Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Закономерности морфогенеза экспериментального цистита
ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных
Автореферат диссертации по теме "Закономерности морфогенеза экспериментального цистита"
На правах рукописи
Соболев Владислав Евгеньевич
ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОРФОГЕНЕЗА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦИСТИТА
06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
005552304
Саранск- 2014
005552304
Работа выполнена в ФГУП НИИ «Гигиены, профпатологии, и экологии человека» Федерального Медико-биологического агентства России.
Научный консультант:
Тельцов Леонид Петрович, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕ, МАВН, МАНЭБ.
Официальные оппоненты:
Усенко Виктор Иванович, доктор биологических наук, профессор заведующий кафедрой фармакологии и токсикологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» (г. Казань).
Мелешков Сергей Федорович, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой диагностики, внутренних незаразных болезней, фармакологии, хирургии и акушерства ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина» (г. Омск).
Чаиркин Иван Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной анатомии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. И.П. Огарева» (г. Саранск).
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт урологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Москва).
Защита диссертации состоится «19» декабря 2014 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.15 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» по адресу 430005, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М.М. Бахтина Мордовского государственного университета им Н.П. Огарева и на сайте www.mrsu.ni.
Объявление о защите и автореферат диссертации размещены на официальном сайте ВАК Минобразования и науки РФ http://vak2.ed.gov.ru.
Автореферат разослан «8 сентября» 2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук Ф>А Т.А. Романова
1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность темы.
Цистит является одним из наиболее распространенных заболеваний мочеполовой системы человека и животных. Рост заболеваемости населения Российской Федерации болезнями этой группы по официальным данным Минздрав социального развития РФ за период с 2003 по 2008 год составил 1606,7 случаев на 100000 взрослого населения стране от 18 лет (от 8777,5 до 10384,2 случаев) (Тимофеева И.В., 2008). По сведениям отечественных морфологов, в экономически развитых странах мира хронические циститы занимают 4 место в общей структуре заболеваний мочеполовой сферы после мочекаменной болезни, неспецифических инфекций мочевыводящих путей и болезней предстательной железы (Лопаткин H.A., Люлько A.B., 1997; Аляев Ю.Г., 2003;). Так, по данным международной ассоциации по изучению интерстициального цистита (ICA) только в США проживает от 4 до 12 миллионов человек больных ИЦ (www.ichelp.org).
Заболеваемость хроническими ццститами в России с 2001 по 2008 год выросла с 321,6 до 549,8 случаев на 100000 населения, что составляет 19-22% всего контингента диспансерных больных урологического профиля (Тимофеева И.В., 2008). Цистит является самым распространенным урологическим заболеванием у женщин. Его распространенность в России достаточно высока и составляет 26-36 миллионов случаев в год (Лоран О.Б., 1996).
Поиск эффективных средств терапии цистита является в этой связи одной из актуальных задач фармакологии, экспериментальной биологии, токсикологии и других отраслей практической медицины. Препараты ГАГ в последнее время рассматриваются в качестве потенциальных терапевтических средств лечения цистита у человека и животных. Однако практически отсутствуют работы, посвященные сравнительной эффективности различных препаратов ГАГ в терапии воспалительного процесса в мочевом пузыре. Недостаточно и противоречиво освещены вопросы использования гликозаминогликанов (ГАГ) в качестве потенциальных биомаркеров патологии, в том числе воспалительного процесса.
Моделирование на экспериментальных животных патологических состояний и различных заболеваний, возникающих при воздействии неблагоприятных факторов, является основным звеном доказательной медицины, позволяющим изучить патогенез и механизмы формирования исследуемых процессов у животных и человека (Усенко В.И., 1999; Чаиркин И.Н., и др., 2008; Соседова Л.М., и др., 2013). В этой связи в экспериментальной биологии продолжают оставаться актуальными исследования, направленные на моделирование патологии мочевого пузыря у лабораторных животных (Cruz C.D., Avelino А., 2012; Кеау S., et al., 2012; Homan Т, et al., 2013).
Изучение особенностей морфологии мочевого пузыря и биохимии воспалительного процесса находит отражение в работах отечественных (Чумаков В.Ю., Складнева Е.Ю., 2011) и зарубежных исследователей (Harzmann R„ et al., 1983; Ayres P.H., et al., 1985; Mac Dermott J.P., et al., 1993; Ercan F„ et al., 1999; Rau A.R., et al., 2009). В то же время многие вопросы патоморфогенеза цистита остаются недостаточно изученными. Имеется незначительное количество работ, в которых воспалительный процесс в мочевом пузыре
3
млекопитающих рассматривается с позиций морфометрии, гистохимики ГАГ, физиологии мочевыделителыюй функции и системной биохимии.
Таким образом, экспериментальное моделирование воспалительного процесса в мочевом пузыре млекопитающих животных представляет собой современный инструмент научного познания, значимый как для медицины человека, так и для ветеринарной медицины. Получение новых знаний в области морфологии, биологии и биохимии воспалительного процесса у животных в свою очередь актуально в аспекте развития современной сравнительной патологии человека и животных. Диссертационная работа выполнена в соответствии с темой РАН «Механизмы и закономерности индивидуального развития животных и птиц (в норме и при патологии)» Номер государственной регистрации: 01200704777.
1.2. Цель н задачи исследований.
Целью исследования является определение основных закономерностей патоморфогенеза цистита в эксперименте при моделировании на лабораторных животных, а также роли цистита в развитии недержания мочи («подмокания») у молодняка соболя черного в условиях промышленного звероводства. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие основные задачи исследования:
1. Провести сравнительную оценку методов экспериментального моделирования цистита химической, токсической, термической и бактериальной этиологии.
2. Определить основные закономерности гистологических и цитологических изменений в мочевом пузыре у лабораторных животных при экспериментальном моделировании цистита различной этиологии.
3. Изучить клинико-биохимические показатели крови и мочи, а также показателей баланса жидкости у лабораторных животных при экспериментальном моделировании цистита различной этиологии.
4. Провести комплексное экспериментальное исследование защитных свойств препаратов гликозаминогликанов при воздействии на ткани мочевого пузыря лабораторных животных повреждающих факторов: химической, токсической и бактериальной этиологии.
5. В условиях промышленного звероводческого хозяйства провести комплексное исследование, направленное на изучение этиологии недержания мочи («подмокания») у молодняка соболя черного в возрасте 5-7 месяцев и оценить значение цистита как вероятного этиологического фактора недержания мочи у молодняка соболя.
1.3. Научная новизна.
Проведена сравнительная оценка методов экспериментального индуцирования цистита у лабораторных животных. Разработан способ внутрипузырной инъекции растворов, используемых для индуцирования воспалительного процесса в мочевом пузыре у лабораторных животных.
Выявлены основные закономерности морфологии воспалительного процесса в мочевом пузыре животных. Пополнены фундаментальные сведения по морфометрическим характеристикам мочевого пузыря при различных вариантах цистита у животных. Показана возможность использования
морфометрических характеристик мочевого пузыря в качестве биомаркеров воспалительного процесса.
Дополнены фундаментальные сведения о роли гликозамнногликанов при воспалительном процессе в мочевом пузыре, уровне экскреции этих соединений с мочой у животных и содержании в тканях мочевого пузыря. Впервые с помощью метода количественной гистохимической оценки определены уровни содержания гликозамнногликанов в тканях мочевого пузыря при геморрагическом цистите индуцированном циклофосфамидом.
Впервые получены данные, свидетельствующие о наличии воспалительного процесса в мочевом пузыре у молодняка соболей, больных недержанием мочи («подмокание», "wet belly"). Разработано и запатентовано устройство для сбора экскрементов у пушных зверей в промышленном звероводстве (патент РФ № 108915, опубл. 10.10.2011 г).
1.4. Теоретическая и практическая значимость работы.
Получены новые научные данные о морфологии мочевого пузыря при цистите различной этиологии у животных, дополняющие информацию о патоморфогенезе воспалительных заболеваний животных и человека.
Проведенная оценка морфологических изменений в мочевом пузыре при цистите у животных с помощью методов морфометрического, гистохимического анализа и цифрового анализа изображений гистологических препаратов позволяет расширить современные представления о развитии патологии в органах мочевыводящей системы.
Дополнена информация о защитной роли гликозамнногликанов мочевого пузыря в ответ на воздействие агрессивных повреждающих факторов и в условиях воспалительного процесса.
Впервые показано наличие воспалительного процесса в мочевом пузыре у молодняка соболей с недержанием мочи («подмокание», "wet belly"), что создает предпосылки для дальнейших исследований, направленных на изучение связи цистита с нарушением мочевыделительной функции у животных.
Результаты диссертационного исследования и предложенные рекомендации могут быть использованы в работе научно-исследовательских лабораторий, практической деятельности ветеринарных и медицинских специалистов, при подготовке и чтении лекционного курса «нефрология и урология животных», а также при написании соответствующих разделов учебников, учебных пособий для биологов, морфологов, медицинских и ветеринарных специалистов.
1.5. Реализация результатов исследований.
Разработанные в диссертации методики и полученные результаты исследований внедрены и используются в ФГУП НИИ «Гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА Росссии; звероводческом хозяйстве «Заря» ОАО «Северная пушнина» Ленинградской области. По результатам работы подготовлены и опубликованы монографии «Современные методы исследования почек и мочевыводящих путей домашних животных» и «Цистит. Экспериментальное моделирование».
Материалы научных исследований используются в работе и в педагогическом процессе Мордовского, Брянского, Хакасского университетов;
Санкт-Петербургской и Казанской академии ветеринарной медицины; Орловском, Саратовском, Омском, Алтайском, Воронежском, Краснодарском аграрных университетах; в Брянской, Ульяновской, Костромской сельскохозяйственной академиях; ФГУП НИИ «Гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Закономерности морфологических изменении тканей и клеток мочевого пузыря животных при различных этиологических вариантах цистита.
2. Влияние воспалительного процесса в мочевом пузыре на биохимические показатели крови и мочи экспериментальных животных.
3. Гликозаминогликаны как защитные факторы при цистите различной этиологии.
4. Цистит как вероятная причина недержания мочи («подмокания») у молодняка соболя черного в возрасте 5-7 месяцев в условиях промышленного звероводства.
1.6. Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены на научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Санкт-Петербург, 2004; 2005; 2007); на международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы электрофизиологии и незаразной патологии животных» (Улан-Уде, 2009); на международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 2010); на конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010); на международной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов ФГБОУ ВПО СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2011); на международной научно-практической конференции по патологической физиологии животных, посвященной 90 летию кафедры патологической физиологии ФГБОУ ВПО «СПбГАВМ» (Санкт-Петербург, 2011); на 2 Всероссийской интернет-конференции «Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии» (Казань, 2012) на 1 международной интернет-конференции «Современные тенденции в сельском хозяйстве» (Казань, 2012); на 2 Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы медицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); на 4 съезде токсикологов России (Москва, 2013); на международной конференции «Механизмы и закономерности индивидуального развития человека и животных», посвященной 75-летию заслуженного деятеля науки РФ, д.б.н., Тельцова Л.П. (Саранск, 2014); на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы медицины и фармации», (Орел, 2014).
1.7. Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ, в том числе 21 статья в рецензируемых научных изданиях, рекомендуемых ВАК Российской Федерации, 2 монографии и патент на полезную модель «Устройство для сбора экскрементов животных в клеточном звероводстве».
1.8. Личное участие автора в получении результатов исследования.
Основные результаты, представленные в диссертации, получены, обработаны и проанализированы лично автором. Исследования проведены на базе центральной ветеринарной станции Советского района г. Брянска; вивария кафедры внутренних болезней животных ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургской Государственной академии ветеринарной медицины»; звероводческом хозяйстве «Заря» Ленинградской области; в клинике экспериментальных животных ФГУП НИИ «Гигиены, профпатологии и экологии человека» Федерального медико-биологического агенства России.
1.9. Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 251 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Указатель литературы содержит сведения о 340 источниках, 80 из которых на русском и 260 на иностранных языках. Иллюстрации представлены на 101 рисунках (из них 70 микрофотографии), цифровой материал сгруппирован в 32 таблицы.
2. Материалы и методы исследования.
В работе использованы лабораторные белые крысы в возрасте от трех до шести месяцев. Экспериментальные работы с животными проводились с соблюдением международных требований биоэтики лабораторных исследований с учетом требований государственного стандарта РФ ГОСТ Р 54434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».
В работе по изучению этиологии недержания мочи («подмокания») у молодняка черного соболя были использованы звери клеточного содержания в возрасте 5-7 месяцев. Для проведения патологоанатомической диагностики использовали 97 трупов животных, имеющих клинические симптомы недержания мочи после планового технологического убоя.
2.1. Методы моделирования воспалительного процесса мочевого пузыря у лабораторных животных. Воспалительный процесс в мочевом пузыре у крыс и мышей индуцировали двумя способами: 1. Непосредственным введением в полость органа раздражающих и патогенных веществ (раствор уксусной кислоты, горячий физиологический раствор, взвесь микроорганизмов) и 2. Внутрибрюшинным введением растворов ЦФ. С целью лучшей идентификации мочевого пузыря при введении первым способом крысам за 10 минут в/м инъецировали фуросемид (лазикс) в дозах 1-2 мг/кг веса тела. Инъекцию осуществляли непосредственно в полость мочевого пузыря крыс через брюшную стенку под мануальным контролем (Sharp P.E., La Regina М.С., 1998; Suckow M.A., et al. 2001; Rigaiii A., Di V.E., 2009). Растворы ЦФ крысам вводили путем внутрибрюшинной инъекции. Растворы ЦФ готовили ex tempore на 0,9% растворе натрия хлорида с концентрацией 20 мг/мл согласно инструкции по применению препарата.
2.2. Патологоанатомическне методы. Патологоанатомическое вскрытие трупов животных проводили методом полной эвисцерации внутренних органов в соответствии с методическими рекомендациями по патологоанатомической диагностике (Sharp P.E., La Regina М.С., 1998; Suckow M.A., et al. 2001; Жаров A.B., 2013). Результаты заносили в модифицированный протокол патологоанатомического вскрытия (Sharp P.E., La Regina М.С., 1998).
2.3. Морфологические методы. Кусочки мочевого пузыря и других органов, размером 0,5 х 0,5 см вырезали острым скальпелем и помещали в фиксирующий раствор на срок, рекомендованный для каждого конкретного фиксатора (Коржевский Д.Э., Гиляров A.B., 2010). Использовали фиксацию тканей в 10 % буферном растворе формалина, фиксаторе Карнуа, фиксаторе Буэна, фиксаторе Лилли для сохранения «кислых» ГАГ, в растворе по прописи К.В. Топчиевой (Брохман С.Е., 1998). Гистологические срезы получали на санном микротоме, а также на микротоме-криостате. Для обзорного изучения гистологические срезы препаратов окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике (Семченко В.В., 2006). Использовали гематоксилины Карацци, Гарриса, Мейера. Для выявления ГАГ в тканях мочевого пузыря срезы окрашивали альциановым синим (pH 1,0; 2,5) коллоидным железом (в модификации реакции Хейла по Грауманну-Клаусу) и в реакции Шифф-йодной кислотой (ШИК-реакция). При необходимости проводили селективное удаление кислых ГАГ путем ферментативного гидролиза с гиалуронидазой с последующим окрашиванием толуидиновым синим (Jlynna X., 1980).
2.4. Метод количественной оценки интенсивности гистохимической реакции на гликозаминогликаны в срезах мочевого пузыря позволяет судить об уровне содержания этих веществ по принципу пропорциональной связи. Принцип метода приготовления градуировочных стандартов красителей разработан Т.А. Силантьевой E.H. Горбач (2010; 2009). В качестве красителя для гистохимической идентификации гликозаминогликанов в мочевом пузыре использовали альциановый синий (АС) pH 2,5. С целью количественной оценки интенсивности гистохимической реакции использовали градуировочные стандарты красителя альцианового синего. Из насыщенного водного раствора альцианового синего известной концентрации при температуре +37° готовили серии двукратных разведений на основе коллоидного раствора желатина с конечной концентрацией желатина 20% (табл. 1). Растворы разливали в пластиковые контейнеры объемом 1 см3 и помещали для полимеризации в холодильную камеру бытового холодильника. Через сутки из блоков, имеющих консистенцию плотного геля, лезвием вырезали образцы размером 5x5x5 мм, замораживали их в жидком азоте и помещали на охлажденные блокодержатели микротома-криостата. Срезы толщиной 7 и 9 мкм получали на микротоме-криостате при температурном режиме - 20°С. Криостатные срезы монтировали на маркированные с указанием конечных концентраций красителя предметные стекла, высушивали на воздухе и заключали под покровные стекла.
№ п/п Соотношение Краситель/вода Краситель, мкл Вода, мкл Концентрация, г/л*
1 1:400 2,5 997,5 0,0125
2 1:200 5 995 0,025
3 1:100 10 900 0,05
4 1:50 20 980 0,1
5 1:10 100 900 0,5
6 1:5 166 834 1,0
7 1:1 500 500 2,5
8 2:1 666 333 3,3
9 4:1 800 200 4
10 10:1 900 100 4,5
11 1:1 1000 1000 5,0
12 2:1 1335 665 6,6
13 4:1 1600 400 8,0
с 20% раствором желатина.
Гистологические срезы, содержащие градуировочные стандарты АС, фотографировали при увеличении Х50, XI00, Х200, Х400. На полученных цифровых изображениях в программе ВидеоТест 5.0 для Windows ХР методом случайного отбора при помощи инструмента «окружность» выбирали не менее 10 участков, в которых программно определяли показатель оптической плотности в относительных единицах. Полученные значения оптической плотности градуировочных стандартов использовали для построения графика калибровочной функции, которая представляла собой зависимость между концентрацией красителя в градуировочном стандарте (ось абсцисс) и полученным значением оптической плотности (ось ординат). В гистологических срезах мочевого пузыря, окрашенных АС, определяли концентрацию красителя с использованием графика градуировочных стандартов.
2.5. Морфометрические методы. Морфометрические измерения на гистологических срезах проводили с использованием винтового окуляр микрометра MOB-1-16, а также в программе для персонального компьютера ВидеоТест Размер 5.0 на базе операционной системы Windows ХР. Калибровку эталона длины в программе ВидеоТест Размер 5.0 производили при помощи объект-микрометра ОМ-П с ценой деления 0,005±0,0003 мм. Гистометрические измерения структур органов проводились методом случайного отбора поля зрения микроскопа (Автандилов ГГ., 1990). Удельное количество объектов на миллиметр площади среза определялось по методу A.A. Гуцол, Б.Ю. Кондратьев ( 1988).Объем ядер и плазмы клеток, близких к эллипсоидной форме вычисляли по формуле, предложенной В.В. Малашко (1993):
V=-xAB2; б '
где V-объем; А - большой диаметр клетки; В - малый диаметр клетки; к-
3,14.
Использовали также формулу W. Jacobi (Автандилов Г.Г., 1990), предложенную для ядер и клеток, близких к сферической форме:
V = 0,523 x D3;
где D-диаметр ядра или клетки.
Вычисление цитоплазменно-ядерных отношений (ЦЯО) клеток в относительных цифрах проводилось по формуле:
ЦЯ0=^;
* Z
где Vz - объем клетки; Vk - объем ядра клетки.
2.6. Биохимические и клинические методы.
2.6.1. Биохимия сыворотки крови. Исследования образцов проводили на автоматических биохимических анализаторах Lisa 300 (Biocode Hycel®) и Сапфир 400 (Niigata Mechatronics®). Использовали коммерческие наборы реактивов фирмы Randox (Англия). В сыворотке крови животных определяли 12 показателей в соответствии с рекомендациями по клиническим лабораторным исследованиям. AJIT и ACT определяли оптимизированным стандартным методом с а-оксоглутаратом. Общий белок - колориметрическим методом в биуретовой реакции, альбумин - колориметрическим методом по связыванию бромкрезолового зеленого. Глюкозу определяли энзиматическим колориметрическим методом; мочевину - уреазным методом, креатинин - в реакции Яффе, щелочную фосфатазу - оптимизированным кинетическим методом. Кальций определяли унифицированным колориметрическим методом с о-крезолфталеиновым комплексоном; фосфор - колориметрическим методом в реакции с молибдатом аммония. Содержание железа определяли колориметрическим методом без депротеинизации, трансферрин -иммунотурбиниметрическим методом, ферритин - турбидиметрическим методом.
Клиренс эндогенного креатинина определяли по приведенной ниже формуле с учетом рекомендаций научной литературы по клинической нефрологии (Darling I.M., Morris М.Е., 1991; Fischbach F.T., Dunning M.B.A., 2008; Арутюнов Г.П., Оганезова Л.Г., Соколова A.B., 2011; Суховершин P.A., 2012). Клиренс креатинина в соответствии с представленной формулой выражали в мл/мин/кг и считали аналогом показателя СКФ в почках (Суховершин P.A., 2012).
Xci=UCr*VUr/SCr/1440*Bw
Где ХС1 - клиренс креатинина; UCr - концентрация креатинина в моче, ммоль/л; VUr - объем суточной мочи; SCr - концентрация креатинина в сыворотке крови, ммоль/л; 1440 - количество минут в сутках; Bw - вес крысы в килограммах.
2.6.2. Определение цитокннов в плазме крови. Цитокины IL-lß, IL-2, IL-6, IL-10, IFN-y, GM-CSF в плазме крови крыс определяли методом мультиплексного анализа на проточном флуориметре Luminex 200. Использовали коммерческие наборы для определения цитокинов компании BioRad.
2.6.3. Электролиты и газы крови. В крови крыс определяли содержание натрия, калия, хлора, а также pH, а также ряд параметров газообмена: С02, р02, tC02, НСОз, BE (избыток оснований). Исследования проводили с помощью анализатора газов OPTI ССА (США). Содержание лактата в крови определяли экспресс-методом на анализаторе Accutrend Plus.
2.6.4. Анализ мочи. Анализ мочи выполняли в анализаторе Combylazer на полосках Human-test Combina 13. Определяли рН, удельный вес, уробилиноген, билирубин, кетовые тела, кровь, белок, микроальбумин, нитриты, лейкоциты, глюкозу, аскорбиновую кислоту. После центрифурирования образца мочи в течение 10 минут при 2000 об/мин. отбирали 15-20 мкл осадка мочи для микроскопирования при увеличении 103Х; 213Х; 413Х.
2.6.5. Определение содержания гликозаминогликанов (ГАГ) в моче. ГАГ в моче определяли спектрофотометрическим методом (Mitsuhashi H., et al., 1993; Grant D.K., 2003), адаптированным нами для 96-луночного планшета, используемого для иммуноферментного анализа. Метод основан на метахроматическом окрашивании раствора, содержащего сульфатированные ГАГ с 1,9-диметил-метиленовым синим (Ci8H22CINaS 0.5ZnCl2) «Голубой Тайлора», DMMB). Для определения ГАГ использовали микропланшетный спектрофотометр Biotek Epoch.
Для приготовления калибровочных растворов ГАГ использовали препарат Хондролон (Микроген, Россия), содержащий 100 мг хондроитина сульфата. Для приготовления растворов 10 мг препарата растворяли в 100 мл деионизированной воды. Растворяли в течение 10 минут на магнитной мешалке и хранили в емкости из темного стекла с притертой пробкой. Маточный раствор содержал ГАГ в количестве 10 мг/дл. Далее готовили растворы разной концентрации ГАГ 0; 0,25; 0,75; 1, 1,5; 2; 4; 5; 7,5 мг/дл, необходимые для построения калибровочного графика.
Раствор DMMB готовили растворением 11 мг в 1 л 0,05 M ацетатном буфере. Для приготовления буферного раствора 6,8 г натрия триуглекислого в 950 мл деионизированной воды и смешивали на магнитной мешалке в течение 15 минут до полного растворения. Уровень рН 4,75 устанавливали капельным добавлением 0,1 M соляной кислоты или 1 M гидроксида натрия. Конечный объем 1л доводили деионизированной водой. Готовый раствор хранили в емкости из темного стекла с притертой пробкой. Для построения калибровочной кривой в лунки планшета вносили 250 мкл раствора DMMB и добавляли 25 мкл калибровочных растворов ГАГ. Считывание показателей абсорбции производили при длине волны 520 нм на планшетном спектрофотометре в течение 1 минуты в трех повторах. Определяли средние значения абсорбции. Полученный график калибровочной функции сохраняет линейность до 4 мг/дл. Процедуру построения калибровочной кривой проводили перед определением ГАГ в пробах мочи. Мочу животных перед определением концентрации ГАГ центрифугировали в течение 10 минут при 2500 об/мин, супернатант использовали для проведения анализа. В лунки планшета вносили 250 мкл раствора DMMB и добавляли 25 мкл мочи. Считывание показателей абсорбции производили при длине волны 520 нм на планшетном спектрофотометре в течение 1 минуты в трех повторах. Определяли средние значения абсорбции. В соответствии со значениями графика калибровочной функции определяли содержание ГАГ в моче в мг/дл.
2.7. Статистические методы. Статистическая обработка результатов исследований выполнена при помощи пакета программ MS Excel 2007, и компьютерной программы Graph Pad Prizm 5.0. В работе использовали
общепринятые в медицине и биологии статистические методы исследования (Гланц С., 1999; Petrie A., Watson Р., 2006). Данные оценивали методами описательной статистики с определением арифметического (М) среднего, ошибки среднего (ш) и величины стандартного отклонения (S), медианы (Me). Данные отвечающие требованиям нормального распределения сравнивали методом однофакторного дисперсионного анализа (One-way ANOVA) в тесте Бонферони, в других случаях использовали непараметрический критерий Краскелла-Уоллеса и тест Данна. Различия между данными анализируемыми с помощью всех используемых методов считали статистически значимыми при уровне р< 0,05.
3. Результаты исследований и их обсуждение. 3.1. Морфологические измеиения в мочевом пузыре при цистите различной
этиологии.
3.1.1. Цистит химической этиологии моделировали на 12 белых лабораторных крысах. По принципу пар-аналогов были сформированы 2 группы животных по 6 крыс в каждой. Крысы 1 группы использовались как интактный контроль. Животным 2 группы в мочевой пузырь методом цистоцентеза вводили 0,5 мл 9% раствора уксусной кислоты. По истечении 48 часов с начала эксперимента проведена эвтаназия всех животных и отбор мочевых пузырей с фиксацией их тканей в 10% нейтральном формалине для гистологического исследования.
По результатам морфометрического анализа срезов мочевого пузыря установлено, в мочевом пузыре животных 2 группы высота переходного эпителия, а также толщина слизистой оболочки существенно ниже (3,89±0,4 мкм), чем у животных 1 группы (6,77±0,74 мкм) (р<0,01). У крыс 2 группы также отмечено статистически значимое увеличение толщины подслизистой основы (25,5±5,08 мкм против 18,0±3,5 мкм в контрольной группе) и серозной оболочки мочевого пузыря (10,04±0,95 мкм против 5,41±0,83 мкм в контрольной группе) (р<0,01). В этих участках наблюдаются тканевый отек, эритростазы и обильная лейкоцитарная инфильтрация (рис. 1,2).
Рис. 1. Группа 2. Срез мочевого пузыря крысы (х246). ШИК-реакция. 1-эпителий; 2-собственная пластинка; 3-мышечная оболочка; 4-серозная оболочка; стрелками показан кровеносный сосуд.
Рис. 2. Группа 2. Срез мочевого пузыря крысы (х413). Г-Э. 1-серозная оболочка; 2-мышечная оболочка; стрелками показаны участки лейкоцитарной инфильтрации.
3.1.2. Геморрагический цистит моделировали на самках 36 белых нелинейных лабораторных крыс. По принципу пар-аналогов были сформированы 4 группы животных по 9 крыс в каждой. Крысы 1 группы использовались как интактный контроль. Животным 2 группы в/б однократно вводили раствор ЦФ в дозе 100 мг/кг веса тела. Крысам 3 группы ЦФ вводили в/б в дозе 200 мг/кг веса тела. Животным 4 группы ЦФ вводили аналогичным путем в дозе 400 мг/кг веса тела. В период от 4 до 12 часов после введения раствора ЦФ крысам группы 3 наблюдали 100% летальность животных. По истечении 72 часов с начала эксперимента проведена эвтаназия животных, и отбор мочевых пузырей с фиксацией их тканей в 10% нейтральном формалине для гистологического исследования.
При введении ЦФ в дозе 200 мг/кг у животных 3 группы наблюдали наиболее типичную морфологическую картину развития геморрагического цистита. При этом в мочевом пузыре крыс 3 группы происходила тотальная десквамация переходного эпителия (рис. 3), что обуславливало невозможность проведения объективной оценки высоты эпителиального слоя. В группах 2 и 4 наблюдали увеличение высоты переходного эпителия (42,33±6,05 и 49,7±5,78 мкм ) по сравнению с показателем интактных крыс (41,77±8,48) статистически значимое для животных 4 группы (р<0,01) (рис. 4). У животных 2, 3 и 4 групп наблюдали статистически значимое (р<0,01) увеличение толщины собственной пластинки слизистой оболочки мочевого пузыря (85,05±9,43 мкм; 50,25±13,52 мкм; и 56,08±7,82 мкм против 13,29±1,54 мкм у крыс контрольной группы) с признаками отека, лейкоцитарной и эритроцитарной инфильтрации. В мочевом пузыре крыс 3 группы наблюдали интенсивный выход эритроцитов за пределы сосудов с пенетрацией подслизистой основы, собственной пластинки и переходного эпителия.
Рис. 3. Группа 3. Срез мочевого пузыря Рис. 4. Группа 4. Срез мочевого пузыря крысы (х246). Г-Э. 1-эпителиоциты; 2- крысы (х413). Г-Э. 1-эпителий; 2-собственная пластинка слизистой оболочки собственная пластинка слизистой оболочки;
стрелками показаны эритроциты.
Сравнительная оценка степени повреждения тканей и клеток мочевого пузыря крыс 2, 3 и 4 группы показывает развитие наименьшей интенсивности геморрагического процесса у животных 2 группы, которым инъецировали ЦФ в дозе 100 мг/кг. Геморрагический инфильтрат в субэпителиальной зоне мочевого пузыря у этих животных незначителен. В мочевом пузыре крыс 4 группы, которым ЦФ вводили в дозе 400 мг/кг, констатировали развитие
геморрагического процесса (рис. 4), однако степень повреждения тканей органа у этих животных была существенно ниже, чем в 3 группе, что обусловлено высоким уровнем летальности в ранние сроки после введения препарата. Это вероятно обусловлено влиянием токсичных продуктов метаболизма ЦФ.
Наиболее типичные морфологические изменения, характерные для ГЦ, наблюдались при использовании дозы ЦФ 200 мг/кг веса тела. Введение препарата животным в дозе 100 мг/кг приводит к развитию геморрагического процесса умеренной интенсивности. Доза ЦФ 400 мг/кг приводит к 100% гибели животных, что не позволяет реализоваться полной клинической картине воспалительного процесса. В то же время морфологическое исследование мочевого пузыря выявляет в нем характерные признаки геморрагического воспалительного процесса. Указанные факты не позволяют рекомендовать ЦФ в дозе 400 мг/кг в качестве препарата для моделирования геморрагического цистита.
3.1.3. Моделирование цистита бактериальной этиологии проводили на самках 24 белых лабораторных крыс. По принципу пар-аналогов были сформированы 4 группы по 6 крыс в каждой. Животные 2-4 группы были задействованы в опыте, животные 1 группы использовались как интактный контроль. У крыс 2, 3 и 4 групп воспалительный процесс мочевого пузыря вызывали путем инъекционного введения в полость мочевого пузыря живой культуры бактерий St. Epidermidis. Крысам 2 группы в полость мочевого пузыря микроорганизмы вводили в количестве 15 млрд. м.т., животным 3 группы - 5 млрд. м.т., и крысам 4 группы 1 млрд. м.т. Животным 1 группы в мочевой пузырь вводили стерильный 0,9% раствор натрия хлорида. Продолжительность наблюдения за животными составила 72 часа, после чего проведена эвтаназия всех крыс, вскрытие брюшной полости и отбор образцов ткани мочевых пузырей для гистологического исследования.
Наибольшие отличия в морфометрических характеристиках мочевого пузыря по сравнению с контролем выявлены во 2 и в 3 группах. Слизистая оболочка мочевого пузыря у этих животных также статистически значимо превышает показатели контрольных животных, причем за счет утолщения собственной пластинки. У животных 2 группы толщина слизистой оболочки составляет 76,0±23,9 мкм, в контрольной группе - 48,9±9 мкм (р<0,01). Толщина подслизистой основы мочевого пузыря крыс 2 группы составляет 37,5±4,5 мкм, в контрольной группе - 24±4,4 мкм (р<0,01). Клетки переходного эпителия слизистой оболочки мочевого пузыря у крыс 2 группы имели большие размеры - 90,8±29,8 мкм против 48,5±10,9 мкм в контрольной группе (р<0,01) и объем, а также выраженный цитоплазматический сдвиг (ЦЯС>=0,9). У крыс 4 группы при введении в мочевой пузырь 1 млрд м.т признаки воспалительного процесса в мочевом пузыре не наблюдались, что свидетельствует о недостаточной дозе патогенного фактора, необходимого для развития воспалительного процесса. 3.1.4. Моделирование цистита термической этиологии проводили на 12 белых лабораторных крысах. По принципу пар-аналогов были сформированы 2 группы по 6 крыс в каждой. Животным 2 группы в мочевой пузырь вводили 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида температурой 80-85 °С. Животных 1 группы использовали как интактный контроль. По истечении 24 часов с начала
Рис. 5. Группа 1 Контроль. Срез мочевого Рис. 6. Группа 2. Термический цистит. Срез пузыря крысы (х 103). Г-Э. мочевого пузыря крысы (х246). Г-Э.
Стрелками показана десквамация переходного эпителия.
Высота переходного эпителия у животных 2 группы (12,45±3,28 мкм) статистически значимо ниже по сравнению с животными 1 группы (17,31 ±1,74) (см. рис. 5 и 6). Этот факт связан с усилением десквамации поверхностного эпителиального слоя под влиянием термического фактора.
3.2. Закономерности морфологических изменений в мочевом пузыре под влиянием различных этиологических факторов.
Высота эпителия. Показатель в целом информативно представляет реакцию эпителиального слоя мочевого пузыря на воздействие повреждающих факторов. Как известно, усиление десквамации поверхностного слоя эпителиоцитов мочевого пузыря может быть следствием адгезии патогенных микроорганизмов, например Е. Coli, на поверхности эпителиоцитов (Schilling J., Hultgram S., 2002). Разрушение или десквамация поверхностного эпителиального слоя также может происходить под воздействием ирритантов химического или термического происхождения (Rajasenkaran М., et al., 2006). В наших исследованиях у животных с индуцированным бактериальным циститом не наблюдали изменений высоты эпителиального слоя, что вероятно связано как с непродолжительным воздействием повреждающего фактора, так и выбором в качестве ирритативного агента условно-патогенных микроорганизмов. У животных с ЦФ-индуцированным циститом, в дозе 400 мг/кг веса тела, наблюдали статистически значимое увеличение высоты эпителиального слоя. Снижение высоты эпителиоцитов в наших исследованиях отмечено у животных с циститом термической и химической этиологии. Этот факт отражает повреждающее воздействие ирритантов, приводящее к десквамации эпителиоцитов. Толщина собственной пластинки слизистой оболочки
эксперимента проведена эвтаназия всех крыс, вскрытие брюшной полости и отбор образцов ткани мочевых пузырей для гистологического исследования.
Характерные признаки развития воспалительного процесса в мочевом пузыре крыс 2 группы, наблюдали только у 2 животных (рис. 6). Отличия в морфометрических характеристиках мочевого пузыря по сравнению с контролем во 2 группе связаны с увеличением толщины слизистой оболочки -80,74±7,21 мкм против 61,72±7,92 мкм в контрольной группе (р<0,01) ~~за счет собственной пластинки.
изменялась в сторону увеличения у животных с термическим циститом и при использовании высокой концентрации микроорганизмов у крыс с бактериальным циститом, а также при использовании ЦФ во всех рассмотренных дозах. У крыс с воспалительным процессом, индуцированным уксусной кислотой наблюдается уменьшение толщины этой области мочевого пузыря. Собственная пластинка слизистой оболочки, как и подслизистая основа, обеспечивают васкуляризацию мочевого пузыря. Наблюдаемые признаки отека в этой области мочевого пузыря, включающие клеточную инфильтрацию, характеризуют повышение проницаемости сосудистой стенки и диапедез иммунокомпетентных клеток острой фазы воспаления - нейтрофилов (Haraoka M., et al., 1999). Средний диаметр кровеносных сосудов. Существенное, статистически значимое увеличение этого параметра наблюдали при моделировании цистита ЦФ. При этом наибольшие различия отмечены при использовании дозы 200 мг/кг веса тела. Развитие сосудистых эффектов и фиброза мочевого пузыря у человека при использовании ЦФ дозе, превышающей 6г/м2 для лечения некоторых видов новообразований установлено еще в 70-х годах двадцатого века (Johnson W.W., et al., 1971). Сосудистые эффекты ЦФ при моделировании цистита у животных также были описаны ранее, однако не были охарактеризованы количественно (Moráis М.М., et al., 1999). Дилатация сосудов собственной пластинки также в целом подтверждает известные данные о токсичном действии метаболитов ЦФ, связанных с повреждением эндотелия сосудов и повышении их проницаемости (Kachel D.L., Martin W.J., 1994). Слизистая оболочка. В наших исследованиях установлено утолщение слизистой оболочки мочевого пузыря у крыс при термическом, бактериальном и ЦФ-индуцированном цистите, реализованное преимущественно за счет утолщения собственной пластинки. При цистите химической этиологии наблюдается утончение слизистой оболочки, в том числе снижение высоты эпителиального слоя и собственной пластинки. Подобные различия свидетельствуют о более выраженном патологическом воздействии на ткани мочевого пузыря ирритантов химического происхождения и ЦФ. Подобное влияние ЦФ на морфологию этого гистологического отдела отмечается в работах зарубежных исследователей, которые, однако, не используют в своих работах морфометрический анализ (Moráis М.М., et al., 1999; Juszczak К., et al., 2010). Мышечная оболочка. Статистически значимых отличий по толщине этого гистологического отдела мочевого пузыря не выявлено у животных с индуцированным бактериальным, химическим и термическим циститом. В то же время у животных, которым цистит индуцирован ЦФ, наблюдали статистически значимое истончение мышечной оболочки при использовании всех рассматриваемых доз, от 100 до 400 мг/кг веса тела. Серозная оболочка. У крыс с циститом химической этиологии наблюдается интенсивный воспалительный процесс в серозной и подлежащем к ней мышечной оболочке мочевого пузыря. Вероятно, это связано с инъекционным методом введения ирританта снаружи мочевого пузыря через серозную и мышечную оболочку в его полость. Следует отметить, что в контексте моделирования экспериментальной патологии мочевого пузыря этот факт интересен в связи с перспективностью подобного моделирования
повреждений мочевого пузыря при абдоминальной травме. Цитометрические показатели. Статистически значимые отличия размеров эпителиальных клеток и ядер эпителиоцитов от показателей клинически здоровых животных были зафиксированы только в крыс с бактериальным циститом при инъецировании 15 млрд. микробных тел. При этом в сторону увеличения изменились размеры эпителиальных клеток, а также их ядра и ЦЯО. Этот факт свидетельствует о реализации патогенного воздействия микрофлоры на эпителиальный слой. У животных, с циститом, индуцированным ЦФ, также наблюдаются статистически значимое увеличение размеров ядер и клеток переходного эпителия. Для клеток эпителия характерны плазморексис цитоплазмы, умеренная вакуолизация, размытость клеточных границ, при этом последнее вероятно связано с пермобилизацией эпителиального слоя.
3.3. Влияние воспалительного процесса в мочевом пузыре на биохимические показатели крови и мочи экспериментальных животных. 3.3.1. Биохимический анализ крови крыс при геморрагическом цистите.
Исследования показали отсутствие статистически значимых изменений основных биохимических показателей у крыс при экспериментальном цистите, индуцированном ЦФ в дозах 100 и 200 мг/кг веса тела. Содержание общего белка, альбумина, холестерина, мочевины и креатинина у крыс всех групп находятся в пределах показателей клинически здоровых животных. Исключение составляет повышение концентрации глюкозы (15,4±0,7 ммоль/л; 16,3±1,4 ммоль/л) и лактата (3,7±0,4 ммоль/л; 3,4±0,5 ммоль/л) в крови крыс, которым цистит индуцирован в дозах 100 и 200 мг/кг веса тела. Подобные факты являются следствием гепато-токсических эффектов ЦФ. Известно, что применение ЦФ может приводить к развитию глюкозурии и диабета (Вгос! 8., е1 а1., 2006). Полученные результаты исследования следует учитывать при выборе ЦФ в качестве индуктора воспалительного процесса у крыс.
3.3.2. Газы и электролиты крови у крыс при цистите.
Концентрация основных газов и электролитов крови крыс при экспериментальном цистите не выходит за пределы диапазона нормы клинически здоровых животных (табл. 2). Это свидетельствует об отсутствии значимого влияния воспалительного процесса в мочевом пузыре на кислотно-щелочное состояние и электролитный баланс организма животных, за исключением незначительных сдвигов отдельных показателей, таких как рС02, ВЕ, и концентрация хлоридов. Повышение концентрации хлоридов с одновременным снижением рН, ВЕ и гидрокарбонатов в крови крыс 3 группы, вероятно, указывает на компенсированный сдвиг КОС в сторону метаболического ацидоза (Дорман А., Веге Т., 2000; Уиллард М.Д., и др., 2006). В пользу этого предположения также может свидетельствовать установленное ранее повышение концентрации в крови глюкозы и лактата у крыс, которым моделировали цистит введением аналогичной дозы ЦФ 100 мг/кг веса тела. У животных 4 группы, которым индуцировали цистит введением большей дозы ЦФ - 200 мг/кг наблюдаемое повышение парциального давления С02 спустя 24 часа после введения ЦФ в совокупности с умеренной гиперхлоремией и низким значением рН может свидетельствовать о более выраженной тенденции к развитию у животных метаболического ацидоза (Уиллард М.Д., и др., 2006).
Таблица 2. Газы и электролиты крови у крыс при цистите (Ме±Б)
Показатели Группы животных Референсный интервал
1 (Контроль) 2 0,9% NaCl 3 ЦФ 100мг/кг 4 ЦФ 200мг/кг
pH 7,47±0,03 7,53±0,02 7,45±0,02 7,46±0,05 7,46-7,52'
рСО,, мм.рт.ст. 51,33±6,03 48,33±4,93 51,67±4,93 53,67±8,08 50,4±0,44
pOi, мм.рт.ст. 43,33±6,81 42,67±4,72 46,0±11,53 46,0±8,0 39,3±2,54
Избыток оснований (BE), ммоль/л. 10,43±1,12 13,77±2,14 8,9±3,54 11,23±1,44 Нет данных
С02, ммоль/л. 37,83±2,28 40,53±2,99 36,47±4,4 39,2±2,48 37,7-39,9'
НС03, ммоль/л. 36,27±2,14 39,2±2,68 34,87±4,3 37,53±2,27 Нет данных
Натрий, ммоль/л 145,7±5,51 149,7±5,03 143,7±0,57 142,7±0,57 140-1532
Калий, ммоль/л 5,43±0,32 5,83±0,11 5,06±0,38 5,07±0,73 4,0-7,02
Хлориды, ммоль/л 106,3±1,53 107,7±0,57 107,7±2,88 109,3±5,03 97-1 Об2
по книге «The Laboratory rat» (1998); 2- по книге «The toxicologist pocket handbook» (2008); по собственным данным; 4- по книге «Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом эксперименте (1978).
3.3.3. Цитокиновый профиль плазмы крови крыс при цистите.
В наших исследованиях показано статистически значимое повышение концентрации в плазме крови крыс цитокинов - 1Ь-6 и 1Ь-10 в течение 48 часов после индуцирования ЦФ воспалительного процесса в мочевом пузыре в дозе 100 и 200 мг/кг веса тела (табл. 3).
Таблица 3. Содержание цитокинов в плазме крови крыс (М±т)
Цитокины, пг/мл 1 группа (Контроль) 2 группа 0,9% NaCl 3 группа ЦФ 100 мг/кг 4 группа ЦФ 200 мг/кг
IL-lß 0,28±0,13 0,18±0,08 0,24±0,07 0,33±0,03
IL-2 1,19±0,07 8,72±2,09 20,26±33,38 29,80±10,80
IL-6 2,63±0,68 11,91±4,89 9,24±3,86 52,27±4,80***
IL-10 4,99±0,52 8,22±0,85 5,54±3,13 20,81±2,65***
***- р<0,001 по сравнению с группами 1,3,4**.
Повышение концентрации IL-6 в плазме крови после инъекции ЦФ в модели геморрагического цистита ранее отмечено в работах зарубежных исследователей (Nishii Н., et al., 2006). Аналогичное повышение концентрации этого цитокина в плазме кровн наблюдали при использовании и других химических индукторов цистита, таких как протамина сульфат (Lu Y-S., et al., 2013). Цитокин IL-10 обладает преимущественно иммуносупрессорными функциями, действуя как ингибитор продукции провоспалительных медиаторов. В их числе IL-1, IL-6, IL-8, TNF, GM-CSF (Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008). IL-10 может прямо подавлять продукцию лимфоцитами
Т-хелперами цитокннов IL-2 и IL-5 (De Waal Malefyt R., et al., 1993; Кетлинский С.A., Симбирцев A.C., 2008). IL-10 может также усиливать функциональную активность B-лимфоцитов посредством активации Т-хелперов 2 типа (Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008). IL-10 также усиливает активацию NK-клеток, индуцированную IL-18 (Cai G., et al., 1999).
3.3.4. Клинический и биохимический анализ мочи крыс при геморрагическом цистите.
У животных с индуцированным циститом наблюдается сдвиг pH мочи в щелочную сторону и существенно меньшие значения удельного веса мочи. В моче этих животных также содержатся эритроциты и лейкоциты, присутствие которых не наблюдается у здоровых животных. При изучении морфологии осадка мочи отмечено присутствие кристаллов триппельфосфата и аморфных фосфатов у всех животных, которым был индуцирован цистит. В поле зрения микроскопа также встречались клетки переходного эпителия, микрофлора преимущественно кокковой группы, в ряде случаев формирующая конгломераты по типу бактериальных цилиндров. В осадке мочи животных с индуцированным циститом также отмечено присутствие слизистых цилиндров, в ряде случаев являющихся матрицей для образования кристаллических конгломератов.
Результаты биохимического анализа мочи у животных с индуцированным циститом показали увеличение экскреции микроальбумина до уровня 94±34,3 мг/л по сравнению с клинически здоровыми животными 26,0±4,0 мг/л (р<0,01), выделение кетоновых тел и снижение экскреции креатинина с мочой. Выделение с мочой микроальбуминов, является маркером многих патологических состояний. Известно, что микроальбуминурия может являться маркером цистита или воспалительных процессов в урогенитальном тракте (Keane W.F., 2000). Повышение экскреции кетоновых тел с мочой у крыс может косвенно указывать на возникающий вследствие развития воспалительного процесса дефицит глюкозы и гликогена и активизацию повышенного метаболизма жировой ткани. Установленное снижение концентрации креатинина в моче животных согласуется с более ранними работами, в которых также наблюдалось снижение концентрации креатинина в сыворотке крови и повышение концентрации белка при экспериментальном цистите у собак (Bagley R.S., et al., 1991).
3.3.5. Гликозаминогликаны (ГАГ) как защитные факторы при цистите различной этиологии.
3.3.5.1. Влияние препаратов ГАГ на морфологию мочевого пузыря крыс.
В нашей работе проведена оценка морфологических изменений в мочевом пузыре крыс и влияние различных препаратов ГАГ для перорального использования в двух моделях воспалительного процесса:
1. При цистите химической этиологии.
2. При цистите индуцированном циклофосфамндом (ЦФ).
При цистите химической этиологии использовали препараты ГАГ, содержащие хондроитина сульфат и глюкозамина гидрохлорид. При цистите, индуцированном циклофосфамндом, использовали глюкозамина гидрохлорид, а также комплексные препараты:
1. Препарат, содержащий глюкозамина гидрохлорид 50 мг/кг и аскорбиновую кислоту 10 мг/кг (ГГХ+АК 1); Препарат, содержащий 100 мг/кг глюкозамина гидрохлорида +10 мг/кг аскорбиновой кислоты (ГГХ+АК 2).
2. Препарат, содержащий глюкозамина гидрохлорид и хондроитина сульфат в дозах 10, 50 и 100 мг/кг веса тела (ГГХ+ХС 1 ,2 ,3).
3.3.5.2. Влияние ГАГ на морфологию мочевого пузыря при цистите химической этиологии.
Моделирование цистита производилось у самок белых лабораторных крыс. Были сформированы 3 группы животных по 3 особи в каждой группе. Опытные и контрольные группы формировались с соблюдением принципа пар-аналогов. В течение 14 суток до индуцирования цистита крысы 2 группы с питьевой водой получали препарат ГГХ+ХС 2, а крысы 3 группы ГГХ+ХС 3. Животные 1 контрольной группы препараты ГАГ не получали. Спустя 14 суток от начала эксперимента крысам 2, 3 групп индуцировали воспалительный процесс мочевого пузыря инъекцией через брюшную стенку в полость мочевого пузыря 0,5 мл 9% водного раствора уксусной кислоты. Раствор вводили дважды с интервалом 7 дней. После индуцирования цистита животные 2 и 3 групп продолжали получать препараты ГАГ в указанных дозах до завершения исследований. Через 7 суток после повторного введения крысам раствора в мочевой пузырь проведена эвтаназия животных всех групп. При вскрытии брюшной полости во 2 группе у одного животного (11% от объема выборки), выявлено образование спаек серозной оболочки мочевого пузыря с кишечником.
У крыс 2 и 3 групп переходный эпителий мочевого пузыря представлен 36 слоями клеток, на поверхности эпителиальных клеток присутствует тонкий слой слизи (рис 9). Слизистая оболочка мочевого пузыря крыс 1 группы значительно повреждена, присутствует только базальный слой клеток, поверхностный слой слизи отсутствует. В слизистой оболочке мочевого пузыря крыс 2 и 3 групп выявлено присутствие «кислых» ГАГ. Наиболее яркая реакция отмечается в слизистой оболочке мочевого пузыря крыс 3 группы (рис. 9). При этом у крыс 3 группы, получавших препарат в дозе 100 мг/кг веса тела выявлена наибольшая интенсивность окрашивания тканей мочевого пузыря в ШИК -реакции и реакции Хейла. Эти факты могут указывать на поступление принятых животными экзогенных ГАГ в ткани мочевого пузыря, в том числе с целью восполнения потерь эндогенных ГАГ вследствие повреждения тканей мочевого пузыря. В срезах мочевого пузыря 1 группы в реакции Хейла интенсивность окрашивания тканей мочевого пузыря слабая, что свидетельствует о незначительном содержании ГАГ.
Рис. 8. Группа № 1. Мочевой пузырь крысы (хЮОО). ШИК-реакция. Подслизистая основа. 1 -лейкоциты.
Рис. 7. Группа № 3. Мочевой пузырь крысы (х250). Реакция Хейла. 1-слизистая оболочка; 2- подслизистая основа.
У крыс, получавших препараты ГАГ, статистически значимо увеличены объем ядер и цитоплазмы эпителиоцитов, а также ЦЯО клеток эпителия мочевого пузыря в сравнении с животными контрольной группы. Толщина слизистой оболочки мочевого пузыря крыс 3 группы 32±7 мкм статистически значимо превышает аналогичный показатель 1 и 2 групп 23±6 и 22±3 мкм (р<0,01). Эти факты свидетельствуют о меньшей степени повреждения слизистой оболочки мочевого пузыря у крыс 2 и 3 групп, получавших препараты ГАГ по сравнению с контрольной группой. Таким образом, прием комплексного препарата ГАГ, в дозах 50 и 100 мг/кг веса тела в течение 14 суток до воздействия повреждающего фактора, а также после индуцирования цистита позволяет снизить степень повреждения слизистой оболочки мочевого пузыря крыс 9% раствором уксусной кислоты.
3.3.5.3. Влияние препаратов ГАГ на морфологию мочевого пузыря при геморрагическом цистите, а). Глюкозамина гидрохлорид с аскорбиновой кислотой (ГГХ+АС).
Моделирование цистита производилось у самок белых лабораторных крыс. Были сформированы 8 групп животных по 3 особи в каждой группе. Крысы 1 группы использовались как интактный контроль. Животным 2 группы в 3 и 9 дни эксперимента в/б инъецировали 0,9% раствор натрия хлорида в объеме, используемом для введения раствора ЦФ. Крысам 3 группы в течение 3 суток в/ж вводили водную суспензию, препарата ГГХ+АС 1. Крысам 4 группы в течение 3 суток в/ж вводили водную суспензию, препарата ГГХ+АС 2. Животным 5 группы в течение 3 суток в/ж вводили водный раствор аскорбиновой кислоты в дозе 10 мг/кг веса тела. Через 3 суток от начала эксперимента и приема животными 1-3 группы указанных препаратов моделировали цистит путем 2-кратной в/б инъекции раствора ЦФ в дозе 100 мг/кг веса тела в 3 и 9 сутки от начала эксперимента. Крысы 1-3 групп продолжали получать препараты ежедневно, до завершения эксперимента на 14 сутки. Крысы 6-8 групп в течение эксперимента не получали препараты, способные оказать влияние на развитие воспалительного процесса. Животным этих групп также индуцировали цистит путем в/б инъекции ЦФ на 3 и 9 дни эксперимента. Крысам 6 группы использовали дозу 100 мг/кг; 7 группы - 200 мг/кг и в 8 группе - 400 мг/кг веса тела.
В течение 4-12 часов после инъекции ЦФ наблюдали гибель 100% животных в группе 6, которым инъецировали ЦФ в дозе 400 мг/кг веса тела. Секционный осмотр животных не выявил макроскопических признаков воспалительного процесса в мочевом пузыре. Клинические признаки цистита в динамике эксперимента были наиболее выражены у крыс группы 7. По истечении 14 суток от начала эксперимента произведена эвтаназия животных всех групп, вскрытие брюшной полости, отбор и фиксацию мочевых пузырей для последующего гистологического исследования. Признаки геморрагической инфильтрации тканей мочевого пузыря в большей или меньшей степени наблюдались у всех крыс, за исключением животных группы 2, которым инъецировали 0,9% натрия хлорид и у животных группы 1. Наименьшие повреждения тканей мочевого пузыря наблюдались у животных 3,4 и 5 групп. В этих группах не наблюдалось десквамации эпителиального слоя и выраженного отека собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы (рис. 9). Наиболее тяжелая форма геморрагического воспаления наблюдалась в мочевом пузыре крыс 7 группы, которым ЦФ инъецировали в дозе 200 мг/кг веса тела. В мочевом пузыре этих животных наблюдали значительную десквамацию эпителиоцитов, и выход эритроцитов за пределы слизистой оболочки, обуславливающий развитие тяжелой гематурии (рис. 10). Сосуды подслизистой основы значительно расширены, наблюдается интенсивная лейкоцитарная инфильтрация.
На срезах мочевого пузыря крыс 8 группы, которым индуцировали цистит введением 400 мг/кг ЦФ, наблюдали геморрагическую инфильтрацию всех слоев стенки мочевого пузыря, без десквамации эпителия и выхода эритроцитов в полость мочевого пузыря. Однако на микроскопическом уровне в мочевом пузыре этих животных наблюдались признаки начальной стадии отслоения эпителиоцитов от базальной мембраны, выраженный отек собственной пластинки и подслизистой основы, а также полиморфизм ядер эпителиоцитов.
Рис. 9. Группа 5. Мочевой пузырь крысы Рис. 10. Группа 7. Мочевой пузырь крысы (х80). Г-Э. 1-эпителий; 2-подслизистая (хЮЗ). Г-Э. 1-собственная пластинка; 2-
основа; 3-мышечная оболочка; 4-серозная сосуды. Стрелками показана эритроцитарная оболочка. масса.
Морфометрическим анализом мочевого пузыря крыс у животных 6, 7 и 8 групп установлено статистически значимое (р<0,001) утолщение собственной пластинки (85±9,4; 50±13,5; 56±7,8 мкм) вследствие тканевого отека по
сравнению с контролем (13±1,5 мкм). У животных групп 3, 4 и 5, которым для коррекции воспалительного процесса применяли препарат ГАГ и аскорбиновую кислоту подобных изменений не наблюдается. Толщина подслизистой основы и мышечной оболочки у животных 3,4,5,6,7,8 групп статистически значимо меньше чем у интактных крыс, что отражает большую растянутость мочевого пузыря у этих животных, а также больший объем остаточной мочи в нем (табл. 4). Различия по объему остаточной мочи статистически значимы для животных 6 группы.
Таблица 4,Объем остаточной мочи в мочевом пузыре крыс, мл
Группы животных
ЦК) 2 3 4 5 6 7 8
0,3+0,02 ** „ „ . * 0,4+0,07 0,8+0,2 0,8+0,1 0,6+0,05 1,5+0,1** 1,2+0,2 0,7+0,3
-р<0,01; по сравнению с контрольной группой 1.
Цитометрические показатели переходного эпителия: площадь ядер и площадь эпителиоцита, объем ядер эпителиоцита и объем клетки у крыс 2,3,4,5,6,7,8 групп превышают показатели интактных животных. В то же время ЦЯО эпителиоцитов мочевого пузыря у животных этих групп практически не отличается от показателя контрольной группы. Это позволяет рассматривать увеличение размеров ядер и клеток эпителиоцитов у животных 2-8 групп как проявление физиологических, а не патологических реакций и вероятно является отражением индивидуального полиморфизма переходного эпителия.
Наиболее близкие в сопоставлении с интактными животными значения морфометрических показателей мочевого пузыря в этом эксперименте наблюдались у животных 5 группы, которые получали аскорбиновую кислоту в дозе 10 мг/кг. Из групп животных, получавших препарат ГАГ, наименьшие отличия морфометрических показателей от контрольной группы наблюдались у крыс 4 группы, получавших препарат в дозе 100 мг/кг веса тела. Прием препаратов ГАГ позволяет компенсировать развитие воспалительного отека, что подтверждается сопоставлением результатов морфометрического анализа у крыс 3 и 4 группы с показателями животных 6,7,8 групп без терапии. В то же время прием аскорбиновой кислоты не менее эффективно позволяет нормализовать изменения в морфологии мочевого пузыря, вызванные воспалительным процессом.
б). Глюкозамина гидрохлорид и комплекс глюкозамина гидрохлорида с хондроитина сульфатом (ГГХ и ГГХ+ХС 1,3).
Моделирование цистита во втором эксперименте проводили на 35 белых лабораторных крысах. По принципу пар-аналогов были сформированы 7 групп животных по 5 особей в каждой группе. Крысы группы 0 использовались как интактный контроль; животным группы 0/2 в/б вводили ЦФ в дозе 80 мг/кг веса тела двукратно с интервалом 48 часов, после чего в течение 4 суток в/ж 1 р/день вводили комплексный препарат ГГХ+ХС 1, содержащий сульфат хондроитина и глюкозамина гидрохлорид в дозе 10 мг/кг веса тела. Животным 1 группы однократно в/б вводили циклофосфамид в дозе 100 мг/кг веса тела. Крысам 2 группы однократно в/б вводили ЦФ в дозе 100 мг/кг веса и далее в течение 4 суток в/ж 1 р/день вводили препарат, содержащий глюкозамина гидрохлорид в дозе 50 мг/кг веса тела. Животным 3 группы однократно в/б вводили ЦФ в дозе
23
100 мг/кг веса тела и далее в течение 4 суток в/ж 1 р/день вводили препарат ГГХ+ХС 3, содержащий тлюкозамина гидрохлорид в дозе 100 мг/кг веса тела. У крыс 4 группы моделировали хроническую форму цистита, для чего производили четыре в/б инъекции ЦФ с интервалом 24 часа в дозе 50 мг/кг веса тела. Продолжительность наблюдения за животными 4 группы после последней инъекции ЦФ составила 72 часа. Крысам 5 группы в/б однократно вводили ЦФ в дозе 100 мг/кг веса тела после чего в течение 4 суток в/ж 1 р/день вводили комплексный препарат содержащий сульфат хондроитина и глюкозамина гидрохлорид в дозе 100 мг/кг веса тела. По истечении сроков применения препаратов ГАГ и спустя 72 часа после последней инъекции циклофосфамида крысам 4 группы произведена эвтаназия крыс, вскрытие брюшной полости и отбор проб тканей мочевого пузыря для гистологического исследования.
При изучении гистологических срезов мочевого пузыря крыс опытных групп установлены признаки воспалительного процесса с разной степенью повреждения тканей мочевого пузыря по сравнению с контролем (рис. 11). Наиболее выраженные изменения были выражены у животных 1 и 4 групп (рис. 12, 15), которым моделировали цистит без последующей терапии препаратами ГАГ. В мочевом пузыре этих животных наиболее выражены отек собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы, лейкоцитарная и гистиоцитарная инфильтрация.
В мочевом пузыре крыс 4 группы наблюдалась интенсивная геморрагическая инфильтрация подслизистой основы и собственной пластинки слизистой оболочки, приводящая в некоторых участках к пенетрации собственной пластинки и десквамации переходного эпителия (рис. 15). У крыс групп 0/2, 2 и 3, которым после индуцирования цистита проводили заместительную терапию препаратами ГАГ, наблюдали существенно меньшую степень повреждения тканей (рис. 13, 14) по сравнению с животными групп 1 и 4 (рис. 12, 15). В мочевом пузыре животных 5 группы выявлены характерные признаки геморрагического воспаления. При этом наблюдалась умеренная очаговая инфильтрация подслизистой основы и собственной пластинки мочевого пузыря без признаков интенсивной десквамации эпителиального слоя
Рис. 11. Группа 0. Контроль. Мочевой Рис. 12. Группа 1. Геморрагический цистит, пузырь крысы (х246). Г-Э. Мочевой пузырь крысы (х413). Г-Э.
Рис. 13. Группа 2. Геморрагический цистит. Рис. 14. Группа 3. Геморрагический цистит. Терапия ГГХ 50. Мочевой пузырь крысы Терапия ГГХ 100. Мочевой пузырь крысы (х 103). Г-Э.____(хЮЗ).Г-Э.
т
.-/V V \ I . V -Hl. ~ г* % -Ч
Рис. 15. Группа 4. Геморрагический цистит. Без терапии. Мочевой пузырь крысы (х246). Г-Э. 1-эпителий; 2-собственная пластинка; 3- кровоизлияния в подслизистой основе.
Рис. 16. Группа 5. Геморрагический цистит. Терапия ГГХ+ХСЗ. Мочевой пузырь крысы (х103). Г-Э.
Морфометрическим анализом мочевого пузыря у животных опытных групп 0/2,2,3,4,5, установлено статистически значимое увеличение высоты переходного эпителия (16,2±2,9; 6,5±2; 14±6,5; 11,2±3,2; 17,9±7,3; 15,0±3,6 мкм) по сравнению с контролем (10,5±1,7 мкм) (р<0,01). У крыс 1 группы наблюдали уменьшение высоты эпителиоцитов (6,5±2 мкм), что является следствием их интенсивной десквамации до базального слоя клеток. Статистически значимое (р<0,01) утолщение собственной пластинки слизистой оболочки установлено в мочевом пузыре животных всех опытных групп (18,7±4,5; 118,9±20,5; 44,2±16,5; 41,6±7,1; 44,9±16,8; 46,1±15,4 мкм) по сравнению с контрольной группой (16,2±4,5 мкм). Этот факт обусловлен развитием тканевого отека и интенсивной лейкоцитарной инфильтрацией. Наибольшая толщина собственной пластинки наблюдалась у крыс 1 группы без терапии препаратами ГАГ (118,9±20,5 мкм). Геморрагическая инфильтрация тканей мочевого пузыря также явилась причиной утолщения подслизистой основы у животных всех опытных групп и мышечной оболочки у крыс групп 0/2 и 1. У всех животных с индуцированным циститом отмечено статистически значимое (р<0,001) увеличение внутреннего диаметра кровеносных сосудов подслизистой основы (23,7±13,4; 22,2±15,2; 18,5±5,25; 21,1±7,7; 17,5±4,7; 19,0±7,1 мкм) по сравнению с контролем
(15,5±3,9). Цитометрией переходного эпителия мочевого пузыря крыс выявлена меньшая площадь ядер и клеток у животных опытных групп, что отражает десквамацию эпителиоцитов в ответ на воздействие повреждающих факторов. В результате интенсивного слущивания эпителия остающиеся клетки по причине их локализации в более глубоком, прилегающем к собственной пластинке слое, как известно, имеют меньшие размеры. Отсутствие статистически значимых отличий ЦЯО переходного эпителия слизистой оболочки мочевого пузыря у животных всех групп, задействованных в эксперименте, что в целом свидетельствует об отсутствии грубых внутриклеточных сдвигов морфологии эпителиоцитов в условиях наблюдаемого эксперимента.
Резюмируя данные гистологического и морфометрического исследования можно заключить об эффективности внутреннего применения препарата глюкозамина гидрохлорид в дозе 50 (2 группа) и 100 мг/кг веса (3 группа) в заместительной терапии воспалительного процесса. Применение комплексных препаратов ГАГ, таких как ГГХ+ХС 1 и 3 в дозах 10 мг/кг (группа 0/2) и 100 мг/кг (группа 5) менее эффективно предотвращает развитие воспалительного процесса, что подтверждается результатами гистологического исследования и морфометрией срезов мочевого пузыря. Ранее в работах отечественных исследователей был установлен положительный клинический эффект применения внутрипузырного введения препарата ГАГ - гиалуроната цинка при интерстициальном и бактериальном цистите (Кудрявцев Ю.В., и др., 2011). При этом исследователи отмечали повышение функциональной активности эпителиоцитов и способности их к физиологической регенерации. Наши исследования продемонстрировали, что применение препаратов ГАГ через пищеварительный тракт также позволяет снизить степень повреждения тканей и клеток мочевого пузыря при экспериментальном цистите.
3.3.5.4. Заключение о влиянии препаратов гликозаминогликанов на
морфологию мочевого пузыря при цистите различной этиологии.
Высота эпителия у животных принимавших препараты рассматриваемых ГАГ при любом этиологическом варианте цистита, как правило, была выше или была близка по высоте к показателю клинически здоровых интактных животных. При этом лучшие показатели наблюдали при приеме комплексного препарата ГАГ (ГГХ+ХС) в дозе 100 мг/кг при химическом цистите; а также препарата ГГХ+АК 1 и препарата ГАГ в дозах 10 (ГГХ+ХС 1) и 100 (ГГХ+ХСЗ) мг/кг веса тела при геморрагическом цистите, индуцированном ЦФ. Толщина собственной пластинки слизистой оболочки и ее утолщение по нашим наблюдениям связано с развитием отека и клеточной инфильтрацией лейкоцитами. Наибольшая толщина собственной пластинки наблюдалась у животных, которым индуцировали цистит инъекцией ЦФ в дозе 100 мг/кг веса тела. Более высокие дозы 200 и 400 мг/кг веса тела также приводят к развитию отека собственной пластинки, но в гораздо меньшей степени. Прием препаратов ГАГ препятствовал развитию выраженного отека собственной пластинки, при этом наименьшая степень отека наблюдалась у крыс, которым применяли препарат ГГХ+ХС в дозе 10 мг/кг веса тела, препарата ГГХ+АК 2, а также аскорбиновой кислоты в дозе 10 мг/кг веса тела. Другие препараты ГАГ также снижали выраженность отека и толщину
собственной пластинки слизистой оболочки. Однако существенных различий по толщине этого отдела при использовании препаратов ГГХ 50, ГГХ 100 и ГГХ+ХС 2 не наблюдалось. В этой связи можно заключить об идентичном влиянии этих препаратов на толщину собственной пластинки мочевого пузыря крыс. Слизистая оболочка мочевого пузыря имеет меньшую толщину при цистите химической этиологии за счет непосредственного повреждения эпителиального слоя и интенсивной десквамациии эпителиоцитов. При цистите, индуцированном циклофосфамидом в дозах 100 и 400 мг/кг веса тела без последующей коррекции препаратами ГАГ, наблюдается утолщение слизистой оболочки за счет отека и утолщения собственной пластинки. Введение животным ЦФ в дозе 200 мг/кг приводит к развитию тяжело протекающего геморрагического цистита, сопровождающегося тотальной десквамацией эпителия и разрушением слизистой оболочки, что отражается на ее морфометрических характеристиках в сторону уменьшения толщины. Применение препаратов ГАГ позволяет снизить уровень повреждения тканей мочевого пузыря, что отражается в меньшей степени отека тканей мочевого пузыря и лучшей сохранностью эпителиального слоя слизистой оболочки. Сравнительная оценка влияния приема препаратов ГАГ показала эффективность препаратов. Наиболее близкой к показателю интактных животных толщина слизистой оболочки была при использовании препаратов ГГХ+АК 2, аскорбиновой кислоты и ГГХ+ХС 1. Прием животными препарата ГГХ в дозах 50 и 100 мг/кг веса тела приводил к практически идентичным значениям толщины слизистой оболочки. В этой связи можно заключить об идентичном влиянии этих препаратов на толщину слизистой оболочки мочевого пузыря животных. Мышечная оболочка при химическом и ЦФ-индуцированном цистите имеет меньшую толщину, что вероятно отражает отмеченное в наших исследованиях дилатацию мочевого пузыря, растяжение мышечных волокон и увеличение объема остаточной мочи. При использовании препаратов ГАГ наименьшие отличия толщины мышечной оболочки, сопоставимые с показателями интактных животных наблюдали у животных, принимавших аскорбиновую кислоту и препарат ГГХ+АК 2, а также препараты ГГХ 50 и 100. При химическом цистите наилучший результат отмечен при использовании препарата ГГХ+ХСЗ в дозе 100 мг/кг веса тела. Цитометрические показатели. Измерения размеров, площади и вычисление объема клеток переходного эпителия при совместной интерпретации изменений эпителия на гистологических срезах позволят выявить различия между этиологическими формами цистита. При цистите химической этиологии наблюдается десквамация эпителиоцитов практически до базального слоя. Клетки, расположенные в непосредственной близости от собственной пластинки имеют меньшие размеры и индексы, чем в промежуточной и поверхностных слоях. При ЦФ-индуцированном цистите эпителиоциты могут быть как меньшего размера вследствие усиленной десквамации, так и иметь большие размеры в связи с деструктивными изменениями в ядре и цитоплазме. При использовании препаратов ГАГ наименьшие отличия в размерности эпителиоцитов животных с индуцированным циститом от интактного контроля наблюдались при использовании препарата ГГХ+ХС 3 у животных с циститом химической
этиологии. При ЦФ-индуцированном цистите наиболее близкие к норме цитометрические показатели наблюдались при использовании препаратов ГГХ+АК, аскорбиновой кислоты и препаратов глюкозамина ГГХ 50 и 100. Цитометрическим анализом эпителиоцитов мочевого пузыря после приема препаратов ГГХ 50 и 100 не выявлено существенных отличий, что позволяет заключить об отсутствии различий при использовании этого препарата в дозах 50 и 100 мг/кг веса тела.
Резюмируя результаты исследований влияния различных препаратов ГАГ на морфологию мочевого пузыря при различных этиологических вариантах цистита можно заключить о наибольшей эффективности применения комплексного препарата ГГХ+АК, а также аскорбиновой кислоты в дозе 10 мг при геморрагическом цистите, индуцированном ЦФ. Эффективность аскорбиновой кислоты в качестве протектора при ЦФ-индуцированном цистите была ранее установлена для более высокой дозы препарата - 200 мг/кг веса или 60 мг/крысу (РагеЫс! А.А., й а1., 2013). В указанной работе доза аскорбиновой кислоты, таким образом, была в 6 раз больше дозы 10 мг, использованной в наших исследованиях. Защитные свойства комплексного препарата глюкозамина с аскорбиновой кислотой при экспериментальном геморрагическом цистите показаны впервые. 3.3.5.5. Количественная оценка интенсивности гистохимической реакции на мукополисахариды в тканях мочевого пузыря при экспериментальном
цистите.
Материал для исследования использовали от крыс, которые были задействованы в эксперименте по изучению влияния препаратов ГАГ на морфологию мочевого пузыря. Приготавливали гистологические криостатные срезы мочевого пузыря толщиной 7 и 9 мкм. Окрашивали срезы раствором АС (рН 2,5), фотографировали, а далее в программе Видеотест размер 5.0 определяли оптическую плотность участков поверхности эпителия и собственной пластинки слизистой оболочки мочевого пузыря, после чего по графику калибровочных стандартов вычисляли относительную концентрацию красителя. Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5. Количественная оценка гистохимической реакции на
мукополисахариды в тканях мочевого пузыря крыс (Ме+Б)
ГрО Гр 0/2 Гр1 Гр 2 ГрЗ Гр 4 Гр 5
(К) ЦФ ЦФ ЦФ ЦФ ЦФ без ЦФ
Концентр. ГГХ+ХС без ГАГ ГГХ 50 ГГХ 100 ГАГ ГГХ+Х
красителя 1 мг/см3 мг/кг мг/кг СЗ
мг/см3 мг/см3 мг/см3 мг/см3 мг/см3 мг/см3
Поверхность 2,2+1,3 3,2+1,2* 5,0+2,0* 5,4+2,5* 4,3+1,7* 5,6+1,1* 5,9+1,9*
эпителия
Собственная 2,5+1,0 3,3+1,6# 1,7+0,8 3,8+1,9* 4,2+1,3* 4,3+0,7* 4,3+1,2*
пластинка
слизистои
оболочки
р<0,001 по сравнению с контрольной группой 0; р<0,001 по сравнению с группой 1.
ЦФ: группа 0/2- 80 мг/кг; группы 1-3 - доза 100 мг/кг; группа 4- 50 мг/кг.
Установлены существенные отличия концентрации АС в слизистой оболочке мочевого пузыря животных при цистите, индуцированном различными дозами ЦФ, а также при заместительной терапии препаратами ГАГ, что свидетельствует о реализации локальной защитной роли ГАГ в ответ на воздействие повреждающих факторов. Прием препаратов ГАГ - ГГХ+ХС 1; ГГХ 50 и ГГХ 100 приводит к увеличению концентрации красителя, как на поверхности эпителия, так и в собственной пластинке слизистой оболочки мочевого пузыря. Острая форма ЦФ-индуцированного цистита без терапии препаратами ГАГ приводит к увеличению концентрации красителя и соответственно ГАГ на поверхности эпителия мочевого пузыря и к снижению в собственной пластинке слизистой оболочки. При хронической форме геморрагического ЦФ-индуцированного цистита без терапии препаратами ГАГ наблюдается повышение концентрации красителя АС, как на поверхности эпителия, так и в собственной пластинке слизистой оболочки. Этот факт, вероятно, свидетельствует об аккумуляции эндогенных ГАГ в тканях мочевого пузыря в качестве меры локальной компенсации повреждения ткани в условиях хронического воспаления.
3.3.5.6. Количественное определение гликозаминогликанов в моче крыс
при цистите.
Материал для исследования получали от крыс, которые были задействованы в эксперименте по изучению влияния препаратов ГАГ на морфологию мочевого пузыря. Отбор проб суточной мочи от животных всех групп производили трехкратно, в том числе до начала эксперимента (точка 0), через 24 часа после индуцирования цистита и через 96 часов от начала эксперимента у животных группы 0; 0/2; 1; 2; 3; 5. У крыс 4 группы проводили отбор мочи с интервалом 24 часа непосредственно после инъекций раствора ЦФ (5 точек). Полученные образцы суточной мочи центрифугировали при 2000 об/мин. в течение 15 минут, супернатант использовали для определения концентрации ГАГ в моче. Результаты представлены в таблице 6.
Таблица 6. Содержание ГАГ в суточной моче крыс при цистите и терапии
препаратами ГАГ (М±ш)
Точки сбора мочи Группы животных
0 (Контр.) 0/2 ЦФ ГГХ+ХС1 10 мг/кг 1 ЦФ без ГАГ 2 ЦФ ГГХ 50 мг/кг 3 ЦФ ГГХ 100 мг/кг 4 ЦФ без ГАГ 5 ЦФ ГГХ+ХСЗ 100мг/кг
Точка 0 1,38±0,2 1,43±0,77 1,34±0,49 1,77±0,35 1,42±0,22 1,94±0,34 2,15±0,33
Точка 1 0,87±0,29 2,59±0,11' 1,21±0,15 1,6±0,13 1,5±0,16 1,32±0,13 1,77±0,14
Точка 2 1,15±0,06 2,04±0,05 1,22±0,185 1,54±0,03 1,36±0,18 2,05±0,13 2,41±0,1**
Точка 3 - - - - 2,29±0,53 3,03±0,26*
* -р<0,05 по сравнению с контрольной группой 0; **- р<0,01 по сравнению с группой 0; -р<0,05 по сравнению с группой 1; р<0,05 по сравнению с группой 5. ЦФ - доза циклофосфамида в группе 0/2- 80 мг/кг; в группах 1-3-100 мг/кг; в группе 4- 50 мг/кг.
Установлено снижение экскреции ГАГ в сроки от 0 до 72 часов после индуцирования острой формы цистита без терапии препаратами ГАГ (с 1,34 до 1,22 мг/дл). В модели хронического воспаления при многократном введении низких доз ЦФ (50 мг/кг) наблюдается снижение уровня ГАГ в моче в сроки от 0 до 72 часов (1,32±0,13 мг/дл) и повышение экскреции через 96 часов до концентрации 2,29±0,13 мг/дл после индуцирования цистита. Прием разных типов препаратов ГАГ при цистите в разной степени отразился на уровне экскреции этих соединений с мочой. При использовании препарата ГГХ+ХС 3 в дозе 100 мг/кг веса тела наблюдалась существенное повышение экскреции ГАГ с мочой до уровня 3,03 мг/дл через 96 часов после индуцирования цистита и ежедневного приема препарата. Ежедневный прием препарата глюкозамина гидрохлорида ГГХ 50 и 100 в дозах 50 и 100 мг/кг веса тела позволяет стабилизировать уровень экскреции ГАГ на относительно постоянном уровне. При этом наблюдается минимальное снижение уровня выделяемых с мочой ГАГ (с 1,77 до 1,54 мг/дл и с 1,42 до 1,36 мг/дл соответственно).
3.3.5.7. Клинический и биохимический анализ мочи у животных при
цистите и терапии препаратами ГАГ. а) Глюкозамина гидрохлорид с аскорбиновой кислотой (ГГХ+АС).
Моделирование цистита производилось у самок белых лабораторных крыс в возрасте 6 месяцев со средней массой тела 384,3±33,7 грамм. Для решения поставленных в исследовании задач были сформированы 7 групп животных по 3 особи в каждой группе. Продолжительность эксперимента - 14 суток. Крысы 1 группы использовались как интактный контроль. Животных 2 группы использовали в качестве контроля процедуры индуцирования цистита. Им в 3 и 9 дни эксперимента в/б инъецировали 0,9% раствор натрия хлорида в объеме, используемом для введения раствора ЦФ. Крысам 3 группы в течение 3 суток индивидуально в/ж вводили водную суспензию, содержащую препарат, содержащий глюкозамина гидрохлорид из расчета 50 мг/кг веса тела и АК в дозе 10 мг/кг веса тела (ГГХ+АК1). Крысам 4 группы в течение 3 суток индивидуально в/ж вводили водную суспензию, содержащую препарат, содержащий глюкозамина гидрохлорид из расчета 100 мг/кг веса тела и аскорбиновую кислоту в дозе 10 мг/кг веса тела (ГГХ+АК2). Животным 5 группы в течение 3 суток индивидуально в/ж вводили водный раствор АК в дозе 10 мг/кг веса тела. Через 3 суток от начала эксперимента и приема животными 1-3 группы указанных препаратов проводили моделирование цистита путем 2-кратной в/б инъекции раствора ЦФ в дозе 100 мг/кг веса тела в 3 и 9 сутки от начала эксперимента. Препараты ГАГ и аскорбиновую кислоту крысы 2-5 групп продолжали получать ежедневно, до завершения эксперимента на 14 сутки. Крысы 6 и 7 групп в течение эксперимента не получали препараты ГАГ. Животным этих групп также индуцировали цистит путем в/б инъекции ЦФ на 3 и 9 сутки эксперимента в дозе 100 мг/кг и 200 мг/кг. В течение эксперимента производили отбор суточной мочи. Параллельно с отбором проб мочи для определения клиренса креатинина у животных отбирали образцы крови. Результаты исследований представлены в таблице 7.
Таблица 7. Клинический анализ мочи при геморрагическом цистите и терапии __препаратами ГАГ (М±т)_
Показатели Группы животных
1(К) 2 3 4 5 6 7
рН 6,0±0,1 6,1 ±0,06 6,1 ±0,1 6,0±0,1 5,8±0,03 6,2±0,03 6,3±0,1
Удельный 1,02±0,0 1,03±0,0 1,02±0,0 1,03±0,0 1,01 ±0,0 1,01 ±0,0 1,008±0,0
вес (отн.ед) *
Эритроциты , ед/мкл 2,3±0,6 3,6±0,8 9,6±2,6 6,5±1,5 6,2±1,3 13,5±4,0 46,3±5,9*
Лейкоциты, 3,6±0,9 9,5±1,5 17,1 ±4,3 16,2±4,1 22,1±5,3 23,9±4,0 49,3±8,6*
ед/мл
*- р<0,05 по сравнению с группой 1.
Наибольшую степень отклонения таких показателей как удельный вес мочи, содержание эритроцитов и лейкоцитов от показателей животных контрольной группы наблюдали у крыс 6 и 7 группы. У всех животных опытных групп в этом эксперименте наблюдали увеличение содержания в моче эритроцитов и лейкоцитов, наиболее выраженное у животных 6 и 7 групп, которым индуцировали цистит без последующей терапии препаратом ГАГ. Микроскопическим исследованием осадка мочи у животных опытных групп выявлены эритроциты, лейкоциты, клетки переходного эпителия и кристаллические образования, состоящие преимущественно из аморфных фосфатов или триппельфосфата, слизевые цилиндры и цилиндроиды. Результаты содержания креатинина в образцах суточной мочи крыс представлены в таблице 8.
Таблица 8. Клиренс креатинина у крыс при цистите и терапии препаратами
ГАГ (М±ш)
Показатели Группы животных
КК) 2 3 4 5 6 7
Креатишш в сыворотке, мкмоль/л 60,4±2,9 47,6±2,9 52,3±6,4 64,4±4,9 58,4±3,3 52,1±3,3 58,0±2,1
Креатинин в моче, мм оль/л 15,5±1,4 8,4±0,4 5,3±0,9 6,5±0,8 11,8±3,0 4,5±0,2* 7,1 ±0,8
Клиренс креатинина, Мл/мин/кг 4,9±2,0 4,6±0,2 5,9±0,9 4,3±0,6 7,2±3,0 2,9±0,7* 1,1±0,9
*- р<0,05 по сравнению с группой 1.
Установлено снижение клиренса креатинина у животных 6 и 7 групп, которым моделировали цистит без последующей коррекции препаратами ГАГ. В целом данные, полученные в настоящем эксперименте, отражают меньшую степень отклонения результатов анализа мочи от клинической нормы у животных при заместительной терапии препаратами ГАГ.
б) Глюкозамина гидрохлорид и комплекс глюкозамина гидрохлорида с хондроитина сульфатом (ГГХ+ХС).
Моделирование цистита проводили на 35 белых лабораторных крысах, из которых по принципу пар-аналогов были сформированы 7 групп по 5 голов в
каждой группе. Животные группы 0 использовались как интактный контроль; крысам группы 0/2 в/б вводили ЦФ в дозе 80 мг/кг веса тела двукратно с интервалом 48 часов, после чего в течение 4 суток в/ж 1 р/день вводили препарат ГГХ+ХС 1, содержащий сульфат хондроитина и глюкозамина гидрохлорид в дозе 10 мг/кг веса тела. Животные 1 группы использовались как позитивный контроль, им однократно в/б вводили ЦФ в дозе 100 мг/кг веса тела. Крысам 2 группы однократно в/б вводили ЦФ в дозе 100 мг/кг веса и далее в течение 4 суток в/ж 1 р/день вводили препарат, содержащий глюкозамина гидрохлорид в дозе 50 мг/кг веса тела. Животным 3 группы однократно в/б вводили ЦФ в дозе 100 мг/кг веса тела и далее в течение 4 суток в/ж 1 р/день вводили препарат, содержащий глюкозамина гидрохлорид в дозе 100 мг/кг веса тела. У крыс 4 группы моделировали хроническую форму цистита, для чего производили 4 в/б инъекции ЦФ с интервалом 24 часа в дозе 50 мг/кг веса тела. Продолжительность наблюдения за животными 4 группы после последней инъекции ЦФ составила 72 часа. Крысам 5 группы в/б однократно вводили циклофосфамид в дозе 100 мг/кг веса тела после чего в течение 4 суток в/ж 1 р/день вводили препарат ГГХ+ХС 3, содержащий хондроитина сульфат и глюкозамина гидрохлорид в дозе 100 мг/кг веса тела. В течение эксперимента производили отбор суточной мочи. Результаты клинического и биохимического анализа мочи животных представлены в таблице 9.
Таблица 9. Клинический и биохимический анализ мочи при геморрагическом _ цистите и терапии препаратами ГАГ(М+т)_
Показатели Группы животных
0 (К) 0/2 ГГХ+ХС 10 мг/кг 1 ЦФ без ГАГ 2 ЦФ ГГХ 50 мг/кг 3 ЦФ ГГХ 100 мг/кг 4 ЦФ без ГАГ 5 ЦФ ГГХ+ХСЗ
РН 6,0 6,1 ±0,1 6,4±0,1 6,1+0,1 6,0 6,2+0,1 6,3+0,1
Удельный вес (отн.ед) 1,02 1,03* 1,007 1,01 1,01 1,007 1,02
Эритроциты, ед/мкл 0,2 2,0 82±48,2 4,0+2,5 2,0 98,0+43, 8 18,0+15,6
Лейкоциты, ед/мл 0 0 128+94, 3 3,0 17,0+13,5 3,0 3,0
Уробилиноге н, ммоль/л 13,4 13,4 13,4 13,4 13,4 15,98 14,12
Микроальбу мин, мг/л 26±4 18±4,9 94+34,3 50+31,2 74+31,2 74+31,2 126+24,0
Кетоны, ммоль/л 0 0 0,2+0,12 0 0,1 0,2+0,12 0,1
*- р<0,05 по сравнению с группой 1 и 4. . ЦФ: группа 0/2- 80 мг/кг; группы 1 -3 - доза 100 мг/кг; группа 4- 50 мг/кг. Жирным шрифтом выделены наибольшие значения показателя в группах.
Результаты, представленные в таблице 9, показывают отсутствие статистически значимых отличий показателей между группами по рН, содержанию эритроцитов и лейкоцитов в моче животных. Данные таблицы демонстрируют существенные отличия между группами в абсолютных цифрах по таким показателям как удельный вес, эритроциты и лейкоциты. Из
биохимических показателей существенные отличия в сторону увеличения содержания уробилиногена и микроальбумина наблюдаются у животных 1 и 4 групп. Исключение составляет высокий уровень микроальбумина в моче у крыс 5 группы, которые принимали комплексный препарат ГАГ в высокой дозе - 100 мг/кг веса тела. У животных 1 и 5 групп микроальбуминурия является маркером более тяжелого протекания воспалительного процесса в мочевом пузыре. Этот факт согласуется с работами зарубежных исследователей (Keane W. F., 2000; Abrahamsson К., et al., 2002). Уробилинурия у животных 4 группы, вероятно, также является следствием развития воспалительного процесса, сопровождающегося токсичным действием метаболитов ЦФ. При оценке концентрации креатинина установлено, что при отсутствии терапии препаратами ГАГ происходит увеличение его концентрации в сыворотке крови и снижение уровня экскреции с мочой. Клиренс креатинина у животных с циститом без терапии препаратами ГАГ ниже показателей контрольных животных и крыс, получавших препараты ГАГ (табл. 10).
Таблица 10. Клиренс креатинина у крыс с циститом, индуцированным ЦФ и
терапии препаратами ГАГ (M±S)
Показатели Группы животных
0 (К) 0/2 ЦФ ГГХ+ХС1 10 мг/кг 1 ЦФ без ГАГ 2 ЦФ ГГХ 50 мг/кг 3 ЦФ ГГХ 100 мг/кг 4 ЦФ 50мг/кг без ГАГ 5 ЦФ ГГХ+ХСЗ 100 мг/кг
Креатинин в сыворотке, мкмоль/л 57,8±2,5 70,4±4,5 70,4±3 50,6±1* 55,6±2,1 70,2±18, 7 45,0±4,5*
Креатинин в моче, ммоль/л 4,2±0,8 3,5±0,2 2,6±0,9 2,5±0,6 1,8±0,4 6,3±0,9 9,7±1,6*
Клиренс креатинина, Мл/мин/кг 3,9±0,6 4,4±1,1 2,4±0,3 3,3 ±0,2 2,6±0,07 3,1±1,0 3,1±0,9
*- р<0,05 по сравнению с группой 1. ЦФ: группа 0/2- 80 мг/кг; группы 1-3 - доза 100 мг/кг; группа 4- 50 мг/кг.
в) Биохимический анализ сыворотки крови крыс при геморрагическом цистите и терапии препаратами ГАГ.
Моделирование цистита проводили на 35 белых лабораторных крысах. Принцип формирования групп, используемые дозы ЦФ и препаратов ГАГ, а также продолжительность эксперимента изложены в главе 3.3.5.7 б. В сыворотке крови определяли 12 основных показателей, в том числе ACT, AJIT, общий белок, альбумин, глюкозу, мочевину, креатинин, щелочную фосфатазу, кальций, фосфор, железо, трансферрин, ферритин.
Установлено, что у животных группы 0, 0/2, 1, 2 и 3 отсутствуют статистически значимые отличия по всем биохимическим показателям. Однако у животных всех групп, которым вводили ЦФ с целью индуцирования цистита, наблюдали снижение концентрации в сыворотке крови трансферррина, что является одним из признаков-маркеров развития воспалительного процесса (Ritchie R.F., et al., 1999). У животных 4 группы без терапии препаратами ГАГ
констатировали снижение концентрации общего белка, альбумина и глюкозы в сыворотке крови, что вероятно является следствием токсических эффектов метаболитов ЦФ при его длительном применении, а также потерь белков при хроническом геморрагическом процессе. У крыс 5 группы, которые в течение 4 суток после инъекции ЦФ получали препарат ГАГ в высокой дозе 100 мг/кг, наблюдали снижение концентрации альбумина по сравнению с интактными животными группы 0. Однако понижение содержания этого белка находилось в пределах диапазона клинической нормы. У животных 5 группы также отмечено существенное снижение концентрации ферритина в сыворотке крови, что является характерным признаком острой кровопотери, сопровождающей геморрагический тип воспаления в мочевом пузыре. В модели хронического ГЦ происходит потеря белков и снижение концентрации глюкозы в сыворотке крови. Применение комплексного препарата ГАГ ГГХ+ХС 3 в высокой дозе 100 мг/кг веса тела не препятствует развитию потерь пластических веществ, таких как альбумин и ферритин, что свидетельствует о его недостаточной эффективности в коррекции последствий геморрагического воспалительного процесса.
3.3.5.8. Цистит как этнологический фактор недержания мочи ("«подмокания») у черного соболя.
Недержание мочи («подмокание») у молодняка черного соболя в возрасте 6-7 месяцев является распространенным заболеванием этих животных в звероводческих хозяйствах Ленинградской области. Заболевание наблюдается преимущественно у самцов в летне-осенний сезон года и характеризуется недержанием мочи, приводящим к постоянному намоканию шерсти и кожи в области паха и живота («подмокание»). Инцидентность заболевания в разные годы у молодняка соболя черного варьирует от 5 до 10,5%. В период наших наблюдений в 2009-2011 году она находилась в пределах от 5 до 6,5%. Из 18171 голов молодняка соболя черного, содержавшегося в хозяйстве в этот период у 1085 животных было зарегистрировано недержание мочи («подмокание»). а). Результаты патологоанатомического вскрытия молодняка соболей, больных «подмоканием».
Работа выполнена совместно с аспирантом кафедры внутренних болезней животных им. A.B. Синева ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» Ждановым Сергеем Ивановичем. В период с 2009 по 2011 год в звероводческом хозяйстве «Заря» Ленинградской области проведено патологоанатомическое вскрытие 97 голов молодняка соболей, в том числе 83 самцов и 14 самок с диагнозом недержание мочи («подмокание»). В зависимости от тяжести заболевания площадь области «подмокания» вариабельна в широких пределах от 2 до 96 см (рис. 20). На этом основании мы предложили [10, 19] классифицировать «подмокание» соболей в зависимости от площади поврежденной мочой области тела на 3 степени: 1 степень (легкая) - 2-10 см.2 (снижение веса не более 10%); 2 степень (средней тяжести) - 10-20 см.2 (снижение веса 10%-50%); 3 степень (тяжелая форма) > 20 см2 (снижение веса более 50%) (рис. 17, 20). Животные с более тяжелой формой «подмокания» имеют существенно меньший вес тела (рис. 17, 19). К другим часто наблюдаемым симптомам заболевания относятся диарея, анемичность
слизистых оболочек, дерматит (рис. 18), дегидратация и дистрофия скелетной мускулатуры (рис. 17).
Рис. 19. Вес тела соболей, больных Рис. 20. Площадь области «подмокания» у
«подмоканием». больных соболей.
1 »V. ,«подмокания» у молодняка Рис. 18. Эрозии и язвы на коже паховой соболя: 1,2,3 степень. области у соболя, больного
«подмоканием».
Вес соболей при "подмокании"
Площадь "подмокания" убольных соболей
1 степень 2 степень 3 с
1 степень 2 степень 3 степень
■
Рис. 21 . Катаральный цистит соболя больного «подмоканием».
Рис. 22. Геморрагический цистит у соболя при «подмокании». 1-мочевой пузырь; 2-геморрагический участок.
По результатам патологоанатомического вскрытия трупов 97 животных, больных «подмоканием», у 23 самцов (28%) и у 6 самок (14%) диагностировали катаральную (рис. 21) или геморрагическую форму цистита (рис. 22).Таким образом, у молодняка соболей воспалительный процесс в мочевом пузыре может являться этиологическим фактором в реализации патогенеза недержания мочи («подмокания») у этого вида животных. Известно, что инфекции мочевыводящих путей у пушных зверей могут приводить к развитию симптомов недержания мочи (Budd J., et al„ 1966). Однако ранее исследователями, занимающимися проблематикой этиологии и патогенеза «подмокания» ("wet belly") у норок при гистологическом исследовании органов мочевыводящей системы, а именно в почках, мочеточниках, мочевом пузыре и препуции не было выявлено изменений воспалительного характера (Bostrom R.E., et al„ 1967). Выборочный бактериологический анализ мочи соболей, больных «подмоканием» выявил присутствие у некоторых животных антибиотико-резистентных штаммов Е. Coli. В наших исследованиях тем самым впервые показано наличие цистита у молодняка соболей, больных недержанием мочи «подмоканием». В этой связи вполне вероятно, что у определенного числа больных животных причиной может являться воспалительный процесс в мочевом пузыре.
б). Морфология мочевого пузыря у соболей больных «подмоканием».
Для сравнительного анализа гистологических изменений в мочевом пузыре были сформированы три группы животных в возрасте 7 месяцев, от которых отбирали секционный материал. У соболей 1 группы (контроль) клинические признаки заболевания и патологические изменения в мочевом пузыре отсутствовали. Во 2 и 3 группу включили животных с клиническими признаками недержания мочи и воспалительного процесса в мочевом пузыре. У соболей 2 группы при патологоанатомическом вскрытии диагностировали катаральный цистит. Материал от животных 3 группы - мочевые пузыри с признаками очагового геморрагического цистита (рис. 22). На гистологических срезах мочевого пузыря у больных животных 3 группы выявлено наличие геморрагических участков с дегенеративными изменениями структуры соединительной ткани подслизистой основы и мышечных волокон в мышечной оболочке органа. При окрашивании срезов методом Хейла и альциановым синим, отмечается интенсивное окрашивание собственной пластинки слизистой оболочки. Этот факт, очевидно, указывает на локальное накопление ГАГ.
Результаты морфометрического анализа срезов мочевого пузыря показали, что у животных 2 и 3 групп слизистая оболочка (171,3±21,8; 103,7±9,9 мкм) и подслизистая основа (84,3±9,1; 53,78±7,2 мкм) статистически значимо (р<0,001) тоньше, чем в контрольной группе (201,8±33,2 мкм). Истончение слизистой оболочки объясняется усилением десквамации эпителиоцитов и дилатацией мочевого пузыря под влиянием воспалительного процесса. У животных 2 группы по сравнению с контролем (71,0±6,9 мкм) наблюдается утолщение и отек собственной пластинки слизистой оболочки (123,3±24,6 мкм), характерные для катарального воспалительного процесса. Уменьшение толщины мышечной оболочки мочевого пузыря у соболей 2 и 3 групп (834,9± 101,2; 340,3± 50,2 мкм) по сравнению с контролем (1276,0±340,3 мкм) отражает
состояние функциональной неполноценности мочевого пузыря, в частности его атонию и последующую дилатацию. Таким образом, впервые получена информация о гистологических изменениях мочевого пузыря у соболей с синдромом недержания мочи, сопровождающимся патологоанатомическими признаками цистита. С помощью гистохимического исследования обнаружены признаки накопления ГАГ в собственной пластинке мочевого пузыря больных животных, что свидетельствует об активации слизистой оболочкой ее защитных свойств под влиянием факторов воспалительного процесса. Выявлены статистически значимые различия в морфологии мочевого пузыря у соболей при недержании мочи, такие как уменьшение толщины слизистой и мышечной оболочки мочевого пузыря у больных животных, что, по-видимому, обусловлено развитием функциональных нарушений, таких как атония и дилатация мочевого пузыря, наблюдаемых у некоторых животных при секционном осмотре мочевого пузыря. Уменьшение толщины слизистой оболочки у больных животных, вероятно, указывает на усиление процесса десквамации переходного эпителия под влиянием воспалительного процесса, в). Анализ мочи у соболей больных «подмоканием».
Для определения суточного диуреза у здоровых и заболевших «подмоканием» соболей были сформированы 4 группы животных по 3 головы в каждой. В группы 1 -3 были включены соболи, имеющие клинические признаки 1, 2 и 3 стадии заболевания. В группу 4 были включены клинически здоровые животные (контроль). Отбор проб мочи, и учет суточного диуреза у животных проводили в течение 7 суток. Образцы мочи у зверей наблюдаемых групп получали с помощью разработанного нами устройства для сбора экскрементов. В полученной моче после центрифугирования в течение 10 минут при 2500 об./мин. определяли следующие показатели: относительную плотность; рН мочи; общий белок; альбумин и креатинин.
В результате наблюдений установлено, что у заболевших животных с увеличением тяжести течения заболевания снижалось количество выделяемой мочи. Различия являются статистически значимыми (р<0,001) для животных 1-3 групп по сравнению со здоровыми животными 4 группы. Средний объем суточного диуреза у животных 1 группы - 67,91±17,15 мл; во 2 группе -51,72±21,0 мл; в третьей - 31,28±21,29 мл и в 4 - 134,0±34,85 мл. При сравнительном определении рН мочи у здоровых соболей и больных СНМ животных 1-3 стадии статистически значимых отличий не выявлено. У заболевших животных значения рН мочи в среднем составили 6,7±0,54, а в контрольной группе - 6,79± 0,34. Относительная плотность мочи, полученной у больных соболей и у здоровых зверей также не имела статистически значимых отличий и составила 1,02±0,004 у заболевших и 1,02±0,006 у здоровых животных. Статистически значимые отличия (р<0,01) по содержанию выделяемого с мочой общего белка и альбумина установлены у больных «подмоканием» зверей по сравнению со здоровыми животными. Содержание общего белка в моче больных зверей составляет 5,19+1,62 г/л, в то время как в контрольной группе 1,22±0,21 г/л. Содержание альбумина в моче соболей, больных «подмоканием» составляет 1,23±0,67 г/л, а в контрольной группе -0,13±0,06 г/л. В моче больных соболей также наблюдали статистически
значимое повышение содержания креатинина (р=0,02), по сравнению с показателями контрольной группы. При микроскопическом исследовании осадка мочи у больных соболей в отличие от здоровых животных наиболее часто обнаруживали единичные кристаллы или конгломераты кристаллов цистина, цилиндроиды и элементы слизи. Органические элементы осадка (клетки крови, эпителия и цилиндры) как в моче больных, так и здоровых животных встречались в пределах 0-3 элемента в поле зрения микроскопа (х 200).
г). Влияние глюкозамина гидрохлорида на морфологию мочевого пузыря соболей при недержании мочи («подмокании»).
Методом случайной выборки были сформированы 4 группы животных по 3 соболя в каждой группе. В каждую группу включили 2 самца и 1 самку. Животные содержались в индивидуальных бескаркасных клетках из металлической сетки типовых сараях-шедах. В группы 1-3 были включены соболи, имеющие клинические признаки «подмокания»; в группу 4 включили клинически здоровых животных. Соболям 1 и 2 группы ежедневно однократно в течение 60 суток с кормом давали ГГХ в дозах 12,5 мг/кг и 25 мг/кг веса тела. Животные 3 и 4 групп препарат не получали. В период наблюдений периодически проводили отбор проб мочи от животных всех групп, учет суточного диуреза и измерение площади области «подмокания».
Применение препарата ГГХ в группе 1 и 2 в течение всего периода наблюдений не приводило к исчезновению клинических признаков недержания мочи. У соболей 1-Згрупп до начала применения препарата была измерена площадь области повреждения мочой меха и кожи. В первой группе она составила 14,6±2,5 см2; во второй группе - 16,0±2,6 см2; в третьей группе 16,7±3,0 см2. По завершению исследований у соболей 1 группы площадь области повреждения кожи и меха - 25,0±4,3 см2; у животных 2 группы -28,3±7,0 см2; в 3 группе - 36,0±4,6 см2. Таким образом, показано, что у животных всех групп в течение 60 суток произошло увеличение дефектной площади кожи и меха. Однако у соболей 1 группы площадь зоны повреждения существенно меньше, чем у животных 3 группы, не принимавших препарат ГАГ. Различия статистически значимы для р<0,01. При изучении обзорных гистологических срезов мочевого пузыря у животных 1-3 групп признаков воспалительного процесса в нем не установлено.
Методами количественной морфометрии мочевого пузыря выявлен ряд отличий у животных опытных и контрольной групп, которые, однако, имеют неоднозначный характер. У больных животных 1, 2 и 3 групп толщина слизистой оболочки (59,8±10,2; 71,3±13,7; 89,0±21,1 мкм) и ее собственной пластинки (20,0±4,8; 17,1±4,4; 18,5±4,5 мкм) статистически значимо (р<0,05) ниже, чем у здоровых животных (145,6±34,0 и 30,3±5,9 мкм).
У соболей 1, 2 и 3 групп объем клеток (361,3±190,8; 286,8±161,4; 467,2±279,4 мкм) и ядер (139,2±78,6; 88,7±53,8; 177,0±117,3 мкм) переходного эпителия имеют статистически значимо (р<0,001) меньшие размеры по сравнению со здоровыми животными (2123±1553 и 721,9±470,3 мкм).
Снижение толщины слизистой оболочки и меньший объем клеток и ядер переходного эпителия у животных 1, 2 и 3 группы по сравнению с показателями
соболей контрольной группы возможно связано с десквамацией поверхностного слоя эпителиоцптов слизистой мочевого пузыря, которые, как известно, имеют большие размеры. В то время как клетки базального и промежуточного слоев слизистой оболочки близки к сферической форме и имеют относительно небольшие размеры.
Прием больными животными препарата, содержащего ГГХ, в течение 60 суток не приводит к полному устранению симптомокомплекса «подмокания». В то же время у соболей, принимавших препарат ГАГ к завершению исследований площадь области повреждения меха и кожи в среднем на 10% меньше, чем у животных без лечения.
д). Количественное определение ГАГ в моче у соболей больных «подмоканием».
Методом случайного отбора проводили сбор суточной мочи от 3 соболей, больных «подмоканием» и 3 клинически здоровых животных. Концентрация ГАГ в моче клинически здоровых животных составила 3,67±0,17 мг/дл, а у соболей, больных «подмоканием» 2,49±0,23 мг/дл. Различия являются статистически значимыми при р=0,017. Таким образом, нами впервые получена информация о содержании ГАГ в моче соболей, больных «подмоканием» по сравнению с клинически здоровыми животными и установлено снижение экскреции этих веществ с мочой при заболевании.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Экспериментальные исследования воспалительного процесса в мочевом пузыре при моделировании на лабораторных животных показали ряд тканевых и клеточных изменений, которые могут быть количественно охарактеризованы методами морфометрического анализа и использованы в практической ветеринарной медицине в качестве биомаркеров патологического процесса.
2. При цистите термической и химической этиологии происходит статистически значимое уменьшение высоты эпителиального слоя слизистой оболочки, связанное с десквамацией эпителия. Цистит бактериальной, термической, и химической этиологии сопровождается статистически значимым увеличением толщины собственной пластинки слизистой оболочки, тканевым отеком и клеточной воспалительной инфильтрацией. Геморрагический цистит приводит к развитию статистически значимой дилатации сосудов подслизистой основы и собственной пластинки мочевого пузыря, что в дальнейшем способствует выходу эритроцитов во внесосуднстое пространство и развитию гематурии. При геморрагическом цистите наблюдается уменьшение толщины мышечной оболочки. Неспецифический цистит бактериальной этиологии, индуцированный условно-патогенной микрофлорой приводит к статистически значимому увеличению размеров эпителиоцптов и их ядер, к плазморексису и умеренной вакуолизации цитоплазмы и увеличению ЦЯО.
3. Наиболее характерными и закономерными морфологическими изменениями в мочевом пузыре животных при экспериментальном цистите любой этиологии являются отек тканей и клеточная инфильтрация, приводящие к изменению линейных размеров основных гистологических компонентов мочевого пузыря: высоты переходного эпителия; толщины собственной
пластинки, толщины подслизистой основы, толщины мышечной и серозной оболочки, а также цитометрических показателей эпителия.
4. Биохимические показатели крови: АЛТ, АСТ, общий белок, альбумин, глюкоза, креатинин, мочевина, кальций, фосфор, железо, холестерин сыворотки крови крыс под влиянием воспалительного процесса в мочевом пузыре не изменяются, что не позволяет рекомендовать стандартную биохимическую панель в качестве информативного диагностического маркера. При субхронической форме геморрагического цистита происходит статистически значимое снижение концентрации ферритина в сыворотке крови. Воспалительный процесс в мочевом пузыре приводит к повышению содержания в плазме крови крыс специфических белков острой фазы воспалительного процесса, таких как цитокины 1Ь-6 и 1Ь-10 на протяжении 48 часов после индуцирования цистита.
5. При экспериментальном геморрагическом цистите происходит увеличение экскреции с мочой микроальбумина, кетоновых тел и снижение
экскреции креатинина.
6. Под влиянием воспалительного процесса в мочевом пузыре в зависимости от силы и продолжительности воздействия повреждающего фактора уровень экскреции ГАГ с мочой изменяется. При острой форме цистита в течение 72 часов развития воспалительного процесса наблюдается снижение уровня экскреции ГАГ с мочой. При хронической интоксикации ЦФ в модели субхронического цистита наблюдается снижение экскреции ГАГ в течение 72 часов, с последующим повышением экскреции ГАГ через 96 часов.
7. При острой форме цистита происходит накопление ГАГ в поверхностном слое эпителия и снижение содержания ГАГ в собственной пластинке. Субхроническая форма цистита характеризуется повышением концентрации ГАГ на поверхности эпителия и в собственной пластинке слизистой оболочки мочевого пузыря.
8. Гликозаминогликаны (ГАГ) обеспечивают защиту тканей мочевого пузыря от воздействия повреждающих факторов бактериальной и химической этиологии. Препараты ГАГ для перорального применения проявляют защитные свойства в различной степени в зависимости от дозы и состава препаратов. Наибольшая эффективность в терапии экспериментального цистита у крыс установлена для комплексных препаратов ГГХ+АС 1 и 2, содержащих глюкозамина гидрохлорид (50 и 100 мг/кг) с аскорбиновой кислотой (10 мг/кг) и ГГХ+ХС 2 и 3, содержащих глюкозамина гидрохлорид с хондроитина сульфатом в дозах 50 и 100 мг/кг веса тела.
9. Результаты патологоанатомического вскрытия трупов черного соболя, больных недержанием мочи («подмоканием») показали наличие в мочевом пузыре животных катаральной или геморрагической формы цистита у 28% самцов и у 14% самок. Цистит является факторным или сопутствующим заболеванием при недержании мочи «подмокании» у молодняка соболя черного
в возрасте 7 месяцев.
10. Глюкозамина гидрохлорид при пероральном применении в дозах 12,5 и 25 мг/кг веса тела на протяжении 60 суток у соболей в возрасте 7 месяцев, больных недержанием мочи («подмоканием») уменьшает площадь области
повреждения меха и кожи у больных соболей на 10% (25±4,3см2) по сравнению с животными без лечения препаратом (36±4,6 см"). Средняя площадь шкурки соболя составляет 594 см2. У животных получавших препарат ГАГ площадь области повреждения шкурки - 4,2 % (3 группа пороков) от общей площади шкурки, а у животных без лечения - 6,06 % (4 группа пороков). Проведенное лечение привело к уменьшению площади повреждения мехового сырья, повысив его качество и стоимость с 4-ой группы пороков (в зачет 70%) на 3-ю группу, где в зачет идет 80% от средней стоимости шкуры.
11. Средняя стоимость шкурки соболя на международных аукционах в ценах 2013 года составляет 4000 руб. Шкурки с 4-ой группой пороков оцениваются на 70% от средней стоимости (2800 руб.), с 3-ей 80% (3200 руб.) от средней стоимости. Разница составляет 400 руб. Затраты на лечение 1-го животного препаратом ГАГ при «подмокании» в течение 60 дней составляют 72 руб. Экономическая эффективность терапии соболей больных «подмоканием» препаратом ГАГ составляет таким образом 5,55 руб. на рубль произведенных затрат (400 р.-^ 72 руб. = 5,55 руб.).
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Разработанные методики экспериментального моделирования цистита бактериальной, термической и химической этиологии предлагаются к использованию в экспериментальной биологии и учебном процессе прн подготовке специалистов в области биологии, медицины и ветеринарии.
2. Способ введения химических ирритантов (9% раствор уксусной кислоты) в полость мочевого пузыря лабораторных животных (крыс) с предварительной в/м инъекцией раствора фуросемида рекомендуется к использованию в экспериментальной биологии для моделирования цистита химической этиологии, а также как модель механической травмы мочевого пузыря.
3. Метод морфометрической оценки изменений тканей и клеток в мочевом пузыре предлагается к использованию в лабораториях патоморфологической диагностики, а также при экспериментальном моделировании патологических процессов в качестве объективной количественной оценки патологических изменений при воспалительном процессе.
4. В качестве биомаркера воспалительного процесса в мочевом пузыре предлагается метод количественной оценки гистохимической реакции на гликозаминогликаны в тканях мочевого пузыря с использованием градуировочных стандартов красителя альцианового синего.
5. Учебное пособие «Современные методы исследования почек и мочевыводящих путей домашних животных» предлагается к использованию в образовательном процессе студентов ветеринарных факультетов.
6. Монография «Цистит. Экспериментальное моделирование» предлагается к использованию в практической деятельности токсикологов, фармакологов, врачей и ветеринарных специалистов, слушателей курсов постдипломного медицинского и ветеринарного образования, морфологов, биологов, физиологов, преподавателей вузов, студентов факультетов медицины человека и ветеринарной медицины.
7. Для ветеринарных специалистов, практикующих в области промышленного звероводства предлагается клиническая классификация тяжести заболевания соболей «подмоканием», учитывающая размеры области (площади) поврежденного участка кожи и меха и снижение веса тела больных животных на 3 степени: 1 степень (легкая) - 2-10 см2 (снижение веса не более 10%); 2 степень (средней тяжести) - 10-20 см2 (снижение веса 10%-50%); 3 степень (тяжелая форма) > 20см" (снижение веса более 50%) и лечение больных животных препаратом гликозаминогликанов в составе комплексной терапии.
8. Устройство для сбора экскрементов у пушных зверей (патент РФ 108915 МПК А 01К 23/00 (2006.01) рекомендуется для использования в звероводческих хозяйствах.
Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. Статьи в рецензируемых изданиях.
1. Соболев В.Е. Влияние препарата гликозаминогликанов на морфологию
мочевого пузыря и течение бактериального цистита крыс [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Международ, вестник ветеринарии. - 2009. - №3. - С.9-12.
2. Соболев В.Е. Гликозаминогликаны в комплексной терапии цистита различной этиологии [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2010. - № 4 -С. 168-169.
3. Соболев В.Е. Нефрология и урология домашней собаки (Canis lupus
familiaris) [текст]/ В.Е. Соболев // Рос. вет. журн. -2010. -№ 3. - С. 36-38.
4. Соболев В.Е. Нефрология и урология домашней кошки (Felis catis) [текст]/
В.Е. Соболев // Рос. вет. журн. - 2011. - № 1С. 40-42.
5. Соболев В.Е. Влияние экзогенных гликозаминогликанов на морфологию мочевого пузыря крыс в условиях экспериментального цистита [текст]/
B.Е. Соболев // Ветеринар, патология. - 2010. - № 2. - С. 35-38.
6. Соболев В.Е. Защитные свойства гликозаминогликанов к повреждающему действию уксусной кислоты при экспериментальном цистите [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Вестник Орел ГА У. - 2011. - № 6 (33). - С.92-95.
7. Соболев В.Е. Идиопатический цистит кошек [текст]/ В.Е. Соболев // Рос. вет. журн. - 2012. - № 2. - С. 47-51.
8. Соболев В.Е. Синдром недержания мочи у пушных зверей [текст]/ В.Е.
Соболев, С.И. Жданов // Иппология и ветеринария. - 2012. - № 1 (3). -
C.114-117.
9. Соболев В.Е. Влияние экзогенных гликозаминогликанов на
гистологическое строение мочевого пузыря крыс при экспериментальном цистите [текст]/ В.Е. Соболев // Бюллетень эксперимент, биологии и медицины. -2012. -№ 7 (154). - С. 121-126. Ю.Соболев В.Е. Синдром недержания мочи у пушных зверей: основные клинические симптомы и принципы классификации [текст]/ В.Е. Соболев //Вестник Ульянов. СХА. - 2012. - № 2 (18). - С. 64-67.
11. Соболев В.Е. Цистит собак часть 1 [текст]/ В.Е. Соболев // Рос. вет жури -2012.-№4.-с. 46-48.
12. Соболев В.Е. Патологоанатомическая картина при синдроме недержания мочи у соболей [текст]/ В.Е. Соболев // Вет. патология. - 2012. - № 2 - С 95-98.
13. Соболев В.Е. Патологоанатомическая картина при синдроме недержания мочи у соболей [текст]/ В.Е. Соболев // Уч. записки Казан, гос. академии вет. медицины. - 2012. - Т. 212. - С. 150-154.
14. Соболев В.Е. Глюкозамина гидрохлорид в терапии синдрома недержания мочи у соболей [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Известия Оренбург, гос. аграр. ун-та. - 2012. - № 4 (36). - С. 89-93.
15. Соболев В.Е. Цистит собак часть 2 [текст]/ В.Е. Соболев // Рос. вет журн -2012.-№5. _с. 35-37.
16. Соболев В.Е. Гистология мочевого пузыря при синдроме недержания мочи у соболей [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Известия Оренбург, гос. аграр. ун-та. - 2012. - № 5 (37). - С. 91-94.
17. Соболев В.Е. Цистит: этиологический фактор синдрома недержания мочи у пушных зверей [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Иппология и ветеринария. - 2012. - № 3 (5). - С. 129-134.
18. Соболев В.Е. Цистит крупного рогатого скота [текст]/ В.Е. Соболев // Рос. вет. журн.: с.-х. животные. -2012. -№ 4. - С. 40-42.
19. Соболев В.Е. Синдром недержания мочи у соболей: этиология, клинические симптомы и принципы классификации [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Вестник Бурят, гос. с.-х. академии им. В.Р. Филиппова -2012.-№4(29).-С. 13-17.
20. Соболев В.Е. Цистит лошадей [текст]/ В.Е. Соболев // Иппология и ветеринария. - 2012. - № 4 (6). - С.31 -34.
21. Соболев В.Е. Цистит свиней [текст]/ В.Е. Соболев // Рос. вет. журн.: с-х. животные - 2013. - № 1. - С. 32-34.
22. Соболев В.Е.. Анализ мочи соболей при «подмокании» [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Ветеринария. - 2013. -№ 4. - С. 44-45.
23. Соболев В.Е. Клинический и биохимический анализ мочи при синдроме недержания мочи у соболей [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Вестник Бурят, гос. с.-х. академии им. В.Р. Филиппова. - 2013. - № 1 (30) - С 3134.
24. Соболев В.Е. Цистит как вероятный этиологический фактор синдрома недержания мочи у соболей [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Сельхоз. биология. -2014 -№ 2. - С. 112-117.
25. Соболев В.Е. Клинический и биохимический анализ мочи крыс при экспериментальном геморрагическом цистите [текст]/ В.Е. Соболев // Уч. зап. Орл. гос. ун-та: Естеств., тех. и мед. науки - 2014 - № 7 (63) - С 257259.
26. Sobolev V.E. Effects of Exogenous Glycosaminoglycans on the Histological Structure of the Rat Bladder in Experimental Cystitis [текст]/ Sobolev V.E. // Bull. Exp. Biology Med.-2012. -Vol. 154, N. 1. - P. 108-111.
2. Статьи в других изданиях.
27. Соболев В.Е. Методологические основы мониторинга нефрологической и урологической патологии в условиях клиники [текст]/ В.Е. Соболев // Актуал. проблемы вет. медицины: Тез. докл. науч.-практ. конф. 12 ноября 2004г. - СПб, 2005. - С. 60-63.
28. Соболев В.Е. Экспресс-анализ мочи: факторы влияния и интерпретация результатов [текст]/ В.Е. Соболев // Актуал. проблемы вет. медицины: Тез. докл. конф. Белые ночи 24 июня 2005 г. - СПб, 2005. - С.65-72.
29. Соболев В.Е. Изучение защитных свойств гликозаминогликанов в условиях экспериментального цистита у крыс [текст]/ В.Е. Соболев // Актуал. вопросы электрофизиологии и незараз, патологии животных: Материалы международ, науч-практ. конф. 26-28 июня 2009 г.: ч. 2. -Улан-Удэ, 2009. - С. 83-86.
30. Соболев В.Е. Сравнительная характеристика методов создания искусственной непроходимости уретры у кошек в эксперименте [текст]/
B.Е. Соболев // Вет. медицина. Совр. проблемы и перспективы развития: Материалы международ, науч.-практ. конф./ Под ред. A.A. Волкова. -Саратов: Наука, 2010. - С. 381-383.
31. Соболев В.Е. Сравнительная характеристика методов индуцирования экспериментального цистита у лабораторных животных [текст]/ В.Е. Соболев // Вет. медицина. Совр. проблемы и перспективы развития: Материалы международ, науч.-практ. конф./ Под ред. A.A. Волкова. -Саратов: Наука, 2010. - С.383-386.
32. Соболев В.Е. Роль экзогенных гликозаминогликанов в патоморфогенезе экспериментального цистита различной этиологии [текст]/ В.Е. Соболев,
C.И. Жданов. Г.Г. Щербаков // Высокие технологии, фундаментал. и приклад, исследования в физиологии и медицине: Сб. науч. трудов 1-й международ, науч.-практ. конф., 23-26 ноября 2010 г., СПб. - Т.З. - СПб: Политех, ун-т,2010. - С. 322-325.
33. Соболев В.Е. Экзогенные гликозаминогликаны в патоморфогенезе экспериментального цистита различной этиологии [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Материалы международ, науч. конф. профессорско-преподават. состава, науч. сотрудников и аспирантов СПбГАВМ. - СПб: СПбГАВМ, 2011. - С.65-66.
34. Соболев В.Е. Активность этиологических факторов в патогенезе экспериментального цистита крыс [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Междунар. науч.-практич. конф. по патофизиологии животных, поев. 90-летию каф. пат. физиологии ФГБОУ ВПО «СПбГАВМ». - СПб: СПбГАВМ, 2011.-С. 111-112.
35. Соболев В.Е. Гистологическая картина мочевого пузыря при синдроме недержания мочи у соболей [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Совр. проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии: Сб. трудов Всерос. интернет-конф., Казань, 3-6 апреля 2012 г. / ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины» - Казань: Казан, унт, 2012.-С 111-112.
36. Соболев В.Е. Катаральный и геморрагический цистит при синдроме недержания мочи у соболей [текст]/ В.Е. Соболев, С.И. Жданов // Совр. тенденции в сел. хоз-ве: Сб. трудов I междунар. интернет-конф., Казань, 15-17 октября 2012 г. - С. 169-174.
37. Соболев В.Е. Влияние циклофосфамида в модели геморрагического цистита на газообмен и электролиты крови крыс [текст]/ В.Е. Соболев // Мед. академ. журн.: Припож.: Проблемы мед. науки третьего тысячелетия: Материалы 2-й всерос. науч. конф. молодых ученых, Санкт-Петербург, 12-14 ноября 2012 г.-С. 174-175.
38. Соболев В.Е. Морфометрические показатели мочевого пузыря крыс при геморрагическом цистите, индуцированном циклофосфамидом [текст]/ В.Е. Соболев // Мед. акад. журн.: Прилож.: Проблемы мед. науки третьего тысячелетия: Материалы 2-й всерос. науч. конф. молодых ученых, Санкт-Петербург, 12-14 ноября 2012 г.-С. 177-179.
39. Соболев В.Е. Показатели диуретической функции у крыс в условиях цистита, индуцированного циклофосфамидом [текст]/ В.Е. Соболев // Мед. акад. журн.: Прилож.: Проблемы мед. науки третьего тысячелетия: Материалы 2-й всерос. науч. конф. молодых ученых, Санкт-Петербург, 12-14 ноября 2012 г.-С. 179-181.
40. Соболев В.Е. Продукция цитокинов у крыс в модели цистита, индуцированного циклофосфамидом [текст]/ В.Е. Соболев // Мед. акад. журн.: Прилож.: Проблемы мед. науки третьего тысячелетия: Материалы 2-й всерос. науч. конф. молодых ученых, Санкт-Петербург, 12-14 ноября 2012 г.-С. 181-183.
41. Соболев В.Е. Оптимизация выбора дозы циклофосфамида для индуцирования экспериментального воспалительного процесса [текст]/ В.Е. Соболев // IV съезд токсикологов России, 6-8 ноября 2013 г. Москва / ФС по надзору в сфере з.п.п и благополучия чел.: Сб. науч. трудов. -Москва: Capital Press, 2013. - С. 438-440.
42. Соболев В.Е. Оценка гистохимической реакции гликозаминогликанов в тканях мочевого пузыря при экспериментальном цистите [текст]/ В.Е. Соболев, Л.П. Тельцов // Механизмы и закономерности индивидуального развития человека и животных: Матер, междунар. науч.-практ., посвящ. 75-летию заслуж. деятеля науки РФ, д.б.н., проф. Тельцова Л.П. -Саранск: Изд-во Мордовского ун-та, 2014.-Ч.2.-С.317-323.
3. Монографии, учебные пособия.
43. Соболев В.Е. Современные методы исследования почек и мочевыводящих путей домашних животных: Уч. пособие [текст]/ Соболев В.Е. - СПб.: Сатисъ, 2010. - 60 с.
44. Соболев В.Е. Цистит. Экспериментальное моделирование / В.Е. Соболев, Л.П. Тельцов, A.B. Соболева. - СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2014. - 200 с.
4. Патенты.
45. Пат. 108915 Российская Федерация, МПК А 01К 23/00 (2006.01). Устройство для сбора экскрементов животных в клеточном звероводстве / Соболев В.Е, Соболева A.B., Жданов С.И., Жданова И.А.; заявитель и правообладатель ФГБОУ ВПО СПб ветеринар, акад. - 2011115201/13; заявл. 18.04.11; опубл. 10.10.2011, бюл. № 28. - 3 е.: ил.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АК - Аскорбиновая кислота
AJIT - Аланинаминотрансфераза
ACT - Аспартатаминотрансфераза
АС - Альциановый синий
в/в - внутривенно
в/б - внутрибрюшинно
в/ж - внутрижелудочно
в/м - внутримышечно
ГАГ - Гликозаминогликаны
ГГХ - Глюкозамина гидрохлорид
ГГХ+АС — Комплексный препарат, содержащий глюкозамина гидрохлорид и аскорбиновую кислоту
ГГХ+АС 1 - Комплексный препарат, содержащий глюкозамина гидрохлорид 50 мг/кг веса тела и аскорбиновую кислоту 10 мг/кг веса тела
ГГХ+АС2 - Комплексный препарат, содержащий глюкозамина гидрохлорид
100 мг/кг веса тела и аскорбиновую кислоту 10 мг/кг веса тела ГГХ+ХС - Комплексный препарат, содержащий глюкозамина гидрохлорид и хондроитина сульфат
ГГХ+ХС 1,2,3 - Комплексный препарат, содержащий глюкозамина
гидрохлорид и хондроитина сульфат в дозе 10, 50 и 100 мг/кг веса тела
ГЦ - Геморрагический цистит
Г-Э - Гематоксилин-эозин
КОС - Кислотно-основное состояние
КЦ - Катаральный цистит
ЛДГ — Лактатдегидрогеназа
п/к - подкожно
ОКА - Общий клинический анализ крови ЦФ - Циклофосфамид
DMMB - 1,9 - диметил-метиленовый синий («Голубой Тайлора») M±S (значение среднего+стандартное отклонение) Me±S (медиана ± стандартное отклонение) М+ш (значение среднего+стандартная ошибка среднего)
Подписано в печать 14.08.2014. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100. Заказ 12103Ь.
Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Типографии Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 552-77-17; 550-40-14
-
Соболев, Владислав Евгеньевич
-
доктора биологических наук
-
Саранск, 2014
-
ВАК 06.02.01
- Онтогенетический морфогенез вегетативных органов Valeriana wolgensis Kazak. и Tussilago farfara L. в условиях культуры
- Роль механических напряжений в морфогенезе и разметке осевых зачатков у зародышей шпорцевой лягушки
- Морфофункциональные особенности лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных в постнатальном онтогенезе, при уролитиазе и лимфотропной коррекции
- Сравнительный морфогенез и структура вегетативных органов растений хозяйственно ценных видов рода Oenothera L.
- Периодизация и регуляция морфогенеза боковых корней Linum usitatissimum L.
