Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь метаболических процессов и устойчивости к бактериальным инфекциям у животных на фоне действия возбудителей, их антигенов и препаратов на основе наночастиц

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь метаболических процессов и устойчивости к бактериальным инфекциям у животных на фоне действия возбудителей, их антигенов и препаратов на основе наночастиц"

На правах рукописи

МАЛИНИН МИХАИЛ ЛЕОНИДОВИЧ

ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И УСТОЙЧИВОСТИ К БАКТЕРИАЛЬНЫМ ИНФЕКЦИЯМ У ЖИВОТНЫХ НА ФОНЕ ДЕЙСТВИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ, ИХ АНТИГЕНОВ И ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

21 НОЯ 2013

Саратов - 2013

005538707

005538707

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные консультанты: Ласкавый Владислав Николаевич,

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник

Дыкман Лев Абрамович,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты: Васильев Дмитрий Аркадьевич,

доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы

Заднова Светлана Петровна,

доктор биологических наук, ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», ведущий научный сотрудник лаборатории патогенных вибрионов

Лазурина Людмила Петровна,

доктор биологических наук, профессор, ГБОУ ВПО Курский государственный медицинский университет, заведующая кафедрой биологической и химической технологии

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Защита состоится «20» декабря 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан «/¿2» ноября 2013 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Многие инфекционные заболевания характеризуются тем, что число инфицированных животных больше числа заболевших. В организме одних животных возбудитель ведет себя как паразит, в организме других - как сапротроф. Представляет интерес вопрос, от чего зависит реализация того или иного варианта взаимодействия макро- и микроорганизма.

В случае низкоконтагиозных заболеваний состояние макроорганизма, его реактивность играют существенную роль в развитии инфекции. В то же время, состояние организма характеризуется его метаболическим статусом, совокупностью важнейших биохимических параметров крови как ткани, связывающей воедино метаболизм прочих тканей и органов.

Данная работа посвящена изучению взаимодействия микро- и макроорганизма, в частности, формирования устойчивости к тому или иному инфекционному заболеванию, с учетом изменений метаболического статуса макроорганизма.

В качестве инфектов были выбраны кишечная палочка, синегнойная палочка и микобактерии.

Одним из инфекционных заболеваний, наносящих значительный урон животноводству и птицеводству, является колибактериоз (Бессарабов и др., 2008; Akashi et al., 1993). Колибактериоз часто вызывается токсигенными штаммами Escherichia coli. В отличие от млекопитающих, у птиц колибактериоз является типичной се-кундарной инфекцией, развивающейся на фоне сниженного иммунитета (Nolan et al., 1992).

При параллельном заражении птиц возбудителями других заболеваний (например, микоплазмами) необходимая для развития колибактериоза минимальная заражающая доза вирулентных штаммов Е. coli может снижаться в тысячу и более раз (Chulasiri et al., 1989; Norton et al., 1992). Чаще других вызывают колибактериоз у птиц штаммы Е. coli серовариантов Ol, 02, 035, 078, Olli (Бессарабов, 2008; Агр, 1982). Более 58% эпизоотических штаммов Е. coli не типируются отечественными коммерческими коли-сыворотками (Валенкевич, Яхонтова, 2001).

В возникновении, развитии и исходе колибактериоза важнейшую роль играет резистентность организма птиц (Гуткин, Горбатов, 1984; Rosenberger et al., 1985). В связи с этим приобретает актуальность изучение реактивности организма птиц для понимания патогенеза заболевания и механизмов формирования эффективного иммунитета к нему (Stepänek et al., 1987).

Среди возбудителей инфекционных заболеваний животных важное место занимает Pseudomonas aeruginosa. Для синегнойной палочки характерны высокая устойчивость ко многим антибиотикам и хорошая выживаемость в окружающей среде (Bums et al., 2001). P. aeruginosa относится к грамотрицательным нефермен-тирующим микроорганизмам (Gales et al. 2001) и патогенна не только для животных, но и для человека (Foca et al., 2000). P. aeruginosa за счет способности накапливаться в окружающей среде поражает как молодняк, так и животных предубой-ного возраста (Estahbanati et al., 2002), причем заболевание нередко заканчивается летально. Синегнойная палочка, как возбудитель нозокомиальной инфекции, редко поражает здоровые ткани. Это придает актуальность изучению взаимодействия Р. aeruginosa и макроорганизма.

Важной проблемой медицины и ветеринарии до сих пор остается профилактика, диагностика и лечение заболеваний человека и животных, вызываемых ми-кобактериями туберкулеза (Lalvani, 2007). Одними из наиболее распространенных средств диагностики являются кожные пробы, основанные на использовании туберкулина в качестве аллергена (Ozekinci et al., 2007). Туберкулин представляет собой фильтрат убитых нагреванием культур Micobacterium tuberculosis, М. bovis или М. avium, состоящий, в основном, из термостабильных пептидов и карбоновых кислот. Действующим началом туберкулина является гаптен туберкулопротеин, вызывающий у инфицированных или вакцинированных пациентов при внутри-кожном введении специфическую реакцию гиперчувствительности замедленного типа, проявляющуюся как местная реакция в виде гиперемии и инфильтратов. Особый интерес представляет способность золотых наночастиц вызывать гуморальную иммунную реакцию на слабоиммуногенные антигены и гаптены (Дыкман и др., 2010). Вышесказанное определяет актуальность создания биотехнологического препарата на основе конъюгата туберкулина с золотыми наночастицами для изучения механизмов формирования устойчивости животных к туберкулезу, совершенствования диагностики и профилактики этого заболевания.

Одной из ключевых задач современной прикладной микробиологии является определение комплекса наиболее информативных биохимических показателей крови животных, позволяющих адекватно оценить устойчивость или восприимчивость организма к инфекции.

Для биохимических показателей, отражающих устойчивость животных к различным инфекционным заболеваниям, характерна значительная онтогенетическая, индивидуальная и межвидовая вариабельность (Ермаков, 2008). Это определяет актуальность обоснования комплекса биохимических показателей, позволяющих решать вопросы устойчивости организма к инфекционным агентам. Данные по ферментативной активности сыворотки крови диких животных, в частности, жел-тогорлых мышей, из естественных мест обитания с различным экологическим статусом, могут использоваться как фоновые показатели при биомониторинге окружающей среды (Кияшко и др., 2009).

Степень разработанности проблемы. Вопрос о причинах изменения активности ферментов при различных состояниях и патологических процессах, вызванных микробными агентами, до сих пор окончательно не решен. Повышение активности индикаторных ферментов в плазме крови, согласно одной из гипотез, происходит, главным образом, за счет увеличения их выхода из пораженных клеток. Эта гипотеза подтверждается исследованием изоферментного спектра лактатде-гидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (КК) и других ферментов (Коровкин, 1966; Фридрих, 1986; Рослый, 1999). Однако данная гипотеза никак не объясняет нормальную активность ферментов. А между тем, большой интерес представляет вопрос о причинах и биологическом смысле наличия активности индикаторных ферментов в плазме крови в норме.

Согласно другой гипотезе, источником ферментов в крови при патологических процессах, в том числе, бактериальных инфекциях, могут быть и неповрежденные клетки. Эта гипотеза акцентирует внимание на двойном происхождении роста активности ферментов, который связан с выходом в кровь органоспецифи-ческих ферментов и с общей биохимической перестройкой организма (Рослый,

1999; Гавриш, 2007; Artiss, 1987; Harnett, 1994). Однако существуют заболевания (например, грипп), при которых гиперферментемия не отмечается, хотя выраженный острый синдром есть (Мосолов, 1971).

Ферментемия может играть защитно-компенсаторную роль (Рослый, 2005; Гавриш, 2007; Chapatwala, 1982; Jimoh, Odutuga, 2001). В частности, повышение активности КК указывает на защиту клеток от цитолиза и является маркером гипоксии (Guder et al., 1986). Синхронное увеличение активности КК и ACT свидетельствует об интенсификации энергетического обмена. В то же время, значительное увеличение активности КК на фоне снижения активности ACT - плохой прогностический признак, свидетельствующий об истощении энергоресурсов (Рослый, 2005). Повышение активности у-глутамилтрансферазы (ГГТ) указывает на интоксикацию и аллергизацию организма, малигнизацию клеток, а также рассматривается как один из компенсаторных механизмов гипогликемического состояния. Щелочная фосфатаза (ЩФ) участвует в регуляции уровня глюкозы и ионизированного кальция в крови, в формировании пула фосфатов и синергично работает с буферными системами. Трансаминазы регулируют метаболические потоки, ЛДГ -окислительно-восстановительный статус (Мегсеп, 1974).

Таким образом, среди причин изменения метаболического статуса при бактериальных инфекциях выделяют выход ферментов из клеток пораженных тканей и органов на фоне усилившегося при патологическом процессе их биосинтеза.

Большой научный интерес и практическую значимость имеет решение вопросов, связанных с оценкой участия отдельных антигенных компонентов возбудителей в формировании ответных защитных реакций макроорганизма. Так, до сих пор многие вопросы, связанные с механизмами воздействия туберкулина на организм животного или человека, остаются открытыми. Известно, что антитела на туберкулин, при его внутрикожном введении, не образуются. Мажорный белок с молекулярной массой 9,7 кДа, входящий в состав туберкулина, способен вызывать ин-гибирование миграции макрофагов и частичное угнетение бласттрансформации лимфоцитов морских свинок и тем самым тормозить выработку антител (Kuwabara, 1975; Klausen et al., 1994). Лишь недавно был описан способ получения антитуберкулиновых поликлональных антител с использованием в качестве белка-носителя гемоцианина (Но, Kairo, Corbel, 2006).

Последние достижения в области бионанотехнологий демонстрируют возможность использования наночастиц как средства доставки лекарственных препаратов к клеткам-мишеням (Mout et al., 2012). Однако чтобы достигнуть цели, на-ночастица должна обойти много преград, защитных барьеров против чужеродных антигенов в организме животного (Dobrovolskaia, McNeil, 2007). Применение наночастиц золота в качестве носителя антигенов и терапевтических агентов находит широкое применение в современной медицине и биологии (Dreaden et al., 2012; Dykman, Khlebtsov, 2012; Alkilany, Lohse, Murphy, 2012).

Цель работы состояла в выявлении взаимосвязи метаболических процессов в организме животных с формированием устойчивости к ряду инфекционных агентов и отборе комплекса наиболее информативных биохимических показателей; характеристике механизмов действия антигенных компонентов возбудителей -токсинов кишечной палочки, ЛПС синегнойной палочки и туберкулина на клеточ-

ном уровне; разработке и обосновании применения конъюгата туберкулина с золотыми наночастицами в микробиологической и ветеринарной практике.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние иммунизации клетками штамма Е. coli Б-5 на способность сыворотки крови цыплят нейтрализовать токсины различных культур Е. coli, образовывать иммунокомплексы с токсинами и антитела к ЛПС вирулентных культур Е. coli, продуцирующих термолабильный и термостабильный токсины.

2. Выявить закономерности изменения активности ферментов энергетического обмена в крови животных. Разработать биохимический показатель — индекс ферментемии - интегрирующий соотношения энергетического и пластического обмена, а также аэробного и анаэробного окисления углеводов. Определить референтные значения индекса ферментемии для лабораторных животных: морских свинок, белых крыс, белых мышей и кроликов; желтогорлых мышей из естественных биотопов; цыплят различных кроссов. Изучить видовые особенности значений индекса ферментемии в норме и при инфекционной патологии.

3. Изучить взаимозависимость активности трансаминаз и дыхательной активности лейкоцитов различных субпопуляций (гранулоцитов, лимфоцитов, пери-тонеальных клеток) в системе in vitro «клетки печени - лейкоциты». Проанализировать влияние цитокинов на метаболическую активность клеток печени.

4. Определить зависимость влияния ЛПС различных изолятов Р. aeruginosa на дыхательную активность перитонеальных клеток белых крыс in vitro от вирулентности культур.

5. Проанализировать влияние PPD туберкулина для млекопитающих на рост микобактерий и кишечной палочки. Изучить возможность проникновения PPD туберкулина в иммунокомпетентные клетки животных. Разработать технологию получения конъюгата PPD туберкулина с золотыми наночастицами. Провести сравнительный анализ влияния PPD туберкулина и его конъюгата с наночастицами золота на дыхательную активность перитонеальных макрофагов, а также на показатели инфекционного процесса.

Научная новизна. Разработан новый биохимический показатель — индекс ферментемии, интегрирующий соотношения пластический/энергетический обмен и аэробное/анаэробное окисление углеводов в организме животных. Проведен сравнительный анализ метаболического статуса по показателям углеводного, белкового, липидного, минерального обменов в организме интактных, иммунизированных и инфицированных животных. Обнаружена взаимозависимость биохимических и иммунологических показателей у интактных, иммунизированных и инфицированных животных in vitro и in vivo. Проведено комплексное исследование метаболических и иммунологических процессов в организме животных при формировании устойчивости к заболеваниям, вызываемым Е. coli, Р. aeruginosa, М. bovis. Впервые теоретически обосновано и экспериментально подтверждено влияние метаболического статуса на формирование устойчивости животных к заболеваниям, вызываемым этими возбудителями. Проведены фундаментальные исследования по изучению участия клеток печени в регуляции иммунного и метаболического статуса на фоне воздействия возбудителей и их антигенов. Впервые

установлена зависимость влияния антигенов Е. coli Б-5 на состояние клеточного и гуморального иммунитета от температуры выращивания культуры.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость исследования заключается в том, что основные его результаты способствуют расширению знаний в области взаимодействия макро- и микроорганизма, механизмов формирования устойчивости к инфекционным заболеваниям, изучения факторов неспецифической резистентности.

По материалам диссертации получено 7 патентов РФ: 1. Способ оценки устойчивости организма животного к туберкулезу (Ласкавый, Малинин, 2009); 2. Способ оценки физиологического состояния организма цыплят (Ласкавый, Малинин, 2010); 3. Вакцина против колибактериоза кур (Ласкавый, Джавадов, Малинин и др., 2010); 4. Добавка к питьевой воде для кур и способ ее применения (Ласкавый, Иваненко, Фисинин, Сергеев, Стремоусов, Панферов, Малинин и др., 2010); 5. Способ оценки восприимчивости крупного рогатого скота к туберкулезу (Ласкавый, Малинин, Панферов и др., 2012); 6. Способ оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу (Ласкавый, Малинин, Кузнецова и др., 2012); 7. Способ оценки устойчивости крупного рогатого скота к туберкулезу (Ласкавый, Малинин, Панферов и др., 2012).

Материалы диссертации используются в научно-практической работе ГНУ Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакаде-мии, в практической работе ООО «ВетТоргСервис», при чтении лекций в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по дисциплинам «Микробиология», «Прикладная микробиология», «Медицинская микробиология», «Санитарная микробиология»; в ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова» по дисциплинам «Внутренние незаразные болезни животных», «Лабораторная диагностика», «Токсикология», «Микробиология», «Иммунология», что подтверждается актами о внедрении. Материалы диссертации использованы при написании учебно-методического пособия: Интерпретация результатов лабораторных анализов, Саратов, 2013.

Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды как отечественных, так и зарубежных ученых по вопросам влияния факторов неспецифической резистентности на устойчивость животных к инфекционным заболеваниям. Данное исследование основано на комплексном анализе и системном подходе к изучению рассматриваемой проблемы.

При проведении исследования и изложения материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.

Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволили обеспечить объективность полученных выводов и результатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммунизация цыплят штаммом Е. coli Б-5 формирует антитоксическую защиту широкого спектра, эффективную против различных токсинобразующих штаммов Е. coli.

2. Определение индекса ферментемии, отражающего баланс катаболических процессов центральной зоны и анаболических процессов периферической зоны

метаболизма, а также баланс анаэробного и аэробного этапов энергетического обмена, позволяет определять направление метаболических изменений в организме интактных, иммунизированных и инфицированных животных.

3. В системах in vitro повышение активности ACT сопровождается увеличением метаболической активности лейкоцитов. В свою очередь, высокая метаболическая активность лейкоцитов подавляет выделение ACT клетками печени.

4. Туберкулин более чем в 10 раз подавляет дыхательную активность пери-тонеальных макрофагов и втрое снижает адсорбцию бактериальных клеток на ПК. Использование вместо чистого туберкулина его конъюгата с золотыми наночасти-цами не подавляет дыхательную активность макрофагов и на 67% увеличивает адсорбцию бактериальных клеток на ПК.

5. Использование конъюгатов антикроличьих антител с золотыми наночасти-цами позволяет выявлять туберкулиновый антиген на клетках М. bovis. Данный метод может применяться для обнаружения микобактерий в различных объектах окружающей среды. Конъюгирование туберкулина с золотыми наночастицами способствует развитию гуморальной реакции, выработке антител на туберкулин.

Апробация результатов исследований. Материалы диссертации были представлены на: Юбилейной конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях» (Краснодар, 2006); VII Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2007); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2007); IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК»» (Новочеркасск, 2008); Международном рабочем совещании «Инновационные подходы в профилактике, диагностике и лечении зооан-тропонозных и метаболических болезней животных и человека в Саратовской области» (Саратов, 2009); Международной конференции, посвященной 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии (Самара, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и птиц на основе инновационных достижений» (Новочеркасск, 2009); Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения» (Саратов, 2010); Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии и животноводства» (Самара, 2010); Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию ветеринарной науки Кубани «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011); Международной научно-практической конференции «От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов, 2011); Международной научно-практической конференции «Экологические проблемы использования природных и биологических ресурсов в сельском хозяйстве» (Екатеринбург, 2012); Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 45-летию ГНУ Прикаспийский ЗНИВИ «Проблемы ветеринарной медицины в условиях реформирования сельского хозяйства» (Махачкала, 2012); Международной научно-практической конференции «Проблемы ветеринарной

медицины и зооэкологии Российского и Азиатско-Тихоокеанского регионов» (Благовещенск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 работ, из них 10 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также 7 патентов РФ и учебно-методическое пособие.

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в формулировании и разработке теоретических положений, планировании и проведении экспериментов, получении и систематизации данных, в апробации результатов исследования. Автором лично разработаны модификации методик и выполнен статистический анализ массива данных.

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук в период с 2003 по 2013 годы в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение основных закономерностей взаимодействия организма животных и микроорганизмов, обеспечивающих между ними стойкое биологическое равновесие» программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ: «Разработка молекулярно-биологических основ совершенствования и создания новых высокоэффективных и экологически безопасных методов, средств, технологий и систем диагностики, профилактики и терапии болезней животных, обеспечивающих устойчивое ветеринарное благополучие и получение продукции животноводства высокого санитарного качества» раздела «Усовершенствовать существующие и разработать новые методы, средства, технику и технологии диагностики, лечения и профилактики особо опасных и наиболее распространенных болезней животных, птиц, рыб и насекомых на основе изучения молекулярно-биологических и генетических механизмов их развития, с целью получения сырья и продукции высокого санитарного качества» Плана фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Россельхозакадемии по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации на 2011-2015 годы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 9 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 390 страницах машинописного текста, иллюстрирована 77 таблицами и 39 рисунками. Список литературных источников включает 662 наименования, в том числе 450 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Объекты и методы исследований

Объекты исследований. В работе использовали культуры: Е. coli Б-5 (получен из ГНУ Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии), Е. coli №388 (02) и Е. coli № 389 (078) (получены из ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии Россельхозакадемии), полевой изолят Е. coli №1 (выделен из костного мозга павшего цыпленка с признаками колибактериоза в ГНУ Саратовский НИВИ Россельхозакадемии), 2 вирулентных и 3 авирулентных полевых изолята Р. aeruginosa (выделены из спермы хряков-производителей в ГНУ Саратовский НИВИ Россель-

хозакадемии); штамм М. bovis BCG (ОАО «Зооветснаб»); штамм Azospirillum Ъга-silense Sp245 (из коллекции ризосферных микроорганизмов ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук).

Из данных культур были выделены и использованы в работе: токсинсодер-жащий материал, внешняя мембрана и ЛПС штаммов Е. coli Б-5, Е. coli №388 (02), Е. coli № 389 (078), изолята Е. coli №1; ЛПС пяти изолятов Р. aeruginosa и штамма A. brasilense Sp245. В качестве микробного антигена применяли PPD туберкулин для млекопитающих (ФГУП «Курская биофабрика-фирма «БИОК», Россия).

В экспериментах было использовано 350 цыплят, в том числе 100 голов цыплят-бройлеров кросса «Ross-308», 250 голов цыплят яйценоских кроссов, в том числе 200 голов цыплят кросса «Родонит-2» и 50 голов цыплят кросса «Super Nick»; 600 белых крыс; 450 морских свинок; 1200 белых мышей; 150 кроликов, а также 30 желтогорлых мышей. Животные содержались на стандартном рационе вивария Саратовского научно-исследовательского ветеринарного института Рос-сельхозакадемии. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с Международными правилами гуманного отношения к животным и с Модельным законом государств-участников СНГ об обращении с животными от 31.10.2007.

Методы исследований. Микробиологические исследования включали изучение основных тинкториальных, морфологических, культуральных и биохимических характеристик штаммов и изолятов возбудителей инфекций животных по общепринятым методикам (Колычев, Госманов, 2006). Антигенное сходство штаммов и изолятов выявляли методами твердофазного иммунодот-анализа с антителами, меченными золотыми наночастицами (Дыкман, 2008), обратной радиальной иммунодиффузии (Фримель, 1987), токсинообразования (Гусев, 2004).

Липополисахарид (ЛПС) выделяли методом горячей водно-фенольной экстракции (Westphal, 1965). Присутствие токсинсодержащего материала (ТСМ) в культуральной жидкости определяли по изменению дыхательной активности пе-ритонеальных клеток мыши (ПКМ) в НСТ-тесте (Маянский, 1979).

Выделение и очистку белков туберкулина проводили методом высаливания сульфатом аммония с последующей очисткой выделенных белковых фракций методом высокоэффективной жидкостной хроматографии; чистоту фракций проверяли SDS-электрофорезом в 20% полиакриламидном геле.

Моделирование инфекционного процесса и иммунизацию животных и цыплят проводили по общепринятым методам. Кровь для биохимических исследований у лабораторных животных отбирали из сердца (у грызунов), пунктированием краевой вены уха (у кроликов), пунктированием подкрыловой вены (у птиц).

Гематологические исследования проводили на гематологическом анализаторе Abacus 5 и микроскопе БИМАМ Р-14.

Сыворотку крови получали по общепринятой методике. Биохимические исследования образцов сыворотки крови проводили на программируемом фотометре BS 3000 Р Sinnova (КНР). Концентрацию общего белка, альбуминов, глобулинов, мочевины, мочевой кислоты, креатинина, общего холестерина и его фракций, триглицеридов, глюкозы, индекс атерогенности, активность ферментов АЛТ, ACT, КК, ЛДГ, ГГТ, ЩФ, КФ, липазы, а-амилазы, а также содержание фосфора, магния, кальция и железа определяли по общепринятым методикам (Камышников, 2000).

Выбор биохимических показателей определялся необходимостью изучения метаболических изменений по основным видам обмена.

Иммунологические исследования включали определение параметров фагоцитоза (Тихомирова, 2005), бактерицидной активности сыворотки крови, образования иммунокомплексов in vitro (Hashkova, 1978), наличия в крови специфических антител, нейтрализующих ТСМ указанных выше штаммов и изолятов Е. coli.

Выделение и культивирование перитонеальных макрофагов и клеток селезенки проводились по стандартным методикам (Leiter et al., 2001). Дыхательную активность определяли по способности клеток восстанавливать нитротетразолевый синий в формазан (Bernas, Dobrucki, 2000). Количественное определение концентрации восстановленного формазана проводили на программируемом фотометре BS 3000 Р Sinnowa (КНР), >.=490 им.

Золотые наночастицы со средним диаметром частиц 15 нм получали, используя реакцию восстановления золотохлористоводородной кислоты цитратом натрия (Frens, 1973). Для определения «золотого числа» (минимального количества антигена, защищающего золь от солевой агрегации) для водных растворов туберкулина и антител двукратно по 20 мкл титровали раствор антигена в воде с начальной концентрацией 300 мкг/мл для туберкулина. В каждую лунку добавляли по 200 мкл коллоидного золота и по 20 мкл 1,7 M NaCl. Минимальная стабилизирующая концентрация для антигена составила 1,2 мкг/мл. Конъюгацию проводили без использования сшивающих агентов.

Для проведения световой микроскопии препаратов, окрашенных конъюгатом туберкулина с золотыми наночастицами, использовали авторскую модификацию (Дыкман, 2007). Клетки микобактерий отмывали от питательной среды и ресус-пендировали в 0,01 M фосфатно-солевом буфере (рН=7,2) до концентрации 1х109 м.к./мл. Затем к суспензии микробных клеток добавляли растворы антител в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Производили двукратную отмывку от не связавшихся с микробными клетками антител центрифугированием (6000 g, 15 мин) и обрабатывали микробную взвесь вторичными антителами, конъюгированными с золотыми наночастицами (As2o=0,l). Проводили повторную отмывку от не связавшегося с микробными клетками конъюгата в течение 1 ч при комнатной температуре центрифугированием (1000 g, 15 мин). Осадок ресуспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера и готовили влажный препарат. Микроскопировали в просвечивающем режиме без физического контрастирования с использованием микроскопа DMI 3000 (LEICA, Германия). Для получения оптических срезов использовали конфокальный лазерный микроскоп TCS SP5 (LEICA, Германия).

При проведении электронной микроскопии клетки микобактерий наносили на никелевые сеточки с формваровой подложкой. После нанесения препарата проводили его блокировку 1% раствором БСА. Препарат подсушивали и погружали в раствор антител с концентрацией 1 мкг/мл. Препарат отмывали, сеточку подсушивали и инкубировали в растворе вторичных антител, конъюгированных с золотыми наночастицами. Затем проводили повторную отмывку и подсушивание препарата (Дыкман, 2008). Использовали электронный микроскоп Libra 120 (Carl Zeiss, Германия).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым методикам (Ашмарин и др., 1962; Лакин, 1990). Расчетные величины определяли с помощью встроенного статистического пакета Excel (MS Office 2007).

Оценка токсинпродуцирующей способности штаммов Е. coli №388 (02),

Е. coli №389 (078) и изолята Е. coli №1 и образования к ним антител в организме цыплят кросса «Родонит-2»

Изучение тинкториальных, культурально-морфологических, биохимических свойств бактерий вирулентных для птиц штаммов Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078), изолята Е. coli №1, а также авирулентного для птиц штамма Е. coli Б-5, показало их соответствие свойствам типового вида Е. coli.

Для изучения формирования у цыплят, иммунизированных клетками штамма Е. coli Б-5, иммунитета к поверхностным антигенам изучавшихся в работе вирулентных для птиц культур Е. coli применяли тест обратной радиальной иммуно-диффузии. Результаты исследований показали наличие линейной зависимости квадрата диаметра зоны преципитации от дозы иммунизации и от кратности разведения образцов сыворотки крови для штамма Е. coli Б-5 и изолята Е. coli №1. Следовательно, с антителами к штамму Е. coli Б-5 образовывали in vitro иммуно-комплексы антигены не только этого штамма, но и изолята Е. coli №1. В то же время, для штаммов Е. coli №388 (02) и №389 (078) зависимость размера зоны преципитации от дозы иммунизации цыплят и от кратности разведения сыворотки крови отсутствовала.

При использовании метода твердофазного иммунодот-анализа с антителами, меченными золотыми наночастицами, адсорбировали на мембране PVDF антигены (внешняя мембрана и ЛПС бактерий указанных штаммов и изолята Е. coli) в титре до 1/512. В качестве положительного контроля использовали ЛПС и внешнюю мембрану бактерий штамма Е. coli Б-5, в качестве отрицательного контроля -ЛПС и внешнюю мембрану клеток Pseudomonas aeruginosa (Rawadi, 1996). В образцах сыворотки крови цыплят, иммунизированных бактериями штамма Е. coli Б-5, были обнаружены антитела к ЛПС бактерий этого штамма, но не было обнаружено антител к ЛПС штаммов Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078), изолята Е. coli №1. Это свидетельствовало о том, что бактерицидные свойства сыворотки крови иммунизированных цыплят не определялись с наличием специфичных антител к ЛПС вирулентных штаммов и изолятов. В иммунодот-анализе с внешней мембраной штамма Е. coli Б-5 и изолята Е. coli №1 в качестве антигенов было показано образование комплексов антиген-антитело. При этом для штамма Е. coli Б-5 титр сыворотки крови составлял 1/512, а для изолята Е. coli №1 - 1/32. С внешней мембраной вирулентных для птиц штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078) комплексы антиген-антитело не образовывались. Это указывало на наличие во внешней мембране клеток изолята Е. coli №1, в отличие от клеток штаммов Е. coli №388 (02) и №389 (078), структур, взаимодействующих с антителами сыворотки крови иммунизированных бактериями штамма Е. coli Б-5 цыплят.

Был получен токсинсодержащий материал (ТСМ) из культуральных жидкостей штаммов Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078) и изолята Е. coli №1; токсичность проб ТСМ определяли по изменению дыхательной активности перитонеаль-

ных клеток мыши (ПКМ) в НСТ-тесте (Mosmann, 1983). Результаты экспериментов свидетельствовали о том, что ТСМ присутствовали в культуральных жидкостях всех исследовавшихся штаммов и изолята Е. coli (рисунок 1).

Определяли также наличие в образцах сыворотки крови иммунизированных цыплят специфических антител, нейтрализующих токсины указанных штаммов и изолята Е. coli. Сыворотка крови цыплят кросса «Родонит-2», иммунизированных бактериями штамма Е. coli Б-5, содержала антитела, в полной мере нейтрализующие термолабильный токсин штамма Е. coli Б-5 и на 60% нейтрализующие ТСМ изолята Е. coli №1. ТСМ штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078) нейтра-лизовывались сывороткой крови иммунизированных цыплят на 22 и 24% соответственно.

Результаты НСТ-теста для ПК в присутствии ТСМ Е. coli Б-5 (1), Е. coli №388 (2), Е. coli №389 (3), Е. coli №1 (4)

< ]

km—

-20 -15 -10 -5 0 5

а разность ТСМ-ионтроль в присутствии сыворотки крови п разность ТСМ-ионтрольбез сыворотки крови

Рисунок 1 - Разность опытных и контрольных проб (нг формазана на 1 млн ПКМ) для взвеси ПКМ с ТСМ вирулентных штаммов и сывороткой крови цыплят, иммунизированных Е. coli Б-5 в дозе 1 млрд. м.к.

Мы предположили, что величина токсиннейтрализующей активности сыворотки крови зависит от термолабильности ТСМ. ТСМ всех исследовавшихся культур Е. coli были проанализированы на термолабильность токсина по агрегативной способности тромбоцитов. Средний радиус агрегатов тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме крови кролика при добавлении культуральной жидкости изолята Е. coli №1, прогретой при 56°С, уменьшался по сравнению с действием нативной культуральной жидкости на 40%, что подтверждало термолабильность токсина.

В то же время, радиус агрегатов при добавлении образцов культуральной жидкости штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078) не зависел от предварительного прогрева. Это указывало на отсутствие в культуральных жидкостях данных штаммов термолабильного токсина.

Индекс ферментемии как интегральный показатель энергетического обмена

Для более точной оценки метаболического статуса животных нами предложен новый расчетный показатель - индекс ферментемии (ИФ), представляющий

собой безразмерную величину и увязывающий активность ферментов ACT, АЛТ, КК и ЛДГ. КК и ACT отражают активность биохимических процессов центральной зоны метаболизма, а ЛДГ и АЛТ - активность процессов периферической зоны метаболизма. Индекс ферментемии определяется по формуле: ИФ = АСТ/АЛТ + АСТ/ЛДГ + КК/ЛДГ

В соотношении АСТ/АЛТ (коэффициент Де Ритиса) ACT отражает активность реакций центрального звена метаболизма, регулирует поступление субстратов в цикл Кребса с последующим их аэробным окислением, выполняет детокси-цирующую функцию по отношению к аммиаку, включая его в цикл синтеза мочевины, а также обеспечивает восстановление в тканях содержания аспартата, снижающегося при дисбалансе аминокислот и гипоксии. АЛТ - показатель активности альтернативных путей метаболизма глюкозы, взаимопревращений глюкозы и аланина в глюкозоаланиновом цикле. В реакции, катализируемой АЛТ, аминогруппы различных аминокислот переносятся на пируват. Образующийся аланин поступает в кровь и по системе воротной вены переносится в печень. Глюкозо-аланиновый цикл служит каналом передачи азота и предшественников глюкозы в печень; там происходит синтез конечных продуктов азотистого обмена, например, мочевины. АЛТ является показателем анаболического звена метаболизма. Таким образом, соотношение АСТ/АЛТ отражает соотношение энергетического и пластического обмена. Креатинкиназа контролирует синтез одного из важнейших макроэргов - креатинфосфата. В химических связях 1 моль креатинфосфата аккумулируется в полтора раза больше энергии по сравнению с АТФ. Активность КК отражает состояние катаболизма, т.к. энергия, аккумулирующаяся в креатинфос-фате, высвобождается при окислении органических веществ. Направление обратимой реакции, катализируемой креатинкиназой (фосфорилирование креатина -дефосфорилирование креатинфосфата), зависит от рН среды, который, в свою очередь, во многом определяется активностью ЛДГ, контролирующей образование лактата. КК при увеличении затрат АТФ стимулирует процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях и активно влияет как на гликолиз, так и на глюконеогенез, опосредованно взаимодействуя с ферментами обоих этих процессов. При активизации гликолиза происходит уменьшение рН за счет увеличения образования молочной кислоты. В результате равновесие в реакции, катализируемой КК, смещается в сторону образования креатинфосфата за счет АТФ, образующейся в гликолизе. Таким образом, КК влияет на уровень глюкозы в крови. Креатинкиназа участвует также в системе адаптации организма к изменяющимся биоэнергетическим потребностям миокарда, мозга и мышц при разном уровне кровоснабжения.

В то же время ЛДГ катализирует последнюю реакцию молочно-кислого брожения - образование лактата. Лактат с током крови поступает в печень, где конвертируется в глюкозу. Образование лактата может временно заменить аэробное окисление глюкозы, причем частично переносит этот процесс из мышц в печень. Активность ЛДГ отражает также состояние цикла Кори, в котором происходят восстановление пирувата до лактата и синтез на основе лактата глюкозы, т.е. реакции анаболического звена метаболизма. Соотношение АСТ/ЛДГ отражает соотношение аэробного и анаэробного окисления углеводов.

Чем выше значение ИФ в сыворотке крови, тем выше активность катаболиче-ских процессов центральной зоны метаболизма по сравнению с реакциями периферической зоны метаболизма. Изменения индекса ферментемии могут более достоверно свидетельствовать о нарушениях обмена веществ, чем изменение активности отдельных ферментов.

Определение индекса ферментемии позволило выявить глубокие метаболические различия у цыплят-бройлеров кросса «Ross-308» и цыплят яйценоского кросса «Родонит-2»: у первых индекс ферментемии достоверно снижался с возрастом, указывая на все возрастающую роль пластического обмена, у вторых - сохранял стабильность в течение всего периода наблюдений.

Через две недели после заражения не иммунизированных цыплят вирулентными штаммами Е. coli индекс ферментемии снижался в 4,9 раза по сравнению с интактными цыплятами (рисунок 2); у цыплят, иммунизированных в возрасте 14 дней дозой 1-Ю6 м.к. на голову, ИФ снижался в 1,5 раза; у цыплят, иммунизированных в возрасте 22 дня дозой 1 ■ 10е м.к. на голову, ИФ достоверно не отличался от незараженного контроля; у цыплят, иммунизированных в возрасте 22 дня дозой 5-103м.к. на голову, ИФ увеличивался на 80% (р<0,01).

Зависимость индекса ферментемии у цыплят кросса "Родонит-2" от иммунизации

20 15

Рисунок 2 - Значения индекса ферментемии в сыворотке крови иммунизированных против колибактериоза цыплят кросса «Родонит-2», спустя 2 недели после заражения их вирулентными штаммами Е. coli (А - контроль интактный; В - контроль зараженный; С -цыплята, иммунизированные в возрасте 14 суток дозой 1 млн м.к.; D - цыплята, иммунизированные в возрасте 22 суток дозой 1 млн м.к.; Е - цыплята, иммунизированные в возрасте 14 суток дозой 0,5 млн м.к.)

При определении значений индекса ферментемии у интактных лабораторных животных оказалось, что у белых крыс ИФ (10,50±0,9) в 5 раз выше, чем у морских свинок (2,15±0,2), в 3 раза выше, чем у кроликов (3,63±0,4), и в 2 раза выше, чем у белых мышей (5,39±0,7). Это в целом коррелирует с устойчивостью данных видов животных к заражению туберкулезом.

Более высокие значения индекса ферментемии в сыворотке крови желтогор-лых мышей из пессимальных биотопов по сравнению с оптимальными (23,14±1,7 и 15,08±1,1 соответственно) подтверждали более высокую активность у них ката-болических процессов центральной зоны метаболизма.

Антигены Е coli Б-5, их воздействие на иммунологические и биохимические параметры в зависимости от температуры выращивания культуры

При изучении воздействия клеток и антигенов возбудителей инфекционных заболеваний на макроорганизм мы исходили из предположения, что ферменты, присутствующие в плазме крови, являются не только маркерами происходящих процессов, но и активно влияют на состояние организма. В первую очередь, это касается системы иммунитета, поскольку эффекторы иммунного ответа, лейкоциты, погружены в иммунологически и биохимически активную среду - кровь, печень же является основным белоксинтезирующим органом, а также органом кроветворения (в эмбриональном периоде) и детоксикации. Воздействие антигенов уже на уровне печени и системы крови должно приводить как к изменению энзи-матического фона, так и к модуляции иммунологического ответа.

Поскольку температура тела цыплят в норме достигает 42°С, а оптимальная температура роста культуры кишечной палочки составляет 37±0,5 °С, Е. coli Б-5 выращивали при 37 и 42°С в течение ночи на плотной среде Эндо. Полученные колонии в целом были типичны для кишечной палочки, но в случае выращивания при 42°С они были крупнее и с выпуклым центром.

Определяли активность ферментов в плазме крови кролика после инкубации крови in vitro с антигенами К coli Б-5 из культур, выращенных при 37 и 42°С. Результаты определения приведены в таблице 1.

Таблица 1 — Биохимия плазмы крови после инкубации с антигенами Е. coli Б-5

Параметры Биомасса и КЖ, 37°С Биомасса и КЖ, 42°С Контроль

КК, мккат 23,12±0,3" 22,70±2Д" 16,80±1,5

ACT, мккат 0,64±0,1 0,88±0,1 0,82±0,1

АЛТ, мккат 0,52±0,05 0,26±0,03""" 0,61±0,05

Коэффициент Де Ритиса 1,23±0,1 3,34±0,3lhl> 1,34±0,1

ЛДГ, мккат 6,94±0,5 7,75±0,8 8,28±0,9

Индекс ферментемии 4,62±0,5 6,35±0,51'"i' 3,43±0,4

Примечания - Достоверные (р<0,05) отличия от контроля;

2) Достоверные (р<0,05) различия между группами «37°С» и «42°С».

В системе крови активность ферментов реагирует на антигены Е. coli Б-5. Инкубация с антигенами Е. coli Б-5 сопровождалась увеличением в плазме крови активности КК, значений коэффициента Де Ритиса и индекса ферментемии, снижением активности AJIT, ЛДГ. Характерно, что в плазме крови под влиянием антигенов Е. coli Б-5, выращенной при 37°С, достоверно изменяется только активность КК, а под влиянием антигенов Е. coli Б-5, выращенной при 42°С - активность КК, AJIT, величина коэффициента Де Ритиса и индекса ферментемии.

Активность АЛТ в обоих случаях снижалась, но при выращивании культуры Е. coli Б-5 при 37°С — лишь на 15% (р>0,05), а при выращивании при 42°С — на 57% (р<0,05). Снижение активности АЛТ приводит к смещению метаболического акцента в сторону катаболизма, что способствует нейтрализации токсинов метаболическими системами клеток.

Увеличение коэффициента Де Ритиса отражает преобладание катаболических реакций над анаболическими, сопровождающееся аккумулированием энергии в виде АТФ. При выращивании при температуре 37°С величина коэффициента Де

Ритиса под воздействием КЖ и биомассы Е. coli Б-5 снижалась на 8% (р>0,05), а при выращивании при 42°С - возрастала в 2,5 раза (р<0,05).

Высокая активность КК связана с образованием мембранопротектора креа-тинфосфата, а также с активностью цитоскелета. Под воздействием КЖ и биомассы Е. coli Б-5, выращенной при 37 и 42°С, приблизительно в одинаковой степени (в 1,4 раза) увеличивалась активность КК плазмы крови.

Индекс ферментемии в обоих случаях (при выращивании культуры при температуре 37 и 42°С) возрастал, но в случае выращивания культуры Е. coli Б-5 при 37°С - на 35% (р>0,05), а в случае выращивания при 42°С - на 85% (р<0,05).

Была обнаружена зависимость бактериостатической активности плазмы крови в отношении вирулентного штамма Е. coli №389 (078) от уровня активности ферментов (таблица 2). Рост Е. coli обратно коррелирует с активностью ЛДГ и ACT. Сравнительный анализ воздействия антигенов Е. coli Б-5 из культур, выращенных при 37 и 42°С, действительно, обнаруживает некоторую тенденцию к повышению активности ЛДГ и ACT в плазме крови.

Таблица 2 - Корреляция плотности культур Е. coli №389 (078) в образцах плазмы крови цыплят с биохимическими показателями_

Показатели Коэффициенты Пирсона, г, для плотности культуры Е. coli №389 (078) и соответствующего биохимического показателя

КК +0,76±0,2 (р<0,02)

ACT -0,87±0,2 (р<0,002)

АЛТ 0

ЛДГ -0,99±0,05 (р<0,001)

ЩФ -0,66±0,3 (р<0,05)

Кислая фосфатаза +0,56±0,3 (р>0,05)

ГГТ -0,01±0,4 (р>0,05)

Влияние антигенов Е. coli Б-5 на биохимические показатели плазмы крови сходно с взаимозависимостью роста Е. coli №389 (078) и биохимических параметров, причем клетки Е. coli №389 (078) использовались живые, а клетки Е. coli Б-5 - убитые нагреванием. Так, внесение антигенов Е. coli Б-5 сопровождается увеличением в плазме крови активности КК и тенденцией к снижению активности ЛДГ. В то же время, рост штамма Е. coli №389 (078) в плазме крови тем интенсивнее, чем выше активность КК и ниже активность ЛДГ. Это указывало на взаимное влияние друг на друга ферментативной системы плазмы крови и бактериальных клеток.

Изучали также опосредованное ферментативной активностью плазмы крови влияние биомассы и КЖ Е. coli Б-5, выращенной при температуре 37 и 42°С, на киллерную активность лимфоцитов в отношении клеток Candida albicans. Антидрожжевую активность (АДА) рассчитывали по формуле:

АДА = 1 - ([число жизнеспособных дрожжевых клеток в суспензии] / [исходное число клеток]).

Результаты определения антикандидалыюго индекса в зависимости от температуры выращивания Е. coli Б-5 отражены в таблице 3.

Таблица 3 — Антидрожжевая активность лимфоцитов в системе «плазма крови / лимфоциты» при инкубации с антигенами Е. coli Б-5_

Температура выращивания Е. coli Б-5 37°С 42°С Контроль (среда 199)

Антидрожжевая активность 0,48±0,03 0,62±0,01 0,И±0,06

Полученные данные показывают, что внесение антигенов Е. coli Б-5 стимулирует антидрожжевую активность лимфоцитов-киллеров. Антидрожжевая активность под влиянием антигенов культуры Е. coli Б-5, выращенной при 37°С, увеличивается в 4,4 раза, а под влиянием антигенов культуры Е. coli Б-5, выращенной при 42°С - в 5,6 раза.

Таким образом, установлено, что культура Е. coli Б-5 способна расти при различных физиологических значениях температур, от 37 до 42°С. При этом происходит изменение поверхностных структур клетки и/или экскретируемых продуктов, выражающееся в изменении влияния на активность ферментов в плазме крови животных, на опосредованную ферментами активность лимфоцитов, на бактерио-статическую активность плазмы крови. Эффект более выражен при температуре выращивания Е. coli Б-5 42°С.

В плазме крови кролика in vitro под воздействием антигенов Е. coli Б-5 повышается индекс ферментемии - интегральный показатель метаболической активности, что на уровне организма может сказываться положительно на повышении устойчивости к инфекции за счет интенсификации окислительно-восстановительных реакций. Плазма крови может опосредованно влиять на метаболическую активность лейкоцитов, что положительно сказывается на состоянии иммунной системы организма. При этом метаболизм лимфоцитов и фагоцитов связан с активностью КК, AJIT, с индексом ферментемии и коэффициентом Де Ри-тиса. Эффект более выражен при температуре выращивания культуры 42°С.

Антигены Е. coli Б-5 стимулируют активность лимфоцитов-киллеров в отношении дрожжей. Эффект более выражен при температуре выращивания 42°С.

Вакцина против колибактериоза кур

Результатом проведенных исследований явилась разработка вакцины против колибактериоза кур на основе штамма Е. coli Б-5. Вакцина представляет собой суспензию микробных клеток в 15 мМ NaCl, содержащую в 1 мл 1-2 млн м.к. При более низком содержании микробных клеток снижается эффективность вакцины, при более высоком — вакцина становится более токсичной, негативно влияя на привесы.

Протективное действие вакцины определяли по динамике привесов и патоло-го-анатомическому исследованию иммунизированных и неиммунизированных цыплят кросса «Родонит-2» при заражении вирулентными штаммами Е. coli. Вакцину вводили 22-дневным цыплятам перорально, по 0,5 мл на голову. Через 23 дня после иммунизации цыплят заражали вирулентными культурами Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078), Е. coli №1 в дозе 6-107 м.к. на голову. Еще через 12 дней (в возрасте 57 суток) проводили взвешивание и вынужденный убой цыплят; изучали патологические изменения внутренних органов. Результаты гравиметрического анализа отражены в таблице 4.

Наибольшими были привесы у цыплят, иммунизированных дозами 5-Ю5 и 1 ■ 106 м.к. на голову.

Таблица 4 - Динамика привесов у цыплят кросса «Родонит-2»

Иммунизирующая доза, млн м.к. Средний вес цыплят в возрасте 45 суток, г Средний вес цыплят в возрасте 57 суток, г Среднесуточные привесы,г

0 240,4±25 208,0±22 -2,7±0,3

0,5 234,5±26 300,2±31 5,5±0,6

1 256,0±28 299,3±29 3,7±0,3

2 278,0±30 303,7±33 1,8±0,2

Патоморфологические исследования показали, что у всех неиммунизирован-ных цыплят отмечались значительные поражения сердца (фибринозный плевропе-рикардит) и печени (токсическая дистрофия). В группе цыплят, иммунизированных 5 105 м.к., 50% не имели патологических изменений со стороны сердца и 75% не имели патологических изменений со стороны печени. У цыплят, иммунизированных более высокими дозами, частота патологических изменений сердца и печени увеличивалась дозозависимо. Положительная динамика среднесуточных привесов и результаты патоморфологического исследования свидетельствуют о том, что иммунизирующая доза 5 105 м.к. на голову достаточна для защиты цыплят от колибактериоза и при этом не оказывает негативного влияния на физиологические показатели.

Для оценки иммуногенных свойств вакцины определяли содержание в крови цыплят цитокинов 1Ь-1, 1Ь-4, 1Ь-6, ШРу, ТМ?а через 11 дней после иммунизации (таблица 5).

Таблица 5 - Концентрация цитокинов в сыворотке крови цыплят иммунизированных штаммом Е. coli Б-5 в дозе 5-105 м.к. на голову__

Группы цыплят Цитокины

IL-1 IL-4 IL-6 INFy TNFa

Контроль 118,8±10 11,1±1 12,8±1 42,9±5 10,7±1

Опыт 550,2±58 19,3±2 28,7±3 110,2±10 28,5±3

Показано, что вакцина стимулирует выработку цитокинов IL-1, IL-4, IL-6, INFy, TNFa. Таким образом, установлены эффективность, безвредность, антитоксический эффект, протективные свойства вакцины против колибактериоза кур.

Влияние различных субпопуляций лейкоцитов на выделение трансаминаз клетками печени белых мышей in vitro

В рамках изучения влияния метаболического статуса на устойчивость организма животного к инфекциям, и учитывая, что основным источником ферментов, регулирующих метаболические потоки на клеточном, органном и организменном уровне, является печень, представляло интерес определить, как влияют лейкоциты

различных субпопуляций на способность клеток печени выделять ферменты. Исследования проводились на модели, включающей лейкоциты и клетки печени.

Исследования проводились на нелинейных белых мышах. Животные умерщвлялись методом транслокации шейных позвонков. Из крови и селезенки разделением на градиенте фиколла выделялись субпопуляции лейкоцитов. Лимфоциты выделялись в градиенте фиколла 13-15%, моноциты - 17-20%, гранулоциты - 2025%. Содержание клеток в исходных суспензиях составляло (1,6±0,4)Т0б кл/мл.

Показано, что как ACT, так и АЛТ выделяются во внешнюю среду из клеток печени, причем активность ферментов зависит от содержания в среде лейкоцитов различных субпопуляций. Наблюдалось выделение трансаминаз из не разрушенных клеток печени, что подтверждалось нулевой активностью ГГТ во всех пробах.

Общим для всех изучавшихся в опыте лейкоцитов было наличие обратной корреляции между их содержанием и активностью трансаминаз. Однако характер динамики активности ферментов существенно зависел от конкретных субпопуляций лейкоцитов (гранулоцитов, лимфоцитов, перитонеальных клеток).

Активность ACT, выделяемая клетками печени, при последовательном уменьшении содержания гранулоцитов в суспензии незначительно возрастала (таблица 6). Суммарное повышение активности ACT при понижении концентрации гранулоцитов с 1,60 Г/л до нуля составляет 11,85% (р>0,05).

Таблица 6 — Зависимость биохимических показателей суспензии печеночного гомогената от содержания в среде гранулоцитов_

---Концентрация клеток Показатели " _____ 0 0,18 Г/л 0,53 Г/л 1,60 Г/л

.At Г, мккат 9,58±0,9 9,51±1Д 8,75±0,9 8,57±0,9

АЛТ, мккат 8,52±0,9 8,45±0,9 8,43±0,8 8,38±0,8

Коэффициент Де Ритиса 1,12±0,1 1,12±0,1 1,04±0,1 1,02±0,1

При внесении в среду с печеночным гомогенатом суспензии перитонеальных клеток, по мере уменьшения их содержания, активность ACT также повышалась (таблица 7). Суммарное повышение активности ACT при понижении концентрации перитонеальных клеток с 1,60 Г/л до нуля составляло 37,7% (р<0,05).

При внесении в среду с печеночным гомогенатом суспензии лимфоцитов (таблица 8), суммарное повышение активности ACT при понижении концентрации лимфоцитов с 1,60 Г/л до нуля составляло 43,0% (р<0,05).

Таблица 7 - Зависимость биохимических показателей суспензии печеночного гомогената от содержания в среде перитонеальных клеток __

Концентрация клеток Показатели ----------- 0 0,18 Г/л 0,53 Г/л 1,60 Г/л

ЛС'Т, мккат 9,58±0,9 8,20±0,9 7,62±0,7 6,96±0,6

АЛТ, мккат 8,52±0,9 8,38±0,9 8,21±0,8 7,28±0,7

Коэффициент Де Ритиса 1,12±0,1 0,98±0,1 0,93±0,1 0,96±0,1

Таким образом, при наличии в среде с печеночным гомогенатом лимфоцитов активность ACT была минимальна по сравнению с перитонеальными клетками и гранулоцитами, и при снижении концентрации клеток долго оставалась на сравни-

тельно низком уровне, но при уменьшении концентрации лимфоцитов в 10 раз резко возрастала.

Таблица 8 - Зависимость биохимических показателей суспензии печеночного гомогената от содержания в среде лимфоцитов ___

Концентрация клеток Показатели —---- 0 0,18 Г/л 0,53 Г/л 1,60 Г/л

Л( ' Г. мккат 9,58±0,9 7,43±0,8 7,00±0,6 6,70±0,7

AJIT, мккат 8,52±0,9 8,80±0,9 8,63±0,9 7,75±0,7

Коэффициент Де Ритиса 1,12±0,1 0,84±0,05 0,81±0,05 0,86±0,05

При наличии в среде с печеночным гомогенатом перитонеальных клеток активность ACT по мере понижения содержания ПКМ возрастала достоверно, но более плавно, чем в случае с лимфоцитами. Вероятно, клетки печени реагируют не только на снижение концентрации перитонеальных клеток, но и на отсутствие в среде лимфоцитов.

График динамики активности ACT при наличии в среде с печеночным гомогенатом гранулоцитов лежит выше, чем для лимфоцитов и перитонеальных клеток, и его профиль значительно отличается от профилей для агранулоцитов. В этом случае клетки печени, возможно, реагируют не только на снижение содержания гранулоцитов, но и на отсутствие в среде агранулоцитов.

Что касается AJIT, то ее активность в среде с суспензией печеночного гомогената в ответ на уменьшение содержания лейкоцитов также возрастала, но менее выраженно, чем активность ACT. Так, в случае гранулоцитов активность AJIT практически не изменялась. Суммарное повышение активности AJIT при снижении концентрации перитонеальных клеток с 1,б-109 кл/л до нуля составляло 17% (р>0,05). Активность АЛТ в среде с суспензией печеночного гомогената при снижении концентрации лимфоцитов с 1,60 до 0,18 Г/л возрастала на 13,6% (р>0,05).

Характерно, что значения коэффициента Де Ритиса в среде с гранулоцитами всегда превышали 1,0. Для перитонеальных клеток и лимфоцитов коэффициент Де Ритиса был меньше единицы при любой ненулевой концентрации клеток. Это служит дополнительным подтверждением того, что в случае с гранулоцитами выброс трансаминаз из клеток печени происходит, прежде всего, как реакция на отсутствие агранулоцитов, и лишь во вторую очередь зависит от концентрации самих гранулоцитов. Следует отметить тенденцию к меньшим значениям коэффициента Де Ритиса в среде с лимфоцитами, чем в среде с перитонеальными клетками в тех же концентрациях.

Тот факт, что значения коэффициента Де Ритиса в среде с нейтрофильными гранулоцитами были выше, чем в среде с агранулоцитами, можно интерпретировать двояко. С одной стороны, это может указывать на то, что понижение содержания гранулоцитов в отсутствии агранулоцитов воспринимается клетками печени (как органа, участвующего в иммунных реакциях), как более серьезная угроза го-меостазу по сравнению с понижением содержания агранулоцитов в отсутствии гранулоцитов. С другой стороны, это может указывать на более высокий порог чувствительности гранулоцитов к изменению соотношения активности амино-

трансфераз за счет, вероятно, большей доли аэробных реакций в энергетическом обмене.

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что у клеток печени, как органа, участвующего в формировании иммунного ответа, есть возможность воспринимать информацию о количественных и качественных характеристиках лейкоцитов и реагировать на нее посредством выделения в среду ферментов, в частности, трансаминаз ACT и AJ1T.

Влияние трансаминаз in vitro на изменения интенсивности дыхания перитонеальных клеток морских свинок в ответ на М. bovis BCG

Цель экспериментов состояла в изучении влияния различных уровней активности ACT и АЛТ на интенсивность окислительно-восстановительных реакций в перитонеальных клетках.

Методом ступенчатого высаливания белков сульфатом аммония получали обогащенные трансаминазами фракции сыворотки крови кролика (таблица 9).

Таблица 9 - Активность трансаминаз во фракциях сыворотки крови кролика, полученных при концентрации сульфата аммония 20 и 35%_

Концентрация сульфата аммония, % АЛТ, нкат ACT, нкат

20 416,7 105,0

35 0 263,3

Указанные фракции использовали для создания матрицы активностей ACT и АЛТ. Фракции титровали в геометрической профессии со знаменателем 1/3 на 15 мМ NaCl. Матрицу активностей ACT и АЛТ создавали, смешивая по 40 мкл полученных разведений, 20 мкл суспензии М. bovis BCG (20 мкг убитой сухой биомассы в 1 мл) и 900 мкл суспензии перитонеальных клеток с концентрацией Т106 кл/мл. На 1 мл суспензии перитонеальных клеток вносили нитротетразолевый синий до финальной концентрации 0,01%, а также 0,25 мкмоль L-аспартата, 0,05 мкмоль L-аланина, 1,25 мкмоль а-кетоглутарата. Результаты НСТ-теста при добавлении к перитонеальным клеткам ACT и АЛТ в различных сочетаниях на фоне добавления М. bovis BCG представлены на рисунке 3.

Установлено, что накопление формазана, отражающее дыхательную активность перитонеальных клеток, было прямо пропорционально активности ACT и обратно пропорционально активности АЛТ. Влияние ACT было более значительным, поскольку только при минимальной активности ACT (0,3 нкат) накопление формазана в опыте было меньше, чем в контрольной пробе без ферментов. Кроме того, величина концентрации формазана более существенно зависела от изменения активности ACT на фоне константной АЛТ, чем наоборот.

Результаты эксперимента показывают, что дыхательная активность лейкоцитов (на примере перитонеальных макрофагов) существенно зависит от ферментативной активности плазмы крови.

Рисунок 3 - Зависимость накопления формазана ПК морской свинки от активности ACT и АЛТ в среде

Влияние экзогенных цитокинов in vitro на изменения дыхательной активности перитонеальных клеток морских свинок в ответ на М. bovis BCG Лейкоциты выделяют в кровь и тканевую жидкость биологически активные вещества, в частности, цитокины. Цитокины присутствуют в крови в низких концентрациях. Поскольку коммерческие наборы реактивов, рассчитанные на определение концентрации человеческих цитокинов методом иммуноферментного анализа (ИФА), не могут гарантировать точное определение содержания цитокинов лабораторных животных, были использованы лиофилизированные цитокины. Лиофилизаты IFNy, TNFa и IL-4 растворяли в 15 мМ NaCl и с помощью 2-кратного титрования получали титры от 1:1 до 1:256. Получали суспензии печеночных гомогенатов в среде RPMI от интактных белых мышей. Каждую суспензию делили на аликвоты по 0,5 мл, к которым добавляли по 100 мкл титров цитокинов (контроль - 100 мкл 15 мМ NaCl). Затем доводили объем полученных суспензий до 1 мл средой DMEM. Суспензии клеток печени с цитокинами инкубировали 30 мин при 37°С, после чего в культуральных жидкостях определяли активность ферментов (таблицы 10-12).

Таблица 10 - Зависимость биохимических показателей от концентрации TNFa

ACT, мккат TNFa, пг/мл АЛТ, мккат Коэффициент Де Ритиса ЛДГ, мккат

1,38±0,1 12,60 0,13±0,01 10,64±0,9 3,28±0,2

1,82±0Д 6,30 0,16±0,01 11,14±1,0 6,61±0,4

1,68±0,1 3,15 0,45±0,02 3,72±0,2 5,00±0,4

2,11±0,1 1,58 0,68±0,04 3,08±0,2 5,95±0,5

2,30±0,1 0,39 0,79±0,05 2,92±0,2 7, 07±0,5

2,60±0,1 0,10 1,78±0,1 1,46±0,1 5,78±0,7

3,01±0,2 0,01 1,87±0,1 1,61±0,1 11,33±1,0

При внесении в среду с печеночным гомогенатом TNFa в различных концентрациях происходило изменение активности ферментов, выделяющихся клетками печени в окружающую среду. При повышении концентрации TNFa до 12,6 пг/мл активность ACT снижалась в 2,2 раза, AJIT - в 14,4 раза, ЛДГ - в 3,4 раза; коэффициент Де Ритиса повышался в 6,6 раза.

При внесении в среду с печеночным гомогенатом IFNy, при повышении его концентрации до 60 пг/мл активность ACT снижалась в 4,7 раза, АЛТ - в 3,5 раза, а активность ЛДГ не изменялась достоверно. Коэффициент Де Ритиса снижался в 1,4 раза. Как и в случае TNFa, корреляция концентрации цитокина с активностью ACT высокая отрицательная (г=-0,82) (таблица 13).

При внесении в среду с печеночным гомогенатом IL-4 эффект был похож на IFNy, но имелись и отличия. Так, при повышении концентрации IL-4 до 30 пг/мл активность ACT и АЛТ снижалась в 2,4 раза, а активность ЛДГ и коэффициент Де Ритиса не изменялись достоверно. Как и в случае IFNy, корреляция концентрации IL-4 с активностью ACT высокая отрицательная (г=-0,81), с АЛТ значительная отрицательная (г=-0,61).

Таблица 11 - Зависимость биохимических показателей от концентрации IFNy

IFNy, пг/мл ACT, мккат АЛТ, мккат Коэффициент Де Ритиса ЛДГ, мккат

60,00 0,96±0,1 0,15±0,01 6,39±0,5 31,71±2,1

30,00 1,67±0,1 0,14±0,01 12,23±1,1 26,88±2,0

15,00 1,94±0,1 0,17±0,01 11,28±1,0 26,01±2,1

7,50 2,34±0,2 0,17±0,01 13,52±1,1 25,13±2,0

1,88 3,43±0,2 0,26±0,02 12,94±1,2 24,99±1,9

0,47 3,46±0,3 0,37±0,03 9,36±0,9 25,54±1,7

0,01 4,54±0,3 0,52±0,03 8,76±0,6 31,52±3,1

Таблица 12 — Зависимость биохимических показателей от концентрации IL-4

IL-4, пг/мл ACT, мккат АЛТ, мккат Коэффициент Де Ритиса ЛДГ, мккат

30,00 1,20±0,1 0,14±0,01 8,77±0,7 16,38±1,4

15,00 0,90±0,1 0,17±0,02 5,21±0,4 1,29±1,1

7,50 1,51±0,1 0,13±0,01 11,64±0,9 12,33±1,2

3,75 2,22±0,2 0,15±0,01 14,60±1,2 12,86±1,2

0,94 2,58±0,2 0,23±0,02 11,13±1,0 13,57±1,4

0,23 3,48±0,2 0,33±0,02 10,48±0,9 12,90±1,1

0,01 2,88±0,1 0,33±0,02 8,70±0,7 15,39±1,3

Таблица 13 - Коэффициенты Пирсона для цитокинов и биохимических показателей

Цитокин ACT АЛТ Коэффициент Де Ритиса ЛДГ

TNFa -0,76±0,2'' -0,75±0,2" +0,91±0,1 " -0,67±0,3"

IFNy -0,82±0,2" -0,54±0,3 -0,16±0,3 +0,25±0,3

IL-4 -0,81±0,2l> -0,61±0,3 -0,40±0,3 -0,14±0,4

Примечание - р<0,05.

По воздействию на клетки печени в плане элюции ферментов цитокины IFNy и IL-4 очень похожи друг на друга, но значительно отличаются от TNFa. TNFa относится к цитокинам первого поколения и, как таковой, вероятно, в меньшей степени влияет на активность ACT и АЛТ, чем IFNy и IL-4, относящиеся к цитокинам

второго поколения. Впрочем, между IFNy и IL-4 имеются не только сходства, но и различия. Они касаются, прежде всего, активности ЛДГ, которая в случае IFNy в 2 раза выше, чем для IL-4 (таблица 14).

Показана обратная зависимость концентрации цитокинов IFNy, TNFa, IL-4 и активности ACT. Если бы в этой модели присутствовали лейкоциты - продуценты цитокинов, то рост ACT при низких концентрациях цитокинов должен был бы простимулировать метаболическую активность лейкоцитов.

Таблица 14 - Средние значения биохимических параметров в зависимости от цитокина

Цитокин ACT, мккат АЛТ, мккат Коэффициент Де Ритиса ЛДГ, мккат

TNFa 2,14±0,2 0,94±0,2 4,23±1,3 6,77±0,8

IFNy 2,55±0,3 0,29±0,1 9,87±1,0 27,32±1,2

IL-4 2,23±0,3 0,22±0,03 10,44±0,9 12,20±1,4

Результаты эксперимента подтверждают предположение о том, что рост активности ACT в суспензии печеночного гомогената с лейкоцитами происходит в рамках стимулирующего воздействия клеток печени на лейкоциты. С другой стороны, снижение активности АЛТ, наблюдаемое нами во многих случаях, является, вероятно, результатом воздействия лейкоцитов (посредством цитокинов) на клетки печени. Таким образом, увеличение коэффициента Де Ритиса, приводящее к росту устойчивости организма к инфекционной нагрузке за счет смещения метаболического акцента в сторону катаболизма, происходит одновременно за счет увеличения активности ACT и уменьшения активности АЛТ. В свою очередь, повышение устойчивости организма к инфекционной нагрузке является результатом слаженного взаимодействия лейкоцитов, клеток печени и ферментов крови и их взаимного влияния друг на друга.

Влияние ЛПС различных изолятов Pseudomonas aeruginosa на метаболическую активность клеток печени и перитонеальных клеток

белых крыс

В экспериментах использовали перитонеальные клетки белых крыс (ПКК). ПКК ресуспендировали в среде DMEM до 6-106 кл/мл с добавлением нитротетра-золевого синего до финальной концентрации 0,01%. К аликвотам суспензии ПКК объемом по 0,9 мл добавляли растворы ЛПС (по 0,1 мл) изолятов Р. aeruginosa 4, 8 (вирулентные), 11, 12, 14 (авирулентные). Финальные концентрации ЛПС в суспензиях клеток составляли 4 мкг/мл; в качестве контроля использовали 15 мМ NaCl. '

Суспензии ПКК с ЛПС инкубировали 2 ч при 37°С. По окончании времени инкубации каждую пробу делили на две аликвоты. В первых аликвотах определяли накопление формазана ПКК в НСТ-тесте. Вторые аликвоты центрифугировали, осадки клеток отмывали 15 мМ NaCl, ресуспендировали в 500 мкл среды DMEM и добавляли к 500 мкл суспензий печеночного гомогената в среде RPMI. Пробы инкубировали в течение 30 мин при 37°С, после чего центрифугировали (3000 g, 10 мин). В супернатантах определяли активность трансаминаз ACT и АЛТ.

При добавлении ЛПС как вирулентных, так и авирулентных изолятов накопление формазана перитонеальными макрофагами было больше, чем в контроле (р<0,05), но у авирулентных - на 6,7%, а у вирулентных - на 30,4% в среднем (таблица 15).

Таблица 15 - Результаты НСТ-теста для ПК крысы

Культуры Контроль Вирулентные изоляты Авирулентные изоляты

Формазан, нг/106 ПКК 22,4±0,1 29,2±0,1 23,9±0,1

Таким образом, ЛПС всех изучавшихся изолятов P. aeruginosa в низкой концентрации оказывали стимулирующее действие на дыхание перитонеальных клеток крысы, причем для вирулентных изолятов эффект был в 4,5 раза выше, чем у авирулентных.

При биохимическом исследовании было установлено, что активность АЛТ в экстракте печеночного гомогената под влиянием перитонеальных клеток, обработанных ЛПС, проявляет тенденцию к снижению, причем для ЛПС вирулентных изолятов это снижение несколько более выражено. Впрочем, в обоих случаях снижение активности АЛТ было недостоверным и не превышало 17% (таблица 16).

Таблица 16 - Влияние ПКК на выделение трансаминаз клетками печени in vitro

Параметры Контроль Вирулентные изоляты Авирулентные изоляты

ACT, мккат 2,93±0,3 0,75±0,1 2,81±0,3

АЛТ, мккат 4,60±0,4 3,83±0,4 3,94±0,3

Коэффицент Де Ритиса 0,64±0,04 0,19±0,1 0,72±0,1

ЛДГ, мккат 27,10±2,5 18,16±2,0 9,98±1,0

Активность ACT в случае ЛПС вирулентных изолятов снижалась на 74% (р<0,05), а в случае ЛПС авирулентных изолятов практически не изменялась.

Коэффициент Де Ритиса для ЛПС вирулентных изолятов снижался на 70%(р<0,05), а для ЛПС авирулентных изолятов - повышался на 14% (р>0,05).

Активность ЛДГ в экстракте печеночного гомогената под влиянием перитонеальных клеток, обработанных ЛПС, снижалась (р<0,05), причем для ЛПС авирулентных изолятов снижение ЛДГ превышало 60%, а для вирулентных изолятов составляло 33%.

Полученные данные позволяют говорить о том, что ЛПС синегнойной палочки в зависимости от вирулентности изолятов по-разному влияет на клетки макроорганизма.

В перитонеальных клетках ЛПС повышает дыхательную активность. Ферментативный профиль трансаминаз, выделенных клетками печени в среду в присутствии перитонеальных клеток, обработанных ЛПС, различен в зависимости от вирулентности изолятов. В случае ЛПС авирулентных изолятов P. aeruginosa отличия от контроля были незначительны. В то же время, при использовании ЛПС вирулентных изолятов P. aeruginosa коэффициент Де Ритиса снижался по сравнению с контролем в 3,4 раза, активность ACT - в 3,9 раза, активность АЛТ - в 1,2 раза.

Таким образом, реакция перитоиеальных клеток на внесение в среду ЛПС различных изолятов P. aeruginosa коррелировала с вирулентностью последних. Активность трансаминаз также зависела от вирулентности изолятов синегнойной палочки. Под воздействием ЛПС вирулентных изолятов в большей степени изменялась активность ACT, а под воздействием ЛПС авирулентных изолятов - активность АЛТ. При добавлении ЛПС авирулентных изолятов дыхательная активность перитоиеальных клеток увеличивалась, но ненамного, и в присутствии таких перитоиеальных клеток несколько увеличивался коэффициент Де Ритиса, причем за счет снижения АЛТ.

При проведении корреляционного анализа с вычислением коэффициентов Пирсона была выявлена значительная обратная корреляция между интенсивностью дыхания перитоиеальных клеток и активностью ACT в экстракте печеночного гомогената под влиянием тех же перитоиеальных клеток, которая составила г=-0,64. При этом корреляция между интенсивностью дыхания перитоиеальных клеток и значениями коэффициента Де Ритиса составила г=-0,60, а между интенсивностью дыхания ПКК и активностью АЛТ - г=-0,18. Таким образом, добавление к печеночному гомогенату ПКК, уже активированных с помощью ЛПС вирулентных изолятов P. aeruginosa и демонстрирующих высокую дыхательную активность, приводит к существенному снижению коэффициента Де Ритиса в экстракте печеночного гомогената за счет уменьшения активности ACT. Напротив, добавление ПКК с ЛПС авирулентных изолятов не оказывало существенного влияния на трансаминазный профиль экстракта печеночного гомогената.

Влияние метаболического статуса на восприимчивость крупного рогатого

скота к туберкулезу

Туберкулез относится к малоконтагиозным заболеваниям, в развитии которых большую роль играет состояние макроорганизма. Нами были проведены биохимические исследования сыворотки крови коров. На момент исследования все животные были здоровы. В дальнейшем у части из них результаты туберкулиновой пробы были положительными (группа Р), других - отрицательными (группа Н). Результаты биохимических исследований и их статистической обработки представлены в таблице 17.

Таблица 17 - Биохимический анализ сыворотки крови коров, реагировавших (группа Р) и не реагировавших (группа Н) на туберкулин__

Параметры Группа Р Группа Н

ГТТ, мккат 0,24±0,01 0,22±0,03

Общий белок, г/л 61,04±1,1 (р<0,05) 54,34±2,8

Альбумины, г/л 30,60±1,5 30,45±0,9

Глобулины, г/л 30,44±2,0 (р<0,05) 23,89±2,5

Альбумин/Глобулин 1,03±0,1 (р<0,05) 1,33±0,1

Мочевина, ммоль/л 6,42±0,3 6,31±1,2

Мочевая кислота, мкмоль/л 104,32±9,4 (р<0,05) 64,68±4,2

Общий белок / Мочевина 159,81±4,6 171,26±37,1

Животные обеих групп достоверно различались по концентрации общего белка, глобулинов и мочевой кислоты.

При проведении корреляционного анализа были выявлены высокие значения коэффициента Пирсона, отраженные в таблице 18.

Таблица 18-Результаты корреляционного анализа

Параметры Коэффициенты Пирсона

Группа Р Группа Н

Глобулины/Мочевина +0,996 -0,17

Общий белок/ Глобулины +0,67 +0,95

ГТТ/Общий белок -0,99995 -0,06

Мочевина/Мочевая кислота -0,01 -0,97

Было установлено, что у коров, не реагировавших на РРБ туберкулин (группа Н), концентрация общего белка в плазме крови была ниже, чем в группе Р (р<0,05). При этом в обеих группах этот параметр не выходил за границы физиологической нормы. В то же время, обнаружена тенденция к более высоким значениям соотношения общего белка и мочевины в группе Н. Более низкая концентрация общего белка на фоне более высоких значений соотношения общего белка и мочевины указывает на снижение интенсивности белкового обмена.

По концентрации альбуминов группы Р и Н практически не различались. Таким образом, более высокая концентрация общего белка в группе Р целиком определялась более высоким содержанием глобулинов.

При проведении корреляционного анализа было установлено наличие достоверной высокой положительной корреляции (г=+0,95) между концентрацией общего белка и глобулинов у животных группы Н. Это указывает на закономерное изменение концентрации общего белка за счет глобулиновой фракции в этой группе. Корреляционное отношение И для общего белка и глобулинов в данной группе коров оказалось равным 0,98, а для глобулинов и общего белка 0,87. Такие показатели указывают на зависимость этих двух параметров друг от друга, близкую к линейной. Это подтверждается и коэффициентами детерминации Я2, равными 0,99 и 0,93 соответственно. Вариация концентрации общего белка на 99% обусловлена варьированием концентрации глобулинов. Это соответствует очень высокой степени взаимозависимости концентрации общего белка и глобулинов в сыворотке крови коров группы Н. Характерно, что у животных группы Р корреляция между концентрацией общего белка и глобулинов была ниже порога достоверности.

Концентрация мочевины в обеих группах была очень сходна. Однако корреляционный анализ выявил высокую положительную корреляцию между концентрацией мочевины и глобулинов у коров группы Р (г= +0,996); Ь(гло6улинь,/мочевина) = 0,95, Ь(мочевина/Глобупины) = 0,98. Коэффициенты детерминации Я2 равны 0,98 и 0,99 соответственно. Такие показатели указывают на линейный, прямой характер зависимости этих двух параметров друг от друга. Таким образом, вариация концентрации мочевины на 99% зависит от варьирования концентрации глобулинов. Это позволяет говорить об очень высокой степени взаимозависимости концентрации глобулинов и мочевины в сыворотке крови коров группы Р. Для- коров группы Н такая закономерность отсутствует (г=-0,17). Поскольку в организме млекопитающих мочевина является главным компонентом остаточного азота, это также указывает на преимущественный катаболизм глобулинов в группе Р.

Корреляция между активностью ГГТ и концентрацией общего белка в сыворотке крови более выражена у коров группы Р (г= -0,99995). В этой группе Ь(ггт/бело>:)= 0,80, а Ь(белоклтт)= 0,91- Такие показатели указывают на обратный характер зависимости этих двух параметров друг от друга, несколько отличающийся от линейного. Это подтверждается и коэффициентами детерминации, равными 0,89 и 0,95 соответственно, что позволяет говорить об очень высокой степени взаимозависимости концентрации общего белка и активности ГГТ в сыворотке крови коров, положительно реагирующих на туберкулин. Характерно, что у животных группы Н корреляция между концентрацией общего белка и активностью ГГТ отсутствует (г= -0,06). Более выраженная зависимость концентрации общего белка от активности ГГТ находит объяснение в значении ГГТ как основного маркера функциональных нарушений печени.

Корреляция между концентрацией мочевины и мочевой кислоты в сыворотке

КрОВИ, НапрОТИВ, более Выражена у КОрОВ ГруППЫ Н (Г= -0,97); И (мочевина/мочевая кислота) =0,98, а Ь(мочевая кислота/мочевина)=0,99. Линейный обратный характер зависимости этих двух параметров друг от друга подтверждается коэффициентами детерминации, равными 0,99 и 0,997 соответственно. Это позволяет говорить об очень высокой степени обратной взаимозависимости концентрации мочевой кислоты и мочевины в сыворотке крови коров, не реагирующих на туберкулин. Характерно, что у положительно реагирующих на введение препарата РРЭ животных корреляция между концентрацией мочевой кислоты и мочевины отсутствует (г= -0,01).

Несмотря на различные попарные корреляционные связи концентрации общего белка, мочевой кислоты и мочевины в группах реагирующих и не реагирующих на туберкулин животных, корреляционная зависимость всех этих трех параметров друг от друга в обеих группах очень высока и мало различается: для реагирующих на введение туберкулина животных коэффициент Пирсона Г(06щИй белок,

мочевина, мочевая кислота)~0,97, ДЛЯ Не реаГИруЮЩИХ ЖИВОТНЫХ Г(0бщий белок, мочевина, мочевая

кислота)- 0,98.

Таким образом, ряд биохимических показателей животных коррелирует с устойчивостью к туберкулезу.

Взаимодействие туберкулина с иммунной системой лабораторных животных

Целью настоящих исследований было изучение возможности получения антител на конъюгаты туберкулина с наночастицами золота и влияния данных конъюгатов на клетки ретикулоэндотелиальной системы лабораторных животных.

Для получения поликлональных антител на туберкулин конъюгат антигена с золотыми наночастицами вводили кроликам породы шиншилла внутримышечно четырехкратно с интервалом 14 суток в дозе 7,5 мкг антигена на голову. Кровь у животных на наличие антител отбирали спустя 10 суток после четвертой инъекции. Животным контрольной группы вводили не конъюгированный с золотыми наночастицами туберкулин в аналогичной дозе.

Титр антител в сыворотке крови определяли с помощью ИФА с применением меченных пероксидазой хрена антикроличьих антител (Карпищенко, 2002).

Иммунизацию морских свинок проводили в трех группах животных. Животным первой группы подкожно в три точки вводили нативный туберкулин, второй — конъюгат туберкулина с золотыми наночастицами, третьей - 15 мМ ЫаС1. Через

15 суток проводили заражение животных введением подкожно полевого изолята М. bovis в ожидаемой летальной дозе.

Специфичность полученных антител определяли методом иммунодот-анализа. Использовали клетки М. bovis вакцинного штамма BCG, М. phlei и М. smegmatis. Клетки микроорганизмов фиксировали ацетоном. Из фиксированной культуры готовили микробную взвесь с концентрацией 1Т09 м.к./мл и наносили на мембрану «Western S». Проводили блокировку мембраны с нанесенным на нее антигеном 2% обезжиренным сухим молоком в фосфатном буфере, в течение 1 ч. Мембрану инкубировали в растворе антисывороток, разведенных до концентрации 1 мкг/мл 10 мМ фосфатным буфером, в течение ночи при +4°С. Затем мембрану отмывали от неспецифически связавшихся антител и погружали в конъюгат золотых наночастиц с вторичными антителами (А52о=0,5).

При изучении влияния туберкулина на дыхательную активность клеток в качестве контроля использовали 100 мкл клеточных суспензий в 1 мл питательной среды. В опыте к 100 мкл клеточных суспензий добавляли раствор туберкулина до конечной концентрации 7,5 мкг/мл в 1 мл питательной среды с антигеном. Итоговая концентрация клеток составила 2ТО7 кл/мл.

Для определения бактерицидной активности фагоцитов в суспензии фагоцитов (МО6 кл/мл) вносили туберкулин. Клетки инкубировали при 37°С в течение трех часов, после чего в каждую пробу вносили суспензию живых бактерий Е. coli Б-5 из расчета 25 КОЕ на один фагоцит. Пробы инкубировали при +4°С в течение 30 мин. После инкубации и центрифугирования (1000 g, 10 мин) клетки дважды отмывали раствором Хенкса. Из каждого образца проводили высев на плотную питательную среду для определения степени адгезии микроорганизмов.

Титр полученных сывороток у всех кроликов в результате иммунизации конъюгатами туберкулина с золотыми наночастицами составил 1:1024. В сыворотке крови животных контрольной группы, которым вводили неконъюгирован-ный туберкулин, антител к нему не обнаружили. Предел детекции туберкулина с использованием полученной кроличьей сыворотки, определенный методом дот-анализа, составил 0,78 мкг. При дот-анализе бактериальных клеток микобактерий детектировали 200-400 м.к./мкл в случае положительной реакции.

Для определения видовой специфичности полученных поликлональных сывороток изучали перекрестные реакции антител на туберкулин у М. bovis и атипичных микобактерий М. phlei и М. smegmatis. Установлено (рисунок 4), что полученные антитела давали частичный перекрест с М. smegmatis в больших концентрациях (2,510е м.к./мл и выше). Перекрест антител с М. phlei в иммунодот-анализе не обнаружен.

На следующем этапе исследований применяли полученные антитела для проведения микроскопии микобактерий. На рисунке 5 приведены данные трансмиссионной электронной микроскопии при выявлении антигенных детерминант на клеточной поверхности микобактерий полученными антителами. Видно, что данный антиген диффузно распределен по всей поверхности микобактерий.

I 1 ' А

ПОЕР!

i с

Рисунок 4 - Дот-анализ микобактерий с использованием поликлональных антител на туберкулин (А - М. bovis; В - М. smegmatis; С-М. phlei). Выявление проводили с использованием конъюгатов антикроличьих антител с золотыми наночастицами

Рисунок 5 - Трансмиссионная электронная микроскопия: выявление туберкулинового антигена на клетках М. bovis BCG. Выявление проводили с использованием конъюгатов антикроличьих антител с золотыми наночастицами

После проведения электронной микроскопии изучалась возможность применения полученных антител для иммунохимического обнаружения микобактерий в препаратах при использовании световой микроскопии. На рисунке 6 показаны препараты М. bovis вакцинного штамма BCG.

Рисунок 6 - Световая микроскопия: выявление туберкулинового антигена на клетках М. bovis BCG. Выявление проводили с использованием конъюгатов антикроличьих антител с золотыми наночастицами (стрелкой отмечены клетки микобактерий)

.>4

В рамках изучения воздействия туберкулина на иммунокомпетентные клетки макроорганизма представлялось важным выяснить, происходит ли проникновение туберкулина в клетки, или он остается на поверхности клеток.

Изучалось взаимодействие туберкулина, меченного флуоресцеинизотиоциа-натом (ФИТЦ), с перитонеальными и лимфоидными клетками (рисунки 7, 8).

Рисунок 7 - Клетки селезенки, культивированные в присутствии туберкулина, меченного флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ; зеленое свечение)

Рисунок 8 - Перитонеальные клетки, культивированные в присутствии туберкулина, меченного ФИТЦ (зеленое свечение)

Флуоресцентное свечение отмечалось как в лимфоидных, так и в перитоне-альных клетках, т.е. туберкулин взаимодействовал с обоими пулами клеток иммунной системы животных. Возможность проникновения туберкулина в клетки изучалась нами при помощи конфокальной микроскопии (рисунки 9, 10).

Рисунок 9 - Конфокальная микроскопия клеток селезенки, культивированных с туберкулином, меченным ФИТЦ (зеленое свечение)

Туберкулин, меченный ФИТЦ, проникал как в ПК, так и в лимфоциты, однако интенсивность флуоресценции в лимфоидных клетках была ниже, чем в пери-тонеальных. Это указывало на более интенсивное проникновение туберкулина, меченного ФИТЦ, в ПК по сравнению с лимфоидными клетками.

Рисунок 10 - Конфокальная микроскопия перитонеальных клеток, культивированных с туберкулином, меченным ФИТЦ (зеленое свечение)

Туберкулин, вероятно, проникает в фагоцитирующие и нефагоцитирующие клетки при помощи различных механизмов, через различные рецепторы. Мы провели конъюгирование туберкулина с золотыми наночастицами и изучили эффект проникновения конъюгатов в фагоцитирующие и лимфоидные клетки. Золотые частицы, имея размер около 15 нм, могут проникать в макрофаги при помощи фагоцитоза, а в нефагоцитирующие клетки - при помощи эндоцитоза.

На следующем этапе исследования изучалось цитотоксическое действие туберкулина и его конъюгата с золотыми наночастицами на фагоцитирующие и нефагоцитирующие клетки. Оказалось, что туберкулин вызывает резкое угнетение дыхательной активности перитонеальных клеток. Концентрация восстановленного формазана в НСТ-тесте в ПК в опыте составляла 0,25±0,05 мкг/мл, что значительно ниже, чем в контроле (2,9±0,05 мкг/мл) (рисунок 11). На нефагоцитирующие клетки селезенки туберкулин не оказывал заметного цитотоксического действия, концентрация восстановленного формазана в опыте и контроле составила 3,70±0,0 мкг/мл и 3,74±0,04 мкг/мл, соответственно (рисунок 12).

с 3,5

1 3

I 2'5

со

£ 2 О

в- 1,5

га 1 а.

!■ 0,5

Дыхательная активность ПК в НСТ-тесте

2,9

1

□ Контроль ш Туберкулин

Рисунок 11 - Концентрация формазана в перитонеальных клетках в тесте с нитротетрозолевым синим (р<0,05)

Дыхательная активность клеток селезенки в НСТ-тесте

3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5

т : ----3,7--- -!Ш-3

□ Контроль ш Туберкулин

Рисунок 12 - Концентрация формазана в клетках селезенки в НСТ-тесте

В противоположность нативному туберкулину, цитотоксический эффект конъюгата туберкулина с золотыми наночастицами на фагоциты не отмечался; концентрация восстановленного формазана составляла в этом случае 3,1±0,02 мкг/мл (рисунок 13), что указывало даже на некоторый стимулирующий эффект.

Дыхательная активность ПК в НСТ-тесте

Рисунок 13 - Концентрация формазана в перитонеальных клетках в тесте с нитротетразолевым синим

Проникновение конъюгатов туберкулина с золотыми наночастицами в клетки селезенки вызывало двукратное угнетение их дыхательной активности, концентрация восстановленного формазана составляла 1,90±0,06 мкг/мл (рисунок 14).

Следующим этапом работы было изучение адсорбционной активности перитонеальных макрофагов крыс после их взаимодействия с туберкулином и конъ-югатом КЗ-туберкулин (рисунок 15).

Дыхательная активность клеток селезенки в НСТ-тесте

□ Контроль

Конъюгат туберкулина с золотыми наночастицами

Рисунок 14 - Концентрация формазана в клетках селезенки в тесте с нитротетразолевым синим (Р<0,05)

Адсорбция клеток Е. coli Б-5 на ПК

□ Туберкулин

□ Туберкулин, конъюгированный с золотыми наночастицами

□ Контроль

Рисунок 15 - Адсорбция клеток Е. coli Б-5 на перитонеальные клетки, КОЕ Е. coli Б-5 на одну перитонеальную клетку

Показано, что конъюгаты туберкулина с золотыми наночастицами усиливают адгезию фагоцитирующими клетками микробных тел; количество микроорганизмов на один фагоцит составляет 17,03±0,2. При культивировании фагоцитирующих клеток с туберкулином вместе со снижением клеточного дыхания также наблюдается и снижение адгезивной активности; концентрация микроорганизмов на один фагоцит составляет 3,43±0,16.

Проводились исследования по иммунизации морских свинок конъюгатом туберкулина с золотыми наночастицами. Результаты приведены в таблице 19.

Таблица 19-Результаты иммунизации морских свинок

Результаты иммунизации Контроль Туберкулин Конъюгат туберкулина с золотыми наночастицами

Появление гранулемы (сутки) 8 8 18

Появление абсцесса (сутки) 35 35 60

Время гибели от заражения (сутки) 67 68 110

Смертность, % 100 100 70

1,9

10,02

3,43

Иммунизация морских свинок туберкулином при последующем заражении вирулентным полевым изолятом М. bovis не оказывала влияния на время появления гранулем, абсцессов, время гибели и общую смертность.

При заражении вирулентным полевым изолятом М. bovis животных, предварительно иммунизированных конъюгатом туберкулина с золотыми наночастица-ми, время от заражения до появления гранулем увеличивалось на 125%, от заражения до появления абсцессов - на 71%, от заражения до гибели - на 64%, смертность снижалась на 33%.

Возможность получения антител на антигены, входящие в состав туберкулина, имеет значение как с научной, так и с практической точек зрения. В частности, термостабильные белки, входящие в состав данного препарата, могут обладать биоактивными свойствами. Т.к. в большинстве случаев данные белки являются слабыми иммуногенами, в начальной стадии исследований мы поставили перед собой задачу определить способность самого туберкулина вызывать выработку антител при иммунизации с использованием золотых наночастиц как носителя антигена.

Клетки микобактерий, выявляемые поликлональными антителами к туберкулину и контрастируемые антикроличьими антителами, конъюгированными с золотыми наночастицами, при световой микроскопии обнаруживаются как полиморфные палочки, окрашенные в красный цвет. Данный метод может в дальнейшем служить для обнаружения микобактерий в различных объектах окружающей среды и быть хорошим дополнением к уже имеющимся методам окраски. Кроме того, при использовании специфических антител данный метод позволяет проводить дифференциальную диагностику микобактерий.

Оставался открытым вопрос о локализации конъюгата туберкулина с золотыми наночастицами в фагоцитирующих клетках. При микроскопическом исследовании взаимодействия перитонеальных клеток с конъюгатом, меченным ФИТЦ, мы обнаружили зеленое свечение, что указывало на возможность проникновения антигена во внутриклеточное пространство. Для уточнения локализации конъюгата (мембранной или внутриклеточной) мы использовали конфокальную лазерную микроскопию. Оптические срезы продемонстрировали проникновение золотых наночастиц в цитоплазму макрофагов.

При изучении цитотоксического действия туберкулина на фагоцитирующие и нефагоцитирующие клетки оказалось, что туберкулин вызывает резкое угнетение дыхательной активности перитонеальных макрофагов. На нефагоцитирующие клетки селезенки туберкулин не оказывал заметного цитотоксического действия.

Цитотоксический эффект конъюгата туберкулина с золотыми наночастицами на фагоциты не отмечался. Напротив, наблюдался некоторый стимулирующий эффект. Проникновение же конъюгатов в клетки селезенки вызывало угнетение их дыхательной активности.

Для уточнения вопроса о влиянии угнетения дыхательной активности фагоцитирующих клеток туберкулином на их способность захватывать и метаболизи-ровать чужеродные антигены изучалась адсорбционная активность перитонеальных клеток крыс после их взаимодействия с туберкулином и конъюгатом туберкулина с золотыми наночастицами. Показано, что конъюгаты усиливают адгезию фагоцитирующими клетками микробных тел на 67%. При культивировании фаго-

цитирующих клеток с туберкулином параллельно снижению интенсивности клеточного дыхания наблюдается снижение адгезивной активности на 66%.

Исходя из полученных результатов, можно сделать следующие предположения. Золотые наночастицы, проникая во внутриклеточное пространство, частично снимают токсический эффект туберкулина на перитонеальные макрофаги крыс, что способствует более активному развитию гуморальной реакции и выработке антител на туберкулин. Это делает возможным использование золотых наночастиц в качестве носителя для получения антител на вещества, обладающие токсическим эффектом.

Выводы

1. Разработан новый биохимический показатель - индекс ферментемии (ИФ) — интегрирующий соотношения энергетический/пластический обмен и аэробное/анаэробное окисление углеводов. Определены референтные значения ИФ для лабораторных животных, КРС и цыплят различных кроссов. Установлены видовые особенности значений ИФ в норме и при различных инфекционных процессах.

2. Показано, что референтные значения ИФ у лабораторных животных коррелируют с видовой устойчивостью к туберкулезу. При заражении цыплят кросса «Родонит-2» смесью вирулентных штаммов Е. coli происходит достоверное снижение значений ИФ у интактных и дозозависимое увеличение у иммунизированных против колибактериоза особей. Выявлены достоверные различия в значениях ИФ у желтогорлых мышей из оптимальных и пессимальных естественных биотопов, коррелирующие с показателями активности иммунной системы на клеточном уровне.

3. Установлено, что сыворотка крови цыплят, иммунизированных живыми бактериями штамма Е. coli Б-5, нейтрализует токсинсодержащий материал вирулентных для птиц штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078), продуцирующих термостабильный токсин, и изолята Е. coli №1, продуцирующего термолабильный токсин. Выявлена способность сыворотки крови иммунизированных цыплят к образованию in vitro иммунокомплексов с токсинами исследованных вирулентных для птиц культур Е. coli. Антитела к ЛПС исследуемых штаммов Е. coli в сыворотке крови не обнаружены.

4. Показано, что в системе in vitro «клетки печени - лейкоциты» белых мышей выявляются ACT и АЛТ, причем активность ферментов зависит от содержания в среде лейкоцитов различных субпопуляций. В аналогичных системах in vitro для клеток печени мышей и гранулоцитов, лимфоцитов, перитонеальных клеток выявлена обратная корреляция между концентрацией клеток и активностью тран-саминаз. При действии на клетки печени белых мышей различных концентраций экзогенных интерлейкинов IL-4, TNFa, IFNy дозозависимо снижается активность ACT и АЛТ.

5. Обнаружено, что в системе in vitro «перитонеальные клетки - белковые фракции сыворотки крови морской свинки с различным уровнем активности тран-саминаз» дыхательная активность клеток прямо пропорциональна активности ACT и обратно пропорциональна активности АЛТ по данным НСТ-теста.

6. Установлено, что ЛПС пяти изученных изолятов P. aeruginosa в низкой концентрации стимулировали in vitro дыхательную активность перитонеальных

клеток белых крыс; при действии ЛПС вирулентных изолятов значения НСТ-теста были достоверно выше, чем при действии ЛПС авирулентных.

7. Туберкулин PPD в низких концентрациях снижает in vitro фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов белых крыс в отношении микобактерий, а в высоких концентрациях угнетает как активность макрофагов, так и размножение микобактерий в питательных средах. В присутствии PPD туберкулина дозозави-симо подавляются рост культуры и дыхание клеток К coli Б-5.

8. PPD туберкулин, меченный ФИТЦ, in vitro проникает в перитонеальные макрофаги более интенсивно, чем в лимфоциты кроликов. Конъюгирование PPD туберкулина с золотыми наночастицами восстанавливает дыхательную активность перитонеальных макрофагов по сравнению с действием исходного препарата и усиливает адгезию фагоцитами микобактерий.

9. Разработана технология получения конъюгата антител к PPD туберкулину с золотыми наночастицами. Данный препарат позволяет выявлять микобактерии при световой микроскопии мазков-отпечатков из органов и патологического материала, а также в мазках из культур, выращенных на питательных средах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для оценки устойчивости и восприимчивости животных к бактериальным инфекциям, в частности, к инфекциям, вызываемым вирулентными культурами Е. coli, Р. aeruginosa, М. bovis, рекомендуется определять ряд биохимических показателей, таких как активность ферментов ACT, АЛТ, КК, ЛДГ, КФ, концентрация липопротеидов высокой и низкой плотности, мочевой кислоты.

2. Для защиты цыплят от колибактериоза, вызываемого токсигенными штаммами Е. coli, рекомендуется применять вакцину на основе штамма Е. coli Б-5.

3. Для изучения взаимодействия различных звеньев иммунной системы животных с токсичными и слабоиммуногенными веществами бактериального происхождения рекомендуется конъюгирование продуктов жизнедеятельности бактерий с золотыми наночастицами.

4. Антитуберкулиновые антитела, конъюгированные с золотыми наночастицами, могут быть рекомендованы для лабораторной диагностики туберкулеза методами световой и электронной микроскопии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Малинин М.Л. Биохимические и гематологические показатели у цыплят кросса «Родонит-2» в норме и при инфицировании эшерихиями / М.Л. Малинин // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. H.H. Вавилова. - 2008. - №3. — С. 34-38.

2. Половые различия по биохимическим показателям крови у разных видов лабораторных животных / М.Л. Малинин, Е.И. Тихомирова, Л.Б. Обух [и др.] // Известия Саратовского университета. Серия «Химия. Биология. Экология». -2008. - Т. 8, Вып. 1. - С. 51-54.

3. Малинин MJI. Особенности формирования иммунитета к колибактериозу цыплят при введении бактерий штамма Е. coli Б-5 / М.Л. Малинин, В.Н. Ласкавый, Е.И. Тихомирова // Естественные и технические науки. - 2009. - №2. - С. 89-92.

4. Малинин М.Л. Характеристика свойств различных вирулентных для птиц штаммов Е. coli и их способности продуцировать токсины / М.Л. Малинин, Е.И. Тихомирова, К.П. Габалов // Фундаментальные исследования. - 2009. - №4. - С. 34-38.

5. Биохимические и гематологические показатели у мышей при введении ЛПС Azospirillum brasilense Sp245 / A.A. Фомина, М.Л. Малинин, Е.И. Тихомирова [и др.] // Токсикологический вестник. - 2009. - №6. - С. 52-53.

6. Кияшко В.В. Сравнительный анализ биохимических показателей крови желтогорлых мышей из разных мест обитания / В.В. Кияшко, М.Л. Малинин, Е.И. Тихомирова // Естественные и технические науки. - 2009. -№6. - С. 76-82.

7. Разработка иммунозолотых диагностических систем для идентификации возбудителя туберкулеза in situ / С.А. Староверов, И.В. Видяшева, A.C. Фомин, O.A. Василенко, М.Л. Малинин [и др.] // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. — 2011. — № 2. — С. 29-32.

8. Изучение механизмов токсического воздействия туберкулина PPD на клетки иммунной системы лабораторных животных / A.C. Фомин, М.Л. Малинин, O.A. Василенко [и др.] // Ветеринарная патология. -2011. -№3 (37). - С. 76-82.

9. Влияние липополисахаридов различных изолятов Pseudomonas aeruginosa на печень и перитонеальные клетки белых крыс / К.П. Габалов, Т.Н. Тарасенко, М.Л. Малинин [и др.] // Известия Саратовского университета. Серия «Химия. Биология. Экология». - 2011. - Т. 11, Вып. 2. - С. 98-100.

10. Малинин М.Л. Влияние субпопуляций лейкоцитов на выделение тран-саминаз клетками печени белых мышей/ М.Л. Малинин, К.П. Габалов, В.Н. Ласкавый// Ветеринарный врач. - 2013. - № 2. - С. 46-50.

Патенты РФ

1. Способ оценки устойчивости организма животного к туберкулезу: Патент № 2352938 РФ / В.Н. Ласкавый, М.Л. Малинин // Патентообладатель: Государственное научное учреждение Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук. Опубликовано

20.04.2009. Бюл. № 11.

2. Способ оценки физиологического состояния организма цыплят: Патент № 2399203 РФ / В.Н. Ласкавый, М.Л. Малинин // Патентообладатель: Государственное научное учреждение Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук. Опубликовано

20.09.2010. Бюл. №26.

3. Вакцина против колибактериоза кур: Патент № 2404803 РФ / В.Н. Ласкавый, Э.Д. Джавадов, М.Л. Малинин М.Л. [и др.] // Патентообладатель: Государственное научное учреждение Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук. Опубликовано 27.11.2010. Бюл. №33.

4. Добавка к питьевой воде для кур и способ ее применения: Патент № 2422041 РФ / В.Н. Ласкавый, С.И. Иваненко, В.И. Фисинин, В.И. Сергеев, В.М.

Стремоусов, В.И. Панферов, МЛ. Малинин [и др.] // Патентообладатель: Государственное научное учреждение Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук. Опубликовано 27.11.2010. Бюл. №33.

5. Способ оценки восприимчивости крупного рогатого скота к туберкулезу: Патент № 2452952 РФ / В.Н. Ласкавый, М.Л. Малинин, В.И. Панферов [и др.] // Патентообладатель: Государственное научное учреждение Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук. Опубликовано 10.06.2012. Бюл. № 16.

6. Способ оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу: Патент № 2452955 / В.Н. Ласкавый, М.Л. Малинин, А.Е. Кузнецова [и др.] // Патентообладатель: Государственное научное учреждение Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук. Опубликовано 10.06.2012. Бюл. № 16.

7. Способ оценки устойчивости крупного рогатого скота к туберкулезу: Патент № 2452953 РФ / В.Н. Ласкавый, М.Л. Малинин, В.И. Панферов [и др.] // Патентообладатель: Государственное научное учреждение Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук. Опубликовано 10.06.2012. Бюл. № 16.

Публикации в других изданиях

1. Сравнительная характеристика агломеративной способности лимфоцитов у овец и крыс / М.Л. Малинин, В.М. Стремоусов, И.В. Лумельская [и др.] // Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития: сб. материалов

VI Всерос. науч.-практ. конф. - Саратов, 2006. — С. 235-237.

2. Малинин МЛ. Изменения лейкоцитарной формулы цыплят при инфицировании эшерихиями / МЛ. Малинин, В.М. Стремоусов, В.Н. Ласкавый // Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях: сб. материалов юбил. конф. - Краснодар, 2006. - С.182-184.

3. Влияние тимолина на иммунный статус белых крыс / И.В. Бородавкин, И.В. Лумельская, М.Л. Малинин [и др.] // Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях: сб. материалов юбил. конф. - Краснодар, 2006. - С. 392393.

4. Малинин М.Л. Различия биохимических и гематологических показателей животных в зависимости от пола / МЛ. Малинин, В.М. Стремоусов // Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития: сб. материалов

VII Всерос. науч.-практ. конф. - Саратов, 2007. — С. 245-249.

5. Малинин МЛ. Биохимические показатели крови интактных и инфицированных цыплят / МЛ. Малинин // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: сб. материалов Междунар. науч.-практ. конф. — Щелково, 2007.-С. 255-259.

6. Малинин МЛ. Биохимические показатели сыворотки крови цыплят, инфицированных эшерихиями / М.Л. Малинин // Материалы IV Междунар. конф., по-свящ. 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера и 120-летию Парижского института Пастера. - СПб., 2008. - С. 130.

7. Малинин M.JI. Биохимические и патолого-анатомичеекие аспекты эшери-хиоза у цыплят кросса «Родонит-2» / M.JI. Малинин, В.М. Стремоусов, И.В. Боро-давкин // Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК»: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. -Новочеркасск, 2008. - С. 102-107.

8. Кияшко В.В. Оценка биохимических показателей крови желтогорлых мышей из естественных мест обитания в Саратовской области / В.В. Кияшко, M.JI. Малинин, Е.И. Тихомирова // Сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. с между-нар. участием. - Киров, 2008. - Вып. 6 (Ч. 2). - С. 68-70.

9. Малинин M.JI. Использование стандартного метода определения общего белка при исследовании сыворотки крови животных / M.JI. Малинин // Успехи современного естествознания. - 2008. - №3. - С. 105-106.

10. Малинин M.JI. Триглицеридовый индекс как дополнительный показатель при оценке липидного профиля сыворотки крови животных / МЛ. Малинин // Успехи современного естествознания. - 2008. - №3. - С. 106-107.

11. Малинин М.Л. Использование агрегометра для определения бактериальных токсинов / М.Л. Малинин, Т.Н. Тарасенко // Современное состояние и перспективы развития патологии, морфологии и онкологии животных: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. - Новочеркасск, 2008. - С. 167-170.

12. Малинин М.Л. Нарушения метаболизма при экспериментальном колибак-териозе кур / М.Л. Малинин, М.В. Волкова, Д.С. Волков // Инновационные подходы в профилактике, диагностике и лечении зооантропонозных и метаболических болезней животных и человека в Саратовской области: сб. материалов Междунар. рабочего совещания. - Саратов, 2009 - С. 44-45.

13. Влияние иммунизации цыплят кросса «Родонит-2» штаммом К coli Б-5 на восприимчивость к колибактериозу / М.Л. Малинин, В.М. Стремоусов, В.И. Панферов [и др.] // Материалы Междунар. конф., посвящ. 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. - Самара, 2009. - С. 273-275.

14. Влияние трансаминаз на изменения интенсивности дыхания перитонеаль-ных клеток морской свинки в ответ на БЦЖ in vitro / К.П. Габалов, М.Л. Малинин, Т.Н. Тарасенко [и др.] // Ветеринарная медицина домашних животных: сб. статей. - Казань, 2010. - Вып. 7. - С. 94-97.

15. Новый подход в профилактике колиинфекции птиц / М.В. Волкова, М.Л. Малинин, В.Н. Ласкавый [и др.] // Вавиловские чтения: сб. материалов Междунар. науч.-практ. конф. - Саратов, 2010. - Т. 1. - С. 194-195.

16. Изучение механизма воздействия туберкулина PPD на клетки иммунной системы лабораторных животных / В.Н. Ласкавый, A.C. Фомин, М.Л. Малинин [и др.] // Актуальные проблемы современной ветеринарии: сб. материалов Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 65-летию ветеринарной науки Кубани. - Краснодар, 2011. - Ч. 2. - С. 276-278.

17. Малинин М.Л. К вопросу о причинах изменения ферментативной активности при инфекционной и неинфекционной патологии / М.Л. Малинин // От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины: сб. материалов Междунар. науч.-практ. конф. - Саратов, 2011. - С. 173-177.

18. Малинин M.JI. Влияние туберкулина на рост и дыхание дрожжей Saccha-romyces cerevisiae / М.Л. Малинин, К.П. Габалов, С.А. Староверов // От теории - к

практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины: сб. материалов Междунар. науч.-практ. конф. - Саратов, 2011. - С. 178-181.

19. Изучение механизмов взаимодействия туберкулина PPD с клетками иммунной системы лабораторных животных / С.А. Староверов, M.JI. Малинин, A.C. Фомин [и др.] // От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины: сб. материалов Междунар. науч.-практ. конф. - Саратов, 2011.-С. 277-281.

20. Шибаева М.А. Изменение биохимического статуса и уровня продукции провоспалительных цитокинов у мышей при подкожном введении стафилококков / М.А. Шибаева, МЛ. Малинин, Е.И. Тихомирова // От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины: сб. материалов Междунар. науч.-практ. конф. — Саратов, 2011. — С. 355-360.

21. Уточнение механизмов токсического воздействия туберкулина PPD на клетки иммунной системы лабораторных животных / A.C. Фомин, C.B. Козлов, A.A. Волков, С.А. Староверов, B.C. Степанов, МЛ. Малинин [и др.] // Ветеринарная клиника.-2011.-№11 (114). - С. 12-14.

22. Влияние ЛПС изолятов Р. aeruginosa на печень и перитонеальные клетки крыс / К.П. Габалов, Т.Н. Тарасенко, М.Л. Малинин [и др.] // Современные проблемы и инновационные подходы к диагностике, лечению и профилактике болезней животных и птиц: сб. материалов Междунар. науч.-практ. конф. - Екатеринбург, 2012. - С. 44-46.

23. Малинин М.Л. Оценка эффективности иммунизации цыплят кросса «Ро-донит-2» бактериями Е. coli / М.Л. Малинин, В.М. Стремоусов, М.В. Волкова // Современные проблемы и инновационные подходы к диагностике, лечению и профилактике болезней животных и птиц: сб. материалов Междунар. науч.-практ. конф. - Екатеринбург, 2012. - С. 149-150.

24. Ласкавый В.Н. Новые подходы в решении проблемы нарушений обмена веществ у высокопродуктивных молочных коров / В.Н. Ласкавый, МЛ. Малинин, С.М. Морозов // Проблемы ветеринарной медицины в условиях реформирования сельского хозяйства: сб. материалов Междунар. юбил. науч.-практ. конф., посвящ. 45-летию ГНУ Прикаспийский ЗНИВИ. - Махачкала, 2012. - С. 241-250.

25. Габалов К.П. Влияние туберкулина на рост М. bovis BCG в различных средах культивирования / К.П. Габалов, O.A. Галкина, М.Л. Малинин // Проблемы ветеринарной медицины и зооэкологии российского и Азиатско-Тихоокеанского регионов: сб. материалов Междунар. науч.-практ. конф. - Благовещенск, 2012. - С. 87-90.

МАЛИНИН МИХАИЛ ЛЕОНИДОВИЧ

ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И УСТОЙЧИВОСТИ К БАКТЕРИАЛЬНЫМ ИНФЕКЦИЯМ У ЖИВОТНЫХ НА ФОНЕ ДЕЙСТВИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ, ИХ АНТИГЕНОВ И ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ

Автореферат

Подписано в печать 05.11.2013 Формат 60x84 1/16

Бум. офсет. Усл. печ. л. 2,0 Уч.-изд. л. 2,0

Тираж 100 экз. Заказ 33

ООО «Издательский Дом «Райт-Экспо»

410031, Саратов, Волжская ул., 28 Отпечатано в ООО «ИД «Райт-Экспо» 410031, Саратов, Волжская ул., 28, тел. (8452) 90-24-90

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Малинин, Михаил Леонидович, Саратов

Государственное научное учреждение Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук

Малинин Михаил Леонидович

ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И УСТОЙЧИВОСТИ К БАКТЕРИАЛЬНЫМ ИНФЕКЦИЯМ У ЖИВОТНЫХ НА ФОНЕ ДЕЙСТВИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ, ИХ АНТИГЕНОВ И ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

На правах рукописи

05201450418

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты

доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Ласкавый В.Н.

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Дыкман Л.А.

Саратов - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение............................................................................................7

Глава 1. Обзор литературы...................................................................19

1.1. Клинико-диагностическое значение ферментемий.................................19

1.2. Биохимические показатели крови у птиц..............................................30

1.3. Современные представления о профилактике колибактериоза..................35

1.4. Защитно-адаптивные механизмы при инфицировании

микобактериями......................................................................44

1.5. Pseudomonas aeruginosa. Краткая характеристика................................61

1.6. Структура, функции и биологическая активность ЛПС

грациликутных бактерий............................................................63

1.6.1. Механизм взаимодействия ЛПС с клетками организма-хозяина............72

1.7. Цитокины в иммунном ответе.........................................................77

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 2. Объекты и методы исследований.................................................84

2.1. Объекты исследований...................................................................84

2.2. Методы исследования..................................................................85

2.2.1. Микробиологические методы исследования.......................................85

2.2.2. Иммунизация и заражение цыплят..................................................88

2.2.3. Методы исследования крови.........................................................88

2.2.4. Биохимические методы исследования..............................................93

2.2.5. Гематологические методы исследования.........................................99

2.2.6. Микроскопирование.................................................................100

2.2.7. Методы статистического анализа результатов..................................101

Глава 3. Оценка влияния на метаболизм цыплят кросса «Родонит-2»

иммунизации штаммом Escherichia coli Б-5....................................102

3.1. Изучение способности продуцировать токсины у вызывающих

колибактериоз у птиц штаммов и изолятов Е. coli...........................102

3.2. Антигены Е coli Б-5, их воздействие на иммунологические и

биохимические параметры в зависимости от температуры выращивания культуры.............................................................105

3.3. Оценка иммунного статуса цыплят кросса «Родонит-2»,

иммунизированных против колибактериоза штаммом Е coli Б-5.........110

3.4. Оценка иммунного статуса у цыплят кросса «Родонит-2»,

иммунизированных против колибактериоза и

зараженных вирулентными штаммами кишечной палочки.................114

3.5. Изучение формирования иммунной памяти у цыплят кросса

«Родонит-2» при иммунизации против колибактериоза....................116

3.6. Оценка эффективности иммунизации цыплят кросса «Родонит-2»

против колибактериоза штаммом Е. coli Б-5 в раннем возрасте...........119

Глава 4. Биохимические показатели сыворотки крови интактных,

зараженных и иммунизированных против колибактериоза цыплят.......124

4.1. Сравнительный анализ возрастных изменений биохимических

показателей сыворотки крови интактных цыплят мясных и яйценоских кроссов..................................................................124

4.2. Значение биохимического анализа сыворотки крови цыплят кросса

«Родонит-2», иммунизированных против колибактериоза..................133

4.3. Оценка информативности показателей биохимического и

гематологического анализа у цыплят кросса «Родонит-2» при

заражении вирулентными штаммами кишечной палочки..................145

Глава 5. Сравнительный анализ биохимических показателей

сыворотки крови лабораторных животных и грызунов из

естественных биотопов.............................................................154

5.1. Сравнительный анализ биохимических показателей

сыворотки крови интактных лабораторных животных:

белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов.....................154

5.2. Половой диморфизм по биохимическим показателям крови у

различных видов лабораторных животных....................................159

5.3. Особенности метаболических процессов в организме

желтогорлых мышей................................................................163

5.4. Особенности организации иммунной системы желтогорлых

мышей из естественных биотопов Правобережья

Саратовской области.................................................................169

Глава 6. Влияние лейкоцитов и эндогенного комплемента на

выделение ферментов и метаболитов клетками печени.....................173

6.1. Влияние субпопуляций лейкоцитов на выделение трансаминаз

клетками печени белых мышей in vitro..........................................173

6.2. Влияние эндогенного комплемента на выделение ферментов и

метаболитов клетками печени белых мышей in vitro........................181

Глава 7. Влияние бактериальных антигенов на выделение

ферментов и метаболитов клетками печени...................................188

7.1. Влияние бактериальных липополисахаридов на биохимические

и гематологические показатели белых мышей..................................188

7.1.1. Влияние ЛПС Е. coli Б-5 на выделение ферментов и

метаболитов клетками печени мыши in vitro....................................188

7.1.2. Влияние ЛПС Azospirillum brasilense sp245 на биохимические

и гематологические показатели белых мышей in vivo............................191

7.2. Влияние лейкоцитов различных субпопуляций на выделение

ферментов и метаболитов клетками печени крыс под

воздействием культуральной жидкости штамма Е. coli Б-5 in vitro.......198

7.3. Влияние клеток штамма Е. coli Б-5 на клетки печени и

перитонеальные клетки крысы in vitro...........................................211

Глава 8. Влияние токсинов Pseudomonas aeruginosa на дыхательную активность лейкоцитов и метаболическую активность клеток печени лабораторных животных in vitro...............................216

8.1. Влияние токсинов Pseudomonas aeruginosa на дыхательную

активность лейкоцитов и выделение трансаминаз клетками

печени белых мышей in vitro.......................................................216

8.2. Влияние липополисахаридов различных штаммов

Pseudomonas aeruginosa на метаболическую активность

клеток печени и перитонеальных клеток белых крыс........................219

ГЛАВА 9. Влияние эндогенных и экзогенных цитокинов на

метаболическую активность клеток печени....................................224

9.1. Влияние цитокинов на метаболическую активность

клеток печени белых мышей in vitro..............................................224

9.2. Влияние экзогенных цитокинов на метаболическую

активность клеток печени белых мышей in vitro...............................234

ГЛАВА 10. Взаимодействие Mycobacterium bovis BCG и туберкулина с

микроорганизмами и иммунной системой животных........................241

10.1. Влияние трансаминаз на изменения интенсивности дыхания перитонеальных клеток морской свинки в ответ на

Mycobacterium bovis BCG in vitro..................................................241

10.2. Влияние Mycobacterium bovis BCG и PPD-туберкулина

на клетки печени и перитонеальные клетки крысы...........................245

10.3. Влияние туберкулина на рост Mycobacterium bovis BCG

в различных средах культивирования..............................................250

10.4. Влияние туберкулина на рост и дыхательную активность

кишечной палочки...................................................................257

10.5. Влияние туберкулина на рост и дыхание дрожжей

Saccharomyces cerevisiae............................................................262

10.6. Взаимодействие туберкулина с иммунной системой

лабораторных животных............................................................267

10.7. Влияние биохимических показателей крови на восприимчивость

крупного рогатого скота к туберкулезу............................................281

Заключение....................................................................................289

Выводы.........................................................................................304

Список сокращений и условных обозначений........................................306

Список литературы...........................................................................309

Проиложения..................................................................................377

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Многие инфекционные заболевания характеризуются тем, что число инфицированных животных больше числа заболевших. В организме одних животных возбудитель ведет себя как паразит, в организме других - как сапротроф. Представляет интерес вопрос, от чего зависит реализация того или иного варианта взаимодействия макро- и микроорганизма.

В случае низкоконтагиозных заболеваний состояние макроорганизма, его реактивность играют существенную роль в развитии инфекции. В то же время, состояние организма характеризуется его метаболическим статусом, совокупностью важнейших биохимических параметров крови как ткани, связывающей воедино метаболизм прочих тканей и органов.

Данная работа посвящена изучению взаимодействия микро- и макроорганизма, в частности, формирования устойчивости к тому или иному инфекционному заболеванию, с учетом изменений метаболического статуса макроорганизма.

В качестве инфектов были выбраны кишечная палочка, синегнойная палочка и микобактерии.

Одним из инфекционных заболеваний, наносящих значительный урон животноводству и птицеводству, является колибактериоз [23, 516]. Колибактериоз часто вызывается токсигенными штаммами Escherichia coli. В отличие от млекопитающих, у птиц колибактериоз является типичной секундарной инфекцией, развивающейся на фоне сниженного иммунитета [281].

При параллельном заражении птиц возбудителями других заболеваний (например, микоплазмами) необходимая для развития колибактериоза минимальная заражающая доза вирулентных штаммов Е. coli может снижаться в тысячу и более раз [295, 373]. Чаще других вызывают колибактериоз у птиц штаммы Е. coli серовариантов Ol, 02, 035, 078, Ol 11 [23, 243]. Более 58% эпизоотических штаммов Е. coli не типируются отечественными коммерческими коли-сыворотками [28].

В возникновении, развитии и исходе колибактериоза важнейшую роль играет резистентность организма птиц [45, 388]. В связи с этим приобретает актуальность изучение реактивности организма птиц для понимания патогенеза заболевания и механизмов формирования эффективного иммунитета к нему [228].

Среди возбудителей инфекционных заболеваний животных важное место занимает Pseudomonas aeruginosa. Для синегнойной палочки характерна высокая устойчивость ко многим антибиотикам и хорошая выживаемость в окружающей среде [441]. Р. aeruginosa относится к грамотрицательным нефермен-тирующим микроорганизмам [284] и патогенна не только для животных, но и для человека [333]. Р. aeruginosa за счет способности накапливаться в окружающей среде поражает как молодняк, так и животных предъубойного возраста [335], причем заболевание нередко заканчивается летально. Синегнойная палочка, как возбудитель нозокомиальной инфекции, редко поражает здоровые ткани. Это придает актуальность изучению взаимодействия Р. aeruginosa и макроорганизма.

Важной проблемой медицины и ветеринарии до сих пор остается профилактика, диагностика и лечение заболеваний человека и животных, вызываемых микобактериями туберкулеза [426]. Одним из наиболее распространенных средств диагностики являются кожные пробы, основанные на использовании туберкулина в качестве аллергена [500]. Туберкулин представляет собой фильтрат убитых нагреванием культур Mycobacterium tuberculosis, М. bovis или М. avium, состоящий, в основном, из термостабильных пептидов и карбоновых кислот. Действующим началом туберкулина является гаптен туберкулопротеин, вызывающий у инфицированных или вакцинированных пациентов при внутри-кожном введении специфическую реакцию гиперчувствительности замедленного типа, проявляющуюся как местная реакция в виде гиперемии и инфильтратов. Особый интерес представляет способность золотых наночастиц вызывать гуморальную иммунную реакцию на слабоиммуногенные антигены и ran-

тены [2]. Вышесказанное определяет актуальность создания биотехнологического препарата на основе конъюгата туберкулина с золотыми наночастицами для изучения механизмов формирования устойчивости животных к туберкулезу, совершенствования диагностики и профилактики этого заболевания.

Одной из ключевых задач современной прикладной микробиологии является определение комплекса наиболее информативных биохимических показателей крови животных, позволяющего адекватно оценить устойчивость или восприимчивость организма к инфекции.

Для биохимических показателей, отражающих устойчивость животных к различным инфекционным заболеваниям, характерна значительная онтогенетическая, индивидуальная и межвидовая вариабельность [58]. Это определяет актуальность обоснования комплекса биохимических показателей, позволяющих решать вопросы устойчивости организма к инфекционным агентам. Данные по ферментативной активности сыворотки крови диких животных, в частности, желтогорлых мышей, из естественных мест обитания с различным экологическим статусом, могут использоваться как фоновые показатели при биомониторинге окружающей среды [88].

Степень разработанности проблемы. Вопрос о причинах изменения активности ферментов при различных состояниях и патологических процессах, вызванных микробными агентами, до сих пор окончательно не решен. Повышение активности индикаторных ферментов в плазме крови, согласно одной из гипотез, происходит, главным образом, за счет увеличения их выхода из пораженных клеток. Эта гипотеза подтверждается исследованием изоферментного спектра лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (КК) и других ферментов [102, 177, 198]. Однако данная гипотеза никак не объясняет нормальную активность ферментов. А между тем, большой интерес представляет вопрос о причинах и биологическом смысле наличия активности индикаторных ферментов в плазме крови в норме.

Согласно другой гипотезе, источником ферментов в крови при патологических процессах, в том числе, бактериальных инфекциях, могут быть и неповрежденные клетки. Эта гипотеза акцентирует внимание на двойном происхождении роста активности ферментов, который связан с выходом в кровь орга-носпецифических ферментов и с общей биохимической перестройкой организма [188, 198, 245, 363]. Однако, существуют заболевания (например, грипп), при которых гиперферментемия не отмечается, хотя выраженный острый синдром есть [129].

Ферментемия может играть защитно-компенсаторную роль [176, 188, 279, 408]. В частности, повышение активности КК указывает на защиту клеток от цитолиза и является маркером гипоксии [439]. Синхронное увеличение активности КК и ACT свидетельствует об интенсификации энергетического обмена. В то же время, значительное увеличение активности КК на фоне снижения активности ACT - плохой прогностический признак, свидетельствующий об истощении энергоресурсов [176]. Повышение активности у-глутамилтрансферазы (ГГТ) указывает на интоксикацию и аллергизацию организма, малигнизацию клеток, а также рассматривается как один из компенсаторных механизмов ги-погликемического состояния. Щелочная фосфатаза (ЩФ) участвует в регуляции уровня глюкозы и ионизированного кальция в крови, в формировании пула фосфатов и синергично работает с буферными системами. Трансаминазы регулируют метаболические потоки, ЛДГ - окислительно-восстановительный статус [459].

Таким образом, среди причин изменения метаболического статуса при бактериальных инфекциях выделяют выход ферментов из клеток пораженных тканей и органов на фоне усилившегося при патологическом процессе их биосинтеза.

Большой научный интерес и практическую значимость имеет решение вопросов, связанных с оценкой участия отдельных антигенных компонентов возбудителей в формировании ответных защитных реакций макроорганизма. Так,

до сих пор многие вопросы, связанные с механизмами воздействия туберкулина на организм животного или человека, остаются открытыми. Известно, что антитела на туберкулин, при его внутрикожном введении, не образуются. Мажорный белок с молекулярной массой 9,7 кДа, входящий в состав туберкулина, способен вызывать ингибирование миграции макрофагов и частичное угнетение бласттрансформации лимфоцитов морских свинок и тем самым тормозить выработку антител [285, 422]. Лишь недавно был описан способ получения антитуберкулиновых поликлональных антител с использованием в качестве белка-носителя гемоцианина [376].

Последние достижения в области бионанотехнологий демонстрируют возможность использования наночастиц как средства доставки лекарственных препаратов к клеткам-мишеням [592]. Однако чтобы достигнуть цели, наноча-стица должна обойти много преград, защитных барьеров против чужеродных антигенов в организме животного [326]. Применение наночастиц золота в качестве носителя антигенов и терапевтических агентов находит широкое применение в современной медицине и биологии [233, 329, 605].

Цель работы состояла в выявлении взаимосвязи метаболических процессов в организме животных с формированием устойчивости к ряду инфекционных агентов и отборе комплекса наиболее информативных биохимических показателей; характер