Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимоотношение центров организации микротрубочек и центриолей: исследование гигантских клеток слюнных желез Chironomus cingulatus и раннего эмбриогенеза мышей Mus musculus

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Взаимоотношение центров организации микротрубочек и центриолей: исследование гигантских клеток слюнных желез Chironomus cingulatus и раннего эмбриогенеза мышей Mus musculus"

МОСКОВСКИ!! ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Н.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

тп од На правах рукописи

, d .........

АБУМУСЛИМОВ САИДХАМЗАТ САИДМАГОМЕДОВИЧ

УДК 576.353:576.311

ВЗАИМООТНОШЕНИЕ ЦЕНТРОВ ОРГАНИЗАЦИИ МИКРОТРУБОЧЕК И ЦЕНТРИОЛЕИ:

ИССЛЕДОВАНИЕ ГИГАНТСКИХ КЛЕТОК СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ CHIRONOMUS CINGULATUS И РАННЕГО ЭМБРИОГЕНЕЗА [ШЕИ MOS MUSCULUS

03.00.11 - ЭМБРИОЛОГИЯ, ГИСТОЛОГИЯ И ЦИТОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата Отологических наук

Москва - Г994

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители: докт. биол. наук, профессор Ю. С.Чепцов

докт. биол. наук Е.С.Надекдина

Официальные ошоненты: докт. биол. наук Б.В.Конюхов

канд. биол. наук В.Б.Быстревская

Ведущее учреждение: Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова Российской АН

Защита диссертации состоится Й94 г.

в/^> часов на заседании специализированного биологического совета Д 053.05.68 в Московском государственном университете им М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ, Учений совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 1994 Г-

Ученый секретарь совета кандидат биологических наук

Е.Н.Калистратова

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Функцию организации микротрубочек в клетках животных эСично выполняет центросома. которая состоит из пари дентриолей. окруженных осмиофильным электронноплотшм герицентриолярным материалом. Показано, что макромолекулярные сомплексы, на которых происходит инициация роста дасротроубочек, расположены в пернцентрюлярном материале, и Предполагают, что центриоли играют роль каркаса, вокруг соторых этот материал концентрируется. Однако существует много гримеров, когда в клетках нет центриолей, и центры организации йпсротрту бочек (ЦОМТ) представлены скоплениями

герицентриолярного материала различной морфологии (Воробьев, [адеядина, 1987). Так, центриоли обычно исчезают из клеток на ;ТЭДИИ ТерМИНаЛЬНОЙ ДИффереВЦИрОВКИ (Tassin et al., 1985; ;onnoily et al., 1985), и отсутствуют в раннем эмбриональном )азвитии млекопитающих (Szoiiosi, 1972,- szoiiosi, 1973;

Ichatten et: al., 1988; Maro et al., 1991).

Относительно того, как образуются ЦОМТ, лишенные [ентриолей, имеется довольно мало данных. Показано, что в ышечных клетках, в частности, материал ЦОМТ сосредоточен у [дерной оболочки (Tassin et al.. 1985), НО В ЭТИХ КЛеТКЭХ МЭЛО икротрубочек. Не ясно, как организуются микротрубочки, и как неположен материал ЦОМТ в клетках, где микротрубочек много, и ни играют важнуп роль в осуществлении функций клетки, а ;ентриолей нет - в гигантских клетках слюнных желез двукрылых Онищенко, Ченцов, 1977).

В раннем развитии млекопитающих ахромзтиновый аппарат во ремя дробления зиготы функционирует без центриолей. В ходе аннего эмбриогенеза изменяется также белковый состав ятотического веретена и центров организации микротрубочек Hiraoka et al., 1988). Митотические веретена имеют явергентное строение, и механизмы их формирования и их изиология изучены недостаточно. Не ясно, как организованы икротрубочки в интерфазных клетках эмбрионов.

Данные о времени появления центриолей de novo у лекопитающих носят противоречивый характер. Так, по одним

данным они начинают появляться начиная со стадии 0-16 бластомеров (Szoiiosi, 1973), а по другим - со стадии бластоцисти (Dvorak, 1978; Maro et al ., 1991).

Практически не изучен уникальный процесс формирования центриолей de novo у млекопитающих. Имеющиеся в литературе дашше отмечают лишь наличие в клетках поздней бластоцисты ОрТОГОНаЛЬНОЙ пары ЦеНТрИОЛеЙ ( Maro et al., 1991), но

ультраструктура этих центриолей не описана. Не ясны и взаимоотношения формирующихся центриолей и микротрубочек клетки, а также пути формирования в клетках единой центросомы, состоящей из центриолей и перицентриолярного материала.

Целью настоящей работы было изучить с помощью ишуноцитохимических ■ и электронгомикроскопических методов центры организации и систему микротрубочек в гигантских клетках слюнных желез chironomus cinguiatus и ахроматиновый аппарат в раннем развитии у мышей Mas nuscuius.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- Изучить организацию микротрубочек в гигантских клетках

СЛЮННЫХ желез Chironomus cinguiatus.

- Изучить точное время появления центриолей de novo у мышей в раннем эмбриональном развитии.

- Исследовать процесс морфогенеза de novo центриолей, а также формирование центросомы в раннем развитии мыши. -Изучить влияние различных воздействий на форму

бесцентрюлярного веретена на ранних стадиях развития мыши.

Научная новизна

В работе на электронномикроскопическом и иммуноцитохимическом уровнях получены новые данные о структуре ахроматинового аппарата в раннем развитии мыши и о морфогенезе центриолей de novo. Впервые исследована организация мякротрубочек в гигантских клетках елтных желез мотыля.

Показано, что в гигантских клетах слюнных желез chironomus cinguiatus функцию организации микротрубочек выполняют множественные бесцентриолярные центры, как ассоциированные с ядром, так и распределенные по цитоплазме. При этом большинство микротрубочек в апикальной части клеток направлено от ядра к

просвету железы.

Продемонстрировано, что центриоли d мышиных эмбрионах, развивающихся in situ, появляются асинхронно в различных клетках на стадии бластоцисты 4 суток развития. Центриоли возникают как в клетках трофэкто дермы, так и в клетках внутренней клеточной массы.

Показано, что при морфэгенезе de novo центриоли проходят . "пвенильную" стадию развития (стадию процентриоли), характерную для всех известных способов формирования центриолей. Формирующиеся в эмбрионах мши de novo центриоли не связаны с какими - либо органеллами - предшественниками.

• Выявлено, что новообразованные центриоли в начальной стадии их формирования не являются центром организации микротрубочек в клетке. Сначала формируются центриоли , а затем вокруг них группируются остальные компоненты центросомы и, таким образом, происходит созревание центросомы.

С помощью мояоклональных антител, направленных против одного из антигенов центросомы, показано, что этот антиген впервые появляется на стадии бластоцисты, что совпадает по времени с появлением в них центриолей на электронномикроскопическом уровне.

Продемонстрировано, что установление конвергентной формы . веретена деления дробления у мышей не связано с наличием или отсутствием центриолей в их полюсах.

Показана зависимость формы бес це нгрио лярно го веретена деления ранних стадий развития мыши от различных воздействий.

Научно-практическое значение диссертации

Результаты данного исследования имеют теоретическое научное значение, так как способствуют более глубокому пониманию физиологии микротрубочкового цитоскелета клеток, в том числе ахроматинового аппарата в раннем развитии млекопитающих Получены принципиальные новые данные о морфогенезе центриолей и центросом de novo у млекопитающих. Также впервые показана возможность направленной организации сети микротрубочек без участия центриолей или единственной

з

центросомы другого строения.

Разработанные в диссертации методические подхода могут бить использованы в других лабораториях для изучения цитоскелетшх структур в эмбрионах млекопитапдих и в очень крупных клетках.

Полученные в работе дашше могут быть использованы в курсах лекций и в учебниках.

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на семинарах отдела электронной микроскопии НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского и кафедры цитологии и гистологии биологического факультета МГУ. Они также были доложены на 33 Ежегодной Конференции Американского Общества Биологов Клетки (Новый Орлеан, 1993 г.).

Материалы и методы исследования I. Иммуноцитохтякеское исследование гигантских клеток

слюнных желез мотыля В работе были использованы личинки комара смголотие сЫсги1аьиз. содержавшиеся длительное время в проточной воде без кормления.

При получении препаратов цитоскелета слюнных жЬлез у личинок отделяли головную капсулу и выделяли слюнные кёлезы в растворе Ринальдини. Выделенные и сполоснутые слпнные железы переносили в лизирупцую смесь, состоявшую из 1% - ного Тритона Х-100 и 4 М глицерина на буфере 1км (50 пМ имидазола, бо тм КС1, 1 тМ ЭГТА. 0.1 тМ ЭОТА, 0.5 тМ МдС12< 1 гоМ меркаптоэтанола, рн 6.8) на 40 минут, а затем промывали в буфере 1км. Эти процедуры проводили в пластиковых чащках Петри объемом 5 миллилитров. В таких чащках Петри лизированные слюнные железы не прикреплялись к подложке. Затем железы в капле буфера 1км переносили на чистое предметное стекло, предварительно покрытое полилизином в концентрации 0,1 мг/мл. Накрывали ПОКРОВНЫМ СТеКЛОМ, Обернутым ПлеНКОЙ РагаЕ д_1т и придавливали грузиком массой 50 граммов. Препарат фиксировали, протягивая под стеклом в течение 15-20 минут 0,5%-ный раствор глутарового альдегида на фосфатно-солевом рвэ, рн 7,2-7,4.

Полученные препарата цитоскелета слышшх желез окрашивали бриллиантовым сишш для исследовашш на светооптическом уровне, а также с антителами к тубулину по непрямому методу Кунса для иммуноцитохимического изучения.

Для разрушения микротрубочек виделешше в растворе Ринальдини слюнные железы инкубировали при 1°С с 20 мкг/мл нокодазола (sigma, США) в течение 2-3 часов. Для наблюдения динамики восстановления интерфазных микротрубочек железы отмывали в растворе Ринальдини при комнатной температуре в течение 15 минут. 30 и 60 минут.

2. Получение эмбрионов мышей.

• Для исследования ранних эмбриональных стадий в работе были использованы МЫШИ - гибриды (СВА/1ас X С57В1/6) Fl. Неоплодотворенные яйца получали у самок, определяя стадии астрального цикла. Для получения эмбрионов самок подсаживали к самцам на ночь. В различные сроки с момента подсадки самок умерщвляли, вырезали яйцеводы и рога матки, и из них с помощью микропипетки, вымывали яйца и эмбрионы в теплую среду М2 (94.7

mM NaCl, 4,78 тМ KCl, 1,19 тМ MgS04 7Н20, 1,19 тМ КН2Р04< 1,71 тМ СаС12 2Н20. 4 тМ NaH(X>3, 21 тМ HEPES, 23,3 тМ ЛЭКТЭТа Na, о.зз шм пирувата на, 5,56 гом глюкозы, loo мг/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, рн-7,4), содержащую 4 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Quin et al., 1982). Для удаления фолликулярных клеток и блестящей оболочки использовали гиалуронидазу (Sigma) И прОНЭЗУ Р (Serva) .

Мышиные эмбриональные фибробласты получали из 18-дневных эмбрионов, трипсинизируя их, и культивировали в среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки.

3. Иммуноцитохимическое исследование яиц и эмбрионов мыши Для прикрепления эмбрионов и неоплодотворенных яиц к стеклу были сконструированы специальные камеры по принципу, предложенному в работе (Maro et al., 1984). Камеры состояли из из стеклянной шайбы (толщиной 2 мм, наружным и внутренними диаметром 18 и 15 мм, соответственно), которая дентальным воском прикреплялась к покровному стеклу. На стекло наносили раствор конканавалина А (ОД мг/мл; sigma) . Далее камеры споласкивали и наполняли средой ГС с 4 мг/мл

гюлившгалпирролвдона. Микрокагшлляром на покровное стекло камеры переносили яйца и эмбрионы с удаленной блестящей оболочкой. Камеры закрывали вторим покровным стеклом и помещали в центрифужную пробирку с отверстием у основания и вкладышем -поршнем в конической части. Яйца и эмбрионы прикрепляли к стеклам, центрифугируя их при 500 g в течете 10 мин при комнатной температуре в роторе центрифуги we-g (ПНР) с откидывающимися стаканами. После центрифугирования камеры удаляли из пробирки с помощью вкладыша - поршня и снимали с них верхнее стекло. Сперматозоиды мыши прикрепляли к стеклу аналогичным образом. Все дальнейшие процедуры экстрагирования, фиксации, окрашивания и отмывки яиц и эмбрионов проводили в камерах, помещая их в чашки Петри объемом 5 мл.

Для иммуноцитохимического окрашивания яйца, сперматозоиды, эмбрионы экстрагировали в буфере ikm , содержавшем 1% Тритон X-IOO и 4 M глицерина, в течение 30 минут, а мышиные эмбриональные фибробласты - 5 минут. Клетки промывали в буфере г км и фиксировали 3* 'формалином в течение 60 мин. Затем отмывали фиксатор в буфере pbs и проводили иммунофлуоресцентное окрашивание по непрямому методу Кунса, а также окрашивали красителем Hoechst 33258. Препараты просматривали и фотографировали в Фотомикроскоде-3 ("opton", ФРГ).

Для изучения влияния различных способов фиксации на форму веретена деления ранние эмбрионы после удаления блестящей оболочки фиксировали в 3 t формальдегиде, а затем проводили пермеабиализацию детергентом. Также применяла фиксацию с помощью смеси абсолютного метанола с глицерином в различных количественных соотношениях (9:1; 3:1) при температуре - 20°С.

Для изучения способа организации микротрубочек в интерфазных клетках эмбрионов прикрепленные к стеклу эмбрионы охлаждали до 1®с в течение 30 мин, а затем помещали в термостат на 15-20 мин.

При иммунофяуоресценгном окрашивании использовали антитела: моноклональные rn-cg (igc2 класса) против общего фосфопептида нескольких белков ядра и центросомы (Абаимова, Надевдина, 1992); моноклональные dm-i против туОулина (sigma); моноспецифические поликлональные против тубулина, полученные в

щюлике (любезно щдадостаплешшо О.Н.Плетюшкииоп); антитела против иммунолобулинов мыши. получешше п козе и коныогированше с тршетилродашшпзотиоииаиатом (tritc) (sigma) и антитела против иммуноглобулинов кролика, получешше в козе, конъюгировашше с флуоресцсигазотиоцизнатом (fitc> (sítjma) . 4. Электрошюмикроскопическое исследование ранних эмбрионов мыши

Извлечемте из яйцеводов эмбрионы споласкивали в фэсфатно - солевом буфере Зеренсена (ри 7,2), фиксировали в 2,5ï-hom растворе гдутарового альдегида в этом буфере в течение 2 часов при комнатной температуре и постфпссировали в 1*-ном oso4. Зародыши контрастировали в уранилацетате, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне и заключали в Эпон.

Серийные полутонкие срезы (0,2 мкм толщиной) изготавливали на ультрамикротоме Reíechert-Jung (Австрия); окрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в электронном микроскопе ни-ив (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 75 kv.

Кроме того, для электронномикроскопического исследования были использованы лизированвые зародоии на стадии морулы. это процедура облегчала наховдение эмбрионов с митотическими клетками. Для этого эмбрионы с удаленной блестящей оболочкой прикрепляли к покровным стеклам как это описано выше. Прикрепленные к стеклам зародыши лизировали в течение 30 минут при комнатной температуре в буфере гкм, содержащего 25 v глицерина и 1% Тритон Х-100. Далее лизированнне зародыши промывали в свежем буфере ikm и фиксировали 2.5v глутаральдегиде, приготовленном на этом же буфере, в течение 60 минут. Остальные процедуры проводили, как это описано выше.

Результаты и обсуждение

Светооггтическое и иммунофяуоресцеитное исследование центров организации микротрубочек и системы микротрубочек в_гигантских клетках слюнных желез мотыля.

В клетках слюнных желез личинок сьхгопотик. лизированных в детергенте, фиксированных глутзровым альдегидом и окрашенных

бриллиантовым синим, выявлялась густая сеть фибриллярных структур. В апикальной части фибриллы были ориентированы в сторону просвета железы, а в базалыюй части клеток сеть фибрилл была беспорядочной. В цитоплазме помимо фибрилл выявлялись округлые плотные структуры. После инкубации желез на холоде с нокодазолом фибриллы исчезали, а в цитоплазме видны были только эти гранулы.

При иммунофлуоресцентном окрашивании антителами к тубулину в гигантских клетках слшвых желез выявлялась густая сеть микротрубочек, заполняющая практически всю цитоплазму. Характер расположения микротрубочек соответствовал расположению фибрилл, выявляемых при окрашивании бриллиантовым синим.

В хорошо распластанных клетках, окрашенных антителами к тубулину можно увидеть множественные узлы сгущения, из которых выходят микротрубочки. При фазово-контрастной микроскопии этих же клеток в их цитоплазме не было видно каких-либо фибрилл, а расположение немногочисленных мелких плотных гранул не совпадало с расположением немногочисленных центров сгущения микротрубочек. В центрах сгущения при фазово-контрастной микроскопии был виден только материал средней плотности, который в виде тяжей и ячеек заполнял цитоплазму. Расположение центров сгущения совпадало с расположением узлов таких ячеек.

После обработки слюнных желез нокодазолом на холоде в течение 3 часов сеть микротрубочек в гигантских клетках разрушалась, хотя по периферии ядра флуоресценция сохранялась. После отмывки от нокодазола в течение 15. минут в цитоплазме появлялся интенсивно окрашивающийся антителами к тубулину материал в виде мелких пятен небольшого диаметра, разбросанных по цитоплазме и в большом количестве сосредоточенных возле поверхности вдра. Эти пятна обычно имели звездчатую форму.

После 30 минут отмывки от нокодазола в цитоплазме гигантских клеток были видны многочисленные звездчатые структуры, образованные несколькими короткими микротрубочками, а также свободные микротрубочки.

Через 60 минут отмывки от нокодазола цитоплазма гигантских клеток в основном вся была заполнена микротрубочками. Особенйо много микротрубочек было в -околоядерной области. За это время

отмывки от нокодазола практически происходило восстановление исходной структуры микротрубочек с ориептацие11 от ядра к апикальной части клетки.

Паше исследование показало, что гигатские клетки слюнных желез с!игопошиз содержат большое количество микротрубочек, которые в апикальной части клеток имеют выраженную ориентацию от ядра к просвету железы. Основной функцией данных клеток являются синтез и выделение глккопротеидного секрета (Кикнадзе и др., 1985), и, вероятно, микротрубочки участвуют в организации направленного транспорта гранул этого секрета к апикальной поверхности, подобно тому как это происходит в . экзокринных. клетках другого происхождения (Рагсгук еь а1.. 1989). Однако эти микротруОочки не имеют сколько-нибудь выраженного единственного центра организации. Вместо одного общего центра мы наблюдали многочисленные мелкие центры организации микротрубочек, разбросанные по цитоплазме и в несколько в большом количестве сосредоточенные у ядерной поверхности. Поскольку при электронной микроскопии гигантских клеток слюнных желез в их цитоплазме не удается обнаружить центриолей (Онищенко, Чепцов, 1977), вероятно, можно утверждать, что данные клетки содержат бесцентриолярные центры организации микротрубочек.

Утрата центриолей гигантскими клетками слюнных желез, вероятно, связана с их полиплоидизацией; так, в полишгащдазирулцихся фолликулярных клетках дрозофилы центриоли также утрачиваются (МаЬс^аМ еЪ а1., 1979). В полиплоидных . клетках поперечнополосатых мыщц, лишенных центриолей, роль центра организации микротрубочек переходит к ядерной оболочке (Tassi.ii ее а1., 198Б). В гигантских клетках .слюнных желез мы также наблюдали интенсивный рост микротрубочек от поверхности ядра, однако нам представляется наиболее вероятным, что возле ядра сосредоточены те же центры организации микротрубочек, что и разбросанные по цитоплазме.

Из наших данных следует, что сеть интерфазных микротрубочек способна к самоорганизации, и, следовательно, организация направленных микротрубочек не является прерогативой центросомы, содержащей центриоли.

Влияние .различных_обработок_яйцометок_ _и._эмарш1ЮБ_ на__$орму бесцентриолярного.веретена.

Мейотическое веретено в неоплодотворешюй яйцеклетке является дивергентным и имеет широкие бесцентриолярные полюса. В наших экспериментах оказалось, что форма полюса веретена может сильно изменяться в зависимости от способа фиксации. При фиксации смесью метанола с глицерином в соотношении 9:1 веретно выглядит более сжатым и более "конвергентным", чем при фиксации той же смесью в соотношении 3:1. Сразу после прикрепления яйцеклеток к стеклам с помощью центрифугирования веретено имело дивергентную форму. Если, яйцеклетки после этого еще инкубировали в среде М2 при 37°С, полюс веретна заметно уплощался, и размеры веретена увеличивались. Таким образом, эти данные показали, что форма и размеры бесцентриолярного веретена, в отличие от веретена, имеющих центриоли, очень чувствительны к внешним воздействиям.

Показано, что веретена первых делений дроблений у маей также имеют дивергентную форму. Однако, по данным некоторых авторов (schatten et ai., 1985), эти веретена могут быть конвергентными в начальный момент инициации сборки веретена в ранней метафазе, а затем приобретать дивергентную? форму, которую они сохраняют и в анафазе. Начиная с третьего) деления дробления, веретена приобретают, по-видимому, окончательно конвергентную форму, что приводило к предположениям, что в клетках ПОЯВИЛИСЬ центриоли (Szollosi, 1973; Schatten et al-, 1985). Исследование метафазного веретена второго деления дробления более 30 эмбрионов с помощью фиксации в смеси метанола с глицерином (3:1) не выявило в них конвергентной формы веретена, в то время, как при быстрой фиксации в формалине с последующим лизисом клеток (исследовано около 20 эмбрионов) полюс веретена всегда был конвергентным. В первом и втором делении дробления всегда встречалась дивергентная форма веретена в метафазе после ■ прикрепления эмбрионов с помощью центрифугирования при скорости 500 д.

Оказалось также, что при прикреплении эмбрионов к стеклам при высокой скорости центрифугирования (около 1000 д) веретена

четвертого деления дробления разрушаются и имеют вид пучков или фибрилл, радиалыго расходящихся из центра клетки. При скорости 500 g они всегда сохраняют конвергентную форму. После инкубации эмбрионов с разрушенными веретенами в термостате при 37°С в течение 15-30 минут происходит восстановление конвергентной, биполярной формы веретена.

Эти данные показывают, что наблюдаемая форма полюсов метафазного веретена деления дробления может на самом деле сильно зависеть от способа фиксации клеток, и появление устойчивой конверегенгной формы веретена, по-видимому, не связано с появлением или отсутствием в клетках центриолей. Кроме того, эти данные предполагают с осторожностью относится к терминам "конвергентное и дивергентное веретено". По-видимому, по своей устойчивости бесцентриолярные веретена ранних эмбрионов мышей заметно отличаются от таковых у растений. У последних была показана высокая устойчивость полюса (конвергентной формы) к механическому раздавливанию и к высокой концентрации кальция (Eascin, Cande, 19905.

С другой стороны, совершенно не ясными остаются механизмы установления ковергентной формы митотического веретена. Вероятно, важную роль в этом процессе играют белки, ассоциированные с мшсротрубочками, в том числе, белки - моторы, скапливающиеся у КОНЦОВ микротрубочек (Sawin, Schouley, 1991; Theurkauf, Hawley,1992; Katsurai, Endow, 1992).

Ш№°ФЗДоресцентное_исследование _ эмбрионов мышей .9_вд™5ью_шноклонального антитела rh-c6 .

I. Иммунофлуope сцентное окрашивание мышиных эмбриональных фибробластов

В интерфазе в клетках мышиных эмбриональных фибробластов интенсивно окрашивалось ядро в виде дискретных зон, а также двойная точка в цитоплазме возле ядра - центрколи в составе центросомы. В митозе антитела rn-c6 окрашивали в метафазе и в анафазе полюса веретена деления, в телофазе - остаточное тельце. Таким образом, окрашивание мышиных эмбриональных фибробластов, которых можно считать завершающей стадией эмбрионального развития, соответствовало ранее описанному

характеру окрашивания датами антителами других клеточных культур млекопитающих (Абаимова. Надекдина, 1992). Эти антитела узнавали общий фосфопептид нескольких белков культивируемых клеток, а также белков мозга MAPI, nf-l и nf-m. Ранее было показано, что подобные антитела к MAPI могут узнавать в клетках культуры гкани два разных пула антигенов: один из которых все . время на протяжении всего клеточного цикла связан с центросомой, а в телофазе еще и с остаточным тельцем, другой -в интерфазе локализуется в ядре, а в митозе, предположительно, принимает участие в формировании веретена (sato et al., 1983,-

Diaz-Nido et al.. 1989). При ИММУНОЗЛеКТрОННОМ ИССЛеДОВЭНИИ

было выяснено, что антитела rn-cs связываются с матриксом центриолей.

2. Иммунофлуоресценгное окрашивание антителами rn-c6 гамет и ранних эмбрионов мыши

В предовуляторном ооците мыши антитела rn-сй окрашивали ядро в виде многочисленных дискретных зон, причем область ядрышка оставалась неокрашенной. В цитоплазме какие-либо структур! не окрашивались. В целом характер окрашивания антителами rk-cs ядер ооцита соответствовал характеру окрашивания ядер в соматических культивируемых Клетках . (Абаимова, Надекдина, 1932). Сравнение с окрашиванием ядра красителем Hoechst 332S8 показало, что в ядре окрашивались интерхроматиновые зоны, где в ооците происходит активная транскрипция. В неоплодотворенной яйцеклетке антитела rn-cs окрашивали цитоплазму. Окрашивание мейотического веретена или каких-либо пятен в цитоплазме отсутствовало.

В нативном спермии окрашивалась аксонема спермин и - более ярко - область центриоли.

В зиготе антитела RN-ce диффузно окрашивали цитоплазму, при этом отсутствовало окрашивание в пронуклеусах. Кроме того, в цитоплазме зиготы интенсивно окрашивалась аксонема спермия. Такой же характер окрашивания цитоплазмы, а также окрашивание аксонемы спермия. сохранялся в митотической клетке при первом делении дробления. Начиная со стадии двух бластомеров, антитела RN-ce всегда окрашивали ядро в интерфазной клетке в виде . дискретных пяген, а аксояему спермия вплоть до стадии морулы

(8-16 бластморов). В цитоплазме митотических клеток вплоть до стадии бластоцисты окрашивания ни центросом, ни митотических фигур не было выявлено. Отмечалось слабое диффузное свечение цитоплазмы митотической клетки, вероятно, из-за выхода в цитоплазму в митозе ядерного антигена rn-cg.

Распределение антигена rn-cg в гаметах и ранних эмбрионах мышей отличается от того, что было ранее описано для других центросомных антигенов. Другие антигены перицентриолярного материала располагались в полюсах мейотического веретена и веретена первого деления дробления, а также в цитоплазме яйцеклетки И ЗИГОТЫ в виде отдельных пятен (Calaro-Gillam et ai..- 1983; маго et ai., 198S). Антитела rn-c6 не окрашивали ни полюсов мейотического веретена, ни отдельных пятен в цитоплазме яйцеклетки и зиготы. Вероятно, это связано с тем, что антиген rn-cg содержится не в перицентриолярном материале, а связан непосредственно с центриолями.

Диффузное окрашивание цитоплазмы в яйцеклетке, зиготе и митотических клетках более поздних зародышей, да-видимому, обусловлено ядерным антигеном, узнаваемым антителами rn-c6. Ядерный антиген, попадающий в цитоплазму после разрушения зародышевого пузырька ооцита, вероятно, на двуклеточной стадии вновь ре локализуется в ядра, что совпадает с возобновлением в них граскрипции (Дыбан, 1988; Dean et ai., 1989). Очевидно, что этот антиген не входит в состав веретена деления, как это предполагалось ранее (Sato et al., 1983,- Bonifacino et al., 1985; Diaz-Nido et al., 1989), ПО Крайней Мере, В раННИХ

эмбрионах мыши.

3. Иммунофлуоресценгаое окрашивание антителами эмбрионов мыши на стадии морулы и бластоцисты

Впервые окрашивание центриолей (центросомы) монАТ rn-cg в интерфазе, а также в митотической клетке, мы обнаружили на стадии бластоцисты 4 сут.развития. Оно появлялось в виде отдельной точки в цитоплазме митотической клетки. Иногда в митотической клетке окрашивались две точки, которые располагались близко друг от друга, несмотря на то, что клетка находилась на стадии метафазы. На более поздней стадии бластоцисты (около 4,5 сут. развития) в митотических клетках

окрашивались полюса веретена, хотя чаще встречались веретена деления, окрашивание полюсов которых отсутствовало. На этой стадии также окрашивалась единственная точка в цитоплазме некоторых интерфазных клеток.

Окрашивание остаточного тельца антителами RN-сб в эмбрионах мыши также впервые появилось на стадии бластоцисты. До стадии бластоцисты как остаточное тельце, так и митотическое веретено не узнавались антителами rh-cg. Однако и на стадии бластоцисты также встречались неокрашенные остаточные тельца. Окрашивание точек в цитоплазме или в полюсах митотического веретена антителами RN-сб встречалось лишь нескольких (2-6) клетках одной бластоцисты, содержащей более 70 клеток.

Время появления окрашенных монАТ RN-ce точек в цитоплазме соответствует электронномикроскопическим данным о времени появления в бластоцисте центриолей (Maro et ai., 1991) , а также данным, полученным на ишунофлу оресцентном уровне с антителами К перицентриолярному материалу (Calarco-Gillam et

al..1983) .

При иммуноэлектронной микроскопии . антитела rn-cg связываются с ыагриксом центриолей. Конкретная роль антигена, узнаваемого монАТ rn-cc, в центриолярном цилиндре не ясна, но возможно, что он стабилизирует структуру центриоли. Мы полагаем, что появление его в составе остаточного* тельца, служащего для механического скрепления разделившихся клеток именно на стадии бластоцисты может быть не случайным. В это время в клетках появляются десмосомы с хорошо развитой системой тоно^иламентов, что вероятно служит как для создания структурного каркаса самой клетки, гак и их скрепления в пласте (Дыбан,1988; Maro et al., 1991). ПОЯВИВШИЙСЯ антиген RN-C6, возможно, дополнительно стабилизирует остаточное тельце и упрочняет связь между разделившимися клетками в первое время после завершения митоза. Возможно, что антиген rn-cö может представлять собой один из компонентов цитоскелета, выполняющий матриксную функцию сразу в нескольких цитоскелетных структурах. По-видимому, сборка центриолей могла бы инициироваться с общего компонента для центриолей и остаточного тельца.

Таким образом, хотя ядерные антигены монаАГ rn-C6

выявлялись н клетках ранних эмбрионов мыши начиная с 2-х клеточной стадии - начала экспрессии генома, антигены, спязашше с центросомой и с митотическим веретеном, там отсутствовали. Формировашто митотического веретена и остаточного тельца, следовательно, до стадии бластоцистц происходило без участия антигенов монаАТ 1?м-сй . Образованию центросом не предшествовало появление диффузно или мелкодисперсно расположенного в клетках антигена ям-сб.

Микротрубочки в клетках эмбрионов мыши

■ При иммунофлуоресцентном окрашивании эмбрионов мыши антителами к тубулину в интерфазных клетках выявлялась диффузная сеть микротрубочек, не имевших каких-либо центров сгущения. После получасового охлаждения эмбрионов микротрубочки оказывались разрушенными. Последующий прогрев эмбрионов в термостате приводил к восстановлении сети мшсротрубочек. В ходе восстановления в клетках появлялись дисперсно расположенные короткие микротрубочки. Только в некоторых клетках поздней бластоцисты можно было наблюдать звезды из микротрубочек, типичные для роста микротрубочек от центросомы.

Электронномикроскопическое исследование эмбрионов мыши

На стадии морулы мы исследовали на серийных полутонких срезах два эмбриона - один, зафиксированный общепринятым методом, и один, зафиксированный после лизиса в детергенте. Было исследовано два митотических веретена в метафазе и одно в анафазе в лизированном перед фиксацией эмбрионе. В митотических клетках по всей цитоплазме были разбросаны мелкие скопления электронноплотного материала. Диффузные скопления материала такой же электронной плотности выявлялись в области полюсов веретена и изредка этот материал контактировал с микротрубочками веретена. Сколько-нибудь заметные дискретные фокусы схождения большого количества микротрубочек в полюсах не выявлялись. Ни в одном из изученных шести полюсов веретен не было ценгриолей.

В интерфазга« клетках в этом эмбрионе также не били обнаружены центриоли. Микрогрубочки в таких клетках формировали диффузную сеть, без какого бы то ни было выраженного центра схождения.

В зародышах, зафиксированных глютаровым альдегидом без предварительного лизиса, на стадии шестнадцати бластомеров и ранней бластоцисты. полость которой занимала меньше половины общей площади, в цитоплазме встречались очень редкие и хаотически расположенные микротрубочки; как правило, их было больше в кортикальной части цитоплазмы. Специфический фиброгранулярный материал не регистрировался ни вблизи . микротрубочек, ни в остальной цитоплазме. В бластоцисте были просмотрены две прометафазные клетки. В таких клетках микротрубочки были ассоциированы с комочками электронноплотного материала, которые располагались недалеко от хромосом, и с кинетохорами. В клетках этих эмбрионов центриоли не были обнаружены.

Ранее опубликованные данные (szoiiosi, 1972-, szoilosi et al., 1972; Szoilosi, 1973), ЧТО У МЛеКОПИТЭПЦИХ ( В ТОМ ЧИСЛв у

мышей) центриоли появляются в полюсе митотического веретена на стадии 8-16 бластомеров, вероятно, следует считать ошибочными. По-видимому, веретена четвертого деления дробления, 'как и мейотические и веретена двух первых делений дробления- имеют бесцентриолярные полюса. Однако в метафазе веретена четвертого деления дробления конвергентны, что создает видимость центриолярного полюса, и несколько расходятся только в анафазе. . Механизм стягивания микротрубочек веретена в одну точку, при отсутствии в этой точке каких-либо специфических структур, остается непонятным.

В бластоцисте (около 4 суток развития), когда площадь полости занимала более половины общей площади эмбриона, мы обнаружили процентриоли в двух клетках трофоэктодермы и в одной клетке внутренней клеточной массы (ВКМ). Одна из цевтриолей, обнаруженная в клетке ВКМ на продольном срезе, имела диаметр 200 нм и длину - 250 нм, что соответствует размерам процентриоли. В ее стенке, по-видимому, содержались микротрубочки; внутренние структуры били видны плохо. Со

стороны торца этой центршли располагалась электрошюплотная структура. Она состояла из аморфного материала, в котором просматривались отдельные микротрубочки и осевая структура. Между аморфным материалом, содержащим отдельные микротрубочки, и процентриолыо было свободное пространство шириной около 30 им. Вблизи центриоли, а также в ассоциации с ней, не было ни центров полимеризации микротрубочек, ни самих мшсротрубочек.

В одной из клеток трофэктодермы были выявлены три процентриоли: две центриоли находились, по-видимому, в паре, а другая - одиночная, располагалась на растоянии примерно I мкм от этой пары центриолей. На поперечном срезе через одиу из парных процентриолей отчетливо выявлялась ось со спицами и окружающий ее аморфный электронноплотный материал. В этом материале на концах спиц были видны одиночные или дублетные микротрубочки. Диаметр згой процентриоли был равен 200 юл. На продольном срезе через вторую процентриоль из этой пары выявлялись стенки из микротрубочек. В просвете цилиндра практически не были видны какие - либо структуры. Диаметр этой центриоли был равен 200 ем, а длина составляла около 300 нм. На боковой поверхности с обеих сторон имелись электронноплотные выступы с плохо различимой структурой, вблизи которых располагались мелкие мембранные пузырьки. Во всех исследованных случаях центриоли располагались вблизи аппарата Гольджи. Редкие микротрубочки, обнаруженные в этой области, не были связаны ни с центриолями, ни с каким либо другим материалом вблизи них.

В другой клетке трофэктодермы бластоцисты (около 4 су т. развития) также была выявлена процентриоль. Вблизи нее имелись скопления аморфного материла. Однако ни фокусов схождения микротрубочек, ни самих микротрубочек в ассоциации с ней не выявлялись.

В бластоцисте (4,5 суток развития) центриоли встречались чаще, но в подавляющем большинстве клеток они еще отсутствовали. Следует отметить, что мы вымывали бластоцисты из рогов матки на максимально поздних сроках перед имплантацией или, вероятно, слабо прикрепленные эмбрионы. Характерной особенностью таких бластоцист было то, что они были лишены блестящей оболочки. В клетках такой бластоцисты встречались как

двойные. так и одиночные центриоли. В одной из клеток наблюдали парные ювенилыше ценгриоли, видимо, реплицирующиеся, так как у одной из них на боковой поверхности выявлялась почка. Иногда центриоли били связаны с исчерчешшми корешками.

Вокруг центриолей в одной из клеток внутренней клеточной массы выявлялось скопление осмиофильного электрошюплотного материала, которое преимущественно располагалось вблизи одной из центриолей. Из этой области отходили микротрубочки. Кроме того, в скоплении материала вблизи центриоли можно было видеть более электронноплотные мелкие структуры. В целом в этой клетке была сформирована настоящая центросома достаточно типичного строения. Однако в исследованном нами материале мы не встречали перицентриолярных сателлитов и центриолярных придатков.

Электронномикроскопическое исследование ранних стадий развития мышей показывает, что центриоли, по-видамому, начинают появляться впервые на стадии бластоцисты, что в целом соответствует данным, полученным другими авторами при исследовании раннего эмбриогенеза мышей (Calarco-Gillam et al.,

1983,- Schatten et al., 1988; Maro et al., 1991) И КрЫС

(Dvorak, 1978). Из наших данных следует, что центриоли в клетках бластоцисты мыши появляются не одновременно. Это, возможно, объясняется тем, что Оластомеры в бластоцисте'делятся асинхронно (Дыбан, 1988), а процесс новообразования цейтриолей может быть связан с определении клеточным циклом индивидуального бластомера. В бластоцисте, где впервые появились центриоли, было 75 клеток, поэтому вполне вероятно, что центриоли образуются в ходе седьмого клеточного цикла.

Ранее полагали, что центриоли появляются сначала только в клетках трофэкгодермы (Dvorak, 1978; Calarco-Gillam et al., 1983; Maro et ai.,i99i). Однако мы обнаружили центриоль в клетке внутренней клеточной массы в бластоцисте 4 суток, а в клетках ВИЛ бластоцисты 4.5 суток центриоли встречались достаточно часто.

Центриоли, выявленные нами впервые на стадии бластоцисты, имели структуру, характерную для ювенильных органоидов в самом начале их формирования (процентриолей) - аморфные цилиндры, содержащие ось со спицами и отдельные микротрубочки. Эту стадию

формирования центриолярпых цилиндров ранее удавалось наблюдать только при массовом образовашш базалышх телец в ресничном эпителии (Andersen, Brenner, 1971; Dirksen, 1971) и при репликации центриолей в культивируемых клетках (Воробьев. Чепцов, 1978 а,б; Vorobjev, chentsov, 1932). Из наших дашшх следует, что морфогенез центриолей de novo в мышиных эмбрионах последовательно проходит те же стадии, что и их морфогенез на предшествующих структурах. Единственное отличие состоит в том. что, по-видимому, de novo закладываются сразу две центриоли, тесно связанные друг с другом в ортогональную пару, или же происходит быстрая репликация процентргали. Так, из центриолей, обнаруженных нами в трех разных клетках, три были представлены парами и лишь одна была одиночной, причем, возможно, эта центриоль была "неудачной", излишне собранной структурой.

Появлению de novo центриолей у мышей не предшествовало образование звезды из микротрубочек, как это имеет место при партеНОГепеТИЧеСКОМ развитии ЯИЦ МОРСКОГО ежа (Kallenbach, 1982). Более того, в ассоциации с ювенильными центриолями не были выявляны какие-либо структуры, с которыми можно было бы связать их происхождение. Таким образом, формирующиеся у мышей центриоли не имеют сходства с неогенезом, описанным у других объектов (Andersen, Brenner, 1971; Kallenbach, 1982; Крючкова И др., 1989). Они формируются вне связи с другими структурами, по крайней мере, выявляемыми на ультраструктурном уровне.

Созревание новообразованных центриолей, возможно, происходит так же, как и созревание центриолей при их дупликации в соматических клетках. Показано, что реплицированные (дочерние) центриоли в соматических клетках созревают во втором их жизни клеточном цикле (vorobjev, chentsov, 1982), в частности, придатки при созревании центриоли образуются во втором в ее жизни митозе (Воробьев,Ченцов, 1978а; 19786; vorobjev, chentsov, 1982). Дочерние центриоли фактически не участвуют в первом в их жизни митозе. Это может объяснять, наши данные о том, что в митотических клетках бластоцисты при иммунофлуоресцентном исследовании мы видели центриоли, не связанные с веретеном.

В соматических клетках в составе центросомы, которая

является центром организации микротрубочек. перицентриолярный материал и свободные центры нуклеации микротрубочек собраны вокруг центриолей (Воробьев. Надеждана, 1987). Как правило, центросома в интерфазной клетке существует в единственном числе (Paweiecz et ai., 1984). Центросома, выявленная нами на стадии бластоцисты 4,5 суток, имела типичное строение, характерное для соматических клеток млекопитающих, находилась в клетке в единственном числе и была центром организации микротрубочек. На появление центросом или единого центра организации микротрубочек в клетках бластоцисты указывали и данные иммунофлуоресценции, в частности, появление окрашенных антителами rn-c6 полюсов в митозе и появление единичной звезды из микротрубочек после экспериментального разрушения и восстановления микротрубочек в интерфазных клетках.

В области формирующихся центриолей в эмбрионах мышей всегда можно было видеть дикгиосомы аппарата Гольдки и большое количество мембранных пузырьков, иногда близко подходящих к центриолям. Тесная взаимосвязь аппарата Гольджи и центриолей описана практически для всех изученных типов клеток ■ (Kupfer et ai., 1982). Возможно, что именно из аппарата Гольджи поступают для сборки отдельные компоненты центриолей.

Вывода

1. Показано, что в гигантских клетках слпнных желез функцию организации микротрубочек выполняют множественные бесцентриолярные центры организации микротрубочек, как ассоциированные с ядром, так и распределенные по цитоплазме. При этом в апикальной части клеток система микротрубочек носит выраженный ориентированный характер.

2. Ценгриоли в раннем развитии мышей mus muscuius впервые появляются на 4 сут. развития на стадии бластоцисты, асинхронно в различных клетках как трофоэктодермы, так и внутренней клеточной массы.

3. Центриоли в раннем развитии мышей появляются раньше, чем они

становятся центрами организации микротрубочек. [{лоточные микротрубочки не имеют отношения к появлению центриолей. Формировате центросом. служащих центрами организации микротрубочек и содержащих центриоли, происходит к 5 су т. эмбрионального развития.

4. Центриоли в бластомерах мышей появляются de novo, без видимых предоюствешшков. В своем развитии они проходят стадию процентриолей. ранее описанную при репликации центриолей в соматических клетках.

5. Форма бесцентриолярных митотических веретен в яйцеклетках и бластомерах может меняться при их различных обработках. Это заставляет с осторожностью относиться к определениям "конвергентное" и "дивергентное" веретено.

1. Абумуслимов С.С., Надекдина Е.С., Ченцов D.C. Множественные бесцентриолярные центры организации микротрубочек В гигантских клетках СЛЮННЫХ желез Chironomus cingulatus. //Цитология. 1991. Т.33. N12. С. 36-40.

2. Abumuslimov S.S., Nadezhdina E.S., Chentsov Yu.S. Morphogenesis of centrioles and centrosomes in early mice development. //Fourth European Congress of Cell Biology. Prague, 1994.

3. Абумуслимов C.C., Надеждина E.C., Ченцов D.C. Морфогенез центриолей и центросомы в раннем развитии мыши: электронномикроскопическое исследование. //Цитология. 1994. Т.36. (в печати).

4. Абумуслимов С.С., Надеждина Е.С., Ченцов Е. С. Морфогенез центросомы в раннем развитии мышей: иммунофлуорес-центное исследование с помощью антител к антигену центриолей. //Цитология. 1994. (в печати).

Публикации по теме диссертации