Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимозаменяемость факторов роста при стимуляции размножения фибробластов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимозаменяемость факторов роста при стимуляции размножения фибробластов"



российская академия наук

институт молекулярной биологии V . имени в.а. энгельгардта

г

на правах рукописи

акимов Сергей Сергеевич

взаимозаменяемость факторов роста при стимуляции размножения фибробластов

03.00.03 - Молекулярная биология 03.00.25 - Клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Лаборатории функциональной морфологии хромосом (заведующий — д.б.н., проф. A.B. Зеленин) Института молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта Российской Академии наук.

Научные руководители: доктор биологических наукИ.А. Прудовский, кандидат биологических наук Е.Е. Егоров.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. В. Терских, кандидат биологических наук В,И. Попенко.

Ведущая организация — Институт канцерогенеза Всероссийского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН.

Защита состоится" ЪЪ" 1997 г. в" -/(У" часов на

заседании диссертационного совета ДД02.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан "/£/" /-ICJutj^X 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большинство способных к пролиферации клеток многоклеточных организмов может вступать в S-фазу в ответ на целый ряд факторов роста благодаря наличию на поверхности рецепторов для каждого из них. Хотя основной результат действия этих факторов, то есть репликация ДНК, одинаков, однако до сих пор не вполне ясно, эквивалентны ли промежуточные внутриклеточные события, вызываемые разными факторами роста. Недавние исследования показывают возможность отмыва от факторов роста клеток, находящихся в процессе перехода от состояния покоя к пролиферации (в так называемом пререпликативном периоде), с почти полным снятием стимуляции синтеза ДНК (Zhan et al., 1993). Это обстоятельство делает осуществимой замену факторов роста в пререпликативном периоде и выяснение того, способен ли один ростовой фактор передавать пролиферативную эстафету другому. Остаются малоисследованными и другие аспекты действия факторов роста на клетки. Практически все исследования влияния ростовых факторов на клетки проведены на покоящихся культурах, подвергавшихся стимуляции этими факторами и переходившими из состояния GO в клеточный цикл. В то же время, мало изучено влияние различных факторов роста на прохождение G1-периода постоянно циклирующими клетками. Не проведено систематических сравнительных исследований зависимости клеточной чувствительности к различным митогенам от такого важнейшего фактора микроокружения, как плотность культуры. Еще один важный параметр состояния клеток, влияние которого на их способность к митогенной стимуляции остается недостаточно изученным, — это их "пролиферативный возраст". _ Подавляющее большинство исследований чувствительности стареющих клеток к митогенам проведено на диплоидных фибробластах человека. Эти клетки характеризуются большой гетерогенностью и к тому же отличаются очень низким содержанием рецепторов для некоторых ростовых факторов, таких, например, как факторы роста фибробластов (FGF). Стандартной и наиболее удобной моделью для изучения регуляции пролиферации являются мышиные клетки линий ЗТЗ, однако, эти клетки иммортализованы и не стареют в культуре. Тем не менее, в свете современных представлений о роли фермента теломеразы в поддержании иммортализованного фенотипа клеток представилось возможным попытаться вызвать искусственное старение клеток ЗТЗ, подавляя активность теломеразы химическими агентами, такими как ингибиторы обратных транскриптаз, поскольку теломераза относится именно к этому классу полимераз. Таким образом, представляется целесообразным изучение в рамках одной работы таких актуальных проблем молекулярной и клеточной биологии, как зависимость действия факторов роста на пролиферацию фибробластоподобных клеток от положения клеток в цикле, а также от плотности и пролиферативного возраста культуры.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование влияния нескольких ростовых факторов на пролиферацию фибробластоподобных клеток . В качестве основного объекта была использована культура мышиных клеток ЗТЗ Swiss.

з

Сравнивали такие факторы роста, как FGF-1, PDGF-BB, EGF, а также такой сложный стимулятор роста, как сыворотка крови.

В работе решались следующие непосредственные задачи:

1. Определить, сколь длительно необходимо стимулировать покоящиеся клетки различными факторами роста для эффективного вхождения в S-период.

2. Выяснить, можно ли заменить один фактор роста на другой на раннем и позднем этапах перехода от состояния покоя к репликативной фазе без ущерба для последующего вступления в S-период и таким образом узнать, эквивалентны ли события, вызываемые разными факторами роста в раннем и позднем пререпликативном периоде.

3. Сравнить способность различных факторов роста стимулировать прохождение Gl-периода клетками логарифмически растущей культуры.

4. Определить, как зависит эффективность пролиферативной стимуляции клеток различными факторами роста от плотности покоящейся культуры.

5. Исследовать возможность индукции искусственного старения иммортализованных фибробластов мыши путем подавления функции теломеразы ингибиторами обратных транскриптаз.

6. Определить чувствительность клеток, претерпевших искусственное старение, к различным факторам роста.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые была продемонстрирована возможность замены одного фактора роста на другой в раннем пререпликативном периоде без потери скорости вступления клеток в S-фазу, что свидетельствует о пролиферативной эквивалентности событий, вызываемых различными факторами в этом периоде. При этом была показана необходимость постоянного присутствия факторов роста на протяжении практически всего пререпликативного периода для эффективного вступления в репликативную фазу. Вместе с тем, обнаружено, что в позднем пререпликативном периоде FGF-1 не способен принимать пролиферативную эстафету от сыворотки и PDGF-BB. Необходимость длительной стимуляции клеток FGF-1 и сывороткой для достижения максимального пролиферативного эффекта показана как для плотных, так и для редких культур ЗТЗ Swiss. Вместе с тем, обнаружено, что PDGF-BB, действуя на редкие культуры, дает максимальную стимуляцию синтеза ДНК даже при 3-х часовом действии. Впервые обнаружено, что в отличие от PDGF-BB и сыворотки, FGF-1 не только не стимулирует вступление в S-период клеток логарифмически растущей культуры, находящихся в G1 периоде, но и подавляет это вступление. Продемонстрировано, что длительное культивирование клеток ЗТЗ Swiss в присутствии ингибиторов обратных транскриптаз азидотимидина и карбовира, подавляющих функцию теломеразы, вызывает процесс, напоминающий клеточное старение, который выражается в почти полном прекращении роста клеток и приобретении ими фенотипа, характерного для стареющих фибробластов. При отмыве ингибиторов клетки вновь вступают в пролиферацию, причем во многих из митотических клеток обнаруживаются полиплоидные наборы хромосом. Стимуляция предварительно переведенных в бессывороточную среду клеток, претерпевших "искусственное старение", сывороткой, FGF-1 и PDGF-BB приводит к столь же выраженному вступлению в S-период, как и при стимуляции нормальных клеток. При этом сохраняется необходимость в длительной стимуляции для достижения максимального синтеза ДНК. Полученные результаты способствуют более глубокому

пониманию механизмов экзогенной регуляции клеточной пролиферации и представляют интерес для поиска новых подходов в терапии опухолей.

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на XII Всероссийском симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра (1996, Санкт-Петербург), на 36-ой ежегодной конференции Американского общества клеточной биологии (1996, San Francisco) и на Первом съезде онкологов стран СНГ (1996, Москва).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит наименования, из них иностранных

источника. Работа содержит страниц, включая рисунков и таблиц.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

DM! — среда определенного химического состава, содержащая инсулин

EGF — элидермальный фактор роста

FGF-1 — фактор роста фибробластов 1 (кислый)

PDGF-BB — тромбоцитарный фактор роста (гомодимер ВВ)

ТАК — теломеразная активность

ИОТ — ингибиторы обратных транскриптаз

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры клеток. В работе были использованы клетки ЗТЗ Swiss и NIH ЗТЗ, полученные из Американской коллекции клеточных культур (АТСС). Клетки культивировали при 37° С в атмосфере 5% СОг и 95% влажности в среде следующего состава: 90% среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Gibco, Великобритания), 10% телячьей сыворотки (Hyclone, США), 80 мкг/мл гентамицина (Pharmacia, Болгария).

Факторы роста. FGF-1 любезно предоставлен Т. Масиагом (Лаборатория им. Холланда Американского Красного Креста). В работе использовали также PDGF-BB (Promega, США) и EGF (Serva, Германия).

Перевод клеток в состояние пролиферативного покоя. Для перевода клеток в состояние пролиферативного покоя клеточный монослой два раза промывали средой DMEM без сыворотки, после чего клетки инкубировали в среде определенного химического состава (DMI), не содержащей ростовых факторов, кроме инсулина, в течение двух суток. В качестве базовой среды для приготовления DMI использовали смесь сред DMEM и F12 в соотношении 3:1. В базовую среду вносили гентамицин (80 мкг/мл) и следующие химические компоненты: 8 мМ NaHCOj; 15 мМ Hepes (pH 7.4); 4 мкМ MnCI2; 2.5 мМ гистидина; 10 мкМ этаноламина; 0.1 мкМ селенита натрия; 5 мг/л трансферрина; 500 мг/л комплекса линолевой кислоты и бычьего сывороточного альбумина; 10 мг/л инсулина (все реактивы - Sigma, США).

В экспериментах по стимуляции покоящихся клеток факторами роста во всех случаях, кроме специально оговоренных, использовали среду DMI. Синхронизация клеток в метафазе митоза. Субконфлуэнтную культуру клеток ЗТЗ Swiss, растущую в полной культуральной среде в пластиковых флаконах, промывали бессывороточной средой для удаления слабоприкрепленных интерфазных клеток, а затем переводили в полную культуральную среду, содержащую 400 нг/ мл нокодазола (Sigma). Через 5 ч после начала действия

нокодазола округленные клетки, блокированные в метафазе, снимали с поверхности флаконов, слегка их встряхивая. Содержание метафазных клеток определяли с помощью флуоресцентной микросхопии с использованием прижизненного окрашивания акридиновым оранжевым (1(И М). Обычно среди открепившихся клеток было не менее 90% метафазных.

Радиоавтография. Долю клеток, синтезирующих ДНК в исследуемых культурах, определяли методом радиоавтографии по включению 3Н -тимидина, который вносили в культуральную среду из расчета 5 мкКи/мл на 1 ч (импульсная метка) или 1 мкКи/мл на 12 ч (накопительная метка). Полученные препараты подвергали стандартной процедуре радиоавтографии (Епифанова и др., 1977). Анализ радиоавтографических препаратов проводили с помощью светового микроскопа. Для определения доли меченных 3Н-тимидином клеток подсчитывали по 400 клеток в каждом препарате.

На графиках каждая точка получена путем анализа не менее, чем трех препаратов.

Ингибиторы обратной транскриптазы. З'-азидо-З'-дезокситимидин (AZT) был синтезирован в лаборатории A.A. Краевского ИМБ РАН, карбовир -карбоциклический аналог дидезоксигуанозина был любезно предоставлен С. Робертсом (Англия). В работе также использовали дидезоксицитидин (ddC) фирмы "Aldrich".

Определение скорости роста. Клетки высаживали в 35 мм чашки Петри в низкой плотности (104 клеток на чашку) для того, чтобы избежать контактного торможения. С помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа определяли количество клеток в 50 полях зрения через 24 и 48 ч после посадки. Отношение этих величин принимали за скорость роста. Скорость роста контрольных клеток принимали за 100%.

Определение теломеразной активности (ТАК). ТАК определяли согласно методике, описанной Морином (Morin G.B., 1989). Оценивали РНК-зависимую способность клеточных экстрактов удлинять экзогенные одноцепочечные теломерные затравки последовательностью TTAGGG (Yegorov Y.E. et al., 1996).

результаты

Зависимость стимуляции синтеза ДНК от времени действия факторов роста в пререпликативном периоде

Радиоавтографический анализ показал, что при действии FGF-1, PDGF-ВВ и сыворотки крови на покоящиеся культуры ЗТЗ Swiss вступление клеток в S-фазу происходит после длительного пререпликативного периода и идет довольно асинхронно. Хотя начало массового вступления в репликацию приходится на срок 17-19 ч после начала стимуляции, содержание в культуре реплицирующих ДНК клеток выходит на плато только через 22-23 ч. Динамику зависимости уровня синтеза ДНК в культурах ЗТЗ Swiss от времени стимуляции их из состояния пролиферативного покоя исследовали, стимулируя клетки FGF-1, PDGF-BB или телячьей сывороткой в течение различных сроков, затем отмывая факторы роста средой DMEM содержащей, 10 мкг/мл гепарина, к которому FGF-1 и PDGF-BB обладают высоким сродством и инкубируя далее клетки в DMI. Синтез ДНК определяли через 24 ч после начала стимуляции. При этом было обнаружено, что для максимального вступления в S-период клеток ЗТЗ Swiss, по-видимому, требуется присутствие факторов роста на протяжении всего или почти всего пререпликативного периода (рис. 1).

ct

10

с; о

о г

о

£ 30

X

к

о

£ 40

5

о 1

-»-FGF

PDGF Сын.

3

6

12

24

Время стимуляции(ч)

Рис. 1. Зависимость уровня синтеза ДНК в клетках ЗТЗ Swiss от времени стимуляции их FGF-1, PDGF-BB и телячьей сывороткой из состояния пролиферативного покоя. (Здесь и далее объяснения в тексте).

Кроме того, было установлено, что кратковременной стимуляции клеток ЗТЗ Swiss эпидермальным фактором роста также недостаточно для максимально эффективного вступления их в S-фазу. Так, в случае 3-х часовой стимуляции культуры радиоавтографическое исследование выявило, что через 21 ч лишь 1,3±0,6 % клеток вступают в S-фазу, в то время как после 24-х часовой стимуляции ДНК синтезируют 4,1±1,1 % клеток. Относительно слабая стимуляция клеток EGF даже при длительном его воздействии не позволила нам использовать его в дальнейших экспериментах по изучению взаимозаменяемости факторов роста.

Взаимозаменяемость факторов роста в раннем пререпликативном периоде

Необходимость длительной стимуляции клеток для эффективного вступления в S-фазу позволила нам попытаться ответить на вопрос о том, равноценны ли события, вызываемые различными ростовыми факторами в раннем пререпликативном периоде, когда решается вопрос о вступлении клетки в репликативный цикл.

Сопоставляемыми факторами были FGF-1 и PDGF-BB, а также FGF-1 и такой сложный стимулятор роста как сыворотка крови, которая, как известно, содержит PDGF-BB (Ross R. et al., 1988) и не содержит FGF (Sherr С.J., Roberts J.M., 1995; Sherr C.J. et al.,1992). Схема опытов заключалась в стимуляции покоящихся клеток одним из двух исследуемых факторов роста в течение периода,

недостаточного для того , чтобы обеспечить вступление в репликацию, затем замене его на другой фактор роста и определении динамики вступления клеток в Б-период.

В первой серии опытов выясняли возможность передачи эстафеты подготовки к репликации в раннем пререпликативном периоде от РвР-1 к РСЮР-ВВ. Клетки стимулировали рекомбинантным РвР-1 в концентрации 10 нг/мл в ОМ1, содержащей 10 мкг/мл гепарина, в течение 3 ч. Затем культуру трижды отмывали от РвР-1 средой ОМЕМ с 10 мкг/мл гепарина и далее инкубировали различное время в 0М1 с 10 нг/мл рекомбинантного Р06Р-ВВ. На рис. 2, 3, 4 и 5 смена одного фактора роста на другой обозначена буквой "Э" (эстафета). За 1 ч до окончания срока стимуляции в ячейки с клетками вводили 3Н-тимидин из расчета 5 мкКи/мл в культуральной среде, после чего клетки фиксировали 96% этанолом. В качестве контролей использовали: К1 - клетки, которые стимулировали в течение 3 ч, затем отмывали от РвР-1 и далее

инкубировали в ОМ1, не содержащей дополнительных факторов роста; К2 -клетки, которые инкубировали 3 ч в ОМ! без факторов роста, а затем до окончания срока стимуляции с РйСР-ВВ; КЗ - клетки, которые инкубировали только с РйСР-ВВ в течение всего времени стимуляции (рис. 2).

25

Рис. 2. Динамика синтеза ДНК в культуре ЗТЗ Swiss при кратковременной стимуляции FGF-1 с последующей длительной стимуляцией PDGF.

Аналогичным образом проводили опыты с обратной эстафетой (PDGF - FGF) (рис. 3), а также с эстафетами "сыворотка - FGF" и "FGF - сыворотка" (рис. 4 и 5).

При замене FGF-1 на PDGF (рис. 2) кривая возрастания синтеза ДНК Э (эстафета) не только не отставала от контрольной кривой КЗ (постоянная стимуляция клеток PDGF), но даже несколько превышала ее во всех исследованных точках. Кривая Э, как и кривая КЗ, значительно опережала

кривую К2 (стимуляция клеток РйСР с задержкой на 3 ч). При этом, как видно из рис. 2, в случае кривой Э такое опережение нельзя объяснить простым сложением слабой стимуляции, вызванной трехчасовой инкубацией клеток с РСР-1 (кривая К1) со стимуляцией, обусловленной дальнейшим действием на клетки РОвР (кривая К2). Налицо явная передача эстафеты от РСР-1 к РОСР.

Интересно, что даже в поздние сроки после замены РвР-1 на РОСР в культуре проявлялись типичные морфологические изменения, вызываемые РБР-1. В среднем и позднем пререпликативном периоде большинство клеток, постоянно стимулируемых РСР-1, приобретает веретеновидную или звездообразную форму. В то же время, большинство клеток, постоянно стимулируемых РСЮР, имеет полигональную форму. В наших экспериментах через 19 ч после передачи эстафеты от РСР-1 к РОСР вдвое большее число клеток имело звездообразную или веретеновидную форму, чем при стимуляции РОСР в течение 22 ч. Следует отметить, что трехчасовая стимуляция клеток РСР-1 с последующим его отмывом недостаточна для того, чтобы вызвать значительные морфологические изменения, типичные для поздних сроков стимуляции.

14 16 18 20

Время стимуляции(ч)

22

■К1 ■Э

■К2 •КЗ

Рис. 3. Динамика синтеза ДНК в культуре ЗТЗ Swiss при кратковременной стимуляции PDGF-1 с последующей длительной стимуляцией FGF.

В следующей серии экспериментов выясняли, способен ли PDGF передавать эстафету FGF-1. Постановка опытов была аналогичной опытам с эстафетой FGF-1 - PDGF. Как видно из рис. 3, эстафетная кривая практически совпадала с кривой КЗ (постоянная стимуляция клеток FGF-1).

Таким образом, была продемонстрирована передача пролиферативной эстафеты от РЭвР к РвР-1. Можно заключить, что РОСР в течение первых трех часов действия на клетки ЗТЗ Булвэ вызывает в них события, которые в пролиферативном отношении равноценны событиям, вызываемым ЯСР-1.

Интересно было также выяснить, возможна ли передача пролиферативной эстафеты от РвР-1 к сыворотке крови, которая не содержит факторов семейства РвР. Для стимуляции клеток, инкубировавшихся 3 ч с РвР-1 и затем от него отмытых, использовали телячью сыворотку в концентрации 10% в культуральной среде. Как видно из рис. 4, эстафетная кривая почти совпадала с кривой КЗ (постоянная стимуляция клеток сывороткой) и значительно опережала кривую К2 (стимуляция сывороткой, задержанная на 3 ч), что говорит о передаче эстафеты от РвР-1 к сыворотке.

■К1 ■Э

"К2 ■КЗ

Время стимуляции(ч)

Рис. 4. Динамика синтеза ДНК в культуре ЗТЗ Swiss при кратковременной стимуляции FGF-1 с последующей длительной стимуляцией сывороткой.

Следует отметить, что хотя РвР-1 вызывает стимуляцию синтеза ДНК в 3-4 раза более низкую, чем сыворотка, при замене РСР-1 на сыворотку интенсивность стимуляции лишь незначительно ниже, чем при постоянном действии сыворотки. По-видимому, это свидетельствует о том, что события, обеспечивающие более высокий пролиферативный эффект сыворотки по сравнению с РвР-1 происходят не в раннем, а в среднем или позднем пререпликативном периоде.

В последующих опытах выясняли возможность передачи эстафеты от сыворотки к РСР-1. Как видно из рис. 5, эстафетная кривая (сыворотка - РСР-1) значительно опережала кривую К2 (задержанная стимуляция РОР-1) и даже была

несколько выше кривой КЗ (постоянная стимуляция РСР-1). Однако даже на поздних сроках эстафетная стимуляция не достигала и 30% величины стимуляции, наблюдаемой при непрерывном действии сыворотки на покоящиеся клетки. Это свидетельствует о том, что превышение стимулирующего действия сыворотки над стимулирующим эффектом РвР-1 достигается в среднем и/или позднем пререпликативном периоде.

о ш

Время стимуляции (ч)

Рис. 5. Динамика синтеза ДНК в культуре ЗТЗ Swiss при кратковременной стимуляции сывороткой с последующей длительной стимуляцией FGF-1.

Обнаруженная нами передача пролиферативной эстафеты между исследованными стимуляторами клеточного роста позволяет говорить об универсальности механизмов, обеспечивающих выход клеток из состояний покоя и вступление в цикл.

Исследование взаимозаменяемости факторов роста в позднем пререпликативном периоде

Выяснив, что все исследованные факторы роста взаимозаменяемы в раннем пререпликативном периоде, мы решили проверить, сохраняется ли их взаимозаменяемость в позднем пререпликативном периоде за несколько часов до начала массового вступления клеток в S-период, наблюдаемого обычно через 16-18 ч после начала действия факторов роста. Нами был выбран срок 12 ч после стимуляции покоящихся клеток факторами роста. Мы обнаружили, что стимуляция клеток факторами роста в течение этого срока с последующим их отмывом вызывает в 2-5 раз более низкое вступление клеток в репликацию, чем

постоянная стимуляция. В этой серии опытов клетки стимулировали РСР-1 в течение 12 ч, затем РСР-1 отмывали и немедленно вносили среду с РОСР-ВВ. Фиксировали клетки через 12 ч после смены факторов роста. В качестве контролей служили: 1 — клетки, стимулированные РСР-1 в течение 12 ч, отмытые затем от РСР-1 и инкубировавшиеся еще 12 ч без факторов роста; 2 — клетки, инкубировавшиеся 12 ч без факторов роста, а затем 12 ч с РОвЯ-ВВ;

3 — клетки, инкубировавшиеся 24 ч с РСР-1; 4 — клетки, инкубировавшиеся 24

4 с РйСР-ВВ. Аналогичным образом исследовали замену РСЮР-ВВ на РСР-1, РСР-1 на сыворотку и сыворотки на РСР-1. 3Н-тимидин вводили за 1 ч до фиксации клеток (импульсная метка) или за 12 ч (накопительная метка). В таблице 1 приведены результаты типичного эксперимента по исследованию взаимозаменяемости факторов роста в позднем пререпликативном периоде. В данном опыте использовали импульсное мечение клеток.

Таблица 1.

Взаимозаменяемость факторов роста в позднем пререпликативном периоде.

Фактор роста первые 12 ч стимуляции

Фактор роста вторые 12 ч стимуляции

Доля меченых клеток (%)

РСР-1 РСР-1

РСР-1 РОСР-ВВ

РОСР-ВВ Сыворотка Сыворотка

РвР-1 РОСР-ВВ Сыворотка

РОСР-ВВ РОСР-ВВ Сыворотка Сыворотка

РСР-1 РСР-1

РСР-1 РСР-1 РОСР-ВВ Сыворотка

7,2+1,5 0,3±0,3 11,6±0,8 0,4±0,4 15,6+2,1 5,7±1,3 0,3±0,3 1,2+0,6 10,2+1,7 9,9±1,7 13,6±1,9 11,8±0,8 52,1±2,8

Было обнаружено, что замена РСР-1 на РОСР-ВВ приводит к почти столь же интенсивному вступлению клеток в Б-фазу, как и постоянная их стимуляции РСР-1 в течение 24 ч.

При замене РйР-1 на сыворотку также наблюдалась пролиферативная эстафета, однако уровень синтеза ДНК при этом был существенно ниже, чем при постоянной стимуляции клеток сывороткой. Таким образом, как РОСР-ВВ, так и сыворотка способны подхватывать пролиферативную эстафету РСР-1 в позднем пререпликативном периоде.

Совершенно иначе обстояло дело при замене сыворотки и РОСР-ВВ на РСР-1. Пролиферативный эффект связки сыворотка - РСР-1 был не выше, чем при 12 часовой стимуляции сывороткой с последующей инкубацией без факторов роста в течение 12 ч. Замена же РОСР-ВВ на РСР-1 приводила к почти полному снятию эффекта предшествовавшей 12-часовой инкубации

клеток с РОСР-ВВ. Итак, РСР-1 неспособен заменить сыворотку и РйСР-ВВ в позднем пререпликативном периоде.

Опыты с накопительной меткой дали равнозначные с приведенными выше результаты.

РСР-1 в С1-периоде клеточного цикла

Известно, что РвР-1 недостаточен для поддержания постоянной пролиферации клеток перевиваемых линий. Поэтому РСР-1 в культурах клеток применяют в сочетании с другими ростовыми факторами, чаще всего — с сывороткой.

Вместе с тем, из приведенных нами выше результатов видно, что РСР-1 обеспечивает вступление в Э-период значительной части клеток, находящихся а состоянии пролиферативного покоя. В отдельном опыте (таблица 2) было продемонстрировано, что, по крайней мере, некоторые из них затем успешно вступают в митоз, причем для прохождения этими клетками Э-периода, С2-периода и митоза ЯСР-1 не требуется.

Таблица 2.

Вступление в митоз клеток ЗТЗ Swiss стимулированных FGF-1 из состояния пролиферативного покоя.

Время инкубации клеток с FGF-1 (ч) Время после инкубации с FGF-1 (ч) Митотический индекс (%)

0 0 0±0,2

14 13 0,8+0,4

27 0 0,7±0,3

14 36 0,04±0,08

50 0 0,04+0,08

Интересно, что через 50 ч после начала стимуляции, то есть, в период, соответствующий ожидаемому вступлению клеток во второй митоз, мы наблюдали не более 1 митоза на 2500 просмотренных клеток как при сокращенной (14 ч), так и при постоянной стимуляции клеток FGF-1.

Возникает вопрос, действует ли FGF-1 как фактор роста в Gl-периоде клеточного цикла постоянно циклирующих клеток, не связанном с выходом из состояния покоя. Для ответа на этот вопрос клетки культуры ЗТЗ Swiss синхронизовали в метафазе митоза с помощью обработки нокодазолом. Затем округлившиеся клетки снимали, встряхивая флаконы, осаждали центрифугированием и ресуспендировали в среде DMI без дополнительных добавок или с добавлением: a) FGF-1 (10 нг/мл) и гепарина (10 мкг/мл); б) PDGF-BB (10 нг/мл); в) сыворотки (10%). Далее метафазные клетки высаживали в предварительно покрытые фибронектином ячейки культуральных планшетов из расчета 500 клеток на мм2. Покрытие фибронектином обеспечивало

практически немедленное прикрепление и быстрое распластывание клеток. Вступление в S-фазу клеток, вышедших из митоза, определяли с помощью радиоавтографии.

Прежде всего, интересно отметить, что среда DMI эффективно стимулировала вступление значительной части постметафазных клеток в S-период даже в отсутствие дополнительных ростовых факторов (рис. 6). Более 40% пресинхронизованных в митозе клеток синтезировало ДНК через 16 ч после высадки в среде DMI. Введение в DMI 10% сыворотки увеличивало долю синтезирующих ДНК клеток до 70%, a PDGF - до 50%. В противоположность этому, добавление FGF-1 (в присутствии гепарина) в DMI резко снижало индекс меченых клеток - с 40% до 13%. Следует отметить, что этот эффект обусловлен именно FGF-1, а не вводимым одновременно с ним гепарином, ибо добавление одного только гепарина в среду практически не изменяло индекса мечения.

т

.-/С»' « • т

% -r.i

щ 9 т

ш ш

к Геп.,

т

т r&W-'

'»¿¿bjyr

'ЧКУ'г •O&Si iam ш iSEfto ¡ц

PDGF Сыв.,

ВВ 10%

10 мкг/мл

FGF-1

Рис. 6. Действие FGF-1 в Gl-периоде клеточного цикла на синтез ДНК в клетках ЗТЗ Swiss, культивируемых в среде DMI.

В отдельном опыте было обнаружено, что для проявления подавляющего эффекта FGF-1 требуется его длительное присутствие в течение Gl-периода. В самом деле, если инкубация с FGF-1 "Ь течение 13 ч после митоза снижала индекс меченых клеток с 47,7% до 20,3%, то добавление его в течение только первых 3 ч после митоза с последующим отмывом раствором гепарина не приводило к снижению стимулирующего эффекта DMI. Отсутствие специфических компонентов DMI (в первую очередь, по-видимому, инсулина) в культуральной среде, на которую переводили метафазные клетки, значительно изменяло наблюдаемую картину вхождения клеток в S-период. В соответствующем опыте синхронизованные в митозе клетки высаживали на среду DMEM, содержавшую только такой компонент DMI, как ассоциированный с линолевой кислотой бычий сывороточный альбумин, способствующий

лучшему выживанию клеток. Если такая среда не была снабжена никакими дополнительными факторами роста, то в Э-фазу вступало всего 11-16% клеток, что, скорее всего, может быть объяснено наличием небольшой примеси интерфазных клеток в исходной суспензии. Добавление в такую среду РОвР вызывало значительное, а сыворотки — резкое повышение индекса меченых клеток. В то же время, РвР-1 никоим образом не стимулировал вступление клеток в Э-период в такой среде, хотя и не снижал индекса меченых клеток (Рис. 7).

so 80

5?

~ 70 о

5 во х 50

Л

5 « | зо

с 20

О

* 10 о

Л''-' * Л '

■ t. ■ÄitL -.,? ¡äj

f ЙЙГ

Геп., 10 м кг/мл

FGF-1

PDGF-ВВ

Сыв., 10%

Рис. 7. Действие FGF-1 в Gl-периоде клеточного цикла на синтез ДНК в клетках ЗТЗ Swiss, культивируемых в среде DMEM, содержащей бычий сывороточный альбумин, ассоциированный с линолевой кислотой.

Резюмируя эту часть результатов, можно сказать, что в отличие от PDGF и сыворотки, FGF-1 не стимулирует вступление в репликацию клеток ЗТЗ Swiss, находящихся в Gl-периоде клеточного цикла, не связанном с выходом из состояния покоя. По-видимому, в отличие от сыворотки и PDGF, стимулирующий эффект FGF-1 ограничивается клетками, находящимися в состоянии покоя. Необходимо отметить также подавляющий эффект, оказываемый FGF-1 на вызываемое компонентами среды DMI вступление клеток в S-период.

Зависимость стимулирующего действия факторов роста от плотности

клеток в культуре

Интересно было выяснить, существует ли зависимость между плотностью клеточной популяции и потребностью клеток в длительной стимуляции ростовыми факторами для вступления в S-период. С этой целью клетки высевали из расчета от 32 до 500 кл/мм2 в ячейки культурального планшета и через сутки переводили в среду DMEM с добавлением комплекса линолевой кислоты и альбумина ( 0,5 мг/мл) на двое суток. Затем культуру стимулировали

РвРИ, РОСР-ВВ или сывороткой в течение 3 ч (с последущим отмывом средой, содержащей 10 мкг/мл гепарина) или же в течение 24 ч. Среда, использованная в данных экспериментах, являлась, как и в опытах с клетками, синхронизованными в метафазе, упрощенным вариантом ОМ1. Полная среда ОМ! не способствовала достаточно эффективному переходу клеток в состояние покоя в редких культурах: в них после 2 суток инкубации с ОМ1 около 5% клеток включало Н-тимидин при импульсном мечении. В то же время, этот показатель не превышал 1,5% в редких культурах, переведенных в покой при использовании обедненного варианта ОМ1.

Через 24 ч после начала стимуляции клетки импульсно метили 3Н-тимидином, фиксировали и проводили радиоавтографическую обработку. Из таблицы 3 видно, что ни при одной из использованных клеточных плотностей 3-х часовая инкубация с сывороткой и с РСР-1 не вызывала эффективного вступления клеток в Б-период в отличие от 24-часовой инкубации.

Таблица 3.

Зависимость стимулирующего действия факторов роста от плотности культуры.

Стимуляция Время стимуляции (Ч) Плотность культуры (кл/мм2)

32 63 125 250 500

рвр-1 3 24 1,6±0,7 13,5±1,9 2,8±0,9 18,9+2,2 2,1±0,8 21,3±2,3 0,3+0,3 11,3+1,8 0,1±0,1 7,9±1,5

РОвР-ВВ 3 24 21,5±2,3 13,9+2,0 35,2±2,7 29,8+2,6 24,7±2,4 28,8+2,6 0,4+0,4 14,3±2,0 0±0,2 16,5±2,1

Сыворотка 3 24 3,1±1,0 38,0+2,7 4,0+1,1 27,4±2,5 1,8+0,8 30,4+2,6 0,1+0,2 36,8+2,7 0±0,2 33,4±2,7

В то же время, было показано, что при плотностях от 32 до 125 кл/мм2 кратковременная стимуляция клеток РйСР-ВВ дает не менее выраженное (причем, при 32 кл/мм2 даже достоверно большее) вступление клеток в Б-фазу, чем постоянное присутствие этого фактора роста в среде. При более высоких клеточных плотностях кратковременная стимуляция клеток РйСР-ВВ оказывается малоэффективной.

Таким образом, интересной особенностью РООР-ВВ является способность стимулировать синтез ДНК в культурах с низкой плотностью при кратковременном контакте с ними.

Опыты по индукции "искусственного старения"

В опытах по индукции "искусственного старения" мы использовали клетки ЗТЗ Swiss и NIH ЗТЗ.

В первой серии экспериментов были определены максимальные концентрации ИОТ, которые вызывают лишь слабое подавление роста клеток NIH ЗТЗ. Культивирование клеток с 3 мкМ AZT, 20 мкМ карбовира или 100 мкМ ddC вызывало небольшое замедление роста (20%), появляющееся уже на следующий день после их добавления. Степень подавления роста не менялась в течение трех недель. Именно эти концентрации ИОТ использовали в дальнейших экспериментах для индукции "искусственного старения".

В случае AZT и карбовира события развивались следующим образом: скорость пролиферации клеток в присутствии ИОТ постепенно уменьшалась, после первых трех недель культивирования появлялись отдельные крупные клетки, доля которых со временем возрастала. В конце концов, через различные сроки, пройдя разное количество удвоений популяции (УП), клетки переставали делиться полностью и длительное время переживали в неделящемся состоянии (табл.4).

Таблица 4.

Индукция "искусственного старения"

Появление Остановка Переживание

Клетки ИОТ "крупных" пролифе- неделящихся

клеток (нед.)* рации клеток

(нед.)** (нед.)

ЗТЗ Swiss AZT 3-6 10-12 >4

карбовир 3-4 9-11 >4

смесь*** 2 7 >4

ddC 2 3 1

NIH ЗТЗ AZT 5-7 12-16 >4

карбовир 6-8 16-18 >4

смесь*** 2-3 9-10 >4

ddC --- -- -----

Примечания

*Мы подсчитывали долю крупных клеток, соответствующих типу 6 (Bayreuther К. et al., 1988). В таблице указано время, когда доля таких клеток начинала превышать 5%.

"Под остановкой пролиферации мы понимали такое замедление роста, при котором время одного УП составляло не менее двух недель. ***Смесь содержала ЗмкМ AZT и 20 мкМ карбовира.

Особенности действия ddC. Клетки ЗТЗ NIH не меняли скорость роста и морфологию в присутствии ddC в течение по крайней мере 15 недель. Напротив, клетки ЗТЗ Swiss очень быстро (через две недели) реагировали на ddC быстрым снижением скорости роста и появлением морфологических изменений. Практически во всех клетках появлялись выраженные перинуклеарные включения. Пролиферация быстро прекращалась полностью, после чего клетки дегенерировали в течение недели.

При замене ddC на AZT после трех недель инкубации с ddC, токсические явления исчезали в течение нескольких дней, через две недели пролиферация

восстанавливалась до исходного уровня, и в дальнейшем динамика процессов протекала так, как будто инкубации с ddC не было.

Обратимость "искусственного старения". Отмена ИОТ на стадиях, когда рост культуры еще не остановился полностью, но морфологические изменения уже выражены (10 недель для клеток ЗТЗ Swiss), приводила к восстановлению пролиферации. В культуре через 2-3 дня после отмены ИОТ появлялись митотические клетки. Радиоавтографическое исследование показало, что резкое увеличение числа клеток, синтезирующих ДНК в культурах, начинается на вторые сутки после отмены ИОТ. С/точная инкубация клегок с 3Н-тимидином через день после отмены ИОТ выявила, что все появляющиеся митотические клетки (было просчитано 226 клеток) мечены. Это гозорит о том, что под влиянием ИОТ клетки останавливаются в Gl-периоде клеточного цикла, также, как и естественно стареющие клетки (Stein G.H., Dulic V., 1995).

Полиплоидные митотические клетки. На сроках от 7 до 18 дней после отмены ИОТ нами были зарегистрированы гигантские митотические клетки. Наблюдения показали, что такие митозы продолжаются много часов, и клетки при этом имеют неправильную форму. Стандартный кариологический анализ выявил, что в случае культуры NIH ЗТЗ 24% митотических клеток, полученных через 8 дней после отмены AZT, были полиплоидными, некоторые из них содержали свыше 300 хромосом.

Зависимость теломеразной активности от фазы клеточного цикла

Было интересно выяснить связь меиеду наличием в клетках ТАК и их пролиферативным статусом. Клетки ЗТЗ Swiss были переведены в состояние пролиферативного покоя (два дня с 0,25% сыворотки). При этом около 95% клеток не синтезировало ДНК. Измерения показали, что ТАК в этом случае достоверно не меняется.

Таким образом, было установлено, что ТАК достаточно длительное время сохраняется в покоящихся клетках.

Действие факторов роста на клетки ЗТЗ Swiss, претерпевшие "искусственное старение".

Изучение способности клеток ЗТЗ Swiss, претерпевших под действием AZT "искусственное старение", вступать в S-фазу при стимуляции их различными факторами из состояния пролиферативного покоя, показало, что уровень синтеза ДНК в таких культурах не ниже, чем в контроле как при кратковременной (Зч), так и при длительной (24 ч) стимуляции (табл. 5, опыт №1).

Более того, в ряде экспериментов, когда мы использовали для перевода клеток в состояние пролиферативного покоя не DMI, a DMEM, содержащую 0,25% телячьей сыворотки, уровень синтеза ДНК в культуре, претерпевшей "искусственное старение", после стимуляции был достоверно выше, чем в контрольной культуре (табл. 5, опыт №2).

Особенно наглядно это проявилось при использовании в экспериментах по "искусственному старению" смеси ИОТ — 3 мкМ AZT и 20 мкМ карбовира (табл. 5, опыт №3). Интересно, что такие клетки, по всей видимости, сохраняли способность к пролиферативной эстафете.

Таблица 5.

Уровень синтеза ДНК в клетках ЗТЗ Swiss, претерпевших "искусственное старение" под действием ИОТ после кратковременной (3 ч) и длительной (24 ч) стимуляции их из состояния пролиферативного покоя с помощью FGF-1, PDGF-ВВ и телячьей сыворотки и при замене FGF-1 на PDGF-BB.

Стимуляция

№ ИОТ FGF-1 PDGF-BB Сыворотка FGF, 3 ч -PDGF, 21 ч

Зч 24 ч Зч 24 ч Зч 24 ч

1 AZT 2,0±0,8 12,6±1,3 2,4+1,2 10,8±1,8 0,3±0,3 61,1±2,0 —

К 2,3±0,7 10,3+1,7 1,9±0,8 11,2±1,8 0,3+0,3 51,1+2,8 —

2 AZT — 17,4±3,7 — 31,7+4,6 — 64,5+4,7 37,8+4,8

К — 12,0±3,2 — 8,9+2,8 — 51,7±4,9 12,2+3,2

3 смесь* — 21,7±8,3 — 17,2±7,7 — 68,3+5,6 32,0±8,2

К — 9,1±3,6 — 2,7±2,3 — 49,3±4,7 11,3±3,0

Примечания

*К — контрольная культура

"Смесь содержала ЗмкМ AZT и 20 мкМ карбовира.

Таким образом, нам не удалось выявить необратимой потери чувствительности к различным митогенам клетками ЗТЗ Swiss, претерпевшими "искусственное старение" под действием ИОТ.

обсуждение

В результате экспериментов по отмыву ростовых стимуляторов от клеток, проходящих пререпликативный период, мы показали что для эффективного вступления в S-фазу клетки ЗТЗ Swiss требуют наличия в среде FGF-1, PDGF-BB или сыворотки на протяжении большей части пререпликативного периода.

По современным представлениям, наиболее вероятными механизмами, отсчитывающими "пролиферативное время" в раннем и среднем Gl-периоде, являются системы циклинов группы D и соответствующих циклин-зависимых киназ (cdk) (Shin et al., 1996). Скорее всего, именно в результате нарушения функций этих систем клетки выходят из цикла при отмыве факторов роста после кратковременной стимуляции. Известно, что отмыв пролиферирующих

предшественников макрофагов от фактора роста CSF-1 вызывает деградацию циклина D1 (Sliutz G. et al.,1995). Отмыв трансформированных фибробластов от сыворотки предотвращает накопление мРНК, кодирующей cdc2 (Buquet-Fagot С. et al., 1993). Таким образом, поддержание циклин-киназной системы, по-видимому, требует наличия ростовых факторов в среде на протяжении большей части пререпликативного периода.

Возможность эффективного отмыва ростовых стимуляторов с помощью гепарина была впервые использована нами для проведения экспериментов по замене факторов роста в раннем пререпликативном периоде, причем удалось показать, что факторы роста могут сменять друг друга без ущерба для "расписания" цикла.

Данные о том, что различные ростовые стимуляторы вызывают в раннем пререпликативном периоде равные по пролиферативной ценности события, в принципе, позволяют определить обусловленные этими факторами явления как существенные и несущественные для репликации. Так, известно, что спектры генов, транскрипция которых индуцируется при вступлении клеток в цикл, не полностью совпадают при действии FGF и PDGF (Donohue et al, 1994). Таким образом, можно предположить (по крайней мере, в случае первых трех часов после стимуляции), что экспрессия тех генов, которые представлены только в каком-либо одном из этих двух спектров, несущественна для достижения клетками S-периода.

Интересно, что замена сыворотки и PDGF-BB на FGF-1 после 12-часовой стимуляции приводит к резкому снижению вступления клеток в S-период, в то время как замена FGF-1 на сыворотку или на PDGF-BB через 12 ч после начала пролиферативной стимуляции не снижает эффективности вхождения клеток в S-период по сравнению с постоянной стимуляцией клеток FGF-1. По-видимому, события, вызываемые FGF-1 в позднем пререпликативном периоде, резко отличаются от событий, вызываемых PDGF-BB и сывороткой, и не могут быть "состыкованы" с процессами, стимулируемыми сывороткой и PDGF-BB на более ранних этапах пререпликативного периода.

Сходные по значению результаты получены при исследовании влияния различных факторов роста на прохождение логарифмически растущими клетками Gl-периода. Ранее практически не изучалось действие FGF-1 на фибробластоподобные клетки мыши в нормальном клеточном цикле. Нам, в частности, было интересно проверить осуществимость пролиферативной эстафеты в обычном Gl-периоде. Однако оказалось, что в отличие от PDGF-BB и сыворотки, FGF-1 не только не стимулирует вступление в S-период клеток логарифмически растущей культуры ЗТЗ Swiss, синхронизованной путем задержки клеток в метафазе, но и подавляет это вступление. Таким образом, FGF-1 выступает как стимулятор прохождения клетками пререпликативного периода, но вместе с тем может являться ингибитором прохождения ими Gl-периода нормального клеточного цикла.

Известно, что многие факторы роста могут выступать как стимуляторы размножения одних типов клеток и ингибиторы других, но до сих пор не было продемонстрировано, что характер действия фактора роста на клетки может определяться пролиферативным состоянием последних. Этот факт показывает необходимость более осторожной интерпретации результатов, полученных на клеточных культурах, синхронизованных переводом в состояние пролиферативного покоя, при переносе этих результатов на логарифмически растущие клетки.

В организмах факторы роста действуют как в зонах высокой клеточной плотности (например, в базальном слое эпидермиса кожи), так и в участках, где сложившиеся клеточные контакты нарушены (например, в механически поврежденных тканях). Интересно было выяснить, существует ли зависимость между плотностью клеточной культуры и потребностью клеток в длительной стимуляции ростовыми факторами для вступления в S-период. Мы обнаружили, что PDGF-BB, действуя на редкие культуры ЗТЗ Swiss, дает максимальную стимуляцию синтеза ДНК даже при 3-х часовой стимуляции, в то время как в случае FGF-1 и сыворотки для максимального пролиферативного эффекта необходима длительная стимуляция клеток как плотных, так и редких культур. Можно предположить, что при повреждениях тканей в живом организме PDGF, выделяемый в результате разрушения тромбоцитов, способен быстро и эффективно запускать размножение клеток, лишенных межклеточных контактов — например, фибробластов рыхлой соединительной ткани. В то же время, размножение клеток, имеющих обширные контакты (например, клеток эндотелия), вероятно, требует постоянного присутствия FGF или других факторов роста, поступающих в результате паракринной или аутокринной секреции (Friesel and Maciag, 1995). Тот факт, что сыворотка, не стимулирует клетки редких культур, хотя и содержит PDGF, указывает на наличие в ней неких факторв, снимающих вышеупомянутый специфический эффект PDGF.

Особого обсуждения требуют результаты, полученные на клетках, претерпевших "искусственое старение".

Известно, что хромосомы позвоночных оканчиваются последовательностью TTAGGG, повторенной сотни и тысячи раз (Blackburn , 1991). Хромосомы соматических клеток теряют от 50 до 200 концевых нуклеотидов при каждом клеточном делении (Harley et al., 1990). Причина этого явления определяется неполной репликацией концов хромосом из-за особенностей молекулярного механизма репликативного синтеза ДНК (Оловников , 1971). Потери концевой ДНК делают невозможной бесконечную репликацию и пролиферацию. Предполагают, что укорачивание хромосом до определенного размера индуцирует процессы клеточного старения (Allsopp et al., 1992).

В противоположность соматическим смертным клеткам, т.е. клеткам, обладающим пределом размножения in vitro, большинство иммортальных клеток, обладающих способностью к бесконечной пролиферации, содержит теломеразу — фермент, достраивающий свободные З'-концы хромосом короткими повторяющимися последовательностями (в случае человека -TTAGGG) (Kim N.W. et al., 1994). Теломераза содержит собственную РНК-матрицу, поэтому может быть отнесена к обратным транскриптазам (Greider C.W., Blackburn Е.Н., 1989). Мы предположили, что ингибиторы обратных транскриптаз (ИОТ) способны блокировать функции теломеразы в фибробластах мыши и вызывать искусственное старение клеток.

С целью проверки этого предположения были проведены опыты по выяснению влияния долговременной инкубации с ИОТ на пролиферативный потенциал клеток и на теломеразную активность (ТАК).

Известно, что AZT, карбовир и ddC превращаются в клетках млекопитающих и человека в соответствующие 5'-трифосфаты и специфически ингибируют синтез ДНК при катализе ретровирусными обратными транскриптазами, но не влияют на клеточные ДНК-полимеразы (Краевский, 1992,1994).

Параллельно с этими опытами было показано, что З'-азидо-З'-дезокситимидин-5'-трифосфат (AZT-TP) ингибирует ТАК в экстрактах из иммортапьных фибробластов мыши, что увеличивало вероятность нашего предположения (Чернов Д.Н. и др., 1996).

Известно, что в клетках мышей длины теломерных повторов могут быть от нескольких т.п.н. до ста т.п.н. (Kipling , Cooke, 1990; Starling et al., 1990). В связи с этим, ожидаемое укорачивание теломер при действии ИОТ выявить чрезвычайно трудно.

Были разработаны критерии, по которым можно было судить об угнетении функций теломеразы, независимо от измерений длины теломерных повторов;

1. ИОТ должны вызывать процесс, похожий на старение клеток in vitro. Процесс включает в себя постепенное прекращение пролиферации и специфическое изменение морфологии клеток.

2. Учитывая структуру теломерного повтора (TTAGGG), ясно, что аналоги цитидина, обладающие свойствами ИОТ, такие как 2',3'-дидезоксицитидин не должны влиять на функции теломеразы.

Мы показали, что азидотимидин и карбовир, но не дидезоксицитидин, вызывают процесс, напоминающий старение в культуре иммортальных фибробластов мыши. С течением времени пролиферация клеток замедляется, появляются крупные клетки, их количество возрастает. В конце концов, пролиферация останавливается, и неделящиеся клетки длительное время переживают в культуре. При этом образуются очень крупные клетки, по своей морфологии практически не отличающиеся от эмбриональных фибробластов мыши, претерпевших обычное старение в культуре, что отвечает первому из предложенных нами критериев.

Кроме того, было показано, что в отличие от азидотимидина и карбовира ddC не вызывает процесса, напоминающего клеточное старение, хотя и обладает токсическим действием. Эти результаты удовлетворяют второму из предложенных нами критериев. Итак, полученные данные позволяют полагать, что азидотимидин и карбовир блокируют функцию теломеразы в иммортальных фибробластах мыши.

Образовавшиеся в процессе "искусственного старения" огромные клетки обладают сильно развитой, структурированной цитоплазмой, которая, видимо, препятствует цитокинезу. Через несколько дней после отмены ИОТ в культуре появляются гигантские митотические клетки. Можно предположить, что эти митозы возникают в клетках, длительно неделившихся под влиянием ИОТ. Укорачивание теломер в этих клетках изначально привело к индукции процессов, связанных со старением. После отмены ИОТ теломераза начинала наращивать теломеры. Когда теломеры достигали некоей критической величины, в клетках запускались программы прохождения клеточного цикла, которые, видимо, не могли нормально реализоваться.

Способностью теломеразы функционировать в покоящихся клетках, по-видимому, объясняются и результаты, полученные нами при изучении действия факторов роста на клетки ЗТЗ Swiss, претерпевшие "искусственное старение".

Таким образом, выявлены существенные отличия "искусственного старения", вызванного ИОТ, от классического пролиферативного старения. В клетках, претерпевших "искусственное старение", продолжает функционировать теломераза, и длина теломерных участков, по-видимому, благодаря этому поддерживается на некотором критическом уровне. Кроме того, при

"искусственном старении" наблюдается "омоложение" культуры при переходе ее в состояние пролиферативного покоя. Полученные результаты заставляют проявлять определенную сдержанность в отношении использования ИОТ для терапии опухолей, поскольку последние обычно характеризуются достаточно высоким содержанием покоящихся клеток.

ВЫВОДЫ

1. FGF-1, PDGF-BB, сыворотка и EGF должны присутствовать в культуральной среде на протяжении практически всего пререпликативного периода для того, чтобы обеспечить максимальное вступление клеток покоящихся плотных культур в репликацию ДНК.

2. При заменах PDGF-BB на FGF-1 (и наоборот), а также сыворотки на FGF-1 (и наоборот) через 3 ч после начала пролиферативной стимуляции клетки вступают в S-фазу с не меньшей скоростью, чем при постоянной стимуляции тем фактором роста, который присутствовал в первые 3 ч. Это свидетельствует о пролиферативной эквивалентности событий, вызываемых различными факторами роста в раннем пререпликативном периоде.

3. Замена FGF-1 на сыворотку или на PDGF-BB через 12 ч после начала пролиферативной стимуляции не снижает эффективности вхождения клеток в S-период по сравнению с постоянной стимуляцией клеток FGF-1.

4. Замена сыворотки и PDGF-BB на FGF-1 после 12-часовой стимуляции приводит к резкому снижению вступления клеток в S-период. По-видимому, события, вызываемые FGF-1 в клетках, находящихся в позднем пререпликативном периоде, существенно отличаются от событий, вызываемых PDGF-BB и сывороткой, и не могут быть "состыкованы" с процессами, вызванными стимуляцией сывороткой и PDGF-BB на более ранних этапах выхода из пролиферативного покоя.

5. В отличие от PDGF-BB и сыворотки, FGF-1 не только не стимулирует вступление в S-период клеток логарифмически растущей культуры, синхронизованных путем задержки в метафазе, но и подавляет это вступление.

6. Необходимость длительной стимуляции клеток FGF-1 и сывороткой для максимального пролиферативного эффекта показана как для плотных, так и для редких культур ЗТЗ Swiss. Вместе с тем, обнаружено, что PDGF-BB, действуя на редкие культуры, вызывает эффективное вступление клеток в S-фазу даже при 3-х часовой стимуляции.

7. Длительное культивирование клеток ЗТЗ Swiss в присутствии ингибиторов обратных транскриптаз азидотимидина и карбовира, подавляющих функцию теломеразы, вызывает процесс, напоминающий клеточное старение и выражающийся в почти полном прекращении роста клеток и приобретении ими фенотипа, характерного для стареющих фибробластов. При отмыве ингибиторов клетки вновь вступают в пролиферацию, причем во многих из митотических клеток обнаруживаются полиплоидные наборы хромосом.

8. Стимуляция покоящихся клеток, претерпевших "искусственное старение", добавлением сыворотки, FGF-1 и PDGF-BB приводит к столь же выраженному вступлению в S-период, как и при стимуляции нормальных клеток. При этом сохраняется необходимость в длительной стимуляции для достижения максимального синтеза ДНК. Таким образом, искусственное подавление активности теломеразы, по-видимому, не влияет на рецепцию факторов роста и пререпликативные процессы.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Чернов Д.Н., Егоров Е.Е., Акимов С.С. Теломеразная активность клеток мыши при спонтанной трансформации. //Докл. Акад. Наук, 1996, Т. 349, С. 121-123.

2. Yegorov Y.E., Chernov D.N., Akimov S.S., Bolsheva N.L., Kraevsky A.A., Zelenin A.V. Reverse transkriptase inhibitors supress telomerase function and induce senescence-like process in cultured mouse fibrobasts. // FEBS Letters, 1996, V. 389, P. 115-118.

3. Yegorov Y.E., Chernov D.N., Akimov S.S., Zelenin A.V. Reverse transcriptase inhibitors supress telomerase activity and induce senescence-like process in cultured mouse fibrobasts. II Molecular Biology of the Cell, 1996, 7s, 534a.

4. Егоров E.E., Чернов Д.Н., Акимов С.С., Гордеев С.А. Ингибиторы теломеразы подавляют рост опухолевых клеток. II Материалы I съезда онкологов стран СНГ (Москва, 3-6 декабря 1996 г.), 1996, Ч. I, С. 190.

5. Акимов С.С., МасиагТ., Прудовский И.А. Взаимозаменяемость факторов роста в G-1 периоде клеточного цикла. //Тезисы докладов и сообщений, представленных на XII Всероссийском симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра, Санкт-Петербург, 22-24 октября 1996 г.; Цитология, 1997, Т. 39, №1, С. 30.

6. Егоров Е.Е., Чернов Д.Н., Акимов С.С., Большева Н.Л. Ингибиторы обратной транскриптазы блокируют функцию теломеразы в трансформированных фибробластах мыши. //Тезисы докладов и сообщений, представленных на XII Всероссийском симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра, Санкт-Петербург, 22-24 октября 1996 г.; Цитология, 1997, Т. 39, № 1, С. 57.

7. Егоров Е.Е., Чернов Д.Н., Акимов С.С., Большева Н.Л., А.А.Краевский, Зеленин A.B. Действие ингибиторов обратных транскриптаз на функцию теломеразы в иммортальных фибробластах мыши. II Молекулярная биология, 1997, Т. 31, № 1, С. 130-136.

8. Егоров Е.Е., Чернов Д.Н., Акимов С.С., Ахмалишева А.Х., Смирнова Ю.Б., Шинкарев Д.Б., Семенова И.В., Егорова И.Н., Зеленин A.B. Подавление функции теломеразы аналогами нуклеозидов. // Биохимия, 1997, Т. 62, №11, С. 1524-1525.

9. Акимов С.С., МасиагТ., Зеленин A.B., Капник Е.М., Попов К.В., Прудовский И.А. Взаимозаменяемость факторов роста в G0-G1 периоде клеточного цикла. II Докл. Акад. Наук, 1998 (в печати).