Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь между внутриклеточным содержаниемNAD и интенсивностью репарации ДНК, индуцированной N-метил-N-нитрозомочевиной в печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь между внутриклеточным содержаниемNAD и интенсивностью репарации ДНК, индуцированной N-метил-N-нитрозомочевиной в печени крыс"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУГ Б10Х1МЙ ¡мет О.В. ПАЛЛАД1НА

РГ6 ол 1 о ФЕВ 1997

На правах рукопису

ВАСИЛЬЕВА Светлана Михайлтна

Взаемозв 'язок м'1Ж внутр'гшньокл'пинним вмятом МАО та /нтенсившстю репарацп ДНК, /ндуковано7 Ы-метил-Ы-штрозосечовиною в печшц§ щур} в

03.00.04. - БюхЫя

Автореферат

дисертацП на здобуття наукового ступеня кандидата бюлоп'чних наук

КиТв-1997

Дисерт&хцею е рукогшс

Робота викенаиа. у вхддгях Öiexiwif кофермент1в 1нституту бхоххшт iu. О.В.Далладгна Нацхонально? академ!т наук Укра¥ни

Науковий кертвнкк -

доктор бхологгчних наук, чл.-кор. ЙШ Укратни ДОНЧЕШО Георгхй Викторович

Офхщйн! опонэнти;

доктор 6iooiori4HHX наук, професор

СТАРОДУБ Никола Федорович

кандидат 61олог1чних наук ПРОТАС Олехсандр Федорович

Провхдка орг£Нгзац!Я - Нацхенадькяй медичний унхвер-

ситет хм. 0.0. Богоиольця

Захист вЦбудеться d1/ _ 1997 рвку 0 I4oo гедин4

на засхданнг спещалгзованог гченот ради Д 01.84.01 в 1нститут1 6ioxiuxf iu. О.В.Еадладша HAH УкраТни за адресов: 252601, Китв- .30, вуд. Леонговича, 9.

3 дисерг&цгею можна ознайомигись у бгбл'ютещ 2нсгитуту öioxiuxf iu. О.В.Палладхна HAH Укратни

Автореферат разгсланий с?/^1997 року.

Вчений секретар уу л

сшщхалхзовано? ради Кхрсенко

ЗАГМЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА. РОЮТЙ

Актуальнгсть проблема. В осташий час пристальна увага дос-лгдникхв привертаеться до вивчення мехатзмхв дхх негативних фак-ropiB навколишнього середовща на орган:зм рослин, тварин та лю-дини. Резистентность клхтин до екзогенного впливу рхзноманхтнох природи та формування мутащй обумовлеН1 функщонуванням репара-цхйного процесу, який активуегься при дхх радхащ? та х1м!чних ре-човин, i тому, одшею хэ антуальних проблем функционально'! 6ioxi-Mii в питания пошуку фалторгв регуляц11 системи репаращх.

У зв"язку з цкм, значний хнтерес являшь собою дослхдкення молекулярно5 природи взаемодх? внутрхшньоклхтикнох системи вхднов-лення ДНК з бгологхчно активними сполуками ендогекного поход&ен-ня. Безперечна перевага при цьому выводиться вхтамхнам, серед яких найбгльш широко вивчався вплив на процес репаращi вгтамхну РР та його активних поххдких. Особлива роль у них дослхдкеннях налетать had . Де пов"язано з тиы, що численш експерименти по вивченню ефективностх вгдновлэння клгтинних культур пхсля оброб-ки радхо- та хеыхотропниыи факторами показали ¿нгибування окремих етапгв penapaqii на фонх знияення кл1тинного piBHfl nad - Так, E.J.Jacobson та G.Narasimhan /1379, 1930/ виявили, що в кл1ти-нах ЗТЗ зниження BMicry nad гпсля обробки метил-Н1тро-Н1трозогу-анхдином супроводжувалось зменшенням показника вкживання клхтин; проте, пвдвкщення вмхсту nad на 80-90$ сприяло ix нормальному зростанню i активащх ДНК-репарашЙног системи.

в.N.Durkaoz т& cni вроб iтниками /1980-1932/ було встановлено, що зниження ендогенного вм1сту nad фхбробластхв мишн при оброб-цх клгтин N-метил- н -нгтрозосечовинов або диметилсульфатом приводить до такого високого рхвня кл1гинн01 загибелх, який не дося-гався навхть при опромхненн1 дих клхтин. Однак, додавання hikothh-амхду або його аналогiв у середовище зростання культури клхтин значно стимулювало процес penapaniг ДНК шляхом шдвищення рхвня

пвзаплановоге синтезу та збгльаенжя ефективносп лхНрування новях синтезоввнкх ДХДЯНОК полхиуклеотнду / Althaus F., 1930; Bohr v., 1981/. За думкою Berger К.А. /1985/ Т4 Carson D.A. /1986/ сане виснаяення пулу nad е причиною з&гибелг кл1тин i вгдсутиосг1 репарацхйно" здатностг за умов fx зайгодження мутагенами або канцерогенами.

Таким чшои, кожна припустнти, що вхдверташш виснажешш клхтннного had може служите ключсвим фактором попередження загн-белг кл1Ткн внасл1ДОК Д1т пошкоджупчюс агеит1в.

Не та робота. 3 ыегея пояснения функционально1? ролх nad в процес1 репарахцт ДНК вйБчалй вплкв pi3Ksro гыхсту nad та деякнх особливостей його ыетабол13ыу на ефективнхсть вгдноелеюш пош-коднень ДНК, ¿ндукованих м-ыегил-к-нхтрозосечовинсю /ШС/ в пе-Ч1НЦ1 щурхв. Бдаовхдыо до мети робогк булн поставлен! Taici задачх:

1. Бивчення динаыгки 1ндукованот репаращт ДЕШ пэчхнки щургв за умов рхзяого вмхсгу had в органхзкц тварин.

2. Дослгдження вмхсгу i обм1Ну mad в процесг репаращ? поткоджень ДНК, гндукованих ЫНС.

3. Бивчення енергетичного стану клгтин печхнки щурхв в процесх хндукованот репаращт ДНК.

Наумова новизна. Вперше на паиинному pÎBHi було показано регулятэрний ефект ендогенного had на 1нтенсивн1сть penapacir iндукованих пэшкодкень ДНК.

Дослхджения особливостей обигну had та еиергегнчного стану клхтин печхнки щурхв за умов репарацхт ДНК виявили можли-вхсть i снування в1дновног0 синтезу шридиннунлеотиду при хитен-сиф1кац1т метаболхзму nad додатковим введениям тваринам вхта-м1ну PP.

Практичне значения. Одержанх нами данг про н&явнхсть прямого зв"язку ихж ефективнгстю репаращйнкх процесса та пхдвищении /у фгзгологгчних межах/ вмхстом had в печгтц njypiB служить нау-ково-теоретичним обгрунтуванням застосування лхкарських препара-riB, як1 ыгстять В1тамгн РР або нгкотинащд, у якостг xeuio- i радхопротекторгв та анишутаген1в.

Апробахця роботи. Результата дослщкень та основнх висновкя були представлен! на конференщт "Проблемы микробного синтеза витаминов а их производных" /Ташкент, 1990/; X Загальносовзноку сиипозiyni "Структура и функции клеточного ядра" /Гродно, 1990/ та Загазьнвсовзн1й коиференцхт "Кхкническая витаминология" /Москва, 1992/.

Публгкахцт. За текос днсергацх" опублхковано 7 po6ir.

Структура та об"еи роботи. Днсергацхя складаеться 13 вступу, огляду дхтер&турн /3 роздхли/, опису методхв досддаення /I роз-д1л/, викдаду та обговорзняя одеряаних результатов /2 роздхлн/, заключно" частнни, вксновкхв та керзлгку вякоркстано" Л1тератури /243 джерела, хз яхих 39 В1тчизняних та 204 закордонних/. Робота аикладева на 136 сторшках ыезинопнсного тексту, хлвстрована 15 малюнками та 7 таблицами.

Особистий внссок дисертанта. Експерииентальна часгпна викону-валась дисертангом самост1йио, вшсладеиня одеряаних результатов в дисертацх" та друкованнх матер1алах обговерювалось з науковим керхЕНИком.

НЕТОДИ ДОСДЩЕННЯ

Досл1Дн проводили на щурах-самцях касою 120-150 г. Для сти-ыуляц1т б1осиитезу nad тваринаы одноразово вводили внутрхшпьо-черевинно розчин нхкотинамгду /nW у доз1 500 мг/кг наса Т1ла за 3 годинн до декапхтацх". При цьому спостерхгалось майже три-

разове зб1льшення вмхсту nad в печ1нщ. Контрольна rpyni вводили ф1зрозчш.

Для iHflyKqiï процесу penapaqix ДНК подрхбнену тканину печ1Н-ки обробляли N-метил-N -нхтрозосечовиною /100 хшг мутагену на I г тканини/ та хнкубували в середовивд Хенкса протягом 30 хв при 37° С / Skidmore Ch.j. е,а., 1979/. Через kojkhî 5 хв хнкубацхг тканину печ1нки вилучапи хз 1нкубащйного середовища, швидко охо-лоджували i використовували для одержакня клхтинних ядер або для хнших експериментальних процедур.

Вмхст nad визкачали в хлоратних екстрактах тканини печхнки спектрофотоыетрично при специфхчному його вхдновлешп в реакщях окиснення етанолу до ацетаяьдегхду / Kiingenberg м. , 1963/. У хлоратних екстрактах визначали вмхст hiкотинам:ду методом тонко-шаровох хроматограф^ на платхвках "siiufoi " uv 254 в еисте-мх: н-бутанол~1зоащловий спирт-вода /8:2:1/.

Визначення kadh в тканши печшки проводили в лужному екстракт1 при окисненнг пхридиннуклеотиду в процесх перетворення nipyBaTy у лактат /Kiingenberg M. , 1963/.

Про к1лькхсгь аденозинфосфатхв мали уявлення по к1лькост1 nadh , окисненоыу у сполучених реакцхях в1дновлення 1,3-дифосфо-гл1цериново£ кислоги та ферментативного утворення шрувату хз фосфоенолпхрувату /Bûcher Th. , Adam H. > 1963/.

Визначення BMicry бглка ядер проводили за методом Bradford к.м. /1976/; для визначення вкисту ДНК використовували метод Burton К.Р. /1956/.

Про НАВ-глхкогхдролазну актившсть свхдчила кхлыйеть нх-котинмхду, елюйованого з колонки з Дауексом 1x2 /200-400 меш, М-форка/ за методом okayama н. е.а. /1980/ niсля проведения ре-акщг активац11 глхкоггдролаз.

Для визначення nad -шрофосфорилазнох активностх алхквоти

ядер, одержаних за катодом Penniai к. е.а. У1964/ хнкубували 20 хв при 37° С в cyMini, яка шстила 0,25 М глхцил-глхциновий буфер /рН 7,4/; 0,5 мкМ А1Р; 0,3 мкМ нгкотинамгдмононуклеотид; 30 мкМ нгкотинамад; 1,5 мкМ MgCi2 га I мг бхлку у загальному об"емг 0,8 мл. Про значения nad-щрофосфорилазноз; активностх мали уявлення ПО КХЛЬКОСТ! nad, ЯКИЙ уТВОриВСЯ ВНаСЛХДОК ХНКубаЩI / Atkinson

m.R. е.а., 1961/.

Визначення ДНК-полхмеразно1 js активностх проводили при imty-бащт ядер печхнни в буфер:, який вмхщував 0,05 М грис-нсь /рН 7,5/; 0,015 М kcl; 0,008 KgCi2; 0,002 К ЕДТА; 18% глхцерин; 0,0001 М pmsf; 0,001 М дигхотрехгол; 0,04 Ы гхдроксисечовину; 0,015 мМ АТР та 0,030 мМ деоксинуклеозидгрифосфати, один is яких - мхчений

о

Н. Кглькхсть включено'х в ДНК радхоактивностх визначала рхвень ДНК-пол1меразно1 jb активностг /Barger n.a. е.а., 1980/.

Шльк1сть одноланцвгових роэривгв ДНК вимхрювали шляхом визначення спхввхдношення к1лькостг однонитчастих та двонитчастих фрагмент1в ДНК роздоених на гхдрокеиапатитх /3acyxiHa Г.Д. та шп., 1987/.

Для визначення включено? радгоактивно! miтки в окремх ricTo-новх фракц11 водн1 розчини сумарних ricTOHiB, одержаних за методом Ord M.G. та Stocken L. А. /1977/ 13 ОСЭДу, уТВОреНОГО П1СЛЯ хнкубащ'г ядер в систем!, що вм1щувала /Ado-u-14c /nad; 0,1 М трис- нсь/рН 8,0/; 40 мМ kcl; 10 мМ Mgci2 ; 2 мМ дитхотрех'тол та ДНК /4 мг на мл/, роздхляли елекгрофоретично у градхентх ПААГ /Кавецький P.S., 1976/.

Про полх/АБРР,/пол1керазну активн1сть мали увлення по к:ль-kocti зв"язаного з ядерними б:хлкаш абрк -фрагменту молекула nad за умов алтивад11 ферменту / stone p.r. е.а., 1977/.

Зм1ну вхльнох eHeprii ощнзовали через змхну електроххьично-го потенциалу0J/•> визначеного за методом / Williams V.R. 1973/.

Експериментальш дат обробляли методом варгацгйног статистики.

основа! РЕЗУЛЬТАТИ ДОСИЩЕНЬ

Ранхше, у В1ддхлх 6ioxinii коферментхв 1иституту 6ioxiMii im. О.В.Палладша HAH Укра5£ни було показано, що триразове в по-piBHHHHi з контролем збхлшення вмхсту nad в печхнцх i^ypiß слри-яе зниженню кхлькоетх кислоторозчинного материалу ДНК за умов ih~ кубагцi хроматину печхнки з ДНКазою I /Ыулявко Н.О. та шв., 1990/. При цьому, ДНК тварин, у яких внутрхшньоклхтинний bmict nad був знижений на 4С$ вхд контроля енеслгдок ix утримання на РР-дефгцитному ращок!, виявляла пхдвищену чутливхсть до розщеп-лоючо! flii ферменту. Щ експериыенти виявили пряыу залежнхсть м1ж внутршньоюптинним еы1ст0ы nad та чутливгстю ДНК до д1х ДНКази I.

Однак, як В1дош, антаващя мехашзьгу ексцизхйно! репарацхх ДНК, що викликаеться моди$1кащею функщональних труп азотистих основ радхотропними та хемхомутагенниш факторами, супроводжуеть-ся виснаяеншш внугрхшньохлхтинного пулу nad, Вздвертання заги-бельного для кл1тини зниження nad у процесх вздновлення ДНК ыожна досягти шляхом дослхдження його функщональнох рол! в систем! penapaqi i. 3 вдев ыетою нами було виявлено вэаемозв"яэок mix динамхкою репарацН ДНК та bmictom внутргшньоклхтинного nad . Для дього, ми використали експериментальну модель, яка суьйщувала одночасне проходасення npoqeciB репаращх ДНК та общ ну nad .

Так, печшку qypiB, яким попередньо вводили нхкотинамд /+ ЫАт/ або ф1зрозчин /контроль/, обробляли ЫНС, як зазначено у роздхлх "МАТЕР1АДИ ТА МЕТОДИ", а потт, гнкубували у середовивц Хенкса, найбхльш оптимальному для вщновлення клхтин пхеля xi-М1чного шоку.

Оскгльки, встановлено, цо нхкотинамхд або його аналоги здатно впливаги на ефективность позапланового синтезу та логору-вання НОВИХ Д1ЛЯНОК ДНК / Berger N.A. е.а., 1980; Kjellen е. е.а., 1936/, стан репарацгйно! системи у нашому експериментх оцонввали через р1вень ДНК-пол:меразно? р активностх та колыпсть однолан-цюгових розрив1в ДНК у процесх вдаовлення.

Як видно Ï3 рис. I, додаткове введения нхкотинамоду значно подвищуе ДНК-пол1меразну jb активность, особливо, в nepoi 5 хв репаращ ï.

Про пк1сть репарацоï однолангроговюс розривхв сводчить коль-К1сть однонитчастих фрагментов ДНК ni с ля закхнчення експерименту /Рис. 2/; проте, пхдвищення кхлькост1 однонитчастих фрагментов через 5 хвилин посля обробки тканини печонки мутагеном е харак-

L.

S \ œ

I

о

л

ч о s s

5 15 25

Час хнкубавдх, хв

Рис. I. ДНК-полхмеразна /JJ/ активность у процесо penapauiï

пошкоджень ДНК, хццукованих МНС: I. + МНС; 2. /+NAm / + + МНС

©

2 &

£

X к &« : о :

СЙ I

¡У Е"

к X О Ж ЕС О

ъ*' _

5 15 25

Час гнкубащх, хв

Рис. 2. Динамхка накопичення однонитчастих фрагментов ДНК у процес! 1нкубац11 тканини печхнки щур1в в середовивд Хенкса: I. Контроль; 2. + наш ; 3. + ШС; 4. /+КАт / + + МНС

терною ознакою активащ!* процесу репаравд1 /лтИ 3 та 4/. За цих умов через 25 хв хнкубацх! тканини в печгнцх контрольних тварин к1льк1сть однонитчастих фрагментов на 32% леревищуе виходне значения, в той час, як в печшц 1цурхв зх стимульованим бхосин-тезом мас одноланшгов1 розриви ДНК водновились практично пов-ностю.

Отже, вивчення динамки репарацо г пошкодаень ДНК на наогй енспериментальной моделх пхдтверджуе результати, якх були одержан! ониими дослхдниками, г показуе, що додаткове введения щурам нокотинаыоду якхено змхнюе фуккцхонування основних етапхв вгдновлення ДНК.

Доелодкення Бнутрганьокл:тинного вмхету нгк0?инашдаден1н-

15 25

Час гнкубацгг, хв

Рис. 3. Змхна внутргшньоклггинного вмхсту nad печхнки щурхв у проце-ci гнкубацгг тканини в середовищх Хенкса при 37° С: I. Контроль; 2. + nam; 3. + ШС; 4. /+ная / + + ШС

динуклеотиду за умов експерименту виявило /Рис. 3/, що у процесг репарац15 виххдне збхлызення ендогенного вмхсту nad сприяе збе-реяенню його пулу п:гдвкщенкм на 33? поргвняно з контролем протя-гом 20 хв 1нкубац11 тканини печ1Нки. Однак, в першх 5 хв хнкуба-ц1х тканини з шдвищеним emictom внутргшьоклг тинного nad спостер1гаеться стрхмке зниження його пулу, яке за умов penapaijii е бхльш хнтенсивним, hih у тканин:, що мутагеном не оброблялась.

Пояснениям до такого значного зникення пулу нгкотинамгд-аденхндинуклеотиду може послужит« припущення про активацхю nad -глхкогхдролаэнох активное^ за умов пгдвкщеного вмхсту коферменту. Але, вимхряна нами за умов експерименту mad -глхкогхдродазна активн1сть достовгрно не змхнювалась як wis дослхдом i контролем,

так I у процесх репаравдх ДНК. Враховуочи це, ми припустили, що в перш1 5 хв рецарацН ыаб коже хнтенсивно метаболхзуватись у мхсцях його активного використання, тобто у процесх будування по-лхмеру АО?-рибози у ядо1. Оскхльки, основними акцепторами лолх-/лор/рибози е гхстони, для оцхнки рхвня АРР-рибозилювання за умов експерименту ми визначали кхлыпсть вклтених у сукарн1 Жетонов! фракщх мгчених /^С/ по аденшу апрк-залишкхв моле кули нхкотинамхдаденгндинуклеотиду /Табл. I/.

ТАБДИЦЯ I

ШТЕНСЙВНЮТЬ ПОЛt/ADF /РИБОЗИЛЮВАШЯ В ПЕЧИЩ [ЦУР1В ПРИ ДЩВЩЕНОЫУ Ш1СГ1 MAD В 0РГАН13М1 ТВАРИН В ПР0ЦЕС1 1ВДУК0ВАН01 РЕЛАРАЦП ДНК / И + т; л=5 /

Час хнкуб. з МНС Включения /I4CAad в гхсгони, хмп/хв/мг бхлку Полх/аор/рибозилювання rictohib* HMO ЛЬ NAD /иг бхлку

контроль + NAm контроль +■ NAm

0 27800+200 19500+300 4,5+0,12 11,06+0,10 Р 0,001

5 34350+350 44100+350 5,57+0,17 12,15+0,15 Р 0,001

10 66200+400 74350+200 10,73+0,15 14,94+0,20 Р 0,001

15 93600+300 126050+500 15,17+0,16 31,66+0,28 Р 0,001

20 133100+250 84600+350 21,57+0,17 20,29+0,20 Р 0,02

25 96800+300 143330+300 15,69+0,15 23,23+0,30 Р 0.001

ферментом, що присутщй в печхнщ тварин. Для идрахунку розведен-ня використовували коефхциент, що дорхвнюе вхдношенню вмхета као в печ!нц1 досладних тварин до його вм1сту у контрольной тканинх.

Як видно гз табляцх, 6iля ?0$& вгд загальнох кглькосгх nad використанох в печгтц тварин з пхдвищеним bmïctom коферменту, в nepmi 15 хв в1дновлення ДНК ыегаболхзуетьея системою будування adp —рибози на ricroHax.

Разом з тим, вадомо, що активацгя полî/adp/рибозилювання внаслхдок утворення розривхв полхнуклеотиду приводить до швидко1 витрати внутрхшньоклхтинного фонду nad/ Alvarez-Gonzalez R. е.а., 1986; stubberfieid c.r., 1988/, Однак, як видно хз рис. 3, за умов репаращ ï при додатковому введегаи щурам кхкоткнавдду bmïct nad в печгнцх тварин дослхднох групи навгть в останнх хвилини iH-кубац11 достов1рно не знижувався вхдносно контролю /лхН1я 4/. Крхм того, задумкою ch.J.skidnore та ÏK3. /1979/, ЯК1 Бивчали 3MïHy Kfliтинного BMicTy nad при дхх ^-опромшення та ЫНС на Л1М-фоцити людини, ферменти, що специфхчно катаболхзують nad не е причиною його критичного для клгтини виснаження. Тому, логхчно було вважати, що, мояливо, нам вдалось уникнути виснаження внут-рхшньокл1тинного nad завдякн 1снуванню деяких оеобливостей обмхну шридиннуклеотиду при функщонуванш Hanoï експериментальнох модель

Для овднки Mipn деградацг ï nad за умов нааюго експерименгу МИ ВИКОрИСТОВуВаЛИ ПОКаЗНИК ЗМ1НИ кл1тинного BMÏCTy одного хз ос-

новних метабол1Г1в nad - нхкотинамхду. Як видно ia рис. 4, тхльки в печ1НЦ1 тварин з додатковим введениям нхкотинам1ду у npoqeci ре-парацхх спостерхгаеться знкження його ^лгтинного BMicry /лхнхя 4/, хоча, саме в печхнцх nieï групи тварин вмхет nad повинен бути максимальниы за рахунок найбхльи гнтенсивного катаболгзму nad системою пол1/аер /рибозилювання. При цьому, можна вважати, що деяка к1льк1сть нхкотинамду може виходити Ï3 кл1тин, але, оскхль-ки, використаним нами методом тонкошаровох хроматограф^ нхнотин-амхд у середовищ 1нкубацх1 виявленим не був, ми припустили, що

к х к

Ь5 EH

К

Ch «

к

I—( .w

3"

\ © и

л ч о 2 X

5 15 25

Чае хнкубацхг, хв

Рис. 4, Вмхст нгкогинащду в печ1нц1 1цурхв: I. Контроль; 2. + nta; 3. + МНС; 4. /+ наш/ +. МНС

BiH ыоже приймати участь у вхдновному синтез! nad .

Бизначення активностх ключового ферменту системи бхосинтезу nad - nad-пхрофосфорилази - показало, що характер змхни фермен-тативноЗс активноcti в печхнцх щургв з пхдвищеним bmictom nad в процесг penapaijir е зворотньопропоршйним змхнх вьасту hikotkh-ащду в вдй експериментальнхй rpyni тварин /Рис. 5, лшхя 4/. А, яюцо зниження внутргиньокл:тинного вмхсту нхкатинащду супро-водкуеться гидвшценням р1вня основного nad -синтезуючого ферменту, це дозволяв зробити висновок про хснування за умов репаращх В1ДНОВНОГО синтезу nad в печгнцх щурхв з його П1ДВИЩеНИМ bmictow.

Однак, для того, щоб вхдновний синтез пулу nad став ыожли-вим, необххдна наявшсть в кл1гинх достатньо високого енергетич-ного потенщалу, а, як показано багатьма дослдаикаки / Hunting d.

/N

л ег о

1,0

0

15

25

5

Час хикубавд?, хв

Рис. 5. Дшамхка nad-пгрофосфорклазноi актнвноетх пзчгнки щурхв за умов експерименту: 1. Контроль; 2. + NAm; 3. + МНС; 4. /+ "Am/ + ШС

1985; Carson d.a. , 1986/, при експозищг тканини або окремих клх-тинних культур з токсичнимн агентами, що призводять до зменшення ендогекного вмхсту nad, невхдступно вэдбуваеться зниженяя piвня АТР.

За умов нашого експерименту також спостерхгаетвся'зкиження pi вня А1Р, яке, однак, не корелюе зх зниженням вмхсту nad/Рис. 3 та 6/; звертае на себе увагу той факт, що за умов penapaqii, при-достатньо висок1й активности прсцесхв дэградащг nad в цечхнщ дослхдних тварин значення BMicTy АТР навгть перебхльшуе контрольний рхвень протягом всього часу хнкубацхЗ. 3 метою пояснения причин зберхгання високого piBHH АТР за умов penapaqii пошкоджень ДНК, хндукованих МНС, в печхнвд з активованим б1осинтезом nad

були дослхдженх б1оенергетичн1 особливост! кл!тин, оскхльки в!ДОмо,

к ж к

к

frl

<

л n о s x

к w я

•w

ГГ

tu С

15 25

Час iHKy6aqiit хв

Рис. 6. Bmict ATP в тканин! печшки щур1в: I. Контроль; 2. + nam ; 3. + МНС; 4. /+nam / + ШС

ТАБЩЯ 2

3MIHA BlJIbHOl ЕНЕРГИ СИСТЕШ СУБСТРАТНОГО ФОСФОРИЛЮВАННЙ АДЕН03ШШСМТ1В Ю11ТШ ПЕЧ1Ш ЩР1В ЗА УМОВ 1ВДУКОВАНО! РЕПА-РАД1Г ДНК ПРИ Р13Н0МУ BMICT1 В1ТАЫ1НУ РР В 0РГАН13М1 ТВАРИН

«О

/ккад х 10° на I г тканини леч1Нки/

Час :Ёнкубащ1, хв Контроль + nam + МНС / + nam / + + МНС

0 5,038 5,184 5,089 5,184

5 3,828 5,591 4,953 4,945

10 5,759 5,735 5,240 5,687

15 6,803 5,416 5,862 5,655

20 6,309 4,275 5,846 5,487

25 5,344 5,304 5,783 5,910

що ендогенний bmict nad коредюе з ялхтинниы рхвнем АТР- Окрim того, показано, що за умов д1т на клгтину $13Ико-хгм1чннх факторiв му-тагеннох природи вгдбуваеться змхна сгруктурно-функцгональног ак-ruBHocTi багатьох ферментгв, в тоьу ряд1 i ферменпв глхколхзу /Чайка Я.П., Сухомлинов Б.Ф. та ihid. , 1986; 1993/. Оскгльки, моле-кулярний механ1эм взаемозв"язку процасу репарацхг ДНК з системой гл1Кол1зу не е встановденим, у наступшй cepii експернментхв нами було дослгдясено зм1ну енергетичного ргвня основной ланки глгколх-тичного процесу, яка пов"язана зх змхною клхтинного вмхсту nad , а саме: системоп субстратного фосфорилювання аденозинфосфатгв.

Виходячи гз того, що система субстратного фосфорилювання нас щкавила виключно з точки зору здатност1 скнтезувати макроергхчнх сполуки за умов напого-експерименту, для загальн01 оцшки Тх стану ми використовували сщвв1дн0шення, запропоноване для цхех мети Broda е. /1975/:

/атр/ + vg /adp/

/аир /+/ ads' +Ä7P / яке виражае мгру запасу вгльно? eneprii системи субстратного фосфорилювання аденозинфосфаггв у процесх глхколхзу.

Втхм, як видно хз табл. 2, Hi обробка печхнки ¡мутагеном, нх наявн1сть в клхтинах пдаиценого BMicry nad не викликають змхни енергетичного балансу системи обм1Ну аденозинфосфатiв. Проте вх-домо, що в органхзмх щургв /а тахож i людини/ за один метаболхчний цикл за рахунок перетворення I моля AIP утворветься в середньоыу 1,54 х I04 ккал в1льнох eHeprii на I г живо? тканини /Скулачьов В.П., 1989/. Оскхлыси, наведенх у табл. 2 обчислення вхдповхдавть енергетичному потешцалу лише системи обмхну аденозинфосфатхв, одержанх нами данх е надто низькими для того, щоб забезпечити енергхею метаболхчнх системи клхтини у процесх вхдновлення ДНК за

умов експерименту.

Однак, маючи на увазг той факт, ¡цо основнх запаси енергхг в кдхтин! зберхгаються у формг субстратхв, здагнях до бродгння, ди-хання або гвдролгзу, ми припустили, що за умов рапарацхх при хн-тенсивному використаннх внутр1Шньокл1тинно1 енергхх П1двищуеться швидк!сть обертання процесхв обыхну цих високоенергетичних сполук, внаслхдок чого утворюегься певна к:лькхсть В1льн01 енерггх. Для того, щоб переконатись у ыожливостх такого накопичення енергетич-ного запасу, за умов експерименту було проведено виэначення загаль-Н01 к1лькост1 вхльно1 енергх'1 кд1тин печ1нки шляхом викхрювалня електрох1Ы1чного потенцха^ сгацхонарнох з точки зору електроххмхх системи, яка являе собой нейтрал¿зовакий до рН 7,0 екстракт гкани-ни печшки при t=250C. Результати, що були одержан! у мВ та пере-рахованх за системою 51 у ккал на I г тканини печхнки, наведем на Рис. 7.

к

X

я а! К е<

сэ о

5 К X •н

V

о с

ь; и

26

22 18

14

ю у-

б =

2

0

д / ^

5

15 25 Час хнкубацхх, хв

Рис. 7. Загальне значения вхдьно? енергхх в клхтинах печхнки

ищив: I. Контроль; 2. + май; 3. + МНС; 4. /+ ИАт/ + ЫНС

Як можна побачити Í3 рисунку, за умов репаращ? в печхнцг тварин з щдвищеним bmictom had протягом всього часу iHKy6aqix спостерхгаеться значив зростання вхлъно'х eneprií з максимальним значениям на 10-ту хвилину, яке у 2,5 рази перевюцуе значения в1льно1 eHeprií на цей час в печхнщ дослхдних тварин, що мутагеном не оброблялась.

0ск1льки такий енергетичний потенщал був виявлений за умов репаравд? лише в кл i тинах д0сл1дних тварин, а в печгнщ контроль-них ТЕарин зничення вхльно? енергх! протягом вщювкого nsp i оду майже не змхнювалось, пояснения його виникнення було вхднесене до факту наяБНосгг в печхнцг дослхдних тварин надлишкового вмхсту Nad ; так, за уыов хндукованох репарацГх утворен1 розриви ДНК активупть полх/АОрЕ/пол1меразу, внаслхдок чого 1нтенсифхкуеться процес де град ал ix nad , який викорисговуеться для будування полх-меру adp—рибози. Не виклотено, що розрив енергоемкого шридин-рибозильного зв"язку з вив1льненням значнох к1лькост1 eHeprií зда-тен у деяк1й Mipi зняти критичну напругу в oíthhí, яка була вик-ликана енергетичною несгачею. Проте, вивхльнення eHeprií ыоже вхд-буватись i за рахунок спонтанного гхдролхзу nad .

Щдставою для такого припущення послужили деяк1 роботи, як i обговорювали ыожлив1сть використання клхтиною eHeprií пхридин-рибозильного зв"язку. Так, Nishizuka y. та сшвроб. /1970/ висуну-ли г|потезу, яка выводить nad роль енергетичного замхсника, а П13Н1Ше, колектив ДОСЛ1ДНИК1В ПХД керуванням Lennon м.в. /1976/ одержали пхдтвердження цхех гinoresи при вивченн1 впливу nad на вхльну бхлок-синтезушу систему л1зованих ретикулоцитхв кроля.

Враховуочи те, що перход обертання процесу будування та де-градащ? пол1/АоР/рибози значно менший, нхж перход синтезу макро-epri4Horo аденозинфосфату i становить близько 1500 обертгв на до-бу проти 1000 0берТ1В обмхну AIP та ADP / Alvarez-Gonzalez R.

1989; Sei-ichi т. 1989/, а за умов репаравдг метаболхзм nojii/ADP/ рибози прискориеться, накопичення eneprii пхридин-рибозильного зв"язку вхдбуваеться штенсивнше, i тому ri кглькхсть в печгнцг дослхдних тварин злачно бхлыза вхд рхвня В1льн01 eHeprix системи субстратного фоефорияювання аденозинфосфат1в.

Може бути, що наявнхсть такого значного енергегичного потен-вдалу в кл1тинах печхнки дослхдних тварин дозволяв у процесх репа-рацхх використовувати його для синтезу nad j зберхгае охтинний фовд АТР.

Отже, данх, якл було одержано в цхй роботх, показують, що клхтинний вмхст nad е регуляторним фактором процесу penapanii пошкоджень ДНК, 1ндукованих МНС. Молекулярний механхзм Д11 nad реалхзуеться через його участь у систем будування лолх/ш? /рибози, внаслхдох чого вив1льнясться значна кхлькхсть eneprii пхридин-рибозильного зв"язку, яка приймае участь у вхдновноыу синтезi пулу nad хз ыетаболЁгхв, що знаходяться у клхтинх.

Таким чином, активацхя бхоскнтезу nad в органхзм1 щурхв шляхом введения гваринам вхтам1ну РР здатна не тхльки пхдвищити ефек-тивнхсть процесу penapanii в neyimii гварин, але i забезпечити вхдновлення nad з подальшим вхдвертанням зниження його ендогенного

bmicty.

ВИСНОВКИ

1. Додаткове введення щурам н1котинамхду у дозх 500 мг на кг маси тхла тварин за 3 години до 1ндукщ г репаращйного процесу

в ne4iHqi щур1в здатне йдвицити ефективнхсть вхдновлення ДНК, внаслхдок чого знижуетьея к1лькхсть одноланцюгових розривхв пол1-нуклеотиду.

2. Активацхя бхосинтезу nad в пэчппц qypib додагковим введениям тваринаы И1К0ТИнам1ду приводить у процесх репарацх? до

хдвищення гнтенсивностг пол^дор/рибозилювання, що супроводжуеть-я збгльшеиням рхвню had -сингеэуючох активность

3. Внасл1док деградахц? nad системою полх/дпр/рибозилюваяня в роцесх репаращх пошкоджень ДНК Еив1льняеться значна К1льн1сть HepriJ пхридин-рибозильного зв"язку, яка здатна забезпечити функ-;хонування процесхв вхдновленмя клгтин печшки за умов Aii мутагену.

4. Вивчення функц10нальн01 роях NAD в процесс репарацх? пош-:оджень ДНК, хкдукованюс ШС, показало, що внутр:шньокл1тинний

iMicT nad е регуляторним фактором системи вхдновлення ДНК, механхзм __ iii якого заключаеться у 1нтенсифхкацх1 метаболхзму коферменту ¡ерез додаткове введения щурам нхкотинамхду, що здатне вхдвернуги |ниження еадогенного пулу mad .

ПЕРЕД IK НАУКОВИХ ПРАЦЬ ПО TEMt ДЙСЕРТАХЦЙНО! РОБОТИ

1. Ыулявко H.A., Васильева С.М., Донченко Г.В. Исследование юобенностей adp-рибозилирования и структуры хроматина в условиях ¡аз личного содержания nad в печени крыс //Укр. биохим. курн. -:990. - 62, »6. - С. 16-22.

2. Мулявко H.A., Васильева С.М., Коваленко Л.И., Донченко Г.В. 'частие витамина РР в репарации индуцированных повреждений ДНК // [линическая витаминология. Тезисы докл. Всесоюзная конференция. -focKBa, 1992. - С. 26-27.

3. Мулявко H.A., Васильева С,М., Донченко Г.В. Взаимосвязь ¡ежду содержанием nad и скоростью репарации индуцированных разры-юв ДНК ядер печени крыс //Вопр. мед. химии. - 1993. - 39, М. -

4. Васильева С.М., Мулявко H.A., Донченко Г.В. Взаимосвязь юли/лор/рибозилирования гистаиов и содержания nad в печени крыс в фоцессе репарации индуцированных повреждений ДНК // Биохимия. -:994. - 59, №2. - С. 215-219.

5. Васильева С. 14., Мулявко H.A., Донченко Г.В. Изучение динамики репарации повреждений ДНК, вызванных ШМ, в условиях активированного биосинтеза nad в печени крыс // Вопр. мед. химии. - 1994. - 40, И, - С. 8-И.

Васильева С.М. "Взаимосвязь между внутриклеточным содержанием nad и интенсивностью репарации ДНК, индуцированной n-ме-тил- н-нитрозокочевикой в печени крыс".

Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук /специальность 03.00.04. - биохимия/. Институт биохимии им. А.В.Балладина HAH Украины, Киев, 1996.

В представленной работе внутриклеточное содержание нас рассматривается как один из возможных регуляторных факторов процесса репарации индуцированных повреждений ДНК.

В результате изучения особенностей обмена никотинамидаде-ниндинуклеотида в процессе восстановления повреждений ДЕК, индуцированных N-метил- и-нитрозоыочевиной в печени крыс, было показано, что активация метаболизма пиридиннуклеотида путем одноразового введения животным витамина РР предотвращает истощение эндогенного фонда никотинамидаденнндинуклеотида. Предполагается, что предотвращение снижения внутриклеточного содержания nad может происходить за счет восстановительного синтеза пиридиннуклеотида при использовании энергии пиридин-рибозильной связи, высвобождающейся в результате деградации молекулы nad системой поли/авр/рибозилирования.

Vasilieva s.m. Correlation between the NAD Content and DNA Separation Induced by N-nitroso-N-methylurea Intensity in Rat Liver.

Manuscript.

The Dissertation Thesis for Obtaining a Scientific Degree of Candidate of Biological Sciences (Speciality 03.00.04. -Biochemistry). A.V.Palladin Institute of Biochemistry of Ukrainian National Academy of Sciences. Kyiv. Ukraine. 1996.

In the-presented work the intracellular NAD content' is considered as one of the process of induced DNA damages reparation.

In consequence of study of NAD metabolism features in the process of DNA damages restoration induced by N-nitroso-N-methylurea has been shown the NAD metabolism activation in rat liver by single injection of PP vitamine to animals prevens an depletion of endogenous NAD store. It is supposed that the prevention of decrease of endogenous NAD content.could be the result of NAD synthesis de novo under the use of piridin-ribose bond energy.

lOi'ouoBi слова: репарац! я ДНК, nad метабол13ы, пол! /adp /рибозгатованкя

ГНдписано до друку 14.01.Э7р. Формат 60x84/16. Ум. друк. арк. 1,0. Обл.-вид. арк. 1,0. Тираж 100. Зам. 10.

Вгдд1п оперативно! пол!графн Центру МЬкнародно! ocBirn 227-12-75, 227-37-86