Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Обоснование использования наноматериалов в антисептической практике

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Обоснование использования наноматериалов в антисептической практике"

005534955

<А

Кутузова Галина Анатольевна

Обоснование использования наноматериалов в антисептической

практике

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ОКТ 2013

Краснодар 2013

005534955

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»

Научный руководитель -

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Назарова Лариса Степановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Родионова Тамара Николаевна

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Тяпкина Евгения Викторовна

Ведущая организация - ГНУ Саратовский научно-исследовательский институт Россельхозакадемии

Зашита диссертации состоится снс!Гие-!и*Л 2013 года в ^часов на заседании

диссертационного совета Д 220.038.07 при ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет».

Автореферат размещён на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»: http://www.kubagro.ru/.

Автореферат диссертации разослан «^»СйхУ^^аА2013г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13, ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», учёному секретарю диссертационного совета.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук, профессор

И. А. Родин

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Возбудителями гнойно-септических заболеваний человека и животных являются условно-патогенные микроорганизмы пограничных тканей - кожи и слизистых оболочек, а также некоторые бактерии, обитающие в окружающей среде. К условно-патогенным микроорганизмам, прежде всего, относятся грамположительные кокки, грамотрицательные бактерии семейства Enterobacleriaceae, родов Pseudomonas и неспорообразующие анаэробы, дрожжеподобные грибы Candida spp.

Условно-патогещгые микроорганизмы обладают высокой пластичностью, быстро приобретают резистентность к антибиотикам и антисептикам, что связано с выраженной гетерогенностью популяций, мутациями, высокой скоростью размножения. В результате чего антимикробные препараты способствуют непреднамеренному отбору, выживанию и размножению устойчивых особей, дающих потомство (Тимофеев, 2007; Martinez, 2009; Hawkey и др., 2009). Кроме того, клетки, за счёт которых осуществляется первая линия защиты от инфекции, в первую очередь, резидентные макрофаги, не воспринимают их как чужеродные агенты из-за наличия в клеточных стенках этих бактерий особых конформационных изменений (Домарадский и др., 2002).

Антисептики и антибиотики применяются давно, поэтому их влияние на микробные клетки и популяции щучены достаточно полно. Установлены мишени для действия этих препаратов. Вместе с тем микроорганизмы способны эти мишени видоизменять, маскировать, активизировать работу ферментов, разрушающих или метаболизирующих антимикробные areinbi (Падейская, 2000). Поэтому постоянно ведутся поиски новых способов воздействия на условно-патогенные и патогенные бактерии и грибы. Одним из таких способов является применение наноматериалов, т.е. материалов, имеющих размеры до 100 нм.

Наноматериалы, вследствие своих малых размеров, обладают уникальными физико-химическими и биологическими свойствами, совмещая в себе качества частиц — квантов и волны (Арсеньтьева и др., 2009). Они могут встраиваться в цитоплазматические мембраны эукариотических и прокариотических клеток, проникать в их цитоплазму, вступать во взаимодействие с нуклеиновыми кислотами (Фолманис и др., 2009).

Степень разработанности темы. Наноматериалы обладают бактерицидными свойствами по отношению к грамположительным и грамотрицательным прокариотам (Медведева, 2006). Это установлено и in vitro, и in vivo, особенно для наночастиц серебра (Чекман, 2009; Уша и др., 2012).

В литературе приводится очень мало сведений об изменчивости культуральных и морфологических свойств у отдельных видов грамположительных и грамотрицательных бактерий, контактирующих с наноматериалами (Нечаева и др., 2011). Противоречивы данные о

токсических свойствах наноматериалов. Отсутствуют сведения, касающиеся исследований влияния наноматериалов железа, кремния и золота на морфологические, культуральные и биохимические свойства условно-патогенных микроорганизмов, на их чувствительность к антибиотикам; взаимодействия нагруженных наночастицами бактерий с эукариотическими клетками и организмом в целом. Также нет данных о морфологических изменениях в клетках и тканях биопробных животных, в том числе в ранах, обработанных коллоидным золотом в наноформе.

Учитывая вышеизложенное, были поставлены следующие цель и задачи работы.

Цель работы - изучить эффективность препаратов, полученных методом нанотехнологий для лечения гнойпо-септических ран и обосновать целесообразность их внедрения.

Задачи работы:

1. Определить токсикологические свойства наночастиц железа, кремния и золота.

2. Изучить фармакологические свойства наночастиц железа, кремния и золота.

3. Выбрать на основании сравнительных фармакотоксикологических исследований наиболее эффективный наноматериал, который может быть использован для разработки лечебного препарата, санирующего глубокие инфицированные раны.

Научная новизна. Впервые были изучены фармакотоксикологические свойства наночастиц железа, кремния и золота размером 15-30 нм.

Определено влияние наноматериалов железа, кремния и золота на морфологические, культуральные свойства условно-патогенных микроорганизмов, некоторые факторы их патогенности, чувствительность к антибиотикам.

Выявлено, что наноматериалы всех изученных химических элементов адгезируют в виде кластеров на поверхность бактериальных клеток, а наножелезо в восстановленной форме поступает в цитоплазму. Изучен процесс адгезии различных штаммов Escherichia coli на поверхности кремниевых пластин.

Впервые с помощью цитологических и гистологических методов исследовано in vitro и in vivo действие наночастиц на клетки и ткани макроорганизма. Установлено, что из всех изученных наночастиц только золото не обладало повреждающим действием, стимулировало приток макрофагов к месту своего введения, активизировало их, подавляло воспалительный процесс в ранах, обеспечивало освобождение от условно-патогенных бактерий и заживление первичным натяжением.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные позволяют теоретически обосновать ранозаживляющий эффект наночастиц золота, которые эффективно подавляют размножение условно-патогенных бактерий за счёт адгезии на клеточных стенках, снижают выделение факторов патогенности, повышают чувствительность к антибиотикам.

Одновременно оно стимулируют клеточные механизмы защиты и пролиферативные процессы в ранах. На основе наночаспщ золота разработан лекарственный препарат для лечения ран у животных, на который получен Патент «Лекарственный препарат для лечения ран у животных» № 24314В1. Препарат успешно прошёл испытание на лабораторных, мелких непродуктивных животных с открытыми гнойными ранами и на сельскохозяйственных животных с кастрационными и спонтанно полученными ранами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Физико-химические свойства наноматериалов железа, кремния и золота.

2. Результаты фармакотоксикологических исследований свойств наноматериалов железа, кремния и золота.

3. Эффективность применения препаратов нанозолота в качестве антисептика при экспериментальных, спонтанных и хирургических ранах.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов подтверждается использованием широко известных и проверенных методов цитологических, гистологических, иммунологических и микробиологических исследований и оценки общей токсичности нанопрепаоатов, на экспериментальных животных и в ходе клинических испытаний на сельскохозяйственных животных, проведённых на современном уровне со статистической обработкой полученных результатов.

Результаты диссертации были обсуждены и получили положительную оценку на: Международных научно-практических конференциях «Вавиловские чтения» (Саратов, 2007, 2008, 2010); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» (Курск, 2008); конференции по итогам научно-исследовательской и производственной работы студентов (Саратов, 2009); Второй Международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы современной химии» (Астрахань, 2008); рабочем совещании «Инновационные подходы в профилактике, диагностике и лечении зооантропонозных и метаболических болезней животных и человека в Саратовской области» (Саратов, 2009); научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных» (Саратов, 2010); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011); научно-практической конференции с международным участием «Окружающая среда и здоровье» (Саратов, 2012); 7-м Саратовском Салоне инноваций (Диплом второй степени и серебряная медаль).

По материалам диссертационной работы опубликовано 15 работ, из них 5 в изданиях, включённых в перечень ведущих рецензируемых журналов и изданиях ВАК РФ. Опубликована 1 монография.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 161 страницах компьютерного текста, содержит 23 таблицы, 36 рисунков; состоит из трёх глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает в себя 173 источника, в том числе 42 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Методология и методы исследования

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ» в 2007 - 2012 гг.

В качестве наноматериалов были выбраны: коллоидное золото, полученное методом Френса, размер частиц 15-30 им; наночастшш оксида кремния и железа, полученные плазмохимическим методом, размер наночастиц 15-30 нм; пластины пористого кремния, полученные путём электрохимического травления монокрисгаллического кремния. Для сравнения бактерицидной эффективности нанозолота использовали наночастицы серебра (1530 нм), полученные электролизом из азотнокислого серебра. Все выбранные наноматериалы используются либо для наружного применения на кожу и слизистые оболочки, либо для СКйрМЛнБаКИЯ ЖйБОТКЫМ, а ПирйСТЫЙ КрсмННИ - В ОСТсОшшСТИКс (БорИСсЬИч и Др., 2010, Кульзенёва, 2011). Наночастицы золота и серебра были предоставлены кандидатом медицинских наук М.Н. Киреевым (РосНИПЧИ «Микроб»), нанопорошки железа и кремния, а также пластины пористого и гладкого кремния - заведующим лабораторией, кандидатом физико-математических наук Д.И. Биленко (Институт образовательных наноструктур и биосистем СГУ им. Н.Г. Чернышевского, лаборатория диагностики наноматериалов и структур).

Токсикологические, фармакологические и клинические исследования проводили на животных: 165 белых мышах, 54 крысах, 3 кроликах породы шиншилла, 33 мелких непродуктивных и сельскохозяйственных животных. Доклинические изучения наиопрепаратов осуществляли в соответствии с требованиями «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев, 2005). Острую токсичность изучали на белых мышах при однократном подкожном введении нанопрепаратов на основе метода Дейхмана и Лейбланка (1943). Испытывали следующие дозы наночастиц 2,85; 4,28; 6,41; 9,62; 14,43; 21,64; 32,46; 48,69 мкг/кг массы тела. Хроническую токсичность препаратов изучали на белых крысах массой 200-250 г по методу Лима и др (1961). Подкожно вводили в течение 14 дней по 28,5 мкг/кг массы тела, всего 399 мкг/кг массы тела.

При фармакологическом исследовании нанопрепаратов были использованы 7 штаммов микроорганизмов, предоставленных музеем кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ» (Staphylococcus aureus 209 Р, Streptococcus

pyogenes 163, Escherichia coli Ol, K12, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27533, Bacillus cereus 8035, Candida albicans 130), и 39 клинических изолятов, выделенные из ран, отделяемого носа и содержимого кишечника животных (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp., Escherichia coli). Выбор музейных штаммов микроорганизмов был обусловлен тем, что все они относятся к условно-патогенным и могут вызывать гнойно-септические заболевания.

Культивирование микроорганизмов проводили на общеупотребимых, дифференциально-диагностических и элективных средах, рекомендуемых для вышеупомянутых микроорганизмов (Лабинская, 2001).

В работе использовали фармакопейную мазь «Левомеколь» (ООО «Нижфарм» г. Н. Новгород, Россия) и изготовленный нами лекарственный препарат для лечения ран у животных, состоящий из физиологического раствора хлористого натрия, содержащего 0,057-0,060 мкг наночасгиц золота в 1 % растворе цитрата натрия - 0,8-0,6 вес.%, и глицерина - 99,2-99,4 вес.%.

Адгезию и пенетрашпо наноматериалов в бактериальные и эукариотические клетки определяли общепринятыми методами: золото - с помощью обработки мазков бактерий и гистологических срезов перекисью водорода, двухвалентное железо — по методу Маккалума жёлтой кровяной солью, трёхвалентное железо - по методу Перлса красной кровяной солью, нанокластеры кремния изучали в неокрашенных препаратах (Лилли, 1969). Дополнительно адгезию наночасгиц золота у aureus 209 Р изучали с помощью электронного микроскопа.

Влияние наночасгиц железа, кремния и коллоидного золота на чистые культуры бактериальных клеток определяли двумя методами: помещением их в «колодцы» (Лабинская, 2001) или в мясо-пепгонный бульон с последующим высевом на плотные питательные среды.

Действие на Е. coli К 12 и S. aureus 209 Р. наносеребра и нанозолота исследовали в сравнении на восьмиканалыюм спектрофотометре в течение 24 ч при длине волны ).d = 450 нм.

Изучение влияния кремниевых пластин на развитие микробных популяций изщучали следующим образом. Их помещали в мясо-пептонный бульон (МПБ) одновременно с одним из трёх штаммов Е. coli К 12, 4, 7 или S. aureus 209 Р. После инкубации в течение 3, 6 и 24 ч определяли количество микроорганизмов на поверхности пластин и в бульоне (Назарова, 2011). В полужидком агаре проверяли подвижность микроорганизмов штаммов Е. coli, поместив туда отмытые пластаны после инкубации. Дополнительно определяли аутофлуоресценцию кремниевых пластин до и после пребывания в стерильном МПБ с помощью люминесцентного микроскопа.

Цитологические методы исследования проводили in vivo и in vitro, используя клетки перитонеального экссудата и гепаринизированную периферическую кровь кролика (Новиков,

Новикова, 2003). Выделенные клетки инкубировали на пластиковых чашках Петри диаметром 40 мм для получения монослоя, к которому добавляли бактериальные культуры, выращенные с наночастицами золота, кремния или железа в соотношении 10:1. После инкубации в течение 30 мин и 4 ч определяли индекс бактерицидности (Фримель, 1987). В монослое клеток после контакта с бактериями изучали состав форменных элементов и их структуру, окрашивая синькой Лёффлера.

В опытах in vivo наночастицы золота вводили внутрибрюшинно белым мышам и спустя двое суток получали монослой согласно методике (Новиков, Новикова, 2003).

В мопослое изучали: количество клеток - с помощью камеры Горяева и их морфологию; наличие нанозолота (Лилли, 1995); состояние активированности - по способности образовывать розетки с аутологачными эритроцитами; «дыхательный взрыв» - с добавлением на пластиковые чашки Петри по 1 мл раствора нитросинего тетразолия (0,2 % на забуференном физиологическом растворе pH 7.2); индекс бактерицидности (ИБ) - при внесении S. aureus 209 Р в количестве 10:1, выращенного без наночастиц (Фримель, 1987).

В опытах с кровью использовали наночастицы без бактерий, которые добавляли к гепаринизкрованной крови. Послс инкубации при 37 °С через 10, 30, 60 мин и 24 ч делали мазки крови, которые окрашивали по Романовскому - Гимза.

Гистологические исследования проводили общепринятыми методами (Меркулов, 1995). В первом опыте бельм мышам наночастицы золота вводили внутримышечно, подкожно, накожно или через зонд в желудок. Внутрижелудочное введение этих наночастиц осуществляли катетером 3 раза в день по 0,1 мл физиологического раствора в концентрации 0,057 мкг/мл. При парентеральном введении во внутреннюю поверхность бедра инъецировали бактерии штамма Е. coli К 12 или S. aureus 209 Р в дозе 1-Ю5 м.кУ0,5 мл, которые непосредственно перед введением смешивали с наночастицами, взвешенными в стерильном физиологическом растворе в дозе 0,057 мкг/мл. Животным, служащим контролем, в аналогичных условиях вводили физиологический раствор или только микроорганизмы в той же дозе. Через двое суток у забитых животных извлекали кусочки соединительной ткани с лимфатическим узлом, мышечную ткань. Депарафинировашше срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону, толуидиновым синим. В лимфатическом узле выявляли золото (Лишш, 1995).

В опьгге с накожной аппликацией использовали наночастицы золота в физиологическом растворе NaCI (0,057 мкг/мл), которые наносили на скарифицированную кожу живота по 0,1 мл. В контрольной группе мышей использовали только физиологический раствор.

У животных, которым наночастицы золота вводили внутрижелудочно через двое суток проводили микробиологические исследования содержимого толстого кишечника с высевом на питательные среды (Колычев, 2010).

Для изучения возможности применения наночастиц золота в качестве лекарственного препарата для лечения кожных ран у самцов беспородных крыс под эфирным наркозом в межлопаточной области отрезали кожный лоскут размером 2x1,5 см2, дополнительно глубоко повреждали мышцы. На рану наносили 0,1 мл смеси микроорганизмов: P. aeruginosa sp., S. aureus sp., S. pyogenes sp. в дозе 1-107 каждый. Животных разделили на 5 групп по 6 особей в каждой и содержали изолированно в равных условиях. Через 8 ч раны начинали обрабатывать различными композициями наночастиц золота. Первой группе крыс на рану наносили наночастицы золота в физиологическом растворе NaCl, второй - эти паночастицы в смеси с глицерином, третьей - в смеси с вазелином. Наночастицы золота в физиологическом растворе и глицерине наносили на рану с помощью автоматической пипетки по 0,05 мл, в вазелине - с помощью стерильной косметической лопаточки в той же дозе. Концентрация наночастиц золота была одинаковой для всех групп животных и составляла 0,057 мкг/мл. Раны животных четвёртой группы обрабатывали только физиологическим раствором NaCl. Пятой группе животных на рану наносили косметической лопаточкой мазь «Левомекояь» (0,05 мл). Все виды обработок проводили дважды в день в течение 7 суток.

Смывы с поверхности ран для определения микрофлоры проводили через 8 ч после моделироваши ран до первой обработки антисептиками и через сутки - после 2 обработок.

Через 8 суток с начала санации ран животных умерщвляли под эфирным наркозом. Края раны иссекали и подвергали гистологическому исследованию.

Клинические испытания препарата коллоидного золота проводили на мелких непродуктивных и сельскохозяйственных животных, имевших хирургические и спонтанно полученные раны

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Токсикологические свойства наночастиц железа, кремния и золота

Однократное подкожное введение наножелеза в виде инъекции в дозах 2,85-4,28 мкг/кг массы тела не вызывало видимых клинических проявлений. При введении доз 21,64-48,69 мкг/кг, наблюдалась адинамия и заторможенность, но все животные остались живы в течение 14 суток.

При изучении влияния наночастиц железа на показатели крови при однократном введении исследуемого препарата отмечали уменьшение эритроцитов при всех испытуемых дозах по сравнению с контрольной группой. Количество гемоглобина увеличилось прямо пропорционально дозе, вводимой мышам, до концентрации наножелеза 6,41 мкг/кг, затем его уровень достоверно снизился до 3,3х1012/л при концентрации 48,69 мкг/кг. Цветовой показатель крови колебался в пределах нормы. Количество лейкоцитов у животных всех опытных групп достоверно увеличивалось по сравнению с животными контрольной группы,

особенно это проявлялось при введении максимальной дозы 48,69 мкг/кг (Таблица 1). Следовательно, с увеличением дозы подкожное введение наночасгиц железа негативно влияет на организм экспериментальных животных, что свидетельствует о его умеренной токсичности.

Таблица 1 - Показатели крови у белых мышей под влиянием наночасгиц железа

Доза наножелеза, мкг/кг Эритроциты, *1012/л (М±т) Лейкоциты, х109/л (М±т) Гемоглобин, г/л (М±т) Цветовой показатель

2,85 4,7±0,2 6,1±0,4 142,2±0,5 0,91

4,28 4,5±0,3 7,1±0,5* 143,8±0,3* 0,96

6,41 4Д±0,2 7,4±0,4* 144,6±0,2* 1,03

9,62 4,2±0,4 7,5±0,3* 136,1±0,3 0,97

14,43 4,1±0,2* 7,5±0,2* 130,5±0,5 0,95

21,64 3,9±0,1* 7,8±0,4* 124,3±0,2 0,96

32,46 3,8±0,2* 8,1±0,4* 122,7±0,3* 0,97

48,69 3,3±0,2* 9,3±0,4* 115,4±0,2* 1,04

Контроль 4,8±0,4 5,3±0,2 138,3±0,4 0,93

* Достоверность к котролыгой группе Р<0,05.

Однократное подкожное введение нанокремния в физиологическом растворе в дозах 2,85 и 4,28 мкг/кг не вызывало видимых изменений состояния опытных животных в течение всего срока наблюдений. Клинические проявления (адинамия, заторможенность, анорексия) отмечались при использовании дозы 6,41 мкг/кг массы тела животного. При введении дозы 48,69 мкг/кг одно животное из группы пало на 6-е сутки. Признаки интоксикации у мышей, которым вводили нанокремний в дозах 21,64; 32,46 и 48,69 мкг/кг массы тела, отмечали до 9 дней.

При анализе полученных данных по основным показателям крови мышей, которым вводили наночастицы кремния в дозах 6,41 мкг/кг и выше, было отмечено снижение количества гемоглобина и эритроцитов по сравнению с контрольной группой, особенно при максимальной дозе препарата - 48,69 мкг/кг. В крови при введении нанокремния увеличивалось содержание лейкоцитов прямо пропорционально дозе по сравнению с контролем (Таблица 2).

Таблица 2 - Показатели крови у белых мышей под влиянием наночасгиц кремния

Доза нанокремния, мкг/кг Эритроциты, х1012/л (М±т) Лейкоциты, х109/л (М±т) Гемоглобин, г/л (М±т) Цветовой показатель

2,85 4,7±0,4 6,2±0,5 138,4±0,5 0,88

4,28 4,5±0,3 6,6±0,3* 137,3±0,4 0,92

6,41 4,0±0,6* 7,5±0,2* 132,5±0,1 0,99

9,62 3,9±0,4* 7,6±0,1* 126,5±0,2 0,97

14,43 4,0±0,4* 7,6±0,4* 124,9±0,2 0,94

21,64 3,9±0,2* 7,8±0,3* 124,1±0,4* 0,95

32,46 3,6±0,1* 8,2±0,2* 113,6±0,2* 0,95

48,69 3,3±0,3* 8,7±0,1* 107,9±0,2* 0,98

Контроль 4,8±0,4 5,3±0,2 138,3±0,4 0,93

•Достоверность к контрольной группе /'<0,05.

Цветовой показатель находился в пределах нормы у всех групп животных.

Однократное подкожное введение наночасгиц золота в дозе 2,85; 4,28 и 6,41 мкг/кг не вызывало изменения в физиологическом состоянии опытных животных в течение всего срока наблюдений (14 суток). Выраженную клинику интоксикации (снижение реакции на внешние раздражители, отказ от пищи, гиперемия ушей) наблюдались при введении мышам максимальных доз — 32,46 и 48,69 мкг/кг массы тела в течение 4 дней. Достоверное увеличение количества лейкоцитов отмечали при введении дозы 21,64 мкг/мл, что свидетельствовало о проявлении защитных свойств макроорганизма. При этом происходило незначительное снижение количества гемоглобина и эритроцитов. У животных, получивших максимальное количество наночастиц золота (48,69 мкг/кг), количество эритроцитов и гемоглобина снизилось, а уровень лейкоцитов увеличился по сравнению с контролем. Цветовой показатель находился в пределах нормы во всех группах животных (Таблица 3).

Таблица 3 — Показатели крови у белых мышей под влиянием наночастиц золота

Доза нанозолота, мкг/кг Эритроциты, х1012/л (М±т) Лейкоциты, х109/л (.М±т) Гемоглобин, г/л (.М±т) Цветовой показатель

2,85 4,8±0,2 5,3±0,3 138,2±0,2 0,86

4,28 4,7±0,5 5,3±0,4 137,8±0,2 0,88

6,41 4,7±0,3 5,6±0,3 137,5±0,5 0,88

9,62 4,6±0,3 6,1±0,3 137,1±0,5 0,89

14,43 4,6±0,4 6,6±0,4* 134,5±0,2 0,88

21,64 4,5±0,3* 6,8±0,3* 131,3±0,4 0,88

32,46 4,4±0,5* 7,1±0,2* 127,1±0,2 0,87

48,69 4,0±0,3* 7,9±0,4* 121,5±0,2* 0,91

Контроль 4,8±0,4 5,3±0,2 138,3±0,4 0,93

* Достоверность к контрольной группе Р<0,05.

При определении хронической токсичности отмечали, что в крови животных, получавших нанопрепараты, количество эритроцитов снижалось во все случаях по сравнению с контролем. Наименьшее снижение отмечали при введешш нанозолота. Количество лейкоцитов увеличивалось во всех опытных группах по сравнению с контролем. Это было наиболее выражено в случае с нанокремнием, наименее - с нанозолотом. Уровень гемоглобина также снижался в зависимости от природы наночастиц.

Результаты изучения острой токсичности суспензии наночастиц железа, кремния и золота на белых мышах свидетельствуют о том, что при однократном подкожном введении всех препаратов они безопасны согласно ГОСТ. 12.1.007-76 и принадлежат к 4-му классу токсичности.

Изучение хронической токсичности нанопрепаратов показало, что они не обладали кумулятивным эффектом при подкожном введении, так как на протяжении всего эксперимента

пе было падежа животных в опытных группах. Вследствие этого, не удалось рассчитать коэффициент кумуляции.

При сравнении результатов вышеприведённых опытов о влиянии исследуемых наночастиц на состояние лабораторных животных и показатели их крови оказалось, что наименьшие изменения при подкожном введении были при использовании наночастиц золота. Следовательно, данный наноматериал менее токсичен, чем наночастицы железа и кремния.

3.2. Характеристика действия наночастиц железа, кремния и золота на популяции микроорганизмов

На первом этапе исследований было установлено, что наночастицы всех наноматериалов, внесённые в лунки, сделанные в плотной питательной среде и засеянной бактериальными культурами, не действовали на рост микроорганизмов: Staphylococcus aureus 209 Р, Escherichia coli К 12, Bacillus cereus 8035, Candida albicans 130, т.е. они не диффундировали в агар.

Инкубирование микрооргшгизмов в питательном бульоне, куда помешали наночастицы, позволило установить, что наночастицы железа стимулировали размножение эукариотов (С. albicans 130), КОЕ которых увеличивалось на 32 % по сравнению с контролем, и грамотрицательных бактерии (Е. coli К 12 и Р. aeruginosa АТСС 27533). Соответственно уровень их КОЕ возрастал на 44 % (Е. coli К 12) и 11 % (Я. aeruginosa АТСС 27533) по сравнению с контролем. Наножелезо подавляло развитие грамположительных бактерий, особенно стрептококка на 12 % и бацилл - на 5 %.

Присутствие нанопорошка кремния в МПБ подавляло развитие большинства испытуемых культур, особенно это проявлялось по отношению к S. pyogenes 163 (на 37 % меньше КОЕ, чем в контроле), но он стимулировал рост/', aeruginosa АТСС 27533 и С. albicans 130, уровень КОЕ был соответственно на 27,5 и 28,5 % больше, чем в контроле.

В отличие от двух первых нанопорошков коллоидное золото в наноформе подавляло размножение и грамотрицательных, и грамположительных микроорганизмов, особенно стрептококков. Уровень КОЕ у бактерий был в среднем на 30-35 % меньше, чем в контроле. Однако нанозолото незначительно стимулировало размножение С. albicans 130.

У всех видов изучаемых микроорганизмов при контакте с наноматериалами культуральные признаки при росте на жидкой и плотной питательной среде не изменялись.

При бактериоскопическом изучении препаратов, приготовленных из бульонных культур, инкубированных с наночастицами, оказалось, что коллоидное золото, не изменяло ни морфологические, ни тиикториальные свойства изученных прокариотов. Под влиянием наночастиц железа и кремния бледнее, чем в контроле, окрашивались В. cereus 8035, а у грамотрицательных бактерий (P. aeruginosa АТСС 27533, Е. coli Ol) отмечали полиморфизм с

появлением более мелких форм. На морфологию грамположительных кокков все наночастицы влияния не оказывали.

Установлено, что наночастицы золота и кремния адгезировали на поверхности бактериальных клеток в виде кластеров: первые - в виде тёмно-синих зёрен, вторые - в виде коричневых. Нанокластеры железа также были выявлены на поверхности бактерий в виде зёрен. При обработке мазков жёлтой и красной кровяной солью и микроскопии выявлено, что на поверхности бактерий железо было в трёхвалентной, а в цитоплазме - в восстановленной двухвалентной форме. Наночастицы золота были обнаружены на бактериях и в мазках, сделанных из колоний прокариотов, которые вырастали при пересеве культуры с жидкой питательной среды на плопгую. Однако несущих их клеток было меньше. Следовательно, наличие на бактериях наночастиц золота не препятствовало их размножению, но предотвращало адгезию на плотную питательную среду и переводило часть из них в нскультавируемую форму.

Электронномикроскопическое исследование позволило определить наночастицы золота на клеточных стенках стафилококков в виде изолированных зерен или кластеров, состоящих из наночастиц.

В опыте с параллельным изучением действия наночастиц золота и серебра на рост популяций Е. coli К 12 и S. aureus 209 Р выявляли умеренный бактериостатический эффект наночастиц серебра на оба вида бактерий, а наночастиц золота - только на грамнегативные.

Нанозолото оказывало влияние не только на сгафитококки музейного штамма, но и на клинические изоляты (S.. aureus 1, 4, 5, 9, 12). У всех из них снижалась гемолитическая и коагулазная активность, резко повышалась чувствительность ко всем используемым в опыте антибиотикам.

Адсорбция нанокластеров железа и кремния на бактериальных клетках не изменяла чувствительности Е. coli К 12 к химиопрепаратам. У S. aureus 209 Р нанопрепарат железа повышал чувствительность к ампициллину, к другим антибиотикам стафилококки становились устойчивыми. Наночастицы кремния снижали чувствительность микроорганизмов к левомицетину, но не влияли на чувствительность к другим антибиотикам. Нанокремний повышал устойчивость стафилококка к левомицетину и фурагину. Наночастицы золота увеличивали чувствительность Е. coli К 12 к левомицетину. В отличие от всех других наноматериалов oini повышали чувствительность S. aureus 209 Р ко всем изученным химиопрепаратам (особенно к фурагину) по сравнению с контролем.

Наночастицы золота и железа практически не оказывали влияние на антибиотикочувствительность клеток В. cereus 8035 ко всем изученным химиопрепаратам.

Нанокремний обеспечивал значительное повышение чувствительности бацилл только к ампициллину и небольшое - к тетрациклину.

При изучении антибиотикочувствительности штамма С. albicans 130 к двум производным имидазола (кетоконазол, клотримазол) и к двум производным триазола (играконазол и флуконазол) установлено, что наноматериалы повышали резистентность капдид, особенно -нанокремний и коллоидное золото.

Для изучения влияния пористого кремния на бактерии были взяты музейные штаммы S. aureus 209 Р и Е. coli К 12 и два клинических изолята Е. coli 7 Lac+ и Е. coli 4 Lac". В данном случае определяли возможность адгезии указанных микроорганизмов на поверхность кремниевых пластин. Известно, что для адгезии микроорганизмов и образования на них биоплёнки необходимо присутствие на поверхности органических веществ. Свидетельством адсорбции веществ на поверхности пористого кремния служило изменение яркого фиолетового свечения исходной пластины, наблюдаемое в люминесцентном микроскопе, на более тусклое с голубоватым оттенком после её пребывания в МПБ в течение 4 ч, т.е. у пористого кремния изменялся спектр флуоресценции. Несмотря на наличие питательных веществ на кремниевых пластинах, $- пш-pus 209 Р ядгезировял им них только через 6 ч?.сов, с увеличением числя клеток к 24 ч. Е. coli К 12 и два клинических изолята Е. coli 7 и Е. coli 4 адгезировали раньше (уже через 3 ч), когда начинали высеваться с поверхности обоих типов пластин, достигая максимальных значений также к 24 ч. Клетки подвижного штамма Е. coli К 12 не теряли своей подвижности после роста на пластинах. Адгезия и рост кишечной палочки на кремниевых пластинах неоднозначно изменяли чувствительность Е. coli 1 к Е. coli 4 к антибиотиками, но в основном повышали их устойчивость. Таким образом, установлено что, пористый нанокремний не обладает бактерицидным эффектом.

3.3. Микробиологические, цитологические и гистологические исследования безвредности и антимикробной активности наночастиц железа, кремния и золота Нагруженные наночастицами всех химических элементов бактерии влияли на функции и жизнеспособность иммунокомпетенгных клеток, которые заключались в образовании контактов между макрофагами и тучными клетками, дегрануляции тучных клеток, слущивании макрофагов и гибели фагоцитов, поглотивших бактерии. Из всех наноматериалов только коллоидное золото, присутствующее на бактериальных клетках, приводило к стимуляции макрофагов и к перевариванию S. aureus 209 Р без повреждения фагоцитов.

В опытах с клетками периферической крови, к которой добавляли все виды наночастиц, установлено, что наночастицы железа и кремния приводили к снижению поверхностного заряда эритроцитов, связываясь с плазмолеммой, что выражалось в склеивании эритроцитов по типу «монетных столбиков». Нанозолото, первоначально адгезированное на их поверхности, затем

оказывалось между этими клетками. Эритроциты при этом не были повреждены. Одновременно происходила активация моноцитов, которые приобретали форму активированных макрофагов. Имело место повреждение только части полиморфноядерных лейкоцитов, у которых были морфологические признаки апоптоза, но не некроза.

При внутриперитонеальном введении наночастиц золота было установлено, что они стимулировали приток макрофагов к месту введения. При подсчете данных клеток, адгезированных на пластиковую поверхность, выявлено, что их количество было на порядок больше, чем в контроле, когда животным вводили только физиологический раствор. Макрофаги имели признаки активированных. Отмечали их резкую вакуолизацию, включения в цитоплазму и образование розеток с аутолопгчными эритроцитами, «дыхательный взрыв», но индекс бактерицидности был ниже, чем в контроле из-за их гиперактивации высокой дозой наночастиц (0,25 мкг/мл).

Гистологические исследования показали, что наиболее эффективным является накожное, подкожное и внутримышечное использование наночастиц золота. При данных методах введения воспалительных изменений ни в коже, пи в подкожной клетчатке, ни в подлежащих их мышцах не установлено, даже при наличии в инъецируемом материале условно-патогенных бактерий (стафилококков и эшерихий). Наблюдали в соединительной тканп повышенное коллагенообразование, а в мышечной ткани - пролиферацию предшественников миоцигов.

При внутрижелудочном введении белым мышам наночастиц золота отмечали иарушешге нормофлоры кишечника (Таблица 4).

Таблица 4 - Состав микрофлоры толстого кишечника у мышей после внутрижелудочного введения наночастиц золота

Группа бактерий KOE/r (M±m)

опыт норма

Bifidobacterium spp. - 10s... 109

Lactobacterium spp. (1,4±0,02)102 106... 107

Lactococcus spp. (9,2±0,05)T0' 106... 10s

Enterococcus spp. (2,3±0,06)-102 105...106

E. colt spp. (4,3±0,04)-102 107... 10s

Proteus spp. - 104

Staphylococcus aureus sp. - 103

Эффективность применения нанозолота при гнойно-септических процессах у экспериментальных животных

Были созданы три композиции наночастиц золота: взвесь в физиологическом растворе №С1; взвесь в смеси с вазелином или взвесь глицерином. Санирующее действие определяли на

глубоких кожных ранах лабораторных животных. Оказалось, что композиция с глицерином обладала лучшим эффектом, чем другие, превосходя по действию фармакопейную мазь «Левомеколь». При её использовании в ранах обнаруживали бактерии родов Streptococcus spp., Bacillus spp., обладающие гемолитичекой активностью, и Е. coli spp. При обработке лекарственным препаратом на основе наночастиц золота были выделены бактерии по культуральным, биохимическим и морфологическим признакам, относящиеся к кишечной палочке. При применении наночастицам золота количество микроорганизмов через 8 ч после первой обработки ран было на 43 % меньше, чем в ранах, обработанных мазью «Левомеколь», а на вторые сутки - ыа 37 % (Таблица 5).

Таблица 5 - Состав микрофлоры ран крыс

Группа бактерий KOE/r (M±m)

Мазь «Левомеколь» Наночастицы золота в глицерине

Первые сутки после обработки ран

Е. coli spp. 21±0,03 17±0,04

Streptococcus spp. 25±0,04 10±0,03

Bacillus spp. 14±0,05 7±0,03

Вторые сутки после обработки ран

Е. coli spp. 14±0,04 15±0,05

Streptococcus spp. 7±0,03 -

Bacillus spp. 2±0,04 -

В ранах, в зависимости от сроков, имели место различные морфологические изменения. Вначале отмечали повышенное коллагенообразование, продукцию межуточного вещества соединительной ткани, торможение притока полиморфноядерных лейкоцитов, затем -дегрануляцию тучных клеток и увеличение числа нейрофилов. К 8-м суткам полная эпителизация раны происходила только при обработке её лечебным препаратом на основе наночастиц золота. Рубцовая ткань отсутствовала.

Ранозаживляющее действие препарата нанозолота при спонтанных и хирургических раневых процессах у животных

Препарат на основе наночастиц золота в глицерине успешно прошёл испытание не только на лабораторных, по и на мелких непродуктивных животных, лечившихся в Межкафедралыюй проблемной лаборатории ортопедии, травматологии и терапии животных «Ветеринарный госпиталь».

Беспородная кошка поступила с грубыми повреждениями правой задней конечности в виде множественных открытых оскольчатых переломов плюсневого сустава, гнойным воспалением раны. Из раны выделялись бациллы и гемолитический стафилококк, малочувствительные к целому ряду антибиотиков.

Схема лечения: цефтриаксон 75 мг один раз в сутки, линкомицин по 0,5 мл 3 раза в сутки, ронколейкин - 50 тыс.ед. в сутки, взвесь наночастиц золота концентрацией 0,057 мкг/мл в

глицерине, в виде влажной повязки, которую накладывали два раза в сутки на протяжении пяти дней. На вторые сутки после назначения лечебного препарата наночастиц золота рана очистилась, приобрела ровные края. На седьмые сутки животное стало наступать на лапу, общее состояние улучшилось, из раны был высеян только золотистый стафилококк с возросшей чувствительностью к антибиотикам.

Беспородная кошка с вырванной задней левой лапой. При изучении микрофлоры раны выделены Staphylococcus aureus spp., и Streptococcus pyogenes spp., чувствительные к цефазолину.

Схема лечения: цефазолин по 0,5 мл 2 раза в сутки, линкомицин по 0,5 мл 2 раза в сутки, ронколейкин - 50 тыс.ед. в сутки, наночастицы золота в физиологическом растворе в виде спрея дважды в день после промывания раньг. Через двое суток рана очистилась, высевался только Streptococcus pyogenes spp., у которого отмечена чувствительность к назначеїшьш антибиотикам. Через 15 суток животное было выписано с полной эшггализацией раны.

Беспородная собака поступила с множественными огнестрельными ранениями двух переднім конечностей, осложнение вызывали оставшиеся в ранах дробины. Из ран высевались гемолитические бациллы и Staphylococcus aureus. Лечение проводи по той же схеме, что и в предыдущем случае, но наночастицы золота были в глицерине. На вторые сутки после лечения не отмечалось гнойных выделений из ран. Микрофлора представлена только Bacillus spp. Полное выздоровление наступило на 8-е сутки.

В хозяйстве ООО «Время» Энгельсского района Саратовской области проводили клинические испытания препарата на основе наночастиц золота на кастрированных поросятах крупной белой породы в возрасте 1-2 недели. Были отобраны животные в (2 группы по 10 гол. в каждой) по принципу аналогов массой 1200-1400 г, которых содержали в равных условиях в станках для опороса. В конце операции в рану у опытной группы заливали наночастицы золота в глицерине в рекомендуемой дозе (0,057 мкг/мл) по 3 мл. Через 8 и 24 ч на раны вновь наносили нанопрепарат. Контрольной группе поросят после операции в рану засыпали стрептоцид и в те же временные промежутки проводили обработку раствором йода.

В течение суток наблюдали за состоянием животных. Через 24 ч проводили взвешивание поросят и осмотр раны, измеряли температуру, пульс и частоту дыхания.

Клинические исследования препарата на основе наночастиц золота на поросятах подтвердили результаты, полученные на экспериментальных животных. Так, воспаление в послеоперационной ране в контрольной группе отмечали у 6 животных из 10 (60 %), а в опытной - только у одного (10 %). Воспаление сопровождалось повышением температуры тела, учащением пульса, снижепием аппетита и активности молодняка. В контрольной группе максимальная температура поднималась до 40,7 °С, в то время как в опытной группе

повышение температуры выше нормы до 40,3 °С наблюдали только у одной особи. В опытной группе животные были в спокойном состоянии, о чём свидетельствовала частота пульса и дыхания. В контрольной группе снижалась масса животных в среднем на 36 г, а в опытной группе оставалась такой же, как и до операции.

Аналогичный положительный лечебный эффект был получен в эксперименте проведённом в Ветеринарной клинике ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ» при кастрации козлят в возрасте 22,5 месяца.

Выводы

1. Установлено, что при однократном подкожном введении наночастиц железа, кремния и золота размером 15-30 им в физиологическом растворе в виде инъекций в дозе 2,85-4,28 мкг/кг массы тела изменения в состоянии животных не обнаружено. При введении доз нанопрепаратов от 6,41—48,69 мкг/кг отмечалось угнетение состояния опытных животных, снижение реакции на внешние раздражители. Введение наночастиц кремния дозе 48,69 мкг/кг приводило к гибели 20 % животных.

2. Выявлено, что наночастицы железа, кремния и золота являются малотоксичными препаратами, относятся к 4-му классу токсичности (согласно ГОСТ 12.1.007-76) и не обладают кумулятивным действием.

3. Разработан метод совместного культивирования микроорганизмов с напочастицами химических элементов в жидкой питательной среде, при инкубировании в которой наночастицы кремния и золота адгезировали в виде кластеров на поверхности бактерий, а наночастицы железа дополнительно проникали в их цитоплазму.

4. Определено, что наноматериалы не изменяли культуральные свойства микроорганизмов, но по-разному действовали на их размножение и чувствительность к антибиотикам. Из всех наноматериалов только наночастицы золота угнетали рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, препятствовали выделению факторов патогенности и повышали их антибиотикочувствителыюсть.

5. Выявлено in vitro и in vivo, что из всех наноматериалов только наночастицы золота не обладали повреждающим действием на клетки и ткани макроорганизма. Они стимулировали приток макрофагов к месту введения и активировали их, подавляли воспалительный процесс в ранах, обеспечивали освобождение поверхности ран от условно-патогенных бактерий и их заживление первичным натяжением. Оптимальный способ применения наночастиц золота в ветеринарии - наружный.

6. Разработан и прошёл клинические испытания препарат на основе наночастиц золота в глицерине на мелких непродуктивных и сельскохозяйственных животных, получивших спонтанные и хирургические раны. Данный препарат оказался более эффективным при лечении

гнойно-септических ран, чем официнальные препараты мазь «Левомеколь», раствор йода и стрептоцид.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кутузова, Г. А. К вопросу о бактерицидном действии коллоидного золота /Г. А. Кутузова, Л. С. Назарова, А. А. Щербаков, М. Н. Киресв // Материалы конф., посвящ. 120-летию со дня рождения Н.И. Вавилова. - Саратов, 2007. - С. 313-314.

2. Кутузова, Г. А. Современные подходы к лечению животных / Г. А. Кутузова, Л. С. Назарова, А. А. Щербаков // Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса (материалы Междунар. науч.-практ. конф, Курск, 23-25 января 2008, Курск : Изд-во Курская ГСХА, - 2008. - С. 204-206.

3. Кутузова, Г. А. Исследование действия золота в виде наночастиц на прокариотические и эукариотические клетки / Г. А. Кутузова, Л. С. Назарова, М. Н. Киреев // Фундаметальные и прикладные проблемы современной химии: материалы 2-й Междунар. конф., Астрахань, 15-17 апреля 2008. / Астраханский университет. - Астрахань, -2008. -С. 318-319.

4. Назарова, Л. С. Бактерицидное и иммуномодулирующее действие наночастиц золота / Л. С. Начапгтя. Г А. Кутузова .// материяды Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 95-летию Саратовского агроуниверсигега. - Саратов : Наука, - 2008. - С. 166-167. ,

5. Назарова, Л. С. Микробиологический контроль токсичности кремниевых пластин / Л. С. Назарова, Г. А. Кутузова, И. В. Алексеева, Г. М. Желтова // Материалы конф. по итогам научно-исследовательской и производственной работы студентов за 2008 г. - Саратов : Наука, -2009. -С. 15-18.

6. Кутузова, Г. А. Внедрение нанотехнологии в ветеринарную практику / Г. А. Кутузова, Л. С. Назарова // Инновационные подходы в профилактике и лечении зооантропонозных и метаболических болезней животных и человека в Саратовской области: материалы Междунар. рабочего совещания, Саратов, 16-17 ноября. 2009. - Саратов, - 2009. - С. 34-35.

7. Кутузова, Г. А. Динамика роста популяций грампозигавных и грамнегативных штаммов бактерий под действием наночастиц золота и серебра / Г. А. Кутузова, В. В. Галушка, Л. С. Назарова // Актуальные проблемы ветеринарии, патанатомии, физиологии, биотехнологии, селекции животных, современные технологии, переработки сельскохозяйственной продукции: Сб. материалов науч.-практ. конф., Саратов 1-5 февраля. 2010. - Саратов, 2010. -С. 64-67.

8. Кутузова, Г. А. Характеристика микробной контаминации ран у мелких непродуктивных животных, лечившихся в ветеринарном госпитале / Г. А. Кутузова, Л. С. Назарова // Актуальные проблемы современной ветеринарии: материалы Междунар. науч.-практ. конф.,: Краснодар, - 2011. - С. 190-192.

9. Кутузова, Г. А. К вопросу о возможности применения антисептика на основенаночастиц золота в ветеринарной практике / Г. А. Кутузова, М. П. Мариничева, И. Г. Позднякова // Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии и фармации: материалы Межрегион, науч,-практ. конф., Краснодар, - 2012. - С. 167-169.

10. Кутузова, Г. А. Перспективы производства экологически чистой козлятины / Г. А. Кутузова, М. Н. Киреев, В. М. Горбунова, Л. С. Назарова // Материалы науч.-пракг. конф. с международным участием. -Саратов, —2012. -С. 101-103.

11. Кутузова, Г. А. Действие изменённых наночастицами микроорганизмов на иммунокомпетенгные клетки / Г. А. Кутузова, Л. С. Назарова, Д. И. Биленко // Вестник Саратовского госагроуниверситега им. Н.И. Вавилова. - 2009. - № 10. - С. 31-36.

12. Кутузова, Г. А. Наночастицы золота: клеточные механизмы реализации ранозаживляющего эффекта / Г. А. Кутузова, Л. С. Назарова, М. Н. Киреев, Н. А. Шарапова. // Труды Кубанского государственного аграрного университета. — 2010. -№ 6. - С. 127-131.

13. Кутузова, Г. А. Характеристика действия наночастиц кремния на Escherichia coli и клетки крови/Г. А. Кутузова, Л. С. Назарова//Вестник Алтайского ГАУ. - 2011. -№ 8. -С. 74-77.

14. Кутузова, Г. А. Препарат на основе наночастиц золота - перспективное средство для лечения глубоких инфицированных ран у животных / Г. А. Кутузова, Л. С. Назарова // Известия Самарской ГСХА. - 2012. -№ 1. -С. 195-196.

15. Назарова, Л. С. Новые подходы в лечении инфицированных ран кожного покрова / Л. С. Назарова, Г. А. Кутузова, И. Г. Позднякова // Вестник ветеринарии. - 2012. -№ 60(1). - С. 3738.

16. Характеристика действия химических элементов в ионной и наноформе на прокариотические и эукариотические организмы / Л. С. Назарова, В. А. Назаров, И. В. Назаров, Д. И. Биленко, Г. А. Кутузова, Т. А. Проценко. ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ». - Саратов. 2011.-100 с.

17. Пат. 2 431 481 РФ С 1 А61К 3/24, А61Р 17/00 Лекарственный препарат для лечения ран у животных / Г. А. Кутузова, Л. С. Назарова; заявитель я патентообладатель ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ». - № 2010100761/15; заявл. 11.01.2010; опубл. 20.10.2011.

Автор приносит благодарность за консультативную и методическую помощь Галушка В. В. Институт образовательных наноструктур и биосистем СГУ им. Н.Г. Чернышевского, лаборатория диагностики

наноматериалов и стуиур

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать Riso. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 0109

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИП «Экспресс тиражирование» 410005, Саратов, Пугачёвская, 161, офис 320 ® 27-26-93

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Кутузова, Галина Анатольевна, Саратов

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И. ВАВИЛОВА»

СО

см

На правах рукописи КУТУЗОВА ГАЛИНА АНАТОЛЬЕВНА

Обоснование использования наноматериалов в антисептической практике

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О

СО 00

СО Научный руководитель:

со 8

см

° сотрудник

доктор медицинских наук, старший научный

Назарова Л.С.

Саратов 2013

Оглавление

ВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................9

1.1. Антисептические вещества и их применение в ветеринарной фармакологии....................................................................................................................................................9

1.2. Наносоединения и их биологические свойства, перспективы применения в фармакологии................................................................................................................20

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................................42

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..........................................57

3.1. Физико-химические свойства нанопрепаратов железа, кремния и золота..........................................................................................................................................................................57

3.2. Токсикологические свойства наночастиц железа, кремния и золота 66

3.3. Фармакологические исследования препаратов......................................................75

3.3.1. Влияние наноматериалов на микроорганизмы................................................75

3.3.1.1. Влияние наночастиц на микроорганизмы в зависимости от способа контакта..............................................................................................................................................75

3.3.1.2. Сравнительное изучение влияния наночастиц золота и серебра

на рост популяций Е. coli К12 и S. aureus 209 Р................................................................81

3.3.1.3. Изучение адсорбции нанопрепаратов на бактериальных клетках 81

3.3.1.4. Изучение влияния адгезированных нанокластеров различных химических элементов на чувствительность микроорганизмов........................84

3.3.1.5. Изучение влияние нанозолота на клинические изоляты микроорганизмов............................................................................................................................................99

3.3.2. Изучение действия нанопрепаратов на эукариотичкские клетки.... 102

3.3.3. Влияние нанозолота на организм животных........................................................108

3.3.3.1. Влияние наночастиц золота на биоценоз кишечника..................................108

3.3.3.2. Влияние наночастиц золота на перитонеальные макрофаги..............109

3.3.3.3. Влияние наночастиц золота на скарифицированную кожу..............111

3.4. Ранозаживляющее действие нанозолота........................................................................111

3.4.1. Влияние нанозолота на регенеративные процессы........................................111

3.4.2. Экспериментальная эффективность нанозолота при гнойно-септических процессах..............................................................................................................................115

3.4.3. Ранозаживляющее действие нанозолота при спонтанных раневых

процессах у животных................................................................................................................................123

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................................................133

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................................138

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................140

ПРИЛОЖЕНИЕ................................................................................................................................................157

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Возбудителями гнойно-септических заболеваний человека и животных являются условно-патогенные микроорганизмы пограничных тканей - кожи и слизистых оболочек, а также некоторые бактерии, обитающие в окружающей среде. К условно-патогенным микроорганизмам, прежде всего, относятся грамположительные кокки, грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и неспорообразующие анаэробы, дрожжеподобные грибы Candida spp.

Условно-патогенные микроорганизмы обладают высокой пластичностью, быстро приобретают резистентность к антибиотикам и антисептикам. Это связано с выраженной гетерогенностью популяций, мутациями, высокой скоростью размножения. В результате чего антимикробные препараты способствуют непреднамеренному отбору, выживанию и размножению устойчивых особей, дающих потомство [75, 132, 154]. Кроме того, клетки, за счёт которых осуществляется первая линия защиты от инфекции, в первую очередь, резидентные макрофаги, не воспринимают их как чужеродные агенты из-за наличия в клеточных стенках этих бактерий особых конформационных изменений [96].

Антисептики и антибиотики применяются давно, и поэтому их влияние на микробные клетки и их популяции изучены достаточно полно. Установлены мишени для действия этих препаратов. Однако, микроорганизмы в силу гетерогенности их популяций, мутационной и рекомбинационной изменчивости быстро приобретают к ним резистентность [108]. Вследствие этого, постоянно ведутся поиски новых способов воздействия на условно-пратогенные и патогенные бактерии и грибы. Одним из таких способов является применение наноматериалов, т.е. материалов имеющих размеры до 100 нм.

Наноматериалы стали производиться совсем недавно, но сразу в широких масштабах [29], и используются в различных областях хозяйственной деятельности человека: в технике, электронике, химической и военной промышленности, биологии, медицине, сельском хозяйстве, ветеринарии, пищевой промышленности [2, 4, 23, 31, 95]. Вследствие своих малых размеров, наноматериалы обладают уникальными физико-химическими и биологическими свойствами, совмещая в себе качества частиц - квантов и волны [57, 70, 79, 104]. Они могут встраиваться в цитоплазматические и другие биологические мембраны эукариотических клеток, проникать внутрь клеток, вступать во взаимодействие с нуклеиновыми кислотами [69].

Наноматериалы обладают бактерицидными свойствами по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям [7, 22, 86, 134, 148]. Это установлено и in vitro, и in vivo, особенно для наночастиц серебра.

Имеются единичные работы, в которых приводятся сведения об изменчивости культуральных и морфологических свойств у отдельных видов грамположительных и грамотрицательных бактерий [79, 134, 152, 169]. Протеворечивы данные о токсических свойств наноматериалов.

В доступной литературе отсутствуют сведения, касающиеся исследований влияния наноматериалов железа, кремния и золота на морфологические, культуральные и биохимические свойства условно-патогенных микроорганизмов, их чувствительность к антибиотикам, противоречивы данные о токсичности наноматериалов, данные о взаимодействии нагруженных наночастицами бактерий с эукариотическими клетками и организмом в целом, нет сведений о морфологических изменениях в клетках и тканях биопробных животных, в том числе в ранах, обработанных коллоидным золотом в наноформе.

Учитывая вышеизложенное, были поставлены следующие цель и задачи работы.

Цель работы - изучить эффективность препаратов, полученных методом нанотехнологий для лечения гнойно-септических ран и обосновать целесообразность их внедрения.

Задачи работы:

1. Определить токсикологические свойства наночастиц железа, кремния и золота.

2. Изучить фармакологические свойства наночастиц железа, кремния и золота.

3. Выбрать на основании сравнительных фармакотоксикологических исследований наиболее эффективный наноматериал, который может быть использован для разработки лечебного препарата, санирующего глубокие инфицированные раны.

Научная новизна. Впервые были изучены фармакотоксикологические свойства наночастиц железа, кремния и золота размером 15-30 нм.

Определено влияние наноматериалов железа, кремния и золота на морфологические, культуральные свойства условно-патогенных микроорганизмов, некоторые факторы их патогенности, чувствительность к антибиотикам.

Выявлено, что наноматериалы всех изученных химических элементов адгезируют в виде кластеров на поверхность бактериальных клеток, а наножелезо в восстановленной форме поступает в цитоплазму. Изучен процесс адгезии различных штаммов Escherichia coli на поверхности кремниевых пластин.

Впервые с помощью цитологических и гистологических методов исследовано in vitro и in vivo действие наночастиц на клетки и ткани макроорганизма. Установлено, что из всех изученных наночастиц только золото не обладало повреждающим действием, стимулировало приток макрофагов к месту своего введения, активизировало их, подавляло воспалительный процесс в ранах, обеспечивало освобождение от условно-патогенных бактерий и заживление первичным натяжением.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные позволяют теоретически обосновать ранозаживляющий эффект наночастиц золота, которые эффективно подавляют размножение условно-патогенных бактерий за счёт адгезии на клеточных стенках, снижают выделение факторов патогенности, повышают чувствительность к антибиотикам. Одновременно оно стимулируют клеточные механизмы защиты и пролиферативные процессы в ранах. На основе наночастиц золота разработан лекарственный препарат для лечения ран у животных, на который получен Патент «Лекарственный препарат для лечения ран у животных» № 2431481. Препарат успешно прошёл испытание на лабораторных, мелких непродуктивных животных с открытыми гнойными ранами и на сельскохозяйственных животных с кастрационными и спонтанно полученными ранами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Физико-химические свойства наноматериалов железа, кремния и золота.

2. Результаты фармакотоксикологических исследований свойств наноматериалов железа, кремния и золота.

3. Эффективность применения препаратов нанозолота в качестве антисептика при экспериментальных, спонтанных и хирургических ранах.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов подтверждается использованием широко известных и проверенных методов цитологических, гистологических, иммунологических и микробиологических исследований и оценки общей токсичности нанопрепаратов, на экспериментальных животных и в ходе клинических испытаний на сельскохозяйственных животных, проведённых на современном уровне со статистической обработкой полученных результатов.

Результаты диссертации были обсуждены и получили положительную оценку на: Международных научно-практических конференциях

«Вавиловские чтения» (Саратов, 2007, 2008, 2010); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» (Курск, 2008); конференции по итогам научно-исследовательской и производственной работы студентов (Саратов, 2009); Второй Международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы современной химии» (Астрахань, 2008); рабочем совещании «Инновационные подходы в профилактике, диагностике и лечении зооантропонозных и метаболических болезней животных и человека в Саратовской области» (Саратов, 2009); научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных» (Саратов, 2010); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011); научно-практической конференции с международным участием «Окружающая среда и здоровье» (Саратов, 2012); 7-м Саратовском Салоне инноваций (Диплом второй степени и серебряная медаль).

По материалам диссертационной работы опубликовано 15 работ, из них 5 в изданиях, включённых в перечень ведущих рецензируемых журналов и изданиях ВАК РФ. Опубликована 1 монография.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антисептические вещества и их применение в ветеринарной

фармакологии

В настоящее время весьма актуальным для ветеринарной медицины является вопрос патогенеза и лечения ран. Основные трудности в проблеме лечения ран и раневой инфекции связаны с необходимостью разработки обоснованной тактики и лечения. Множественные порезы кожи и раны сельскохозяйственные животные в основном получают в летний период. Как известно, сельскохозяйственные животные являются основными поставщиками на рынок страны молока, мяса и шерсти на рынке. Также важна роль сельскохозяйственных животных, а в особенности пушных зверей в кожевенной и меховой промышленности, где крайне важно чтобы сырьё, т.е. шкура животных была качественной и имела товарный вид. Поэтому, недопустимо наличие залысин, дырочек, рубцов. Кожа должна быть одинаковой толщины для лучшего удобства и качественной выделки. А в случае пушного звероводства требования по качеству сырья ещё выше. Вследствие этого основной задачей для производителей сельскохозяйственных животных является отсутствие повреждений кожи у животных [27, 46, 106, 113].

Домашние питомцы также часто получают кожные раны, которые могут возникать как осложнения после стрижки и тримминга. Тем более что как известно рана - это открытое или закрытое механическое повреждение кожи или тканей, которое сопровождается нарушением структурной целостности. Если при повреждении совершенно отделяется от тела участок ткани, то такая рана с потерей вещества представляет дефект. Основными признаками раны являются боль, зияние и кровотечение, иногда нарушение функции. Впоследствии порезы и раны гноятся и часто покрываются личинками насекомых, тем самым доставляя ещё большее неудобство для животного. При этом наблюдается достаточно интенсивное угнетение центральной

нервной системы и общего состояния организма, доводя животных до дистрофии. В связи с этим хозяйства ежегодно несут большие убытки в результате выбраковки животных, в связи с чем сокращаются сроки их хозяйственно-полезного использования, соответственно, хозяйства получают потенциально меньше животноводческой продукции, поскольку животные не успевают окупить затраты, связанные с их выращиванием [110]. Кроме того, в настоящее время сельскохозяйственное производство находится в крайне тяжёлом состоянии, особенно это касается мелких фермерских хозяйств, из-за отсутствия денежных средств. Для многих сельхозпроизводителей антибактериальные препараты остаются недоступными. Поэтому поиск альтернативных средств в ветеринарной медицине для лечения порезов и ран остается одной из актуальных проблем.

Важна роль антибактериальных препаратов и хирургии для обработки операционного поля, рук медперсонала, инструмента и в дальнейшем -послеоперационной раны. Тем более, что как спонтанно полученные, так и хирургические раны всегда заселяются условно-патогенной микрофлорой, которая попадает с кожных покровов и окружающей среды. В настоящее время возникла проблема и нозокоминальных инфекций, вызываемых антибиотикорезистентными микроорганизмами, циркулирующими в ветеринарных клиниках и госпиталях, которые вторично инфицируют раны. Проблема профилактики и лечения внутрибольничных хирургических инфекций крайне важна [61, 89, 119, 124]. Внутрибольничные инфекционные осложнения не только ухудшают эффект хирургического лечения, но и увеличивают летальность, стоимость и продолжительность лечения. Хирургические раневые инфекции составляют до 40 % среди всех внутрибольничных инфекций. Возбудителями гнойно-септических заболеваний у животных являются условно-патогенные микроорганизмы пограничных тканей - кожи и слизистых оболочек, а также некоторые бактерии, обитающие в окружающей среде. К условно-патогенным микроорганизмам, прежде всего, относятся грамположительные кокки,

грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и неспорообразующие анаэробы, Candida spp.

Условно-патогенные микроорганизмы обладают высокой пластичностью, быстро приобретают резистентность к антибиотикам и дезинфектантам. Это связано с выраженной гетерогенностью популяций, мутациями, высокой скоростью размножения, в результате чего антимикробные препараты способствуют естественному отбору, выживанию и размножению устойчивых особей, дающих потомство [5, 24, 87]. Кроме того, клетки, за счёт которых осуществляется первая линия защиты от инфекции, в первую очередь резидентные макрофаги, не воспринимают их как чужеродные агенты из-за наличия в клеточных стенках этих бактерий особых конформационных изменений [25].

В настоящее время лечение кожных ран обычно проводят при помощи бактерицидных мазей наружного применения, предназначенных для заживления ран, а также растворов АСД, кирилина, дихлофоса и т.д. с пахучими веществами, основным назначением которых является отгон насекомых. Следует отметить, что почти все пахучие средства не обладают эффективным действием, так как их запахи быстро улетучиваются, а их химический состав, проникая через клетки в организ�