолированных нейронов моллюсков. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологическое строение и поведение нейронов непосредственно после изоляции их из мозга.

2. Исследовать формирование первичных сплетений нейронов.

3. Проанализировать процессы структурной перестройки н первичных сплетениях нейронов.

4. Исследовать деструкцию нервных сплетений.

Научная новизна. В проведенном исследовании с использованием фазовоконтрастнон микроскопии и серийной микрофотосъемки впервые подробно изучен процесс формирования целого нервного сплетения в культуре изолированных нейронов. Выявлено два этапа в морфогенезе

сплетений: этап формирования первичного нервного сплетения и этап структурной перестройки первичнообразовапного сплетения. Показано, что формирование нервных сетей в кулыуре основано на нейротаксисе и контактных реакциях нейронов друг с другом. Нейротаксические влияния являются неспецифическими и обусловливают рост нейритов, как правило, к ближайшей мишени. На начальных стадиях образования отростков признаки нейротаксиса могут отсутствовать. Некоторая упорядоченность, свойственная процессам, происходящим на обоих этапах морфогенеза сплетении, определяется контактными реакциями нервных клеток.

В работе подробно описаны типы контактных взаимоотношений между нейронами. Сформулировано положение о той, что в морфогенезе нервных сплетений в кулыуре нейронов существенную роль играет инициация образующимися межнейропными контактами разнообразных клеточных процессов (перемещение клеточных те л нейронов, элиминация нейритов и др.), определяющих последующий вид сплетения.

Выявлено два этапа в формировании отростков и морфологического типа нейронов. Предложена классификация формирующихся в культуре отростков на первичные и вторичные, в основу которой положены способы образования отростков и их морфологическая зрелость. Показаны различные способы образования отростков, в частности, такие, как вычленение отростков из первичных ламелл, содержащих оптически плотные тяжи, и формирование шлейфного отростка. Описан феномен мультипликации оптически плотных гяжей внутри первичных ламелл.

Показано три способа элиминации нервных отростков: ретракция (втягивание в тело клетки), тотальное истончение и фрагментация. Обнаружено формирование колб рефакции на обоих концах полностью изолированного фрагмента нейрита. Детально рассмотрен процесс формирования цитосомы, как вариант фрагментации отростков. Показано, что цитосомы являются жизнеспособными и автономными образованиями, которые могут формировать небольшие нейриты.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы имеют главным образом теоретическое значение. Полученные данные представляются важными для раскрытия клеточных механизмов формирования нервных сетей в культуре изолированных нейронов, а также могут быть использованы при исследовании механизмов формирования нервной системы в эмбриогенезе.

Результаты и выводы исследований имеют и некоторое практическое значение, так как возможно их применение при изучении репаративных процессов в нервной системе. Кроме того они могут быть включены в учебные курсы по неиробнологии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: XI., конференции студентов и аспирантов морфологических кафедр и

лабораторий Санкт-Петербургских пунш и НИИ, посвященной 125-летию со дня рождения академика В.Н. Шевкуненко (С.-Петербург, 1997); Научном совещании, посвященном 100-летию со дня рождения Н.Г.Хлопина (С.-Петербург, 1997); Международном симпозиуме, посвященном памяти академика В.Н. Черниговского (С.-Петербург, 1997); объединенном заседании трех обществ - СПб общества анатомов, гистологов и эмбриологов, СПб общества естествоиспытателей и СПб общества физиологов, биохимиков и фармакологов им. И.М. Сеченова (С.-Петербург, 1998); Научной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения профессора Е.А.Дыскина (С.-Петербург, 1998); 11 Международном симпозиуме «Структура и функции вегетативной нервной системе» (Воронеж, 1998); XVII Съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 195 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания метода и объекта исследования, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 214 источников. Работа иллюстрирована 61 рисунком и 3 таблицами.

МЕТОД И ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Материалом для культивирования служили нейроны ганглиев окологлоточного кольца взрослых моллюсков Ьутопаеа Б1ацг1аиБ (Большой прудовик).

Техника выделении и культивирования нейронов. Неидентнфицированиые нейроны выделяли и культивировали по методу, разработанному М.А. Костенко (1972; 1978). Выделение нейронов из ганглиев производили ферментативио-механическим способом. Продолжительность проназироиаиия ганглиев составляла 40-60 минут при температуре 20°С. Пипетирование осуществляли с помощью Г-образных микропипеток с диаметром кончиков 0,8 и 0,6 мм. Варьирование временем проназирования, концентрацией нроназы и активностью пипетирования позволило выделять либо полностью изолированные тела нервных клеток, либо нейроны с фрагментами нервных отростков. Нейроны культивировали на стекле (без использования специального покрытия) в камерах двух видов. 1. Стеклянные кольца высотой 0,8 см и диаметром 0,8 см, прикрепленные смесью парафина и вазелина ко дну стеклянной чашки Петри или к покровному стеклу. 2. Модифицированная нами камера Карелля объемом 4мл с двумя круглыми отверстиями диаметром 0,8 см на верхней и нижней стенке, которые закрывались покровными стеклами и запаивались смееыо парафина и вазелина. Культивирование нейронов на нижнем покровном стекле модифицированной камеры Карелля позволило производит!, микроскопированне при больших увеличениях (с объективами х40 и х60)

инвертированного микроскопа, в. результате чего стало возможным наблюдать детали растущих нейронов, невидимые на малых увеличениях или в результате рассеяния спета при прохождении его через толстое дно чашки Петри. Клетки культивировали в течение 10 суток без смены питательной среды.

Растворы. Для содержания окологлоточных колец и приготовления ферментативного раствора использовали физиологический раствор для моллюсков следующего состава (мМ): 90NaCI, 5K.CI, 2CaCI2, l,5MgCh, 50мкг/мл гентамицина сульфата, 0,3'Грис, рН7,6. Ферментативная обработка производилась 0,2-0,4% раствором проназы (Sigma). Питательная среда приготовлялась путем разведения стандартной среды Rl'Ml-1640 солевым раствором, содержащим (мМ): 75NaC'l, 5КС1, 2,5CaCl2, 2,5MgCl2, 0,3'Грис, pi 17,6.

Оборудование. Снеговая микроскопия осуществлялась с помощью инвертированного фазовоконтрастного микроскопа МБИ-13 (JIOMO) с водно-тепловым фильтром. Для микроскопировашш при больших увеличениях использовали фазовые объективы фирмы Zeiss (Ph0,40; Ph0,60). Серийную фотосъемку производили фотокамерой "Зоркин-4К" на пленку Микрат-200 или Микрат-орго.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Строение и поведение нейронов нспосредстпенно после их изоляции

Полярность и отростчатостъ нейронов. Проведенное исследование показало, что преобладающими в ганглиях моллюсков являются одноотростчатые униполяры. Однако, кроме них встречаются также двух- и даже трехотроегчатые нервные клетки, относящиеся к уни- и биполярам. Таким образом, многоотростчатые клетки не всегда идентичны мультиполярам. Истинных мультиполяров, аналогичных мультиполярам позвоночных, у моллюсков обнаружить не удается.

Двигательная активность отростков, связанных с телом нейрона. Общей тенденцией нейритов, сохранившихся после диссоциации ганглиев, является их активное сокращение, приводящее к полному округлению клеток. Скорость укорочения отростков колеблется у исследованных нейронов от 0,06 до 4,16 мкм/мии. Многократные измерения длины отростков показали, что двигательная активность нейритон часто имеет фазный, волнообразный характер. Вслед за фазой ретракции следует либо фаза покоя, либо фаза удлинения (экструзии) отростка. Экструзия отростков проявляется образованием филоподий и мелких ламелл на концах ретрагирующих отростков. При этом колбы ретракции могут оставаться выраженными. Фазы

удлинения отростков, видимо, можно рассматривать как абортивные попытки регенерации поврежденного нейрита. Возникающие у нейритов периоды покоя продолжались от I до 95 мни. Средняя результирующая скорость укорочения нейритов (0,84*0,27 мкм/мин) оказывается в итоге существенно меньше средней скорости сократительного процесса нейритов в фазу их ретракции (2,4±0,5 мкм/мин).

Кроме этого, было обнаружено, что движения разных нейритов одного и того же нейрона несинхронны. Отмечены также случаи, когда у двухогростчатого нейрона сокращался только один нейрит.

Двигательная активность ценностью изолированных отростков. При исследовании нейритов, полност ью изолированных от тел нейронов, мы наблюдали появление колб ретракции как на одном, так и на обоих концах изолированного фрагмента нейрита. Средняя результирующая скорость укорочения таких фрагментов равнялась 0,18 ^,06 мкм/мин. В процессе сокращения нейритов отмечено возникновение фаз покоя, а также периодическое появление гонких филоподий. Таким образом, поведение изолированного фрагмента нейрита напоминает поведение оборванного нейрита, соединенного с телом нейрона. При этом размах наблюдаемых изменений и, соответственно, результирующая скорость сокращения у изолированного нейрита гораздо меньше.

Тот факт, что сходные волновые процессы протекают п у нейритов, соединенных с телом нейрона, и у полностью изолированных фрагментов отростков, по-видимому, свидетельствует о том, что механизмы, лежащие в основе двигательной активности таких отростков являются автономными, то есть не зависящими от процессов, идущих в соме клетки.

Двигательная активность безотростчатых нейронов. Отметим, что культивируемые нервные клетки в течение первых суток не распластываются на стекле и остаются слабо прикрепленными к дну камеры. После ретракции отростков и округления тел нейронов в 'этот период времени наблюдается два варианта их подвижности, связанной с возникновением гомогенных выпячиваний. Часть нервных клеток формирует множественные относительно мелкие округлые обводненные выпячивания, локализация которых может изменяться в течение минут. В результате нейроны демонстрируют колебательные движения. Другие клетки испытывают поляризацию. Ядро и гранулярная цитоплазма располагаются на одном полюсе, а на другом полюсе образуется крупное овальное гомогенное выпячивание, лишенное гранул. При тгом клетка медленно смещается но субстрату в направлении этого выпячивания. Возможно, образование гомогенных выпячиваний, обусловливающих двигательную активность нейронов, является признаком повреждения клеток. Аналогичные, только более выраженные обводненные гомогенные участки цитоплазмы наблюдаются и у безнадежно травмированных в процессе выделения клеток.

Отметим также, что большинство безотростчатых нейронов до начала формирования у них отростков остаются неподвижными.

Наблюдения показали, что перемещение одиночных безотростчатых нейронов в этих условиях не является направленным. Кроме того, такое движение клеток происходит очень медленно и на незначительные расстояния. Тем не менее, оно может привести к объединению близлежащих нейронов в мелкие клеточные агрегаты. При этом наблюдается различная степень агрегации от слабого касания до образования плотного агрегата, что, по-видимому, определяется мембранной специфичностью нервных клеток. Таким образом, упорядоченность в такой системе создается только колебательными движениями нейронов и гетерогенностью их мембран, обусловливающих степень агрегации клеток.

Поведение пейроно» при формировании первичных локальных нервных сплетений п культуре

Помещенные в культуру нейроны ведут себя разнообразно. Отмечается гетерохрония распластывания нейронов и начала образования у них отростков, а также кажущиеся направленными перемещения клеток. Некоторые нейроны быстро собираются в агрегаты, другие длительное время остаются одиночными. Диаметры клеток меняются, что связано со степенью их распластывания.

Способы обраювшшя отростков. К концу первых суток часть нейронов начинает давать отростки. При этом у одних нейронов отмечается мощный рост нейритов, у других после формирования коротких отростков или ламелл происходит торможение их дальнейшего развития. Время появления отростков и интенсивное п. их развития не зависят от диаметра клетки.

Среди появляющихся отростков мы выделяем первичные и вторичные. Первично формирующиеся отростки имеют гомогенную, лишенную видимых цитоскелетных структур и включений цитоплазму, либо содержат локальные участки оптически более плотных цитоскелетных структур, имеющих форму тяжей, внутри гомогенной цитоплазмы. Первичные отростки по форме могут быть широкими пластинчатыми или венечноподобнымп (ламеллы), узкими лентовидными и нитевидными. Венечноподобные ламеллы завершаются множественными игольчатыми филоиодиями, направленными но радиусам от тела клетки. Существование такого разнообразия типов первичных отростков (от нитевидных до венечноподобных) свидетельствует о различиях адгезионных свойств культивируемых нервных клеток.

Первичные ламеллы близкорасположенных нейронов могут устанавливать между собой контакты с сохранением щелевидного пространства (осуществляются топкими микровыростами), наползать друг на

друга и даже образовывать структуры, напоминающие синцитий кольцевидной формы. Таким образом, уже у первичных отростков имеются различные варианты контактных взаимоотношений, свидетельствующие, по-видимому, о наличии специфических типов мембранных молекулярных взаимодействий, в основе которых лежат качественные различия между клеточными поверхностями разных нейронов.

Образование вторичных отростков осуществляется двумя способами. Наиболее распространенным из них является "вычленение" вторичных отростков из первичных, когда происходит уплотнение цигоскелетных тяжей и одновременное истончение участков гомогенной цитоплазмы вплоть до их полного исчезновения. В результате из одного первичного отростка может образоваться от одного до множества вторичных отростков. Отметим, что в ряде случаев, еще до начала процесса «вычленения» вторичных отростков, внутри первичных ламелл наблюдается перестройка цитоскелетных тяжей, сопровождающаяся их мультипликацией. В дальнейшем из таких ламелл формируются несколько параллельно идущих отростков, напоминающих рыхлый пучок. Другая форма нейритогенеза - это превращение первичных лентовидных и нитевидных отростков во вторичные путем их тотального обогащения оптическиплотньш материалом. Таким образом, на ранних стадиях нейритогенеза количество отростков у некоторых нейронов непостоянно.

Морфологические типы нейронов, формирующих отростки. В односуточной культуре нейронов но количеству и локализации первичных отростков можно выделить двухотростчатые биполяры, многоотростчатые мультиполяры и нейроны с ламеллярным венчиком. Однако такие первичные клеточные формы часто носят временный характер. Устойчивые клеточные формы связаны с образованием вторичных отростков, сопровождающимся трансформацией части нейритов.

В двухсуточной культуре, где уже можно различить формирующиеся вторичные отростки, несколько увеличивается количество многоотростчатых клеток, разнообразие которых может быть рассмотрено с точки зрения двух признаков - количества отростков и равномерности их роста. Одни клетки формируют несколько нейритов, и скорость их роста часто оказывается различной у одной и той лее клетки. Иногда можно наблюдать значительное преобладание роста одного нейрита. Другие нейроны демонстрируют относительно равномерный рост многочисленных отростков, доходящий до двух десятков. Среди них можно выделить типичные мультиполяры, а также биполяры, у которых от одного полюса отходят один или два отростка, а все остальные формируются внутри первичной ламеллы на другом полюсе. Несмотря па разнообразие форм многоотростчатых нейронов, наиболее распространенной клеточной формой па данных сроках культивирования является двухотростчатый билоляр.

Все эти клеточные формы наблюдаются как среди одиночно лежащих нейронов, удаленных от других клеток и их скоплений, так и в группах близлежащих нейронов. Более того, из опыта в опыт встречаются клетки, имеющие, на данных сроках культивирования характерные варианты форм. Вероятно, устойчивые клеточные формы достаточно жестко генетически детерминированы и минимально подвержены внешнему влиянию. Однако необходимо отметить, что вторичные клеточные формы хотя и выглядят генетически детерминированными, они не соответствуют морфологическим типам этих нейронов в условиях нативного мозга. Такое несоответствие отмечено и для культивируемых эмбриональных нейронов чувствительных ганглиев позвоночных (Limisdeii, 1951; Чумасои,1981). По-видимому, появление разнообразных клеточных форм наиболее заметно в культурах нейронов, имеющих m vivo преимущественно униполярную форму, что не исключает трансформацию формы у нейронов в полиморфных клеточных культурах.

Характер роста нейритов и образования первых контактов. Начальный рост нейритов не имеет выраженной адресности (направленности), и отростки имеют тенденцию к радиальному распределению. Контакты, образуемые подрастающими нейритами на телах близлежащих клеток или их отростках, носят случайный характер. Однако постепенно начинают проявляться отдельные признаки нейротаксиса: плавные аркадоподобные повороты и рост отростков друг к другу или к телу собственной клетки, а также в сторону близлежащего нейрона или от него.

Двигательная активность нейронов и формирование клеточных агрегатов. После установления растущими отростками и ламеллами контактов с другими клетками может происходить сближение контактирующих нейронов путем перемещения клеточных тел внутри этих отростков и ламелл. Возникающие при этом нейронные агрегаты часто оказываются нестабильными образованиями, и через некоторое время клетки могут разойтись. В других случаях, напротив, площадь контакта между клетками в агрегате со временем увеличивается, а агрегат уплотняется. Граница в области контакта часто не просматривается, что напоминает слияние. Движение нейронов виугри агрегатов осуществляется тем же способом, что и движение одиночных нейронов - перемещением гранулярной цитоплазмы клеточных тел внутри гомогенной цитоплазмы ламелл. Таким образом, клеточная агрегация является динамичным процессом, что, вероятно, свидетельствует об изменении мембранных свойств в процессе репарации нейронов после повреждения.

Безотростчатые клетки, вошедшие в состав агрегата, могут давать отростки. У клеток, уже имеющих нейриты на момент контакта, продолжается их дальнейшее формирование по описанным выше схемам. Нейришгенез у агрегированных клеток позже заканчивается образованием

нервных пучков, выходящих из агрегата. Реже агрегация нейронов приводит к торможению уже имеющегося роста нейритов у одной или нескольких клеток и даже к элиминации отростков и уплотнению в дальнейшем агрегата, приобретающего глобулярную форму. Таким образом, контактное торможение роста отростков не всегда происходит с прерыванием связи, инициирующей реакцию, что может рассматриваться как разновидность классического контактного торможения. Эти наблюдения позволяют предположить, что как торможение роста отростков у агрегированных нервных клеток, так и сама агрегация нейронов могут являться селективными клеточными реакциями, зависящими от свойств контактирующих клеток.

Проведенное исследование показало, что сразу же после образования первых межнейронных связей в формирующемся сплетении начинают проявляться признаки структурной перестройки, наиболее выраженной в последующие дни культивирования. Очевидно, что структурная перестройка иинциирусгся образующимися между клетками контактами. На данных сроках культивирования она проявляется начальными этапами направленного движения клеточных тел, торможением роста некоторых неГфитов, изменением адгезионных свойств и даже гибелью отдельных нейронов. Таким образом, уже в ранней культуре нейронов при формировании нервных сетей просматривается некоторая упорядоченность морфогенетических процессов, обусловленная детерминированностью свойств нейронов и межклеточными взаимодействиями.

Ядро и ядрышки культивируемых нейронов. На вторые сутки как у одиночных, так и у агрегированных нейронов становятся отчетливо видны ядро и ядрышки, что связано с распластыванием клеток. Ядро крупное, занимает приблизительно половину объема клеточного тела. Располагается оно эксцентрично, приближаясь к внутренней мембране метки, часто имеет бобовидную или близкую к пей форму. Ядро может также полностью заполнять одну из половин тела нейрона, повторяя его очертания. Количество ядрышек у разных клеток может варьировать от 3 до 30 и более. У активно растущих нейронов число ядрышек значительно больше, чем у клеток со слабыми ростовыми потенциями или безотроетчатых. Разница в количестве ядрышек у таких клеток может достигать порядка. По-видимому, в процессе роста отростков имеет место усиление рибосомального синтеза с образованием ck novo многочисленных ядрышек.

Глипльные клетки и их чшимоотношеиче с нейронами. В культуре присутствуют немногочисленные глнальпые клетки, имеющие множественные короткие топкие отростки. Среди них различаются два типа -глиоцнты звездчатой и неправильной удлиненной формы. Образование нитевидных отростков у глиоцитов происходит путем вычленения их из первичных ламелл, то есть аналогично формированию вторичных отростков у нейронов. У близлежащих клеток глнальпые отростки хаотично

• .

переплетаются. Глиоцитм на протяжении всего срока культивирования остаются неподвижными.

Растущие нейриты неизменно огибают встречающиеся на их пути глиоциты, не приближаясь к клеточным телам более, чем на расстояние, рапное длине глиальных отростков. Однако растущие отростки глиальных клеток могут устанавливать контакты с телами и отростками нейронов. При этом очевидно, что глиальные отростки испытывают нейротаксические влияния.

Вторая волна образования нейритов и завершение формирования первичных нервных сплетении. В конце вторых суток культивирования наблюдается новая волна прорастания, а именно появление первичных отростков у тех нейронов, которые за двое суток не проявляли никаких признаков роста. В результате этих двух ростовых толчков почти все нейроны, за редким исключением, обладают к этому времени первичными или вторичными отростками. Увеличивается количество связанных между собой нейронов и нейронных агрегатов и появляются первые ячейки сплетения - замкнутые пространства, ограниченные отростками и телами нейронов. В группах близлежащих клеток обозначаются границы первичных локальных сплетений.

Структурная перестройка первичных локальных нервных сплетений в культуре

К началу третьих суток культивирования наблюдается картина разрозненных структурно очерченных небольших локальных сплетений, содержащих отдельные нервные клетки и нейронные агрегаты. На протяжении последующих четырех суток внутри этих сплетений идуг процессы сближения и расхождения клеточных тел, рост и ветвление нейритов, формирование новых и перестройка уже имеющихся связей с истончением и элиминацией одних отростков и укреплением других.

Закономерности двигательной активности нейронов. Распад агрегатов. Несмотря на то, что любое движение нейронов осуществляется одним и тем же способом - перемещением клеточных тел внутри собственных отростков -, скорость сближения клеток после установления между ними ламеллярного перешейка явно превосходит скорость расхождения нейронов с сохранением такого же ламеллярного перешейка. В результате, расхождение клеточных тел и распад некоторых агрегатов становятся заметными только к началу третьих суток. Кроме того, максимальная скорость сближения нейронов, контактирующих отростками, имеет место только в тех случаях, когда это сближение заканчивается образованием агрегата. Если же в дальнейшем нейроны не вступают в контакт своими телами, то скорость их движения навстречу друг другу по

ламсллярному перешейку сравнима со скоростью расходящихся клеток. Одиночно лежащие нейроны, имеющие отростки, но не установившие связь ни с одной клеткой, обладают очень слабыми двигательными потенциями. Движение же безотростчатых нейронов, имеющееся в отдельных случаях, является еле заметным.

Иными словами, образование связи между клетками часто является стимулом к перемещению их тел внутри собственных отростков. Направление и скорость этого движения определяются какими-то внутренними процессами, идущими в нервных [слетках. Очевидно, что сигналы, запускающие эти внутриклеточные процессы, передаются в месте контакта. Таким образом, такая передача сигнала, вероятно, осуществляется через молекулярные взаимодействия контактирующих мембран. Однако, не исключено, что роль сигналов могут играть молекулы или ионы, поступающие из одной клетки в другую в месте контакта. На возможность этого указывают литературные данные о формировании проницаемых контактов между нейронами в культуре (Üivd,James, 1973; Lin,Levitan,l991; Скибо,Коваль,1992; ('ermitufez-cle-Miguel, Vargas, 1997). Необходимо также заметить, что в местах контактов культивируемых нами нейронов границы клеточных тел и отростков часта не просматривались даже в фазовом контрасте. Таким образом, отсутствие синцития, по крайней мере в данной культуре, также нельзя считать доказанным.

С точки зрения положения об инициации межклеточными контактами направленной нейронной подвижности может быть легко объясним феномен усиления агрегации нейронов с ростом плотности клеток в культуре. Чем больше плотность нейронов в культуре, тем больше вариантов контактных взаимовлияний и, соответственно, разнонаправленной двигательной активности тел нейронов. Таким образом, рассортировка нейронов должна происходить активнее и полнее в вьгеокоплогкых культурах. Действительно, культуры с низкой плотностью посева, как в нашел« случае, имеют более диффузный характер и многочисленные мелкие агрегаты, а в культурах с высокой плотностью посева образуются крупные агрегаты (Maar et al.,1997; Monnerie et al.,1997).

Ветвление и созревание отростков. В течение третьих - пятых суток культивирования и дуг процессы удлинения и ветвлення уже сформированных ранее нейритов, но количество основных отростков у клеток практически больше не меняется. По ходу растущих нервных отростков и на их концах часто образуются расширенные цитонлазматические площадки. Встречаются и небольшие ответвления в виде площадок. Кроме того, от отдельных нейритов отходят многочисленные короткие иорсинконодобные выросты, что может рассматриваться как множественные попытки роста. Лишь некоторые боковые ответ вления, осгаваись тонкими, достигают значительной длины или становятся полноценными широкими ветвями. Длинные тонкие ответвления

могут образовывать густую сеть, а короткие веточки - множественные параллельные дублирующие связи между соседними отростками даже одной и той же клетки ("лестничная" система).

По мере роста и созревания нейриты, с одной стороны, истончаются, а, с другой стороны, по-видимому, обогащаясь цитоскелетными элементами, становятся оптически более плотными. При этом часто выявляется неоднородность оптической плотности различных участков нейритов.

Перестройка нсйршпной септ. Одновременно с процессами роста и созревания нейритов идет реструктуризация нейритной сети. Отдельные отростки расширяются, становятся более выраженными, а другие, наоборот, истончаются. На концах некоторых нейритов встречаются конусы ретракции. Процесс деструктивного истончения отростка или его ответвлений может начаться в любой момент независимо от стадии созревания, в которой находятся отростки, и иногда заканчивается их полной элиминацией.

Оба феномена, как расширение, так и сужение нейритов, вероятно, связаны с изменением адгезионных свойств мембраны отростков, а также с неравномерностью поступления нейроплазмы в разные отростки. По-видимому, на эти процессы оказывают влияние нейротаксические факторы, так как наибольшее развитие получают отростки, направленные в сторону мишени. Кроме того, к сужению нейрита может привести установление им контакта с телом другого нейрона. При гзтом в истонченном участке нейрита наблюдается уменьшение оптической иготности.

То, что истончение нейритов в одних случаях ведет к их деградации, а в других является элементом их созревания, по-видимому, напрямую связано со степенью обогащенное! и отростков цитоскелетными элементами. Деструктивно истончающиеся первичные нейриты являются оптически менее плотными. Отростки, суживающиеся в процессе созревания, наоборот, характеризуются повышенной оптической плотностью.

Неиротаксис и пейритотаксис. К третьим суткам культивирования становится отчетливо видно, что основные отростки нейронов изменяют направление своего роста в сторону соседних (ближайших) клеток или их отростков. Таким образом, п большинстве случаев нейротаксис кажется неспецифическим. Однако, п проявлении нейротаксических процессов может просматриваться и некоторая избирательность. Так, иногда нейриты растут к отдаленным нейронам и игнорируют близлежащие. Кроме того, в отдельных случаях растущие нейриты, подойдя на некоторое расстояние к нервной клетке, лежащей на их пути, обходят ее или даже прекращают рост, что может рассматриваться как отрицательный таксис.

Пейритотаксис в этом отношении кажется еще более неспецифическим, что проявляется, и частности, в образовании многочисленных аркад и системы ячеек сплетения,

Контактное торможение роста отростков. Морфологические тины межнеироппых контактов. Более избирательным является контактное узнавание. Рост отростков навстречу друг другу или к соседней клетке может закончиться либо формированием связи определенного морфологического типа, либо остановкой роста с развитием ретрактильных процессов, что может быть отнесено к классическому контактному торможению, Возникающие связи можно разделить на две группы. К первой группе относятся такие контактные взаимоотношения, которые не вызывают остановку роста подросшего к мишени нейрита. Они включают следующие морфологические типы. 1. Пересечение одного отростка другим или подрастание нейрита под лежащую на его пути нервную клетку. 2. Рост нейрита по периметру тела нейрона, лежащего на его пути (огибание) или рост одного нейрита вдоль другого («пионерный рост») либо с плотным прилеганием контактирующих поверхностен, либо с сохранением видимой щели между поверхностями, когда контактирование осуществляется тонкими микровыростами. Вторая группа включает в себя контактные взаимоотношения, сопровождающиеся остановкой роста подросшего к мишени нейрита и изменением формы его терминали. В зависимости от формы терминали различаются несколько морфологических типов. 1. Образование широкой оптически светлой ламеллы в месте контакта с мишенью. 2. Формирование конусовидной оптически плотной терминали.

3. Формирование терминальных бутонов, напоминающих синаптические.

4. Образование контакта между двумя встречными отростками по типу «конец в конец» с некоторым расширением терминален и сохранением видимой щели между ними.

Необходимо также отметить, что контактные отношения между отдельными нейронами со временем могут измениться. Возможно прерывание первоначально сформированной связи или изменение морфологического типа контактирования. Такое разнообразие и непостоянный характер морфологических типов контактных взаимоотношений между нейронами на ранних сроках культивирования, возможно, указывает на наличие специфических типов мембранных молекулярных взаимодействий, некоторые из которых, по-видимому, запускают сложные процессы формирования специализированных контактов, а также фасцикуляцию нейритов.

Формирование пучков нейритов в условиях нашей культуры, по-видимому, происходит под воздействием двух факторов: нейротаксиса и контактного узнавания, проявляющегося формированием контактов между нейритами. Рост одного нейрита вдоль другого с образованием контактов между их поверхностями (так называемый «пионерный рост») приводит к формированию плотного пучка. При этом может быть плотное прилегание поверхностей нейритов в пучке или сохранение видимой щели между

нейритами, соединенными тонкими микровыростами. Контактные взаимоотношения между нейритами, формирующими плотный пучок, могут изменяться, что, по нашему мнению, указывает на специфичный характер образуемых связей.

При наличии мощного источника нейротаксических влияний и неспособности образования протяженных контактов растущие отростки одного или нескольких нейронов формируют рыхлый пучок. При этом при наличии контактного торможения между отростками они показывают строго параллельный рост и нигде не пересекаются. При отсутствии контактного торможения отростки в пучке могут пересекаться.

Дополнительная перестройка локальных сплетений, вызванная включением новых клеток Одновременно с непрерывно идущими внутри локальных сплетений процессами их формирования и перестройки происходит расширение самих локальных сплетений путем включения в них новых клеток. Включение новых клеток влечет за собой дополнительную перестройку в локальном сплетении, так как новообразованные связи способны инициировать новые перемещения клеточных тел, а также прерывание одних связей и возникновение или укрепление других. Движение клеток может закончиться формированием новых или изменением и даже распадом имеющихся агрегатов. Таким образом, расширение локального нервного сплетения с включением в него новых клеток нарушает равновесие в уже сбалансированной системе и влечет за собой корректировку имеющихся связей. При этом перестройка может быть настолько выраженной, что возможно смещение функции организационного центра сплетения от одного нейрона или группы нейронов к другим.

Наблюдаемая активная перестройка внутри локальных сплетений свидетельствует о возрастании степени упорядоченности морфогенетических процессов на данных сроках культивирования, что связано, вероятно, с восстановлением свойств клеточных мембран и ростом разнообразия контактных клеточных реакций.

Необходимо отметить, что точка зрения об инициации образующимися • контактами специфических клеточных реакций не является на сегодня устоявшейся. Хорошо известно лишь о специфической индукции межклеточными контактами процессов дифференцировки клеток (так называемая эмбриональная индукция). Однако имеются отдельные находки и других селективных клеточных реакций на контакт в культурах нейронов, изолированных как из эмбриональной мозговой ткани, так и из мозга взрослых животных (Kapfliammer et al.,1986; Cooper et al.,1992; Fernandez-de-Miguel, Vargas, 1997). Некоторые из описанных нами контактных взаимодействий между нейронами в культуре были показаны ранее Sh.Nakajima (1965), на основании чего автор также сделал вывод о селективности контактных реакций. 13 наших условиях культивирования

изолированных нейронов при отсутствии субстрата и других факторов, регулирующих морфогенез сплетений, именно селективность контактных взаимодействий, как мы полагаем, определяет относительную упорядоченность наблюдаемых морфогенетических процессов.

Перестройка нервной сети и культуре изолированных нейронов, инициируемая образованием межклеточных связей, по нашему мнению, очень напоминает клеточное перераспределение на стадии сортировки нервных клеток, выделяемой и нейроонтогенезе (Кокина,19У0). Перераспределение клеток, занявших стационарное положение в конечном пункте миграции формирующегося мозга, также сопровождается активными межклеточными взаимодействиями, образованием как временных контактов адгезионного типа, так и единичных сииаптических связей. Кроме того, эта стадия включает установление взаимной ориентации клеточных тел нейронов, которая придает данной области мозга определенную структурированность. Заметим, что рост аксонов, объединяющих дистантно расположенные группы нервных клеток происходит на следующей стадии нейроонтогенеза. Возможно, что такое сходство в поведении нейронов связано с тем, что на данной стадии нейроонтогенеза процессы, происходящие на уровне межнейронных контактов, являются определяющими.

Как показывает анализ собственных и литературных данных, есть все основания для того, чтобы считать морфогенез нервных сетей в культуре достаточно жестко детерминированным индивидуальными свойствами нейронов. Главным результатом этих экспериментов можно считать обнаружение некоторых клеточных механизмов, которые, вероятно, обусловливают упорядоченность морфогенетических процессов в культуре нейронов.

Объединение локальных сплетений в тотальную диффузную сеть. Отдельные нейроны локальных сплетений могуг давать длинные отростки, уходящие за пределы сплетения. Эти отростки всегда направлены в сторону других локальных сплетений или одиночно лежащих нейронов, удаленных па значительные расстояния. Таким образом, начиная с третьих суток культивирования, при росте как к близким, так и к отдаленным мишеням отмечается явное проявление иейротаксиса. Между встречными отростками локальных сплетений наблюдаются уже описанные выше типы контактных взаимоотношений.

В результате этих процессов большинство локальных сплетений оказываются связанными между собой непосредственно или через одиночные нейроны, лежащие между ними. Однако, необходимо отметить, что появление новых удаленных ог локальных сплетений связей не влечет за собой каких-либо структурных перестроек в сплетениях. Связи, образуемые длинными отростками, не способны инициировать перемещения клеточных

тел нейронов, которые часто наблюдаются у взаимодействующих короткими отростками близлежащих клеток.

В результате описанных морфогенетических процессов практически не остается несвязанных нейронов. Одиночные нейроны и нейронные агрегаты, не входящие в отдельные сплетения, в большей или меньшей степени все соединены отростками. Возникающая тотальная диффузная сеть выглядит как система связанных между собой локальных сплетений.

Деструкция локальных нервных сплетении в культуре

Деструкцию нервных сплетении наблюдали в условиях отсутствия смены питательной среды.

Остановка морфогенетических процессов. Первой реакцией нейронов на истощение питательной среды, накопление в ней метаболитов, изменение ее ионного состава и кислотности является полное прекращение перемещения тел нейронов внутри собственных отростков и остановка роста подавляющего большинства нейритов. Сплетения как бы переходят в застывшее состояние, когда на протяжении одних - двух суток в них не заметно почти никаких структурных изменений. По окончании данной стадии начинается выраженная морфологическая деградация нейронов.

Способы дегенерации нервных отростков. В первую очередь деградационные процессы затрагивают нейритный компонент сплетении. Значительно увеличивается количество концевых конусов ретракции, характеризующихся ровными краями и отсутствием филоподий. Ретракция филоподий связана с тем, что они имеют меньшую степень адгезии и являются более подвижными структурами, чем корпус конуса роста и остающийся позади него ствол нейрита (Агцйо е1 а1., 1985). Однако, заметного укорочения прикрепленных к стеклу отростков, формирующих на концах конусы ретракции, не наблюдалось. Кроме того, в условиях остановки роста нейритов сохраняется некоторое количество морфологически выраженных конусов роста, что свидетельствует о повышенной адгезионной силе в данных терминальных участках. Вероятно, по причине повышенной адгезии элиминация отростков у культивируемых нейронов идет в основном не путем втягивания их в тело клетки, как в случае неадгезированных нейронов, а двумя другими способами - тотального истончения п фрагментации.

Тотальному истончению подвержены гонкие и недавно возникшие ответвления, что может быть связано с недостатком в них цитоскелетных элементов. Сужение нейритов может происходить как равномерно на всем их протяжении, так и неравномерно, когда преимущественно истончается или проксимальная, или дистальная части отростка.

)

Оптически плотные отростки, как правило, тотально истончаются незначительно, и их дегенерация идет путем фрагментации (по типу валлеровской). Фрагментация осуществляется путем последовательного истончения и элиминации одних локальных участков и обособлении соседних расширенных. При этом расширенные участки приобретают вид площадок неправильной звездчатой формы. Зачастую только после распада отростка на фрагменты происходит округление изолированных площадок, что также свидетельствует о значительной степени адгезии данных участков нейрита. Фрагментация длинных отростков начинается с днстальнмх участков и позже распространяется на всю оставшуюся часть нейрита.

Особым вариантом фрагментации нервных отростков является образование цитосомы, когда, с одной стороны, происходит расширение концевого участка отростка, а, с другой стороны, оставшийся фрагмент нейрита на всем своем протяжении или только на отдельном участке претерпевает истончение вплоть до элиминации. В результате на некагором расстоянии от тела нейрона возникает изолированная цнгосома - участок нейроплазмы, ограниченный цитоплазматической мембраной и лишенный ядра. Такие образования могут оказаться на некоторое время вполне жизнеспособными, что проявляется в их относительной морфологической сохранности и способности формировать небольшие отростки. При этом отросткам цитосом также свойственен нейротаксис.

Таким образом, проявление адгезионных свойств нейронов в культуре накладывает отпечаток на конкретное выражение процессов дегенерации нервных отростков, как и процессов формирования отростков и клеточных форм (особенно первичных), о чем упоминалось ранее.

Деструкция шея неиронии. К процессу распада нейритной сети несколько позже присоединяется гибель тел нейронов. Начальным признаком гибели клеточных тел является утрата ими характерной формы, завершающаяся их полным округлением. В дальнейшем у таких нейронов становится отчетливо видно ядро, и, наконец, обозначается выраженная граница самих клеток. При этом нейрон может вновь потерять шарообразную форму и приобрести произвольную неправильную.

Гибель клеточных тел характеризуется асинхронностыо. Зависимость времени гибели нейронов ог каких-либо морфологических особенностей клеток или их положения в сплетении не выявляется. Гибель тел нервных клеток, по-видимому, не связана также с сохранностью связей и состоянием отростков. Агрегированные нейроны также гибнут асинхронно, причем разница во времени их гибели может достигать, как и у неагрегировапных клеток, нескольких суток. К десятым суткам обычно происходит полный распад нейритной сети и гибель всех нейронов сплетения.

• •

ВЫВОДЫ

1. До формирования сплетений выделенные нейроны претерпевают ретракцию сохранившихся инициальных отростков вплоть до полного округления клеток. Ретракция этих отростков, также как и сокращение полностью изолированных фрагментов нейритов, периодически прерывается фазами покоя и попытками абортивной регенерации.

2. Морфогенез нервных сплетений в культуре изолированных нейронов состоит из этапа формирования первичных сплетений и этапа структурной перестройки первичных сплетений. Для обоих этапов характерна некоторая упорядоченность морфогенетических процессов, проявляющаяся в контактных взаимодействиях нервных клеток.

3. Между нейронами, формирующими сплетения, наблюдаются следующие морфологические типы контактных взаимоотношений: 1) плотное прилегание контактирующих поверхностей и 2) сохранение видимой щели между поверхностями, когда контактирование осуществляется тонкими микровыростами. При этом контактирующий нейрит может либо продолжить свой рост вдоль поверхности мишени, либо пересечь мишень, либо прекратить рост. Контакты, устанавливаемые нейронами с соседними клетками, могут инициировать разнообразные клеточные реакции -направленное и избирательное движение нейронов, торможение роста или элиминацию нейритов, изменение адгезионных свойств нервных клеток, гибель нейрона -, опосредующие структурную перестройку первичиых сплетений. Характер клеточных реакций на контакт со временем может измениться.

4. Нейротаксис в культуре изолированных нейронов проявляется как неспецифический. Его роль в формировании сплетений сводится к контактированию ближайших по отношению друг к другу нервных клеток. Однако нейротаксические влияния не определяют характер контактных взаимоотношений между нейронами. На начальных стадиях образования отростков нейротаксис отсутствует.

5. Процесс формирования отростков у нейронов в культуре состоит из двух этапов. Вначале образуются первичные отростки, к которым относятся нейриты с просветленной гомогенной цитоплазмой, а также ламеллы с оптически плотными тяжами внутри гомогенной цитоплазмы. Формирование тяжей внугри ламелл может сопровождаться их спонтанной перестройкой и мультипликацией. В дальнейшем первичные отростки трансформируются во вторичные, заполненные оптически плотным

» »

материалом и не имеющие участков светлой цитоплазмы. Вторичные отростки образуются либо путем вычленения их из первичных ламелл, содержащих оптически плотные тяжи, либо путем тотального обогащения первичных отростков оптически плотным материалом.

6. Формирование морфологического типа части культивируемых нейронов проходит в два этапа. Первичная (временная) форма таких нервных клеток связана с образованием первичных отростков. Трансформация первичных отростков во вторичные приводит к изменению клеточной формы. Отмечено несоответствие морфологических типов культивируемых нейронов клеточным формам, встречающимся в ганглиях моллюсков. Культивируемые нейроны являются главным образом би- и мультиполярами.

7, Элиминация отростков у культивируемых нейронов может происходить одним из двух способов - тотальным истончением или фрагментацией нейритов. Тотальному истончению подвержены тонкие первичные отростки. Фрагментирующиеся оптически плотные нейриты истончаются лишь на отдельных участках. При этом в одних случаях нейриты распадаются на множество мелких фрагментов неправильной формы, а в других происходит расширение и последующее отшнуровывание крупного терминального отдела отростка - цитосомы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Чистякова И.А. Поведение изолированных нейронов мозга взрослого животного в культуре. В кн.: «Сборник тезисов ХЬ конференции студентов и аспирантов морфологических кафедр и лабораторий санкг-петербургских ВУЗов н НИИ, посвященной 125-летию со дня рождения академика В.Н.Шевкуненко». С.-Петербург, 1997.С. 55-56.

Сотников О.С., Чистякова И.А. Механизмы нейрофилогенеза и морфогенеза простых систем нейронов в культуре ткани. В кн.: «Гистогенетический анализ изменчивости и регенерация тканей». Материалы научного совещания, посвященного 100-летию со дня рождения Н.Г.Хлопина. С.-Петербург, 1997. С.82-83.

Сотннков О.С., Лукашин В.Г., Чистякова И.А. Структура интраорганного рецептора (статика и кинетика). В кн.: «Проблемы интероцепции». Материалы международного симпозиума, посвященного памяти академика В.Н.Черниговского к 90-летию со дня рождения. С.-Петербург, 1997. С.97-98.

Sotnikov O.S., Lukasliin V.G., Malasliko V.V., Cliistyakova LA. General rebuilding mechanisms of (lie autonomic neuronal plexuses in vertebrate ontogeny. Journal of Morphology, 1997, v.232, N3, p.326.

Сотников О.С., Костенко М.А., Чистякова И.А. Закономерности и механизмы деструкции нервных сплетений при патологии (моделирование in vilro). В кн.: «Морфофункциональные преобразования органов и тканей при воздействии на организм экстремальных факторов». Материалы конференции, посвященной 75-летию со дня рождения проф. Е.А.Дыскина. С.-Петербург, 1998. СД15-117.

Сотников О.С., Чистякова И.А. Поведение изолированных нейронов, лишенных глии, в культуре ткани при формировании сплетений. В кн.: «XVII Съезд физиологов России. Сборник тезисов». Ростов-на-Дону, 1998. С.298.

Сотников О.С., Лукашин В.Г., Малашко В.В., Чистякова И.А. Двигательная активность нейронов вегетативных сплетений и модельных плексусов в культуре ткани. В кн.: «Структура и функции вегетативной нервной системы». Материалы 11 Международного симпозиума, посвященного 80-летшо Воронежской государственной медицинской академии им. П.Н.Бурденко. Воронеж, 1998. С.27-28.

Sotnikov O.S., Podol'skaya L.A., Cliistyakova I.A. The kinetics of neurite structure afier isolation from the mollusk brain. Neurosci. and Behav. Physiol., 1999, v.29, N3, p.243-249.

Kostenko M.A., Sotnikov O.S., Cliistyakova I.A., Sergeeva S.S. The methodological and method approaches to the investigation of the Lymnaea stagnalis brain neurons in tissue culture. Neurosci. and Beliav. Physiol., 1999, v.29, N4, p.402-406.

Подписано в печать 03. 05. 2000. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,16. Тираж 100 экз. Заказ № 126.

ЦОП типографии Издательства СПбГУ. 199034, С-Петербург, наб. Макарова, 6.