Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и культурно-морфологическая характеристика кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение и культурно-морфологическая характеристика кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки"

На правах рукописи

Фридман Михаил Львович

ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЕРАТИНОЦИТОВ КОЖИ ПЛОДОВ КРОЛИКА, КОШКИ, СОБАКИ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003460451

Но правах рукописи

Фридман Михаил Львович

ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТУ РАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЕРАТИНОЦИТОВ КОЖИ ПЛОДОВ КРОЛИКА, КОШКИ, СОБАКИ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ) имени Я.Р. Коваленко

Научный руководитель:

Лауреат премии Совета Министров СССР, заслуженный деятель науки РФ, доктор биологически* нйук, профессор Дьяконов Лев Петрович

Официальные оппоненты!

Доктор биологических наук, профессор Кузнецова Светлана Владимировна Доктор биологических наук, профессор Смирнова Елена Александровна

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина

Защита состоится 20 февраля 2009 в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбинат, тел/факс (495) 526-43-74; vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ

Автореферат разослан 19 января 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Кожа образует внешний покров организма и играет важную физиологическую роль. Она представляет собой важный объект для фундаментальных и прикладных исследований в биотехнологии, ветеринарной и гуманитарной медицине.

Первыми практический интерес к культурам клеток кожи проявили ком-бустиологи, т.к. закрытие раневой поверхности имеет решающее значение в лечении пациентов с обширной ожоговой травмой.

Важную роль в регенерации кожного покрова играет эпидермис, основным клеточным компонентом которого являются кератиноциты. Принципиальная возможность использования для заживления ран аутологичных кератино-цитов кожи, выращенных in vitro, была показана ещё в сороковых годах XX века в работах профессора зоологии Лондонского университета P.B. Medawar (1948).

В то же время группа ученых, в процессе изучения вируса полиомиелита показала возможность использования различных клеточных культур и, в частности, культур клеток кожи в качестве моделей для изучения и накопления вирусов (Robbins F.C., Enders J.F., Weller Т.Н., 1949).

Первичные и органные культуры клеток кожи нашли широкое применение в исследованиях дермотропных вирусов, а также в производстве вакцин против них (Рысмендесва К.К., 1992; Wurster D.H., Benirschke К., 1970).

Получение и культивирование кератиноцитов осложнено их терминальной дифференцировкой и активным ростом привнесенных в первичную куль-гуру дермальных фибробластов.

Развитию методик получения и культивирования кератиноцитов способствовало изучение биологии дерматофитов и патогенеза дерматофитозов, т.к. жизнедеятельность этих г рибов тесно связана с кератином эпидермиса (Hu F., Livingood C.S. et al., 1954; Alteras I., Gavrilescu M, 1965).

Определенные успехи в массовом культивировании кератиноцитов были достигнуты к 1975 г. (Rheinwald J.G., Green Н., 1975). Впервые авторами было предложено разделение кожи по базальной пластинке на эпидермис и дерму, применение факторов роста и фидерных слоев клеток.

В нашей стране значительных успехов в культивировании кератиноцитов человека с целью трансплантации достигли A.B. Васильев, A.B. Волошин и В.В. Терских (Терских В.В., Васильев A.B., 1995).

Культуры кератиноцитов человека и различных видов животных обладают высоким пролиферативным потенциалом, поэтому хорошо зарекомендовали себя в трансплантологии и косметологии (трансплантационный материал), в тканевой инженерии (клеточные компоненты), в генной инженерии и терапии (источник генетического материала и стволовых клеток), в вирусологии (в качестве модели) в биотехнологии (субстраты для производства противовирусных вакцин), в фармакологии и токсикологии (модель для скрининга) и в др. областях науки.

Исследования по разработке и оптимизации методов получения и культивирования кератиноцитов человека и животных активно продолжаются и в настоящее время (M.S. Islam, Н.М. Zhou, 2007), т.к. существующие методики выделения и последующего субкультивирования кератиноцитов сопряжены с использованием специфических и дорогостоящих реактивов, применением сложных и длительных приемов культивирования, ряд которых накладывает ограничения на возможности дальнейшего изучения и применения полученных культур.

Немногочисленные постоянные линии кератиноцитов не способны обеспечить быстро растущие потребности различных областей науки и производства.

Таким образом, в научном и практическом отношениях представляется актуальной задача по разработке легко воспроизводимых и унифицированных для различных видов животных методик получения культур и постоянных кле-

точных линий ксратиноцитов, а также изучение их культурально-морфологических, кариологичееких и электронно-микроскопических свойств. Цель исследований. Получение и культурально-морфологическая характеристика ксратиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

■ получить первичные культуры клеток эпидермального слоя кожи плодов (ЭСКП) кролика, собаки, кошки;

■ получить субкультуры клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки с преобладанием в составе монослоя клеток эпителиоподобной морфологии;

■ провести сравнительное изучение культурально-морфолог ических свойств полученных культур со стабильной клеточной линией Г^К и диплоидным штаммом КЭК;

" провести сравнительный кариологический анализ полученных культур со стабильной клеточной линией ЯБК;

" провести ультраструктурное исследование полученных культур клеток;

■ изучить чувствительность полученных культур к различным вирусам;

• отработать метод глубокого замораживания (-196°С) полученных культур и депонировать их в криобанк ВИЭВ;

" на основе проведенных исследований разработать методические рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки. Научная новизна

Получены первичные культуры и субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки с использованием различных диспергирующих агентов.

Получен диплоидный штамм кератиноцитов кожи плода кролика и постоянная клеточная линия кератиноцитов кожи плода кролика. Изучены их культурально-морфологические и кариологические свойства. Представлена ультраструктурная характеристика полученных клеточных культур.

Показано, что субкультуры клеток ЭСКП кролика на 20 и 38 пассажах, диплоидный штамм клеток ЭСКП кролика на 45 пассаже, а также постоянная

клеточная линия ЭСКП кролика (ЭККПКр) обладают высокой чувствительностью к вирусу ВД-БС и слабой чувствительностью к вирусу ИРТ. Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований усовершенствованы методы получения первичных культур и субкультур клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки- Подучены и заложены н криобанк ВИЭВ субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки. Получен и заложен в криобанк ВИЭВ диплоидный штамм кератиноцигов кожи плода кролика и постоянная клеточная линия ЭККПКр. Показана возможность их использования в вирусологических исследованиях. Разработаны и опубликованы методические рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки. Апробация

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на:

■ Международной научной конференции «Сохранение генетических ресурсов» (Москва, ВИЭВ, 2006 г.);

■ 3-ем Всемирном конгрессе регенеративной медицины (Лейпциг, 2007 г.);

■ Методической комиссии и Ученом совете ВИЭВ (2008 г.);

■ Секции «Ветеринарной биотехнологии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 2008 г.

Личный вклад соискателя

Представленная диссертационная работа является результатом собственных научных исследований автора. Работа выполнялась под научным руководством Заслуженного деятеля науки РФ, д.б.н., профессора Дьяконова Льва Петровича, который оказывал научно-методическую помощь в проведении исследований и обобщении полученных результатов. Электронно-микроскопическое исследование и анализ результатов проведены совместно с д.б.н. Миллер Галиной Генриховной (Зав. лабораторией ассоциированных инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (РАМН))

Публикации

По материалам диссертации опубликовано б научных работ, 1 работа находится в печати. Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 135 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 14 таблицами, 63 рисунками. Список литературы включает 105 публикаций, в том числе 67 иностранных.

Обзор литературы В главе представлен обзор гистологического строения и эмбриогенеза кожи млекопитающих, описаны ранее полученные культуры клеток кожи, история их получения и представлены данные об их практическом применении, проведен анализ работ по получению и культивированию кератиноцитов млекопитающих.

Собственные исследования Материалы и методы Питательные среды н растворы

Использовали следующие питательные среды: Игла MEM, Игла MEM в модификации Дюльбекко (ДМЕМ), Игла с двойным набором аминокислот, среду 199, ГЛА. Питательные среды дополняли фетальной сывороткой КРС, а также растворами антибиотиков: раствором генгамицина или энросепта. Для дезагрегации тканей при получении первичной культуры использовали 0,25% раствор трипсина, 0,02% раствор версена и их смеси в различном соотношении, диспазу стерильную лиофилизироваиную, коллагеназу (тип IV) стерильную лиофилизированную. Для снятия клеток с субстрата при пассировании применяли смесь из 0,02% раствора версена и 0,25% раствора раствор трипсина в соотношении 1:9.

Для промывания исходного биологического материала и разведения дезагрегирующих ферментов применяли стерильный раствор Хенкса без ионов Са2' и Mg2+ или стерильный физиологический раствор.

При криоконсервации в качестве криопротекгора применяли раствор ДМСО.

Постоянные линии и диплоидные штаммы клеток

В качестве одного из объектов исследований использовали длительно-культивируемую постоянную клеточную линию ЯвК и диплоидный штамм КЭК. В вирусологических исследованиях применяли длительно-культивируемые постоянные клеточные линии КСТ и МОВК. Штаммы вирусов

Для тестирования чувствительности полученных клеточных культур использовали следующие вирусы, имеющие практическое значение в ветеринарии:

- ВД-БС - вакцинный штамм ВК-1 и штамм «МИР»;

- ИРТ - вакцинный штамм ТК-А (ВИЭВ) В-2 и штамм ТНЛ. Получение первичной культуры клеток кожи

Для получения первичной культуры ЭСКП кролика в качестве исходного материала использовали клинически здоровых беременных самок кролика. Убой крольчих производили под общей анестезией на 25-28 день после естественного оплодотворения. После убоя извлекали матку путем радикального кесарева сечения.

Для получения первичной культуры ЭСКП кошки и собаки в качестве исходного материала использовались матки беременных (45-58 день после оплодотворения) клинически здоровых животных, полученные в ходе радикального кесарева сечения или плоды, полученные в ходе консервативного кесарева сечения.

Транспортировку плодов или маток осуществляли в герметично закрывающейся стерильной емкости соответствующего объема при температуре +4°С. Максимальное время транспортировки составляло 4 часа.

Дезагрегацию кожной ткани проводили 0,25% раствором трипсина, смесями растворов трипсина (0,25%) и версена (0,02%) в различных соотношениях, раствором диспазы IV (0,4%) без ионов Ca2' и Mg2" и раствором коллагеназы IV типа (0,075%). Кожная ткань подвергалась различной экспозиции в дезагрегирующих растворах при различных температурных режимах. Подсчет концентрации клеток в суспензии

Для определения посевной и итоговой концентрации клеток в суспензии использовали счетную камеру Горяева. Количество клеток подсчитывали с помощью светового микроскопа. Концентрацию рассчитывали по общепринятой методике.

Определение доли жизнеспособных клеток и подсчет индекса пролиферации

Жизнеспособность клеток в суспензии определяли путем суправитально-го окрашивания суспензии 0,5% водным раствором трипановой сини: живые клетки не окрашиваются, а мертвые - окрашиваются в синий цвет. Индекс пролиферации определяли как отношение итоговой и посевной концентрации клеток.

Цитологические методы исследования

Для цитологического контроля культивируемых клеток готовили препараты, окрашенные азур Ii-эозином по методу Романовского-Гимза. Для оценки пролиферативной активности культивируемых клеток определяли митотиче-ский индекс в промилле (%о). Кариологическое исследование

Хромосомные препараты готовили по методу P.S. Moorhead, P.C. Nowell, W.J. Mellman et al. (1960) с небольшими модификациями. Кариологический анализ проводили ири световой микроскопии (увеличение х900) с масляной иммерсионной системой путем подсчета числа хромосом в 1000 метафазных пластинок.

Электронно-микроскопическое исследование

Ультратонкие срезы получали на ультратоме (Reichert Yang, Австрия), дополнительно контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и анализировали в электронном микроскопе JEM-100CX при ускоряющем напряжении 80kv и инструментальных увеличениях *5300, * 16000, ><28000 и ><53000. Вирусологические исследования

Вирусологические исследования проводили на базе кафедры вирусологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина. Изучали чувствительность полученных культур к вирусам ВД-БС и ИРТ. Исследовали также пригодность ЭККПКр для определения диагностического титра антител к ВД-БС в сывороках крови в РН. Чувствительность ЭККПКр сравнивали с данными, полученными на эталонной культуре КСТ. Для постановки реакции использовали микрометод. Криоконсервирование и создание банка культур клеток

Для криоконсервации осадок клеток ресуспендировали в криозащитной среде, состоящей из питательной среды (50%), сыворотки крови КРС (40%) и диметилсульфоксида (ДМСО) (10%). Достигали концентрации клеточной суспензии 3,5 млн.кл./мл криозащитной среды.

Взвесь клеток разливали в криоампулы объемом 2 мл, которые помещали в холодильник при температуре 4°С для эквилибрации в течение 1-2 часов. Дальнейшее замораживание клеток проводили по двухступенчатому режиму понижения температуры: от 0 до -30°С - со скоростью 1°С/мин., а от -30°С до -70°С - со скоростью 4-6°С/мин. Охлажденные до -70°С ампулы с суспензией клеток помещали в сосуды Дьюара с жидким азотом.

При необходимости восстановления культуры клеток ампулы извлекали из сосуда Дьюара и размораживали при температуре 37°С.

Результаты исследований Разработка оптимальных условий ферментативного разделения эпидер-малыюго и дермалыюго слоев кожи плодов кролика, кошки, собаки В качестве диспергирующих растворов использовали 0,25% раствор трипсина, смесь из 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соот-

ношении 1:1, смесь из 0,02% раствора всрсена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 7:1,0,4% раствор диспазы, 0,075% раствор коллагеназы IV.

Для выделения эпидермального слоя кожи мы использовали три различных режима ферментативной обработки биоптатов кожи плодов кролика, кошки и собаки: инкубирование в растворах ферментов при 30-32°С, инкубирование в растворах ферментов при 37°С, длительное инкубирование в растворах ферментов при 4-6°С в течение суток.

Разделения слоев кожи удалось достичь с применением 0,4% раствора диспазы: при 30-32°С - в течение 1-1,5 часов, при 37°С - в течение 30-40 мин., а при 4-6°С - в течение суток. Также разделения слоев кожи удалось достичь при использовании смеси из 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 7:1 в течение суток при 4-6°С.

Разработка оптимальных условий ферментативной дезагрегации ЭСКП кролика, кошки, собаки

В качестве диспергирующих растворов исиользовали растворы аналогичные примененным при разделении эпидермального и дермального слоев кожи плодов. Наилучшие результаты были достигнуты при использовании смеси из 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 7:1.

При дробной трипсинизации с циклом в 9-11 мин. наибольший выход жизнеспособных клеток наблюдался на 3-4 циклах дезагрегации. Жизнеспособность полученных клеток на этих циклах дезагрегации отличалась для плодов различных видов животных и составляла для кролика - 62,9-65,3%, для собаки - 52,8-56,7%, для кошки - 49,7-53,6%.

Разработка оптимальных условий культивирования первичной культуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки

При изучении влияния различных подложек на адгезию клеток первично дезагрегированного эпидермиса плодов кролика, кошки и собаки использовали белки, входящие в состав внеклеточного матрикса и базальной мембраны: коллаген I типа, коллаген IV тина, фибронектин.

С целью определения подложки, обеспечивающей оптимальную адгезию, суспензию- клеток в посевной концентрации разливали в покрытые различными белками культуральные флаконы. В качестве контроля использовали культу-ральные флаконы со стандартной поверхностью из полистирола.

Через 20, 30, 60 и 120 мин. проводили подсчет концентрации клеток и вычисляли долю адгезировавших клеток от посевной концентрации.

На всем протяжении опыта доля прикрепившихся клеток в контрольных культуральных флаконах была ниже, чем в опытных.

В течение 30 мин. наибольшая адгезия клеток ЭСКП кролика наблюдалась во флаконах с наслоенным коллагеном I типа (20,1%). Адгезия во флаконах с наслоенным коллагеном IV типа и фибронектином составила 8,3% и 12,9% соответственно. Через 120 мин. доля клеток, прикрепившихся к коллагену I типа - 35,8%, а к коллагену IV типа - 32,7%, что превысило долю клеток, прикрепившихся к фибронектину, более чем в 2 раза.

Аналогичная тенденция сохранилась и в отношении клеток ЭСКП собаки, хотя доля прикрепившихся клеток за аналогичные промежутки времени в этом случае была ниже.

Клетки ЭСКП кошки за 30 мин. активнее прикреплялись к фибронектину (9,8%) и несколько хуже к коллагену I типа (8,4%). Через 120 мин. доля клеток ЭСКП кошки прикрепившихся к коллагену I типа превысила долю клеток, прикрепившихся к фибронектину, более чем в 1,5 раза.

Определение эффективности ростовых свойств питательных сред для культивирования первичных культур ЭСКП кролика, кошки, собаки

Для культивирования использовали следующие питательные среды: Игла MEM, Игла ДМЕМ, Игла MEM с двойным набором аминокислот, 199, 0,5% гидролизат лактальбумина (ГЛА), а также смесь сред 199 и 0,5% ГЛА в соотношении 9:1. К средам добавляли фетальную сыворотку КРС в количестве 57%. Посевная концентрация составляла 400-500 тыс.кл./мл. Эффективность сред оценивали по времени формирования конфлюэнтного монослоя, а также оценивали индексы пролиферации. Монослой клеток ЭСКП кролика формиро-

вался на 5 сутки культивирования при использовании следующих питательных сред: Игла MEM, 199, а также смеси сред 199 и 0,5% ГЛА в соотношении 9:1. Однако наиболее быстрое формирование монослоя наблюдали при использовании сред Игла ДМЕМ и Игла MEM с двойным набором аминокислот - 100% монослой формировался на 4 сутки культивирования. Аналогичные результаты получены при культивировании клеток ЭСКП собаки. Клетки ЭСКП кошки также быстрее формировали монослой при использовании сред Игла ДМЕМ и Игла MEM с двойным набором аминокислот, однако монослой формировался в течение 6-7 суток.

Субкультивирование культур клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки

Одной из главных задач работы было получение штаммов эпителиопо-добных клеток ЭСКП кролика, собаки и кошки.

На различных циклах дезагрегации были получены культуры с не одинаковым соотношением фибробластоподобных и эпителиоподобных клеток в составе монослоя.

Для дальнейшей работы отбирались первичные культуры клеток, полученные в 4 цикле трипсинизации, т.к., в составе монослоя этих культур содержалось 58-82% эпителиоподобных клеток.

В процессе пассирования применялись такие методические приемы, как: " разделение, основанное на различной адгезивной способности эпидермо-цигов и фибробластов дермального слоя кожи плодов;

■ частичное отделение клеток от субстрата;

■ культивирование при малом содержании сыворотки в питательной среде;

■ культивирования клеток эпидермального слоя кожи плода кролика, кошки, собаки при физиологически низкой температуре 30°С

" культивирование с пересевом концентрированных суспензий клеток

Достичь положительного эффекта удалось лишь с применением пересева методом концентрированных суспензий (400-500 тыс.кл./мл или 0,8-1 млн.кл./мл). Формирование конфлюэнтного монослоя после подобного пересева наблюдалось у культур клеток ЭСКП кролика и собаки на 1-2 сутки, а у

культур клеток ЭСКП кошки на 2-3 сутки. После формирования конфлюэнтно-го монослоя пересев повторяли. Данный прием применяли на протяжении 5 пассажей. Уже после четвертого пассажа произошло изменение морфологического состава всех культур клеток в сторону увеличения доли эиителиоподоб-ных клеток. На шестом пассаже в состав монослоя культуры клеток ЭСКП кролика входило до 98% клеток эпителиоподобного типа, культуры клеток ЭСКП | собаки - 80%, культуры клеток ЭСКП кошки - 68%.

При дальнейшем пассировании установлено, что культуры клеток ЭСКП собаки и кошки имеют конечный срок культивирования, ограниченный 8-9 пассажами. На этом основании их можно отнести к категории короткоживущих культур. Дальнейшие исследования проводились только с культурами ЭСКП кролика.

С 6 пассажа пересев культур клеток ЭСКП кролика проводили с коэффициентом пересева 1:2-1:3. На 7 пассаже культура на вторые сутки после пересева сформировала отдельные, резко очерченные, плотные, разрастающиеся колонии эпителиоподобных клеток (рис. 2).

Рис. 2. Культура клеток ЭСКП кролика. 7 пассаж, 2 сутки культивирования. Колония эпителиоподобных клеток. (Микрофото, ок. хЮ, об. хю, нативный препарат)

В результате объединения колоний, на пятые сутки культивирования сформировался плотный монослой эпителиоподобных клеток с участками неза-роста. На 8 пассаже на 4 сутки культивирования клетки культуры сформировали равномерный монослой, состоящий на 99% клеток эпителиоподобного типа (рис. 3).

■ ■ _ •»• -'Л

- , с Ч/И :;*.

•:■ л.* •

Рис. 3. Культура клеток ЭСКП кролика. 8 пассаж, 4 сутки культивирования.

Колония эпителиоподобных клеток.

(Микрофото, ок. х!0, об. х!0, нативный препарат) Сравнительное изучение культурально-морфологических свойств полученных культур с постоянной линией КНК и диплоидным штаммом КЭК Цитологический анализ культуры клеток ЭСКП кролика проводили на 5, 8, 12, 17, 22 и 32 пассажах.

Анализ цитологических препаратов и световая микроскопия нативной культуры на 5 пассаже показали, что культура клеток ЭСКП кролика представлена, эпителиоподобными и фибробластоподобными клеткам. В ряде случаев островки эпителиоподобных клеток были окружены прилегающими полями однонаправлено ориентированных фибробластов. В других случаях наблюдали смешанный рост клеток фибробластоподобного и эпителиоподобного типов, образующих монослой без четкой упорядоченности. Рост эпителиоподобных

клеток неравномерный: наряду с участками монослоя, имеются участки многослойного роста в виде плотных напластований клеток без четко выраженных границ.

Фибробластоподобныс элементы имеют веретеновидную форму с длинными отростками. Ядро овальной или элипсовидной, реже округлой формы с 13 (иногда больше), округлыми ядрышками варьирующими по размерам. Ядерный матрикс равномерный, мелкозернистый, Цитоплазма окрашивается равномерно. В отдельных клетках имеются крупные вакуоли.

Форма эпителиоподобных клеток различна - цилиндрическая или полигональная. Ядра клеток, в основном, округлой или овальной формы, расположены в центре или слегка эксцентрично. Ядра содержат 1-4, реже больше ядрышек различного размера и мелкие глыбки хроматина. Размеры клеток не одинаковы. В равномерном монослое эпителиоподобные клетки имеют одинаковый размер и форму, границы клеток хорошо выражены. Ядра таких клеток округлой или овальной формы, содержат 1-3 ядрышка различного размера. В максимально плотном монослое границы клеток слабо выражены.

В процессе субкультивирования количество эпителиоподобных клеток увеличивается, они сохраняют характерную морфологию, и демонстрируют клональный островковый рост (рис 2). Размер колоний увеличивается за счет пролиферации периферических зон роста. К 6 пассажу монослой представлен 97-98% эпителиоподобных клеток. К 8 пассажу культура становится морфологически однородной, конфлюэнгный монослой представлен эпителиоподобны-ми клетками (рис. 4). В процессе дальнейшего пассирования морфология клеток и морфологический состав монослоя культуры сохраняется. При продолжительных пассажах культура уплотняется и приобретает многослойность, т.е. на монослое формируются напластования эпителиоподобных клеток. Часть клеток из этих напластований отслаивается и переходит в среду.

Культуры ЭСКП собаки и кошки на ранних пассажах также представлены эпителио- и фибробластоподобными элементами, с преобладанием первых. Эти эпителиоподобные клетки образуют плотные колонии с четкими границами,

окруженные полями фибробластов. Также имеются участки монослоя с неупорядоченным ростом клеток. Эпигслиоподобные клетки имеют цилиндрическую или полигональную форму. Ядра клеток, в основном, округлой или овальной формы, расположены в центре и имеют 2-3 ядрышка. В ядрах некоторых клеток содержится до 6 ядрышек. И в этих культурах также пролиферируют, в основном, периферические зоны колоний.

Типичные фибробластоподобные клетки вытянутые, расположены одно-направлено широкими полями. Центрально расположенное ядро овальное, либо элипсовидное с 2-3 ядрышками.

Постоянная культура клеток ЯБК однородна по морфологическому составу и представлена эпителиоподобными клетками округлой, цилиндрической, или полигональной формы (рис. 5). Ядра клеток округлой формы с 2-3 ядрышками. Ядерный метрике однородный. Цитоплазма окрашена равномерно. В цитоплазме отдельных клеток имеются вакуоли. В конфлюэнгном монослое границы клеток хорошо видны. При длительных пассажах культура формирует сплошной пласт уплотненных клеток с плохо различимыми границами и приобретает многослойность. Часть клеток напластований отслаивается и переходит в среду.

Культура клеток КЭК представлена эпителиоподобными и фибробласто-подобными клетками. Эпителиоподобные клетки располагаются в культуре одиночно или формируют колонии плотно соприкасающихся друг с другом клеток. Фибробластоподобные клетки плотным слоем окружают эпителиоподобные.

Фибробластоподобные клетки имеют вытянутую или веретеновидную форму с расширенным основанием. Ядро овальной формы с 2-3 ядрышками и мелкими глыбками хроматина. Цитоплазма окрашена равномерно, в цитоплазме отдельных клеток имеются вакуоли, ацидофильные цитоллазматические включения и тонкие микрофиламенгы (актиновые нити).

Клетки эпителиоподобного типа имеют округлую, цилиндрическую или полигональную форму с интесивно окрашивающимися крупными ядрами, в ко-

торых находятся чаще 1-3 ядрышка. Ядро клетки сферической формы и распо ложено, главным образом, в периферической области цитоплазмы. Межклеточ ные границы выражены хорошо. В монослое встречаются двуядерные клетки, также гигантские клетки с очень крупным ядром, содержащим 6-11 ядрышек.

Рис. 4. Культура клеток ЭСКП кролика. 8 пассаж, 3 сутки культивирования. (Микрофото, ок. х 1О, об. х40, окраска по Романовскому-Гимзе)

Рис. 5. Культура клеток Я8К. 4 сутки культивирования. (Микрофото, ок. хЮ, об. х20, нативный препарат)

Изучение динамики митотической активности в процессе длительного

культивирования эпителиоподобных клеток кожи плода кролика

Митотическую активность клеток изучали на на 5, 15, 25 и 38 в течение 5 суток культивирования после пересева.

Для определения митотической активности культур, клетки ЭСКП на различных пассажах высевали в концентрации 90-100 тыс.кл./мл, а затем определяли сроки формирования монослоя, индекс пролиферации, митотичеекий индекс по суткам культивирования, а также максимальную плотность клеток в конфлюэнтном монослое.

Монослой с максимальной плотностью клеток образуется на 3-4 сутки их культивирования. Плотность клеток в монослое составляет на 5 пассаже -4,2*104 кл./см, на 15 пассаже - 4,6х104 кл./см2, на 25 пассаже - 4,9х104 кл./см2, на 38 пассаже - 4,8x104 кл./см2.

На уровне 5-15 пассажей наибольшая митогическая активность отмечалась в первые сутки культивирования (20,4-22,3%о), на уровне 25-38 пассажей -на вторые сутки (23,8-25,3%о). На всех пассажах наблюдалось снижение митотической активности на четвертые сутки культивирования до 6,3-7,4%о на 5-15 пассажах и до 6,7-8,2%о на 25-38 пассажах.

Изменение динамики формирования монослоя клетками на различных пассажах коррелирует с динамикой изменения их митотической активности на различных сроках культивирования.

Сравнительный кариологнческий анализ культур клеток ЭСКП кролика

и ЯБК

Кариологнческий анализ культуры эпителиоподобных клеток кожи плода кролика проводили на 15, 25 и 38 пассажах.

На 15 пассаже распределение числа хромосом варьирует от 31 до 45, модальный класс представлен 38-39 хромосомами в 54% клеток, диплоидный набор хромосом (2п=44) имели 2% клеток. На 25 пассаже распределение числа хромосом варьирует от 32 до 45, модальный класс представлен 38-39 хромосомами в 56% клеток, диплоидный набор хромосом - в 4% клеток. На 38 пассаже

распределение числа хромосом варьирует от 30 до 46, модальный класс представлен 38-39 хромосомами в 56% клеток, диплоидный набор хромосом - в 5% клеток. На анализируемых пассажах полиплоидное™ клеточной культуры не выявлено.

Интервал изменчивости числа хромосом в клетках ЯБК от 9 до 66. Модальный класс хромосом соответствует диплоидному набору (2п=44) и представлен у 43% клеток.

Ультраструктурная характеристика состава культуры клеток ЭСКП

кролика

Электронно-микроскопическое исследование проводили на уровне 9, 15 и 38 пассажей. Культура ЭСКП кролика растет с признаками специализированной дифференцировки и представлена несколькими клеточными типами.

Один из находящихся в культуре клеточных типов представлен крупными, плотно расположенными, активно делящимися, светлыми эпителиоподоб-ными клетками. Этот тип клеток характеризуется невысокой электронной плотностью. Клетки данного типа содержат центрально расположенное, крупное округлое или овальное ядро правильной формы с ровными контурами ядерной мембраны. Ядерный компонент представлен гомогенной сетью хроматина, одним или двумя небольшими ядрышками и глыбками нуклсосомального компонента. Цитоплазма таких клеток всегда богата неупорядоченно расположенным микрофиламентозным компонентом. Овальные или округлые митохондрии имеют особым образом расположенные кристы. На свободном участке цитоплазматической мембраны хорошо видна сегевидная структура зоны замыкания. На ультратонком срезе хорошо видно, что она построена из тончайших волокон, формирующих «запирательный» клубок.

В монослое присутствуют и другие светлые клетки, которые по ультраструктуре и набору органелл можно идентифицировать как клетки Лангерганса. Для них характерны длинные ветвящиеся отростки, которые проникают между соседними эпидермальными клетками. Эти клетки имеют неправильную фор-

му, а для их ядер характерны глубокие вдавления и карманы, образуемые ядерной мембраной.

Среди светлых клегок также присутствуют меланобласты, которые имеют сходные ультраструктурные параметры, как с клетками Лангерганса, так и с промежуточными клетками, содержащими хлопьевидные цитоплазматические включения, которые можно трактовать как места синтеза предшественника меланина или кератогиалина.. Для меланобластов характерна везикулярная структура цитоплазмы, гипертрофия эндоплазматического регикулума (ЭР), высокая плотпость рибосом в зоне, где можно предположить место синтеза пигментов, а также отросчатая клеточная поверхность с ориентированными пучками тоно-фибрилл и микротрубочек.

Среди светлых клеток, низкой осмнофильносш, встречаются обильно ва-куолизированные клетки, бедные клеточными органоидами, но содержащие иногда значительные количества микрофиламентов. На основании ультраструктурной организации эти клетки можно идентифицировать как продолжающие дифференцировку клетки Лангерганса. Для этих клеток характерны везикулярная структура цитоплазмы, гипертрофия ЭР, высокая плотность рибосом в зоне, где можно предположить место синтеза пигмента и отросчатая клеточная поверхность с ориентированными пучками тонофибрилл и микротрубочек.

Также в культуре присутствуют клетки средней или высокой осмиофиль-ности и плотности, так называемые темные клетки, с хорошо развитой эндоплазма гической сетью, тоже обильно снабженные митохондриями. Эти клетки чаще всего сильно вытянуты и уплощены. Их ветвистые отростки переплетены друг с другом и плотно соединены межклеточными контактами. ЭР темных клеток гипертрофирован..

В популяции имеется еще один тип клеток средней плотности, у которых вся поверхность снабжена микроворсинками (микровилли). При большом увеличении видно, что микроворсинки заполнены микрофиламентозным материалом, который позволяет им осуществлять функции движения и всасывания, и

представлен микротрубочками, диаметром до 10 им, тонофибриллами и актином. Среди клеток средней и высокой плотности не обнаружено делящихся клеток.

Обнаружены все три вида межклеточных контактов, характерных для эпидермального слоя: плотные, щелевые и адгезивные контакты. Во всех типах клеток документирован развитый микрофиламентозный компонент, что характерно для кожного эпителия.

Тонофибриллы и актиноподобные филаменгы также обильно присутствуют в разных типах клеток. Они расположены как локально, большими скоплениями, так и распределены по всей цитоплазме. Наиболее выразительно эти виды микрофиламентов представлены в светлых клетках и клетках средней плотности.

Наличие разных видов межклеточных контактов и ассоциированных с ними микрофиламентов указывают на сохранение у клеток в культуре разнообразных функциональных активностей - всасывающих, проводящих, двигательных и выделительных.

В цитоплазме многих клеток можно наблюдать концентрические или спирально закрученные цистерны гранулярного ЭР, которым можно было бы приписать функции начала формирования клеток железистого эпителия и (или) секреторных мешочков для клеток с выделительными функциями.

Прослеживается динамика последовательного формирования из малых вакуолей больших полостей, представляющих собой гипертрофированно расширенные полые цистерны ЭР. Эти цистерны иногда имеют незначительное количество внутреннего содержимого в виде коротких волокнистых или хлопьевидных образований низкой электронной плотности.

Ядерный хроматин светлых клеток имеет традиционно тонкую характерную сеть дезоксиполинуклеотидов и одно крупное ядрышко однородной плотной или очень плотной сетевидной структуры. Предположительно эти структурные варианты также являются отражением интенсивности биосинтетических процессов, специфичных для каждого типа клеток, составляющих много-

слойный ороговевающий эпителий, равно как и процессов естественного выбывания отдельных клеточных элементов из многослойного эпителиального пласта.

Всс изменения структуры, увеличения количества и размеров ядрышек вместе с модификациями ЭР прямо указывают на интенсивность процессов синтеза специфических белков и дайной клетке, в том числе можно предполагать также и синтез кератогиалина и меланина. На динамике изменений в ультраструктурной организации ядра и ядрышек можно проследить последовательность этапов дифференцировки клеток в специализированные типы.

Проведенные электронно-микроскопические исследования указывают, что в клеточной культуре ЭСКП кролика, содержатся все признаки многослойного плоского ороговевающего эпителия - эпидермиса. Все ультраструктурные картины указывают на органоспецифичность полученной культуры. На протяжении 15 пассажей культура сохранила специализированный фенотип в виде нескольких типов клеток, которые на основании ультраструктурных данных можно охарактеризовать как компоненты многослойного ороговевающего эпителия. В культуре продолжаются процессы дифференцировки, которые завершаются началом синтеза двух морфологически отличных видов пигмента, один из которых можно было бы ассоциировать с керагогиалином - компонентом кератиноцитов, а другой с меланином - компонентом меланоцитов.

Изучение влияния глубокого замораживания на жизнеспособность культур клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки

Для криоконсерваци использовали культуры клеток ЭСКП кролика на 12, 22, 32, 44 и 60 пассажах, а субкультуры ЭСКП собаки и кошки на 4 пассаже. Все культуры были заложены в криобанк ВИЭВ.

Через 40-60 дней хранения в жидком азоте при температуре -196°С проводили размораживание и рекультивирование клеток.

Жизнеспособность клеток восстановленных ЭСКП кролика составляла 75-80% не зависимо от пассажа, на котором производили глубокое замораживание. Монослой субкультур клеток ЭСКП кролика формировался на 4-5 сутки

культивирования. Изменений в морфологическом составе клеток восстановленных субкультур не выявлено. Культуры полностью восстанавливали культу-рально-морфологические свойства после 1-2 пассажей.

Жизнеспособность клеток ЭСКП собаки составляла 65%, а клеток ЭСКП кошки - 50-55%, Монослой клеток ЭСКП собаки формировался на 6-7 сутки культивирования, а клеток ЭСКП кошки - на 8-9 сутки. Изменений в морфологическом составе монослоя восстановленных субкультур не выявлено. Криогс-низация не оказывала отрицательного влияния на культурально-морфологические свойства культур при использовании криозащитной среды указанного состава.

Изучение чувствительности к вирусам полученных культур клеток ЭСКП

кролика

Определяли чувствительность культуры к вирусам ВД-БС и ИРТ на 20, 38 и 45 пассажах.

Через 24 часа инкубирования в зараженной вирусом ВД-БС культуре клеток эпидермального слоя кожи плода кролика обнаружили участки произвольно сгруппированных, дегенерирующих, уменьшенных или увеличенных в размере, округлившихся, слабо адгезированных клеток, а также истонченные участки и разрывы монослоя. В культуральной среде присутствовала взвесь отслоившихся клеток. В контрольных культурах подобных изменений не наблюдали.

При анализе цитологических препаратов, в инфицированных клетках культуры ЭСКП кролика выявляли мелкозернистую ацидофильную инфильтрацию, а также вакуолизацию перинуклеарной зоны. В ядрах многих клеток отмечали конденсацию хроматина и набухание ядрышек. Ядра некоторых клеток имели пикнотические изменения, подвергались кариорексису и кариолизи-су. Клетки с пикнотичекими изменениями ядра существенно уплотнялись, уменьшались в размерах и отслаивались от субстрата. Заметно увеличилось число различных видов патологических митозов. Так, в ряде клеток наблюдали слипание и набухание хромосом, хромосомные мостики, колхициноподобные

метафазные пластинки, а также выявляли многополюсный и ассимегричный митозы.

Через 48 часов монослой инфицированной культуры полностью разрушался, что сопровождалось гибелью клеток и их отслоением в культуральную жидкость. Прикрепленными остались отдельные клетки с неровными, рваными краями и сильной вакуолизацией, а также отдельные клеточные тяжи и фрагменты. В контрольных культурах ЦПД не выявлено. Аналогичные процессы наблюдали на протяжении трех последовательных пассажей. Характер ЦПД в культуре клеток эпидермального слоя кожи плода кролика был аналогичен ЦПД в культуре клеток КСТ. Накопление вируса ВД-БС в культуре клеток ЭСКП кролика достигало 6,0-6,5 ^ТЦД50/мл.

Таким образом, нами установлено, что вирус БД-БС репродуцируется в культуре клеток ЭСКП кролика и в высоком титре размножается при пассировании в аналогичной культуре. Показана возможность пассирования в ней этого возбудителя без потери титра, что свидетельствует о чувствительности данной клеточной линии к вирусу ВД-БС.

Высокая чувствительность культуры клеток ЭСКП кролика к вирусу ВД-БС позволяет высоко оценить культуру в качестве модели для постановки РН на ВД-БС. При использовании в РН дозы вируса ЮОТЦДзд/лунку результаты реакции в культурах клеток ЭСКП кролика и КСТ совпадают в 90% случаев.

Мелкоочаговое ЦПД в зараженной вирусом ИРТ культуре клеток ЭСКП кролика удалось обнаружить лишь через 48 часов инкубирования. В монослое инфицированной культуры наблюдали отдельные мелкие группы уменьшенных в размере, слабо адгезированных, дегенерирующих клеток, которые приобретали способность ярче окрашиваться на цитологических препаратах. В контрольных культурах подобных изменений не наблюдали.

При анализе цитологических препаратов, в инфицированных клетках культуры выявляли пикнотические изменения ядра. В ядрах многих клеток отмечали деструктуризацию ядрышек, конденсацию и маргинацию хроматина. Ядра некоторых клеток подвергались кариорексису. Клетки с пикнотическими

изменениями ядра существенно уплотнялись, уменьшались в размерах и отслаивались от субстрата.

В течение пяти суток наблюдения полного разрушения монослоя инфицированной вирусом ИРТ культуры клеток ЭСКП кролика не произошло, что свидетельствует о малой чувствительности этой культуры к вирусу ИРТ.

Выводы

1. Отработаны методы выделения и культивирования клеток эпидермального слоя кожи плода (ЭСКП) кролика, собаки и кошки. Установлено, что наиболее эффективным способом разделения эпидермального и дермального слоев кожи является применение 0,4% раствора диспазы, а также применение смеси из 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 7:1. Для ферментативной дезагрегации клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки рекомендуется применение смеси из 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 7:1. Клетки ЭСКП кролика, собаки, кошки активно пролиферируют в средах Игла ДМЕМ и Игла MEM с двойным набором аминокислот и удовлетворительно пролиферируют на средах Игла MEM, 199, а также смеси сред 199 и 0,5% ГЛА в соотношении 9:1. Питательные среды следует дополнять 5-7% фетальной сыворотки КРС.

2. Получены первичные культуры и субкультуры клеток ЭСКП кролика, собаки и кошки, изучены их культурально-морфологические свойства. Впервые получены диплоидный штамм ЭСКП кролика и постоянная линия клеток (ЭККПКр) и дана их кульгурально-морфологическая характеристика.

3. Дана ультраструктурная характеристика субкультур клеток и диплоидного штамма ЭСКП кролика и ЭККПКр. Субкультура, диплоидный штамм клеток ЭСКП кролика и ЭККПКр представлены различными типами клеток, которые по ультраструктурной организации могут быть идентифицированы как керагиноциты, меланоциты и клетки Лангерганса на различных стадиях дифференциации.

4. Для полученных культур оптимизированы условия глубокого замораживания и последующего восстановления. Для глубокого замораживания субкультур клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки, а также для глубокого замораживания диплоидного штамма ЭСКП кролика и ЭККПКр применима криозащитная среда, состоящая на 50% из питательной среды Игла MEM, на 40% - из фетальной сыворотки КРС и на 10% - из ДМСО, Жизнеспособность восстановленных клеток ЭСКП кролика не зависела от пассажа и составляла 75-80%. Жизнеспособность клеток ЭСКП собаки и кошки на 4 пассаже была несколько ниже и составляла 65% и 50-55% соответственно. Все полученные культуры депонированы в криобанке ВИЭВ.

5. Установлена высокая чувствительность клеток субкультуры, диплоидного штамма и ЭККПКр к вирусу ВД-БС (титр вируса достигает 6,0-6,5 ^ТЦД50/мл) и слабая чувствительность к вирусу ИРТ. Цитоморфологиче-ские изменения, вызываемые вирусом ВД-БС в культурах клеток ЭСКП кролика и ЭККПКр сходны с изменениями, развивающимися в культурах клеток ICCT и ПЭК.

6. Показана возможность применения ЭККПКр в качестве демонстративной модели для постановки реакции нейтрализации для диагностики ВД-БС.

Практические предложения

1. Отработанные методы получения культур клеток эпидермального слоя кожи плодов кролика, собаки, кошки рекомендуются для научных учреждений и диагностических лабораторий.

2. Субкультуры клеток эпидермального слоя кожи плодов кролика, собаки, кошки могут быть использованы в научных исследованиях.

3. Диплоидный штамм и постоянная клеточная линия эпидермального слоя кожи плодов кролика (ЭККПКр) высокочувствительные к вирусам ВД-БС рекомендуются для вирусологических исследований и в качестве демонстративной модели для постановки реакции нейтрализации на ВД-БС.

4. Разработаны, утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН и изданы «Методические рекомендации по получению и культивированию

кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки», М. РАСХН. - 2008. -12 с.

Список опубликованных работ по теме диссертации

■ 1. Фридман, М.Л. Эпидермальные стволовые клетки кожи плодов животных / Фридман М.Л., Дьяконов Л.П. II Ветеринария и кормление. - 2007. - №6. -С. 32-33.

2. Фридман, М.Л. Методические рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки» / М.Л. Фридман, Т.В. Гальнбек//М., РАСХН. - 2008. - 12 с.

3. Фридман, М.Л. Стволовые клетки кожи - перспективный источник генетического материала редких и исчезающих видов животных / Фридман М.Л., Абдрахманов И.К. // Ветеринарная патология. - 2008. - №4(27). - С. 65-68.

4. Фридман, М.Л. Гибридные клеточные системы - новый подход в биотехнологии продуцентов биологически активных веществ / Абдрахманов И.К., Гальнбек Т.В., Скалецкий H.H., Фридман М.Л., Дьяконов Л.П., Кленовиц-кий П.М. // Материалы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел», Москва, ВИЭВ, 9-10 октября 2008 г. // ООО «Партнер-М». - 2008. - С. 307-311. - 440 С.

5. Каталог. 2-е издание (дополненное и уточненное) Специализированная коллекция перевиваемых и соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) / Л.П. Дьяконов, Т.В. Гальнбек, Г.Т. Акиншина, А.Я. Самуйленко, A.B. Дагдано-ва, A.C. Симонова, М.Л. Фридман // М., ООО «Эльфа-К». - 2006. - 115 С.

6. Friedman M.L. The skin cells culture is a perspective source of stem cells / Friedman M.L., Miller G.G., Galnbek T.V., Dyakonov L.P. // Regenerative Medicine. - 2007. - Vol.2, №5. - PP. 607-608.

Отпечатано в ООО "Мещера" М.О., г. Щелково, ул.Свирская, д.8а зак. №10 тир. 110 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фридман, Михаил Львович

Список условных сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Культуры клеток кожи млекопитающих и история их получения.

2.2. Гистологическое строение и эмбриогенез кожи млекопитающих.

2.3. Методы получения и культивирования кератиноцитов млекопитающих

3. Собственные исследования.

3.1. Материалы исследований.

3.1.1. Питательные среды и растворы.

3.1.2. Постоянные линии и диплоидные штаммы клеток.

3.1.3. Штаммы вирусов.

3.2. Методы исследований.

3.2.1. Получение первичной культуры клеток кожи.

3.2.2. Подсчет концентрации клеток в суспензии.

3.2.3. Определение доли жизнеспособных клеток и подсчет индекса пролиферации.

3.2.4. Цитологические методы исследования.

3.2.5. Кариологическое исследование.

3.2.6. Электронно-микроскопическое исследование.

3.2.7. Вирусологические исследования.

3.2.8. Криоконсервирование и создание банка культур клеток.

3.3. Результаты исследований.

3.3.1. Разработка оптимальных условий ферментативного разделения эпидермального и дермального слоев кожи плодов кролика, кошки, собаки.

3.3.2. Разработка оптимальных условий ферментативной дезагрегации ЭСКП кролика, кошки, собаки.

3.3.3. Разработка оптимальных условий культивирования первичных культур ЭСКП кролика, кошки, собаки.

3.3.4. Определение эффективности ростовых свойств питательных сред для культивирования первичных культур ЭСКП кролика, кошки, собаки

3.3.5. Субкультивирование клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки.

3.3.6. Сравнительное изучение культурально-морфологических свойств полученных культур с постоянной линией RSK и диплоидным штаммом КЭК.

3.3.7. Изучение динамики митотической активности в процессе длительного культивирования клеток ЭСКП кролика.

3.3.8. Сравнительный кариологический анализ культуры клеток ЭСКП кролика и постоянной линии RSK.

3.3.9. Ультраструктурная характеристика состава клеточной культуры ЭСКП кролика.

3.3.10. Изучение влияния глубокого замораживания на жизнеспособность клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки.

3.3.11. Изучение чувствительности культуры клеток ЭСКП кролика к вирусам.

4. Обсуждение результатов исследований.

5. Выводы.

Практические предложения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и культурно-морфологическая характеристика кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки"

Кожа образует внешний покров организма и является одним из наиболее крупных органов. Физиологическую значимость кожи трудно переоценить. Пограничное расположение кожи обусловливает ее непосредственное взаимодействие с внешней средой и ее повреждающими факторами. Поврежденная кожа не способна выполнять возложенные на нее функции, а обширные и долго не заживающие повреждения могут привести к летальному исходу.

Таким образом, кожа представляет собой важный объект для фундаментальных и прикладных исследований в биотехнологии, ветеринарии и гуманитарной медицине.

Первыми практический интерес к культурам клеток кожи проявили врачи-комбустиологи, т.к. одной из главных проблем лечения больных с обширной ожоговой травмой (30-40% поверхности тела) является закрытие раневых поверхностей. Однако закрыть все ожоговые раны при помощи одних лишь аутодермотрансплантатов часто бывает невозможно из-за дефицита донорских ресурсов.

Принципиальная возможность использования для заживления ран аутоклеток кожи, выращенных in vitro, была показана ещё в сороковых годах XX века в работах профессора зоологии Лондонского университета Р.В. Medawar (1948). Тогда же были предприняты первые попытки получения кератиноцитов.

В то же время группа ученых (Robbins F.C., Enders J.F., Weller Т.Н., 1949) в процессе изучения вируса полиомиелита показали возможность использования различных клеточных культур и, в частности, культур клеток кожи в качестве моделей для изучения и накопления вирусов.

Первичные и органные культуры клеток кожи нашли широкое применение в исследованиях дермотропных вирусов, а также в производстве вакцин против них (Рысмендева К.К., 1992; Животная клетка в культуре, 2000; Wurster D.H., Benirschke К., 1970).

Развитие методической базы для получения и культивирования кератиноцитов произошло благодаря изучению биологии дерматофитов и патогенеза дерматофитозов, т.к. жизнедеятельность этих грибов тесно связана с кератином эпидермиса (Ни F., Livingood C.S. et al., 1954; Alteras I., Gavrilescu M., 1965).

Культуры кератиноцитов хорошо зарекомендовали себя не только как основной компонент для создания трансплантационного материала, но также как чувствительная модель для вирусологических исследований, ценный инструмент в биотехнологическом производстве и фармакологии (Prunieras М., 1984; Livingood C.S., Ни F., 1954), доступный источник стволовых клеток (Papini S., Cecchetti D., Campani D. et al., 2003, Radu E., Simionescu O., Regalia Т., 2003; Спичкина О.Г., Калмыкова H.B., Кухарева JI.B. и др., 2006) и генетического материала (De Luca М., Pellegrini G., 1997).

К 1975 г. были достигнуты определенные успехи в культивировании трипсинизированных кератиноцитов (Rheinwald J.G., Green Н., 1975). Преимуществом данного метода является предварительное разделение кожи по базальной пластинке на дерму и эпидермальный слой с последующей дезагрегацией отделенного эпидермиса.

Использование фидерных слоев клеток и питательных сред с физиологически высоким содержанием кальция позволило решить техническую задачу получения эпидермальных пластов с целью их трансплантации.

Но разработанные еще в 1975 году методики выделения и последующего субкультивирования кератиноцитов сопряжены с рядом трудностей, а именно использование специфических, дорогостоящих реактивов, применение сложных и длительных приемов культивирования, ряд которых накладывает ограничения на возможности дальнейшего применения полученных культур.

У большинства известных перевиваемых линий клеток эпидермального слоя кожи при длительном пассировании снижается чувствительность к вирусам, ухудшается пролиферативный потенциал, меняются культурально-морфологические свойства. Всегда может возникнуть потребность оперативного получения новых перевиваемых линий кератиноцитов от различных видов животных.

Поэтому, представляется актуальной в научном и практическом отношениях разработка легко воспроизводимых, оперативных и унифицированных для различных видов животных методик получения культур кератиноцитов с их детальной культурально-морфологической, кариологической и ультраструктурной характеристикой.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в получении культур кератиноцитов кожи плодов кролика, собаки, кошки, изучение их культурально-морфологических свойств и чувствительности к вирусам.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: получить первичные культуры клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки; получить субкультуры клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки с преобладанием в составе монослоя клеток эпителиоподобной морфологии; провести сравнительное изучение культурально-морфологических свойств полученных культур со стабильной клеточной линией RSK и диплоидным штаммом КЭК; провести сравнительный кариологический анализ полученных культур со стабильной клеточной линией RSK; провести ультраструктурное исследование полученных культур клеток; изучить чувствительность полученных культур к различным вирусам; отработать метод глубокого замораживания (-196°С) полученных культур; депонировать полученные культуры клеток в криобанк ВИЭВ; на основе проведенных исследований разработать методические рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки.

Научная новизна. Получены первичные культуры и субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки с использованием различных диспергирующих агентов.

Получен диплоидный штамм кератиноцитов кожи плода кролика и постоянная клеточная линия ЭККГЖр. Изучены их культурально-морфологические и кариологические свойства. Представлена ультраструктурная характеристика полученных клеточных культур.

Показано, что субкультуры клеток ЭСКП кролика на 20 и 38 пассажах, диплоидный штамм клеток ЭСКП кролика на 45 пассаже, а также ЭККПКр обладают высокой чувствительностью к вирусу ВД-БС и слабой чувствительностью к вирусу ИРТ.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований усовершенствованы методы получения первичных культур и субкультур клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки. Получены и заложены в криобанк ВИЭВ субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки. Получен и заложен в криобанк ВИЭВ диплоидный штамм кератиноцитов кожи плода кролика и постоянная клеточная линия ЭККПКр и показана возможность их использования в вирусологических исследованиях.

Разработаны и опубликованы методические рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки.

Апробация. Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на:

Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» (Москва, ВИЭВ, 2006 г.);

3-ем Всемирном конгрессе регенеративной медицины (Лейпциг, 2007

Межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2008 г.).

Секции «Ветеринарной биотехнологии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 2008

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, 1 работа находится в печати.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 135 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 14 таблицами, 63 рисунками. Список литературы включает 105 публикаций, в том числе 67 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Фридман, Михаил Львович

120 5. Выводы

1. Отработаны методы выделения и культивирования клеток ЭСКП кролика, кошки и собаки. Установлено, что наиболее эффективным способом разделения эпидермального и дермального слоев кожи является применение 0,4% раствора диспазы, а также применение смеси из 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 7:1. Для ферментативной дезагрегации клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки рекомендуется применение смеси из 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 7:1. Клетки ЭСКП кролика, кошки, собаки активно пролиферируют в средах Игла ДМЕМ и Игла MEM с двойным набором аминокислот и удовлетворительно пролиферируют на средах Игла MEM, 199, а также смеси сред 199 и 0,5% ГЛА в соотношении 9:1. Питательные среды следует дополнять 5-7% фетальной сыворотки КРС.

2. Получены первичные культуры и субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки, изучены их культурально-морфологические свойства. Впервые получены диплоидный штамм ЭСКП кролика и постоянная линия клеток (ЭККПКр) и дана их культурально-морфологическая характеристика.

3. Дана ультраструктурная характеристика субкультур клеток и диплоидного штамма ЭСКП кролика и ЭККПКр. Субкультура, диплоидный штамм клеток ЭСКП кролика и ЭККПКр представлены различными типами клеток, которые по ультраструктурной организации могут быть идентифицированы как кератиноциты, меланоциты и клетки Лангерганса на различных стадиях дифференциации.

4. Для полученных культур оптимизированы условия глубокого замораживания и последующего восстановления. Для глубокого замораживания субкультур клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки, а также для глубокого замораживания диплоидного штамма ЭСКП кролика и ЭККПКр применима криозащитная среда, состоящая на 50% из питательной среды Игла MEM, на 40% - из фетальной сыворотки КРС и на 10% - из ДМСО. Жизнеспособность восстановленных клеток ЭСКП кролика не зависела от пассажа и составляла 75-80%. Жизнеспособность клеток ЭСКП собаки и кошки на 4 пассаже была несколько ниже и составляла 65% и 5055% соответственно. Все полученные культуры депонированы в криобанке ВИЭВ.

5. Установлена высокая чувствительность клеток субкультуры, диплоидного штамма ЭСКП кролика и ЭККПКр к вирусу ВД-БС (титр вируса достигает 6,0-6,5 1§ТЦД50/мл) и слабая чувствительность к вирусу ИРТ. Цитоморфологические изменения, вызываемые вирусом ВД-БС в культурах клеток ЭСКП кролика и ЭККПКр сходны с изменениями, развивающимися в культурах клеток КСТ и ПЭК.

6. Показана возможность применения ЭККПКр в качестве демонстративной модели для постановки реакции нейтрализации на ВД-БС.

Практические предложения

1. Отработанные методы получения культур клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки рекомендуются для научных учреждений и диагностических лабораторий.

2. Субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки могут быть использованы в научных исследованиях.

3. Диплоидный штамм ЭСКП кролика и постоянная клеточная линия ЭККПКр, высокочувствительные к вирусам ВД-БС, рекомендуются для вирусологических исследований и в качестве демонстративной модели для постановки реакции нейтрализации на ВД-БС.

4. «Методические рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки», РАСХН, М., 2008-12 с.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фридман, Михаил Львович, Москва

1. Анджапаридзе, О.Г. Получение и характеристика культур диплоидных клеток из тканей животных / Анджапаридзе О.Г., Осидзе Д.Ф., Витина С.А. // Вопросы вирусологии. 1973. - №1. - С.102-108.

2. Быков, B.JI. Частная гистология человека (краткий обзорный курс) / B.JI. Быков. — 2-е изд. перераб и доп. — СПб.: Сотис, 1999. 301 с.

3. Васильев, А.В. Роль фидерных клеток в прикреплении и росте кератиноцитов человека и крысы / Васильев А.В., Волошин А.В., Терских В.В. // Цитология. 1991. - №33 (12). - С. 84-89.

4. Гаврилюк, Б.К. Культура клеток и реконструкция ткани (На прим. кожи) / Б.К. Гаврилюк, Ю.А. Рочев, Т.И. Николаева // АН СССР, Науч. центр биол. исслед., Ин-т биол. физики Пущино : ОНТИ НЦБИ АН СССР. -1988.- 121 с.

5. Гистология, цитология и эмбриология: Учеб. лит. для студ. мед. вузов. / Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина, Е.Ф. Котовский и др.; Под ред. Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина. 5-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002 - 744 с.

6. Гистология: Учеб. для вузов / Н.В. Бойчук, P.P. Исламов, C.JL Кузнецов, Э.Г. Улумбеков, Ю.А. Челышев. М.: «Гэотар-Мед», 2001. - 672 с.

7. Горелик, Ю.В. Влияние компонентов внеклеточного матрикса на распластывание кератиноцитов крысы на субстрате при культивировании в низкокальциевой среде / Горелик Ю.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. // Цитология. 1994.-№36 (12).-С. 1209-1212.

8. Гуков, Ф.Д. Практикум по цитологии гистологии и эмбриологии сельскохозяйственных животных / Ф.Д. Гуков, В.И. Соколов, Е.В. Гусева. -Владимир.: ООО «Фолиант», 2002. 178 с.

9. Данишевский, Д.А. Цитопатогенное действие вирусов инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и парагриппа-3 в культуре клеток :

10. Дис. . канд. вет. наук: 16.00.03 / Д.А. Данишевский ; ВИЭВ. — Москва, 1981.-147 с.

11. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / под ред. проф. Л.П. Дьяконова, проф. В.И. Ситькова // М.: Компания Спутник+, 2000. 400 с.

12. Жидков, С.А. Вирусная диарея болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота : Дис. . докт. вет. наук: 16.00.03 / С.А. Жидков; ВИЭВ. -Москва, 1994.-352 с.

13. Колокольцова, Т.Д. Создание аттестованных коллекций и банков культур клеток для научных исследований, производства препаратов, диагностики и лечения : Дис. . докт. биол. наук: 03.00.23 / Т.Д. Колокольцова; ГИСК. Москва, 2007. - 272с.

14. Кузнецов, С.Л. Атлас по гистологии, цитологии и эмбриологии / С.Л. Кузнецов, Н.Н. Мушкамбаров, В.Л. Горячкина. М.: Медицинское информационное агентство, 2002. - 374 с.

15. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний / под. ред. проф. Э. Леннета, Н. Шмидт, перев. с англ. проф. С.Г. Дроздова // М.: Медицина, 1974. 776 с.

16. Миронова, Л.Л. Выделение штамма перевиваемых клеток из тканей эмбриона человека. / Л.Л. Миронова, Н.Е. Гольдфрин, О.Ф. Сарычева // Кн.: Полиомиелит и другие энтеровирусные инфекции. М. - 1963. - С. 231-232.

17. Миронова, Л.Л. Новые линии диплоидных клеток человека / Миронова Л.Л., Стобецкий И.В., Крючкова Г.П., Кудинова С.И., Кармышева В .Я., Малыгина И.Г., Попова В.Д., Ральф Н.М., Алпатова Г.А. // Вопросы вирусологии. 1987. - №5.

18. Полянская Г.Г. Влияние иммобилизованного фибронектина на кариотипическую изменчивость в клеточной сублинии фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Горячая Т.С., Пинаев Г.П. // Цитология. 2005. - Том 47, №10. - С. 925-932.

19. Полянская, Г.Г. Влияние внеклеточного белка теплового шока на хромосомную изменчивость в клеточной культуре фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Кинев А.В., Сакута Г.А., Асеева Е.В. // Цитология. 1997. - Том 39, №11.- С. 1070-1082.

20. Полянская, Г.Г. Влияние криоконсервации на цитогенетические характеристики клеточной сублинии фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Семенова Е.Г., Шубин Н.А. // Цитология. -1990. Том 32, №3. - С. 256-265.

21. Полянская, Г.Г. Влияние ламинина на кариотипическую изменчивость в клеточной линии фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Горячая Т.С., Пинаев Г.П. // Цитология. 2002. - Том 44, №5. - С. 491-498.

22. Полянская, Г.Г. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую структуру клеточной линии индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. // Цитология. 1992. - Том 34, №3. - С. 82-88.

23. Полянская, Г.Г. Влияние условий культивирования на кариотипическую структуру двух клеточных сублиний фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г. // Цитология. 1989. - Том 31, №7. - С. 807817.

24. Полянская, Г.Г. Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных условиях (Обзор) / Полянская Г.Г. // Успехи совр. биол. 2000. - Том 120, №6.-С. 529-539.

25. Полянская, Г.Г. Исследование генотоксического влияния ципрофлоксацина на культивируемые клетки почки кенгуровой крысы и фибробласты кожи индийского мунтжака /. Полянская Г.Г., Сизова JI.C. // Цитология. 1996. - Том 38, №9. - С. 958-973.

26. Полянская, Г.Г. Кариотипическая характеристика клеточных сублиний почки кенгуровой крысы и фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г. // Цитология. 1988. - Том 30, №6. - С. 732-738.

27. Полянская, Г.Г. Кариотипическая характеристика линии фибробластов кожи индийского мунтжака при культивировании с разными сыворотками / Полянская Г.Г., Сизова JI.C., Николаенко Н.С. // Цитология. 1993. - Том 35, №2. - С. 86-96.

28. Полянская, Г.Г. Особенности количественной изменчивости кариотипа в клеточных сублиниях фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Самокиш В.А. // Цитология. 1999. - Том 41, №9. - С. 747-751.

29. Рысмендеева, К.К. Сравнительное изучение чувствительности культур клеток кожи плода овцы и плода крольчихи к вирусу контагиозной эктимы овец и коз : Дис. канд. биол. наук: 03.00.06 / К.К. Рысмендеева ; ВИЭВ. Москва, 1992. -172 с.'

30. Сандомирский, Б.П. Жизнеспособность кожи при криоконсервировании / Б.П. Сандомирский, Н.А. Волкова // Киев.: Наукова думка, 1985. 88 с.

31. Терских, В.В., Эпидермальные кератиноциты человека и животных: Проблемы культивирования и трансплантации / В.В. Терских, А.В. Васильев // М.: Наука, 1995. 104 с.

32. Токин, Б.П. Общая эмбриология: Учеб. для биол. спец. ун-тов. / Б.П. Токин. 4-е изд. перераб и доп. - М.: Высш. шк., 1987. - 480 с.

33. Ченцов, Ю.С. Введение в клеточную биологию: Учеб. для вузов / Ю.С. Ченцов. 4-е изд. перераб и доп. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2004. - 495 с.

34. Юшканцева, С.И. Гистология, цитология и эмбриология. Краткий атлас: Учеб. пособие / С.И. Юшканцева, В.Л. Быков. СПб.: ЗАО «П-2», 2006. -96 с.

35. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер // М.: Библионика, 2007. 524 с.

36. Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина // М.: ВНИТИБП, 1998. 928 с.

37. Adams, J.C. Changes in keratinocyte adhesion during terminal differentiation: reduction in fibronectin binding precedes alpha 5 beta 1 integrin loss from the cell surface / Adams J.C., Watt F.M. // Cell. 1990. - Vol. 63, №2. - P. 425435.

38. Alteras I., Gavrilescu M. Considerations on the parabiosis of dermatophytes in tissue culture, preliminary research // Mycopathol Mycol Appl., 1965 Mar 25; №25.-P. 61-72.

39. Bertolero F. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes / Bertolero F., Kaighn M.E., Camalier R.F., Saffiotti U. // In Vitro Cell Dev Biol. 1986. - Vol. 22, №7. - P. 423428.

40. Boyce S.T. Cultivation, frozen storage, and clonal growth of normal human epidermal keratinocytes in serum-free media / Boyce S.T., Ham R.G. // J. Tissue Cult. Meth. 1985. - Vol. 9, №2. - P. 83-93.

41. Briggaman R.A. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryo human epidermal cells / Briggaman R.A., Abele D.C., Harris S.R., Wheeler C.E. // J Invest Dermatol. 1967. - Vol. 48. - P. 159-168.

42. Carpenter G. Vanadate, epidermal growth factor and the stimulation of DNA synthesis / Carpenter G. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1981. -Vol. 102, №4.-P. 1115-1121.

43. Chen J.D. Human keratinocytes make uniguely liner phagokinetic tracks / Chen J.D., Helmod M., Kim J.P. // Dermatology. 1994. - Vol. 188. - P. 612.

44. Coria M.F. Cell cultures of bovine embryonic skin: growth and characterization / Coria M.F. // Am. J. Vet. Res. 1969. - Mar; Vol. 30, №3. -P. 369-375.

45. De Luca M. The importance of epidermal stem cells in keratinocyte-mediated gene therapy / De Luca M., Pellegrini G. // Gene Ther. 1997. - Vol.4, №5. -P. 381-383.

46. Freshney R.I. Culture of Animal Cells. A manual of basic technique / R.I. Freshney // N-Y.: Alan R. Liss, Inc., 1987. P. 117

47. Furukawa F. Characterization and practical benefits of keratinocytes cultured in strontium-containing serum-free medium / Furukawa F., Huff J.C, Lyons M.B., Weston W.L., Norris D.A. // J. Invest. Dermatol. 1988. - Vol. 90, №5. - P. 690-696.

48. Fusenig N.E. Mouse epidermal cell cultures. 2. Isolation, characterization and cultivation of epidermal cells from perinatal mouse skin / Fusenig N.E., Worst P.K. // ExP. Cell Res. 1975. - Vol. 93, №2. - P. 443-157.

49. Germain L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin / Germain L., Rouabhia M., Guignard R., Carrier L., Bouvard V., Auger F.A. // Burns. 1993. - Vol. 19, №2. - P. 99-104.

50. Gilchrest B.A. Growth of human keratinocytes on fibronectin-coated plates / Gilchrest B.A., Nemore R.E., Maciag T. // Cell Biol. Int. Rep. 1980. - Vol 4, №11.-P. 1009-1016.

51. Gilchrest В.A. In vitro assessment of keratinocyte aging / Gilchrest B.A. // J Invest Dermatol. 1983. - Vol. 81 (1 Suppl). - P. 184s-189s.

52. Gilchrest B.A. Attachment and growth of human keratinocytes in serum-free environment / Gilchrest B.A., Calhoun J.K., Maciag T. //J. Cell Physiol. -1982.-Vol. 112, №2.-P. 197-206.

53. Gragnani A. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation / Gragnani A., Sobral C.S., Ferreira L.M. // Braz J Biol. 2007. - Vol. 67, №1. - P. 105109.

54. Guo M. Activation of human keratinocyte migration on type I collagen and fibronectin / Guo M., Toda K.I., Grinnell F. // J. Cell Sci. 1990. - Vol. 96 (Pt.2). — P. 197-205.

55. Hawley-Nelson P. Optimized conditions for the growth of human epidermal cells in culture / Hawley-Nelson P., Sullivan I.E., Kung M. Hennings H., Yuspa S.H. // J. Invest. Dermatol. 1980. - Vol. 75, №2. - P. 176-182.

56. Hayflick L. The serial cultivation of human diploid cell strains / Hayflick L., Moorhead P.S.//Exp. Cell Res. 1961, - V.25, №3.-P. 585-621.

57. Hennings H. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture / Hennings H., Michael D., Cheng C., Steinert P., Holbrook K., Yuspa S.H. // Cell. 1980. - Vol. 19, №1. - P. 245-254.

58. Hodges G.M. The localization of trypsin in cultured mammalian cells / Hodges G.M., Livingston D.C., Franks L.M. // J. Cell Sci. 1973. - Vol. 12. - P. 887902.

59. Holbrook H. Phenotypic expression of epidermal cells in vitro / Holbrook H., Hennings H. // J Invest Dermatol. 1983. - Vol. 81. - P. 1 ls-24s.

60. Horikoshi Т. Effect of oxygen on the growth of human epidermal keratinocytes / Horikoshi Т., Balin A.K., Carter D.M. // J. Invest. Dermatol. 1986. - Vol. 86, №4. - P. 424-427.

61. Hsu T.C. Primary cultivation and continuous propagation in vitro of tissues from small biopsy specimens / Hsu T.C, Kellogg D.S Jr. // J. Natl. Cancer Inst.- 1960, Vol. 25. P. 221-235.

62. Huang Y. Effects of thrombin peptides on wound healing and proliferation and migration of normal human epidermal keratinocyte (NHEK) / Huang Y., Yang Z., Carney D. // Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2000. - Vol. 16, №1. - P. 2629.

63. Islam M.S. Isolation and characterization of putative epidermal stem cells derived from Cashmere goat fetus / Islam M.S., Zhou H.M. // Eur J Dermatol.- 2007. Vol. 17, №4. - P. 302-308a.

64. Islam M.S. Isolation and propagation of keratinocytes derived from Cashmere goat fetus / Islam M.S., Zhou H.M. // Tissue Cell. 2007. - Vol. 39, №6. - P. 377-385b.

65. Izumi K. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells / Izumi K., Tobita Т., Feinberg S.E. // J Dent Res. 2007. - Vol. 86, №4. - P.341-346.

66. Jakic-Razumovic J. Organotypic skin cultures: a human model for basic studies / Jakic-Razumovic J., Zekusic M., Vladovic-Relja Т., Boranic M. // Croat Med J. 1998. - Vol.39, №4. - P. 401-403

67. Jensen P.K. Low Ca2+ stripping of differentiating cell layers in human epidermal cultures: an in vitro model of epidermal regeneration / Jensen P.K., Bolund L. // Exp Cell Res. 1988. - Vol. 175, №1. - p. 63-73.

68. Karasek M.A. Growth of postembryonic skin epithelial cells on collagen gels / Karasek M.A., Charlton E. // J Invest Dermatol. 1971. - Vol. 56. - P. 205210.

69. Khammo N. Development of an innervated model of human skin / Khammo N. Ogilvie J., Clothier R.H. // Altern Lab Anim. 2007. - Vol.35, №5. - P. 487-491.

70. Kurita T. Apoptotic cell death induced by serum and its prevention by thiols / Kurita Т., Namiki H. // J. Cell Physiol. 1994. - Vol. 161, №1. - P. 63-70.

71. Limat A. Postmitotic human dermal fibroblasts preserve intact feeder properties for epithelial cell growth after long-term cryopreservation / Limat A., Hunziker Т., Boillat C, Noser F., Wiesmann U. // In Vitro. 1990. - Vol. 26,№7.-P. 709-712.

72. Ljungren C.A. Von der Fahigkeit des Hautepitels, auBerhalb des Organismus sein Leben zu behalten, Mit Beriicksichtingung der Transplantation / Ljungren C.A. // Deutsch Zschr Chir. 1898. - Vol. 47. - P. 608-628

73. Maciag T. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes / Maciag Т., Nemore R.E., Weinstein R., Gilchrest B.A. // Science. 1981. - Vol. 211, №4489. - P. 1452-1454.

74. Marcelo C.L. Cyclic AMP, glucocorticoid and retinoid modulation of in vitro keratinocyte growth / Marcelo C.L., Tomich J. // J. Invest. Dermatol. 1983. -Vol. 81, №1 suppl. - P. 64s-68s.

75. Medawar P.B. The cultivation of adult mammalian skin epithelium in vitro / Medawar P.B. // Quart. J. Microsc. Sci. 1948. - Vol. 89. - P. 187-196.

76. Mochizuki R. Expression of desmosomal proteins in rat keratinocytes during in vitro differentiation / Mochizuki R, Kamiyama M, Arai KY, Arai K, Uehara K. // J Vet Med Sci. 2002. - Vol. 64, №2. - P. 123-127.

77. Moorhead P.S. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood / Moorhead P.S., Nowell P.C., Mellman W.J., Battips D.M., Hungerford D.A. // Exp Cell Res. -1960. №20. - P. 613-616.

78. Morhenn V.B. Separation of human skin cells by velocity sedimentation into functionally distinct fractions / Morhenn V.B., Starr E.D., Terrell C., Cox A.J., Engleman E.G. // J. Invest. Dermatol. -1982. Vol. 78, №4. - P. 319-322.

79. Murray J.C. Epidermal cells adhere preferentially to type IV (basement membrane) collagen / Murray J.C., Stingl G., Kleinman H.K., Martin G.R., Katz S.I. // J. Cell Biol. 1979. - Vol. 80. - P 197-202.

80. Patrick C.W. Dermal fibroblasts genetically engineered to release nerve growth factor / Patrick C.W, Zheng В., Schmidt M., Herman P.S., Chauvin B.P., Fan Z., Stark В., Evans G.R. // Ann Plast Surg. 2001. Vol. 47, №6. - P. 660-665.

81. Pentland A.P. Effects of gas tension on epidermal keratinocyte DNA synthesis and prostaglandin production / Pentland A.P., Marcelo C.L., Jordan M.A., Voorhees J.J. // J. Invest. Dermatol. 1986. - Vol. 86, №2. - P. 177-180.

82. Pittelkow M.R. New techniques for the in vitro culture of human skin keratinocytes and perspectives on their use for grafting of patients with extensive bums / Pittelkow M.R., Scott R.E. // Mayo Clinic Proc. 1986. -Vol. 61.-P. 771-777.

83. Praeger F.C. Use of strontium to separate calcium-dependent pathways for proliferation and differentiation in human keratinocytes / Praeger F.C., Stanulis-Praeger B.M., Gilchrest B.A. // J. Cell. Physiol. 1987. - Vol. 132, №1. - P. 81-89.

84. Price F.M. Approaches to enhance proliferation of human epidermal keratinocytes in mass culture / Price F.M., Taylor W.G., Camalier R.F., Sanford K.K. // J. Natl. Cancer Inst. 1983. - Vol. 70, №5. - P. 853-861.

85. Prunieras M. Epidermal cell culture systems in skin pharmacology / Prunieras M, Delescluse C. // Br J Dermatol. 1984. - Vol. 111 Suppl 27. - P. 43-57.

86. Puck T.T. Genetics of somatic mammalian cells III. Long-term cultivation of euploid cells from human and animal subjects / Puck T.T., Cieciura, S.J., Robinson A. // J. Exp. Med. 1958 - Vol. 108, №6. - P. 945-956.

87. Radu E. Stem cells (p63(+)) in keratinocyte cultures from human adult skin / Radu E., Simionescu O., Regalia Т., Dumitrescu D., Popescu L.M. // J. Cell. Mol. Med. 2002. - Vol. 6, №4. - P. 593-598.

88. Rheinwald J.G. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizating colonies from single cells / Rheinwald J.G., Green H. // Cell. 1975. - Vol. 6. - P. 331-344.

89. Robbins F.C. Cultivation of the Lansing Strain of Poliomyelitis Virus in Cultures of Various Human Embrionic Tissues / Robbins F.C., Enders J.F., Weller Т.Н. // Science. 1949. -vol.109. - P. 85-87.

90. Thompson C.H. Optimised growth of human epidermal cells in vitro without the use of a feeder layer or collagen substrate / Thompson C.H., Rose B.R., Cossart Y.E. // Austr. J. ExP. Biol, and Med. Sci. 1985. - Vol. 63 (Pt 2). - P. 147-156.

91. Tsukahara K. Inhibitory effect of an extract of Sanguisorba officinalis L. on ultraviolet-B-induced photodamage of rat skin / Tsukahara K, Moriwaki S, Fujimura T, Takema Y. // Biol Pharm Bull. 2001. - Vol. 24, №9. - P. 9981003.

92. Tsukahara K. Ovariectomy accelerates photoaging of rat skin / Tsukahara K, Moriwaki S, Ohuchi A, Fujimura T, Takema Y. // Photochem Photobiol. -2001. Vol. 73, №5. - P. 525-531.

93. Watt F.M. Epidermal stem cells in culture / Watt F.M. // J. Cell Sci. Suppl. -1988.-Vol. 10.-P. 85-94.

94. Waymouth C. Construction and use of synthetic media and tissue in culture / Waymouth C. // N.Y. Acad. Press. - 1965. - Vol. 1. - P. 546-587Л

95. Witte M.B. Upregulation of arginase expression in wound-derived fibroblasts / Witte M.B., Barbul A., Schick M.A., Vogt N., Becker H.D. // J Surg Res. -2002.-Vol. 105, №1.-P. 35-42.

96. Wurster D.H. Indian muntjac, Muntiacus muntjak: a deer with a low diploid chromosome number / Wurster D.H., Benirschke K. // Science. 1970. -Vol. 168, №937.-P. 1364-1366.

97. Zhu Z. Expression of P450 enzymes in rat whole skin and cultured epidermal keratinocytes / Zhu Z., Hotchkiss S.A., Boobis A.R., Edwards RJ. // Biochem Biophys Res Commun. 2002. - Vol. 297, №1. - P. 65-70.