Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование осевых органов у зародышей амфибии: роль и механизмы поляризации клеток

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Образование осевых органов у зародышей амфибии: роль и механизмы поляризации клеток"

ИОСКОВСКИИ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени И.В.ЛОЙОНОСОВА

Биологический факцльтет

На пра&ах рукописи НДК:591.413:.597.812

НОВОСЕЛОВ Владимир Валериевич

ОБРАЗОВАНИЕ ОСЕВЫХ ОРГАНОВ и ЗАРОДНВЕЙ АИФНБИИ: роль и иеханизиы поляризации клеток

03.00.11 - эмбриология и гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -

1992

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского государственного университета имени

М Е Ломоносова.

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор Белоусов Л. К

Официальные, оппоненты: доктор биологических . наук Михайлов А. Т. кандидат биологических наук Черданцев В. Г.

Ведущая организация - НИИ морфологии человека РАМН.

"/7" Ггб/Гл^-Р 1992 г. в Ц.^С

Защита диссертации состоится часов на заседании специализированного совета Д. 053.05.68 при Московском государственном университете им. ЕЕ Ломоносова по адресу: 119899 Шсква, ГСП-З, В-234, Воробьевы горы, ИГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им.

М. Е Ломоносова.

Автореферат разослан "Ш 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Калистратова Е. Е

Актуальность проблеш. Образование осевых органов (нервной системы, хорды, сомитов) является ключевым и интереснейшим этапом развития, именно на этой стадии возникает единый план строения зародышей позвоночных животных. Типичная организация и взаимосвяэанность осе -вого комплекса органов обеспечивается цепью индукционных и морфоге--нетических взаимодействий между отдельными зачатками. Важным фактором является наличие характерного рисунка клеточных натяжений, изменение которого драматически сказывается на формообразовании и дифференцировке осевых органов.

В процессе развития полей клеточных натяжений клетки претерпо -вают специфические деформации: форма клеток в значительной степени отражает существующие на данной стадии развития клеточные натяжения. Более того, к настоящему времени накоплено немало данных о тесной связи и взаимозависимости изменений формы клеток с синтети ческой активностью, экспрессией определенных генов (ЕсЫтап, Васильев, 1989). Активные -изменения формы клеток создают новые натяжения, таким образом связывая клеточный и тканевой уровни организации. Одним из механизмов, которые могут вызывать клеточные натяжения в эпителиальных пластах, является контактная поляризация клеток. В теоретической модели эпителиальных морфогенезов Велмнцена и соавторов (1985), описывающей контактную поляризацию клеток, ьы деляются следующее характерные черты этого процесса.

1. Клетки стабильны в нескольких дискретных состояниях: сильно поляризованном- и примерно изодиаметричком.

2. Поляризация способна распространяться контактно, от клеши к клетке. . .

3. Поляризация связана с активным сжатием апикальной поиерх-ности клетки, что'вызывает упругое растяжение эпителиального плас та. Постепенно нарастающее натяжение ограничивает распространит!-.1 волны клеточной поляризации.

Пели и задачи работы: Основная цель настояпрй работы заключалась ь изучении клеточных основ образования и развития комплекса ооеьих органов у зародышей амфибий.

Для достижения этой цели были поставлены следующие аадачи.

1. Описать динамику поляризации дорсальной эктодермы п еи>:ап

- 2 -

преобразованием в нервную пластинку и трубку.

г. Исследовать влияние релаксации механических натяжений на поляризацию эктодермы и дальнейший морфогенез зародышей амфибий.

3. Провести сравнительный анализ образования и развития зачатка хорды у зародышей хвостатых (Р1. »а1Ш1) и бесхвостых (X 1аву^з) амфибий.

4. Исследовать ультраструктурные механизмы поляризации клеток в ответ на релаксацию натяжений, определить роль цитоскелетных элементов в атом процессе.

Научная новизна: В результате исследования- показано, что формирование нервной пластинки сопряжено с закономерными пространственно-временными изменениями поляризации клеток эктодермы. Установлено, что развитие области поляризации находится под контролем механических натяжений эктодермального' пласта. Релаксация тангенциальных механических натяжений приводит к повсеместной поляризации клеток эктодермы и к нарушению специфического паттерна поляризации нейроэктодермы.

Выдвинуто предположение о тесной взаимосвязи процесса поляризации клеток с действием активирующего сигнала при нейральной индукции. Кранио-каудальное растяжение средней части нервной пластинки представляется морфологическим аналогом трансформирующего сигнала по Ньюкупу.

Изучен механизм релаксационной поляризации клеток эктодермы. Поляризация клеток связана с ориентацией шкротрубочек и цистерн эндоплазматического ретикулутиа вдоль латеральной поверхности. Апикальная поверхность поляризованных клеток собирается в многочисленные микроворсинки, подостланные слоем микрофиламент.

Установлено, что обособление хорды от окружающих тканей происходит в двух направлениях одновременно.^ У зародышей Р1. ч/аШИ образование -зачатка хорды сопряжено с поляризацией клеток крыши ар-хентерона в сагиттальной плоскости и в переднем, и в заднем направлении, у зародышей X. 1аеу1з переднетуловищный и заднетуло-шщшМ способы обособления хорды различны: для заднетуловищного

юсоба характерна тесная связь аачатка хорды с медианной нейроэк эдермой.

Научно-практическая значимость: Благодаря примененной методике ее-ийных полутонких срезов с поворотом плоскости резки данная работа первые предоставляет детальное морфометрическое описание структура севых органов на последовательных стадиях развития зародышей амфи-ий. Работа содержит данные о клеточных и ультраструктурных меха-измах образования осевых органов. Все это составило и может соста-ить в последующих работах основу для экспериментального сследования этого процесса. Поляризация клеток эктодермы после ре-аксации натяжений имеет много общего'с различными морфогенетичес• ими процессами в развитии и является удобной и адекватной моделью ля исследования закономерностей морфогенеза эпителиальных пластов, лияния механических и химических факторов на этот процесс. Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на ра-очем совепщии "Теоретические и математические проблемы морфогене-а"(Пущино, 1991), на семинарах кафедры эмбриологии Биологического акультета МГУ.

Публикации, ilo теме диссертации опубликовано 4 статьи. Структура работы. Работа построена по общепринятому плану. Лис -ертация состоит из введения, обзора литературы, методов исследова-ия, результатов, обсуждения • и выводов. Работа изложена на ... границах машинописного текста,- содержит 73 рисунка и 4 таблицы, писок литературы включает ... наименований. '

ЦАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

В работе .были ' использованы зародыши шпорцевой лягушки Хепориз aevis Daudln на стадиях 10 1/4 (ранняя гаструла) . - 18 (поздняя ейрула) (по Niewkóop, Faber, 1956) и зародыши испанского тритона leurodelös waltln Mi chah, на стадиях 9 1/2 (ранняя гаструла) - 10 поздняя нейрула) (по Gallien, Durochier, 1957).

Яйцевые оболочки удаляли с помощью заточенных преиаропалмая гл в растворах Слэка-Формана (Slack, Forman, 1980) или модифициро--анном растворе Рингера (Gerhart, Kirschner,1985).

Релаксацию тангенциальных натяжений осуществляли путем продольного разреза вентральной области зародыша X. laevis на стадии ранней гаструлы (ст. 10 1/4 - 10 1/2).

Для полутонкой резки и просвечивающей электронной микроскопии зародышей фиксировали в течение 12-14 ч 2,5%-ным глютаровым альдегидом на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2) и в течение 2ч 12-ной четырехокисью осмия на 0,1 М буфере (рН 6,3) при температуре 4°С. Затем образцы обезволивали в возрастающих концентрациях этанола и ацетоне и заключали в эпоновую смолу. Зародышей резали поперечно, полутонкие (2 мкм) срезы окрашивали 1£-ным толуидиновым синим. Ультратонкие срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца по Рей-нольдсу и изучали в электронных микроскопах Hitachi и Jeol (Япония) при увеличении *5.000-40. ООО.

Образцы для сканирующей электронной микроскопии либо доводили до ацетона и высушивали методом обхода критической точки с замещением углекислотой, либо сразу из 70° спирта использовали Метод замораживания-высушивания. При необходимости делали сколы объектов да высушивания в 70° спирте. Далее объекты фиксировали на специальных столиках лаком и ориентировали должным образом. Просматривали образцы в сканирующем электронном микроскопе Hitachi S-405A при увеличении *30- 10. ООО.

С целью изучения роли элементов цитоскелета в процессе поляризации клеток проводили эксперименты с цитостатиками колхицином и цитохалазином Б. Зародышей сразу после релаксации натяжений и спус-, тя 3 часа инкубировали 10',30' и 1 час в растворах цитостатиков с рабочей концентрацией 50 мет/мл(колхицин) и 5 мкг/мл(цитохалазин Б).

Для маркирования предполагаемого жидкофазного эндоцитоза в инкубационную среду добавляли флюоресцентна красители- люциферовый желтый (2,5 и Б мг/мл) и флюоресцеинизотиоцианат(ПТг)-декстран (5 мг/мл). Для зародышей сразу же после релаксации натяжений и спустя 1 и 3 часа время инкубации в красителях составляло от 5 минут до 1 часа. После отмывки объекты фиксировали 4Z формальдегидом на 0,1 Ы фосфатном буфере. Как маркер эндоцитоза использовали также и перок-

- Б -

¡идазу хрена в рабочей концентрации 5 мг/шг. Поело отмывки и фиксб-цт глютаральдегидом проявляли пероксидазу с диаминобензидиком и терекисью водорода.

Для измерения клеточных параметров осевых органов использовали • серийные поперечные срезы. Важным дополнительным условием являлось строгое соблюдение перпендикулярности плоскости среза к поверхности зародыша. С этой целью полутонкую резку начинали от дорсальной губи бластопора. В дальнейшем плоскость резки постепенно поворачивая» с целью сохранения перпендикулярности к дорсальной поверхности зародыша. Серии по 10 полутонких срезов получали с интервалами в 50 и 100 мкм. Расстояние от дорсальной губы бластопора определяли по лимбу ультрамикротома "Тез1'а". С одного объекта получали по 100300 полутонких срезов в зависимости от стадии развития.

Для оценки изменений • формы клеток эктодермы измеряли индекс поляризации Р, т.. е. отношение высоты клетки к ее ширине. Для измерений использовали срединные, ядросодержащие срезы клеток.

Результаты измерений представлены в виде графиков индекса поляризаций в сагиттальной и поперечной плоскостях. При этом отдельно, составляли графики для сагиттальной и парасагиттальньгх плоскостей зародыша, отстояшдх от сагиттальной на 210 мкм ( стадии 11-17) и на . 85 мкм (стадии 14-17). По оси абсцисс откладывали расстояние от дорсальной губы бластопора в микронах. На графиках в поперечной плоскости по оси абсцисс откладывали либо расстояние от сагиттальной плоскости-в микронах, либо угол,с сагиттальной плоскостью в" градусах.

Для ыорфрметрии осевых органов делали прорисовки зачатков на последовательных поперечных срезах с помощью рисовалыю-проекционного аппарата РА-6У4. 2 под общим увеличением *200-Б00.

результаты и ошгадашв

Морфсгенеттесюю движения энтодермы в период гаструляции и

нейруляцин, их соотношение с этапами ней роль ной индукции.

1. Процесс поляризации клеток и дальнейшие преобразования поляризованного домена дорсальной эктодермы в период гаструляции и нейру

\

Рис. 1. Изменение области поляризованных клеток внутреннего слоя эктодермы на последовательных стациях развития.

ляции имеют регулярный характер и являются неотъемлемой частью эти: этапов развития. С началом гаструляции во внутреннем слое эктодерм! шпорцевой лягушки выделяется область повышенной поляризации клеи» (индекс поляризации > 2) (Рис.,.1). Расположение зоны поляризованньо Iслеток совпадает - с презумптивной территорией нервной пластинки нг стадии ранней гаструлы (Keller, 1975; 1976). Дальнейшие деформацш области поляризованных клеток с образованием нервной пластинки i нервной трубки убеждают нас в том, что зона поляризованных клето» представляет собой зону презумптивной нейроэктодермы. В течение гаструляции поляризованный домен не имеет резкой границы с покровной эктодермой, индекс поляризации плавно уменьшается в вентро-латеральной области зародыша. С началом нейруляции граница становитс? более явственной, эктодермальный пласт подразделяется на аону поляризованных клеток и тангенциально растянутую покровную э>сгодерму. На средней нейруле поляризованная зона ясно выделена морфологичесю

и представляет собой нервную пластинку в традиционном понимании.

Важно отметить, что нарастающее во времени разделение эктодер-мального пласта на домены поляризованных и тангенциально растянутых клеток является одной-из характерных черт механизма контактной поляризации, предлагаемого моделью эпителиальных морфогенезов Бедин-цева и соавторов.

Процесс поляризации и сокращения апикальных поверхностей клеток нейроэктодермы имеет решающее значение и для дальнейшего морфогенеза нервной пластинки. Региональная специфика поляризации клеток определяет характер скручивания нервной пластинки по кршшалышму или спинномозговому образцу (Nagele et al., 1987; Schoenwolf, Smith, 1990). Наряду с деформацией клеток нейроэктодермы происходит интенсивное растяжение нервной пластинки в кранио-каудальном направлении. В соответствии с этим Джекобсон и Гордон (Jacobson, Gordon, 1976) выделяют в нейруляции тритона Tari cha torosa два основных морфогенетических процесса:

1) дифференциальное сокращение апикальных поверхностей клеток нейроэктодермы, что соответствует различной степени ■ поляризации, клеток (см.также Keller, 1980);

2) кранио-каудальное растяжение нервной пластинки вдоль сагиттальной плоскости зародыш вместе с зачатком хорды.

В опытах с эксплантатами поляризация клеток является неотъемлемым атрибутом нейральных ( ,и,- вообще, осевых) дифференцировок. Из эксплантатов с-упрабластопоральной области шпорцевой лягушки развиваются осевые производные, и именно эти эксплантаты характеризуются высокой и устойчивой поляризацией клеток (Белоусов, ■ Петров, 1983; Георгиев, Белоусов, 1987). Эксплантаты же латеральной эктодермы значительно реже дшот осевые- производные, но и поляризация клеток в этих эксплантатах не выражена. Аналогичные закономерности наблюдали при индукционном воздействии на эктодерму цыпленка (Lee, Nage lo, 1988). После действия индуктора клетки эктодермы образоиыв;ьчи оформленные высокополяризованные кластеры, которые давали в дальнейшем развитии нейральные производные.

- в -

Tciким образом, поляризация клеток имеет не только важное мор-ifoгенетическое значение, но и сказьшается на развитии клеток по нейральному пути дифференцировки. Еознике т закономерное желание сопоставить морфогенетические преобразования гаструляции с современным воззрениями на механизмы нейральной индукции. Точка зрения школы Ньюкупа на природу нейральной индукции заключается в том, что процесс индукция состоит из 2-х разнесенных' во времени и пространстве стадий: стадии активации и последующей стадии трансформации (Nieuwkoop, Weyer, 1978; Durston et al., 1990).

'I. Активирующий сигнал пробуждает нейральные потенции в клетках презумлтивной нейрозктодермы, что превращает эктодерму в пре-аумптивный передний мозг. Действие активирующего сигнала связывают с губой бластопора ранней гаструлы.

II. Трансформирующий сигнал генерируется дорсальной губой бластопора поздней гаструлы, и вторично превращает часть нейрозктодермы в более задние нервные структуры (задний и спинной мозг).

Полученные нами данные позволяют определить процесс поляриза- • ции клеток эктодермы как выражение нейральной компетенции и морфологический аналог активирующего сигнала по Ньюкупу. 2. Особое место в отношении поляризации клеток эктодермы занимает сагиттальная плоскость зародыша. Уже на ранней гаструле в околоб-ластопоралыюй области заметна локальная деполяризация клеток внутреннего слоя эктодермы. На последующих стадиях развития обращает на себя внимание быстрое отодвигание зоны поляризованных клеток от бластопора. На стадиях с 12 по 17 это движение происходит со средней скоростью 3,5 мкм в минуту. Причем величина отодвигания зоны поляризованных клеток от бластопора существенно превосходит значение, ожидаемое на основе картирования движений на дорсальной стороне зародыша в этот период развития. Это показывает, что деполяризация клеток вдоль сагиттальной плоскости зародыша не может быть результатом одних лишь перемещений клеток, а должна включать и не-пзсредстпеиную деформацию (уменьшение индекса поляризации) клеток olivс сагиттальной плоскости.

Расположение и характер морфогенетических движений зоны медианной деполяризации совпадают с регионом notoplate (Jacobson, Gordon, 1976), который играет исключительную роль в кранио-каудаль-ном удлинении и- медио-латеральной конвергенции материала нейроэкто-дермы в туловищной области зародыша. Регион notoplate характеризуется . способностью к автономному удлинению. Индукция notoplate происходит до начала подворачивания мезодермы, т.че. индуцирующий сигнал проходит вдоль зктодермального пласта, как и в случае предшествующей индукции мезодермы эндодермой (Keller et al., 1992).

Удлинение зоны медианной деполяризации клеток (notoplate) происходит уже в существующем домене поляризованных клетдк и порождает

*

изменения Л поляризованного домена с образованием морфологических признаков туловипцгого отдела нервной системы (кранио-каудальное растяжение и медио-латеральная конвергенция материала). Таким образом, по отношению к поляризации меток нервной пластинки распространение зоны notoplate носит вторичный характер и может быть названо трансформирующим.

Следовательно, морфологическим аналогом трансформирующего сигнала по Ныокупу представляется кранио-каудальное удлинение и медио-яатерадьная конвергенция клеток средней части нервной пластинки (notoplate). Направление удлинения региона notoplate из околоблае-топорального кольца совпадает с предполагаемым направлением распространения трансформирующего сигнала от бластопора.

Несколько- упрощенно схему индукционных воздействий и морфогенетических движений при нейральной индукции,могао представить в виде таблицы .(см. следующую страницу).

3. Заслуживает внимания тот факт, что со стадии 12 по стадию 17 плошадь поляризованной зоны во внутреннем слое эктодермы (с учетом повышения индекса поляризации на более поздних стадиях, сопровождающегося уменьшением апикальной, поверхности клеток) сокращается примерно в два раза Некоторая часть уменьшения площади объясняется более плотной упаковкой клеток нейроэктодермы на поздних стадиях, но столь значительный спад нельзя свести толы«) к этому: nenoTojo>

стада

эдерма

нейроэктодерма

.ранняя гаструла

" медио-латеральная конвергенция

поляризация > клеток

поздняя гасттэула

^ поляризация

клеток -> кранио-каудальное, растяжение

ранняя нейрула

клиновидные кл.

кранио-каудальное,. растяжение

^.кранио-каудальные», различия

планарная индукция (вдоль пласта) предполагаемая Планерная индукция ^ вертикальная индукция (поперек пласта)

* - .Образование заднего и спинного мозга. ** • '- Возникающие найральные производные имеют более краниальный характер.

количество поляризованных клеток теряется в процессе конвергентной сегрегации на дорсальной стороне зародыша, т.е. они деполяризуются. Сходные явления обнаружены при дрейфе границы экспрессии эпидер-мального маркера ХК-8, негативно отмечающего область нейрозктодер-мы, •что■расценивается Как еще одно проявление самоорганизационногс характера определения границ нервной системы (Зарайский,. 1991)." I терминах клеточной поляризации факт уменьшения размеров домена при одновременном росте средних значений индекса поляризации объясню, увеличением порогового значения Р крит, т.е. того значения индексг поляризации, которое определяет будет ли клеил поляризоваться ил» нет в дальнейшем развитии.. Увеличение пороговых значений- Ркрит об-

наружено и при развитии клеточной поляризации в эксплантатах, дающих осевые производные (Петров, Белоусов, 1984). Особое'значение для определения самоорганиэационного характера развития нервной пластинки имеет явление масштабной регуляции размеров нервной пластинки, когда при вырезании части эктодермалыюго пласта соответственно уменьшается и область нейроэктодермы (Зарайский, 1931).

Представление об определении окончательных размеров нервной пластинки по типу гомейотической индукции, т. е. индукции эктодермы эктодермой (Grunz, 1990)выглядит в терминах клеточной поляризации ' как контактные взаимодействия между поляр!, овакным доменом и непо-ляризованной окружающей эктодермой.

4. В наружном слое нейроэктодермы значительные изменения происходят на стадиях 14-17. Здесь наблюдается волна поляризации клеток вдоль сагиттальной плоскости зародыша, продвигающаяся от бластопора со скоростью 9,2 мкм в минуту и'дающая начало нервному желобку. По ходу .волны в краниальном направлении зона поляризованных клеток расширяется. Вероятно, это связано с меньшим натяжением пласта эктодермы в более краниальных районах, а натяжение по одному из постулатов модели контактной поляризации клеток ограничивает абсолютные размеры поляризованной зоны. При переходе от стадии 16 к 17 в каудальной области заметно падение индекса поляризации поверхност- / ного слоя эктодермы, но в это же самое время происходит быстрый подъем нервных валиков. Очевидно, что именно активная деформация клеток приводит к формированию нервных валиков, на это указывают и • опыты с разрушением цитоскелета, когда в отсутствии деформаций клеток -не происходило и образование нервных валиков (Löfberg, 1974).

Влияние релаксант механических натяяений на поляриаацию эктодерм.

С целью исследования влияния внешних натяжений на поляризацию клеток и развитие характерной организации нервной системы производили релаксацию натяжений в эктодермальном пласте на стадии ранней гаструлы. Это осуществлялось путем продольного разреза вентральной части зародыша

Поверхностный слой эктодермы первым откликается на изменение механических натяжений в пласту и оказывается равномерно поляризованным к 1 часу после операции. У интактных зародышей соответствующей стадии развития клетки поверхностного слоя примерно изодиамет-ричны. Через 4 часа после релаксации натяжений поляризуется и внутренний слой эктодермы. Клетки внутреннего слоя имеют высокий индекс поляризации (2,4-2,6) по всей длине поперечных срезов. У интактных зародышей эктодермальный слой уже разделен на домен поляризованных ( презумптивная нейроэктодерма) и тангенциально растянутых ( покровный эпителий) клеток. При дальнейшей инкубации экспериментальных зародышей происходит разделение равномерно поляризованной эктодермы по индексу поляризации клеток, наиболее вероятно вдоль сагиттальной плоскости вычленяется домен поляризованных клеток, но он значительно шире, чем в нормальном развитии и менее четко организован. Выделение одного направления для развития поляризованного домена, очевидно, связано с автономным кранио-каудальным растяжением региона notoplate (Keller et al., 1989). Но регион notoplate также испытывает влияние релаксации натяжений. В нормальном развитии notoplate характеризуется тесной связью с подлежащей хордой. В условиях же релаксации натяжений еще и сомитная мезодерма оказывается связанной с.парасагиттальной эктодермой, что может служить указанием на расширение области notoplate в условиях релаксации натяжений. Судьба дополнительно поляризованного в результате релаксации натяжений материала эктодермы достаточно отчетливо прослеживается на последовательных стадиях развития. Спустя 14 часов . после операции дополнительный материал расположен по бокам формирующихся нервных валиков и в дальнейшем образует боковые придатки ("уши") нервной трубки.

Одним из крайних случаев является вариант с возникновением двух осей для формирования нервной системы: в этом случае в однородно • поляризованной эктодерме выделяются два направления кранио-каудаль-■ кого растяжения и медио-латеральной конвергенции материала, возникает две нервные трубки. Принципиальная возможность удлинения и

конвергенции по нескольким направлениям показана для региона notoplate в опытах по продольному рассечению сунрабласто'поральной области (Keller et al. , 1992).

Сброс натяжений приводит к искажению поля натяжений, характерного для гаструляции и нейруляции, что проявляется в ненормальном развитии паттерна поляризации: расширении, искривлении, пногда_д;-воении доменов поляризованных клеток эктодермы. Эти явjiciiия_в_дал

нейшем развитии приводят к множественным аномалиям_в .строении

нервной системы: от появления дополнительных придатков у_нервной

трубки до ее удвоения.

Ультраструктурные изменения клеток эктодермы при поляризации. Первым следствием релаксации натяжений является выпячивание апикальных поверхностей клеток поверхностного слоя эктодермы в т-посредственной близости от края разреза. Это явление может бить зафиксировано у опытных зародышей уже спустя менее 1 минуты после операций. Через 10 мин инкубации волна выпячиваний апикальной поверхности распространяется в вентро-дорсальном направлении. Минимального значения поверхностные углы в дорсальной области достигают через 1 час после сброса натяжений. Причину этого явления мы ьилим в рассогласовании удлинения клетки после релаксации натяжений с сокращением апикальной поверхности, последнее несколько запаздывает, что и проявляется в первоначальном выпячивании апикальной поверхности, уменьшении поверхностных углов клеток. В нормальном развитии ^ти процессы взаимосвязаны и точно согласована

Через 4 часа после релаксации натяжений апикальная поверхность ' собирается в многочисленные микроворсинга! и складки, -.подостланные слоем микрофиламент. Относительно дальнейшей судьбы апикальной мембраны не существует однозначного ответа. Несмотря на присутствие многочисленных пузырьков под апикальной поверхностью мы не показали эндоцитоза и интернализации метки ни с помощью люциферового желтого, ни с помощью FITZ-декстрана,. ни с помощью пероксидазы хрена С другой стороны, от поверхности микроворсинок часто отщепляются мембранные пузырьки, происходит едгелуиквание (shedding) апикальной мембраны. Но определить насколько этот процесс важен для сокращения

апикальной мембраны клетки в настоящее время не представляется воз--модзшм.

На латеральной поверхности реакцией на релаксацию натяжений является вставка мембраны, что в конечном итоге способствует , вытягиванию клетки, т.е. ее поляризации. В нормальном развитии процесс экзоцитоза в латеральную поверхность клетки, очевидно, локализован в околоконтактной зоне, поэтому релаксация натяжений, провоцирующая вставку мембраны, приводит к' появлению в контактной зоне явных излишков мембраны, выростов и интердигитаций латеральных поверхностей соседних клеток. Спустя 1 час после операции латеральная поверхность клеток си.ько возрастает. Значительный резерв мембраны содержится в цистернах зндоплазматического ретикулума (ЭПЬ, лежащих вдоль всей латеральной поверхности поляризованной клетки.

Важную роль в поляризации клеток играют микротрубочки. При разрушении микротрубочек колхицином не наблюдается релаксационной поляризации клеток эктодермы, тогда как при добавлении цитохалазина клетки поверхностного слоя оказываются сильно поляризованы. Помимо влияния на общую цитоморфологшо колхицин нарушает и правильное расположение цистерн ЭПР под латеральной поверхностью. Это говорит о значении микротрубочек в обеспечении направленного везикулярного транспорта к латеральной поверхности при поляризации клетки.

Сходные ультраструктурные преобразования-отмечены при образовании колбовидных клеток бластопора (ВитпвКЗе, 1973; Monroy.et. aL , 1976) и клеток нервного желобка в нервной пластинке (КагпГипке1, 1972; ЬйЛэеге, 1974), а именно:

1. Образование субапикального слоя микрофиламентов.

2. Появление ' мембранных выростов на апикальной поверхности: микроворсинок и складок. . ,

3. Ориентация многочисленных микротрубочек перпендикулярно к пласту, вдоль длинной оси клетки.

Кроме того, у клеток нервной пластинки и поляризованных клеток после релаксации натяжений мы обнаружили сходство в расположении многочисленных вакуолей и цистерн эндоплазматическоГо ретикулума

непосредственно под латеральной поверхностью. Много общего мы находим у этих процессов и с выделением хорды из крыши архентерона у зародышей Pl. waltlu.

Образование хорда.

1. Первые признаки появления хорды можно заметить у зародышей Pleurodeles val ti i i уже на ранней гаструле (ст. 10) - это поляризация дорсальных клеток крыши архентерона: индекс поляризации клеток, лежащих вдоль сагиттальной плоскости зародыша, значительно выше, чем у более латеральных клеток.

При анализе срезов и графиков обособл.яия хорды на последовательных стадиях развития (Рис. 2А) возникает следующая картина диф-ференцировки хорды у зародышей Pl. yaltlii. Медианное скопление по-, ляризованных • клеток хордомезодермы переходит в веерообразнто структуру хорды путем сокращения клеточных поверхностей, обращенных в полость архентерона. Следует выделить тот факт,что клетки зачатка ход^ы. более тесно упакованы по сравнению с окружающей мезодермой и собственно только они и сохраняют эпителиальную структуру крыши ар-

хентерона. Остальная* -мёэодерма выходит из состава пласта в ходе

■

подворачивания, а также в дальнейшем выселяется по бокам от хорды. Прогрессирующее сокращение вершин клеток хорды, обращенных в гастроцель,приводит к выделению хорды из пласта и потере веерообразного расположения клеток. ХОрда полностью отделена.от окружающих тканей. , .

С-9дует отметить особо , что найболее дифференцированный участок хорды находится в средней части зачатка, будучи окружен и спереди, и сзади менее дифференцированными участками. На основании этого логично было бы предположить,что процесс обособления хорды продвигается одновременно и в переднем, и в заднем направлении. Если провести границу по середине наиболее дифференцированного участка хорды! то получаем, что в переднем направлении обособляется 47 % общей длины хорды,а в заднем - 53 Z. Скорость волны поляризации клеток Крыши, архентерона, как первой стадии обособления хорды, составляет 0,96 мкм/мин или 87 мкм/tg. ,

Г-'^Ч i--».. "

- 1Ь- . Развитие хорды

Р1.*/аШП (А) и ХЛаеу^ (Б)

стадии развития

О '200___ 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 <

ЧЗ-1 ЧУ4 «-' <г <Г <-

О 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 расстояние от бластопора, мкм

НШН -> J—^-г^йкг^нО^

Рис. 2. Развитие хорды. Дромежуточные этапы обособления хорды показаны в виде схем под графиками.

По мере развития хорды у зародышей PI. waltlii ее длина увели чивается от 150 мкм на ранней гас?руле до 1800 мкм на поздней ней-руле. Средняя площадь поперечного сечения хорды уменьшается на этих

.же стадиях с 23*103шш2до 9,8а Ю3мкм? но несмотря на это объем

закладки возрастает от 3,3*106мкм3до 17,6*1 ./'мкм?

2. Начальные этапы дифференцировки хорды у зародышей Xenopus laevis довольно схожи с таковыми у Pi. waltlij: на ранней гаструле (ст.,11) можно заметить скопление и поляризацию хордомезодермы в сагиттальной плоскости. В дальнейшем развитии у зародышей X. laevis отмечаем ту же закономерность, что и у Pl.waltlit: наиболее дифференцированный участок хорды находится в середине зачатка, но в отличии от PI. waitШ этапы дифференцировки хорды не одинаковы в передне- и заднетуловищных областях зародыиа (Рис. 2Б).

В передней части мы еидим знакомую картину (скопление и поляризация клеток,веерообразная структура),но необходима поправка нч расположение хордомезодермы во внутреннем слое и изначальное отсутствие контакта с полостью гастроцеля. В передней части формируется 44 Т. зачатка хорды. В задней части обособление хорды происходит иначе. Характерные черты этого способа - более раннее отделение зачатка хорды от окружающей мезодермы и позднее от гипослоя нейро-эктодермы. Указания на тесную связь хорды и эктодермы именно в кау-дальном районе X. laevis можно найти и в работе Youn et al. ,1980. К концу гаструляции медиолатеральная . конвергенция 'хордомезодермы и специфическая интеркаляция клеток хорды приводят к появлению дела-минационных границ метау зачатком хорды и сомитной мезодермой. На стадии 14 (средняя нейрула) для заднетуловищной области характерно взаимное подстраивание клеток гипоэктодермы и хорды, так что они ориентируются параллельно друг другу. Этот факт может быть связан с усилением синтеза игзнно на этой стадии молекул адгезии нервной ткани (NCAM; Balak et al. ;1987). Граница между зародышевыми листками появляется здесь позднее, хотя параллельная ориентация клеток еще сохраняется. По этому способу формируется 56% хорды.

Обкзя длина зачатка хорды у зародышей Xlaevis увеличивается

на исследуемых нами стадиях от 100 мкм (стадия 11) до 1800 мкм (стадия 16), средняя площадь поперечного сечения уменьшается с 18,5

до 7,4*103мкм2, объем же закладки'возрастает с 1,85 до 13,3*106mkíÍ

Келлер и соавт. (Keller et al. ,1989) считают, что удлинение . хорды на стадии нейрулы у зародышей X. laevis обеспечивается одновременно несколькими механизмами: вакуолизацией клеток в передней части хорды, интеркаляцией в середине и "подтоком" дополнительного материала из - района, прилегающего к бластопору. Для нас юз представляется важным отметить вклад переднетуловипдаого способа, . т. е. поляризации медианной хордомезодермы, в общее удлинение хорды. Помимо наличия промежуточных этапов образования хорды по этому способу на всех стадиях развития это доказывается и тем, что по данным цейтрайферной съемки и мечения клетки хорды заметно сдвигаются назад относительно сомитов (Keller,et al. ;1989), т.е. в передней части хорды должен существовать .мощный источник ее удлинения.

Показателем тесной связи развития хорды и нервной пластинки служит тот факт, что увеличению длины хорды соответствует продвижение в переднем направлении волны деполяризации сагиттальной гипоэк-. тодермы. Это еще раз подтверждает, что этот регион нервной пластинки соответствует notoplate англоязычных авторов (Jacobson, Gordon, • 1976;).

3. Различия в обособлений хорды у X. laevis и Pl. waltlii очевидно связаны с разным расположением закладок мезодермы: у бесхвостых амфибий зачаток хорды изначально отделен от гастроцеля клетками гипо-хорды. Вероятно, именно этим объясняется различие в способах формирования хорды в заднетуловйщной области зародышей Pl. waltli i и X. laevis: у Хепораз нет необходимости в выделении хорды путем изги- ■ бания пласта. И все таки многие черты в развитии хорды являются общими для исследуемых видов. Прежде всего, это развитие хорды в 2-х направлениях, причем соотношение переднего и заднего направлений '" примерно одинаково для обоих видов: переднее-44-47 Х,ааднее-БЗ-5б X.

Далее нельзя не заметить большое сходство в обособлении .хорды

У зародышей Pl. waltlu (Urodela) и в-переднетуловшцной области зародышей X. laevis (Anura): это поляризация сагиттальной мой одер мы и веерообразная структура. Вероятно, что для X laevis эти черти-являются выражением эволюционной преемственности.

Исходя из наших данных, скорость удлинения хорды составляет 4, 1 мкм/мин для X.laevis и 1.1Б мкм/мил для Pl.waltlii. Если же отнести эти скорости к характерному времени дробления для каждого из видов, различие в скоростях существенно уменьшается. В результате мы получаем близкие значения: 123 и 104 мкм/tQ для Xenopus laevis и

Pleurodeles waltlii, соответственно.

Вывода

1. Начиная со стадии ранней гаструлы в эктодерме зародышей шпорцевой лягушки выявляется область с высоким индексом поляризации клеток, соответствующая презумптивной территории нервной пластинки. Дальнейшее формирование нервной пластинки сопровождается кранио-ка-удэльлым растяжением и медио-латеральной конвергенцией области поляризованных клеток, более резким ее обособлением от тангенциально растянутой покровной эктодермы.

Z. В сагиттальной плоскости зародыша удлиняется зона деполяриэации-клегок внутреннего слоя нервной пластинки. Предел распространения зоны медианной деполяризации в краниальном направлении соответствует туловищному отделу нервной системы.

3. Мэрфогенетические, движения поляризованного домена хорошо согласуются с представлением о двух стадиях нейральной индукции по Нь-юкупу. Шрфологическим' выражением нейральной компетенции и аналогом активирующего сигнала является процесс поляризации дорсальной эктодермы ранней гаструлы, а трансформирующего сигнала - удлинение зоны деполяризации по средней линии нервной пластинки.

4, На стадии средней нейрулы возникает волна поляризации клеток поверхностного слоя нейроэктодермы вдоль' сагиттальной плоскости, что приводит к образованию нервного желобка. Дальнейшие деформации поляризованных клеток находят отражение в образовании нервных валиков.

5. Релаксация тангенциальных механических натяжений приводит к ьначителыюму расширению области поляризованных клеток эктодермы, что обуславливает нарушения во взаимном расположении и структуре осевых органов. "

в. Поляризация клеток после релаксации натяжений связана с ориентацией микротрубочек вдоль латеральной поверхности и организацией системы вакуолей эндоплазматического ретикулума (ЭПР) под латеральной поверхностьа Разрушение микротрубочек колхицином препятствует релаксационной поляриаации клеток, при этом отсутствуют и сублате-раль ные вакуоли ЭПР.

При сокрашэнии апика. ьной поверхности на ней возникают многочисленные микроворсинки и складки, которые подостланы слоем актиьа-ъых филамент.

Механизм релаксационной поляризации клеток эктодермы принципиально схож с таковыми при образовании колбовидных меток бластопо-ра, клиновидных клеток нервного желобка, вычленении хорды из состава архентерона у зародышей Р1. *а1Ш1.

7. У оародышей Р1. *а1Ш1 и К 1авУ1з дифференцировка зачатка хорды происходит в двух направлениях одновременно. Причем, если у Р1. угаКШ способы обособления хорды в обоих направлениях аналогичны, то у X. 1аеу1э различаются переднетуловищный и заднетуловищный способы, для последнего характерна тесная связь зачатка хорды с эктодермой, но оба пути дифференцировки хорды эквифинальны.

Список работ, опубликованных по теш диссертации:

. Новоселов Е Е, Белоусов Л а Динамика поляризации клеток дорсальной эктодермы зародышей шпорцевой лягушки в нормальном развитии и в условиях сброса натяжений// Онтогенез. 1990. Т. 21. с. 480-486.

:. Beloussov L. V., Lakirev Л.. v., Naumidi I.I. , Novosolov V. V. Effects of relaxation of mechanical tensions upon the early morphogenesis of Xonopus laevis orrt. ios// Int. Journal or Dev. Biology. 1990. V.34. P. 409-419.

t. Новоселов E E ' Сравнительный анализ образования хорды у эарог J-еэй амфибий// Онтогенез. 1992. Т. 23 С. 624-631.

L. ^Beloussov l. v., Saveliev s. О., Naumidi I. I., Hovoselov V. V. Mechanical stresses in embryonic ' tissues: ' patterns, morphogenetical role and involvement in regulatorial feedbacks/ / Int. rev lev of cytology, (in press).

Подвивало з,печать 1С.И.1992 г. Зак. 685. Формат 60x84/16. Тир. 100.

Москва. Типография PACJCI.