Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль механических напряжений в морфогенезе и разметке осевых зачатков у зародышей шпорцевой лягушки

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ермаков, Александр Сергеевич, Москва

/

Московский Государственный Университет им.

М.В. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи

Ермаков Александр Сергеевич

УДК 591

Роль механических напряжений в морфогенезе и разметке осевых зачатков у зародышей шпорцевой

лягушки

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Л. В. Белоусов

Москва - 1999

Оглавление.

Введение...................................................................3

Глава I. Обзор литературы.........................................5

Проблема регуляции биологического морфогенеза...................5

Гаструляция амфибий........................................................17

Проблема эмбриональной индукции. Общие

сведения..........................................................................20

Планарная и вертикальная индукция....................................22

Представления о градиентах концентрации

индукционных факторов.....................................................23

Роль механических напряжений в организации морфогенеза....25 Морфогенетические поля и устойчивые морфогенетические

движения.........................................................................28

Гипотеза гипервосстановления механических напряжений.......30

Глава II. Материалы и методы...................................32

Микрохирургия................................................................33

Гистологическая обработка и световая микроскопия...............37

Сканирующая электронная микроскопия..............................38

Морфометрия...................................................................38

Статистическая обработка

результатов......................................................................39

Глава III. Результаты................................................40

Ближайшие (2-3 часа) последствия релаксации механических

натяжений на стадии поздней бластулы................................40

Последствия релаксации механических напряжений через 5-6 часов культивирования.......................................................40

Особенности экспериментальных зародышей после

долговременного (1 -1.Зсуток) культивирования......................42

Гистологическое строение зародышей, культивируемых 1.5 суток

после операции..................................................................43

Анализ аномальных морфогенетических движений с помощью

гетеропластических меток....................................................45

Результаты экспериментов по растяжению зародышей, подвергнутых перед этим операции по релаксации механических напряжений (тяга стеклянными палочками на агарозном

субстрате........................................................................47

Результат релаксации механических натяжений путем сагиттального разреза........................................................47

Последствия операций по изменению рисунка механических напряжений в дорсальной маргинальной зоне на стадии ранней гаструлы. Наблюдения за маркированными зародышами........48

Отдаленные результаты операций.......................................49

Количественные оценки объемов зачатков осевых органов......50

Глава IV. Обсуждение..............................................53

Выводы...................................................................66

Список литературы...................................................67

Приложение.............................................................80

Введение.

Любой развивающийся организм в ходе своего развития многократно и закономерно изменяет свою форму. При этом происходит усложнение его пространственной организации, понижение порядка симметрии. Цепь морфогенетических событий сопряжена с процессами дифференцировки тканей и органов. Актуальной представляется задача выяснения соответствия между нарушениями морфогенетических и дифференцировочных процессов.

Еще классические эксперименты Г. Дриша по разделению бластомеров морского ежа на стадии двух бластомеров, каждый из которых превращался в полноценную личинку, продемонстрировали целостность развития. Эти данные были затем подтверждены огромным количеством, экспериментов на разных объектах и стадиях развития. Их результаты были обобщены в законе Дриша: "Судьба части есть функция ее положения в целом" (Дриш, 1915). Этот закон послужил отправной точкой для концепции морфогенетических полей (Гурвич, 1944; Гурвич, 1991). Согласно одной из современных интерпретаций морфогенетические поля рассматриваются как системы взаимодействующих пассивных и активных механических напряжений в эмбриональных тканях (Веки^оу, 1993; ЕЫоиэзоу, 1994). Именно поля механических натяжений определяют устойчивость морфогенетических движений (Черданцев, 1977).

Установлено, что каждый период развития характеризуется своим уникальным рисунком механических натяжений

определенной топологии (Beloussov, Dorf man, Cherdantzev, 1975) и что натяжения влияют на морфогенез (Лакирев, Белоусов, Наумиди, 1988). Вместе с тем, влияние механических натяжений на морфогенез и разметку осевых зачатков изучено далеко не достаточно.

Задача данной работы — изучить именно эти вопросы, экспериментально модифицируя механические натяжения на стадиях поздней бластулы и ранней гаструлы и прослеживая влияние этих модификаций на морфогенез и дифференцировку осевых зачатков.

Глава I. Обзор литературы.

Проблема регуляции биологического морфогенеза.

Образование закономерных форм и структур (пространственной организации зародыша) — основа индивидуального развития. Явление пространственной организации не получило, однако, достаточно убедительного объяснения в рамках классического каузально-аналитического подхода, исходящего из линейных представлений об однозначности причинно-следственных связей. Этот подход неизбежно приводил к преформизму (представлению о предраспределении зачатков), который был окончательно отклонен более 100 лет тому назад опытами Г.Дриша по обнаружению эмбриональных регуляций (Дриш, 1915).

В широком смысле слова регуляциями принято называть воссоздание нормальной структуры организма после нарушений нормального состояния зародыша в результате изъятия, добавления и перемещения частей его материала. В преобладающем числе регуляций судьба почти всех материальных элементов зародыша изменяется по сравнению с судьбой тех же элементов в нормальном развитии. Именно такие регуляции получили название Дришевских (в противоположность Гольтфретеровским регуляциям, при которых судьба элементов не меняется, но изменяется их расположение). Очевидно, что изменение судьбы большинства или всех элементов зародыша при Дришевских регуляциях прямо указывает на отсутствие

предустановленных жестких причинно-следственных связей между индивидуальными элементами, определяющими их дальнейшую судьбу.

Сам Дриш сформулировал свой закон в следующих словах: "Проспективное значение каждого элемента системы есть функция его положения в целом" (Дриш, 1915). Закон Дриша — неопровержимое эмпирическое обобщение, которое

непосредственно вытекает из фактического материала, и которое несомненно должно лежать в основе любой теории морфогенеза. Значительно труднее понять, какие внутренние механизмы лежат в его основе. Сам Дриш считал, что открытые им закономерности являются неотъемлемыми свойствами именно живого. Он полагал, что в основе его закона не могут лежать какие-либо действующие в природе физико-химические законы. Поэтому Дриш отказался от попыток естественнонаучной интерпретации полученных им результатов.

В дальнейшем идеи Дриша развивались по нескольким относительно независимым направлениям. Наиболее популярной среди современных биологов попыток объяснения целостности развития является выдвинутая английским биологом Л. Вольпертом концепция позиционной информации. Вольперт (\¥Ъ1рег1, 1972) обращает внимание на такие аспекты морфогенеза, как паттерн (буквально: "узор" или же "разметка") и форма. Формирование паттерна, по Вольперту, предшествует построению формы, как бы размечая будущие морфогенетические процессы путем воздействий на клеточные движения и перестройки. Возникающие силы считают при этом зависимыми от перестроек

клеток. Поэтому проблему формы Вольперт сводит к образованию и регуляции паттернов.

Образование паттернов Вольперт связывает с градиентами концентраций морфогенетически активных веществ, которые и являются носителями "позиционной информации" (\Уо1рег1, 1969). По его представлениям, разметка зародышей связана с их разбиением на несколько зон, границы которых соответствуют определенным порогам концентрации морфогенов.

Концепция Вольперта неизбежно связана с постулированием

и И <-»

наличия определенных, выделенных частей зародыша, являющихся источниками позиционной информации для всех остальных частей. При этом очевидно, что любое изменение взаимного расположения точек отсчета нарушило бы не только масштабную инвариантность, но и вообще какое бы то ни было геометрическое сходство данного зародыша с нормальным. Между тем, эмпирические данные показывают, что в подавляющем большинстве регуляционных систем допустимы самые значительные взаимные смещения любых наперед заданных точек отсчета. Другими недостатками концепции Волънерта являются фактическое игнорирование взаимодействий между частями зародыша (согласно Вольперту, они воспринимают позиционную информацию независимо друг от друга) и, главное, отодвигание всей проблемы специфики морфогенеза на фазу "интерпретации" позиционной информации, о которой автор ничего не говорит. Иными словами, данная концепция не решает проблему морфогенеза.

Другой подход к морфогенезу, также исходящий из законов Дриша, связан с концепцией морфогенетических полей (Гурвич, 1944, 1991; Гудвин 1979).

Согласно этой концепции, положение в целом следует отсчитывать от некоторых элементов симметрии или топологии системы, независимо от того, какие материальные части зародыша их образуют. Такой способ отсчета подразумевает, что регуляция требует сохранения хотя бы основных элементов симметрии и/или топологии при нарушении целостности.

Можно сказать, что регуляционные системы должны обладать специфической "топогеометрией целого" (Белоусов, 1982).

Идеи этого рода были впервые высказаны и доведены до конкретных моделей морфогенеза А.Г. Гурвичем (цит. по Гурвич, 1991). По Гурвичу, поле имеет значение "нормирующей инварианты стерических параметров протекающих в живых системах молекулярных процессов". Структура реально действующего в данный момент времени актуального поля в данной точке есть функция от нескольких переменных:

1) Числа не слишком отдаленных от данной точки клеток, поля которых могут оказать воздействие на данный элемент зародыша.

2) Их расположения.

3) Интенсивности их полей.

На современном этапе развития науки большую роль для понимания морфогенеза и целостности развития сыграли идеи теории самоорганизации или, по терминологии одного из

основателей этого научного направления, термодинамики неравновесных систем (Николис, Пригожин, 1990). Это же научное направление называется синэргетикой (Хакен, 1980; Хакен, 1991).

Теория самоорганизации показывает, что в термодинамически неравновесных условиях могут образовываться устойчивые макроскопические структуры, и что на основе нелинейных взаимодействий с обратной связью может идти их усложнение (понижение порядка симметрии). При достаточной удаленности от равновесия нелинейные взаимодействия порождают множество устойчивых состояний. Выбор одного из них может осуществляется в зонах неустойчивости (в так называемых точках или областях бифуркации) либо стохастически, либо в зависимости от заданных величин динамических переменных. С другой стороны, само наличие бифуркации (возможность выбора) определяется значением параметров системы.

Рассмотрение живого организма как устойчивой и неравновесной системы позволяет приблизиться к пониманию таких, не решаемых с точки зрения классического детерминизма особенностей развития, как его эмбриональные регуляции, единство вариабельности и эквифинальности, автоколебания и автоволны и ряд других явлений, включая спонтанную дисимметризацию (то есть несоответствие симметрии эффекта и симметрии воздействия).

На основе теории самоорганизации предложен ряд моделей морфогенеза, опирающихся как на химические, так и на физические процессы.

Из "химических" наиболее популярны т.н. реакционно-диффузионные модели, в первую очередь, семейство моделей, ведущих свое начало от системы уравнений Майнхарда-Гирера (МетБагсН;, 01егег, 1980; МетИагсй, 1982). Базовая модель этих авторов исходит из того, что все клетки развивающегося организма потенциально способны продуцировать два вещества: активатор и ингибитор, которые диффундируют в другие клетки. Принимается, что коэффициент диффузии ингибитора больше коэффициента диффузии активатора. Продукция активатора —

о и

автокаталитическии процесс второго порядка. С другой стороны, продуцирование активатора замедляется ингибитором. Продукция ингибитора зависит квадратично от концентрации активатора. Вводятся члены, выражающие постоянную продукцию активатора и отток ингибитора и активатора.

Такая система взаимодействий позволяет получить целые семейства пиков концентрации активатора, окруженных более пологими подъемами концентраций ингибитора. Если принять, что определенная концентрация активатора стимулирует образование определенных морфологических структур, то через эту модель можно интерпретировать морфогенезы и дифференцировки.

Одной из разновидностей базовой модели является модель латеральной активации взаимно исключающих состояний. Идея состоит в том, что некое локальное состояние подавляет альтернативное состояние в непосредственной близости от себя. На этом принципе строится объяснение морфогенеза сегментарных структур.

В определенных пределах модель Майнхарда-Гирера интерпретирует и объясняет явление масштабной инвариантности. Объяснение состоит в том, что в зачатках уменьшенных размеров ингибитор имеет меньшее пространство для диффузии, и его концентрация повсеместно повышается, что приводит к сужению пика концентрации активатора, т.е. к уменьшению детерминируемой им структуры.

Существуют и другие химические модели, претендующие на объяснение морфогенетических процессов. Общая их особенность наличие двух или более химических реакций высокого порядка, связанных друг с другом обратными связями. Можно сказать, что идеологической предтечей таких моделей являются модель А.Тьюринга и работы Брюссельской школы (Николис, Пригожин, 1979).

Ви и

целом, основной недостаток химических моделей состоит в том, что они чересчур упрощают процессы морфогенеза, сводя их к однозначной разметке и фактически игнорируя морфогенетические движения и механические аспекты преобразований формы. Кроме того, трудно представить себе реальный многоклеточный организм как единый химический реактор, в котором может свободно идти диффузия. Однако, идеи близкодействующей активации — дальнодействующей ингибиции, лежащие в основе этих моделей, оказали сильнейшее влияние на дальнейшее развитие теоретической биологии. В частности, эти идей были использованы при построении механических моделей морфогенеза.

Впервые мысль об участии механических напряжений в морфогенезе высказывалась Гисом (His, 1874, цит по Белоусов, 1989), применительно к морфогенезу эпителиальных пластов. В дальнейшем, существенный вклад в развитие этих идей внес Д'Арси Томпсон (Thompson, 1942), а применительно к растительным объектам — Коломыцев (Коломыцев, 1969; Коломыцев, 1974), Мартынов (Мартынов, 1982) и Грин (Green, 1997; Green, 1996а; Green, 19966). Эти авторы показали, что механические напряжения, в зависимости от начальной геометрии зачатков, могут создавать весьма сложные и упорядоченные формы отдельных зачатков, мутовок и соцветий, близко соответствующие реальным. В основе всех этих моделей лежит идея морфогенетической роли активного давления пролиферирующих клеток при наличии внешних противодействий свободному расширению зачатков.

В конце 70-х — начале 80-х годов было предложено несколько принципиально новых моделей морфогенезов, опирающихся на физические свойства клеток и тканей (Oster, Murray, Harris, 1983; Harris et al., 1984; Odell et al., 1981; Белинцев, 1991; Белинцев, Белоусов, Зарайский, 1985). Эти модели опираются на выявленные экспериментально механические напряжения в тканях зародышей животных.

Одной из таких моделей является модель мезенхимных морфогенезов (Oster, Murray, Harris, 1983; Harris, Stopak, Wild 1984). В основу модели легли экспериментальные данные по поведению групп фибробластов на эластичном субстрате (Harris, Stopak, Wild, 1981; Harris, Stopak, Wild 1984). Было показано,

что отдельные фибробласты, высеянные на эластичный субстрат, способны вызывать перенатяжения субстрата. Эмбриональные фибробласты выращивали на подложке из коллагенового геля. Посеянные на эластичный гель фибробласты образуют правильную решетку у часто гексагональную, узлы которой образованы клеточными скоплениями, а ребра — клеточными потоками, ориентированными в направлении натяжений субстрата. На неэластичном субстрате такая культу