Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных условиях

Полянская, Галина Георгиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных условиях
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных условиях"

На правах рукописи

РГ£ од

ПОЛЯНСКАЯ 1 7 ирп 2000

Галина Георгиевна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ КАРИОТИПИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В РАЗНЫХ УСЛОВИЯХ

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук, профессор, Ю. Б. Бахтин, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, В. Т. Какпаков, Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, Москва

доктор биологических наук, И. Е. Воробцова,

Центральный

науч но-и ссл едовател ьски й

рентгено-радиологический

институт МЗ РФ,

Санкт-Петербург

Петербургский институт ядерной физики РАН

Защита состоится » мая 2000 года в часов на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан " ¿иу,¿¿¿у 2000 г.

Ученый секретарь . ___

Диссертационного совета /[ /

доктор биологических наук С- н ПИСАРЕВА

Емгжо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Кариотипическая изменчивость клеток имеет место как in vivo, так и in vitro. Кариотипическая изменчивость в большой степени обусловливает протекание эволюционных процессов в природе. Те же процессы, т.е. количественные и структурные изменения в кариотипе, могут вызывать наследственные болезни и развитие новообразований. В практических биомедицинских исследованиях индукция кариотипических изменений является тестом на мутагенность и канцерогенность окружающей среды. Очевидно, что изучение закономерностей кариотипической изменчивости является актуальной проблемой современной клеточной биологии.

Цитогенетические процессы и, в частности, кариотипическая изменчивость в нормальных клеточных популяциях in vivo находятся под постоянным контролем интегральных систем организма и обусловлены межтканевыми и межклеточными взаимодействиями. Степень кариотипической изменчивости контролируется стабилизирующим отбором [1-7]. При переходе клеток в состояние in vitro основными типами клеточного взаимодействия в популяциях становятся физический контакт между клетками и связь через метаболиты в ростовой среде. Эти взаимодействия объединяют клетки, составляющие клеточную популяцию, в единую автономную систему, поддерживаемую благодаря существованию между клетками "метаболической кооперации" [8-11]. Образование постоянных клеточных линий, т. е. приобретение клетками свойства иммортализации, связано со многими генетическими и цитогенетическими изменениями в клеточных популяциях [12-17]. Несмотря на то, что при переходе клеток в состояние in vitro изменяются многие функции, свойственные клеткам в условиях организма, потенции клеток к воссозданию первоначальных свойств остаются, а в некоторых клеточных линиях ряд свойств сохраняется Q2,10,18,19]; Malpoix, Poljanskaya, 1979). Некоторые закономерности кариотипической изменчивости клеток в культуре также сходны с таковыми в условиях организма [5,7,20-22]. Клеточная популяция in vitro как автономная система имеет и свои особенности по сравнению с организмом. Для ее выживания необходимо образование сбалансированной кариотипической структуры, которой характеризуется стадия стабилизации клеточной линии [22-25].

Большинство клеточных линий на этапе стабилизации характеризуется наличием в кариотипе перестроенных по сравнению с донором постоянных маркерных хромосом ("маркерные" линии). Меньшая часть известных постоянных клеточных линий не имеет таких хромосом в составе кариотипа ("безмаркерные" линии). Кариотипы этих линий либо соответствуют донорам, либо отличаются от них количеством гомологичных хромосом. Подобно "маркерным" линиям, они могут иметь разную степень трансформированное™ ([26-30]; Полянская, 1988;1989; Полянская, Фридлянская,1991). Существование разных кариотипических вариантов постоянных клеточных линий позволяет предположить, что хромосомные аберрации, обеспечивающие образование маркеров, являются лишь одним из инструментов, с помощью которых достигается необходимый для существования клеточной популяции генный баланс. Таким образом, при стабилизации постоянной кле-

точной линии должны существовать определенные ограничения кариоти-пической изменчивости, обусловливающие сбалансированную генетическую структуру. Есть ряд данных, подтверждающих это предположение [32-34]. Тем не менее состояние данной проблемы требует, несомненно, расширения исследований по поиску закономерностей ограничений кариотипической изменчивости.

Клеточные популяции in vitro являются динамичными системами и, лишившись многоступенчатого организменного контроля, в значительной степени подвержены влиянию внешних факторов, которые способствуют, в частности, усилению кариотипической изменчивости, что может повлечь за собой изменение других клеточных свойств. Для большинства постоянных клеточных линий, по-видимому, наиболее адекватным путем установления нового генного баланса при варьировании условий культивирования являются структурные и количественные изменения в составе маркерных хромосом. Отсутствие маркеров в ряде клеточных линий, возможно, обусловливает отличные от "маркерных" линий закономерности кариотипической изменчивости в процессе культивирования клеточных линий, находящихся на стадии стабилизации. Ряд немногочисленных данных литературы [35-40] свидетельствует, что при некоторых, совершенно разных воздействиях и в разных "безмаркерных" линиях отмечается появление дицентриков, образованных на основе теломерных ассоциаций. В связи с этим нам представлялось существенным провести детальное исследование кариотипической изменчивости в таких линиях при расширении спектра воздействий и круга объектов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель настоящей работы - поиск и исследование закономерностей структурной и количественной кариотипической изменчивости, преимущественно в "безмаркерных" клеточных линиях, при длительном культивировании их в разных условиях.

Были поставлены следующие задачи: 1) Анализ структурной и количественной кариотипической изменчивости в "безмаркерных" клеточных линиях при действии факторов, как правило присутствующих при длительном культивировании, а также факторов, влияющих на жизнедеятельность клеток. 2) Анализ структурной и количественной кариотипической изменчивости в различных по степени трансформированное™ "безмаркерных" клеточных линиях при одинаковом воздействии - микоплазменной контаминации. 3) Сравнение характера кариотипической изменчивости в "безмаркерных" и "маркерных" клеточных линиях при одинаковом воздействии - микоплазменной контаминации. 4) Поиск закономерностей ограничений кариотипической изменчивости, обеспечивающих сбалансированность кариотипической структуры "безмаркерных'' и "маркерных" клеточных линий на этапе стабилизации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Впервые показано, что дицентрики, образованные на основе теломерных ассоциаций, являются характерной чертой кариотипической изменчивости в "безмаркерных" клеточных линиях при длительном культивирова-

нии в разных условиях. Определен ряд общих свойств дицентриков. Представленные результаты впервые позволили предположить особую роль дицентриков для "безмаркерных" линий, связанную с созданием генетических структур, обеспечивающих систему адаптации клеточной популяции как автономного образования к условиям существования in vitro.

Впервые проведен статистический анализ отклонений по числу индивидуальных хромосом от их количества в основном структурном варианте кариотипа (СВК) и корреляции между разными хромосомами при одновременных однонаправленных и разнонаправленных отклонениях для поиска закономерностей ограничений количественной кариотипической изменчивости, обусловливающих образование сбалансированной кариотипической структуры в "безмаркерных" и "маркерных" клеточных линиях. Установлено, что для выживания клеточной популяции in vitro необходимо существование в ней в определенном соотношении клеток с разными СВК; выявлены конкретные закономерности этого явления.

Впервые обнаружены корреляции между статистически выявленными и морфологически выраженными закономерностями кариотипической изменчивости. На основе этих данных выдвинуто предположение, что закономерности количественной изменчивости, установленные при анализе СВК, и тенденции морфологических изменений кариотипа (дицентрики на основе тело-мерных ассоциаций) представляют собой проявления единой клеточно-попу-ляционной функции.

Результаты проведенного исследования значительно расширили представления о закономерностях структурной и количественной кариотипической изменчивости в постоянных клеточных линиях. Существенный вклад, внесенный в решение фундаментальных проблем клеточной биологии, состоит в том, что впервые клеточные линии, не имеющие маркерных хромосом, были рассмотрены как особые биологические системы и получены результаты, подтверждающие наличие характерных кариотипических особенностей э тих линий.

НАУЧНО - ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Полученные данные по кариотипической изменчивости в клеточных линиях при длительном культивировании в разных условиях показали необходимость периодического проведения цитогенетического контроля в клеточных культурах. Так, данные, касающиеся восстановительных процессов в клетках после размораживания, связанные с репарацией и репликацией, свидетельствуют о нестабильности клеточной культуры сразу после декри-оконсервации, что необходимо учитывать при постановке экспериментов. Необходимо стремиться к минимальному по времени контакту клеток с DMSO после декриоконсервацни в связи с установленной цито- и геноток-сичностыо препарата. Перевод клеток на другую среду, качество сыворотки могут изменять кариотипнческую структуру клеточной популяции при длительном культивировании, что может привести к изменению других свойств линии, изучаемых как в фундаментальных, так и в прикладных работах. Необходима периодическая проверка присутствия миконлазмы в культурах, т.к. по мере удлинения срока контаминации могут происходить существенные кариотипические изменения, не проявляющиеся на ранних сроках. Дицентрики, появляющиеся часто раньше других типов аберраций в

"безмаркерных" линиях, по-видимому, могут служить показателем неблагоприятных условий культивирования.

Результаты работы могут быть использованы в учебных целях.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации представлялись на Всесоюзном симпозиуме "Генетические процессы в популяциях опухолевых клеток" (Ленинград, 1980); на объединенном Конгрессе ETCS и EURES (Будапешт, 1983); на Всесоюзных (Российских) конференциях "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1987; Пущино, 1990,1994; Санкт-Петербург, 1992,1995,1998); на 2-й Всесоюзной конференции "Геномчеловека-91" (Переяславль-Залесский, 1991); на Международном симпозиуме по микоплазмам (Брно, 1992, Чехословакия); на 7-м Международном Конгрессе по клеточным коллекциям (Китай, 1992); на 10-м Международном Конгрессе по микоплазмологии(Бордо, 1994, Франция); на 39-м ежегодном собрании Американского общества клеточных биологов (Вашингтон, 1999, США); на 2-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург,2000).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация изложена наЗДО стр. машинописного текста и иллюстрирована 61 таблицей и 39 рисунками. Материалы диссертации отражены в 34 публикациях в отечественных и международных журналах, в том числе в обзорной работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Материалы и методы 1Л. Материалы

В работе были использованы следующие клеточные линии:

1) Иммортализованная линия фибробластов кожи индийского мунтжака \iuntjacus типчак, М -аббревиатура собственная ([30,ССЬ157]; Каталог РККК, 1999). Кариотип этой линии идентичен ка-риотипу донора (рис. 1а). Сублинии МТ, М1, М2 (рис 16, 2), спонтанно образовавшиеся из линии М (Полянская, 1988, Полянская, Фридлянс-кая, 1991, РгеесНашкауае! а1., 1992); сублиния М, в отличие от перечисленных выше, не имела четко выраженное модальное число хромосом, наиболее часто встречались клетки с 6,7 и 10 хромосомами (Полянская и др., 1993) 2) Иммортализованная линия клеток почки кенгуровой крысы РоЮгоиз иШас1у1Ь, ИВЬ-З-11

а.

2 2 1 1 1

П н I »

1 2 X У:

3 з - 1 1

1И Iii i "

1 2 X V,

Рис. 1. Основные структурные варианты кариотипов (СВК) клеток М (а): 2+2+1 + 1 + 1 и сублинии МТ (б): 3+3+1+2.

Арабские цифры (нижние) - номера хромосом; латинские буквы - номенклатура половых хромосом. Арабские цифры (верхние) - число гомологичных хромосом одного морфологического типа, составляющих СВК.

([30.CCL 35]; Каталог РККК, 1999). Кариотип этой линии соответствует кариотипу донора за исключением моиосомии по аутосоме 5 (рис. За). Сублиния NBL-3-17 (рис. 36), спонтанно образовавшаяся из NBL-3-11 (Полянская, 1988; Каталог РККК, 1999). 3) Имморталнзован-ная линия клеток лейомиосаркомы человека, SK-UT-1В ([30, НТВ 115; Каталог РККК, 1999). Кариотип соответствует кариотипу человека [29]. 4) Неиммортализованная клеточная линия легкого эмбриона человека, MR.C-5 ([30, CCL 171]; Каталог РККК, 1999). 5) Иммортали-зовалная линия клеток легкого китайского хомячка, V-79 (Каталог РККК, 1999). Количество маркеров -1 ¡(Полянская, Ефремова, 1993). 6) Клональные клеточные линии 2с-16 и 2с-11, выделенные из иммортализованной линии яичника китайского хомячка, А14-2с-1. Количество маркеров -14 и 15, соответственно (Полянская и др., 1981). 7) Иммортализованная клеточная линия карциномы шейки матки человека М HcLa clonel 1. (Каталог РККК, 1999). Количество маркеров - 13. 8) Клеточные гибриды: между иммортализованной линией эмбриональных фибробластов мыши (NIH3T3) и клоном (JF1) иммортализованной линии клеток саркомы крысы Jensen Sarcoma, ауксотрофнмми по аспарагину (Каталог РККК, 1999); между клетками сублиний М1, М2 и JF1.

Все перечисленные клеточные культуры получены из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН.

1.2. Методы

1.2.1. Культивирование клеток.

Клетки культивировали на средах, как правило рекомендованных в Каталогах коллекций клеточных культур АЗО]; Каталог РККК, 1999). Используемые в работе среды: ЕМЕМ (минимальная среда Игла), DMEM (среда Игла в модификации Даль-бекко), Fl2 (среда Хэма), DMFM/ F12 с добавлением в них 10% эмбриональной бычьей сыворотки.

Рис. 2. Основные структурные варианты кариотипов (СВК) клеток М (а): 2+2+1+1 + 1 и сублиний М1 (б): 3+3+2+1, М2 (в): 3+4+2+1.

Обозначения те же, что на рис. 1.

а.

2 п л 2 2 в \ ? » \ i оа 2 3 2 2 1 ut i* * X L ь

3 Ш i S 3 И? tu 2 Ш 3

ш X 3 4 2 $ z

Рис. 3. Основные структурные варианты кариотипов (СВК) клеток линии N61.-3-11 (а): 2+2+2+2+2+1 и сублинии ЫВ1--3-17 (б): 3+3+3+3+3+2.

Обозначения те же, что на рис. 1.

1.2.2. Получение клеточных гибридов. Клеточный гибрид между клетками N1113X3 и №1 и клеточные гибриды между клетками М1, М2 и получали при обработке культур в течение 1 мин 1 мл 45% раствора полиэтилен-гликоля, содержащего 10% ОМБО. Принципиальное отличие гибридов М1хЛР1и М2х1Р1 от гибрида М1НЗТЗх1Р1 состояло в том, что после гибридизации в первом случае суспензию клеток высевали без клонирования на среду без аспарагина. При таких условиях селекции в массовой культуре росли гибридные клетки и родительские клетки мунтжака. Это позволило оценить в равных условиях культивирования цитогенетические характеристики в родительских и гибридных клетках.

1.2.3. Кариологический анализ. Для кариологического анализа использовали метафазный метод. Препараты метафазных хромосом получали общепринятым методом (Полянская, 1988). Хромосомы окрашивали тремя способами: рутинная окраска раствором красителя Гимзы (1:50); дифференциальная окраска для выявления ¿¡-дисков ([41]; Глебов и др., 1981); дифференциальная окраска для выявления С - дисков по модифицированному методу Самнера [42]. Используемые модификации касались, главным образом, времени обработок разных клеток. Кариологический анализ проводили как на цитологических препаратах, так и на микрофотографиях. При анализе дифференциально окрашенных хромосом просматривали от 15 до 50 метафазных пластинок в зависимости от поставленной цели. Основными задачами, которые решались при анализе дифференциально окрашенных хромосом, были: характеристика кариотипа ряда интактных и подвергнутых воздействиям клеточных культур; локализация аберраций в идентифицированных хромосомах. При анализе рутинно окрашенных хромосом было просмотрено от 100 до более 2000 метафазных пластинок в зависимости от цели эксперимента. Были исследованы количество, типы хромосомных аберраций и анеуплоидия. При изучении анеуплоидии исследовалось распределение клеток по числу хромосом, состав и количество разных структурных вариантов кариотипа (СВК). В формуле СВК указано количество гомологичных хромосом разных морфологических типов или количество хромосом в разных морфологических группах. Основной СВК - наиболее часто встречающийся СВК в клетках с модальным числом хромосом. На рис. 1-3 приведены примеры нескольких основных СВК для разных сублиний фиб-робластов кожи индийского мунтжака и почки кенгуровой крысы.

1.2.4. Используемые в работе воздействия (факторы), изменяющие условия культивирования и способствующие кариотипической нестабильности.

1. Влияние разной генотипической срелы на кариотипическую изменчивость в клетках мунтжака. Кариологический анализ (количество, типы, локализация хромосомных аберраций и степень анеуплоидии) в клеточных гибридах М1х1Р1и М2х1Р1 проводили при дробной фиксации клеток в течение 27 - 128 сут после их получения.

2. Влияние разных культуральных сред на количественную кариотипическую изменчивость в сублинии КтВЬ-3-17.( используемые среды: НМЕМ -минимальная Игла на растворе Хэнкса, ЕМЕМ - та же среда на растворе Эрла и И12) Кариологический анализ проводили через 30 и 60 сут после рассева на указанные среды (Полянская, Дьяконова, 1988).

3. Влияние антибиотиков на капиотипичсские характеристики в клетках

М и МТ. Была использовала смесь: гентамицин, стрептомицин и пенициллин, каждый в концентрации 100 мкг/мл - "терапевтическая" доза, применяемая для предотвращения микробной инфекции [43]. Антибиотики вводили тремя способами: в культуру М сразу после декриоконсервации; через 60 сут после нее; в культуру МТ через 60 сут после декриоконсервации. Карио-логический анализ проводили через 30 и 60 сут после введения в среду антибиотиков.

4. Влияние криоконсервации на цитогенетические процессы. Были изучены выживаемость, внеплановый синтез ДНК и количество хромосомных аберраций в клеточной сублинии МТ в разные сроки после криоконсервации, проводимой в присутствии или в отсутствие криопротектора диметил-сульфоксида (ЭМ50 - фирма Р1ика), а также влияние Е)М50 без криоконсервации на количество хромосомных аберраций. Опыты по криоконсервации проводили на программном замораживателе типа ЗПБ-1. Декриокон-сервацию осуществляли путем отогрева в аппарате РТ-3 при 40°С в течение 80 с. Среднее время контакта клеточной культуры с ОМБО при комнатной температуре в процессе криоконсервации - декриоконсервации составляло около двух часов. Выживаемость клеток определяли с помощью трипаново-го синего, в каждом варианте просчитывали по 100 клеток. Определение внепланового синтеза ДНК проводили через 3 -5 ч и 1,2, 3,7,8,9, 13 и 15 сут после декриоконсервации. Внеплановый синтез ДНК исследовали методом авторадиографии с помощью 3Н-тимидина (уд. акт. 0.79 ТБк/ммоль). Изотоп вводили в среду в концентрации 37.0x104 МБк/мд и инкубировали в течение 1 ч. Отмывку от изотопа проводили в растворе Хенкса с холодным тимидином и фиксировали клетки в смеси Карнуа. Препараты покрывали эмульсией Р и выдерживали в холодильнике до 1.5 мес. При микроскопиро-вании клетки разделяли на три группы: сильномеченые (свыше 70 зерен над ядром), слабомеченые (11 - 70 зерен) и немеченые (5 -10 зерен над ядром, фон). Показателем внепланового синтеза ДНК служило увеличение числа слабомеченых клеток за счет уменьшения числа немеченых без заметного уменьшения числа сильномеченых клеток. В каждом варианте просчитывали 1000 - 2000 клеток при двух - трех повторностях. Для изучения влияния криоконсервации и ОМБО на количество и типы хромосомных аберраций были использованы следующие варианты опыта: 1) криоконсервация и хранение в жидком азоте без ОМБО и с ОМБО в течение 7 сут и последующий кариологический анализ через 3 и 7 сут после декриоконсервации; 2) криоконсервация и хранение в жидком азоте без ОМБО и с ОМБО в течение 6 мес и последующий кариологический анализ через 3 сут; 3) введение ОМБО на 2 ч с последующей отмывкой и фиксацией клеток через 23 ч после начала воздействия (введение ОМБО в клеточную культуру осуществляли двумя способами: в распластанную, рутинно ведущуюся культуру и в суспензию, для точного моделирования процедуры подготовки к криоконсервации). Всем исследованным вариантам сопутствовал интактный контроль, культивируемый в течение 60 - 64 сут после декриоконсервации.

5. Влияние эмбриональной бычьей сыворотки разных серий при варьировании концентраций накариотипическую изменчивость в клеточных культурах М и Были добавлены в культуральную среду сыворотка серии 181, производства НИИ эпидемиологии и микробиологии (Минск) и сыво-

ротка серии 33, производства Института эпидемиологии и микробиологии (Москва). Каждую сыворотку добавляли в среду в концентрации 10 и 3%. С целью повышения жизнеспособности и скорости пролиферации клеток при употреблении 3% сыворотки в среду в оптимальных концентрациях вводили компоненты (добавки), частично заменяющие сыворотку [44].

6. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую изменчивость в клеточных культурах: М, NBL-3-17. NBL-3-11. SK-UT- 1 В. MRC-5, V-79, М HeLa clonel 1. Было проведено искусственное заражение культур двумя видами микоплазм: Mycoplasma arginini R-16 (аргининозависимая) и Acholeplasma laidlawii А, штамм PG-8 (глюкозозависимая). Контаминацию проводили при полном монослое культуры с исходным титром для М. arginini 2 х 106 колонеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мл, для А. laidlawii - 2 х 10'°. Первое определение наличия микоплазмы в культуре проводили через 2 пассажа (10 -15 сут) после заражения и перед каждой фиксацией клеток двумя методами: окраской флуорохромом Хёхст - Н-33258 [45] и микробиологическим высевом на твердые и жидкие питательные среды для микоплазм. Титр микоплазм устанавливали при высеве культуральной пробы контами-нированных клеток на твердый агар PPLO. Кариологический анализ проводили при дробной фиксации клеток в процессе длительной микоплазменной контаминации в течение 15 - 168 сут. Сроки исследования в указанных пределах варьировали между перечисленными выше культурами. Кариологический анализ проводили также при деконтаминации от микоплазм клеточных культур М и V-79 с помощью антибиотика ципрофлоксацина (ЦФ) при использовании двух методов [46,47].

7. Влияние ЦФ на кариотипическую изменчивость в клеточных культурах NBL-3-11 и М. Клетки подвергали кратковременному и длительному действию ЦФ в концентрациях 10, 25, 50 и 100 мкг/мл. Учитывая данные о длительности фаз клеточного цикла исследуемых линий [48], в опытах с кратковременным действием ЦФ на клетки его добавляли в ростовую среду в разные фазы 1-го митотического цикла и в конце 2-го цикла. А именно, в культуры клеток NBL-3-11 - за 6.5,18.5, 24.5 и 48 ч до их фиксации; в культуры фибробластов мунтжака - за 6, 15, 24 и 48 ч до фиксации. В опытах с длительным действием ЦФ его добавляли в ростовую среду в течение 15 и 30 сут, предшествующих фиксации клеток.

8. Влияние внеклеточного белка теплового шока (в-БТШ70) на хромосомную изменчивость в клеточной линии М. В интактные и обработанные ЦФ в концентрации 50 мкг/мл клеточные культуры вводили В-БТШ70. ЦФ добавляли в ростовую среду в разные фазы 1 -го митотического цикла: за 6 и 24 ч до фиксации клеток, а также на 6 ч с последующим культивированием в течение 18 ч (до фиксации) на чистой среде. Клетки подвергали действию в-БТШ70 в концентрациях 10 и 100 мкг/мл при введении его в культуру за 24 ч до фиксации. Введение В-БТШ70 в концентрации 100 мкг/мл проводили также за 6 ч до фиксации и на 6 ч с последующим культивированием в течение 18 ч (до фиксации) на чистой среде. Совместное культивирование клеток с ЦФ и В-БТШ70 (50 и 100 мкг/мл) проводили: 1) в течение 6 и 24 ч до фиксации; 2) при введении агентов на 6 ч с последующим культивированием в течение 18 ч на чистой среде до фиксации; 3) при введении ЦФ за 24 ч до фиксации, а В-БТШ70 - только на последние 6 ч перед фиксацией. Клетки

подвергали действию денатурированного В-БТШ70, который вводили в культуру за б ч (100 мкг/мл) и за 24 ч (50 и 100 мкг/мл) до фиксации, а также на 6 ч (100 мкг/мл) с последующим культивированием в течение 18 ч на чистой среде. Совместное культивирование клеток с ЦФ и денатурированным в-БТШ70 при концентрации белка 50 и 100 мкг/мл проводили в тех же условиях, что и с нативным В-БТШ70. Липополисахарид (ЛПС), полученный из Е. coli (Sigma), в концентрации 50 мкг/мл вводили в культуру за 24 ч до фиксации. Совместное культивирование клеток с ЛПС и В-БТШ70 в концентрации 100 мкг/мл также проводили в течение 24 ч до фиксации.

БТШ70 выделяли из скелетных мышц крупного рогатого скота методом двухступенчатой очистки с использованием ионообменной и аффинной хроматографии [49]. Чистоту препарата определяли методом электрофореза в денатурирующих условиях [50]. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда [51], в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (Sigma, тип V). Денатурацию белка осуществляли кипячением на водяной бане в течение 10 мин.

1.2.5. Методы статистического анализа. Все полученные в работе результаты обрабатывали с использованием t - критерия Стыодента и критерия %г- Различия считали достоверными при вероятности нулевой гипотезы Р < 0.01. Наиболее широко эти статистические методы были применены при исследовании закономерностей количественной кариотипической изменчивости в клеточных популяциях линий М, МТ, М2, NBL-3-11, 2с-11 и 2с-16). В этих исследованиях принятая нулевая гипотеза состояла в допущении равновероятности численных отклонений любой хромосомы от её количества в основном СВК и случайности корреляций между разными хромосомами при одновременных отклонениях.

Глава 2. Результаты и обсуждение 2.1. Влияние факторов, как правило присутствующих при длительном культивировании, на структурную кариотипическую изменчивость

в "безмаркерных" клеточных линиях 2.1.1. Влияние антибиотиков в "терапевтических" дозах на хромосомные аберрации в клеточных линиях фибробластов кожи индийского мунтжака. При работе с клеточными культурами, особенно при длительном культивировании, во избежание бактериального заражения или для подавления его на начальных стадиях используют антибиотики в дозах, существенно не влияющих на жизнеспособность клеток. С целью изучения возможного влияния антибиотиков в "терапевтических" дозах на кариотипическую изменчивость проанализировали характер их действия на количество и типы хромосомных аберраций в клеточных линиях М и МТ (Полянская, 1989).

В клетках линии М имеет место достоверное увеличение количества хромосомных аберраций при действии антибиотиков в течение 30 - 60 сут (Р<0,01) сразу после декриоконсервации. Увеличение количества хромосомных нарушений происходит только за счет постепенного повышения уровня дицентриков (рис. 4а и 7). При введении антибиотиков через 60 сут послс декриоконсервации и их последующем действии в течение 30 - 60 сут количество хромосомных аберраций соответствует контролю. Длительность культивирования после декриоконсервации, по-видимому, может определять

10 о

гЬ

"X" г гЬ -ъ й

ЙЯ 1 1

□ все аберрации

□

дицентрики

® остальные типы аберраций

Рис. 4. Количество хромосомных аберраций в «безмаркерных» клеточных линиях при разных воздействиях в условиях длительного культивирования.

По сои абсцисс: а - «терапевтические» дозы антибиотиков; б - сыворотки; в - клеточные гибриды; г - ципрофлоксацин; д - длительность культивирования; е, - микоплазменная контаминация (М. агд/Ыт); е2 - микоплазменная контаминация (А. агд/п/п/); в скобках -аббревиатура линии; по оси ординат: частота встречаемости хромосомных аберраций, %.

й я 5 >о

£ °

о р

5 я

1° Й о

5 2 - с к ~

я й г

хЗ

-"V п

» -о ' о

Ю Ш СО 5

^ 5

^о КГ

^ я

2 х

а х

~ 43

- 5 §.§

~ к

о ю

й о

. ¡»'С

о П) а\

й ё я

£ о я

-5 ч :£

£2 о я

Ы Зэ

2 я

= с

К о

о- я

28 2

" х - а -а о

ы И ? м ?

в 2

ОЧ Ч 43 -

С £

и а* р о

•а я

о о

V ЕС

2 о

2 п>

■ Зэ СО ?

А К

2 к

я ^

о |

а д

о Я

а\ а

чз я

к I

5 О I

а I :

* ОЧ !

К О

2 о

з*

ез

■31

о 2 Л С8 О) 5

г чэ 5 ?

£ а

I 2

» Е

" I

и 2

Зз 43 а пса я - о 43 -С За

8 п 2

о 43 5

я п 3

о " я

о X

р н я

а о С н

¡а

п .

я ~ ^

Нч: >2 ^

я н

о к

О Я

ь =

° о

81 2

3 »

3 «

к Е

о в

Т- Р

р о

к 4 £

Я ю

За я н

о о я

а и м

Я о се

О р"

— За р я к Ж оя н V о

О О я

Я I Й и

о о- к ¿3

5 Я Й ^

£5 й. о о

Э н о

§ -8 » *<

= ? ы Я

з ё * 1

3 е 41 я

О , ОО !

8 Е чз

- а

чз я

§® ? й

2 ы - к

Е о " "

Е 3 9 -

о £

Я С)

в р

. Ь ё а

^ &

о <П!

к ^

° к н .

о се

О О О! й

СТ1

к а 3 ъ 5 = я

я о о и а

л й 2

о << Д

0\ ' о '

ш а о р

У *

Зд V " —

Я! Я о Р

В Я Я X!

а к ' 2

Ь п Ж

5 »

к « 2 Е

з я и

о Р в ■ ш Я

р 3 Л1 ^ -а "

» н ч ^ ^ к „ч о ^ » Й

Зоя >3 * Й 9 3?

__ с?

я а

оз а

3? й й я О о Я!

>, имеют сочетания -1+1,1+2,1+Х,

£ 2+Х.; в линии М 70% дицентри-

5 ков имеют сочетания: 1+-Х,

2 Х+У, (при сравнении с

0 контролем видно, что У, вовле-х- кается в образование дицентри-™ ков только при действии анти-я биотиков). Из приведенных ре-о- зультатов следует, что в обеих £ линиях дицентрики образуются

одинаковыми хромосомами 1 и X, а различия состоят в том, что ° в МТ еще участвует в дицентри-£ ках и хромосома 2, а в М - хро-° мосома У,, отсутствующая в ос° новном СВК линии МТ. Необ-

1 ходимо подчеркнуть, что на-

1 блюдаемым дицентрикам не со-5 путствуют двойные фрагменты. | Это позволяет считать, что ди-о центрики образованы на осно-о ве теломерных ассоциаций.

§ 2.1.2. Влияние криоконсер-

2 вации на щ атеистические ха-* рактернетики клеточной субли-§ нии МТ. Для хранения постоян-я ных клеточных линий применя-

0 ют криоконсервацию в жидком ш азоте при использовании криоп-ю ротекторов, в частности,

ОМБО. Большинство клеточ-я ных линий не может быть замеса: рожено без криопротектора. ю При последующей декриокон-х сервации клеточные культуры

1 ^ сохраняют присущие им свой-о § ства. В ряде работ отмечена ка-о . я риотипическая нестабильность, о я о наблюдающаяся в разных лини-Ч1т ях в течение некоторого времени после декриоконсервации

о ™ ш [52,53]. На нескольких линиях

5 2 п показано, что сразу после дек-

§ 11 риоконсервации в течение двух

з « недель имеет место усиленный

^ о д внеплановый синтез ДНК, кото-

^ 5<§ Ры" при дальнейшем культиви-

5 ровании возвращается к конт-

рольному уровню [54,55]. Следовательно, физиологическое состояние клеточных культур действительно может зависеть от длительности культивирования после дек-риоконсервации. Культуры фиб-робластов кожи индийского мунг-жака отличаются от других способностью переживать криоконсерва-цию без криопротекторов (выживаемость 15%). Исследование таких культур позволяет выяснить, как криоконсервация влияет на ци-тогепетические параметры, в чем возможные причины нежизнеспособности большинства клеточных линий при криоконсервации без криопротекторов, какова роль ЮМБО в изменении исследуемых цитогенетических характеристик. Нами проведено исследование влияния криоконсервации в присутствии 10% ОМБО и без него на выживаемость, внеплановый синтез ДНК, количество и типы хромосомных аберраций. Исследовано также влияние БМБО на хромо-

Рис. 6. Количество хромосомных аберраций в «маркерных» клеточных линиях при длительной микоплазменной контаминации (а) и в соответствующих контрольных вариантах (б).

По сои абсцисс: е, - микоплазменная контаминация (М. агд/л/л/); е - микоплазменная контаминация (А. агдтю/)', в скобках - аббревиатура клеточной линии; по оси ординат: частота встречаемости хромосомных аберраций, %.

сомную изменчивость без криоконсервации (Полянская и др., 1990).

Показано, что после размораживания клеток, криоконсервированных в присутствии 10% ОМЭО, достоверно уменьшается выживаемость; восстановление её до контрольного уровня происходит через 7 сут. После размораживания клеток, криоконсервированных без ЭМБО, происходит постепенное восстановление выживаемости, которое достигает контрольного уровня только к 14-м сут. После размораживания клеток, криоконсервированных в присутствии ОМБО, достоверно увеличивается внеплановый синтез ДНК, который снижается до уровня контроля к 14-м сут. После размораживания клеток, криоконсервированных без ОМБО, также значительно увеличивается внеплановый синтез ДНК, но достоверно меньше, чем в присутствии ЭМБО. Кроме того, имеет место достоверное снижение интенсивности репликативного синтеза ДНК; восстановление этих синтезов до контрольного уровня происходит к 14-м сут. Следовательно, криопротектор ЭМБО способствует поддержанию оптимального уровня выживаемости клеток, репарации повреждений и нормальной интенсивности репликации ДНК, которые нарушаются при глубоком замораживании клеток в жидком азоте.

После размораживания клеток, криоконсервированных без ОМЗО, через 3 сут имеет место достоверное увеличение количества аберраций, в основном за счет хромосомных разрывов, по сравнению с вариантом с ОМБО

и с интактным контролем (16.0+2.0, 2.3+0.8, 0.9+0.5%, соответственно); через 7 сут наблюдается нормализация исследуемого параметра. При хранении клеток в течение 6 мес количество аберраций значительно выше (88.5+2.4%), чем при хранении в течение 7 сут (24.0+2.4%). Показано, что в хромосоме X длительная криоконсервация без ОМБО способствует увеличению числа точек, подверженных разрывам, по сравнению с кратковременной криоконсервацией. Помимо значительного увеличения хромосомных разрывов, наблюдается достоверное увеличение дицентриков по сравнению с контролем (11.4+2.0, 0.4+0.4%, соответственно). Возможно, что при длительном хранении клеток в условиях криоконсервации накапливается большое количество потенциальных хромосомных повреждений, которые в отсутствии ОМБО реализуются в истинные перестройки. Наблюдаемое явление сходно с известным феноменом увеличения частоты мутаций при длительном хранении семян, установленным М. С. Навашиным [56]. По-видимому, ОМЙО способствует репарации потенциальных хромосомных повреждений. Имеет место неслучайное вовлечение хромосом в образование дицентриков в клетках, криоконсервированных без ОМБО в течение 6 мес. Так, из 30 проанализированных дицентриков 23 (75%) имеют в своем составе хромосомы 1, 2, X и сочетания 1+Х; 2+Х.

В клетках, обработанных 10% ВМБО в течение 2 ч (без криоконсервации), наблюдается достоверное снижение выживаемости клеток (93.0+2.0%) по сравнению с контролем (99.0+1.0%). Обнаружено существенное увеличение количества хромосомных аберраций за счет хромосомных, хроматид-ных разрывов и транслокаций. Следовательно, ИМ80 в зависимости от условий взаимодействия с клетками может обладать цитотоксичным и гено-токсичным действием, что подтверждает данные более ранних исследований [57-60].

2.1.3. Влияние сыворотки на хромосомные аберрации в клеточных линиях М н М. Не имея возможности полностью проконтролировать состав сыворотки или совсем исключить ее из компонентов ростовой среды, мы провели исследование влияния эмбриональной бычьей сыворотки разных серий в концентрациях 10 и 3% на изменчивость хромосом (Полянская и др., 1993). Обобщенные результаты представлены на рис.4б и 56.

Из полученных данных следует, что при культивировании клеток линии М в среде с 10% сыворотки серий 181 и 33 в течение 120 и 135 сут не изменяется количество хромосомных повреждений; тем не менее, среднее количество аберраций достоверно различается: 12,0+1.0% (сер. 181) и 5.4+1.3% (сер. 33) - Р<0.01. По-видимому, качество сыворотки отражается на спонтанном уровне хромосомных аберраций.

Проведено сравнение влияния сыворотки в концентрации 3 и 10% на кариотипическую изменчивость. При культивировании клеток М в среде с 3% сыворотки серии 181 в течение 30 сут значительно увеличилось количество хромосомных аберраций за счет хромосомных разрывов и дицентриков; через 60 сут наблюдаемое увеличение хромосомных аберраций происходило только за счет дицентриков (Р< 0.05), количество которых через 90 сут снизилось до контрольного уровня.

При использовании 3% сыворотки серии 33 в процессе культивирования клеток М уже через 15 сут отмечалось существенное увеличение количества

аберраций за счет хромосомных, хроматидных разрывов и дицентриков по сравнению с контролем (10%).

Следовательно, снижение оптимальной концентрации сыворотки, несмотря на введение добавок, приводит к усилению хромосомной нестабильности, но характер этой нестабильности зависит от качества сыворотки.

При культивировании другой сублинии клеток - М, в среде с 10% сыворотки серии 33 в течение 120 сут количество хромосомных аберраций не меняется, но оно выше, чем в линии М в варианте с этой же серией. Так, в среднем, в линии М количество аберраций - 5,4+1,3%, а в М, - 11,7+1,5% (Р< 0,01). При культивировании клеток М, в среде с 3% сыворотки количество аберраций изменялось иным образом по сравнению с клетками М в тех же условиях: в течение 60 сут наблюдалось постепенное увеличение только количества дицентриков, которое к 90-м сут снизилось до контрольного уровня. По-видимому, характер кариотипической изменчивости при одинаковых условиях культивирования может зависеть от конкретной структуры кариотипа клеточной популяции.

В клетках М в среде со сниженной концентрацией сыворотки при анализе 64 дицентриков показано неслучайное вовлечение хромосом в их образование - в 80% обнаружена хромосома 1; в 61% - хромосома 2 и в 20% - X.

2.1.4. Исследование кариотипической изменчивости в процессе длительного культивирования в клеточной сублинии NBL-3-17. Очевидно, что сам фактор времени при длительном культивировании может вызывать карио-типическую нестабильность, т.к. при культивировании всегда имеется совокупность условий, которые невозможно учесть (качество сыворотки, куль-туральной посуды, небольшие колебания температуры и т.д.) Поэтому длительное культивирование в одинаковых или постоянных условиях - понятие относительное. Полученные результаты подтверждают эту точку зрения. В двух независимых опытах показано, что культивирование клеток сублинии NBL-3-17 в течение 30-150 сут приводит к существенному увеличению количества хромосомных аберраций, в основном за счет дицентриков (рис. 4д и 5д). Так, в первом опыте наблюдаемое количество дицентриков через 30 сут составляло 1.9+1.3%, а через 150 сут -10.0+3.0%; во втором опыте наблюдаемое количество дицентриков через 40 сут составляло 3.3+1.4%, через 110 сут - 20.0+4.0%. Разные хромосомы с разной вероятностью участвуют в образовании дицентриков. Наиболее часто вовлекаются хромосомы 1,4 и X (с частотой 44%, каждая); хромосома 1 соединяется преимущественно q-пле-чом, хромосома X - равномерно двумя плечами (Полянская, Ефремова, 1996).

Таким образом, совокупность представленных в этом разделе данных позволяет с большой вероятностью утверждать, что дицентрики, которые появляются под влиянием факторов, как правило присутствующих при длительном культивировании, являются характерной чертой кариотипической изменчивости в клеточных линиях без маркерных хромосом.

2.2. Действие факторов, влияющих на жизнедеятельность клеток, на структурную кариотиническую изменчивость в разных клеточных линиях при длительном культивировании

2.2.1. Изменчивость хромосом муитжака в гибридах соматических клеток. Исследовали изменчивость хромосом фибробластов кожи индийского

мунтжака в гибридах соматических клеток между клетками JF1, и клетками Ml и М2 (Полянская, Фридлянская,1991). Из полученных результатов следует, что в гибридных клетках (MlxJFl и M2xJFl) количество хромосомных аберраций достоверно выше через 27 и 34 сут культивирования, чем в клетках Ml и М2, в основном за счет увеличения хромосомных разрывов и дипентриков (рис.4в и 5в). По мере культивирования количество хромосомных аберраций постепенно снижается и через 128 сут не отличается от количества аберраций, характерного для родительских клеток мунтжака. Позднее другими авторами было показано увеличение количества теломерных ассоциаций в клеточных гибридах между клетками SVM, трансформированными вирусом SV40, и спонтанно трансформированными фибробластами кожи индийского мунтжака [61].

При анализе 123 дицентриков обнаружено неслучайное вовлечение хромосом в их образование: в 68% обнаружена хромосома 1; в 61 % - хромосома 2; в 17% - Y2; в 13% - X. Следовательно, дицентрики образуются преимущественно за счет хромосом 1 и 2. Наблюдаются неслучайные сочетания хромосом при образовании дицентриков. Наиболее часто встречались сочетания хромосом: 1 + 1 (22.4%), 1+2 (25%); несколько реже - 1+Х (14.5%), 2+2 (14.5%) и 2+Y2 (11.8%). Остальные 5 возможных сочетаний наблюдались с частотой не более 5%. Участие хромосомных плеч при слиянии теломер не всегда равномерно: хромосома 1 равномерно соединялась как р-, так и q-плечами, а хромосома 2 преимущественно q-плечом. В клеточных гибридах в "крысиной" части кариотипа дицентрики не наблюдались.

Анализ частоты хромосомных разрывов показал, что наиболее ломкими являются хромосомы 1 (77.3+3.4%) и X (20.0+3.3%). С помощью критерия х2 показано, что наблюдаемое распределение хромосомных разрывов не зависит от относительной длины и количества исследованных хромосом (Р<0.01). Существенно, что в хромосоме 2, которая с высокой частотой участвует в образовании дицентриков, хромосомные разрывы регистрируются сравнительно редко. Эти данные могут косвенно свидетельствовать о том, что основная масса дицентриков действительно образована посредством слияния теломер, а не с помощью разрывов. Из полученных результатов следует, что причиной хромосомного дисбаланса в гибридных клетках является изменение генотипической среды после гибридизации, т.к. изменчивость хромосом мунтжака в родительских и гибридных клетках в идентичных условиях культивирования, выявляемая на одних и тех же препаратах, различается.

2.2.2. Влияние микоплазменной контаминации разных клеточных линий на хромосомные аберрации. Учитывая существенное влияние микоплазм на жизнедеятельность клеток [62-65], нами было проведено сравнительное исследование влияния длительной микоплазменной контаминации на количество хромосомных аберраций в "безмаркерных" и "маркерных" клеточных линиях.

1) Клеточная линия М. Результаты, полученные при длительной искусственной контаминации клеток линии М двумя видами микоплазм (Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma arginini), имеющими разные биохимические пути взаимодействия с клетками [64], свидетельствуют о существенном влиянии обеих микоплазм на кариотшшческую изменчивость (Полянс-

кая, Ефремова, 1992, 1994). При контаминации М. arginini в течение 95 -150 су г наблюдается достоверное увеличение хромосомных аберраций только за счет дицентриков; другие типы аберраций достоверно не превышают уровень контроля (рис. 4е,, 5е,и 8). При контаминации A. laidlawii в течение95 -168 сут также преимущественным типом хромосомных изменений являются дицентрики ((рис.4е2,5е2и 9). При контаминации обоими видами микоплазм преимущественно участвуют в образовании дицентриков хромосомы 1, 2, реже X. С помощью критерия у} показано, что имеет место действительно неслучайное вовлечение определенных хромосом в образование дицентриков, несмотря на разное количество гомологичных хромосом в основном СВК 2+2+1+1 + 1 (Р<0.01). Преимущественными сочетаниями хромосом в дицентриках при контаминации М. arginini и A. laidlawii являются 1+2 (46 и 45%) и 1+Х ((17 и 15%), соответственно. Хромосома 2 соединяется преимущественно q-плечом, а хромосома X - р-плечом.

Для деконтаминации клеточной культуры был применен ЦФ в дозе 10 мкг/мл (Полянская, Ефремова, 1993, 1994; Полянская и др., 1994а, б,; Freedlanskaya et al., 1994). Культивирование с ним клеток в течение 15-45 сут привело к снижению количества дицентриков до контрольного уровня, который сохранялся и при последующем культивировании клеток на чистой среде в течение 30 - 45 сут.

2) Клеточная линия NBL-3-17. Из полученных результатов следует (рис. 4е2, 5с;), что при контаминации клеток сублинии NBL-3-17 A. laidlawii в течение 40 сут наблюдается достоверное увеличение количества хромосомных аберраций, за счет достоверного увеличения дицентриков (в 3.5 раза) и менее значительного увеличения хромосомных разрывов (в 1.7 раза, Р<0.05). Через 110 сут культивирования действие микоплазменной контаминации на эти клетки обнаружить нельзя, т.к. согласно результатам, полученным в не-контаминированном варианте, происходит суммирование двух воздейс твий: фактора времени и контаминации. Поэтому наблюдаемое появление в кон-таминированном варианте дицентриков, возможно, частично связано с фактором времени при длительном культивировании (Полянская, Ефремова, 1996). Показано, что в контамииированных клетках разные хромосомы с разной вероятностью участвуют в образовании дицентриков: наиболее часто в этом процессе участвуют хромосомы 1 - q-плечо (51%), 2 (42%) и 4 (36%); реже - хромосомы 3 (22%), X (19%) и 5 (6.5%).

Анализ хромосомных аберраций показал, что разрывы распределяются по хромосомам неравномерно. Наиболее часто как в чистой, так и в конта-минированной культурах разрывы встречаются в хромосомах 1,2 и X. Следует отметить, что хромосома 4, активно участвующая в образовании дицентриков, крайне редко подвергается разрывам. Подобное явление отмечалось ранее для хромосомы 2 фибробластов кожи индийского мунтжака (Полянская, Фридлянская, 1991). Оба явления могут быть косвенным свидетельством того, что основная масса дицентриков действительно образована посредством слияния теломер, а не с помощью разрывов.

3) Клеточная линия SK-UT-1B. При контаминации клеток A. laidlawii в течение 30 - 90 сут происходит постепенное увеличение количества дицентриков, которое к 90-м суг достигает величины в 13 раз большей, чем в контроле; тогда как количество хроматидных разрывов увеличивается только в

2 раза (рис. 4сг 5е2 и 10). Существенно подчеркнуть, что дицентрики появляются независимо от других типов хромосомных аберраций и увеличиваются в количестве по мере удлинения срока контаминации (Полянская и др., 1998).

4) Клеточная линия MRC-5. Ранее нами были исследованы "безмаркерные" постоянные клеточные линии, различающиеся по степени трансфор-мированности. Во всех случаях был получен однозначный результат, свидетельствующий о появлении дицентриков на основе теломерных ассоциаций при разных воздействиях в условиях длительного культивирования. Представляется существенным дополнить эти сведения исследованием неиммор-тализованной клеточной линии с ограниченным сроком жизни (Полянская и др., 2000а). При микоплазменной контаминации A. la id law ii в течение 15 -45 сут имеет место постепенное увеличение количества дицентриков. Через 45 сут их наблюдается в 2 раза больше, чем через 15 сут. Количество других типов хромосомных аберраций соответствует контролю (рис. 4ег 5е,). Следовательно, полученные результаты подтверждают выдвинутое ранее предположение о том, что дицентрики, образованные на основе теломерных ассоциаций, являются характерной чертой кариотипической изменчивости в "безмаркерных" клеточных линиях в условиях длительного культивирования при разных воздействиях, независимо от степени трансформированнос-ти этих линий.

5) Клеточные линии V-79 и M HcLa clone 11. Для подтверждения выдвинутого нами положения о дицентриках (теломерных ассоциациях) как характерной черте кариотипической изменчивости в "безмаркерных" клеточных линиях необходимо было провести исследование данного параметра в линиях с маркерными хромосомами при индуцирующих хромосомную нестабильность воздействиях в условиях длительного культивирования (Полянская, Ефремова, 1993; Полянская и др., 1994а, б; Frcedlanskaya et al., 1994; Полянская и др., 1996; Полянская, Ефремова, 2000). Показано, что при контаминации клеток линии V-79 в течение 30 - 70 сут (Л. laidlawii J и в течение 53-131 сут (M. arginini) количество хромосомных аберраций существенно увеличивалось, но только за счет хромосомных и хроматидных разрывов. При контаминации клеток линии M HeLa clone 11 в течение 15 - 60 сут (А. laidlawii J и в течение 30 сут (М. arginini) генотоксический эффект не был обнаружен (рис. 6). Известны и другие данные об отсутствии генотоксичес-кого влияния микоплазменной контаминации ([66]; Полянская, Смирнова, 1987). Генотоксическое влияние выявляется только при удачном сочетании чувствительности клеточной линии, вида и количества микоплазмы, а также оптимальной длительности воздействия.

2.2.3. Влияние цкпрофлоксацина на хромосомные аберрации в клеточных линиях NBL-3-11 и М. В этом разделе приведены результаты по исследованию влияния на кариотипическую изменчивость "безмаркерных" клеточных линий ЦФ - фактора, дестабилизирующего клеточные процессы (Полянская, Сизова, 1996). В высоких концентрациях ЦФ индуцирует хромосомные нарушения в клетках костного мозга мыши [67]. Механизм действия ЦФ как аналога 4-хинолина заключается, по-видимому, в ингибироваиии топоизомеразы II, которая участвует во многих клеточных процессах [6873]. Генотоксическое влияние его на культивируемые клетки при разных кон-

центрациях и длительности действия ранее не изучалось.

Показано, что при кратковременном действии ЦФ на клетки М только в концентрации 50 мкг/мл наблюдается генотоксическое влияние; концентрации 10 и 25 мкг/мл - негенотоксичны, а концентрация антибиотика 100 мкг/ мл, за исключением 6-часового воздействия, - летальна для клеток. При разной длительности действия ЦФ в указанных пределах возрастало количество хромосомных аберраций разного типа. При кратковременном действии ЦФ на клетки ЫВЬ-3-11 в концентрациях 25, 50 и 100 мкг/мл также наблюдается генотоксический эффект и возрастание количества хромосомных аберраций разного типа при разной длительности действия ЦФ в указанных пределах. Различие типов аберраций хромосом, возникающих в клетках обеих исследуемых линий при разной длительности кратковременного действия ЦФ в эффективных концентрациях, по-видимому, объясняется его действием на клетки в разных фазах митотического цикла. В обеих линиях не обнаружено увеличение количества дицентриков.

При длительном действии ЦФ (15 сут) на клетки М наблюдается генотоксическое влияние в концентрациях 25 и 50 мкг/мл, причем в первом случае только за счет дицентриков, а во втором - за счет хромосомных разрывов и дицентриков; через 30 сут генотоксическое влияние при концентрации 25 мкг/мл исчезает, т. е. количество дицентриков возвращается к контрольному уровню; а при 50 мкг/мл генотоксический эффект имеет место за счет всех типов хромосомных аберраций, включая дицентрикн (рис. 4г и 5г). При анализе 88 дицентриков установлено неслучайное вовлечение хромосом в их образование: хромосома 1 (48%), 2 (20%) и У, (16%), X (11%) и У2 (8%); наиболее часто встречаются сочетания 1 + 1(24.4%), 1+У,(24.4%), 1+2 (9.7%), 1+Х (9.0%), и 2+У,(6.7%). Остальные сочетания хромосом наблюдаются с частотой 0.5% каждое. Эти результаты в большой степени сходны с полученными при действии антибиотиков в "терапевтических" дозах: в обоих случаях обнаружено заметное участие в образовании дицентриков хромосомы У, и сочетания 1+У, (Полянская, 1989). Возможно, что этот факт свидетельствует о специфическом действии антибиотиков именно на эту хромосому, т.к. другие хромосомы участвуют в образовании дицентриков и при других воздействиях.

Полученные результаты являются дополнительным доказательством того, что дицентрикн представляют собой характерную черту кариотшш-ческой изменчивости в "безмаркерных" клеточных линиях при длительном культивировании.

2.2.4. Влияние внеклеточного белка теплового шока (в-БТШ70) на хромосомную изменчивость в клеточной линии М. Проведенное исследование охватывает только кратковременное воздействие В-БТШ70 на культивируемые клетки. Известна защитная функция белков теплового шока, в частности В-БТШ70, для разных клеток [74-77]. Данные о роли В-БТШ70, как фактора защиты, на уровне хромосом нам неизвестны. Было исследовано влияние В-БТШ70 на хромосомную нестабильность, индуцированную ЦФ (Полянская и др., 1997). Из результатов, представленных в табл. 1, следует, что ЦФ и В-БТШ70 (50,100 мкг/мл, соответственно) при раздельном действии на интактные клетки в течение 6 и 24 ч вызывают достоверное увеличение количества хромосомных аберраций по сравнению с контролем за счет хро-

матидных или хромосомных разрывов. При совместном действии ЦФ и в-БТШ70 в течение 6 и 24 ч наблюдается достоверное снижение хромосомных аберраций до уровня контроля. Различие в типах аберраций хромосом, обнаруженное при разной длительности действия ЦФ и В-БТШ70, объясняется, по-видимому, действием агентов на клетки в разных фазах митотическо-го цикла.

Таблица 1

Влияние внеклеточного белка теплового шока (В-БТШ70) на количество хромосомных аберраций в интактных и обработанных цип-рофлоксацином (ЦФ) ¡слетках линии М

при разных условиях воздействия

Вариант опыта KoHiieifT-рация агента, мкг/м 1 Дш11'-11> НОСТЪ действия до фиксации, ч Число проанализированных клеток Частота клеток с ХРОМОСОМНЫМИ аберрациями, х+^,% Частота хромосомных аберраций разного типа, х+8т,%

всех аберраций ХРОМОСОМНЫХ разрывов хрома-тидных разрывов ДИ11С1ГТ- риков без двойных фрагментов аберраций обменного типа Частота хромосомных и хро-матнл-ных пробелов, Х+5.,%

Контроль и «о 8.4+1.8 8.4+1.8 3.2+1.1 2.4+1.6 2.4+1.6 0.0+0.4 0.4+0.4 ТЛ+ЕГ

Цф id 24 245 18.8+2.5' 23.3+2.7' 11.8+2.1' 5.7+1.5 4.1+1.3 1.6+0.8

ЦФ+ В-БТШ70 50+10 24 105 19.0+3.8' 26.7+4.3' 12.4+3.2' 7.6+2.5 4.8+2.1 1.9+1.3 3.8+1.9

50+I0Ö 205 10.2+2.1 1 1.7+2.2 ~773+Т75 2.9+1.2 1.0+0.7 0.5+0.5 3.9 + 1.4

В-1ЛШ70 10 24 ' 130 12.3+2.9 12.3+2.У 8.5+2.4 3.8+1.7 0.0+0.8 0.0+0.8 5.3+2.0

100 270 18.5+1:3' 20.4+2.4' ТП5+ТЖ1 3.3+1.1 4.1+1.2 1.5+0.7 3 011.0

КонтроЛ! 6 250 9.2+1.8 10.0+1.9 4.0+1.2 2.4+1.0 '3.6+1.2 0.0+0.4 0.810.6

ЦФ 50 6 145 '24.1+3.5' 26.9+3.71 6.9+2.1 13.1+2.8' 3.4+1.5 3.4+1.5 4.8+1.8

ЦФ+В-БТШ70 5ЧГГШ7В 50+100 6 130 12.3+2.9 13.1+3.0 5.4+2.0 9.1 +2.7 6.9+2.2 "ШТЗ.З' 0.8+0.8 0.0+0.8 3.011.5

100 6 130 20.8+5.5' 0.91,0.9 0.9+0.9 ТИ+ТП~ 4.5+2.0 ТП+ОХ

Кон грол( 560 9.8+1.2 11.2+1.4 5.04 0.9 2.8+0.7 3.0+0.7

ЦФ 50 24 ' 540 20.2+1.7' 24.2+1.81 14.1 + 1.5' 5.0+0.9 4.110.8 1.1+0.4 1-3+0.5

ЦФ+ В-БТШ70 ¡-БТШ70 50+100 24+6- 115 11.3+3.0 12.2+3.1 4.3+1.9 2.6+1.5 2.6+1.5 2.6+1.5 4.3+1.9

100 6 " 1за 20.8+3.5' 29.2+4.0 10.0+2.6 16.2+3.2' 2.3+1.3 0.910.9 3.8+1.7

50 6+|8ь 525 24.0+2.4' 31.0+2.5' 14.8+'2.0' 7.1 + 1.4' 7.2+1.4' 2.1+0.8 2.1+0.8

ЦФ+ В-БТШ70 50+100 6+18- 435 18.8+1.9' 20.9+1.9' 12.2+1.6' 6.2+1.2 1.8+0.6 0.710.4 6.0+1.1

В-КТШ70 100 6+18" 270 25.2+4.3' 33.0+2.8' 14.4+2.1 8.6+1.7' 7.8+1.6' 2.2+0.9 4.8+1.3

' достоверно отличается от соответствующего контроля (Р<0.01) "-введение ЦФ за 24 ч до фиксации, за 6 ч до фиксации добавлен в-БТШ70. б- введение агента на 6ч с последующим культивированием 18 ч па чистой среде до фиксации.

"-введение ЦФ и в-БТШ70одновременно на 6ч с последующим культивированием 18 ч на чистой среде до фиксации

С целью выяснения причин генотоксичности В-БТШ70 было исследовано влияние денатурированного белка на хромосомную изменчивость. Полученные данные свидетельствуют о том, что защитный эффект В-БТШ70 сохраняется до тех пор, пока не нарушена его нативная конформация.

Важно было выяснить, зависит ли характер защитного действия В-БТШ70 на хромосомы от фазы митотического цикла. Частично ответ на этот вопрос дают результаты, представленные на этой же таблице. Показано, что при введении В-БТШ70 за б ч до фиксации в обработанную ЦФ в течение 24

ч культуру имеет место достоверное снижение количества хромосомных аберраций по сравнению с их раздельным действием до уровня контроля. Введение же В-БТШ70 одновременно с ЦФ на 6 ч с последующим культивированием в течение 18 ч на чистой среде до фиксации вызывает неоднозначный эффект. А именно, при одновременном введении ЦФ и В-БТШ70 на 6 ч и последующем культивировании на чистой среде в течение 18 ч до фиксации не наблюдается достоверного уменьшения частоты клеток с хромосомными аберрациями по сравнению с раздельным действием агентов, но по количеству всех аберраций имеют место достоверные различия как при сравнении с контролем, так и с раздельным действием агентов, т.е. имеет место небольшой защитный эффект, причем исключительно за счет уменьшения количества дицептриков. В данном случае действие агентов осуществляется, по-видимому, в поздней 01 - ранней фазе Б. Эти данные свидетельствуют о том, что дицентрики, характерные для "безмаркерных" линий при разных воздействиях в условиях длительного культивирования могут появляться и при некоторых кратковременных воздействиях. Обращает внимание факт исчезновения дицентриков при совместном действии ЦФ и В-БТШ70, тогда как хромосомные разрывы не подвергаются модификации, что, возможно, связано с разным значением этих хромосомных нарушений для клетки. Из совокупности представленных результатов следует, что защитное действие на хромосомы В-БТШ70 оказывает в большей степени в фазе С2 митоти-ческого цикла. Возможно, что В-БТШ70 защищает топоизомеразу II - фермент, который принимает участие в репарации ДНК и в то же время является мишенью для ЦФ [67,80,81]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при действии В-БТШ70 на интактные клетки всегда наблюдается генотоксический эффект. В литературе также имеются данные, когда один и тог же агент, в том числе и БТШ70, оказывает мутагенное или антимутагсн-ное действие в зависимости от условий [77-79].

Характерные черты дицентриков, возникающих в "безмаркерных" клеточных линиях в процессе культивирования в разных условиях

Нам удалось показать, что характерной чертой кариотипической изменчивости в "безмаркерных" клеточных линиях при длительном культивировании в разных условиях являются дицентрики, образованные на основе те-ломерных ассоциаций. Установлено несколько характерных черт дицентриков (Полянская, 2000; Полянская и др., 20006).

1. Постоянное появление дицентриков с определенной частотой, преимущественно при длительном воздейст вии разных по своим свойствам факторов в процессе культивирования "безмаркерных" клеточных линий (рис. 4, 5). Наблюдается разная степень увеличения количества дицентриков: их число может превышать уровень всех остальных хромосомных аберраций, может соответствовать этому уровню или быть несколько ниже. Из данных рис. 6 следует, что при микоплазменной контаминации "маркерных" клеточных линий количество дицентриков не увеличивается по сравнению с интактным контролем. Хромосомная изменчивость в этих линиях имеет иной характер по сравнению с "безмаркерными".

2. Отсутствие постоянной взаимосвязи с другими типами хромосомных нарушений и наличие определенной количественной динамики дицентриков (рис. 7-10). Как видно из приведенных примеров, постоянный повышен-

30 60 90 120

1 - - - 2 —•— 3 - о- - 4

Рис. 7. Зависимость количества дицентриков и остальных типов хромосомных аберраций в клетках линии М и сублинии МТ от длительности культивирования с «терапевтическими» дозами антибиотиков.

По сои абсцисс: длительность культивирования, сут; по оси ординат: частота встречаемости хромосомных аббераций, %.

1 - количество дицентриков при введении антибиотиков сразу после декриокон-сервации (М); 2 - количество остальных типов хромосомных аберраций при введении антибиотиков через 60 сут после декриоконсервации (М); 3 - количество дицентриков при введении антибиотиков через 60 сут после декриоконсервации (МТ); 4 -количество остальных типов хромосомных аберраций при введении антибиотиков через 60 сут после декриоконсервации (МТ).

ный уровень количества дицентриков не влечет за собой повышение уровня других хромосомных аберраций, что может свидетельствовать об отсутствии нарушений при прохождении анафазы этими структурами, т.е. о нормальной сегрегации хромосом в митозе.

3. Преимущественное участие определенных хромосом в образовании ди-

Рис. 8. Зависимость количества дицентриков и остальных типов хромосомных аберраций в клетках линии М от культивирования с М. агдтЫ.

сь

х дицентрики • хромосомные разрывы

х дицентрики • хроматидные разрывы

100 110 120 130 140 150 160 170 160

х дицентрики

* аберрации обменного типа_

Рис. 9. Зависимость количества дицентриков и хромосомных разрывов (а), хроматидных разрывов (6), аберраций обменного типа (в) в клетках линии М от культивирования с А. агдттг

центриков. При исследовании влияния разных воздействий на клетки линий фибробластов кожи индийского мунтжака показано, что хромосомы 1, 2 (реже X) преимущественно участвуют в образовании дицентриков; часто встречающиеся сочетания 1+2 и 1+Х с преимущественным участием ч-плеча хромосомы 2. Для линии N151.-3-17 преимущественно участвуют в эгом процессе хромосомы 1^-плечо) и 4.

20 40 60 80 100

х дицентрики в контаминированной культуре • дицентрики в контрольной культуре

20 40 60 80 100

* хроматидные разрывы в контаминированной культуре

• хроматидные разрывы в контрольной культуре

Рис. 10. Зависимость количества дицентриков (а) и хроматидных разрывов (б) в контаминированных А. агдЫЫ и контрольных клетках линии БК-иТ-1 В от длительности культивирования.

Учитывая перечисленные свойства дицентриков, можно заключить, что образование дицентриков в "безмаркерных" клеточных линиях носит универсальный характер. Возможно, что роль дицентриков в данном случае состоит не в создании кариотипической нестабильности, а наоборот, в образовании генетических структур, обеспечивающих систему адаптации клеточной популяции к неблагоприятным факторам. Возможно, что образование дицентриков стабилизирует теломерную ДНК [82].

Указанные выше свойства дицентриков позволяют предположить их постоянное существование на некотором отрезке времени, что возможно при инактивации одного из центромер [83-87]. В этом случае в процессе длительного культивирования возможно участие отбора в стабилизации определенных дицентриков. Можно рассмотреть три положения в поддержку этой точки зрения. I) В наших экспериментах показано, что способность образо-

вывать дицентрики свойственна всем хромосомам в любых сочетаниях, и следовательно, должен существовать механизм, обеспечивающий реально наблюдаемые разные количественные соотношения между дицентриками. 2) Имеют место различия между преимущественным участием определенных хромосом в образовании дицентриков при кратковременном воздействии (Полянская и др., 1997) и при разных длительных воздействиях. 3) Известно, что наиболее устойчивыми являются варианты дицентриков с короткими расстояниями между центромерами [88]. В наших же экспериментах, наоборот, преимущество при образовании дицентриков имеют длинные хромосомы. Можно провести аналогию между частотами встречаемости дицентриков и нестабильных маркеров, часто наблюдаемых в "маркерных" клеточных популяциях. Генетическое значение, которое имеют маркеры и дицентрики в клеточных популяциях, вероятно, сходно. В обоих случаях, видимо, имеет место эффект положения, и следовательно, изменение функционирования некоторых генов. Но возможны различия в степени изменения генной экспрессии. Это может быть связано с тем, что образование маркерных хромосом обусловлено реальными хромосомными разрывами, в результате которых часто возникают перестройки обменного типа, а образование теломерных ассоциаций происходит при слиянии теломер, по-видимому, без участия тех механизмов, которые задействованы при возникновении хромосомных аберраций [15 -17,89 - 93].

Следует отметить, что дицентрики, образованные на основе теломерных ассоциаций, встречаются и в других клетках, но это достаточно редкое явление. Так, дицентрики наблюдаются в клетках человека, преимущественно в определенных типах опухолей, в нескольких опухолевых клеточных линиях, в стареющих фибробластах, при вирусной трансформации первичных клеток и при некоторых незлокачественных синдромах [17,90,94,95]. Но свойства этих дицентриков неоднозначны в разных случаях. По-видимому, подобно хромосомным перестройкам, их роль может быть различной в разных биологических системах. В наибольшей степени свойства дицентриков, установленные в наших экспериментах, сходны с таковыми диценгриков, наблюдавшихся в фибробластах человека при старении [96].

Действие факторов, как правило присутствующих при длительном культивировании, и факгоров, влияющих на жизнедеятельность клеток, на количественную кариотипическую изменчивость в разных клеточных линиях

Кроме структурной изменчивости кариотипа, в клеточных популяциях in vitro имеет место количественная кариотипическая изменчивость. И если структурная изменчивость хромосом, способствующая образованию маркеров, наблюдается не во всех клеточных линиях, то количественная изменчивость всегда сопровождает образование любой клеточной линии. Поэтому параллельно с изучением структурной изменчивости хромосом, в наших экспериментах анализировался и характер анеуплоидии.

Совокупность полученных нами результатов, а также ряд данных литературы, свидетельствуют о том, что кариотипическая структура клеточных популяций in vitro, как правило, имеет несколько характерных черт: 1) клетки с модальным числом хромосом, выраженным в большей или меньшей степени; 2) клетки с другими числами хромосом и, в частности, с субмодаль-

ным; 3) постоянные пределы изменчивости по числу хромосом; 4) клетки с любым выраженным числом хромосом имеют преобладающий СВК, который в клетках с модальным числом хромосом называется основным; 5) клетки с любым числом хромосом имеют дополнительные СВК. При варьировании условий длительного культивирования могут происходить изменения в характере анеуплоидии, которые выражаются в следующем: 1) изменение частоты клеток с определенным числом хромосом, включая модальное, при постоянстве среди них количества клеток с преобладающим или основным СВК; 2) изменение частоты клеток с определенным числом хромосом и одновременное изменение доли клеток с преобладающим или основным СВК среди них; 3) появление новых СВК; 4) изменение пределов изменчивости по числу хромосом. В результате могут образовываться новые устойчивые сублинии, адаптированные к измененным условиям существования клеточной популяции.

Наглядным примером могут служить результаты, представленные на рис.11, где показано влияние сыворотки на количественную кариотипичес-кую изменчивость клеток М (Полянская и др., 1993). При культивировании клеток с 10% сыворотки серии 181 в течение 45 -120 сут имеет место изменение характера распределения клеток по числу хромосом. После 120 сут культивирования частота клеток с модальным числом хромосом достоверно уменьшается, а частота клеток с 9 и 10 хромосомами достоверно увеличивается. Следовательно, имеет место равная частота встречаемости клеток с 6, 7, 9 и 10 хромосомами (22.0±2.9, 25.0+3.1, 20.0±2.8 и 22.0+2.9%, соответственно). Анализ частоты встречаемости разных СВК показал, что для клеток с модальным числом хромосом характерен основной СВК 2+2+1 + 1 + 1; для клеток с субмодальным числом хромосом характерен СВК 2+2+1 + 1; для клеток с 9 хромосомами-СВК 3+3+2+1 идляклетокс 10 хромосомами - СВК 3+4+2+1. Эти результаты свидетельствуют о том, что клетки с лго-

ЬО

30 -

го -

10 Г Л ..п Г

10 - 6

10 - — - _

го - -

>0 - т -

е е

30 - -

го - г- — -

10 г - -

* 1 в 7 9 ю и /2 > !г с 5 6 7 в Я ю тг >1г

Рис. 11. Распределение по числу хромосом клеток линии М, культивируемых в среде с сво-роткой серии 181.

По сои абсцисс: число хромосом в клетке; по оси ординат: частота встречаемости клеток, %.

а-в - культивирование в среде с 10% сыворотки в течение 45, 90 и 120 сут, соответственно; г-е -культивирование в среде с 10% сыворотки в точение 30 сут, а затем в среде с 3% сыворотки в течение 15, 60 и 90 сут, соответственно.

и]

Ы]

1} 15 17 13 !1 >25 11 75 П 19 11 >25

О 1 1 2

: Л

1.1. II гт^Г

" « л »» ц 5 В и 22 <,0 4» 52 55

3 60 л 2

Ьк^г-Л о

40 46 49 52 Ь5 25

40 46 49 52 5Ь

Рис. 12. Распределение по числу хромосом клеток линий М (а), N{51.-3-17 (б), У-79 (в), БК-иТ-1В (г), М НеЬа с1опе11 (д) при длительной контаминации Лс/го/ер/аята 1аШ1аиги.

1 - интактный контроль; 2 - контаминированные клетки.

бым числом хромосом, встречающиеся с заметной частотой, всегда имеют преобладающий СВК. Частота СВК в основном не изменяется в процессе культивирования в течение 120 сут. Но есть и исключения: частота СВК 3+4+2+1 увеличивается (Р<0.05). Пределы изменчивости по числу хромосом всегда постоянны и составляют 5 -12. Уменьшение содержания сыворотки приводит к перераспределению клеток с разным числом хромосом (рис.11).

Другим примером могут служить результаты, представленные на рис. 12, где показано влияние длительной микоплазменной контаминации А. 1а1(11а\т на количественную кариотипическую изменчивость в разных клеточных линиях (Полянская, Ефремова, 1993, 1994, 1996, 2000; Полянская и др., 1998). Существенный результат, который следует из этих данных, состоит в том, что в клеточных линиях М, У-79, ЫВЬ-3-17 микоплазменная контаминация либо не вызывает изменения в распределении клеток по числу

хромосом, либо вызывает небольшие нарушения, заключающиеся в изменении модального числа хромосом на 1 по сравнению с контролем. Пределы изменчивости по числу хромосом не изменяются. В контаминироваиных же клетках SK-UT-1B и М HeLa clone 1 (существенно изменяется характер распределения клеток по числу хромосом по сравнению с контролем и выше перечисленными линиями. А именно, существенно расширяются пределы изменчивости по числу хромосом по сравнению с контролем (28 - 55 и 40 - 48 хромосом, для SK-UT-1B; 25 - 53 и 35 - 53 хромосомы для М HeLa clone 11). Анализ этих распределений с помощью критерия у} показал достоверные различия между опытными и контрольными вариантами (Р<0.01). Предположительно, наблюдаемые различия связаны с опухолевым происхождением этих линий и возможным наличием у них свойства злокачественности. Так, похожие изменения обнаружены при некоторых воздействиях в других высоко злокачественных линиях [97-100].

При исследовании влияния генотипической среды на характер анеупло-идии в гибридах между клетками JF1 и М2 показано, что через 85 - 128 сут культивирования гибридов, в них устанавливается новая структура карио-типа мунтжака: модальное число хромосом равно 3, основной СВК 1+2+Y2, пределы изменчивости 1-6 хромосом. Следовательно, изменение генотипической среды приводит к неслучайным количественным нарушениям в ка-риотипе мунтжака. В связи с этими данными существенно привести результаты, полученные при исследовании двух клеточных гибридов между клетками JF1 и NIH3T3, где показано сходство по ряду признаков клеточной поверхности. Тем не менее, с помощью дифференциальной окраски па С -диски, по-разному проявляющейся на хромосомах мыши и крысы, обнаружены существенные различия между этими гибридами по составу кариоти-па: гибрид Н9-1 содержит около двух геномов линии крысы и менее 15% генома клеток линии мыши, а гибрид Н9-2 содержит по одному геному клеток родительских линий (Фридлянская и др., 1983).

Возможно, что имеются определенные пределы количественной изменчивости в гибридной клеточной популяции. Эти пределы ограничены функциональной активностью генов, ответственных за определенные клеточные свойства, которые селективно выгодны в данной популяции. Это предположение подтверждается как собственными данными, так и литературными [101,102].

Таким образом, образование и дальнейшее существование любой постоянной клеточной линии, по-видимому, связано с установлением баланса между клетками, имеющими разное число хромосом и разные СВК. Поиску количественных закономерностей ограничений кариотипической изменчивости, обусловливающих образование сбалансированной кариотипической структуры, посвящена следующая часть работы (Полянская, 1999; Полянская, Самокиш, 1999 а, б, в, г).

2.5. Анализ закономерностей количественной кариотипической изменчивости в разных клеточных линиях

Мы впервые провели статистический анализ отклонений по числу хромосом от их количества в основном СВК и, что особенно важно, исследовали корреляции между разными хромосомами при одновременных, как од-

ненаправленных, так и разнонаправленных о тело нениях от основного СВК. Основная часть работы в этом направлении была проведена на "безмаркерных" линиях, которые явились удобной моделью для изучения количественных закономерностей указанных ограничений в связи с их минимальной ка-риотипической гетерогенностью. Из таких линий были выбраны те, которые имеют малое число крупных, легко идентифицируемых при рутинной окраске хромосом (М, МТ и М2 и ЫВЬ-3-11). Было проведено сопоставление данных, полученных на "безмаркерных" и "маркерных" линиях с целью возможного обобщения полученных результатов для клеточных линий с разной структурой кариотипа. В качестве "маркерных" линий были исследованы клональные линии яичника китайского хомячка (Полянская и др., 1981).

Установлено, что для выживания клеточной популяции в культуре действительно необходимо существование в ней клеток с конкретными вариантами кариотипов. Закономерности, определяющие кариотипическую структуру, следующие: 1) неслучайный характер распределения клеток по числу отклонений от основного СВК, 2) специфический характер отклонений каждой хромосомы от основного СВК, 3) наличие связей между отдельными хромосомами при одновременных численных отклонениях.

При анализе совместных отклонений по числу хромосом от основного СВК, в результате которых образовались дополнительные СВК в клетках М, МТ и М2, доказано, что существуют достоверные корреляции между хромосомами, г.е. появление этих СВК неслучайно (табл.2).

Таблица 2

Сравнение наблюдаемого и ожидаемого количества клеток с одновременными численными отклонениями от основного СВК _по нескольким хромосомам'_

Допол- Наблю- Наблю- Ожида- Ожида- X2

нитель- даемое даемая емая час- емое коли-

ные количес- частота тота чество со-

СВК тво сочетаний сочетании сочетании четаний

3+3+1±2_| 103 0.04 0.001 2.3 4409

3+3+2+1 21 0.009 0.0008 1.8 2054

3+4+2+1 25 0.011 0.0007 1.6 342

2+2+1+1 510 0.226 0.48 1085 305

'-объем выборки 2260 клеток; критическое значение X2' 11-34

Следовательно, выдвинутое ранее предположение о том, что отбор в клеточной популяции идет не по отдельным хромосомам, а по сбалансированному кариотипу, получило подтверждение. Кариотипическая изменчивость в значительной степени обусловлена взаимодействием хромосом при добавлениях или потерях их по сравнению с основным СВК.

Тем не менее, несмотря на существование общих закономерностей, каждая клеточная линия имеет свои специфические особенности. Так, в каждой линии мунтжака наблюдается определенная, отличная от других, частота отклонений по числу хромосом от основного СВК, разная частота отклонений по одинаковым хромосомам (табл. 3), небольшие различия по характе-

ру связей между хромосомами при одновременных численных отклонениях.

Также имеют место различия по характеру связей между отдельными хромосомами при одновременных отклонениях между линией ЫВЬ-3-11 и линиями М, МТ и М2. В линии ЫВЬ-3-11 эти связи носят либо однонаправленный характер в основном в сторону увеличения числа хромосом, либо разнонаправленный. В линиях мунтжака наблюдается в основном однонаправленный характер численных одновременных отклонений, либо в сторону увеличения, либо - уменьшения по сравнению с основным СВК. Можно предположить, что именно такой характер отклонений в разных клеточных линиях способствует генетической стабильности и селективно выгоден, т.к. эти линии произошли и от разных видов животных и из разных тканей.

Таблица 3

Сравнение тенденций по численным отклонениям хромосом в клеточных линиях М, МТ и М2

Хромосома м МТ М2

1 трисомия дисомия дисомия

2 три-тетрасомия дисомия ди-трисомия

X дисомия нуллисомия моносомия

V, дисомия моносомия дисомия

V, нуллисомия - -

Известно, что существует функциональная связь между генами, ответственными за геномную стабильность и анеуплоидию, а также локализация функционально связанных генов в разных хромосомах [103-105]. В связи с этим возможно, что стабильность кариотипической структуры клеточной популяции, обеспечивающаяся, в частности, характером одновременных численных отклонений хромосом, зависит от взаимодействий на уровне функциональной активности генов. В пользу предположения о регуляции структурно-функциональной организации кариотипа через активность генов, свидетельствуют некоторые экспериментальные результаты, полученные на других моделях. При статистическом анализе корреляций между ЯОР хромосом показан компенсаторный механизм, регулирующий поведение хромосом, несущих ядрышковые организаторы [106,107].

3. Заключение

Нам удалось обнаружить корреляции между статистически выявленными и морфологически выраженными (структурными) закономерностями кариотипической изменчивости. Так, исследование количественной кариотипической изменчивости при индукции хромосомной нестабильности с помощью микоплазменной контаминации и соматической гибридизации клеток (Полянская, Фридлянская, 1991; РоЦапвкауа й а1.,1999; Полянская, Самокиш, 1999 г; Полянская,2000) показало, что основные закономерности, установленные на интактных культурах, не нарушены. Тем не менее отмечены некоторые изменения в характере отклонений индивидуальных хромосом, а также нарушение некоторых связей между хромосомами. В результате сопоставления количественных и структурных изменений было отмечено: 1) образование дицентриков при микоплазменной контаминации про-

исходит именно теми хромосомами, между которыми нарушены связи при одновременных отклонениях; 2) имеет место связь между неслучайной сегрегацией определенных хромосом мунтасака в клеточном гибриде, JFlxM2, и участием несегрегированных хромосом в образовании дицептриков. На основании этих наблюдений выдвинуто предположение, что в "безмаркерных" линиях закономерности количественной изменчивости, установленные при анализе СВК, и тенденции морфологических изменений кариотипа (ди-центрики) представляют собой проявления единой клеточно-популяцион-ной функции в различных степенях выражения. При этом появление дицептриков может рассматриваться как одно из проявлений анеуплоидии. В отличие от организма, где существует много способов поддержания устойчивой кариотипической структуры, в условиях in vitro основное влияние на эти процессы оказывают непосредственные клеточные контакты и условия культивирования. Поэтому характер структурно-функциональных связей в кариотипе может изменяться, способствуя адаптации клеточной популяции к новым условиям. Приведенные нами результаты позволяют предположить наличие по крайней мере двух способов адаптации клеточных популяций к условиям in vitro: i) образование дицептриков и изменения в регуляции генной активности; 2) стабилизация определенной цитогенетической структуры в популяции (СВК). По-видимому, в клеточной популяции реализуется состояние, которое можно назвать кариотипическим гомеостазом; в целом наблюдаемые явления, морфологически выраженные и статистически выявленные, характеризуют процессы, составляющие такой гомеостаз.

4. Выводы

1. Факторы, как правило присутствующие при длительном культивировании постоянных клеточных линий без маркерных хромосом (фиброблас-ты кожи индийского мунтжака и почка кенгуровой крысы), систематически способствуют образованию дицептриков (теломерных ассоциаций). В этом отношении исследованы: антибиотики в "терапевтических" дозах, длительность хранения без DMSO в жидком азоте, качественно разные сыворотки (в варьирующих концентрациях), продолжительность культивирования. Тот же эффект наблюдается при действии и других факторов, влияющих на жизнедеятельность клеток "безмаркерных" линий (фибробласты кожи индийского мунтжака, почка кенгуровой крысы, лейомиосаркома человека, легкое эмбриона человека) в процессе длительного культивирования. В этом отношении исследованы: изменение генотипической среды в клеточных гибридах, микоплазменная контаминация, антибиотик ципрофлоксацин (ЦФ) в генотоксичных дозах. Из наших и литературных данных следует, что в постоянных клеточных линиях с маркерными хромосомами при длительном культивировании в разных условиях образование дицептриков не наблюдается.

2. Возникающие дицентрики характеризуются: постоянным появлением их с определенной частотой при действии разных по своим свойствам факторов; отсутствием постоянной взаимосвязи с другими типами хромосомных нарушений, наличием определенной количественной динамики при отсутствии усиления хромосомной нестабильности; преимущественным образованием их определенными хромосомами. Совокупность этих свойств по-

зволяет предположить, что появление дицентриков в "безмаркерных" линиях связано с созданием генетических структур, обеспечивающих систему адаптации клеточной популяции как целостного образования к неблагоприятным условиям культивирования.

3. Дицентрики в "безмаркерных" клеточных линиях могут возникать не только при длительных , но и при кратковременных воздействиях в течение одного митотического цикла. Появление дицентриков в этом случае зависит от характера и времени воздействия. В частности, показано, что при раздельном действии ЦФ и внеклеточного белка теплового шока (в-БТШ70) на фибробласты кожи индийского мунтжака предположительно в конце G1 - начале фазы S наблюдаются дицентрики, которые при совместном действии этих факторов не обнаруживаются. По-видимому, В-БТШ70 оказывает защитное действие на индуцированную ЦФ хромосомную нестабильность, которое в наибольшей степени проявляется в фазе G2 митотического цикла.

4. При действии на клетки "безмаркерных" и "маркерных" клеточных линий неопухолевого происхождения (фибробласты кожи индийского мунтжака, почка кенгуровой крысы, легкое эмбриона человека, легкое китайского хомячка, яичник китайского хомячка) антибиотиков в "терапевтических" дозах, ЦФ в генотоксичных дозах, качественно разных культуральных сред и сывороток (в варьирующих концентрациях), при клонировании, а также при микоплазменной контаминации и изменении генотипической среды в условиях длительного культивирования возникают существенно однотипные изменения в количественных характеристиках кариотипа: в соотношении доли клеток с модальным, субмодальным и другими числами хромосом; в соотношении основного и дополнительных структурных вариантов кариотипа (СВК). В клетках с данным числом хромосом выявляется преобладающий СВК, который, возможно, имеет селективное преимущество. Пределы изменчивости по числу хромосом остаются устойчивой характеристикой при любых воздействиях.

5. В клеточных линиях опухолевого происхождения как в "безмаркерной", так и в "маркерной" (лейомиосаркома человека и карцинома шейки матки человека), в отличие от неопухолевых линий, при длительной микоплазменной контаминации имеет место значительное расширение пределов изменчивости по числу хромосом. Эти результаты в совокупности с данными литературы позволяют предположить, что причиной наблюдаемой нестабильности структуры кариотипа является опухолевое происхождение этих линий, возможно, связанное с наличием свойства злокачественности.

6. Статистический анализ индивидуальных кариотипов, проведенный на большом числе клеток "безмаркерных" и "маркерных" линий (фибробласты кожи индийского мунтжака, почка кенгуровой крысы, яичник китайского хомячка) в отсутствие каких-либо воздействий показал, что для выживания клеточной популяции in vitro необходимо существование в ней в определенном соотношении клеток с разными СВК. Выявляются: неслучайный характер распределения клеток по числу хромосомных отклонений от основного СВК; специфический характер отклонений каждой хромосомы ог основного СВК; наличие достоверных связей между отдельными хромосомами при одновременных численных отклонениях. Установленные законо-

мерности свидетельствуют о том, что отбор в клеточных популяциях идет не по отдельным хромосомам, а по сбалансированному кариотипу. При микоплазменной контаминации линии фибробластов кожи индийского мун-тжака имеют место небольшие изменения в характере отклонений индивидуальных хромосом и частичные нарушения связей между хромосомами при одновременных отклонениях, не изменяющие основные количественные закономерности, установленные для интактных культур.

7. Закономерности количественной изменчивости, установленные при анализе СВК и тенденции морфологических изменений кариотипа (дицент-рики), представляют собой проявления единой клеточно-популяционной функции в различных степенях выражения. В пользу этого положения свидетельствуют: образование дицентриков при микоплазменной контаминации именно теми хромосомами, между которыми нарушены связи при одновременных отклонениях; связь между неслучайной сегрегацией определенных хромосом мунтжака в гибриде между клетками клона саркомы Йен-сена и фибробластами кожи индийского мунтжака и участием несегрегиро-ванных хромосом в образовании дицентриков.

8. Предполагается, что клеточные популяции могут адаптироваться к условиям in vitro, по крайней мере, двумя способами: 1) образованием дицентриков и изменениями в регуляции генной экспрессии; 2) стабилизацией определенной цитогснетической структуры в популяции (СВК). Эти способы могут быть как взаимодополняющими, так и взаимозаменяемыми на разных стадиях существования клеточной популяции. В целом в клеточной популяции реализуется состояние, которое можно назвать кариотипическим гомеостазом; наблюдаемые явления характеризуют процессы, составляющие такой гомеостаз.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Лобашев М. Е и др. Журн. эволюц. биохим. физиол. 1973. 9 (4): 398406. 2. Бахтин Ю.Б. 1980. Генетическая теория клеточных популяций. Л.: Наука. 168 с. 3. Дюжикова Н.А. и др. 1997. Генетика. 33 (8): 1077 - 1082. 4. Jacobs P. A. et al. 1961. Nature. 191: 1178. 5. Ford J. H„ Russel J. A. 1985. Am. J Hum. Genet. 37:973 - 983. 6. Martin R. H. 1995. Proc. on chromosome segregation andaneuploidy. Edit, by A. Abbondandolo, B.K. Vig, R.Roi. April 24-29, Sorrento, Italy: 230 - 239. 7. Nath et.al.1995. Chromosoma. 103: 725 -731. 8. Subak - Sharpe H. et al. 1966. Heredity. 21: 342-343. 9. Cox R. P. et al. 1972. Exp. Cell Res. 74: 251-268. Ю.Терци M. 1977.Генетика и животная клетка. М: Мир,291 с. 11. Албертс Б. и др. 1994. Молекулярная биология клетки. М.: Мир. Т. 2. 540 с. 12. WolmanS. R. et al. 1964. Cytogenetics. 3:45-61. 13. Wolman S. R. et al. 1980. Canccr Genet. Cytogenet. 2: 39 - 46.14. Moorhead P. S., Saksela E. 1965. Hereditas. 52: 271-284. 15. Counter С. C. et al. 1992. EMBO. 11: 1921-1929. 16. Reddel R. R. 1998. In: Annales of the New York Academy of Science. 854:8 - 19.17. Ducray C. et al. 1999.0ncogene. 18:4211 -4223. 18. Фридлянская И. И., 1984. В кн.: Биология клетки в культуре. Л.: Наука. 50 - 100.19. Турилова В. И. и др. 1998. Цитология. 40 (6): 536 - 548. 20. Hughes D.T. 1968. Nature. 217:518-523.21. Catalan J. etal 1995. Cytogenet. Cell Genet. 68: 11 - 16. 22. Мамаева C.E. 1996. Цитология. 38 (8): 787-814.

23. Mamaev N., Mamaeva S. 1990. Int. Rev. Cytol. 121: 233 - 266. 24. Kraemer P.M. et al. 1972. Adv. Cell Mol. Biol. 2: 47 - 108. 25. Розанов Ю. M. И др. 1984. Цитология. 26 (9) 1079 - 1080. 26. Shaw M. W., Krooth R. S. 1964. Cytogenet. 3: 19 -33. 27. Grewal M. S. et al. 1971. Exp. Cell Res. 69: 241-244. 28. Brown J.A., Cohen M.M. 1973. Canad. J. Genet. Cytol. 15:135-143. 29. Chen T. R., 1988. Cancer Genet. Cytogenet. 33: 77 - 81. 30. American type culture collection. Catalogue of cell lines and hybridoms. 1988,1992. Rockville. 31. Филатов M.B. и др. 1988. Цитология. 30 (8): 999 -1007. 32. Мамаева С.Е. и др. 1986. Цитология. 28 (2): 193-203. 33. Zakharov A.F. et al. 1964. J. Natl. Cancer Inst. 33: 935-956. 34. Захаров А.Ф. и др. 1966. Цитология. 8 (2): 193201. 35. Levan G.1970. Hereditas. 64: 85 - 96. 36. Yuasa Y. et al. 1978. GANN. 69: 441 - 446. 37. Yamaguchi N., Huh N. 1979. J. Gen. Virol. 42: 289 - 296. 38. Lewis I.L. et al. 1981.Mutat. Res. 88: 211 - 216. 39. Pillidge L. et al. 1986. Int. J. Radiat. Biol. 50:119 -136.40. Pillidge L. et al. 1986. Mutat.Res. 166: 265-273. 41.SeabrightM. A. 1971. Lancet. 2:971 - 972. 42. Sumner A. T. 1972. Exp. Cell Res. 75: 304 - 306. 43. Paul J., 1975. Cell and tissue culture. Edinburgh: Livingstone. 490 p. 44. Николаенко H.C. и др. 1990. Тезисы докл. 3-го Всесоюзного совещания "Культивирование клеток человека и животных". М.: 41 - 44. 45. Chen Т. R. 1977. Exp. Cell Res. 104: 255 - 262. 46. Mowles J. M., 1988. Cytotechnology. 1:355 - 358. 47. Schmitt К. et all988. J. Immunol. Meth. 109:17 - 25. 48. Brown J. A., Cohen M.M.I 973. Canad. J. Genet. Cytol. 15:145154. 49. Welch W. J., Feramisco J.R., 1985. Mol. Cell Biol. 5: 1229 - 1236. 50. Laemmli U. K. 1970. Nature. 227: 680 - 685. 51. Bradford M. M. 1976. Anal. Biochem. 72: 248 - 254. 52. Ashwood-Smith M. J., Friedmann G. B. 1979. Cryobiology. 16: 132 - 140. 53. Rudd N. L. et al 1989. Genome. 32: 196 - 202. 54. Семенова E. Г. 1988. биология. (1): 17 - 20. 55. Семенова E. Г. 1989. Криобиология. (3): 20 - 24.56. Навашин М. С., Герасимова Е. П. 1935. Биол. журн. 4 (4): 593 - 632. 57. Barnett В. М. 1972. Radiat. Res. 51: 131 - 141. 58. Сальникова Т. В., 1976. Генетика. 12 (2): 157 - 161. 59. Fulton А. М., Bond D. J. 1984. Mol. Gen. Genet. 197: 347 - 349. 60. Вепринцев Б. H. и др. 1989. Криобиология. N 2: 16 - 21. 61. Ryan A.J., Johnson R.T. 1996. Somat. Cell Mol. Genet. 22: 177 - 189. 62. Кузьмина С.В. 1983. Малигнизация нормальных клеток в условиях длительного культивирования in vitro. М. Наука. 228 с. 63. McGarrity G.J. et al. 1984. In Vitro. 20: 1 - 19. 64. Борхсениус C.H.,Чернова O.A. 1989. Микоплазмы. Л., Наука. 156 с. 65. Rottem S., Naot Y. 1998. Trends in microbiology. 6: 436 - 441. 66. De Vries G., Vogelzang A. 1967. Lancet. 1: 160 -161.67. Mukherjee A. et al. 1993. Mutat. Res. 301:87 - 92. 68. Liu L. F. 1989. Ann. Rev. Biochem. 58:351 - 375.69. Charron M., Hancock R. 1991. Chromosoma. 100: 97 - 102. 70. DownesC. S. et al. 1994. Nature. 372: 467-470. 71. Suzuki H„ NakaneS. 1994. Biol, and Pharm. Bull. 17: 222 - 226. 72. Poljak L„ Kas E. 1995. Trends in Cell Biol. 5: 348 - 355. 73. Sumner A. T. 1995. Proc. on chromosome segregation and aneuploidy. Edit, by A. Abbondandolo, B.K. Vig, R.Roi. April 24-29, Sorrento, Italy:121 -132.74. Smith P. J. S. et al. 1993. Biol. Bull. 185: 293 - 294. 75. Tytell M. et al. 1994. Neurosci. Res. 38: 19 - 31. 76. Jovtchev G. etal. 1993. Biol. Zbl. 112: 358 - 364. 77.Тихо-мирова M.M. и др. 1994. Генетика. 30 (8): 1097 - 1104. 78. Feder J. H. et al. 1992. Genes, Development. 6: 1402- 1413. 79. Voronin A.et al. 1995. Abstr. of ESF and Euroconferences meeting. Grete (Greece): 102. 80. Goswami P. C. et

al. 1996. Mol. Cell. Biol. 16: 1500 - 1508. 81. Samali A., Cotter T. G. 1996. Exp. Cell Res. 223: 163 - 171.82. Mac Donald C. et al. 1991. Exp. Cell Res. 195:458 - 461. 83. Earnshaw W. C., Migeon B. R. 1985. Chromosoma. 92: 290 - 296. 84. Therman et al. 1986. Hum. Genet. 72: 191 - 195.85. Zinkowski R. P. et al. 1986. Chromosoma. 94: 243 - 248. 86. Vig В. К. et al. 1989. Cancer Genet. Cytogenet. 38: 283 - 296. 87. Fukagawa T. et al. 1999. EMBO. 18: 4196 - 4210. 88. Sullivan B. A., Willard H. F. 1998. Nature Genet. 20: 227 - 228.89. Hastie N. D., Allshire R.C.I989. Trends Genet. 5: 326 - 321. 90. Saltman D. etal. 1993. Chromosoma. 102: 121 -128.91.ChongL. etal. 1995. Science. 270: 1663- 1667. 92. Ancelin K. et al. 1998. BioEssays. 20: 879 - 883. 93. Bailey S. M. et al. Pros. Natl. Acad. Sci USA. 1999.. 96: 14899-14904.94. Fett-ContcA. C. et al. 1993. Cancer Genet. Cytogenet. 69: 141 - 145. 95. Ray F.A. et al. 1992. Mutat. Res. 284: 265 - 275. 96. Benn P. A. 1976. Am. J. Hum. Genet. 28: 465 - 473. 97. Fogh J., Fogh H. 1967. Pros. Soc. Exp. Biol. Med. 126:67 - 74. 98. Fogh J., Fogh H. 1968. Pros. Soc. Exp. Biol. Med. 129: 944 - 950. 99. Saksela E. et al. 1960. Exp. Cell Res. 19: 402 - 404.100. Сорокина E. А. и др. 1988. Цитология. 30 (2): 197 - 203. 101. Gille J.J.P., Joenje H. 1989. Mutat. Res. 219: 231 - 240. 102. Fenech M. 1995. Proc. on chromosome segregation and aneuploidy. Edit, by A. Abbondandolo, B.K. Vig, R.Roi. April 24-29, Sorrento, Italy: 250 - 257.103. McKusick V. 1980. J. Hered. 71: 370 - 391. 104. Ouspenski I.I. et al. 1995. Proc. on chromosome segregation and aneuploidy. Edit, by A. Abbondandolo, B.K. Vig, R.Roi. April 24-29, Sorrento, Italy: 343-355.105. Strauss B. S. 1990. Mutat. Res. 233: 139 -150. 106. Monteagudo L.V., Arruga M.V. 1991. Caryologia. 44: 85 - 91.107. Nikolis J., Kekic V. 1988. Cytogenet. Cell Genet. 47:197 - 200.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ IIO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Malpoix P., Poljanskaya G. 1979. Dyserythropoietic cytological anomalies preceding changes in proliferation and differentiation. Adv. in Compar. Leukemia Res.: 65 - 66.

2. Полянская Г.Г., Абрамян Д.С., Глебов O.K. 1981. Кариотипическая структура клоновых популяций клеток китайского хомячка при длительном культивировании. Цитология. 23 (7): 818-830.

3. Глебов O.K., Полянская Г.Г., Пинаев Г.П. 1981. Идентификация изолированных метафазных хромосом. II. Сравнение с узнаваемостью хромосом в составе метафазных пластинок. Цитология. 23 (9): 1042 - 1045.

4. Фридлянская И. И., Полянская Г. Г., Блумквист Е., Татулян С. А., Пинаев Г. П. 1983. Экспрессия признаков, характеризующих клеточную поверхность, в гибридах малигнизированных и немалигнизированных клеток. Цитология. 25 (5): 593 - 600.

5. Полянская Г. Г., Смирнова Т. Д. 1987. Влияние микоплазм на цитоге-нетические характеристики клеточных линий. Цитология. 29 (9): 1100.

6. Полянская Г.Г. 1988. Кариотипическая характеристика клеточных сублиний почки кенгуровой крысы и фибробдастов кожи индийского мунт-жака. Цитология. 30 (6): 732 -738.

7. Полянская Г. Г., Дьяконова М. Ю. 1988. Влияние условий культивирования на кариотигшческую структуру клеточной сублинии почки кенгу-

ровой крысы. Цитология. 30 (11): 1355 - 1363.

8. Полянская Г.Г. 1989. Влияние условий культивирования на кариотн-пическую структуру двух клеточных сублиний фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 31(7): 807-817.

9. Полянская Г. Г., Семенова Е. Г., Шубин Н. А. 1990. Влияние криокон-сервации на цитогенетические характеристики клеточной сублинии фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 32 (3): 256 - 265.

10. Полянская Г.Г., Фридлянская И.И. 1991. Изменчивость хромосом индийского мунтжака в гибридах соматических клеток. Цитология. 33 (6): 86-94

11. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. 1992. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую структуру клеточной линии индийского мунтжака. Цитология. 34 (3): 82-88.

12. Freedlanskaya 1.1., Poljanskaya G,G., EfremovaT.N., PinaevG.P. 1992. Animal cell culture collection in Russia. In vitro. 28 (3, part 2): P169A

13. Полянская Г.Г., Сизова JI.С., Николаенко Н.С. 1993. Кариотипичес-кая характеристика линии фибробластов кожи индийского мунтжака при культивировании с разными сыворотками. Цитология. 35 (2): 86-96.

14. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. 1993. Влияние микоплазменной контаминации и деконтаминации с помощью ципрофлоксацина на кариотипическую структуру клеточной линии легкого китайского хомячка V-79. Цитология. 35 (8): 71-78.

15. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. 1994. Влияние контаминации микоп-лазмой культур фибробластов кожи индийского мунтжака и последующей деконтаминации культур с помощью ципрофлоксацина на кариотипическую структуру клеточной линии. Цитология. 36 (4): 393-400.

16. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., Фридлянская И. И. 1994а. Деконта-минация культивируемых клеток от микоплазм с помощью ципрофлоксацина: отсутствие гено- и цитотоксических эффектов. Цитология. 36 (6): 534.

17. Полянская Г.Г., Сизова Л.С., Ефремова Т.Н., Фридлянская И.И. 19946. Цитогенетическое исследование линии клеток легкого китайского хомячка V-79, инфицированной микоплазмой Mycoplasma arginini и декон-таминированной с помощью ципрофлоксацина. Цитология. 36 (8): 880-887.

18. Freedlanskaya 1.1., Drexler Н., Mac Leod R., Efremova Т. N., Vogcs M, Poljanskaya G. G. 1994. Mycoplasma infection and ciprofloxacin mycoplasma erradication in mammalian cell lines; Cytogenetical assay. ЮМ Lett. 3, P126: 308.

19. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. 1996. Влияние микоплазменной контаминации двух сублиний клеток почки кенгуровой крысы на кариотипическую структуру. Цитология. 38 (1): 75-84.

20. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., Сизова Л. С. 1996. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую изменчивость в клеточных линиях с разной структурой кариотипа. Цитология. 38 (2): 243 -244.

21. Полянская Г.Г., Сизова Л. С. 1996. Исследование генотоксического влияния ципрофлоксацина на культивируемые клетки почки кенгуровой крысы и фибробласты кожи индийского мунтжака. Цитология. 38 (9): 958 - 973.

22. Полянская Г.Г., Кинев A.B., Сакута Г.А., Асеева Е.В. 1997. Влияние внеклеточного белка теплового шока на хромосомную изменчивость в кле-

точной культуре фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 39 (11): 1070-1082.

23. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., Эндер Н.А. 1998. Влияние микоплаз-менной контаминации клеточной линии лейомиосаркомы человека SK-UT-1В на кариотипическую структуру. Цитология. 40 (1): 23-30.

24. Полянская Г.Г. 1999. Особенности количественной изменчивости ка-риотипа в клеточных сублиниях фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 41 (3/4): 305.

25. Полянская Г. Г., Самокиш В.А. 1999а. Особенности количественной изменчивости кариотипа в клеточной линии фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 41 (8): 729 - 734.

6. Полянская Г.Г., Самокиш В.А. 19996. Особенности количественной изменчивости кариотипа в клеточных суб линиях фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 41 (9):747 - 751.

27. Полянская Г.Г., Самокиш В.А. 1999в. Особенности количественной кариотипической изменчивости в клеточной линии почки кенгуровой крысы. Цитология. 41 (9): 758 - 763.

28. Полянская Г.Г., Самокиш В.А. 1999г. Исследование количественной кариотипической изменчивости при индукции хромосомной нестабильности в культивируемых клетках фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 41 (9): 752 - 757.

29. Poljanskaya G. G., Efremova Т. N.. Sakuta G. А. 1999. Kaiyotypic variability of "markerless" continuous cell lines. Mol. Biol. Cell, Suppl. Abstracts 39* ASCB annual meeting. 10: 282.

30. Каталог Российской коллекции клеточных культур, 1999., отв. ред. Пинаев Г.П., Полянская Г.Г. Санкт - Петербург Омск: ОмГПУ. Биологическая серия, вып. 5. (на русском и англ. яз.) 429 с.

31. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., Сакута Г. А. 2000а. Влияние микоп-лазменной контаминации клеточной линии легкого эмбриона человека MR.C-5 на кариотипическую изменчивость. Цитология. 42 (2): 190 - 195.

32. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., Сакута Г.А. 20006. Кариотипичес-кая изменчивость в длительно культивируемых клеточных линиях без маркерных хромосом. Тезисы II съезда ВОГиС. Санкт - Петербург. 1: 246 - 247.

33. Полянская Г.Г. 2000. Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных условиях (Обзор). Успехи совр. биол. (в печати)

34. Полянская Г. Г., Ефремова Т. Н. 2000. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую изменчивость клеточной линии карциномы шейки матки человека М HeLa clone 11. Цитология, (в печати).

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Полянская, Галина Георгиевна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Цитогенетические процессы в клеточных популяциях in vivo.

2.1.1.Системный контроль цитогенетических процессов в клеточных популяциях in vivo.

2.1.2. Влияние экзогенных и эндогенных факторов на кариотипическую изменчивость в клеточных популяциях in vivo.

2.2. Кариотипическая изменчивость в клеточных популяциях in vitro.

2.2.1. Некоторые генетические и цитогенетические характеристики неиммортализованных клеточных культур и их изменения в процессе иммортализации.

2.2.2. Кариотипическая структура иммортализованных клеточных линий.

2.2.3. Некоторые закономерности кариотипической изменчивости, определяющие процесс стабилизации в клеточных популяциях in vitro.

2.2.4.0собенности кариотипической изменчивости в стабильных «маркерных» клеточных линиях при культивировании в разных условиях.

2.2.5.Особенности кариотипической изменчивости в стабильных «безмаркерных» клеточных линиях при культивировании в разных условиях.

2.2.6. Цели и задачи представляемой работы.

3. Материалы и методы.

3.1. Материалы.

3.2. Методы.

3.2.1. Культивирование клеток.

3.2.2 Получение клеточных гибридов.

3.2.3. Кариологический анализ.

3.2.4. Используемые в работе воздействия (факторы), изменяющие условия культивирования и способствующие кариотипической нестабильности.

3.2.5. Методы статистического анализа.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Влияние факторов, как правило присутствующих при длительном культивировании, на структурную кариотипическую изменчивость в «безмаркерных» клеточных линиях.

4.1.1. Влияние антибиотиков в «терапевтических» дозах на хромосомные аберраций в клеточных линиях фибробластов кожи индийского мунтжака.

4.1.2. Влияние криоконсервации на цитогенетические характеристики клеточной сублинии МТ.

4.1.3. Влияние сыворотки на хромосомные аберрации в клеточных линиях М и М1.

4.1.4. Исследование кариотипической изменчивости в процессе длительного культивирования в клеточных линиях N61.-3-11 и N61-3-17.

4.2. Исследование действия факторов, влияющих на жизнедеятельность клеток, на хромосомные аберрации в разных клеточных линиях при длительном культивировании.

4.2.1. Изменчивость хромосом мунтжака в гибридах соматических клеток.

4.2.2. Влияние микоплазменной контаминации клеточной линии М на хромосомные аберрации.

4.2.3. Влияние микоплазменной контаминации клеточных линий N61-3-11 и N61-3-17 на хромосомные аберрации.

4.2.4. Блияние микоплазменной контаминации клеточной линии лейомиосаркомы человека 8К-11Т-16 на хромосомные аберрации.

4.2.5. Блияние микоплазменной контаминации клеточной линии легкого эмбриона человека MRC-5 на хромосомные аберрации.

4.2.6. Влияние микоплазменной контаминации клеточных линий с маркерными хромосомами V-79 и М Hela clone на хромосомные аберрации.

4.2.7. Исследование влияния ципрофлоксацина на клеточные линии почки кенгуровой крысы NBL-3-11 и фибробласты кожи индийского мунтжака М.

4.2.8. Влияние внеклеточного белка теплового шока (в-БТШ70) на хромосомную изменчивость в клетках линии М.

4.2.9. Характерные черты дицентриков, возникающих в «безмаркерных» клеточных линиях в процессе культивирования в разных условиях.

4.3. Влияние факторов, как правило присутствующих при длительном культивировании, на количественную кариотипическую изменчивость в «безмаркерных» клеточных линиях.

4.3.1. Влияние разных культуральных сред на количественную кариотипическую изменчивость в сублинии почки кенгуровой крысы NBL-3-17.

4.3.2. Влияние антибиотиков в «терапевтических» дозах на количественную кариотипическую изменчивость в клеточных линиях М и МТ.

4.3.3. Влияние сыворотки на количественную кариотипическую изменчивость клеток М и Mi.

4.4. Исследование действия факторов, влияющих на жизнедеятельность клеток, на количественную кариотипическую изменчивость в разных клеточных линиях при длительном культивировании.

4.4.1. Влияние микоплазменной контаминации клеточной линии М на количественную кариотипическую изменчивость.

4.4.2. Влияние ципрофлоксацина на количественную кариотипическую изменчивость в клеточных линиях М и NBL-3

4.4.3. Влияние микоплазменной контаминации клеточных линий NBL-3-11 и NBL-3-17 на количественную кариотипическую изменчивость.

4.4.4. Влияние микоплазменной контаминации клеточной линии легкого китайского хомячка V-79 на количественную кариотипическую изменчивость.

4.4.5. Влияние микоплазменной контаминации клеточных линий человека - лейомиосаркомы SK-UT-1В и карциномы шейки матки М Hela clone 11 на количественную кариотипическую изменчивость.

4.4.6. Влияние микоплазменной контаминации клеточной линии легкого эмбриона человека MRC-5 на количественную кариотипическую изменчивость.

4.4.7. Количественная изменчивость хромосом мунтжака в гибридах соматических клеток.

4.5. Анализ закономерностей количественной кариотипической изменчивости на примере нескольких клеточных линий.

4.5.1. Особенности количественной изменчивости кариотипа в клеточной линии М.

4.5.2. Особенности количественной изменчивости кариотипа в клеточных сублиниях МТ и М2.

4.5.3. Особенности количественной изменчивости кариотипа в клеточной линии NBL-3-11 и клоновых популяциях клеток китайского хомячка.

4.5.4. Исследование количественной изменчивости кариотипа при индукции хромосомной нестабильности в культивируемых клетках фибробластов кожи индийского мунтжака.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных условиях"

Тема представляемой работы - «Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных условиях.

Работа посвящена поиску и исследованию закономерностей структурных и количественных кариотипических изменений и их взаимодействия преимущественно в популяциях иммортализованных клеточных линий, не имеющих в составе кариотипа маркерных хромосом, при длительном культивировании в разных условиях. В работе проведено сопоставление результатов по характеру кариотипической изменчивости в «безмаркерных» и «маркерных» клеточных линиях.

Кариотипическая изменчивость клеток имеет место как in vivo, так и in vitro. Кариотипическая изменчивость в большой степени обусловливает протекание эволюционных процессов в природе. Те же процессы, т.е. количественные и структурные изменения в кариотипе, могут вызывать наследственные болезни и развитие новообразований, в частности злокачественных. В практических биомедицинских исследованиях индукция кариотипических изменений является тестом на мутагенность и канцерогенность окружающей среды. Очевидно, что поиск и изучение закономерностей кариотипической изменчивости является актуальной проблемой современной клеточной биологии.

Клеточные популяции в организме и вне его находятся в разных условиях. Так, обеспечение нормальной жизнедеятельности организма достигается посредством сложных межклеточных и межтканевых взаимодействия на уровне генов и их продуктов (Бахтин, 1980; Албертс и др., 1994). Клеточные популяции в организме имеют преимущественно постоянный кариотип. Следовательно, должны быть механизмы, поддерживающие это постоянство. По мере усложнения организации живых систем в процессе филогенеза животных развиваются их интегральные системы - нервная, гормональная и иммунная. Цитогенетические процессы, к которым относится и кариотипическая изменчивость, находятся под контролем этих систем. Системный контроль осуществляется через внутриклеточный обмен веществ и является одним из проявлений положения о том, что изменение метаболических процессов, вызванное любым фактором, может явиться одной из причин возникновения мутаций (Керкис, 1940; Лобашев, 1947). Существование системного контроля ци-тогенетических процессов к настоящему времени подтверждено большим количеством экспериментальных фактов (Speight et al., 1968; Та-рабрин, 1970; Невструева, 1970; Керкис, Логвинова, 1963; Полянская, 1969,1970, 1971,1972; Цапыгина, 1971; Лобашев, 1973). Было высказано предположение, что одной из существенных функций нервной системы является регуляция состояния генетического аппарата по принципу обратной связи в соответствии с текущими нуждами организма, влиянием среды и индивидуального опыта. По-видимому, нервная система организует и запускает сложную иерархию регуляторных влияний на хромосомный аппарат. При этом используется многообразие сигнальных веществ, синтезируемых как в самих нервных элементах, так и в различных железах внутренней секреции, активируемых нервной системой. Это положение подтверждено многими исследованиями влияния стресса на цитогенетические процессы. Установлена связь между совокупностью цитогенетических характеристик и генетически детерминированным уровнем функционального состояния нервной системы, определяемым как ее возбудимостью, так и особенностями метаболизма вторичных посредников, а также параллелизм в реактивности на стресс генетического аппарата, гипоталамо - гипофизарно - адренокортикальной системы и системы перекисного окисления липидов (Дюжикова и др., 1997). По-видимому, нарушение внутриклеточного гомеостаза, вызванное мобилизацией иммунологических механизмов организма против чужеродных антигенных субстанций, может приводить к структурным нарушениям хромосом (Керкис, Спорова, 1971).

Тем не менее известно, что под влиянием различных экзогенных и эндогенных факторов кариотипические изменения с небольшой частотой в организме происходят. Поддержание определенного уровня кариотипической изменчивости осуществляет стабилизирующий отбор, который поддерживает превосходство нормы над нарушениями (Бахтин, 1980).

При переходе клеток в состояние in vitro нарушаются условия их существования. Основными типами клеточного взаимодействия в популяциях in vitro становятся физический контакт между клетками и связь через метаболиты в культуральной среде. Эти взаимодействия объединяют клетки, составляющие клеточную популяцию в единую автономную систему, поддерживаемую благодаря существованию между клетками «метаболической кооперации» (Subak - Sharpe et al.,1966; Сох et al., 1972; Терци, 1977; Албертси др., 1994).

Образование постоянных клеточных линий, т.е. приобретение ими свойства иммортализации, связано со многими генетическими и цитоге-нетическими изменениями в клеточных популяциях (Yerganian et al., 1962; Wolman et al., 1964, 1980; Moorhead, Saksela, 1965; Counter et al., 1992; Дункан, Реддел, 1997; Реддел и др., 1997; Reddel, 1998; Wang et al., 1998; Chin et al., 1999; Ducray, 1999). После иммортализации изменяются первоначальные функции клеток. Основной функцией становится пролиферация. Условия in vitro более вариабельны, чем in vivo, поэтому в клеточных популяциях происходит усиление полиморфизма по многим свойствам, в частности по кариотипической структуре. Кариотипическая гетерогенность в клеточных культурах значительно усиливается по сравнению с состоянием in vivo.

Несмотря на то, что при переходе клеток в состояние in vitro изменяются многие функции, свойственные клеткам в условиях организма, потенции клеток к воссозданию первоначальных свойств остаются, а в некоторых клеточных линиях ряд свойств сохраняется (Терци, 1977, Malpoix, Poljanskaya, 1979; Бахтин, 1980; Фридлянская, 1984; Турилова и др, 1998, 1999). Некоторые закономерности кариотипической изменчивости клеток в культуре также сходны с таковыми в условиях организма. Так, в опухолевых и лейкозных клеточных линиях сохраняются многие специфические хромосомные перестройки, свойственные клеткам в организме; наблюдается неслучайный характер численных и структурных изменений хромосом в линиях разного гистогенеза; для одного вида животных характерны сходные хромосомные нарушения в разных клеточных линиях; имеет место утрата одной из половых хромосом при длительном культивировании клеточных культур, аналогичное явление происходит в организме при старении и разных формах новообразований; имеет место сходный характер распределения по числу нормальных хромосом в клеточных популяциях в условиях in vivo и in vitro. (Hughes, 1968; Fitzgerald, McEwan, 1977; Ford, Russel., 1985; Hando et al., 1994; Catalan et al., 1995; Nath et al., 1995; Мамаева, 1996; Mamaeva, 1998).

Клеточная популяция in vitro как автономная система имеет и свои особенности по сравнению с организмом. Так, в клеточных культурах в отличие от организма наблюдается, как правило, постоянство числа, интенсивности серебрения и распределения по хромосомам Ад - позитивных ядрышковых организаторов, что позволяет идентифицировать любую клеточную линию. Известно, что характер серебрения отражает функциональную активность рибосомных генов.(Mamaev, Mamaeva, 1990). В процессе стабилизации постоянной клеточной линии устанавливается сбалансированная кариотипическая структура, которая выражается во-первых, в сохранении всего хромосомного материала, свойственного донору, во-вторых, в сохранении, как минимум, дисомии по всем аутосомам (Мамаева, 1996; Mamaeva, 1998). При анализе нескольких линий культивируемых клеток китайского хомячка показана кариотипическая сбалансированность, которая проявляется в наличии корреляции между изменением общего числа хромосом в клетках стволовой линии и соотношением хромосом разных размеров (Zacharov et al., 1964; Захаров и др., 1966). Сбалансированность генома клеточных линий проявляется также в сходстве их по количеству ДНК независимо от числа хромосом (Kraemer et al., 1972; Розанов и др., 1984).

Следует обратить внимание, что несмотря на существенную структурную и количественную перестройку кариотипа в постоянных клеточных линиях, не наблюдаемую в организме, состояния, к которым стремятся клетки в условиях in vitro, сходны с in vivo. А именно, с одной стороны, нижним пределом кариотипической изменчивости клеток в культуре, как правило, является состояние дисомии, подобно состоянию in vivo; наблюдается сохранение хромосомного материала, свойственного донору и сохранение постоянного количества ДНК независимо от количества хромосом. С другой стороны, у разных видов млекопитающих, различающихся по числу хромосом, не обнаружено существенных различий по содержанию ДНК (Оно, 1973). Следовательно, пути, с помощью которых клетка адаптируется к условиям вне организма, свойственны исключительно клеточным популяциям in vitro как автономным целостным системам, но тем не менее «след» организма имеет место.

Большинство клеточных линий на этапе стабилизации характеризуется наличием в кариотипе ряда постоянных маркерных хромосом. Меньшая часть известных постоянных клеточных линий в составе карио-типа не имеет таких хромосом. Кариотипы этих линий либо соответствуют донорам, либо отличаются от них количеством гомологичных хромосом. Причем среди «безмаркерных» линий есть как иммортализованные, незлокачественные так и высокозлокачественные (Shaw, Krooth, 1964; Wurster, Benirschke, 1970; Grewal et al., 1971; Brown, Cohen, 1973 а, 6; Chen, 1988, 1990; Полянская, 1988 а, б; Полянская, Фридлянская, 1991; АТСС, 1992). Таким образом, рассматривая кариотипические варианты постоянных клеточных линий, можно предположить, что основными элементами, по которым идет отбор при образовании иммортализованных клеточных линий, являются генные изменения, как структурные, так и эпигенетические. По-видимому, хромосомные аберрации - лишь инструмент, с помощью которого достигается необходимый для существования клеточной популяции генный баланс. Неважно сколько образовалось в кариотипе хромосом, важно, как в нем функционируют гены. Таким образом, при стабилизации постоянной клеточной линии должны существовать определенные ограничения кариотипической изменчивости, обуславливающие сбалансированную генетическую структуру. В настоящее время есть ряд данных, подтверждающих это предположение. Так, при сопоставлении гетерогенности кариотипов отдельных клеток китайского хомячка по числу и размерам хромосом с постоянством суммарного распределения хромосом клоновых популяций по содержанию ДНК показано, что происходят постоянно одни и те же перестройки хромосом (Филатов и др., 1988). При анализе взаимосвязи нормальных и маркерных хромосом в сублиниях HeLa показано, что взаимосвязаны между собой именно хромосомы, имеющие в своем составе общий хромосомный материал ( Мамаева и др., 1986). Еще одним подтверждением могут явиться ранее упомянутые работы Захарова с соавторами, где полученные ими результаты свидетельствуют о существовании ограничений по количественной кариотипической изменчивости, определяющей хромосомную сбалансированность в клеточных популяциях китайского хомячка in vitro (Zakharov et al., 1964; Захаров и др., 1966). По-видимому, существенной для клеточной популяции in vitro является доза функционирующих генов. Возможно, что определенные пределы количественной изменчивости отчасти и отражают это явление. Утверждение о существовании определенных ограничений в кариотипической изменчивости клеточных популяций in vitro несомненно требует расширения исследований по поиску закономерностей этих ограничений.

Как было отмечено выше, клеточные популяции in vitro представляют собой автономные системы, которые, достигнув стадии стабилизации, имеют устойчивые характеристики. Тем не менее, они представляют собой динамичные системы и вне организма, лишившись многоступенчатого организменного контроля, они в значительной степени подвержены влиянию внешних факторов. Под внешними факторами следует понимать как непосредственно те, что постоянно присутствуют при культивировании (культуральная среда, сыворотка, качество подложки в культуральной посуде, «терапевтические» дозы антибиотиков, используемые для микробной деконтаминации культур, условия криоконсерва-ции и т. д.), так и прочие, которые могут способствовать созданию неблагоприятных условий (бактериальная или микоплазменная контаминация, токсичные дозы антибиотиков и т. д.). В связи с этим в клеточных популяциях in vitro может усиливаться полиморфизм по некоторым признакам и, в частности, по кариотипическим характеристикам. Усиление же кариотипической нестабильности может способствовать изменению других свойств, присущих определенной клеточной линии.

Логично предположить, что если большинство постоянных клеточных линий имеет маркерные хромосомы, то такой путь установления нового генного баланса, достигаемого, например через эффект положения, и приспособленного к условиям in vitro, наиболее адекватен для клеточных популяций. Структура же «безмаркерных» клеточных линий отличается от донора только генными изменениями и анеуплоидией, что, возможно, обуславливает отличные от «маркерных» линий закономерности кариотипической изменчивости в процессе культивирования клеточных линий, находящихся на стадии стабилизации. Ряд немногочисленных данных литературы, рассмотренных ниже, поддерживает сделанное нами предположение относительно возможных особенностей «безмаркерных» линий.

Результаты по индукции хромосомной нестабильности в «безмаркерных» клеточных линиях немногочисленны. Так, исследованы кариотипическая изменчивость при длительном культивировании клеточной линии почки кенгуровой крысы и трансформированных вирусом SV 40 и avian sarcoma viruses первичных культур фибробластов кожи и почки индийского мунтжака, а также влияние родамина В при кратковременном действии на клеточную линию фибробластов кожи индийского мунтжака (Levan, 1970; Yuasa et al., 1978; Yamaguchi, Huh, 1979; Piliidge et ai., 1986 a,b; Lewis et al., 1981). Вывод, который мы сделали, рассмотрев эти результаты, сводится к следующему: 1.«Безмаркерность», наблюдаемая в некоторых клеточных линиях, явление неслучайное и обусловлено, по-видимому, свойствами генотипа этих клеток. Возможно, что при образовании «маркерных» и «безмаркерных» клеточных линий существуют неизвестные пока причины, обусловливающие разный характер кариотипических изменений при становлении и стабилизации клеточных популяций. 2. При некоторых, совершенно разных, воздействиях и в разных линиях отмечается появление дицентриков, образованных на основе теломерных ассоциаций. При культивировании в разных условиях «маркерных» клеточных линий подобного явления не наблюдалось. Появление дицентриков в процессе культивирования имеет место не только в «безмаркерных» постоянных линиях, но и в неиммортализованных фибробластах человека при старении (Benn,1976; Harley et al., 1990). Обнаруженный нами при анализе литературных данных факт появления дицентриков на основе теломерных ассоциаций при отсутствии постоянной связи с другими типами хромосомных нарушений, позволяет предположить возможную особую биологическую роль этих образований в «безмаркерных» клеточных популяциях.

Задачей представляемой работы явилось детальное исследование кариотипической изменчивости в популяциях «безмаркерных» клеточных линий с целью поиска возможных характерных особенностей этого явления и изучения его закономерностей. В работе впервые проведено исследование кариотипической изменчивости в «безмаркерных» клеточных линиях, различающихся по степени трансформированное™ в разных условиях длительного культивирования. В качестве воздействий, индуцирующих кариотипическую нестабильность, были использованы факторы, как правило присутствующие при длительном культивировании, а также влияющие на жизнедеятельность клеток.

Выше мы указали на недостаточную изученность причин, обусловливающих ограничения кариотипической изменчивости в клеточных популяциях. В частности, образование и дальнейшее существование любой постоянной клеточной линии связано с установлением баланса между клетками, имеющими разное число хромосом, причем клетки как с модальным, так и с немодальными числами хромосом могут иметь разные структурные варианты кариотипа, т.е. разное число гомологов. Количественная сбалансированность кариотипической изменчивости, так же как и структурная в клеточной популяции в целом, обусловлена взаимодействием процессов кариотипической изменчивости и двух форм отбора (стабилизирующего и прогрессивного), работающих в клеточных популяциях in vitro (Бахтин, 1980). Нами были проведены поиск и исследование закономерностей, обеспечивающих сбалансированность кариотипической структуры, на этапе стабилизации интактных клеточных линий и при индукции в них хромосомной нестабильности. Впервые был проведен статистический анализ отклонений по числу хромосом от основного структурного варианта кариотипа и, что особенно важно, иссле

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Полянская, Галина Георгиевна

6. Выводы.

1. Факторы, как правило присутствующие при длительном культивировании постоянных клеточных линий без маркерных хромосом (фибробласты кожи индийского мунтжака и почка кенгуровой крысы), систематически способствуют образованию дицентриков (теломерных ассоциаций). В этом отношении исследованы: антибиотики в «терапевтических» дозах, длительность хранения без ОМБО в жидком азоте, качественно разные сыворотки (в варьирующих концентрациях), продолжительность культивирования. Тот же эффект наблюдается при действии и других факторов, влияющих на жизнедеятельность клеток «безмаркерных» линий (фибробласты кожи индийского мунтжака, почка кенгуровой крысы, лейомиосаркома человека, легкое эмбриона человека) в процессе длительного культивирования. В этом отношении исследованы: изменение генотипической среды в клеточных гибридах, мико-плазменная контаминация, антибиотик ципрофлоксацин (ЦФ) в геноток-сичных дозах. Из наших и литературных данных следует, что в постоянных клеточных линиях с маркерными хромосомами при длительном культивировании в разных условиях образование дицентриков не наблюдается.

2. Возникающие дицентрики характеризуются, постоянным появлением их с определенной частотой при действии разных по своим свойствам факторов; отсутствием постоянной взаимосвязи с другими типами хромосомных нарушений, наличием определенной количественной динамики при отсутствии усиления хромосомной нестабильности; преимущественным образованием их определенными хромосомами. Совокупность этих свойств позволяет предположить, что появление дицентриков в «безмаркерных» линиях связано с созданием генетических структур, обеспечивающих систему адаптации клеточной популяции как целостного образования к неблагоприятным условиям культивирования.

3. Дицентрики в «безмаркерных» клеточных линиях могут возникать не только при длительных , но и при кратковременных воздействиях в течение одного митотического цикла. Появление дицентриков в этом случае зависит от характера и времени воздействия. В частности, показано, что при раздельном действии ЦФ и внеклеточного белка теплового шока (в-БТШ70) на фибробласты кожи индийского мунтжака предположительно в конце - начале в фазы наблюдаются дицентрики, которые при совместном действии этих факторов не обнаруживаются. По-видимому, в-БТШ70 оказывает защитное действие на индуцированную ЦФ хромосомную нестабильность, которое в наибольшей степени проявляется в фазе митотического цикла.

4. При действии на клетки «безмаркерных» и «маркерных» клеточных линий неопухолевого происхождения (фибробласты кожи индийского мунтжака, почка кенгуровой крысы, легкое эмбриона человека, легкое китайского хомячка, яичник китайского хомячка) антибиотиков в «терапевтических» дозах, ЦФ в генотоксичных дозах, качественно разных культуральных сред и сывороток (в варьирующих концентрациях), при клонировании, а также при микоплазменной контаминации и изменении генотипической среды в условиях длительного культивирования возникают существенно однотипные изменения в количественных характеристиках кариотипа: в соотношении доли клеток с модальным, субмодальным и другими числами хромосом; в соотношении основного и дополнительных структурных вариантов кариотипа (СВК). В клетках с данным числом хромосом выявляется преобладающий СВК, который, возможно, имеет селективное преимущество. Пределы изменчивости по числу хромосом остаются устойчивой характеристикой при любых воздействиях.

5. В клеточных линиях опухолевого происхождения как в «безмаркерной», так и в «маркерной» (лейомиосаркома человека и карцинома шейки матки человека), в отличие от неопухолевых линий, при длительной микоплазменной контаминации имеет место значительное расширение пределов изменчивости по числу хромосом. Эти результаты в совокупности с данными литературы позволяют предположить, что причиной наблюдаемой нестабильности структуры кариотипа является опухолевое происхождение этих линий, возможно, связанное с наличием свойства злокачественности.

6. Статистический анализ индивидуальных кариотипов, проведенный на большом числе клеток «безмаркерных» и «маркерных» линий (фибробласты кожи индийского мунтжака, почка кенгуровой крысы, яичник китайского хомячка) в отсутствие каких-либо воздействий показал, что для выживания клеточной популяции in vitro необходимо существование в ней в определенном соотношении клеток с разными СВК. Выявляются: неслучайный характер распределения клеток по числу хромосомных отклонений от основного СВК; специфический характер отклонений каждой хромосомы от основного СВК; наличие достоверных связей между отдельными хромосомами при одновременных численных отклонениях. Установленные закономерности свидетельствуют о том, что отбор в клеточных популяциях идет не по отдельным хромосомам, а по сбалансированному кариотипу. При микоплазменной контаминации линии фибробластов кожи индийского мунтжака имеют место небольшие изменения в характере отклонений индивидуальных хромосом и частичные нарушения связей между хромосомами при одновременных отклонениях, не изменяющие основные количественные закономерности, установленные для интактных культур.

7. Закономерности количественной изменчивости, установленные при анализе СВК и тенденции морфологических изменений кариотипа (дицентрики), представляют собой проявления единой клеточно-популяционной функции в различных степенях выражения. В пользу этого положения свидетельствуют: образование дицентриков при микоплазменной контаминации именно теми хромосомами, между которыми нарушены связи при одновременных отклонениях; связь между неслучайной сегрегацией определенных хромосом мунтжака в гибриде между клетками клона саркомы Йенсена и фибробластами кожи индийского мунтжака и участием несегрегированных хромосом в образовании дицентриков.

223

8. Предполагается, что клеточные популяции могут адаптироваться к условиям in vitro, по крайней мере, двумя способами: 1) образованием дицентриков и изменениями в регуляции генной экспрессии; 2) стабилизацией определенной цитогенетической структуры в популяции (СВК). Эти способы могут быть как взаимодополняющими, так и взаимозаменяемыми на разных стадиях существования клеточной популяции. В целом в клеточной популяции реализуется состояние, которое можно назвать кариотипическим гомеостазом; наблюдаемые явления характеризуют процессы, составляющие такой гомеостаз.

5. Заключение.

Настоящая работа была посвящена детальному изучению карио-типической изменчивости, явления, давно известного для клеточных популяций. Кариотипическая изменчивость в клеточных популяциях выражена гораздо значительнее в условиях in vitro, чем in vivo. Закономерности кариотипической изменчивости в иммортализованных клеточных линиях, установленные ранее, были обнаружены при исследовании линий, имеющих в составе кариотипа маркерные хромосомы. Основное внимание в настоящей работе было уделено изучению кариотипической изменчивости в «безмаркерных» клеточных линиях, структура кариотипа которых существенно отличается от «маркерных» тем, что переход к иммортализованному состоянию и дальнейшая стабилизация этих линий связана только с генными изменениями (возможно эпигенетическими) и частично с анеуплоидией. Таким образом, значительно меньшая кариотипическая гетерогенность, свойственная «безмаркерным» линиям может обусловливать отличные от других линий закономерности кариотипической изменчивости, проявляющиеся в процессе культивирования уже находящихся на стадии стабилизации клеточных культур. Тем не менее нами исследован характер кариотипической изменчивости не только в «безмаркерных», но и в «маркерных» клеточных линиях при длительном культивировании в разных условиях с целью сравнения характера изменений.

В результате проведенной работы нам удалось показать, что характерной чертой кариотипической изменчивости «безмаркерных» клеточных линий при длительном культивировании в разных условиях являются дицентрики, образованные на основе теломерных ассоциаций. Установлено несколько характерных черт дицентриков.

1. Постоянное появление дицентриков с определенной частотой, преимущественно при длительном воздействии разных по своим свойствам факторов в процессе культивирования «безмаркерных» клеточных линий. Наблюдается разная степень увеличения количества дицентриков: их число может превышать уровень всех остальных хромосомных аберраций, может соответствовать этому уровню или быть несколько ниже. Некоторые факторы могут индуцировать дицентрики и при кратковременном воздействии.

2. Отсутствие постоянной взаимосвязи с другими типами хромосомных нарушений и наличие определенной количественной динамики дицентриков, заключающейся в ряде случаев в постепенном увеличении и последующем снижении их числа. Постоянный повышенный уровень количества дицентриков не влечет за собой повышение уровня других хромосомных аберраций, что может свидетельствовать об отсутствии нарушений при прохождении анафазы этими структурами, т. е. о нормальной сегрегации хромосом в митозе.

3. Преимущественное участие определенных хромосом в образовании дицентриков.

Учитывая перечисленные свойства дицентриков, можно заключить, что образование их в «безмаркерных» клеточных линиях носит универсальный характер. Результаты позволяют предположить, что появление дицентриков с определенной частотой в клеточной популяции in vitro является ее ответом на неблагоприятные условия культивирования, подобно маркерным хромосомам в других линиях. Возможно, что дицентрики являются способом адаптации «безмаркерных» клеточных линий к варьирующим условиям культивирования.

Основываясь на совокупности результатов и их обсуждении, мы предположили, что в данном случае роль дицентриков состоит не в создании кариотипической нестабильности, а наоборот, в создании генетических структур, обеспечивающих систему адаптации клеточной популяции как целостной системы к неблагоприятным условиям. (Полянская, 1989; Полянская, Фридлянская, 1991; Полянская, Ефремова, 1992, 1994, 1996; Полянская и др., 1993, 1997, 1998; Полянская, Сизова, 1996; Полянская, 2000). Ранее при исследовании иммортализованных эпителиальных клеток почки кролика было предположено, что образование дицентриков стабилизирует теломерную ДНК (Mac Donald et. al., 1991).

Совокупность полученных нами результатов, а также ряд данных литературы свидетельствуют о том, что кариотипическая структура кпеточных популяций in vitro, как правило имеет несколько характерных черт: 1) клетки с модальным числом хромосом, выраженным в большей или меньшей степени; 2) клетки с другими числами хромосом и, в частности, с субмодальным; 3) постоянные пределы изменчивости по числу хромосом. 4) клетки с любым выраженным числом хромосом имеют преобладающий С В К, который в клетках с модальным числом хромосом называется основным; 5) клетки с любым числом хромосом имеют дополнительные СВК. При варьировании условий длительного культивирования могут происходить изменения в характере анеуплоидии, которые выражаются в следующем: 1) изменение частоты клеток с определенным числом хромосом при постоянстве среди них количества клеток с основным СВК; 2) изменение частоты клеток с определенным числом хромосом и одновременное изменение доли клеток с основным СВК среди них; 3) появление новых СВК; 4) изменение пределов изменчивости по числу хромосом. В результате могут образовываться новые устойчивые сублинии, адаптированные к измененным условиям существования клеточной популяции.

Таким образом, образование и дальнейшее существование любой постоянной клеточной линии связано с установлением баланса между клетками, имеющими разное число хромосом и разные СВК. Количественная сбалансированность кариотипической структуры обусловлена взаимодействием процессов кариотипической изменчивости и двух форм отбора (стабилизирующего и прогрессивного), работающих в клеточных популяциях in vitro (Бахтин, 1980).

В результате анализа количественной кариотипической изменчивости в клеточной популяции в целом при исследовании большого числа индивидуальных хромосом или групп хромосом с помощью статистических методов впервые обнаружен ряд количественных закономерностей, имеющих место в любых клеточных культурах, независимо от присутствия или отсутствия маркерных хромосом и обусловливающих описанные выше явления. Так, показано, что для выживания клеточной популяции in vitro необходимо существование в ней в определенном соотношении клеток с разными СВК. Конкретные закономерности, определяющие кариотипическую структуру, таковы: 1) неслучайный характер распределения клеток по числу отклонений от основного СВК, 2) специфический характер отклонений каждой хромосомы от основного СВК, 3) наличие достоверных связей между отдельными хромосомами при одновременных численных отклонениях.

При анализе совместных отклонений по числу хромосом от основного СВК, в результате которых образовались дополнительные СВК в клетках фибробластов кожи индийского мунтжака, доказано, что существуют достоверные связи между хромосомами, т. е. появление этих СВК неслучайно. Следовательно, существующее предположение о том, что отбор в клеточной популяции идет не по отдельным хромосомам, а по сбалансированному кариотипу (Литвинчук и др., 1986; Полянская, Дьяконова, 1988; Полянская, Сизова, 1993) получило реальное подтверждение. Можно утверждать, что действительно существует взаимосвязь поведения отдельных хромосом при образовании СВК.

Тем не менее, несмотря на существование общих закономерностей для любых клеточных линий, каждая клеточная линия имеет свои специфические особенности. Так, в каждой линии мунтжака имеет место вполне определенная, отличная от других, частота отклонений по числу хромосом от основного СВК, разная частота отклонений по одинаковым хромосомам, небольшие различия по достоверным связям между хромосомами при одновременных численных отклонениях. В линии N61-3-11 также имеются некоторые различия по сравнению с линиями мунтжака, принципиально не нарушающие установленные закономерности.

Микоплазменная контаминация и соматическая гибридизация клеток не нарушают основных закономерностей, установленных для ин-тактных культур. Тем не менее, микоплазменная контаминация способствует увеличению количества отклонений в сторону уменьшения числа хромосом, а также нарушению некоторых связей между хромосомами при одновременных отклонениях. Микоплазменная контаминация оказывает существенное влияние на поведение хромосомы значительно увеличивая количество нуллисомиков по ней. Условно, без своей пары в увеличенном количестве остаются хромосомы 1, 2 и X, что может нарушить численную сбалансированность кариотипа. Наблюдаемое нами появление большого количества дицентриков (теломерных ассоциаций) в этих экспериментах, связанное именно с преимущественным слиянием хромосом 1, 2 и X (разд. 4.2.2.), позволяет провести аналогию между оставшимися «свободными» хромосомами и дицентриками. Возможно, что дицентрики являются механизмом, обеспечивающим сбалансированность кариотипа в определенных условиях. Эта аналогия может явиться еще одним косвенным подтверждением адаптивной роли дицентриков в «безмаркерных» клеточных линиях в неблагоприятных условиях культивирования.

Следует отметить еще одну особенность, которая наблюдается в гибридных клетках. Пока не стабилизировался новый основной СВК в гибриде иР1хМ2, в кариотипе наблюдалось большое число дицентриков, которые исчезли после стабилизации СВК. Существенно, что хромосомы, преимущественно участвующие в образовании дицентриков те же, что и во вновь установленном СВК -1,2 и У2 (разд.4.2.1.). Возможно, что дицентрики необходимы для адаптации клеток в нестабильных условиях. На основании вышеотмеченных наблюдений: образование дицентриков при микоплазменной контаминации именно теми хромосомами, между которыми нарушены связи при одновременных отклонениях; связь между неслучайной сегрегацией определенных хромосом мунтжака в клеточном гибриде иЯ1хМ2 и участием несегрегированных хромосом в образовании дицентриков - нами предположено, что закономерности количественной изменчивости, установленные при анализе СВК и тенденции морфологических изменений кариотипа (теломерные ассоциации) представляют собой проявления единой клеточно-популяционной функции в различных степенях выражения (Роуапэкауа а\., 1999; Полянская, 2000). При этом появление дицентриков может приниматься как одно из проявлений анеуплоидии.

Подводя итог проведенной работе необходимо отметить, что используя кариотипические особенности ряда клеточных линий, в частности, малое число легко идентифицируемых при рутинной окраске крупных хромосом, нам удалось выявить характерные черты кариотипиче-ской изменчивости, не отмечавшиеся ранее при исследовании других линий и подтвердить собственные результаты, полученные при анализе морфологических групп хромосом. Обобщая результаты проведенных исследований, можно сформулировать следующие положения: сбалансированность кариотипической структуры клеточной популяции in vitro обусловлена определенными соотношениями СВК, которые устанавливаются в результате ограниченной частоты отклонений по числу индивидуальных хромосом, а также в результате взаимосвязи разных хромосом при одновременных численных отклонениях от основного СВК. Наблюдаемое явление свойственно клеточным линиям с разной структурой кариотипа, независимо от наличия маркерных хромосом. Известно, что кариотип является единой генетической системой, функциональный смысл которой состоит во взаимосвязи отдельных ее элементов (Макгрегор, 1986). Явления, описанные в настоящей работе, могут быть компонентами общего механизма сцепления хромосом в кариотипе. В отличие от организма, где существует много способов поддержания устойчивой кариотипической структуры, в частности, системный контроль цитогенетических процессов, в условиях in vitro основное влияние на эти процессы оказывают непосредственные клеточные контакты и условия культивирования. Поэтому характер структурно-функциональных связей в кариотипе может изменяться, способствуя адаптации клеточной популяции к новым условиям. По-видимому, клеточные популяции могут адаптироваться к условиям in vitro, по крайней мере, двумя способами: 1) образованием дицентриков и изменениями в регуляции генной экспрессии; 2) стабилизацией определенной цитогенетической структуры в популяции (СВК). Эти способы могут быть как взаимодополняющими, так и взаимозаменяемыми на разных стадиях существования клеточной популяции. Возможно, что пределы количественной кариотипической изменчивости in vitro обусловлены установлением определенной дозы функционирующих генов, продукты которых находятся как в клетках, так и в окружающей их среде, и регулируют таким образом структурно-функциональную организацию кариотипа клеточной популяции. Ранее было показано наличие функциональной связи между генами, ответственными за геномную стабильность и анеуплоидию (Ouspenski et al., 1995). По-видимому, в клеточной популяции реализуется состояние, которое можно назвать кариотипическим гомеостазом; в целом наблюдаемые явления, морфологически выраженные и статистически выявленные, характеризуют процессы, составляющие такой гомеостаз.

Следует подчеркнуть, что совокупность полученных результатов не только существенно расширила и углубила представления о кариоти-пической изменчивости в клеточных популяциях in vitro, но и позволила дать практическую рекомендацию о необходимости периодического проведения цитогенетического контроля в экспериментах, связанных с длительным культивированием в разных условиях. Так, данные, касающиеся восстановительных процессов в клетках после размораживания, связанные с репарацией и репликацией, свидетельствуют о нестабильности клеточной культуры сразу после декриоконсервации, что необходимо учитывать при постановке экспериментов. Необходимо стремиться к минимальному по времени контакту клеток с DMSO после декриоконсервации в связи с установленной цито- и генотоксичностью препарата. Перевод клеток на другую среду, качество сыворотки могут изменять карио-типическую структуру клеточной популяции при длительном культивировании, что может привести к изменению других свойств линии, изучаемых как в фундаментальных, так и в прикладных работах. Необходима периодическая проверка присутствия микоплазмы в культурах, т. к. по мере удлинения срока контаминации могут происходить существенные кариотипические изменения, не проявляющиеся на ранних сроках. Ди-центрики, появляющиеся часто раньше других типов аберраций в «безмаркерных» линиях, по-видимому, могут служить показателем неблагоприятных условий культивирования.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Полянская, Галина Георгиевна, Санкт-Петербург

1. Авцын А. П., Кондакова Л. И., Полякова Г.П., Халанский A.C. 1987. Отечественные линии опухолей нервной системы в экспериментальных исследованиях. Цитология. 29 (9): 1071.

2. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. 1994. Молекулярная биология клетки. М.: Мир. Т. 2. 540 с.

3. Андреева Е. В., Петров Ю. П., Семенова Е. Г. 1987. Изменение кариотипа и поверхностных свойств L клеток при адаптации суспензионной культуры к росту в монослое. Цитология. 29 (6): 684 - 688.

4. Анисимов А.П. 1986. Полиплоидия в индивидуальном и историческом развитии организмов. Цитология. 28 (10): 1125.

5. Баренфельд Л. С., Калмыкова Н. В., Андреева Л. Ф., Плескач Н. М., Прокофьева В. В., Михельсон В. М. 1999. Морфофункциональные характеристики фибробластов при базально-клеточном невусе и синдроме Кокейна. Цитология. 41. (11): 927- 931.

6. Бариляк И. Р., Неумержицкая Л. В., Туркевич А. Н.1978. Исследование антимутагенных и антитератогенных свойств димексида (ДМСО). Цитология. 20 (1): 50 56.

7. Бершадский А.Д., Гельфанд В.И. 1970. Старение и малигнизация клеточных штаммов. Цитология. 12 (4): 423 435.

8. Борхсениус С.Н.,Чернова O.A. 1989. Микоплазмы. Л., Наука.156 с. Бочков Н. П., Козлов В. М., Севанькаев A.B., Антощина М.М.1966. Анализ анеуплоидии в культурах эмбриональных фибробластов и лейкоцитов человека. Генетика. (10): 120 -124.

9. Бочков Н. П., Пяткин Е. К. 1969. Факторы, индуцирующие хромосомные аберрации у человека. В кн. Основы цитогенетики человека. М.: Медицина: 176 246.

10. Ван-Ганзем П. 1979. Старение клеток in vitro. Цитология 21 (6): 627

11. Бахтин Ю.Б., 1974. Генетика соматических клеток. П.: Наука. 258 с.

12. Бахтин Ю.Б. 1980. Генетическая теория клеточных популяций. Л.: Наука. 168 с.

13. Вепринцев Б. Н., Новиков А. Н., Смолихина Т.И., Утешев В. К. 1989. Действие диметилсульфоксида и субнулевых температур на зародышей вьюна. Криобиология. (2): 16 21.

14. Глебов O.K., Полянская Г.Г., Пинаев Г.П. 1981. Идентификация изолированных метафазных хромосом. II. Сравнение с узнаваемостью хромосом в составе метафазных пластинок. Цитология. 23 (9): 1042 -1045.

15. Гринберг К. Н. 1969. Хромосомные болезни: нарушения в системе аутосом. В кн. Основы цитогенетики человека. М.: Медицина: 310 410.

16. Гундерина Л. И., Кикнадзе И. И., Голыгина В. В. 1999. Внутривидовая дифференциация цитогенетической структуры природных популяций Chironomus plumosus L. центрального вида группы видов - двойников (Chironomidae, Díptera). Генетика. 35 (2): 193 -202.

17. Дубинин Н. П., 1994. Некоторые проблемы современной генетики. М.: Наука. 223 с.

18. Дубинин Н. П., Чережанова Л.В., 1981. Антимутагенный и мутагенный эффект стрептомицина. ДАН СССР. 140 (3): 703 704.

19. Дункан Э.Л., Реддел P.P. 1997. Генетические изменения, связанные с иммортализацией. Биохимия. 62 (11): 1477-1490.

20. Дюжикова H.A., Токмачева Е.В., Лопатина Н. Г. 1997. Исследование структурно-функциональной организации хромосом при реакции на стресс. Генетика. 33 (8): 1077 -1082.

21. Захаров А.Ф., Какпакова Е.С., Еголина H.A. 1966. Взаимоотношение числовой и структурной изменчивости кариотипа в культивируемых клетках китайского хомячка. Цитология. 8 (2): 193-201

22. Игнатова Т. Н., 1984. Трансформация клеток. В кн. Биология клетки в культуре. Л.: Наука. 101 -194.

23. Ильинская Н. Б., Петрова Н. А., 1997. Кариотип и инверсионный полиморфизм природных популяций Camptochironomus tentans северозападного региона России (Díptera, Chironomidae). Цитология. 39 (9): 848 -856.

24. Ильинская Н. Б., Петрова Н. А., Матена И. 1999. Зависимость уровня инверсионного полиморфизма от типа водоема, сезона и года наблюдения у мотыля Chironomus plumosus L (Díptera, Chironomidae). Генетика. 35 (8): 1061 -1071.

25. Исаенко А. А., Немцов Ю.В., Царева A.A. 1990. Исследование кариотипа клеток почки африканской зеленой мартышки линии 4647, культивируемых в средах с различными сыворотками. Цитология. 32 (7): 736 740.

26. Какпакова Е.С. 1966. Эволюция кариотипа в длительно культивируемых клеточных популяциях китайского хомячка. Генетика. (5): 47-58.

27. Картавцева И. В., Павленко М. В., Костенко В. А., Чернявский Ф. Б.1998. Хромосомная изменчивость и аномальные кариотипы у красно -серой полевки Clethrionomys rufocanus (Rodentia, microtinae). Генетика. 34: 1106-1113.

28. Каталог РККК. Каталог Российской коллекции клеточных культур.1999. Отв ред. Пинаев Г.П., Полянская Г.Г. Санкт-Петербург Омск: ОмГПУ. Биол.серия, вып.5 (на русском и англ. яз.) 429 с.

29. Керкис Ю. Я. 1940. Физиологические изменения в клетке, как причины мутационного процесса. Усп. соврем. Биол. 12 (1): 143 -159.

30. Керкис Ю. Я., Логвинова В. В. 1963. Влияние гормонов надпочечника на радиоционную чувствительность хромосомного аппарата в эпителиальных клетках роговицы мышей. ДАН СССР. 152 (4): 992 994.

31. Керкис Ю. Я., Спорова С. В. 1971. Мутагенный эффект иммунологического стресса при тканевой несовместимости у мышей. Генетика. 7 (11): 70 -74.

32. Кузьмина С. В., 1972. Действие микоплазм на хромосомный аппарат клеток в культуре ткани на примере мышиных фибробластов. Генетика. 8 (1): 165 -167.

33. Кузьмина C.B. 1983. Малигнизация нормальных клеток в условиях длительного культивирования in vitro. M. Наука. 228 с.

34. Куренова Е. В., Мейсон Д. М. 1997. О функциях теломер. Биохимия. 62 (11): 1453 -1466.

35. Лейпольдт М., Шмидтке И. 1986. Экспрессия генов у филогенетически полиплоидных организмов. В кн.: Эволюция генома. М. Мир: 217-233.

36. Литвинчук Л. Ф., Мамаева С. Е., Ковтунович И. Г., Пинаев Г. П. 1986. Кариотип постоянных клеточных линий. Изменчивость кариотипа M Hela при статическом и роллерном способах культивирования. Цитология. 28 (1): 56 61.

37. Лобашев M. Е., 1947. Физиологическая (паранекротическая) гипотеза мутационного процесса. Вестн. Ленингр. ун -та. (8): 10-29.

38. Лобашев M. Е., Пономаренко В. В., Полянская Г. Г., Цапыгина Р. И. 1973. О роли нервной системы в регуляции различных генетических и цитогенетических процессов. Журн. Эволюц. биохим. физиол. 9 (4): 398 -406.

39. Логвинова В. В., Керкис Ю. Я. 1967. Влияние адреналэктомии на радиочувствительность хромосом в клетках эпителия роговицы и костного мозга крыс линии Вистар. Генетика. 3 (7): 48 50.

40. Логвинова В. В., Керкис Ю.Я., Попова И. А. 1970. Анеуплоидия в клетках костного мозга крыс после инъекции гидрокортизона. Цитология. 12 (12): 1579-1582.

41. Лучник Н. В. 1968. Биофизика цитогенетических поражений и генетический код. Л.: Медицина. 296 с.

42. Макгрегор Г. 1986. Гигантские хромосомы и видообразование у амфибий. В кн. «Эволюция генома». М.: Мир: 313-328.

43. Мамаева С. Е. 1984. Цитогенетика клеток в культуре. В кн.: Биология клетки в культуре. П.: Наука. 195 234.

44. Мамаева С. Е. 1988. Хромосомный анализ культивируемых клеток. В кн.: Методы культивирования клеток. Л.: Наука. 78 97.

45. Мамаева С.Е., 1996. Закономерности кариотипической эволюции клеток в культуре. Цитология. 38 (8): 787-814.

46. Мамаева С.Е., Литвинчук Л.Ф., Пинаев Г.П. 1986. Характеристика кариотипа постоянных клеточных линий. II. Изменчивость и сбалансированность хромосомного набора клеток M-Hela. Цитология. 28 (2): 193-203.

47. Навашин М. С., Герасимова Е. П. 1935. Природа и причины мутации. 1. О природе и значении хромосомных мутаций, возникающих в клетках покоящихся растительных зародышей в результате старения. Биол. журн. 4 (4): 593 632.

48. Назаренко С. А., Бурмакина Ю. Э. 1986. Оценка кинетики клеточной пролиферации с помощью дифференциальной окраски сестринских хроматид по двум точкам фиксации. Бюл. эксперим. биол. мед. 102(10): 457-459.

49. Невструева В. В. 1970. Сперматогенез при нарушении нормальных иннервационных отношений в семеннике. В сб. Вопросы нервной регуляции тканевых процессов. М.: 148 -155.

50. Никольский H. Н. 1984. Пролиферация клеток в культуре. В кн.: Биология клетки в культуре. Л.: Наука. 10-49.

51. Оно С. 1973. Генетические механизмы прогрессивной эволюции. М.: Мир, 227 с.

52. Орбели Л. А. 1938. Лекции по физиологии нервной системы. Л.

53. Петрова Н. А., Ильинская Н. Б., Кайданов Л. 3. 1996. Адаптивный характер инверсионного полиморфизма у мотыля Chironomus plumosus

54. Мд (Díptera, Chironomidae): Пространственное разделение инверсий по ареалу. Генетика. 32 (12): 1417 -1430.

55. Пименова М.Н. 1975. Влияние нейро-активных веществ на цитогенетические процессы в соматических клетках (мышь, человек). Автореферат канд. дисс. Л.

56. Пименова М.Н., Симоненко В.Д. 1974. Метод культивирования роговицы глаза мыши in vitro. Цитология. 16 (9): 1179-1181.

57. Полянская Г. Г. 1969. Влияние преганглионарной симпатэктомии на радиационную чувствительность хромосом в эпителии роговицы мышей. Цитология. 11 (7): 888 891.

58. Полянская Г. Г. 1970. Влияние преганглионарной симпатэктомии на возникновение хромосомных перестроек и митотическую активность в эпителии роговицы мышей. Цитология. 12 (6): 790 794.

59. Полянская Г. Г. 1971. Зависимость количества хромосомных перестроек и митотической активности от времени после облучения X -лучами в эпителии роговицы симпатэктомированных мышей. Вестник ЛГУ, сер. биол. вып. 3(15): 129 -136.

60. Полянская Г. Г. 1972. Влияние симпатикотомии на суточный ритм митотической активности в эпителии роговицы мышей. Вестник ЛГУ, сер. биол. вып 3 (15): 117-123.

61. Полянская Г. Г. 1988. Кариотипическая характеристика клеточных сублиний почки кенгуровой крысы и фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 30 (6): 732 -738.

62. Полянская Г. Г. 1989. Влияние условий культивирования на кариотипическую структуру двух клеточных сублиний фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 31(7): 807-817.

63. Полянская Г. Г. 1999. Особенности количественной изменчивости кариотипа в клеточных сублиниях фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 41 (3/4): 305.

64. Полянская Г. Г. 2000. Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных условиях (Обзор). Успехи совр. биол. (в печати).

65. Полянская Г. Г., Дьяконова М. Ю. 1988. Влияние условий культивирования на кариотипическую структуру клеточной сублинии почки кенгуровой крысы. Цитология. 30 (11): 1355 -1363.

66. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. 1992. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую структуру клеточной линии индийского мунтжака. Цитология. 34 (3): 82-88.

67. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. 1993. Влияние микоплазменной контаминации и деконтаминации с помощью ципрофлоксацина на кариотипическую структуру клеточной линии легкого китайского хомячка V-79. Цитология. 35 (8): 71-78.

68. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. 1994. Влияние контаминации микоплазмой культур фибробластов кожи индийского мунтжака и последующей деконтаминации культур с помощью ципрофлоксацина на кариотипическую структуру клеточной линии. Цитология. 36 (4): 393-400.

69. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. 1996. Влияние микоплазменной контаминации двух сублиний клеток почки кенгуровой крысы на кариотипическую структуру. Цитология. 38 (1): 75-84.

70. Полянская Г. Г., Ефремова Т. Н. 2000. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую изменчивость клеточной линии карциномы шейки матки человека М HeLa clone 11. Цитология, (в печати).

71. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., Сакута Г.А. 2000а. Влияние микоплазменной контаминации клеточной линии легкого эмбриона человека MRC-5 на кариотипическую изменчивость. Цитология. 42 (2): 190-195.

72. Полянская Г. Г., Ефремова Т.Н., Сакута Г. А. 20006. Кариотипическая изменчивость в длительно культивируемых клеточных линиях без маркерных хромосом. Тезисы II съезда ВОГиС. Санкт-Петербург. 1: 246-247.

73. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., Сизова Л. С. 1996. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую изменчивость в клеточных линиях с разной структурой кариотипа. Цитология. 38 (2): 243 -244.

74. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., Фридлянская И. И. 1994а. Деконтаминация культивируемых клеток от микоплазм с помощью ципрофлоксацина: отсутствие гено- и цитотоксических эффектов. Цитология. 36 (6): 534.

75. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., Эндер Н.А. 1998. Влияние микоплазменной контаминации клеточной линии лейомиосаркомы человека SK-UT-1B на кариотипическую структуру. Цитология. 40 (1): 2330.

76. Полянская Г. Г., Самокиш В.А. 1999а. Особенности количественной изменчивости кариотипа в клеточной линии фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 41 (8): 729 734.

77. Полянская Г.Г., Самокиш В.А. 19996. Особенности количественной изменчивости кариотипа в клеточных сублиниях фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 41 (9):747 751.

78. Полянская Г. Г., Самокиш В. А. 1999в. Особенности количественной кариотипической изменчивости в клеточной линии почки кенгуровой крысы. Цитология. 41 (9): 758 763.

79. Полянская Г. Г., Самокиш В. А. 1999г. Исследование количественной кариотипической изменчивости при индукции хромосомной нестабильности в культивируемых клетках фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 41 (9): 752 757.

80. Полянская Г.Г., Сизова J1. С. 1996. Исследование генотоксического влияния ципрофлоксацина на культивируемые клетки почки кенгуровой крысы и фибробласты кожи индийского мунтжака. Цитология. 38 (9): 958 -973.

81. Полянская ГГ., Сизова Л.С., Николаенко Н.С. 1993. Кариотипическая характеристика линии фибробластов кожи индийскогомунтжака при культивировании с разными сыворотками. Цитология. 35 (2): 86-96.

82. Полянская Г. Г., Смирнова Т. Д. 1987. Влияние микоплазм на цитогенетические характеристики клеточных линий. Цитология. 29 (9): 1100.

83. Полянская Г.Г., Фридлянская ИИ. 1991. Изменчивость хромосом индийского мунтжака в гибридах соматических клеток. Цитология. 33 (6): 86-94.

84. Полянская Г.Г.,Абрамян Д.С., Глебов O.K. 1981. Кариотипическая структура клоновых популяций клеток китайского хомячка при длительном культивировании. Цитология. .23 (7): 818-830.

85. Полянская Г.Г., Кинев A.B., Сакута Г.А., Асеева Е.В. 1997. Влияние внеклеточного белка теплового шока на хромосомную изменчивость в клеточной культуре фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 39 (11) 1070-1082.

86. Полянская Г. Г., Семенова Е. Г., Шубин Н. А. 1990. Влияние криоконсервации на цитогенетические характеристики клеточной сублинии фибробластов кожи индийского мунтжака. Цитология. 32 (3): 256 265.

87. Полянская Г.Г., Фридлянская И.И. 1991. Изменчивость хромосом индийского мунтжака в гибридах соматических клеток. Цитология. 33 (6): 86-94.

88. Полянская Г. Г., Цапыгина Р. И. 1968. Инверсионный полиморфизм Boophtora erythrocephala (Simuliidae, Díptera). Генетика. 4 (5): 70 79.

89. Прайс К. М. 1997. Синтез теломерной с-цепи. Биохимия. 62 (11): 1423-1431.

90. Прокофьева-Бельговская А. А. 1966. Природа ассоциации акроцентрических хромосом человека. Цитология . 8 (2): 169 -177.

91. Реддел Р. Р., Брайан Т. М., Мернейн Д. П. 1997. Иммортализованные клетки без измеримой активности теломеразы. Биохимия. 62 (11): 1467 -1476.

92. Розанов Ю. М., Мамаева С. Е., Литвинчук Л. Ф., Савельева Л. Г., Гольцова Т. А. 1984. Сравнительный кариотипический и ДНК-цитометрический анализ постоянных клеточных линий человека. Цитология. 26 (9) 1079 -1080.

93. Рокицкий П. Ф. 1967. Биологическая статистика. Минск: Вышейш. школа, 328 с.

94. Созанский О. А., Терехов С. М. 1984. Клональный анализ межклеточной вариабельности в активности ядрышковых организаторов хромосом человека. Бюл. эксперим. биол. мед. 97 (5): 592 595.

95. Сальникова Т. В., 1976. Влияние ДМСО на мутагенную активность N -нитрозо N - диэтилмочевины. Генетика. 12 (2): 157-161.

96. Семенова Е. Г., 1988. Внеплановый синтез ДНК в культивируемых клетках после криоконсервации. Криобиология. (1): 17 20.

97. Семенова Е.Г., 1989. Действие трипсина, версена и криопротекторов на внеплановый синтез ДНК клеток в культуре в период подготовки к криоконсервации и после деконсервации. Криобиология. (3): 20 24.

98. Семенова Е. Г., Хоменко А. В., Мамаева С. Е.1984. Изменение продолжительности клеточного цикла и кариотипа клеток L мыши при смене способа культивирования. Цитология. 26 (10): 1156 -1160.

99. Скулачев В. П. 1997. Старение организма особая биологическая функция, а не результат поломки сложной живой системы:биохимическое обоснование гипотезы Вейсмана. Биохимия. 62 (11): 1394 -1399.

100. Смирнова Т. Д. 1986. Деконтаминация клеточных культур от микоплазмы: сравнение двух методов. Цитология. 28 (10): 1113-1116.

101. Сорокина Е. А., Новикова И. Ю., Гринчук Т. М., Сальникова К. В. 1988. Анализ кариотипа мышиных фибробластов клона 1 929 с применением дифференциальной окраски хромосом. Цитология. 30 (2): 197-203.

102. Спитковский Д. М. 1997. Теломерные последовательности ДНК и концепция о клетках онтогенетического резерва. Биохимия. 62 (11): 1503 -1509.

103. Стобецкий В. И., 1976. Теломерное слияние хромосом в клетках, обработанных колцемидом и 5БДУ. Бюл. эксперим. биол. мед. 82 (9): 1142-1144.

104. Стобецкий В. И., 1990. Индукция специфических дицентрических хромосом в клетках яичника китайского хомячка СНО 6. Цитология. 32 (1): 92-94.

105. Стобецкий В. И., Миронова Л. Л., 1988. Повышение интенсивности образования полицентрических хромосом в клетках с микроядрами при воздействии 5 бромдезоксиуридина в условиях длительной гипертермии при 40°С. Цитология. 30 (3): 358 - 360.

106. Тарабрин С. Б. 1970. Нарушение иннервациии и мутационный процесс в ткани. В сб. Вопросы нервной регуляции тканевых процессов. М.: 85-93.

107. Тартаковский А. Д., 1988. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих. В кн. Методы культивирования клеток. Л.: Наука. 44 62.

108. Терци М. 1977. Генетика и животная клетка. М.: Мир, 291 с.

109. Тихомирова М. М., Ватти К. В., Мамон Л. А., Барабанова Л. В., Куцкова Ю. А. 1994. Механизмы, обеспечивающие устойчивость генетического материала клетки к стрессовым воздействиям. Генетика. 30 (8): 1097-1104.

110. Филатов J1. В., Мамаева С. Е., 1985. Стабильность кариотипа двух постоянных линий клеток китайского хомячка СНО-К1 и V-79. Цитология. 27 (9): 1031 1038.

111. Фридлянская И.И., 1984. Постоянные клеточные линии, дифференцирующиеся in vitro. В кн.: Биология клетки в культуре. Л.: Наука. 50-100.

112. Фридлянская И. И., Полянская Г. Г., Блумквист Е., Татулян С. А., Пинаев Г. П. 1983. Экспрессия признаков, характеризующих клеточную поверхность, в гибридах малигнизированных и немалигнизированных клеток. Цитология. 25 (5): 593 600.

113. Хейфлик Л. 1997. Смертность и бессмертие на клеточном уровне. Биохимия. 62 (11): 1380 1393.

114. Цапыгина Р. И. 1971. Роль центральной нервной системы в регуляции процессов клеточного деления и радиочувствительности хромосом клеток эпителия роговицы у мышей. В сб. Исследования по генетике. Ленингр. ун-т. (4): 54 60.

115. Царева А. А., Исаенко А.А.,Урманова М.А., Юрченко М.Д., Балзовская Е.Г., Родионова М.О. 1990. Исследование кариотипа клеток линии Vero, длительно культивируемых в монослое статическим и роллерным способами. Цитология. 32 (7): 741 747.

116. Чернова О.А., Волкова Е.Н., Чернов В.М. 1996. Хромосомные аберрации, индуцированные микоплазменными инфекциями в лимфоцитах периферической крови человека. Генетика. 32 (6): 810-815.

117. Abruzzo М. A., Miller J. A., et al., Singer V.L. 1991. Telomeric associations involving Yq12 in a lymphoblastoid cell line. Cytogenet. Cell Genet. 56: 149-151.

118. Adair G., Stallings B. L., Friend K., Siciliano M. J. 1983. Gene mapping and linkage analysis in Chinese hamster: assignment of the genes for APRT, LDHA, IDH2 and GAA to chromosome 3. Somat. Cell Genet. 9: 477 488.

119. Alder G. M., Austen В. M., Bashford C. L., Pasternak C. A. 1990. Heat shock proteins induce pores in membranes. Biopsi. Rep. 10: 509 518.

120. Aledo R., Aurias A., Avril M.F., Ditrillaux B.1989. Jumping end -to end dicentrics in a case of squamous cell carcinoma from a patient with xeroderma pigmentosum. Cancer Genet. Cytogenet. 40: 95 -103.

121. Allshire R. C., Dempster M., Hastie N. D. 1989. Human telomeres contain at least three types of G-rich repeat distributed non-randomly. Nucleic Acid Res. 17: 4611 -4617.

122. Ancelin K., Brun C., Gibson E.1998. Role of the telomeric DNA-binding protein TRF2 in stability of human chromosomes ends. BioEssays. 20: 879 -883.

123. Ashwood-Smith M. J., Friedmann G. B. 1979. Lethal and chromosomal effects of freezing, thawing storage time, and X irradiation of mammalian cells preserved at -196° in dimethyl sulfoxide. Cryobiology. 16: 132 - 140.

124. ATCC American type culture collection. Catalogue of cell lines and hybridoms. 1988,1992. Rockville.

125. Aula P., Nichols W. W., 1967. The cytogenetic effects of mycoplasma in human leukocyte cultures. J. Cell. Physiol. 70: 281 290.

126. Bailey S. M., Meyne J., Chen D. J., Kurimasa A., Li G. C., Lehnert B. E., Goodwin E. H. 1999. DNA double-strand break repair proteins are required to cap the ends of mammalian chromosomes. Pros. Natl. Acad. Sci USA. 96: 14899-14904.

127. Barile M. F., 1978. Mycoplasma tissue cell interactions. The mycoplasma, Human and animal mycoplasma. New York: Acad. Press. V. 2. 500p.

128. Barnett B. M. 1972. Radioprotective effects of dimethyl sulfoxide on Dr. melanogaster. Radiat. Res. 51: 131 -141.

129. Barile M. F. 1979. Mycoplasma tissue cell interaction. The mycoplasma. Human and animal mycoplasma. New York: Acad. Press. V 2, 500 p.

130. Baseman J. B. 1996. Interplay between mycoplasmas and host cells. IOM Lett. 4: 26.

131. Bastian F., Clement W.M., Holbook W.M. 1992. Eucaryotic chromosome abnormalities secondary to spiroplasma infection. IOM Lett. 2: 142.

132. Becaert S., Vermeesch J. R., Marijnen., Van Oostveldt P. 1998. Telomere length regulation in telomerase positive murine cell line. Cytogenet Cell Genet. 81: 116.

133. Becak M.L., Becak W. 1998. Evolution by polyploidy in Amphibia: new insights. Cytogenet. Cell Genet. 80: 28 33.

134. Benn P. A. 1976. Specific chromosome aberrations in senescent fibroblast cell lines derived from human embryos. Am. J. Hum. Genet. 28: 465 -473.

135. Berger R., Bernheim A., Fellous M., Brouet J. C. 1979. Cytogenetic study of a european Burkitt's lymphoma cell line. J. Nat. Cancer Inst. 62: 1187-1192.

136. Bertuch A., Lundblad V. 1998. Telomeres and double-strand breaks: trying to make ends meet. Trends in Cell Biol. 8: 339 342.

137. Besnard C., Lores P., Daegelen d., Jami J. 1989. Reversible extinction of insulin gene expression in insulinoma x fibroblast somatic cell hybrids. Exp. Cell Res. 185: 101 -108.

138. Biessmann H., Mason J.M. 1994. Telomeric repeat sequences. Chromosoma. 103: 154-161.

139. Bigner S. H., Mark J., Bigner D. D. 1987. Chromosomal progression of malignant human gliomas from biopsy to establishment as permanent lines in vitro. Cancer Genet. Cytogenet. 24: 163 -176.

140. Blasco M. A., Lee H., Hande M. P., Samper E., Lansdorp P.M., DePinho R. A., Greider C. W. 1997. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell. 91: 25 34.

141. Bond D. J., 1987. Mechanisms of aneuploid induction. Mutat. Res. 181: 257-267.

142. Bradford M. M. 1976. A rapid and simple method for quantititation of microgram quantities of proteins utilising the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248 254.

143. Brat S.V., Verma R.S., Dosik H. 1979. Structural organization of chromosomes of the Indian muntjac (Muntjacus muntjak). Cytogenet. Cell Genet., 24: 201-208.

144. Brat S.V., Verma R.S., Dosik H. 1979. Anthramycin-induced sister-chromatid exchange and caffeine potentiation in the chromosomes of Indian muntjac. Mutat. Res. 63: 325 334.

145. Brinkley B. R., Valdivia M. M., Tousson A., Brenner S. L. 1984. Compound kinetochore of the Indian muntjac. Evolution by linear fusion of unit kinetochores. Chromosoma. 91: 1 -11.

146. Brown J.A., Cohen M.M. 1973a. The characterization of two established heteroploid lines (Indian muntjac and Rat-kangaroo) with a low chromosome number.I. In vitro karyotype evolution and cell cycle dynamics. Canad. J. Genet. Cytol. 15:135-143.

147. Brown K. D., Wood K. W., Cleveland D. W. 1996. The kinesin-like protein CENP E is kinetochore-associated throughout poleward chromosome segregation during anaphase A. J. Cell Sci. 109: 961 - 969.

148. Casati A., Stefanini M., Giorgi R., Ghetti P., Nuzzo F. 1991. Chromosome rearrangements in normal fibroblasts from Xeroderma pigmentosum homozygotes and heterozygotes. Cancer Genet. Cytogenet. 51: 89-101.

149. Catalan J., Autio K., Wessman M., Lindholm C., Knuutila S., Sorsa M., Norppa H. 1995. Age-associated micronuclei containing centromeres and the X chromosome in lymphocytes of women. Cytogenet. Cell Genet. 68: 11 -16.

150. Charron M., Hancock R., 1991. Chromosome recombination and defective genome segregation induced in Chinese humster cells by the topoisomerase II inhibitor VM-26. Chromosoma. 100: 97 -102.

151. Chen T. R. 1977. In situ detection of mycoplasma contamination in cell cultures by fluorescent HOEHST 33258 stain. Exp. Cell Res. 104: 255 262.

152. Chen T. R. 1979. Cytogenetics of somatic cell hybrids. 1. Progression of stemlines in continuous uncloned cultures of man-mouse cell hybrids. Cytogenet. Cell Genet. 23: 221 230.

153. Chen T. R., 1988. SK-UT-1B, a human tumorigenic diploid cell line. Cancer Genet. Cytogenet. 33: 77 81.

154. Chen T. R., 1990. SK-UT-1B cell line has the diploid karyotype. Cancer Genet. Cytogenet. 48: 139 -141.

155. Chen T. R., Hay R.J., Macy M. L. 1982. Karyotype consistency in human colorectal carcinoma cell line established in vitro. Cancer Genet. Cytogenet. 6: 93 -117.

156. Chen M., Beck W. T. 1995. Differences in inhibition of chromosome separation and G2 arrest by DNA topoisomerase II inhibitors merbarone and VM-26. Cancer Res. 55: 1509 -1516.

157. Chin L., Artandi S. E., Shen Q., Tam A., Lee S L , Gottlieb G. J., Greider C. W., DePinho R. A. 1999. P53 deficiency rescues the adverseeffects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate cancinogenesis. Cell. 97: 527 538.

158. Chong L., van Steensel B., Broccoli D., Erdjument-Bromage H., Hanish J., Tempst P., de Lange T. 1995. A human telomeric protein. Science. 270. 1663-1667.

159. Cifone M. A., Fiedler I. J. 1981. Increasing metastatic potential is assosiated with increasing genetic instability of clones isolated from murine neoplasms. Proc. Nat. Sci. USA. 78: 6949 6952.

160. Cimini D., Antoccia A., Tanzarella C., Degrassi F. 1997. Topoisomerase II inhibition in mitosis produces numerical and structural chromosomal aberrations in human fibroblasts. Cytogenet. Cell Genet. 76: 61 -67.

161. Clarke D. J., Johnson R. T., Downes C. S. 1993. Topoisomerase II inhibition prevents anaphase chromatid segregation in mammalian cells independently of the generation of DNA strand breaks. J. Cell Sci. 105: 563 -569.

162. Cortes F., Pinero J., Palitti F. 1993. Cytogenetic effects of inhibition of topoisomerase I or II activies in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8. Mutat. Res. 288: 281 289.

163. Counter C. C., Avilion A. A., Le Feuvre C.E., Stewart N. G., Greider C. W., Harly C. B., Bacehetti S. 1992. Telomere shortering associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. EMBO. 11: 1921 -1929.

164. Cox R. P., Krauss M. R., Balis M. E., Dancis J. 1972. Communication between normal and enzyme-deficient cells in tissue culture. Exp. Cell Res. 74: 251 268.

165. Cram L.S., Bartholdi M.F., Ray F.A. Travis G. L., Kraemer P. M. 1983. Spontaneous neoplastic evolution of Chinese Hamster cells in culture, multistep progression of karyotype. Cancer Res. 43: 4828 4837.

166. Cunha R.A.F., Takimoto M.S. 1994. Clastogenic effects caused by certain serotypes of Ureaplasma urealyticum on human chromosomes. IOM Lett. 3: 643 644.

167. De Vries G., Vogelzang A. 1967. Mycoplasma and Down's syndrome. Lancet. 1: 160-161.

168. Di Leonardo A., Carolina P., Maddalena A. 1993. DNA topoisomerase II inhibition and gene amplification in V79/B7 cells. Mutat. Res. 301: 177 -183.

169. Downes C. S., Clarke D. J., Millinger A. M., Gimenez Abiun J. F., Creighton A. M., Johnson R. T. 1994. A topoisomerase II - dependent G2 cycle check-point in mammalian cells (Erratum). Nature. 372: 467 - 470.

170. Ducray C., Pommier J -P., Martins L., Boussin F. D., Sabatier L. 1999. Telomere dynamics, end-to-end fusions and telomerase activation during the human fibroblast immortalization process. Oncogene. 18: 4211 -4223.

171. Dutrillaux B., Croquette M. F., Viegas-Pequignot E., Aurias A., Coget J., Couturier J., Lejeune J. 1978. Human somatic chromosome chains and rings: a preliminary note on end-to-end fusions. Cytogenet. Cell Genet. 20: 70-77.

172. Earnshaw W. C., Migeon B. R. 1985. Three related centromere proteins are absent from the inactive centromere of a stable isodicentric. Chromosoma. 92: 290 296.

173. Earnshaw W. C., Ratrie H., Stetten G. 1989. Visualization of centromere proteins CENP B and CENP - C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads. Chromosoma. 98: 1-12.

174. ECACC. 1992. European collection of animal cell cultures. Catalogue of Cell lines and services. 4th edition.

175. Ellis R. J., van der Vies S. M. 1991. Molecular chaperones. Ann. Rev. Bioch. 60: 321 347.

176. Elsea S. H., Osheroff N., Nitiss J. L. 1992. Cytotoxicity of quinolones toward eukaryotic cells: identification of topoisomerase II, as the primary cellular target for the quinolone CP-115, 953 in yeast. J. Biol. Chem. 267: 13150-13153.

177. Feder J. H., Rossi J. M., Solomon N., Lindquist S. 1992. The consequences of expressing hsp70 in Drosophila in normal temperatures. Genes, Development. 6: 1402 -1413.

178. Fett-Conte Agnes C., Liedtke H. Jr., Chaves H., Thome J. A., Tajara E.H. 1993. Telomeric fusions in a Wilm's tumor. Cancer Genet. Cytogenet. 69: 141 -145.

179. Figueroa J., Saffrich R., Ansorge W., Valdivia M. 1998. Microinjection of antibodies to centromere protein CENP A arrests cells in interphase but does not prevent mitosis. Chromosoma. 107: 397 - 405.

180. Finn G. K., Kuzz B. W., Cheng R. Z., Shmookler R. J. 1989. Homologous plasmid recombination is elevated in immortally transformed cells. Mol.Cell Biol. 9: 4009 4017.

181. Fitzgerald P. H., 1975. A mechanism of X chromosome aneuploidy in lymphocytes of aging women. Humangenetic. 28: 153 -158.

182. Fitzgerald P.H., McEwan C.M. 1977. Total aneuploidy and age-related sex chromosome aneuploidy in cultured lymphocytes of normal men and women. Hum. Genet. 39: 329 337.

183. Fitzgerald P.H., Morris C.M., 1984. Telomeric associations of chromosomes in B cell lymphoid leukemia. Hum. Genet. 67: 385 - 390.

184. Fogh J., Fogh H.1965. Chromosome changes in PPLO-infected FL human amnion cells. Pros. Soc. Exp. Biol. Med. 119: 233 238.

185. Fogh J., Fogh H. 1967. Irreversibility of major chromosome changes in a mycoplasma modified line of FL human amnion cells. Pros. Soc. Exp. Biol. Med. 126: 67-74.

186. Fogh J., Fogh H. 1968. Karyotypic changes in mycoplasma-modified line of FL human amnion cells. Pros. Soc. Exp. Biol. Med. 129: 944 950.

187. Ford J. H., Russel J. A. 1985. Differences in the error mechnisms affecting sex and autosomal chromosomes in women of different ages within the reproductive age group. Am. J Hum. Genet. 37: 973 983.

188. Fredga K. 1971.ldiogram and fluorescence patterns of the chromosomes of the Indian muntjac. Hereditas. 68: 332-337.

189. Freedlanskaya I. I., Drexler H., Mac Leod R., Efremova T. N., Voges M., Poljanskaya G. G. 1994. Mycoplasma infection and ciprofloxacin mycoplasma erradication in mammalian cell lines; Cytogenetical assay. IOM Lett. 3, P126: 308.

190. Freedlanskaya I. I., Poljanskaya G. G., Efremova T. N., Pinaev G. P. 1992. Animal cell culture collection in Russia. In vitro. 28 (3, part 2): P169A.

191. Fukagawa T., Pendón C., Morris J., Brown W. 1999. CENP C is necessary but not sufficient to induce formation of a functional centromere. EMBO. 18: 4196-4210.

192. Fulton A. M., Bond D. J. 1984. Dymethylsulfoxide induces aneuploidy in a fungal test system. Mol. Gen. Genet. 197: 347 349.

193. Gallardo M. H., Bickham J. W., Honeycutt R. C., Ojeda R. A., Kohler N. 1999. Discovery of tetraploidy in a mammals. Nature. 401: 341.

194. Galloway S. M., Buckton K. E. 1978. Aneuploidy and ageing: chromosome studies on a random sample of the population using G-banding. Cytogenet. Cell Genet. 20: 78 95.

195. Garagna S., Broccoli D., Redi C. A., Searle B., Cooke H. J., Capanna E. 1995. Robertsonian metacentrics of the house mouse lose telomericsequences but retain some minor satellite DNA in the pericentromeric area. Chromosoma. 103: 685 692.

196. Gille J.J.P., Joenje H. 1989. Chromosomal instability and progressive loss of chromosomes in HeLa cells during adaptation to hyperoxic growth conditions. Mutat. Res. 219: 231 -240.

197. Gille J. J. P., Mullaart E., Vijg J., Leyva A. L., Arvert F„ Joenje H. 1989. Chromosomal instability in an oxygen-tolerant variant of Chinese hamster ovary cells. Mutat. Res. 219: 17 28.

198. Goswami P. C., Roto Roti J. L., Hunt C. R. 1996. The cell cycle-coupled expression of a-topoisomerase II a during S phase is regulated by mRNA stability and is disrupted by heat shock or ionizing radiation. Mol. Cell. Biol. 16: 1500-1508.

199. Grewal M. S., Dev V.G., Miller D. A., Miller O.J. 1971. Quinacrine fluorescent patterns of the chromosomes in cell lines of the rat-kangaroo {Potorous tridactylis apicalis). Exp. Cell Res. 69: 241-244.

200. Gupta P., Sharma T. 1981. Non-random distribution of aberrations and identification with C- and G-bandings of the position of breakage points on Muntjak chromosomes induced by mytomycin C, bromodeoxyuridine and hydroxylamine. Mutat. Res. 81: 63 74.

201. Guzhova I., Negulayev Yu., Kinev A., Margulis B. A. 1994. Interaction of exogenous hsp70 with the cell surface. Micromolecules and stressresponse: Abstr. Of Workshop of ESF network on stress genes and their protein products. Rome, Italy: P. 52.

202. Haaf T., Schmid M. 1990. Y isochromosome associated with a mosaic karyotype and inactivation of centromere. Hum. Genet. 85: 486 490.

203. Hadlaczky Gy., Went M., Ringertz N. R. 1986. Direct evidence for the non-random localization of mammalian chromosomes in the interphase nucleus. Exp. Cell Res. 167: 1 -17.

204. Hammond C., Helenius A. 1995. Quality control in the secretory pathway. Curr. Opin. Cell Biol. 7: 523 529.

205. Hando J. C., Nath J., Tucker J. D. 1994. Sex chromosomes, micronuclei and aging in women. Chromosoma. 103: 186 -192.

206. Harley C.B., Futcher A.B., Greider C.W. 1990. Telomeric shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345: 458 460.

207. Hastie N. D., Allshire R.C.1989. Human telomeres: fusion and interstitial sites. Trends Genet. 5: 326 321.

208. Hastie N. D., Dempster M., Dunlop M. G., Thompson A. M., Green D. F., Allshire R. C. 1990. Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing. Nature. 346: 866 868.

209. Hayashi K., Schmid W., 1975. Tandem duplication q14 and dicentric formation by end to end chromosome fusions in Ataxia telangiestasia. Humangenetic. 30: 135-141.

210. Heneen W. K., 1976. HeLa cells and their possible contamination of other cell lines: karyotype studies. Hereditas. 82: 217 248.

211. Hittelman W. N., Rao P. N. 1974. Bleomycin-induced damage in prematurely condensed chromosomes and its relationship to cell cycle progression in CHO cells. Cancer Res. 34: 3433 3439.

212. Jacobs P. A., Court-Brown W. M., Doll R. 1961. Distribution of human chromosome counts in relation to age. Nature. 191: 1178.

213. Johnson A. D., Tytell M., 1993. Exogenous HSP70 becomes cell associated, but not internalized, by stressed arterial smooth muscle cells. In vitro Cell Develop. Biol. 29A: 807 812.

214. Jovtchev G., Stergios M., Rieger R., Michaelis A. 1993. Modulatory effects of novobiocin, actinomycin D and caffeine on heat shock protection against induction of chromatid aberrations by maleic hydrazide in Hordeum vulgare. Biol. Zbl. 112: 358 364.

215. Kapoor M., de Oca Luna., Liu G., Lozano G., Cummings C., Mancini M., Ouspenski I., Brinkley B. R., May G. S. 1998. The CENP В gene is not essential in mice. Chromosoma. 107: 570 - 576.

216. Karlseder J., Broccoli D., Dai Y., Hardy S., de Lange T. 1999. P53 -and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science. 283: 1321 -1325.

217. Katzenel A., Tarshis M., Rottem S. 1998. Survival of M. penetrans with HeLa cells. IOM Lett. 5: 193.

218. Khan M., Smith M. 1984. Report of the commitee on the genetic constitution of chromosome 7, 8 and 9. Human gene mapping 7. Cytogenet. Cell Genet. 39: 71 -102.

219. Kobayashi M. K.H., de Campos Bicudo H. E. M. 1997. Inversion polymorphism in laboratory strains and natural samples of Drosophila sturtevanti. Cytobios. 89: 7-21.

220. Kohno S. I., Minowada J., Sandberg A. A. 1980. Chromosome evolution of nearhaploid clones in an established human acute lymphoblastic leukemia cell line (Nalm-16). J. Nat. Cancer Inst. 64: 485 493.

221. Kondo I., Shimizu N. 1983. Mapping of the human gene for epidermal growth factor receptor (EGER) on the p13-q22 region of chromosome 7. Cytogenet. Cell Genet. 35: 9-14.

222. Kotani H., Phillips D., McGarrity G. J. 1986. Malignant transformation of NIH3T3 and CV-1 cells by a helical mycoplasma, Spiroplasma mirum, strain SMCA. In vitro. 22: 756 763.

223. Kovacs G., Muller-Brechlin R., Szucs S.1987. Telomeric association in two human renal tumors. Cancer Genet. Cytogenet. 28: 363 366.

224. Kraemer P.M., Deaven L. L., Crissman H. A., Van Dilla M. A. 1972. DNA constancy despite variability in chromosome number. Adv. Cell Mol. Biol. 2: 47-108.

225. Mac Donald C., Watts P., Stuart B., Kreuzbarg-Duffy U., Scott DM., Kinne R.K. 1991. Studies on the phenotype and karyotype of immortalized Rabbit kidney epithelial cell line. Exp. Cell Res. 195: 458 -461.

226. MacPherson J., Montagnier L., 1964. Agar suspension culture for the selective assay of cells transformed by polyoma virus. Virology. 23: 291 -294.

227. Malpoix P., Poljanskaya G, 1979. Dyserythropoietic cytological anomalies preceding changes in proliferation and differentiation. Adv. In Comparative Leukemia Res.: 65 -66.

228. Mamaev N., Mamaeva S. 1990. Nucleolar organizer region activity in human chromosomes and interphase nuclei of normal, leukemic and tumor cells, as evaluated by silver staining. Int. Rev. Cytol. 121: 233 266.

229. Mamaeva S. E. 1998. Karyotypic evolution of cells in culture: a new concept. Int. Rev. Cytol. 178: 1 -40.

230. Mandahl N., Heim S., Kristoffersson U., Mitelman F., Rooser B., Rydholm A., Willen H. 1985. Telomeric association in a malignant fibrous histiocytoma. Hum. Genet. 71: 321 324.

231. Mandahl N., Heim S., Arheden K., Rydholm A., Willen H. Mitelman F. 1988. Rings, dicentrics and telomeric association in histiocytomas. Cancer Genet. Cytogenet. 30: 23 33.

232. Margulis B. A., Guzhova I., Welsh M., Kinev A., Lasunskaya E., Darieva Z., Nilsson K. 1993. Stress-induced post-translational protein modifications. Abstr. of Workshop of ESF network on stress genes and their protein products. Paris, France. P13.

233. Margulis B. A., Nachrov P. V., Tsvetkova O., Welsh M., Kinev A. 1991. The characterization and use of different antibodies against the HSP70 major heat shock pritein family for the development of an immunoassay. Electrophoresis. 12: 670-673.

234. Mark H. F., Naram R., Santoro K., Bland K. I. 1995. A study of induced genotoxicity in MRC-7 cells. Cytobios. 84: 171 -177.

235. Matlashewski G., Osborn K., Banks L., Stanley M., Crawford L.1988. Transformation of primary human fibroblast cells with human papillomavirus type 16 DNA and Ej ras. Int. J. Cancer. 42: 232 - 238.

236. McGarrity G.J., Vanaman V., Sarama J. 1984. Cytogenetic effects of mycoplasmal infection of cell cultures: a review. In vitro. 20: 1-19.

237. McKusick V. 1980. The anatomy of the human genome. J. Hered. 71: 370 391.

238. Merry D. E., Pathak S., Hsu T. C., Brinkley B. R. 1985. Anti-kinetochore antibodies: use as probes of inactive centromeres. Am. J. Hum. Genet. 37: 425 430.

239. Meyne J., Ratliff R. L., Moyzis R. K. 1989. Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates. Proc. Natl. Acad Sci USA. 89: 7049 7053.

240. Miller R. G., Nickols W.W., Pottash J., Aronson M.M. 1977. In vitro aging. Cytogenetic comparison of diploid human fibroblast and epithelioid cell lines. Exp. Cell Res. 110: 63-73.

241. Monteagudo L.V., Arruga M.V. 1991. NOR activity interaction among the chromosomes of common rabbit: a statistical analysis. Caryologia. 44: 85 -91.

242. Moorhead P. S., Saksela E. 1965. The sequence of chromosome aberrations during SV40 transformation of a human diploid cell. Hereditas. 52: 271 284.

243. Morgan R., Jarzabek V., Jaffe J. P., Hecht B.K., Hecht F., Sandberg A. A. 1986. Telomeric fusion in pre-T- cell acute lymphoblastic leukemia. Hum. Genet. 73: 260 263.

244. Morimoto R. I., Tissieres A., Georgopoulos C. 1990. The stress response, function of the proteins, and perspectives. Stress proteins in biology and medicine. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press: 1 36.

245. Morita T., Nagaki T., Fukuda I., Okumura K. 1991. Effect of pH on the activity and stability of clastogens in the in vitro chromosomal aberration test with Chinese hamster ovary K1 cells. Mutat Res. 262: 159 166.

246. Morita T., Takeda K., Okumura K. 1990. Evaluation of clastogenicity of formic acid, acetic acid and lactic acid on cultured mammalian cells. Mutat. Res. 240: 195-202.

247. Mowles J. M., 1988. The use of ciprofloxacin for the eliminator of mycoplasma from naturally infected cell lines. Cytotechnology. 1: 355 358.

248. Mukherjee A., Sen S., Agarwal K. 1993. Ciprofloxacin: mammalian DNA topoisomerase type 2 poison in vitro. Mutat. Res. 301: 87 92.

249. Mukherji B., MacAlisterT. J., Guha A., Gillies G., Jeffers D. C., Slocum S. K. 1984. Spontaneous In vitro transformation of human fibroblasts. J. Nat. Cancer Inst. 73: 583 594.

250. Murakami H., Masui H., Sato G. H., Sueoka N., Chow T. P., Kasro -Sueoka T. 1982. Growth of hybridoma cells in serum-free medium: ethanolamine is an essential component. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79: 1158 -1162.

251. Mutchinick D., Ruz L., Casas L. 1980. Time of first generation metaphases. 1. The effect of various culture media and of fetal calf serum in human lymphocyte cultures. Mutat. Res. 72: 127 -134.

252. Nakagome Y., Abe Т., Misawa S., Takeshita Т., linuma K. 1984. The «loss» of centromeres from chromosomes of aged women. Am. J. Hum. Genet. 36: 398 404.

253. Nanda I., Schneider-Rasp S., Winking H., Schmid M. 1995. Loss of telomeric sites in the chromosomes of Mus musculus domesticus (Rodentia: Muridae) during Robertsonian rearrangements. Chromosome Res. 3: 399 -409.

254. Nath J., Tucker J. D., Hando J. C. 1995. Y chromosome aneuploidy, micronuclei, kinetochores and aging in men. Chromosoma. 103: 725 731.

255. Negulyaev Y. A., Vedernikova E. A., Kinev A. V., Voronin A. P. 1996. Exogenous heat shock protein hsp70 activates potassium channels in U 937. Biochim. Biophys. acta. 1291: 156 -162.

256. Nielsen K. 1972. The chromosomes of an in vitro derivative of an Ehrlich ascites tumor of the mouse during its adaptation from monolayer to suspension culture. Hereditas 70: 217 -224.

257. Nikolis J., Kekic V. 1988. Evidence for a compensatory mechanism regulating Ag-NOR activity in families with de novo 21,21 translocation Down syndrome. Cytogenet. Cell Genet. 47:197 200.

258. Parry J. M., Parry E. M. 1987. Comparisons of tests for aneuploidy. Mutat. Res. 181: 267-287.

259. Pathak S., Wang Z., Dhaliwal M. K., Sacks P. S. 1988. Telomeric association: another characteristic of cancer chromosomes. Cytogenet. Cell Genet. 47:227 229.

260. Paton G. R., Jacobs I.P., Perkins F.T.1965. Chromosome changes in human diploid cell cultures infected with Mycoplasma. Nature. 207: 49-51.

261. Patterson M. K., Maxwell M. D., Conway E. 1969. Studies on the asparagine requirement of the Jensen sarcoma and derivation of its nutritional variant. Cancer Res. 29: 296 305.

262. Paul J., 1975. Cell and tissue culture. Edinburgh: Livingstone. 490 p.

263. Pillidge L., Downes C. S., Jonson R.T. 1986. Defective post-replication recovery and U.V. sensitivity in a simian virus 40-transformed Indian muntjac cell line. Int. J. Radiat. Biol. 50: 119 -136.

264. Poljak L., Kas E., 1995. Resolving the role of topoisomerase II in chromatin structure and function. Trends in Cell Biol. 5: 348 355.

265. Poljanskaya G. G., Efremova T. N., Sakuta G. A. 1999. Karyotypic variability of «markerless» continuous cell lines. Mol. Biol. Cell, Suppl, Abstracts 39th ASCB annual meeting. 10: 282.

266. Rao P. N., Engelberg J. 1965. Hela cells: effects of temperature on the life cycle. Science. 148: 1092 -1094.

267. Ray F.A., Meyne J., Kraemer P.M., 1992. SV-40T antigen induced chromosome changes reflect a process that is both clastogenic and aneuploidogenic and is ongoing throughout neuplastic progression of human fibroblasts. Mutat. Res. 284: 265 275.

268. Razin S., Barile M.F. 1985. Cytogenetics effects of mycoplasmas. The mycoplasmas. Vol. 4. Mycoplasma patogenecity. New York, London. Acad. Press. 508 p.

269. Reddel R. R. 1998. Genes involved in the control of cellular proliferative potential. In: Annales of the New York Academy of Science. 854: 8-19.

270. Retzlaff C., Yamamoto Y., Hoffman P. S., Friedman H., Klein T.W. 1994. Bacterial heat shock proteins directly induce cytokine mRNA and interleukin-1 secretion in macrophage cultures. Infect. Immun. 62: 5689 -5693.

271. Rey J. A., Bello M. J.Ramos C., Benitez J., Muelas J. M. 1983. Serial cytogenetic study of a human glioma cell line. Cancer Genet. Cytogenet. 8: 287 -295.

272. Rieder C. L., Salmon E. D. 1998. The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis. Trends in Cell Biol. 8: 310 318.

273. Rottem S., Naot Y., 1998. Subversion and exploitation of host cells by mycoplasmas. Trends in microbiology. 6: 436 441

274. Rudd N. L., Hoar D. I., Williams S. E., Hennig U. G. G. 1989. Genotype and the cryopreservation process affect the levels of aneuploidy and chromosome breakage in cultured human fibroblasts. Genome. 32: 196 202.

275. Ryan A.J., Johnson R.T. 1996. Dominant genetic instability and sensitivity to DNA damaging agents in a Mammalian Cell line. Somat. Cell Mol. Genet. 22: 177-189.

276. Saksela E., Saxen E., Penttinon K. 1960. Further studies on the growth controlling action of human serum on cells cultivated in vitro. Exp. Cell Res. 19: 402-404.

277. Saltman D., Morgan R., Cleary M. L., de Lange T. 1993. Telomeric structure in cells with chromosome end associations. Chromosoma. 102: 121 -128

278. Saltman D., Ross F. M., Fantes J. A., Allshire R., Turner G. E., Evans H.J. 1989. Telomeric associations in a lymphoblastoid cell line from a patient with B cell follicular lymphoma. Cytogenet. Cell Genet. 50: 230 - 233.

279. Samali A., Cotter T. G., 1996. Heat Shock proteins increase resistance to apoptosis. Exp. Cell Res. 223: 163-171.

280. Sarlangue J., Poutiers F., Benaudin H., Bebear C. 1992. Assay the several antibiotic treatments for elimination of mycoplasmas from cell cultures. IOM Lett. 2: 312.

281. Saveljeva L., Mamaeva S. 1988. Population analysis of karyotypic heterogeneity of the Raji, Burkitt lymphoma cell line: analysis of 100 karyotypes. Cancer Genet. Cytogenet. 34: 63 75.

282. Schmitt K., Daubener W., Bitter-Suerman D., Hadding U. 1988. A safe and efficient method for elimination of cell culture mycoplasmas using cyprofloxacin. J. Immunol. Meth. 109: 17 -25.

283. Schubert I., Schriever-Schwemmer G., Werner T., Adler l.-D. 1992. Telomeric signals in Robertsonian fusion and fission chromosomes: implications for the origin of pseudoaneuploidy. Cytogenet Cell Genet. 59: 6 -9.

284. Seabright M. A. 1971. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2: 971 972.

285. Sen P., Sharma T. 1985. Characterization of G-banded chromosomes of the Indian muntjak and progression of banding patterns through different stages of condensation. Cytogenet. Cell Genet. 39:145-150.

286. Shaw M. W., Krooth R. S. 1964. The chromosomes of the tasmanian rat- kangaroo (Potorous tridactylis apicalis). Cytogenet. 3: 19-33.

287. Shepard J. S., Pettengill 0. S., Wurster-Hill D. H., Sorenson G. D. 1979. Karyotypic evolution associated with loss of tumorigenicity. JNCI. 62: 547 555.

288. Shubber E. K., Al-Allak B. M. A., Nada S. M. 1987. Spontaneous frequencies of chromosomal aberrations and sister chromatid exchanges in human lymphocytes, II. Effects of serum, incubation time and blood storage, the Nucleus. 30: 21 28.

289. Slijepcevic P., Hande M. P., Bouffler S.D., Lansdorf P., Bryant P.E. 1997. Telomere length, chromatin structure and chromosome fusigenic potential. Chromosoma. 106: 413 421.

290. Slijepcevic P., Bryant P. E. 1995. Absence of terminal telomeric FISH signals in chromosomes from immortal Chinese hamster cells. Cytogenet. Cell Genet. 69: 87 89

291. Smith P. J. S., Duthie G. G., Shipley A., Tytell M. 1993. Steady-state calcium effect from Aplysia neurons: perturbation by H202 and protection by stress protein, hsp70. Biol. Bull. 185: 293-294.

292. Speight J., Smith E., Baba W., Wilson G. 1968. Lymphocyte chromosomes in untreated and 131J-treated thyrotoxic patients. J. Endocrinol. 42: 277 282.

293. Sperling K., Ludtke E. K. 1981. Arrangement of prematurely condensed chromosomes in cultured cells and lymphocytes of the Indian muntjac. Chromosoma. 83: 541 553.

294. Stanbridge E., Onen M., Perkins F.T., Hayflick L. 1969. Karyological and morphological characteristics of human diploid cell strain WI-38 infected with mycoplasmas. Exp. Cell Res 57: 397 410.

295. Steel C. M., Shade M., Woodward M. A. 1980. Chromosome aberrations acquired in vitro by human B-cell lines. Gains and losses of material. J. Nat. Cancer Inst. 65: 95 100.

296. Stewart S. D., Watson H.L., Cassell G.H.1994. Investigation of the clastogenic potential of Ureaplasma urealyticum on human leukocytes. IOM Lett. 3: 662 663.

297. Stobetsky V. I. 1978. Mammalian polykaryocytes in vitro II. The phenomenon of delayed disruption of telomeric links between chromosomes. Biol. Zbl. 97: 595 604.

298. Strauss B. S. 1990. The control of O6 methylguanine - DNA methyltransferase (MGMT) activity in mammalian cells: A pre-molecular view. Mutat. Res. 233: 139-150.

299. Sturrock J. E., Nunn J. F. 1978. Cromosomal damage and mutations after exposure of Chinese hamster cells to high concentrations of oxygen. Mutat Res. 57: 27 33.

300. Subak-Sharpe H., Burk R. R., Pitts J. D. 1966. Metabolic cooperation by cell to cell transfer between genetically different mammalian cells in tissue culture. Heredity. 21: 342-343.

301. Sullivan B. A., Willard H. F. 1998. Stable dicentric X chromosomes with two functional centromeres. Nature Genet. 20: 227 228.

302. Sumner A. T. 1972. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Exp. Cell Res. 75: 304 306.

303. Sumner A. T. 1995. Topoisomerase II and chromosome segregation. Proc. on chromosome segregation and aneuploidy. Edit, by A. Abbondandolo, B.K. Vig, R.Roi. April 24-29, Sorrento, Italy: 121 -132.

304. Suzuki H., Nakane S. 1994. Differential induction of chromosomal aberrations by topoisomerase inhibitors in culture Chinese hamster cells. Biol, and Pharm. Bull. 17: 222 226.

305. Szostak J.W., BlackburnE.H. 1982. Cloning yeast telomeres on linear plasmid vectors. Cell. 29: 245 255.

306. Taylor A. M., Oxford J. M., Metcalfe J. A. 1981. Spontaneous cytogenetic abnormalities in lymphocytes from thirteen patients with ataxia telangiectasia. Int. J. Cancer. 27: 311 -319.

307. Taylor-Robinson D., Davies H. A., Sarathchandra P., Furr P. M. 1991. Intracellular location of mycoplasmas in cultured cells demonstrated by immunocytochemistry and electron microscopy. Int. J. Exp. Path. 72: 705 -714.

308. Therman E., Trunca C., Kuhn E. M., Sarto G. E. 1986. Dicentric chromosomes and the inactivation of the centromere. Hum. Genet. 72: 191 -195.

309. Thielmann H. W., Fischer E. 1983. Spontaneous in vitro malignant transformation in a xeroderma pigmentosum fibroblast line. Int. J. of Cancer. 31:687-700.

310. Thompson K. V. A., Holliday R., 1975. Chromosome changes during the in vitro ageing of MRC-5 human fibroblasts. Exp. Cell Res. 96: 1 6.

311. Trewyn R. W., Kerr S. J., Lehman J. M. 1979. Karyotype and Tumorigenicity of 1-methylguanine transformed Chinese Hamster Cells. 62: 633 - 638.

312. Tytell M., Barbe M. F., Brown I. R. 1994. Induction of heat shock (stress) protein 70 and its mRNA in the normal and light-damaged rat retina after whole body hyperthermia. Neurosci. Res. 38: 19 31.

313. Vig B. K. 1984. Sequence of centromere separation: orderly separation of multicentric chromosomes in mouse L cells. Chromosoma. 90: 39 - 45.

314. Vig B. K., Broccoli D. 1988. Sequence of centromere separation: differential replication of pericentric heterochromatin in multicentric chromosomes. Chromosoma. 96: 311 -317.

315. Vig B. K., Paweletz N., Schroeter D.1989. Sequence of centromere separation: kinetochore formation and DNA replication in dicentric chromosomes showing premature centromere separation in rat cerebral cells. Cancer Genet. Cytogenet. 38: 283 296.

316. Vig B. K., Swearngin S. E. 1985. Sequence of centromere separation: premature centromere separation in multicentric chromosomes. Cytobios. 43: 253 262.

317. Vig B. K., Willcourt M. 1998. Decondensation of pericentric heterochromatin alters the sequence of centromere separation in mouse cells. Chromosoma. 107: 417 -423.

318. Voronin A., Aseeva E., Kinev A., Margulis B.1995. The exogenous HSP70/HSC70 decreases DNA synthesis in human leukemia U 937 cells. Biology of molecular chaperones: Abstr. Of ESF and Euroconferences meeting. Grete (Greece): 102.

319. Wainwright L. J., Middleton P. G., Rees J. L. 1995. Changes in mean telomere length in basal cell carcinomas of the skin. Genes, Chromosomes, Cancer. 12: 45-49.

320. Wandall A. 1994. A stable dicentric chromosome: both centromere develop kinetochores and attach to the spindle in monocentric and dicentric configuration. Chromosoma. 103: 56-62.

321. Wang S., Grash R.N., Chellappan S.P. 1998. Raf -1 physically interacts with Rb and regulates its function: a link between mutagenicsignaling and cell cycle regulation. MCB (Mol. And Cell Biol ). 18: 7487 -7498.

322. Welch W. J., Feramisco J.R. 1985. Rapid purification of mammalian 70.000-dalton stress proteins: affinity of the proteins for nucleotides. Mol. Cell Biol. 5: 1229-1236.

323. Whitaker A. M., Gould J., Smith E. M. 1974. Chromosomes of WI-38. The effect of repeated subcultivations and of a serum with an unusual property. Exp. Cell Res. 87: 55 62.

324. Wolman S. R., Hirschhorn K., Todaro G.J. 1964. Early chromosomal changes in SV40 infected human fibroblast cultures. Cytogenetics. 3: 45 61.

325. Wolman S. R., Steinberg M.L., Defendi V. 1980. Simian virus 40-induced chromosome changes in human epidermal cultures. Cancer Genet. Cytogenet. 2: 39 46.

326. Wright W.E., Shay J. W. 1992. Telomere positional effects and the regulation of cellular senescence. Trends in Genetics. 8: 193 -197.

327. Wright W. E„ Tesmer V. M., Huffman K. E., Levene S. D., Shay J. W. 1997. Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end. Genes & development. 11: 2801 2809.

328. Wurster D. H., Benirschke K. 1970. Indian muntjac, Muntiacus muntjak: a deer with a low diploid chromosome number. Science. 168: 82 84.

329. Yamaguchi N., Huh N. 1979. Establishment and characterization of Indian muntjak cell lines transformed with simian virus 40. J. Gen. Virol. 42: 289 296.260

330. Автор выражает чувство глубокой благодарности профессору Георгию Петровичу Пинаеву, который оказывал постоянную поддержку автору в процессе выполнения работы.

331. Автор глубоко признателен всем своим соавторам. Особенно хочется поблагодарить Олега Константиновича Глебова, Ирину Исааковну Фридлянскую, Татьяну Николаевну Ефремову, Галину Анатольевну Сакута и Владимира Андреевича Самокиша.г<ьга1 1 11б1

Информация о работе

Полянская, Галина Георгиевна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.25

Диссертация

Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных условиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы