Закономерности формирования радиационного адаптивного ответа в клетках костного мозга мышей in vivo

Клоков, Дмитрий Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Закономерности формирования радиационного адаптивного ответа в клетках костного мозга мышей in vivo
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности формирования радиационного адаптивного ответа в клетках костного мозга мышей in vivo"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ п п имени М.В. ЛОМОНОСОВА *!о

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ 2 9 АаГ 2,103

На правах рукописи

УДК 575.224:599.323.4

КЛОКОВ ДМИТРИЙ ЮРЬЕВИЧ

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ РАДИАЦИОННОГО АДАПТИВНОГО ОТВЕТА В КЛЕТКАХ КОСТНОГО МОЗГА МЫШЕЙ IN VIVO

03.00.01 -Радиобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2000

Работа выполнена в Учебном центре Физиологии и Биофизики Пущинского Государственного Университета на базе Группы цитогенетики Института теоретической и экспериментальной биофизим Российской Академии Наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

С.И.Заичкина

Научный консультант: чл.-корр. РАН,

В.Е. Балакин

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук профессор И.И. Пелевина

доктор биологических наук В.Г. Тяжелова

Филиал Института Биоорганической Химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г Пущино

Защита диссертации состоится 22_июня_2000 г. в ' часов

на заседании диссертационного Совета Д.053.05.74 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ. Отзывы просим направлять по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, диссертационный Совет Д.053.05.74

Автореферат разослан «.2-2. » 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

£>/ Mi з.о

Pf//; 4/)/ #/^¿20 r>

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время проблема биологического действия малых доз ионизирующих излучений (ИИ) занимает доминирующее место в современной радиационной биологии. Несмотря на то, что эадиационная биология обладает весьма обширными знаниями о механизмах и закономерностях действия на биоту достаточно высоких доз ИИ, она оказалась не в состоянии однозначно объяснить многие эффекты малых доз, которые принято называть особенностями биологического действия малых доз. К их -телу следует отнести прежде всего повышенную радиочувствительность клеток < действию малых доз ИИ и явление адаптивного ответа (АО).

Повышенная радиочувствительность биологических объектов заключается в том, что уровень повреждений, индуцируемый малыми дозами ИИ, превышает уровень, получаемый путем экстраполяции экспериментальных цозовых кривых, построенных при действии больших доз. В последнее время появляется все больше экспериментальных данных о подобной нелинейности сривой «доза-эффект» в области действия малых доз (Заичкина и др., 1992; Vlarples and Joiner, 1993; Skov, 1999), что противоречит официальной линейной эеспороговой концепции, принятой ранее МКРЗ и НКДАР ООН (Публикация VIKP3 № 26, 1978).

Что касается АО, суть которого заключается в том, что воздействие ИИ в чалой адаптирующей (Di) дозе увеличивает радиорезистентность эиологического объекта к последующему облучению в высокой выявляющей дозе (D2), то проведено большое количество исследований, в основном, in vitro [Shadley, 1994). Поэтому многие закономерности индукции АО, такие как зависимость от дозы и мощности адаптирующего облучения, типа излучения, зремени между Di и D2 получены на системах in vitro. В отношении исследований \0 in vivo, то немногочисленность и противоречивость этих работ (Jacobson-<ram and Williams, 1988; Wojcik and Tuschl, 1990) вынуждает исследователей оворить об АО in vivo с некоторой осторожностью и неопределенностью (Stecca 3nd Gerber, 1998), и тем более не представляется возможным проследить ¡акономерности формирования АО in vivo на основании имеющихся отрывочных питературных данных. Поэтому становиться ясной и обоснованной необходимость всестороннего исследования закономерностей формирования \0 именно на системе in vivo.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было ^следование закономерностей формирования радиационного дитогенетического АО в клетках костного мозга мышей in vivo. В соответствии с зтим были поставлены и решены следующие задачи:

Исследовать форму дозовой зависимости выхода цитогенетических повреждений в клетках костного мозга мышей in vivo в области действия малых доз ИИ.

! 2

2. Исследовать такие закономерности формирования радиационного цитогенетического АО в клетках костного мозга мышей in vivo, как зависимость от величины, мощности, режима и типа адаптирующего облучения, времени между адаптирующим и выявляющим облучениями, возраста животных на момент адаптации, а также возможность индукции перекрестного АО агентами разной природы;

3. Исследовать возможность модификации радиационного АО в клетках костного мозга мышей in vivo различными соединениями, обладающими антиоксидантной активностью.

Научная новизна полученных результатов. На системе in vivo получено экспериментальное подтверждение продемонстрированной ранее in vitro нелинейности дозовой кривой в области действия малых доз ИИ.

Показана возможность индукции радиационного АО на системе in vivo, что \ подтверждает общебиологический характер данного явления. Впервые продемонстрирована возможность сверхдлительного сохранения АО на протяжении большей части жизни животных и независимость способности организма к индукции АО от возраста животного.

Также впервые обнаружена возможность индукции перекрестного АО за счет введения животным in vivo низких концентраций перекиси водорода (Н2О2). При исследовании возможности модификации АО показано устранение эффекта на фоне введения животным антиоксидантного фермента каталазы и независимость АО от наличия в организме экзогенного антиоксиданта полифенольной природы, дигидрокверцетина.

Научно-практическое значение работы. Полученная кривая «доза-эффект» меняет представление об оценке радиационного риска и позволяет более критично подойти к проблеме существующих норм радиационной безопасности, основанных на беспороговой концепции МКРЗ и НКДАР ООН (Публикация МКРЗ № 26, 1978).

Выявленные на системе in vivo новые характеристики радиационного АО могут найти практическое применение данного феномена в клинической практике, например, при радиационной терапии опухолей.

Результаты исследования модифицирующего действия различных антиоксидантов и индукции перекрестного АО малыми концентрациями Н2О2 позволяют сузить поиск начальных молекулярных событий при индукции АО, что является одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии стресса. Кроме того, обнаружено новое возможное применение АО - использование его в качестве теста при скрининге пищевых биологически активных добавок.

Личный вклад соискателя. Основные результаты исследований, представленные в диссертации, получены и оформлены непосредственно автором работы в Группе цитогенетики ИТЭБ РАН. В проведении экспериментов также принимали участие сотрудники Группы цитогенетики. В работе

использовались теоретические концепции научного руководителя к.б.н. С.И. Заичкиной и научного консультанта чл.-корр. РАН В.Е. Балакина.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации докладывались на семинарах ИБХФ РАН, Лаборатории радиационной молекулярной биологии, Лаборатории регуляции пролиферации и гибели клеток ИТЭБ РАН, Лаборатории радиационной биохимии и клеточной биологии ИБК РАН, на 3-м Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 14-17 октября, 1997), на VI международном симпозиуме «Урал атомный. Урал промышленный" (Екатеринбург, 22-24 сентября, 1998), 3-м Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов растительного происхождения» (Санкт-Петербург-Пушкин, 29 июня-1июля, 1999), на 11-м Международном Конгрессе по радиационным исследованиям, ICRR'99 (Dublin, Ireland, 18-23 July, 1999), на сателитноом совещании "Biological effects of low dose radiation" (Cork, Ireland, 25-26 July, 1999).

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 9-ти статьях и 24-х гезисах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 102 стр., "одержит 22 рисунка, 17 таблиц, состоит из введения, разделов, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 232 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В экспериментах использовались самцы мышей пинии SHK. Животные содержались в стандартных условиях и получали стандартную диету.

Облучение. Острое у-облучение осуществлялось от источника Со60 на установке ГУБЭ. Мощность всех использованных доз, за исключением дозы 1,5 Гр, составляла 0,125 Гр/мин, а дозы 1,5 Гр -1 Гр/мин.

Хроническое облучение с мощностью 1, 5 и 10 сГр/сут проводилось в у-фоновом помещении от источника 137Cs. Контрольная группа мышей (без фонического облучения) содержалась в аналогичных условиях.

Плотноионизирующим излучением (излучение с высокой ЛПЭ) в наших экспериментах являлись вторичное излучение от протонов с энергией 70 ГэВ [ВИП), и поток пи-мезонов, генерируемые на Серпуховском ускорителе заряженных частиц в г. Протвино. Среднее значение ЛПЭ ВИП составляет 50-60 <эВ/мкм, а пи-мезонов - 40 КэВ/мкм. Облучение мышей ВИП и пи-мезонами проводилось в биологическом канале ускорителя.

Обработка веществамй. Введение Н2О2 проводили внутрибрюшинно [в/б) или внутривенно (в/в) за 1 ч или 1 сут до выявляющего у-облучения в физрастворе по 0,1 мл на мышь в концентрациях 1,47 или 14,7 мМ, что в пересчете на объем крови животного составляло 100 и 1000 мкМ, соответственно.

Дигидрокверцетин (ДГКВ). Использовался «Диквертин» (ДКВ) заводского производства, активным действующим началом которого является ДГКВ. ДКВ содержит не менее 92% ДГКВ. ДКВ растворялся в спиртовом физрастворе и вводился животным в/б из расчета 24 мг/кг веса за 15-20 мин до облучения. В (ачестве позитивного контроля использовался классический радиопротектор

аминоэтилизотиурониум (АЭТ) в дозе 300 мг/кг веса, который вводился в аналогичных условиях.

Каталаза. Фермент (Sigma из печени крупного рогатого скота, 10000 ед/мг) растворялся в 0,9% NaCI с 5 мМ калий фосфатным буфером рН 7,8 и вводился мышам в/в и в/б в дозе 10000 ед/кг веса за 20 мин до у-облучения в Di или D2. Проводились контрольные эксперименты с термоинактивированным ферментом (100 С, 5 мин).

Оценка цитогенетического повреждения. Процедура проведения микроядерного (МЯ) теста проводилась по стандартной методике (Schmid, 1975) с некоторыми собственными модификациями. Для исключения эффектов клеточного цикла проводился контроль соотношения полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) и нормохроматофильных эритроцитов (НХЭ).

Оценка клеточности тимусов. Тимоциты из выделенного тимуса суспендировались в PBS. Подсчитывалось общее количество тимоцитов на каждое животное с помощью светового микроскопа и камеры Горяева.

Статистическая обработка результатов. При вычислении ошибок учитывался как разброс данных по отдельным мышам, так и ошибки, связанные с конечным числом клеток. При проверке статистической достоверности различий между группами использовался критерий Стьюдента. При вычислении величин АО погрешность определялась как ошибка частного от деления средних арифметических с их ошибками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Дозовая зависимость в области малых доз. При исследовании характера дозовой зависимости выхода цитогенетических повреждений в клетках костного мозга мышей in vivo была получена кривая, представленная на рис. 1.

Таблица 1. Соотношение ПХЭ:НХЭ в костном мозге мышей в зависимости от дозы у-облучения.

Доза, Кол- Кол- ПХЭ в ПХЭ,

сГр во во них %

мы- эритр.

шеи

0 5 5207 2407 46±3

5 4 4197 2334 56+11

10 5 5592 2468 44±7

20 5 5190 2748 53±9

35 4 4019 2288 55+6

40 5 5141 2175 41±8

50 4 4086 2080 51+5

20 30 40

Доза, сГр

Рис. 1. Дозовая зависимость выхода ПХЭ с МЯ в Костном мозге мышей при гамма-облучении ¡n vivo. Кривая построена после вычета спонтанного Выхода ПХЭ с МЯ.

Видно, что зависимость нелинейная и характеризуется наличием трех участков: первого линейного, на котором наблюдается повышенная радиочувствительность, по сравнению с ожидаемой при обратной линейной экстраполяции данных для больших доз, второй участок плато и последний линейный, но с отличным от первого углом наклона. Ранее на нескольких объектах in vitro был показан аналогичный характер дозовых кривых выхода цитогенетических повреждений (Заичкина и др., 1992), т.е. нелинейность сохраняется и для системы in vivo.

Анализ соотношения ПХЭ:НХЭ показал, что различий у животных, облученных разными дозами, по этому показателю не наблюдалось (табл. 1). Это свидетельствует о правильности выбора времени приготовления цитологических препаратов и позволяет отвергнуть объяснение нелинейности дозовой зависимости за счет эффектов клеточного цикла (задержка деления), предлагаемое некоторыми авторами (Jenssen and Ramel, 1976, 1978). Можно предположить, что, как и в случае in vitro, повышенная поражаемость может объясняться отсутствием репаративных процессов. (Заичкина и др., 1992) Однако, для более обоснованных выводов относительно природы наблюдаемой формы кривой необходимо специальное исследование, не вошедшее в задачи данной работы.

2. Закономерности формирования АО in vivo

2.1. Зависимость АО от величины адаптирующей дозы. Поскольку известно, что индукция АО зависит от Di, то следующим этапом работы было изучение индукции АО разными дозами, что представлялось необходимым для выбора оптимальной дозы Di для нашего объекта. Поэтому для исследования были выбраны дозы, соответствующие разным участкам дозовой зависимости -10, 20 и 40 сГр. Временной интервал между Di и D2 составлял 1 сут. На рис.2 представлены результаты этих экспериментов. Выходы ПХЭ с МЯ в группах, предварительно облученных в дозах Di, были ниже, чем в группе без предварительного облучения, т.е. облучение в малых дозах индуцировало АО.

Таблица 2. Соотношение ПХЭ.НХЭ в костном мозге мышей, облученных в разных адаптирующих дозах и в выявляющей

Доза Кол-во мышей Кол-во эритр. ПХЭ в них ПХЭ, %

0 5 5207 2407 46+3

1,5 Гр 5 4678 1665 36+7

10 сГр+ 1,5 Гр 5 3362 1311 40±7

20 сГр+ 1,5 Гр 5 3574 1354 38±4

40 сГр+ 1,5 Гр 5 3419 1576 43±6

о О

Рис. 2. Выход ПХЭ сМЯв экспериментах по Изучению АО, индуцированного разными дозами 01

Следует отметить, что степень защитного эффекта или величина АО (коэффициент, показывающий во сколько раз снижается уровень повреждений, наносимый дозой Ог, за счет предоблучения в дозе 0^ была примерно одинаковой для всех вариантов адаптирующего облучения, т.е. дозы 10, 20 и 40 сГр индуцировали одинаковый АО при промежутке времени между 01 и Ог, равном 1 сут. При расчете величины АО, как правило, используется аддитивный эффект, т.е. выход повреждений в группе (01+0г), сравнивается с ожидаемым, который получается при сложении выходов в группах 01 и Ог.

Таким образом, принадлежность дозы Di какому-либо из трех, вышеописанных участков дозовой кривой (в области малых доз), не оказывает заметного влияния на формирование АО при облучении в дозе D2 через 1 сут.

В этих экспериментах также не было выявлено изменений продвижения эритробластов по клеточному циклу (табл.2); в дальнейшем данные по соотношению ПХЭ:НХЭ не приводятся.

2.2. Зависимость АО от мощности адаптирующей дозы. Исследования in vitro показали зависимость АО не только от дозы Di, но и от мощности адаптирующего облучения, причем форма этой зависимости меняется с изменением самой дозы Di. Так, при уменьшении мощности требуется уже более высокие дозы для индукции АО (Cortes and Domínguez, 1994). Поэтому в следующих экспериментах мы исследовали индукцию АО хроническим у-облучением. Данные представлены в табл. 3. Видно, что хроническое облучение в дозе как 10, так и 50 сГр понижало выход цитогенетического повреждения от последующего острого у-облучения. Выраженность АО была больше при дозе 50 сГр, чем при дозе 10 сГр.

Таблица 3. Выход ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей, подвергнутых

хроническому (10 и 50сГр) и острому выявляющему у-облучению.

Воздействие Кол-во Число анализи- Число ПХЭ с ПХЭ с МЯ, %

мышеи рованных ПХЭ МЯ

0 5 30276 165 0,51 ±0,17

1,5 5 10320 650 6,32±0,39

10 сГр 5 10231 102 1,02+0,16

50 сГр 5 10064 71 0,72±0,04

10 сГр + 1,5 Гр 5 10131 1017 4,66+0,16"

50 сГр + 1,5 Гр 5 10059 269 2,66±0,38 ***

Здесь и далее в таблицах и рисунках:.* - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001; сравнение проводится с группой, облученной только 1,5 Гр.

Таким образом, зависимость АО in vivo от дозы и ее мощности имеет характер аналогичный характеру, полученному на системах in vitro. При малой мощности эффективные адаптирующие дозы более высокие, чем при больших мощностях.

2.3. Фракционирование адаптирующей дозы. Представлялось интересным изучить возможность увеличения АО за счет повторного острого облучения в дозе Di, или, иными словами, за счет фракционирования адаптирующей дозы. В этих экспериментах двукратное облучение дозе Di, равной 10 сГр, проводилось с интервалами 1 сут, 1 мес и 3,5 мес. Выявляющее облучение проводилось через 1 сут после последней адаптирующей дозы. Ни при каком сроке между двумя дозами Di не наблюдалось достоверного усиления эффекта, т.е. АО не увеличивался за счет повторного адаптирующего облучения. Можно сказать, что облучение в дозе 10 сГр полностью «исчерпывает» свой адаптирующий потенциал, а повторное адаптирующее облучение не влияет на уже индуцированные механизмы АО. Это предположение подтверждается результатами исследований, проведенных in vitro другими авторами, в которых показано, что будучи оптимальной адаптирующей дозой для культуры лимфоцитов человека, доза 1 сГр при двойном применении не усиливает АО (Bai and Chen, 1993). При этом двукратное облучение в дозе 0,5 сГр (однократное облучение не вызывало АО)

индуцировало АО такой же как и облучение в одной дозе 1 сГр.

2.4. Зависимость АО от ЛПЭ адаптирующего излучения. ЛПЭ ИИ может оказывать существенное влияние на индукцию АО. В нашей работе исследовании зависимости АО от ЛПЭ адаптирующего излучения использовали такие типы плотноионизирующих излучений как ВИП и пи-мезоны. Из табл. 4, где представлены результаты данного исследования, видно, что облучение как ВИП, так и пи-мезонами в дозе 10 сГр не приводило к индукции АО при последующем выявляющем у-облучении через 1 сут.

АО не наблюдался и в случае, когда после облучения ВИП в дозе 10 сГр использовалась доза 1,5 Гр опять же ВИП. Более того, в этом случае наблюдалась даже тенденция к аддитивному эффекту. Эти результаты, кроме того, что дополняют известные из исследований in vitro данные о неспособности плотноионизирующих излучений индуцировать АО, предполагают роль репарационных процессов в формировании АО. Ранее было показано in vitro, что ВИП индуцирует трудно- и нерепарируемые повреждения ДНК и, в некоторой степени, само ингибирует репарацию ДНК (Заичкина и др., 1992).

Таблица 4. Выход ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей, подвергнутых

адаптирующему и выявляющему действию излучений с разными ЛПЭ.

Воздействие Кол-во мышей Число анализированных ПХЭ Число ПХЭ с МЯ ПХЭ с МЯ, %

0 5 30276 165 0,51±0,17

1,5 Гр(ВИП) 4 10274 579 5,6±0,6

1,5 Гр (у) 5 10321 650 6,32+0,39

10 сГр (ВИП) + 1,5 Гр (ВИП) 5 13235 1037 6,7±0,4

10сГр(ВИП)+ 1,5 Гр (у) 5 13674 751 5,5±0,6

10 сГр (ВИП) 5 8142 122 1,49+0,22

1,5 Гр (у) 5 5154 262 5,1+0,5

10 сГр (я) + 1,5 Гр (у) 5 5212 306 5,9±0,3

10 сГр (л) 5 5201 90 1,42+0,13

2.5. Сверхдлительная динамика формирования АО in vivo. В описанных выше экспериментах было показано, что двукратное облучение в дозе Di 10 сГр с интервалом в 3,5 мес индуцировало АО, равный по величине АО, индуцированному однократным облучением в дозе 10 сГр. При этом остается неясным, первая ли доза Di индуцировала АО, проявившийся через 3,5 мес, или \0 был индуцирован вторым облучением Di. Для выяснения этого вопроса было эешено исследовать индукцию АО на сверхдлительных промежутках времени между дозами Di и Ü2. Причем поскольку дозы 10, 20 и 40 сГр индуцировали эдинаковый АО на сроке 1 сут, было решено исследовать все три дозы.

Адаптирующая доза 10 сГр. В первой серии экспериментов использовалась адаптирующая дозы 10 сГр, а промежутки времени между Di и Эг составляли 2 недели, 1, 3, 6, 9 и 12 мес. На всех исследованных сроках наблюдалось понижение уровня цитогенетического повреждения в клетках юстного мозга животных из групп, облученных (D1+D2), по сравнению с кивотными из группы, облученной только в дозе D2. Причем величина АО была примерно одинаковой на протяжении всего исследования (рис. 3), а наблюдаемые колебания были незначимы и их можно отнести за счет случайных факторов. Такое длительное сохранение АО на протяжении большей части

жизни животного показано впервые и может представлять собой существенную особенность АО in vivo.

Параллельно, в экспериментах с Di, равной 10 сГр, определялась клеточность тимуса. Поскольку тимус, наряду с костным мозгом, является важным кроветворным органом с активно пролиферирующей тканью, этот тест имел своей целью проверить наличие того же АО, но уже по другому критерию -пролиферативной способности тимоцитов. У животных, облученных (Di+D2) действительно наблюдалось увеличение количества тимоцитов, по сравнению с животными, облученными только D2. Значения клеточности тимуса при этом составляли 1,5X107 против 0,5x107 (Р<0,05).

Адаптирующая доза 20 сГо. При исследовании сверхдлительной динамики формирования АО, индуцированного дозой 20 сГр, на всех исследованных сроках между Di и D2 (2 недели, 1, 2, 3 и 8 мес), как и в предыдущем случае, наблюдался АО. Его величина практически не отличалась от величины АО при дозе 10 сГр, а колебания происходили в том же диапазоне значений (рис. 3).

О <

га х s

5 ^

О)

3,0 2,5 2,0

0,5 0,0

1'5 ' « 1.0 -W-

D, = ЮсГр D, = 20 сГр D, = 40 СГр

2 4 6 8 10 12 14

Время между D1 и D2 ,мес

Рис. 3. Зависимость сверхдлительной динамики АО от величины D1

! Адаптирующая доза 40 сГо. Как было видно из рис. 2, через 1 сут после

j адаптирующего облучения в дозе 40 сГр наблюдался значительный АО, } величина которого была близка по значению к величинам АО, полученным на i этом же сроке при облучении мышей в адаптирующих дозах 10 и 20 сГр. На следующей точке, через 2 недели, величина АО значительно понизилась, а через 1 и 2 мес АО отсутствовал (рис. 3). Таким образом, АО, индуцированный дозой 40 сГр, уже через 1 мес после облучения исчез, проявив максимальную величину на сроке 1 сут.

Таким образом, наблюдается очевидное различие в способности доз 10 и 20 сГр, с одной стороны, и дозы 40 сГр, с другой, индуцировать длительно сохраняющийся АО в клетках костного мозга мышей при облучении in vivo. Однозначное объяснение подобному феномену дать трудно. Можно предположить, что механизмы, ответственные за проявление АО на коротких (сутки) и длительных сроках, отличаются. Дозы 10 и 20 сГр индуцируют

одинаковый уровень повреждений на единицу дозы, отличный от такового для дозы 40 сГр (рис. 1), что может являться причиной таких существенных различий в динамиках АО, индуцированных дозами 10, 20 сГр и дозой 40 сГр.

Если обратиться к литературным данным, то на этот счет не существует какого-либо определенного мнения. Во-первых, существует лишь три работы, в которых были исследованы продолжительные сроки после индукции АО, и максимальный срок, на котором был выявлен АО, составлял 2,5 мес (Yonezawa et al., 1990, 1996). Следует отметить, что хотя выявленная японскими исследователями общая закономерность и соответствует полученным в нашем исследовании результатам (меньшие дозы способны индуцировать АО на боле продолжительных сроках, до 2,5 мес), некоторые их результаты вызывают недоумение. Например, противоположные эффекты в двух повторных экспериментах с дозой 10 сГр, когда в первом АО наблюдался, а во втором - нет, или большой разброс выживаемости мышей в контроле. Что касается работы отечественных авторов, то в диапазоне адаптирующих доз 0,3-5 сГр не выявлено влияния дозы на продолжительность АО по критерию КОЭс мышей на сроках до 28 сут. (Семенец и др., 1993). Здесь авторы либо не вышли на тот дозовый диапазон, где возможны эффекты доз, либо исследованный ими интервал в 28 сут был недостаточен для выявления эффектов.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, во-первых, возможность сверхдлительного сохранения АО in vivo, во-вторых, его зависимость от величины адаптирующей дозы.

2.6. Зависимость АО от возраста животного. Поскольку было показано, что АО сохраняется на протяжении большей части жизни животных после того, как однажды был индуцирован облучением Di в возрасте 2 мес, представлялось необходимым исследовать возможность индукции АО у животных разного возраста, в том числе и у стареющих мышей. На рис. 4 представлена зависимость величины АО от возраста мышей на момент адаптации дозой 10 сГр. Время между Di и D2 составляло 1 мес. Как видно, АО индуцировался у животных всех возрастов, вплоть до 16-ти месячного возраста.

Эти результаты позволяют предполагать, что способность организма к индукции АО in vivo может сохраняться до конца жизни. Нам не известны исследования, в которых изучалась бы возможность индукции АО у стареющих животных и связанные с этим зависимости. Результаты нашего исследования представляют интерес и определенную ценность в отношении не только

О <

го

X S ГГ S

с; ш СО

2 4 9 16

Возраст мышей, мес

Рис. 4. Зависимость относительной величины АО от возраста мышей на момент адаптирующего облучения. Время между адаптирующим и выявляющим облучениями 1 мес.

практического использования АО, но и выяснения зависимости АО от особенностей функционального состояния организма, взаимосвязи и характера взаимодействия механизмов АО, действующих на клеточном и организменном уровнях. Последний аспект мог бы способствовать и выяснению фундаментальных механизмов индукции АО.

2.7. Индукция перекрестного АО низкими концентрациями Н2О2. Известно, что биологическое действие ИИ опосредовано в основном, свободными радикалами, образующимися при радиолизе воды. А поскольку на основании исследований in vitro, предполагается, что инициирующим событием для АО является образование повреждений ДНК (Stecca and Gerber, 1998), логично предполагать, что в индукции АО in vivo существенную роль могут играть кислородные радикалы. Для изучения этого вопроса было решено использовать в качестве адаптирующего агента Н2О2, индуцирующую окислительный стресс. Сначала для индукции перекрестного АО концентрация Н2Ог во введенных в/в 0,1 мл раствора составляла 14,7 мМ. Как видно из рис. 5, предварительное введение Н2О2 снижало выход цитогенетического повреждения, индуцированного выявляющим у-облучением, т.е. наблюдался перекрестный АО. Причем степень защитного действия от введения Н2О2 не отличалась от защитного действия дозы 10 сГр. Следовательно можно предположить, что как при у-облучении, так и при действии Н2О2 (окислительный стресс) механизмы АО одни и те же. Для дальнейшего изучения этого вопроса было исследовано комбинированное действие адаптирующих доз у-облучения и Н2О2 в разных последовательностях.

Из рис. 5 видно, что достоверного снижения выхода повреждений в группах (Н2О2+Ю сГр+1,5 Гр) и (10сГр+Нг02+1,5 Гр) по сравнению с группой (Нг02+1,5 Гр) не наблюдалось. При этом видна лишь тенденция к взаимному усилению эффектов этих воздействий разной природы, что, однако, оставляет

К 5 о

8 2 С 1

8 г

гЬ

№

? с/

Рис. 5. Выход ПХЭ с МЯ в костном мозге мышеи при вариантах ¡¡датирующих доз Н202 и у-лучей последующего выявляющего у-облучения 7,5 Гр

возможность говорить о небольших отличиях механизмов АО при действии ионизирующего излучения и Н2О2. Известно, что АО не наблюдается в течении 46 ч после адаптации, что связано с необходимостью синтеза новых белков (51^1еу е1 а1., 1987). Поэтому далее, была проверена справедливость этой

закономерности для АО, индуцированного Н2О2. Перекрестный АО при выявляющем облучении через 1 сут повторился, что подтверждает существование этого феномена, причем эффект наблюдался и при более низкой <онцентрации Н2О2, 1,47 мМ. Довольно неожиданным явился тот факт, что обе «знцентрации Н2О2 индуцировали АО при выявляющем у-облучении через 1 час юсле обработки Н2О2. Исходя из того, что у-облучение и Н2О2 взаимно не усиливают АО, но при этом АО от малой концентрации Н2О2 наблюдается уже <ерез 1 час после адаптации, можно предположить, что в индукции АО Н2О2 1рисутствуют две составляющие - «быстрая», не наблюдаемая при □адаптации, и «обычная», механизм которой схож с механизмом при у-адаптации. Этим также можно объяснить тенденцию к взаимному усилению эффектов этих 1вух агентов, предполагая, что «быстрая» составляющая АО, при действии Н2О2 ; 1 сут спадает.

Результаты этих экспериментов, в которых показана возможность 1ндукции перекрестного АО in vivo, позволяют высказать предположение о ущественной роли кислородных свободных радикалов в индукции АО. Более ого, рассматривая механизмы инициации АО и исходя из общепринятого факта, то сигналом для индукции АО служат повреждения ДНК, наиболее вероятным андидатом на роль важнейшего для индукции АО повреждения выступают ОР (НК, поскольку они являются основным типом повреждений при действии Н2О2 Dlive and Johnston, 1997).

3. Модификация АО веществами, обладающими антиоксидантной ктивностью.

Описанные выше эксперименты по индукции перекрестного АО, а именно, ндукции АО малыми концентрациями Н2О2, предполагают важную роль в сследуемом феномене кислородных свободных радикалов. Поэтому логично редполагать, что искусственно повышенная антиоксидантная активность клеток о время адаптирующего облучения могла бы модифицировать формирование О. В связи с этим, было решено исследовать модифицирующее действие азличных антиоксидантных соединений на индукцию АО. Использовались ДГКВ \ составе ДКВ) и фермент каталаза.

Модификация АО ДГКВ. Соответствующие данные представлены в абл.5.

зблица 5. Выход ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей при различных вариантах

каптирующего и выявляющего -¡-облучений на фоне введения ДКВ.

Воздействие Кол-во Число ана- Число ПХЭ с МЯ, %

мышеи лизированных ПХЭ ПХЭ с МЯ

ЭГр 5 20257 137 0,68 + 0,05

ДКВ + 0 Гр 5 15188 78 0,47 ± 0,07

этанол+физраствор) 5 10510 69 0,62 ± 0,05

1,5 Гр 5 9251 526 5,54 + 0,32

ДКВ + 10 сГр + (1 час) 1,5 Гр 5 9186 267 2,90 + 0,27**

ЦКВ + 10 сГр + (1 сут) 1,5 Гр 5 9069 297 3,29 ± 0,32**

Ю сГр + (1 час) 1,5 Гр 5 10213 558 5,44+0,38

Ю сГр + (1 сут) 1,5 Гр 5 9128 302 3,30 ±0,19"

ДКВ + 1,5 Гр 5 10103 355 3,02 ± 0,27*

этанол+физраствор) + 1,5 Гр 5 10056 558 5,92 ± 0,32

^ЭТ + 1,5 Гр 5 12072 366 3,00 ±0,14"

Предварительные эксперименты показали, что ДГКВ обладает радиопротекторными свойствами, вероятнее всего благодаря своему антиоксидантному действию, продемонстрированному на молекулярной многокомпонентной биотест-системе (Кондакова и др., 1998а). Причем степень протекторного действия практически не отличалась от такового при действии известного радиопротектора АЭТ. Как видно из табл.5, уровень повреждений в группе (ДКВ+10 сГр+/1 час/+1,5 Гр) почти такой же, как в группе (ДКВ+1,5 Гр), и, поскольку АО при 1-часовом интервале между адаптирующей и выявляющей дозами отсутствует, этот эффект следует отнести за счет радиопротекторных свойств ДКВ, сохранившихся через 1 ч после введения мышам. Видно, что при выявляющем облучении через 1 сут наблюдается АО. При этом введение ДКВ до адаптирующего облучения не оказало никакого влияния на развитие АО. Следовательно, механизм радиопротекторного действия ДКВ не затрагивает запуск дозой Di механизмов АО.

Модификация АО каталазой. Соответствующие данные представлены в табл. 6. Как в/в, так и в/б введение каталазы обладало радиозащитным действием, что согласуется с данными о защитном действии каталазы при облучении культуры клеток млекопитающих и человека (Fillips et al., 1984).

Таблица 6. Выход ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей при различных вариантах

адаптирующего и выявляющего у-облучений на фоне введения каталазы.

Воздействие Кол-во Число анали- Число ПХЭ с МЯ,

мышей зированных ПХЭ ПХЭ с МЯ %

0 4 19000 148 0,79±0,05

Кат в/в 6 6379 46 0,72±0,04

Кат в/6 5 5000 30 0,59±0,04

10 сГр 5 18727 273 0,92±0,16

1,5 Гр 5 10044 668 6,6±0,6

Катв/в+1,5 Гр 5 5000 105 2,5±0,4**

Кат в/б+1,5 Гр 4 4000 99 2,1±0,3"*

(и)Кат в/в+1,5 Гр 1 5 10142 697 6,8±0,07

10 сГр+1,5 Гр 5 6620 447 4,0±0,6*

Кат в/в+10 сГр+1,5 Гр 4 12497 818 6,5±0,5

Кат в/б+10 сГр+1,5 Гр 5 10000 734 7,3±0,8

(и)Кат в/в+10 сГр+1,5 Гр 5 12290 450 3,5±0,4*

-(и)Кат - термоинактивированный фермент

Инакгивированный фермент не проявлял радиозащитного действия. Введение каталазы до Di предотвращало развитие АО, причем подобное действие наблюдалось при обоих вариантах введения фермента. При введении инактивированного фермента наблюдался такой же АО, как и при действии одной только Di.

Таким образом, исследованные нами соединения, обладающие антиоксидантной активностью, при комбинированном действии с малыми дозами ИИ в условиях /л vivo проявляют разные эффекты. Так, флавонои^ растительного происхождения ДГКВ не влиял на способность клеток костногс мозга к индукции АО. С другой стороны, катапаза полностью предотвращала развитие АО. Можно предположить, что в первом случае ДГКВ, несмотря на то что нейтрализует радикалы ОН*, сам способен вызывать образование вторичны) свободных радикалов, в результате чего без видимых цитогенетически) повреждений происходит индукция АО. Это подтверждается тем, что

родственное ДГКВ соединение, кверцетин, может индуцировать повреждения ДНК (Caria et al., 1995) и вызывать перекрестный АО (Oliveira et al., 2000). Устранение АО каталазой подтверждает важную роль свободных радикалов, в частности, Н2О2, в индукции АО. Причем наиболее вероятным первичным событием при запуске механизмов АО, на наш взгляд, является образование ОР ДНК. Тем не менее, следует помнить и о других возможных путях запуска АО, например, опосредованном повреждениями мембран (Эйдус, 1996; Eidus, 2000), сигнальном пути, в котором Н2О2 играет роль сигнальной молекулы для запуска многих активационных процессов (Гамалей и Клюбин, 1996)

АО как тест при скрининге пищевых антиоксидантов. Результаты, полученные в наших экспериментах с ДГКВ и каталазой, могут представлять интерес в свете широко распространяемой практики применения так называемых биоантиоксидантов. В последнее время появилось множество биологически активных веществ, различного происхождения и обладающих антиоксидантной активностью, которые рекомендуются не только в качестве пищевых добавок пожилым людям или людям, страдающими различными патологиями, но и в качестве профилактических препаратов любым группам населения. Человек, /потребляющий различные антиоксиданты, часто подвергается вредному действию различных физических и химических факторов окружающей среды. Среди них особый интерес и важность имеет ИИ, поскольку является неотъемлемой составляющей нашей жизни, а естественный радиационный фон неуклонно возрастает. На наш взгляд, при скрининге подобных препаратов необходимо исследовать их сочетанное действие с возможными неблагоприятными факторами среды, в частности с ИИ, поскольку это действие может давать скрытый негативный эффект, например, понижение адаптационного потенциала организма, что мы и наблюдали. Идея об использовании АО как способа выявления скрытых изменений в системах поддержания стабильности генома, невыявляемых традиционными методами :крининга, была высказана ранее Пелевиной и др. (1994). Наши данные подтверждают справедливость этой идеи и расширяют возможное применение геста по типу АО на скрининг пищевых добавок.

ВЫВОДЫ

I. Показано, что дозовая зависимость выхода цитогенетических повреждений при у-облучении /л vivo имеет сложный ступенчатый характер с первоначальным линейным участком повышенной радиочувствительности и следующим за ним участком плато или индуцированной радиоустойчивости. I. Установлено, что формирование радиационного АО in vivo характеризуется зависимостью от величины и мощности адаптирующей дозы; при этом большие дозы хронического облучения индуцируют более выраженный АО. 5. Показано, что плотноионизирующие излучения, такие как вторичное излучение от протонов с энергией 70 ГэВ и пи-мезоны, не индуцируют АО, что указывает на участие процессов репарации ДНК в формировании АО. I. Впервые показана возможность формирования АО при сверхдлительных сроках между адаптирующим и выявляющим облучениями - до 12 мес, что говорит об устойчивости адаптационных изменений в течении жизни животных.

5. Обнаружено, что способность организма к индукции АО in vivo не зависит от возраста животных, что позволяет говорить о сохранении адаптационного потенциала в процессе старения.

6. Впервые показана возможность индукции перекрестного АО низкими концентрациями Н2О2 при последующем у-выявлении; это подтверждает предположение о возможном участии окислительных процессов в индукции АО in vivo.

7. Обнаружено различное действие веществ, обладающих антиоксидантной активностью, на индукцию радиационного АО in vivo: каталаза предотвращает развитие АО, что подчеркивает существенную роль кислородных радикалов в индукции АО, а дигидрокверцетин, флавоноид растительного происхождения, не модифицировал АО, что позволяет говорить о специфичности действия данного соединения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Клоков Д.Ю., Заичкина С.И., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А.Х., Розанова О.М. Индукция цитогенетического повреждения в клетках костного мозга крыс при комбинированном воздействии хронического и острого у-облучения. Генетика 1997 33(6):855-857

2. Заичкина С.И., Клоков Д.Ю., Розанова О.М., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А.Х. Действие малых доз у-радиации на цитогенетическое повреждение в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей in vivo. Генетика 1998 34(7):1013-1016

3. Кузин А.М., Суркенова Г.Н., Заичкина С.И., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А.Х., Розанова О.М., Клоков Д.Ю. О возможном участии биогенных излучений в явлении «адаптивного ответа». ДАН 1998 358(1):122-124

4. Балакин В.Е., Заичкина С.И., Клоков Д.Ю., Розанова О.М., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А.Х., Смирнова E.H. Обнаружение эффекта длительного сохранения радиационного адаптивного ответа в костном мозге мышей. ДАН 1998 363(6): 843-845

5. Заичкина С.И., Клоков Д.Ю., Розанова О.М., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А.Х., Смирнова E.H. Зависимость длительности сохранения радиационного адаптивного ответа в клетках костного мозга мышей от дозы у-облучения in vivo. Генетика 1999 35(9):1274-1279

6. Заичкина С.И., Клоков Д.Ю., Розанова О.М., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А.Х., Ганасси Е.Э. Зависимость величины цитогенетического адаптивного ответа в клетках костного мозга крыс от дозы хронического у-облучения in vivo. Радиационная Биология. Радиоэкология 1999 39(4):404-405

7. Клоков Д.Ю., Заичкина С.И. Методы автоматического анализа клеток и их применение в радиобиологических исследованиях. Радиационная Биология. Радиоэкология. 2000 40(1):15-22

8. Аптикаева Г.Ф., Заичкина С.И., Розанова О.М., Ахмадиева А.Х., Клоков Д.Ю. Изучение влияния на выход цитогенетического повреждения в двуядерных клетках китайского хомячка предварительного у-облучения в

постсинтетической стадии клеточного цикла. Радиационная Биология.

Радиоэкология 2000 (в печати)

'. Klokov D.Yu., Zaichkina S.I., Rozanova O.M., Aptikaeva G.F., Akhmadieva A.Kh., Smirnova E .N., Balakin V.Y.. The duration of radioadaptive response in mouse bone marrow in vivo. In: Biological Effects of Low Dose Radiation (T.Yamada et al. Eds.) Elsevier, Amsterdam, 2000 (in press)

0. Клоков Д.Ю., Заичкина С.И., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А.Х., Розанова О.М., Смирнова Е.Н. Балакин В.Е., Шапошникова В.В., Кудрявцев А.А. Изучение адаптивного ответа в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей в отдаленные сроки после y-облучения в дозе 10 сГр. 3-й Съезд по Радиационным Исследованиям. Москва 14-17 октября 1997 Т.1 152

1. Klokov D.Yu., Zaichkina S.I., Aptikaeva G.F., Akhmadieva A.Kh., Rozanova O.M., Smirnova E.N., Balakin V.E.. The induction of adaptive response in mouse bone marrow cells in remote terms after in vivo irradiation with a dose of 10 cGy. Joint Meeting of the ARR and the DNA Repair Network. Lancaster UK 23-25 March1998 134

2. Заичкина С.И., Аптикаева Г.Ф., Розанова О.М., Ахмадиева А.Х., Смирнова Е.Н., Клоков Д.Ю. Особенности действия малых доз радиации на индукцию цитогенетического повреждения в клетках млекопитающих и растений: повышенная чувствительность и адаптивный ответ. Труды VI международного симпозиума «Урал атомный. Урал промышленный" Екатеринбург 22-24 сентября 1998 19-20

3. Klokov D.Yu., Zaichkina S.I., Rozanova O.M., Aptikaeva G.F., Akhmadieva A.Kh., Smirnova E.N., Balakin V.Y. Persistence of adaptive response in mouse bone marrow cells in remote terms after in vivo gamma-irradiation with various doses. Abstract book of the 29th Meeting of the European Society for Radiation Biology. Capri Italy 3-7 October 1998 S-24

А. Кондакова H.B., Заичкина С.И., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А.Х., Розанова О.М., Клоков Д.Ю., Сахарова В.В., Рипа Н.В., Ребров Л.Б., Быков В.А Антимутагенное действие дигидрокверцетина при окислительном стрессе, вызванном у-облучением мышей. Материалы 3-го международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов растительного происхождения. Санкт-Петербург-Пушкин 29 июня-1июля 1999 34-36

5. Klokov D.Yu., Zaichkina S.I., Rozanova O.M., Aptikaeva G.F., Akhmadieva A.Kh., Smirnova E.N., Balakin V.Y. Persistence of adaptive response in mouse bone marrow cells in remote terms after in vivo y-irradiation with various doses. Abstract book of the 11th International Congress for Radiation Research. (Eds. M.Moriarty et al.). Dublin Ireland 18-23 July 1999 255

6. Заичкина С.И., Кондакова Н.В., Розанова О.М., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А.Х., Клоков Д.Ю., Сахарова В.В., Рипа Н.В., Ребров Л.Б., Быков В.А Антимутагенное действие сочетанного применения флавоноида дигидрокверцетина и малой дозы у-лучей в костном мозге мышей при окислительном стрессе in vivo. Клиническая геронтология. Тезисы IV Международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни» 30 Сентября - 1 октября 1999, Москва 1999 Т.З 85

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Клоков, Дмитрий Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ.

Часть 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Д030ВЫЕ ЗАВИСИМОСТИ В ОБЛАСТИ ДЕЙСТВИЯ МАЛЫХ

1.1.1. Исследования на клетках бактерий и немлекопитающих.

1.1.2. Исследования на клетках животных и человека.

1.1.3. Исследования in vivo.

1.1.4. Природа нелинейности эффектов при действии малых доз

Глава 2. Феномен радиационного адаптивного ответа.

1.2.1. Радиационный АО in vitro и in vivo.

1.2.2. Характеристики радиационного АО.2В

1.2.3. Перекрестный АО.

1.2.4. Механизмы АО.

Часть 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Облучение.

2.3. Обработка веществами.

2.4. Оценка цитогенетического повреждения.

Часть 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Дозовая зависимость в области малых доз.

3.2. Закономерности формирования АО in vivo.

3.2.1. Зависимость АО от величины адаптирующей дозы.

3.2.2. Зависимость АО от мощности адаптирующей дозы.

3.2.3. Фракционирование адаптирующей дозы.

3.2.4. Зависимость АО от ЛПЭ адаптирующего излучения.

3.2.5. Сверхдлительная динамика формирования АО in vivo.

Адаптирующая доза 10 сГр.

Адаптирующая доза 20 сГр.

Адаптирующая доза 40 сГр.

Зависимость динамики АО от адаптирующей дозы.

3.2.6. Зависимость АО от возраста животных.

3.2.7. Индукция перекрестного АО.

3.3. Модификация АО соединениями, обладающими антиоксидантной активностью.

3.3.1. Модификация АО дигидрокверцетином.

3.3.2. Модификация АО каталазой.

3.3.3. АО как тест при скрининге пищевых антиоксидантов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности формирования радиационного адаптивного ответа в клетках костного мозга мышей in vivo"

В настоящее время проблема биологического действия малых доз ионизирующих излучений (ИИ) занимает доминирующее место в современной радиационной биологии. Интерес к данной проблеме возник с появлением первых свидетельств того, что сложившиеся научные представления о механизмах и закономерностях действия малых доз ИИ на биологические объекты весьма ограничены и противоречивы. Авария на Чернобыльской АЭС и ее последствия поставили новые вопросы, разрешить которые было невозможно исходя из существующих подходов и знаний о действии ИИ на биоту, полученных, в основном, при изучении больших доз. Все это послужило мощным толчком для интенсификации исследований биологического действия ИИ в диапазоне малых доз.

Эта проблема, кроме фундаментального, теоретического, имеет важное практическое значение, поскольку актуальна не только для узких когорт людей, работающих на ядерных объектах или проживающих вблизи их, но и для всего населения Земли. Радиационное загрязнение окружающей среды вследствие аварий на ядерных объектах приобрело настолько огромные масштабы и охватило такие значительные территории поверхности Земного шара, что является одним из важнейших экологически значимых факторов. Естественный радиационный фон все более увеличивается из-за возрастания его техногенной составляющей. Еще в 1988 г. вклад техногенных источников в среднюю годовую эффективную эквивалентную дозу составлял около 20%.

Несмотря на то, что радиационная биология обладает весьма обширными знаниями о механизмах и закономерностях действия на биоту достаточно высоких доз ИИ, она оказалась не в состоянии однозначно объяснить многие эффекты малых доз, которые принято называть особенностями биологического действия малых доз ИИ. К их числу следует отнести прежде всего повышенную радиочувствительность клеток к действию малых доз радиации и явление адаптивного ответа (АО).

Повышенная радиочувствительность биологических объектов заключается в том, что уровень повреждений, индуцируемый малыми дозами, превышает уровень, получаемый путем экстраполяции экспериментальных дозовых кривых, построенных при действии больших доз ИИ. В последнее время появляется все больше экспериментальных данных о подобной нелинейности кривой «доза-эффект» в области малых доз, что противоречит официальной линейной беспороговой концепции, принятой ранее МКРЗ и НКДАР ООН (Публикация МКРЗ № 26, 1978). Следует, однако, признать, что имеющихся экспериментальных данных недостаточно для пересмотра сложившихся и установленных норм радиационной безопасности, что подчеркивает необходимость проведения дальнейших исследований в этой области.

Что касается другой вышеупомянутой особенности биологического действия малых доз ИИ - АО, суть которого заключается в том, что воздействие ИИ в малой дозе увеличивает радиорезистентность биологического объекта к последующему облучению в высокой дозе, - то проведено большое количество исследований и установлен его общебиологический характер. Так, АО наблюдался у клеток бактерий (Smith, 1976), растений (Cortes et al., 1991), млекопитающих (Ikushima, 1989) и у целых организмов (Фоменко и др., 1991; Zhang, 1995). Однако механизмы, ответственные за индукцию АО, остаются невыясненными. Кроме того, подавляющее большинство исследований данного феномена проводилось в условиях in vitro. Данные относительно АО in vivo ограничены и зачастую противоречивы. Учитывая еще и то, что в последнее время активно стали обсуждаться вопросы практического применения и учета этого феномена при оценках радиационного риска, радиотерапии опухолей и в других сферах человеческой деятельности, становится ясной и обоснованной необходимость всестороннего исследования закономерностей формирования АО именно на системе in vivo.

Задачи исследования

1. Исследовать форму дозовой зависимости выхода цитогенетического повреждения на системе in vivo в области действия малых доз ИИ.

Научная новизна полученных результатов

На системе in vivo получено экспериментальное подтверждение продемонстрированной ранее in vitro нелинейности дозовой кривой в области действия малых доз ИИ, что позволяет более обоснованно говорить об универсальности данного феномена.

Показана возможность индукции радиационного АО на системе in vivo, что подтверждает общебиологический характер данного явления. Впервые продемонстрирована возможность сверхдлительного сохранения АО на протяжении большей части жизни животных, что меняет наши представления о данном явлении и открывает новые перспективы для его практического применения. Впервые показана независимость способности организма к индукции АО от возраста животного.

Впервые обнаружена возможность индукции АО за счет введения животным in vivo малых концентраций перекиси водорода. Также при исследовании возможности модификации АО впервые показано различное действие веществ, обладающих антиоксидантной активностью, на индукцию радиационного АО in vivo: каталаза предотвращала развитие АО, что подчеркивает существенную роль кислородных радикалов в индукции АО, а дигидрокверцетин, флавоноид растительного происхождения, не модифицировал АО, что позволяет говорить о специфичности действия данного соединения. 7

Научно-практическое значение работы

Полученная кривая «доза-эффект» меняет представление об оценке радиационного риска и позволяет более обоснованно подойти к проблеме существующих норм радиационной безопасности, основанных на беспороговой концепции МКРЗ и НКДАР ООН (Публикация МКРЗ № 26, 1978).

Выявленные на системе ш vivo новые характеристики радиационного АО могут найти практическое применение данного явления в клинической практике, например, при радиационной терапии опухолей. Обнаружение сверхдлительного сохранения адаптированного состояния организма на протяжении большей части жизни животных открывает новое направление в биологии - исследование обнаруженного эффекта (стабилизации генома?) и возможности в дальнейшем его использования в медицине.

Результаты исследования модифицирующего действия различных соединений, обладающих антиоксидантной активностью, и индукции перекрестного АО малыми концентрациями перекиси водорода позволяют сузить поиск начальных молекулярных событий при индукции АО, что является одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии стресса. Кроме того, возможным практическим применением АО является его использование при скрининге пищевых биологически активных добавок, поскольку, учитывая, что способность к индукции АО отражает адаптационный потенциал организмов и клеток, тест по типу АО позволяет выявлять скрытые изменения в системах поддержания стабильности генома, не выявляемые традиционными методами.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Клоков, Дмитрий Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Показано, что дозовая зависимость выхода цитогенетических повреждений при у-облучении in vivo имеет сложный ступенчатый характер с первоначальным линейным участком повышенной радиочувствительности и следующим за ним участком плато или индуцированной радиоустойчивости.

2. Установлено, что формирование радиационного АО in vivo характеризуется зависимостью от величины и мощности адаптирующей дозы; при этом большие дозы хронического облучения индуцируют более выраженный АО.

3. Показано, что плотноионизирующие излучения, такие как вторичное излучение от протонов с энергией 70 ГэВ и пи-мезоны, не индуцируют АО, что указывает на участие процессов репарации ДНК в формировании АО.

4. Впервые показана возможность формирования АО при сверхдлительных сроках между адаптирующим и выявляющим облучениями - до 12 мес, что говорит об устойчивости адаптационных изменений в течение жизни животных.

6. Впервые показана возможность индукции перекрестного АО низкими концентрациями Н2О2 при последующем /-выявлении; это подтверждает предположение о возможном участии окислительных процессов в индукции АО in vivo.

7. Обнаружено различное действие веществ, обладающих антиоксидантной активностью, на индукцию радиационного АО in vivo: каталаза предотвращала развитие АО, что подчеркивает существенную роль кислородных радикалов в индукции АО, а дигидрокверцетин, флавоноид растительного происхождения, не модифицировал АО, что позволяет говорить о специфичности действия данного соединения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование дозовой зависимости формирования цитогенетических повреждений в клетках костного мозга мышей при действии малых доз /-излучения in vivo выявило нелинейный характер кривой «доза-эффект». Полученная зависимость характеризуется тремя участками - начальным участком с повышенной радиочувствительностью в диапазоне 0-20 сГр, следующего за ним участка плато (20-35 сГр) и последнего линейного участка с отличным от первого углом наклона. Обнаруженная нами дозовая зависимость соответствует складывающимся представлениям о наличие в клеточных ответах на действие ИИ участков гиперчувствительности и индуцированной радиоустойчивости и подтверждает универсальность такой биологической реакции на действие малых доз.

Показано, что ИИ в малых дозах индуцирует цитогенетический АО в клетках костного мозга мышей in vivo, причем адаптация была возможна как при остром (10, 20 и 40 сГр), так и при хроническом /-облучении (10 и 50 сГр). Степень адаптации в результате хронического облучения была выше при дозе 50 сГр, по сравнению с дозой 10 сГр, что соответствует имеющимся в литературе данным о зависимости АО от мощности адаптирующего облучения in vitro.

Двукратное облучение в дозе 10 сГр не приводит к увеличению степени АО по сравнению с однократным облучением при всех исследованных промежутках времени между двумя дозами 10 сГр (1 сут, 1 и 3,5 мес). Это свидетельствует об исчерпании адаптационного потенциала организма уже после первой острой адаптирующей дозы.

Изучение индукции АО излучениями с разными коэффициентами ЛПЭ показало, что плотноионизирующие излучения (с высоким ЛПЭ), вторичное излучение от протонов с энергией 70 ГэВ и пи-мезоны, не индуцируют АО, что косвенно свидетельствует об участии процессов репарации ДНК в исследуемом явлении.

Показано, что способность к индукции АО не зависит от возраста на момент адаптации. Адаптирующее облучение животных всех исследованных возрастных групп от 2 до 16 мес индуцировало АО при выявляющем облучении как через 1 сут, так и через 1 мес.

Впервые обнаружена возможность сверхдлительного сохранения АО in vivo, индуцированного дозами 10 и 20 сГр. АО наблюдался при всех исследованных промежутках времени между адаптирующим и выявляющим облучениями - от 1 сут

81 до 12 мес. Причем обнаружена зависимость динамики АО от величины адаптирующей дозы. Так, в отличие от доз 10 и 20 сГр, доза 40 сГр индуцировала АО, который регистрировался через 1 и 14 суток после адаптации и затем исчезал.

Впервые показана индукция перекрестного АО in vivo за счет обработки животных низкими концентрациями Н2О2. Внутривенное введение Н2О2 (ОД мл) в концентрациях 1,47 и 14,7 мМ индуцировало АО при последующем выявляющем облучении в дозе 1,5 Гр, что предполагает существенную роль свободных радикалов в запуске механизмов АО. Совместное применение Н2О2 и малых доз /-излучения взаимно не увеличивало степень АО, наблюдаемых при применении этих агентов в отдельности. Это позволяет говорить об общности механизмов АО при адаптации Н2О2 и /-адаптации. Однако, АО при введении Н2О2 наблюдался уже через 1 час после воздействия, что нехарактерно для /-адаптации. Следовательно, в путях индукции АО при действии Н2О2 наличествует некая «быстрая» составляющая, о существовании которой при других типах адаптации неизвестно.

Исследование модифицирующего действия веществ, обладающих антиоксидантной активностью, на формирование АО показало, что каталаза (введение в/в и в/б) предотвращает развитие АО при /-адаптации. Эти результаты подчеркивают роль свободных радикалов в индукции АО. С другой стороны, введение ДГКВ (полифенольное соединение растительного происхождения) не устраняло АО, что указывает на специфику действия данного препарата. В этой связи интересным видится приложение теста на АО как способа проверки адаптационного потенциала организма, могущего служить показателем дестабилизации генома, невыявляемой традиционными методами скрининга.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Клоков, Дмитрий Юрьевич, Пущино

1. Гераськин С.А. (1995) Критический анализ современных концепций и подходов к оценке биологического действия малых доз ионизирующего излучения. Радиац. биол. Радиоэкол. 35(5):563-571.

2. Гераськин С.А., Дикарев В.Г., Дикарева Н.С., Удалова А.А. (1996) Влияниераздельного действия ионизирующего излучения и солей тяжелых металлов на частоту хромосомных аберраций в листовой меристеме ярового ячменя. Генетика. 32(2):272-278.

3. Даренская П.Г., Кознова Л.Б., Акоев И.Г., Невская Г.Ф. (1968) Относительная биологическая активность излучений. Фактор времени облучения. М.: Атомиздат, 1968. - 376 с.

4. Жестяников В.Д., Савельева Г.Е. (1992) Выживаемость и репарация однонитевых разрывов в ДНК в /-облученных клетках Escherichia coli при адаптации к метилметансульфонату. Цитология. 34:76-83.

5. Жестяников В.Д., Савельева Г.Е. (1994) Репарация УФ-индуцированных пострепликативных пробелов ДНК в клетках Escherichia coli, адаптированных к метилметансульфонату и этилметансульфонату. Цитология. 36:194-199.

6. Журавская А.Н., Кершенгольц Б.М., Курилюк Т.Т., Щербакова Т.М. (1995)

7. Энзимологические механизмы адаптации растений к условиям повышенного радиационного фона. Радиац. биол. Радиоэкол. 35(3):349-355.

8. Заичкина С.И., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А.Х. и др. (1992) Особенностиреализации цитогенетического повреждения при воздействии малыми дозами облучения на клетки млекопитающих и растений. Радиобиология. 32(1):38-41.

9. Засухина Г.Д., Львова Г.И., Васильева И.М. и др. (1993) Адаптивная репарация, индуцированная малыми дозами /-радиации, в репарационно-дефектных клетках человека. Докл. РАН 329(5):658-660.

10. Зюзиков Н.А, Корогодин В.И., КорогодинаВ.Л. (1999) Особенности действия малых доз /-излучения на дрожжевые клетки. Радиац. биол. Радиоэкол. 39(6):619-622.

11. Клоков Д.Ю., Заичкина С.И., Аптикаева Г.Ф., Ахмадиева А.Х., Розанова О.М. (1997) Индукция цитогенетического повреждения в клетках костного мозга крыспри комбинированном воздействии хронического и острого /-облучения. Генетика. 33(6):855-857.

12. Кондакова Н.В., Сахарова В.В., Рипа Н.В., Колхир В.К., Ребров Л.Б., Тюкавкина H.A. (19986) Радиопротекторная активность дигидрокверцетина в экспериментах in vivo и in vitro. В сб. «Медицинские биотехнологии» Москва. 1998. № 10. С. 66-70.

13. Копылов В.А., Кузин A.M., Ревин А.Ф., Баранова И.А. (1996) Влияние малых доз синтетического аналога хиноидного радиотоксина на жизнеспособность нормальных и /-облученных животных. Радиац. биол. Радиоэкол. 36(3):349-354.

14. Корогодина В.Л., Пантелеева А., Ганичева И., Кузнецова Е., Лазарева Г.,

15. Мельникова Л.А., Корогодин В.И. (1997) Влияние мощности дозы слабого у-облучения на митоз и адаптивный ответ клеток. В кн.: Тез. докл. III Радиобиол. съезда, Москва, октябрь 1997. Пущино. Т.1. С.155.1. Л|

16. Котеров А.Н. (1997) Ингибирование металлотионеином Fe -индуцированного перекисного окисления липидов в липопротеинах яичного желтка. Биохимия. 62(2) : 164-166.

17. Котеров А.Н., Сазыкин А.Ю. (1994) Содержание металлотионеинов в костном мозге и печени мышей и в лимфоцитах человека после общего /-облучения. Радиобиология. 34(2):190-195.

18. Кропачова К., Мишурова Е. (1994) Влияние хронического предварительногооблучения на скрытые повреждения, индуцированные однократным острым /-облучением крыс. Радиобиология. 34(2):251-256.

19. Кузин A.M. (1995) Идеи радиационного гормезиса в атомном веке. М.:Наука, 1995, 158 с.

20. Лотарева О.В. (1990) Комбинированное действие N-Memji-N'-HHTpo-Nнитрозогуанидина и УФ-света на bacillus subtilis. Известия Акад Наук СССР (Биол) 928-931

21. Лучник Н.В. (1957) Об аномальной реакции при малых дозах. Биофизика. 2(1):86-93.

22. Мишурова Е., Кропачова К., Рекса Р. (1992) Влияние хронического /-облучения при экспоненциально снижающейся мощности дозы на содержание нуклеиновых кислот в кроветворных органах и крови крыс. Радиобиология. 32(2):304-311.

23. Пелевина И.И., Николаев В.А., Готлиб В.И., Афанасьев Г.Г., Козлова JI.E.,

24. Серебряный A.M., Терещенко Д.Г., Тронов В.А., Храмцова Е.А. (1994) Адаптивная реакция лимфоцитов крови людей, подвергшихся хроническому воздействию радиации в малых дозах. Радиац. биол. Радиоэкол. 34:805-817.

25. Пелевина И.И., Готлиб В.И., Кудряшова О.В., Серебряный A.M.,Афанасьев Г.Г.,1996) Нестабильность генома после воздействия радиации в малых дозах (в 10-километроой зоне аварии на ЧАЭС и в лабораторных условиях). Радиац. биол. Радиоэкол. 36:546-560.

26. Пелевина И.И., Готлиб В.И., Кудряшова О.В., Антошина М.М., Серебряный A.M. (1998) Свойства потомков облученных клеток. Цитология. 40:467-477.

27. Померанцева М.Д., Рамайа Л.К. (1962) Действие ионизирующих излучений на организм. М.1962. Изд-во АН СССР. С.91-106.

28. Ротт Г.М., Сморызанова O.A., Романцова В.А. (1995) Способность низкодозового и низкоинтенсивного ионизирующего излучения вызывать индукцию металлотионеинов. Радиац. биол. Радиоэкол. 35(4):507-511.

29. Севанькаев A.B. (1991) Текущее состояние проблемы количественной оценкицитогенетических эффектов малых доз радиации. Радиобиология. 31(4):600-605.

30. Семенец Т.М., Семина О.В., Саенко A.C. (1993) Феномен адаптивнойрезистентности к ^-облучению колониеобразующих единиц (КОЕс): условия проявления в экзотесте. Радиац. биол. Радиоэкол. 33(4):525-528.

31. Серебряный A.M., Зоз H.H. (1997) Адаптивный ответ при радиационном мутагенезе у растений и его особенности. В кн.: Тез. докл. III Радиобиол. съезда, Москва, октябрь 1997. Пущино. Т.1. С. 164.

32. Спитковский Д.М. (1992) Концепция действия малых доз ионизирующих излучений на клетки и ее возможные приложения к трактовке медико-биологических последствий. Радиобиология. 32(3):382-400.

33. Филиппович И.В., Никольский А.В., Котеров А.Н., и др. (1993) Адаптивный ответ лимфоцитов крыс при радиационном воздействии. В кн.: Тез. докл. II Радиобиол. съезда, Киев, сентябрь 1993. Пущино. С. 1047.

34. Фоменко JI.A., Кожановская Я.К., Газиев А.И. (1991) Исследование образованиямикроядер в клетках костного мозга хронически облученных мышей при их последующем остром /-облучении. Радиобиология. 31(5):709-715.

35. Шмакова H.JL, Фадеева Т.А., Красавин Е.А. (1998) Действие малых доз облучения на клетки китайского хомячка. Радиац. биол. Радиоэкол. 38(6):841-847.

36. Эйдус JI.X. (1996) Единый механизм инициации эффектов малых дозионизирующего излучения. Радиац. биол. Радиоэкол. 36(6):874-882.

37. Aghamohammadi S.Z., Savage J.R.K. (1991) A BrdU pulse double-labelling method for studying adaptive response. Mutat. Res. 251:133-141.

38. Au W.W., Heo M.Y., Chiewchanwit T. (1994) Toxicological interactions between nickel and radiation on chromosome damage and repair. Environ. Health Perspect. 102 Suppl:9:73-77

39. Azzam E.I., Raaphorst G.P., Mitchell R.E. (1994) Radiation-induced adaptive response for protection against micronucleus formation and neoplastic transformation in C3H 10T1/2 mouse embryo cells. Radiat. Res. 138(Suppl 1):S28-S31.

40. Bai Y., Chen D. (1993) Accumulative effect of two low doses of irradiation in inducing an adaptive response in human lymphocytes. Mutat. Res. 302(4): 191 -196.

41. Barquinero J.F., Barrios L., Caballin M.R., Miro R., Ribas M., Subias A., Egozcue J.1995) Occupational exposure to radiation induces an adaptive response in human lymphocytes. Int. J. Radiat. Biol. 67:187-191.

42. Bauchinger M., Schmid E., Braselmann H., Nahrstedt U. (1989) Absence of adaptive response to low-level irradiation from tritiated thymidine and X-rays in lymphocytes of two individuals examined in serial experiments. Mutat. Res. 227:103-107.

43. Beam C.A., Mortimer R.K., Wolfe R.G., Tobias C.A. (1954) The relation ofradioresistance to budding in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys. 49:110-122.

44. BELLE newsletter (1999) Adaptive response induced by low levels of radiation. Vol.7, No.3.

45. Belyaev I.Y., Spivak I.M., Kolman A. and Harms-Ringdahl M. (1996) Relationshipbetween radiation induced adaptive response in human fibroblasts and changes in chromatin conformation. Mutat. Res. 358:223-230.

46. Belyaev I.Y., Harms-Ringdahl M. (1996) Effects of gamma rays in the 0.5-50-cGy range on the conformation of chromatin in mammalian cells. Radiat. Res. 145(6):687-693.

47. BhattacharjeeD. (1998) Role of radioadaptation on radiation-induced thymic lymphoma in mice. Mutat. Res. 358:231-235.

48. Boothman D.A., Bouvard I., Hughes E.N. (1989) Identification and characterization of X-ray-induced proteins in human cells. Cancer Res. 49:2871-2878.

49. Boreham D.R., Mitchell R.E.J. (1991) DNA lesions that signal the induction of radioresistance and DNA repair in yeast. Radiat. Res. 128:19-28.

50. Borodin P.M., Inouye M., Oda S., Ikushima T., Takagishi Y., Yamamura H. (1994)

51. Radioadaptive response in primary mouse spermatocytes revealed by analysis of synaptonemal complexes Mutat. Res. 310(1): 151-156.

52. Bravard A., Rigaud O., Beaumatin J., Luccioni C. (1997) Modification of antioxidant and nucleotide metabolism in radioadapted cells, in: Proceedings of the 27th Annual Meeting of the ESRB. Radioprotection.32:C 1-420.

53. Brenner S.L. (1980) Laser microirradiation of kinetochores in mitotic PtK2 cells:chromatid separation and micronucleus formation. Cell.Biophysics. 2(2): 139-152.

54. Cai L. and Liu S.Z. (1990) Induction of cytogenetic adaptive response of somatic and germ cells in vivo and in vitro by low-dose X-irradiation. Int. J. Radiat. Biol. 58:187194.

55. Cai L., Wang P., Piao X.G. (1994) Cytogenetic adaptive response with multiple small X-ray doses in mouse germ cells and its biological influence on the offspring of adapted males. Mutat. Res. 324(1-2):13-17.

56. Cai L., Cherian M.G. (1996) Adaptive response to ionizing radiation-induced chromosome aberrations in rabbit lymphocytes: effect of pre-exposure to zinc, and copper salts. Mutat. Res. 369:233-241.

57. Calkins J. (1967) An unusual form of response in X-irradiated protozoa and a hypothesis as to its origin. Int. J. Radiat. Biol. 12:297-301.

58. Cole R.J., Taylor N., Cole J., Arlett C.F. (1981) Short-term tests for transplacental^ active carcinogens. I. Micronucleus formation in fetal and maternal mouse erythroblasts. Mutat. Res. 80:141-157.

59. Cortes F., Dominguez J., Mateos J.S., Pinero J., Mateos J.C. (1990) Evidence for anadaptive response to radiation damage in plant cells conditioned with X-rays or incorporated tritium. Int. J. Radiat. Biol. 57:537-542.

60. Cortes F., Dominguez I., Pinero J., Mateos J.C. (1990) Adaptive response in humanlymphocytes conditioned with hydrogen peroxide before irradiation with X-rays. Mutagenesis. 5:555-557.

61. Cortes F., Dominguez J., Flores M.J. (1994) Differences in the adaptive response toradiation damage in GO human lymphocytes conditioned with hydrogen peroxide or low-dose X-rays. Mutat. Res. 30:157-163.

62. Duell T., Lengfelder E., Fink R. et al. (1995) Effect of activated oxygen species in human lymphocytes. Mutat. Res. 319:3030-308.

63. Eady J.J., Peacock J.H., McMillan T.J. (1992) Host cell reactivation of gamma-irradiate adenovirus 5 in human cell lines of varying radiosensitivity. Br. J. Cancer. 66:113-118.

64. Ehrenberg L., Eriksson G. (1966) The dose dependence of mutation rates in the rad range, in the light of experiments with higher plants. Acta Radiologica, Suppl., 254:7381.

65. Eichholtz-Wirth H., Hietel B. (1994) Cisplatin resistance in mouse fibrosarcoma cells after low-dose irradiation in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 70:579-584.

66. Eidus L.Kh. (2000) Hypothesis regarding a membrane-associated mechanism of biological action due to low-dose ionizing radiation. Radiat. Environ. Biophys. 2000 (in press).

67. Eriksson G. (1963) Induction of waxy mutants in maize by acute and chronic gamma irradiation. Hereditas. 50:161-178.

68. Farooqi Z., Kesavan P.C. (1993) Low-dose radiation-induced adaptive response in bone marrow cells of mice. Mutat. Res. 302(2):83-89.

69. Feinendegen L.E. (1991) Radiation risk of tissue late effects, a net of consequence of probabilities of various cellular responses. Nuclear Medicine. 18:745-749.

70. Fenech M., Morley A.A. (1985) Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutat. Res. 147:29-36.

71. Filippovich I.V., SorokinaN.I., RobillardN., Lisbona A., Chatal J.F. (1998) Radiation-induced apoptosis in human tumor cell lines: adaptive response and split-dose effect. Int. J. Cancer. 77(1):76-81.

72. Fillips B.J., James T.E.B., Anderson D. (1984) Genetic damage in CHO cells exposed to enzymically generated active oxygen species. Mutat. Res. 126:265-271.

73. Flores M.J., Pinero J., Ortiz T., Pastor N., Mateos J.C., Cortes F. (1996) Both bovine and rabbit lymphocytes conditioned with hydrogen peroxide show an adaptive response to radiation damage. Mutat. Res. 372:9-15.

74. Fritz G., Tano K., Mitra S., Kaini B. (1991) Inducibility of the DNA repair gene encoding 06-methylguanine-DNA methyltransferase in mammalian cells by DNA-damaging treatments. Mol. Cell. Biol. 11:4660-4668.

75. Gadhia P.K. (1998) Possible age-dependent adaptive response to a low dose of X-rays in human lymphocytes. Mutagenesis 13:151-152.

76. Geara F.B., Peters L.J., Ang K.K., Wike L.J., Brock W.A. (1992) Radiosensitivitymeasurement of keratinocytes and fibroblasts from radiotherapy patients. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. 24:287-293.

77. Glass H.B., Ritterhoff R.I. (1961) Mutagenic effect of a 5-R dose of X-rays in Drosophila melanogaster. Science. 133:1366.

78. Goodhead D.T. (1989) The initial physical damage produced by ionizing radiation. Int. J. Radiat. Biol. 56:623-634.

79. Gourabi, H. Mozdarani H. (1998) A cytokinesis-blocked micronucleus study of theradioadaptive response of lymphocytes of individuals occupationally exposed to chronic doses of radiation. Mutagenesis 13:475-480.

80. Guntenberg H.-W., Wuttke K., Streffer C., Muller W.-U. (1991) Micronulei in human lymphocytes irradiated in vitro and in vivo. Radiat. Res. 128:276-281.

81. Gupta R., Uma Devi P. (1985) Protection against radiation -induced chromosome injury by SH-compounds. Acta Radiologica Oncologie. 24:419-426.

82. Hakova H., Misurova E. (1993) The effect of Silymarin and gamma radiation on nucleic acids in rat organs. J. Pharm. Pharmacol. 45(10):910-912.

83. Harish S.K., Guruprasad K.P., Mahmood R., Vasudev V., Manjunath K.R., Chethan G.K. (1998) Adaptive response to low dose of EMS or MMS in human peripheral blood lymphocytes. Indian J. Exp. Biol. 36:1147-1150.

84. Heddle J.A. (1973) A rapid in vivo test for chromosomal damage. Mutat. Res. 18(2): 187190.

85. Heddle J.A., Carano A.Y. (1977) The DNA content of micronuclei induced in mouse bone marrow by gamma-irradiation: evidence that micronuclei arise from acentric chromosomal fragments. Mutat. Res. 44(l):63-69.

86. Heddle J.A., Hite M., Kirkhart B., Mavourinin K., MacGregor J.T., Newell J.W.,

87. Salamone M.F. (1983) The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Agency Gene-Tox Program. Mutat. Res. 123:61-118.

88. Heindorff K., Michaelis A., Aurich 0. (1985) Peroxide pretreatment of Vicia faba root-tip meristems results in "clastogenic adaptation" to maleic hydrazide but not to TEA. Mutat. Res. 142(l/2):23-27

89. Jacobson-Kram D., Williams J.R. (1988) Failure to observe adaptive response to ionizing radiation in mouse bone marrow cells in vivo. Environ. Mol. Mutagen. II (Suppl.II). Abstracts of the 19th Ann. Meeting of EMS. 49-50.

90. Jagetia G.C. (1990) Frequency of micronucleated cells in the mouse bone marrow after exposure to various doses of gamma-radiation. Mutat. Res. 230:45-48.

91. Jagetia G.C., Ganapathi N.G. (1994) Radiation-induce micronucleus formation in mouse bone marrow after low dose exposures. Mutat. Res. 304:235-242.

92. Jeggo P. (1979) Isolation and characterization of Escherichia coli K-12 mutants unable to induce the adaptive response to simple adylating agents. J. Bacteriol. 139:783791.

93. Jenssen D., Ramel C. (1976) Dose response at low doses of X-irradiation and MMS on the induction of micronuclei in mouse erythroblasts. Mutat. Res. 41:311-320.

94. Jenssen D., Ramel C. (1978) Factors affecting the induction of micronuclei at low doses of X-rays, MMS and dimethylnitrosamine in mouse erythroblasts. Mutat. Res. 58:51-65.

95. Joiner M.C., Marples B., Johns H. (1993) The response of tissues to very low doses per fraction: a reflection of induced repair? In: J. Denecamp and J.F. Fowler (Eds.) Acute and Long-term Side Effects of Radiotherapy, Wiley, London, pp.27-40.

96. Joiner M.C., Lambin P., Malaise E.P., Robson T., Arrand J.E., Skov K.A., Marples B.1996) Hypersensitivity to very-low single radiation doses: Its relationship to the adaptive response and induce radioresistance. Mutat. Res. 358:171-183.

97. Kaina B. (1983a) Cross-resistance studies with V79 Chinese hamster cells adapted to the mutagenic or clastogenic effect of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine. Mutat. Res. 111:341-352.

98. Kaina B. (1983b) Studies on adaptation of V79 Chinese hamster cells to low doses of methylating agents. Carcinogenesis. 4:1437-1443

99. Karu T., Pyatibrat L., Kalendo G. (1994) Irradiation with He-Ne laser can influence thecytotoxic response of HeLa cells to ionizing radiation. Int. J. Radiat. Biol. 65:691697.

100. Keller A.M. (1976) In: J. Booz, H.G. Ebert, B.G.R. Smith (Eds.) 5th Symposium on Microdosimetry, EUR 5452. Luxembourg: Commission of the European Communities, pp. 409-442.

101. Kelsey K.T., Memisoglu A., Frenkel D., Liber H.L. (1991) Human lymphocytes exposed to low doses of X-rays are less susceptible to radiation-induced mutagenesis. Mutat. Res. 263:97-201.

102. Khandogina E.K., Mutovin G.R., Zvereva S.V., Antipov A.V., Zverev D.O. and Akifyev A.P. (1991) Adaptive response in irradiated human lymphocytes: radiobiological and genetical aspects. Mutat. Res. 251:181-186.

103. Kleczkowska H.E., Althaus F.R. (1996) The role of poly(ADP-ribosyl)ation in the adaptive response. Mutat. Res. 358(2):215-221.

104. Koval T.M. (1984) Multiphase survival response of a radioresistant lepidopteran insect cell line. Radiat. Res. 98. 642-648.

105. Korystov Yu.N., Eliseeva N.A., Kublik L.N., Narimanov A.A. (1996) The effect of low-dose irradiation on proliferation of mammalian cells in vitro. Radiat. Res. 146(3):329-332.

106. Kurihara Y., Rienkjkarn M., Etoh H. (1992) Cytogenetic adaptive response of cultured fish cells to low doses of X-rays. J. Radiat. Res. 33:267-274.

107. P., Marples B., Fertil B., Malaise E.P., Joiner M.C. (1993a) Hypersensitivity of a human tumor cell line to very low dose radiation. Int. J. Radiat. Biol. 63:639-650.

108. P., Fertil B., Malaise E.P., Joiner M.C. (1994b) Multiphasic survival curves for cells of human tumor cell lines: induced repair or hypersensitive cell population? Radiat. Res. 138:S32-S36.

109. P., Malaise E.P., Joiner M.C. (1994c) The effect of very low radiation doses on the human bladder carcinoma cell line RT112. Radiother. Oncol. 32:63-72.

110. Malyapa R.S., Wright W.D., Roti Roti J.L. (1994) Radiation sensitivity correlates with changes in DNA supercoiling and nucleoid protein content in cells of three Chinese hamster cell lines. Radiat. Res. 140(3):312-20.

111. Mandel R., Ryser H.J.-P. (1987) Mechanisms of synergism in the mutagenicity ofcadmium and N-methyl-N-nitrosourea in Salmonella tiphimurium: the effect of pH. Mutat. Res. 176(1):1-10.

112. Marples B., Joiner M.C. (1993) The response of Chinese hamster V79 cells to lowradiation doses: evidence of enhanced sensitivity of the whole cell population. Radiat. Res. 133:41-51.

113. Marples B., Lam G.K.Y., Zhou H., Skov K.A. (1994) The response of Chinese hamster V79-379A cells exposed to negative pi-mesons: evidence that increased radioresistance is dependent on linear energy transfer. Radiat. Res. 138:S81-S84.

114. Melkonyan HS, Ushakova TE, Umansky SR. (1995) Hsp70 gene expression in mouse lung cells upon chronic gamma-irradiation. Int. J. Radiat. Biol. 68(3):277-80.

115. Michaelis A., Takehisa S., Rieger R., Aurich O. (1986) Ammonium chloride and zinc sulfate pretreatment reduce the yield of chromatid aberrations induced by TEM and maleic hydrazide in Vicia faba. Mutat. Res. 173(3): 187-191.

116. Morse M.L., Smith D.S. (1987) N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine-induced resistance to ionizing radiation. Mol. Gen. Genet. 206:220-225.

117. Mozdarani H., Saberi A.H. (1994) Induction of cytogenetic adaptive response of mouse bone marrow cells to radiation by therapeutic doses of bleomycin sulfate and actinomycin D as assayed by the micronucleus test. Cancer Lett. 78:141-150.

118. Muller W.-U., Streffer C., Niederichholz F. (1992) Adaptive response of mouse embryos? Int. J. Radiat. Biol. 62(2):169-175

119. Nemthova G., Kalina I., Racekova N. (1995) The adaptive response of peripheral blood lymphocytes to low doses of mutagenic agents in patients with ataxia telangiectasia. Mutat. Res. 348(3):101-104.

120. Nomura T., Yamaoka K. (1999) Low-dose gamma-ray irradiation reduces oxidativedamage induced by CC14 in mouse liver. Free Radic Biol Med. 27(11-12): 132433.

121. Nunoshiba T., Hashimoto M., Nishioka H. (1991) Cross-adaptive response in Escherichia coli caused by pretreatment with H202 against formaldehyde and other aldehyde compounds. Mutat. Res. 255:265-271.

122. Oftedal P. (1964a) Radiosensitivity of Drosophila spermatogonia. II. Protracted doses. Hereditas. 51:13-30.

123. Oftedal P. (1964b). Radiosensitivity of Drosophila spermatogonia. III. Comparison ofacute and protracted irradiation efficiencies in relation to cell killing. Mutat. Res. 1:63-76.

124. Oliveira N.G., Rodrigues A.S., Chaveca T., Rueff, J. (1997) Induction of an adaptive response to quercetin, mitomycin C and hydrogen peroxide by low doses of quercetin in V79 Chinese hamster cells. Mutagenesis. 12:457-462.

125. Oliveira N.G., Neves M., Rodrigues A.S., Gil O.M., Chaveca T. and Rueff J. (2000) Assessment of the adaptive response induced by quercetin using the MNCB peripheral blood human lymphocytes assay. Mutagenesis 15(l):77-83.

126. Olivieri G., Bodycote J. and Wolff S. (1984) Adaptive response of human lymphocytes to low concentrations of radioactive thymidine. Science. 223:594-597.

127. Olivieri G. (1999) Adaptive response and its relationship to hormesis and low dose cancer risk estimation. Hum. Exp. Toxicol. 18:440-442.

128. Osmak M., Horvat D. (1992) Chromosomal analysis of Chinese hamster V79 cells exposed to multiple gamma-ray fractions: induction of adaptive response to mitomycin C. Mutat. Res.282(4):259-263.

129. Peak M.J., Wang L., Hill C.K., Peak J.G. (1991) Comparison of repair of DNA doublestrand breaks caused by neutron or gamma-radiation in cultured human cells. Int. J.Radiat. Biol. 60:891-898.

130. Pohl-Ruling J., Fischer P., Haas O., et al. (1983) Effect of low-dose acute X-irradiation on the frequencies of chromosomal aberrations in human peripheral lymphocytes in vitro. Mutat. Res. 110(l):71-82.

131. Powell S., McMillan T.J. (1990) DNA damage and repair following treatment with ionizing radiation. Radiother. Oncol. 19:95-108.

132. Quintiliani M. (1986) The oxygen effect in radiation inactivation of DNA and enzymes. Int. J. Radiat. Biol. 50(4):573-94.

133. Redpath J.L. and Antoniono R.J. (1998) Induction of an adaptive response againstspontaneous neoplastic transformation in vitro by low-dose gamma radiation. Radiat. Res. 149:517-520.

134. Rieger R., Michaelis A., Schubert I. (1985) Heat-shocks prior to treatment of Vicia faba root-tip meristems with maleic hydrazide or TEM reduce the yield of chromatid aberrations. Mutat. Res. 143:79-82.

135. Rigaud O., Papadopoulo D., Moustacchi E. (1993) Decreased deletion mutation in radioadapted human lymphoblasts. Radiat. Res. 133:94-101.

136. Rigaud O., Moustacchi F. (1996) Radioadaptation for gene mutation and the possible molecular mechanisms of the adaptive response. Mutat. Res. 358(2):127-134.

137. Russell W.L. (1963) Repair from genetic radiation damage. In: Sobels F.H. (Ed.) Pergamon Press, Oxford, pp.205-215.

138. Salone B., Grillo R., Aillaud M., Bosi A., Olivieri G. (1996) Effects of low-dose (2 cGy) X-ray on cell-cycle kinetics and on induced mitotic delay in human lymphocytes. Mutat. Res. 351(2): 193-197.

139. Samson L., Cairns J. (1977) A new pathway for DNA repair in Escherichia coli. Nature. 267:281-283.

140. Samson L., Schwartz J.L. (1980) Evidence for an adaptive DNA repair pathway in CHO and human skin fibroblast cell lines. Nature. 287:861-863.

141. Sankaranarayanan K., von Duyn A., Loos M.J. and Natarajan A.T. (1989) Adaptiveresponse of human lymphocytes to low-level radiation from radioisotopes or X-rays. Mutat. Res. 211:7-12.

142. Sasaki M.S. (1995) On the reaction kinetics of the radioadaptive response in cultured mouse cells. Int. J. Radiat. Biol. 68:281-291.

143. Schappi-Buchi C. (1994) On the genetic background of the adaptive response to X-rays in Drosophila melanogaster. Int. J. Radiat. Biol. 65:427-435.

144. Schmid W. (1975) The micronucleus test. Mutat. Res. 31 (1):9-15.

145. Schmid E., Bauchinger M., Nahrstedt. (1989) Adaptive response after X-irradiation in human lymphocytes? Mutagenesis. 4(2):87-89.

146. Sedgwick B., Lindahl T.A. (1982) A common mechanism for repair of 06-methylguanine in DNA. J. Mol. Biol. 154:169-175.

147. Shadley J.D. (1994) Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat. Res. 138:S9-S12.

148. Shadley J.D. (1995) Adaptive response in human cells, in: U.Hagen, D.Harder, H.Jung, C.Streffer (Eds.) Proceedings of the 10th International Congress of Radiation Research, 2:689-692.

149. Shadley J.D., Afzal V., Wolff S. (1987) Characterization of the adaptive response toionizing radiation induced by low doses of X-rays to human lymphocytes. Radiat. Res. 111:511-517.

150. Shadley J.D. and Dai G. (1992) Cytogenetic and survival adaptive responses in Gl phase human lymphocytes. Mutat. Res. 265:273-281.

151. Shiomi T., Inagaki E., Inagaki H., Nakao Y. (1963) Mutation rates at low dose level in Drosophila melanogaster. J. Radiat. Res. 4:105.

152. Shadley J.D., Wiencke J.K. (1989) Induction of the adaptive response by X-rays is dependent on radiation intensity. Int. J. Radiat. Biol. 56:107-118.

153. Sherman M.L., Datta R., Hallahan D.E., Weichselbaum R.R., Kufa D.W. (1990) Ionizing radiation regulates the expression of c-jun protooncogene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:5663-5666.

154. Shimizu T., Kato T.J., Tachibana A. and Sasaki M.S. (1999) Coordinated regulation of radioadaptive response by protein kinase C and p38 mitogen-activated protein kinase. Exp. Cell Res. 251:424-432.

155. Singh S.P., Lavin M.F. (1990) DNA-binding protein activated by gamma radiation in human cells. Mol. Cell. Biol. 10:5279-5285.

156. Smith K.C., Martignoni K.D. (1976) Protection of Escherichia coli against the lethal effects of ultraviolet and X-irradiation by prior X-irradiation: a genetic and physiology study. Photochem. Photobiol. 24:515-526.

157. Spencer W.P., Stern C. (1948) Experiments to test the validity of the linear Rdose/mutation frequency relation in Drosophila at low dosage. Genetics. 1948. 33:43.

158. Stecca C., Gerber G.B. (1998) Adaptive response to DNA-damaging agents. Biochem. Pharmacol. 55:941-951.

159. Svistunenko D.A., Ju G.Z., Wei J., Zhang J.S., Liu S.Z. (1992) EPR study of mouse tissues in search for adaptive response to low level whole-body X-irradiation. Int. J. Radiat. Biol. 62(2):327-336.

160. Teale B.S.S., Khanna K.K., Findik D., Lavin M.F. (1992) Purification and characterization of a DNA-binding protein activated by ionizing radiation. J. Biol. Chem. 267: 10295-10300.

161. Thomas B. (1986) Radioprotective effect of certain thiol compounds on the hemopoietic stem cells in Swiss albino mice. PhD thesis (Rajasthan University, Jaipur, India).

162. Tuschl H., Kavac R., Altmann H. (1983) UDS and SCE in lymphocytes of personsoccupationally exposed to low levels of ionizing radiation. Health. Phys. 45(1):1-7.

163. Uma Devi P., Sharma A.S.K.V.S. (1990) Mouse bone-marrow response to low doses of whole-boy gamma-irradiation: induction of micronuclei. Int. J. Radiat. Biol. 57(1):97-101.

164. Venkat S., Chaubey R.C. and Chauhan P.S. (1996) Radio-adaptive response in human lymphocytes in vitro. Indian J. Exp. Biol. 34:909-912.

165. Vijayalaxmi, Burkart, W. (1989a) Effect of 3-aminobenzamide on chromosome damage in human blood lymphocytes adapted to bleomycin. Mutagenesis. 4:187-189

166. Vijayalaxmi, Burkart W. (1989b) Resistance and cross-resistance to chromosome damage in human blood lymphocytes adapted to bleomycin. Mutat. Res. 211:1-5.

167. Vijayalaxmi, Leal B.Z., Deahl T.S. and Meltz M.L. (1995) Variability in adaptive response to low dose radiation in human blood lymphocytes: consistent results from chromosome aberrations and micronuclei. Mutat. Res. 348:45-50.

168. Walker G.C. (1984) Mutagenesis and inducible responses to deoxyribonucleic acid damage in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 48:60-93.

169. Wang Z.-Q., Saigusa S., Sasaki M.S. (1991) Adaptive response to chromosome damage in cultured human lymphocytesprimed with low doses of X-rays. Mutat. Res. 246:179-186.

170. Wiencke J.K., Afzal V., Oliviery G., WolffS. (1986) Evidence that the 3H.thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of chromosomal repair mechanisms. Mutagenesis. 1:375380.

171. Wiese A.G., Pacifici R.E., Davies K.J.A. (1995) Transient adaptation to oxidative stress in mammalian cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 318(1):231-240.

172. Wojewodzka M., Walicka M., Sochanowicz B., Szumiel I. (1994) Calcium antagonist,

173. TMB-8, prevents the induction of adaptive response by hydrogen peroxide or X-rays in human lymphocytes. Int. J. Radiat. Biol. 66(1):99-109.

174. Wojewodzka, M., Kruszewski M., Szumiel I. (1997) Effect of signal transductioninhibition in adapted lymphocytes: micronuclei frequency and DNA repair. Int. J. Radiat. Biol. 71:245-252.

175. Wojcik A., Tuschl H. (1990) Indication of an adaptive response in C57BL mice pre-exposed in vivo to low doses of ionizing radiation. Mutat. Res. 243(l):67-73.

176. Wojcik A., Sauer C., Zolzer F., Bauch T. and Muller W.U. (1996) Analysis of DNA damage recovery processes in the adaptive response to ionizing radiation in human lymphocytes. Mutagenesis 11:291-297.

177. Wolff S. (1992) Low-dose exposure and the induction of adaptation, in: T.Sugahara,

178. A.Sagan, and T.Aoyama (Eds.) Low Dose Irradiation and Biological Defense Mechanisms, Excerpta Medica, Amsterdam-London-New York-Tokyo, pp.21-28.

179. Wolff S., Afzal V., Jostes R.F., Wiencke J.K. (1993) Indications of repair of radon-induced chromosome damage in human lymphocytes: An adaptive response induced by low doses of X-rays. Environ. Health Perspect. 101(Suppl 3): 73-77.

180. Wolff S. (1995) Adaptation of human and other mammalian cells to low doses of radiation. Radiat. Res. 141:115-117.

181. Wolff S. (1996) Aspects of the adaptive response to very low doses of radiation and other agents. Mutat. Res. 358(2):135-42.

182. Wolff S. (1998) The adaptive response in radiobiology: evolving insights and implications. Environ. Health Perspect. 106(Suppl l):277-283.

183. Wouters B.G., Skarsgard L.D. (1994) The response of a human tumor cell line to low radiation doses: evidence of enhanced sensitivity. Radiat. Res. 138:S76-S80.

184. Wouters B.G., Skarsgard L.D. (1996) Low dose hypersensitivity and increasedradioresistance in a panel of human tumor cell lines with different radiosensitivity. Radiat. Res. 146:399-413.

185. Yamamoto K.I., Kikuchi Y. (1980) A comparison of diameters of micronuclei induced by clastogens and by spindle poisons. Mutat. Res. 71(1):127-131.

186. Yamaoka K., Edamatsu R., Mori A. (1991) Increased SOD activities and decreased lipid peroxide levels induced by low dose X irradiation in rat organs. Free Radial Biol. Med. ll(3):299-306.

187. Yamaoka K., Kojima S., Takahashi M., Nomura T., Iriyama K. (1998) Change of glutathione peroxidase synthesis along with that of superoxide dismutase synthesis in mice spleens after low-dose X-ray irradiation. Biochim. Biophys. Acta. 1381(2):265-70.

188. Yanase S., Hartman P.S., Ito A. and Ishii N. (1999) Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutat. Res. 426:31-39.

189. Yonezawa M., Takeda A., Mosonoh J. (1990) Acquired radioresistance after low dose X-irradiation in mice. J. Radiat. Res. 31:256-262.

190. Yonezawa M., Misonoh J., Hosokawa Y. (1996) Two types of X-ray-inducedradioresistance in mice: Presence of 4 dose ranges with distinct biological effects. Mutat. Res. 358:237-243.

191. Yoshida N., Imada H., Kunugita N., Norimura T. (1993) Low-dose radiation-inducedadaptive survival response in mouse spleen T-lymphocytes in vivo. J. Radiat. Res. 34(4):269-277.

192. Youngblom J.H., Wiencke J.K., Wolff S. (1989) Inhibition of the adaptive response of human lymphocytes to very low doses of ionizing radiation by the protein synthesis inhibitor cyclohexamide. Mutat. Res. 227(4):257-261.

193. Yu W., Wang M., Cai L., Jin Y. (1995) Pre-exposure of mice to low dose or low dose rate ionizing radiation reduces chromosome aberrations induced by subsequent exposure to high dose of radiation or mitomycin C. Chin. Med. Sci. J. 10:50-53.103

194. Zhang L. (1995) Cytogenetic adaptive response induced by pre-exposure in human lymphocytes and marrow cells of mice. Mutat. Res. 334:33-37.

195. Zhou P.K., Liu X.Y., Sun W.Z., Zhang Y.P., Wei K. (1993) Cultured mouse SR-1 cells exposed to low dose of gamma-rays become less susceptible to the induction of mutagenesis by radiation as well as bleomycin. Mutagenesis. 8:109-111.

Информация о работе

Клоков, Дмитрий Юрьевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2000
ВАК 03.00.01

Диссертация

Закономерности формирования радиационного адаптивного ответа в клетках костного мозга мышей in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы