Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь между хромосомныи и центриолярным циклами при изменении плоидности клетки

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь между хромосомныи и центриолярным циклами при изменении плоидности клетки"

А-6

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЭДАМЕНИ И ОРДЕНА СКТЯН'ЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ Г0СУДАРС1ВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ МЛ,ЛОМОНОСОВА

ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЯПУ ХРОШСОШЫМ И ЦЕНТРИОЛЯШЫМ • ЩКЯАМИ ИРИ ИЗМЕНЕНИИ МОЩНОСТИ КПЕШИ

03 »00.17 - Цитология

Ав.*орефера1 диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

На правах рукопиои

J

ОНИШЕНКО Галина Евгеньевна

5ДК 576.3И/.316г576*35

Москва - 1989

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии биологического факультета ЖУ им.М.В.Ломоносова

Научный консультант - доктор биологических наук, профеосор

Ю.С ЛЕНДОВ

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук, профессор

В.Я.БРОДСКИЙ

- доктор биологических наук О.Й.ЕПИФАНОЕ

- доктор биологических наук М.Е.АСПИЗ

Ведущее учреждение - Институт цитологии АН СССР (Ленинград)

Защита состоится "_11 1989 г. В —__ ча<

на заседании Специализированного совета Д 053,05.68 при Московском государственном университете-по адресу: 119899, Москва, В-Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологиче! кого факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"_ 1989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета ' кандидат биологических наук

Е.В.КАЛШТРА1

4 ■ ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

"" *

Актуальность проблемы. В соматических клетках животных организмов хромосомный и центриолярный цикли состоят из событий, обеспечивающих удвоение числа данных клеточных компонентов. Существующая в диплоидных клетках корреляция между числом хромосомных наборов и числом центриолей обеспечивается взаимосвязанностыо хромосомного и центриолярного циклов, вклэтащей не только одновременность удвоения хромосом и центриолей, но одновременность распределения этих компонентов в митозе ( Murray et al.,1965; Kuriyama, Borisy,1981i Vorobjev,Chentaov,1982j Alvey,1986 ).

В клетках животных организмов с центриолями, как правило, ассоциирована центросома, которая состоит из фибриллярного материала и выполняет функции центра организации микротрубочек ( Luyks, 1970, Pulton, 1971). В клеточном цикле наблюдают морфофункциональ-ные преобразования центросомы, которые называют центросомным циклом ( Mazia, 1984). В норме в диплоидных клетках центриолярный и центросомный циклы сопряжены друг о другом ( Brinkley,l985 ), а также о хромосомным циклом ( Mazia,1986 ).

Однако до настоящего времени отсутствует детальный анализ характера сопряжения трех циклов друг с другом и последствий разобщения этих циклов для диплоидных'клеток, тлеющих разный тип диф-ференцирсшки, как в норме, так и при патологическом состоянии клеток. Данная проблема является еще менее изученной для клеток, плоидносгь которых отлична от диплогошоЯ.

Изменение плоидности клеток - широко распространенное явление. Снижение площшости клеток происходит при появлении половых клеток и осуществляется путем специального типа деления клеток -мейоза. Умножение числа геномов наблюдается при дифференцировке таких клеток, как гепатоциты, кардиомиоциты, остеокласты, мега-кариоциты, поперечно-полосатые мышечные волокна, трофобласты и т.д. Основными механизмами увеличения числа геномов служат поли-плоидязирующиЗ митоз, блокирование клеток в аг -периоде, эндоре-дупликация, политенизшия и слияние клеток (Бродский,УротаеваДЭЯ).

Кроме того, изменение плоидности клетск происходит при таких патологических процессах, как воспаление, опухолевый рост, вирусные инфекции, а также в ответ на различные воздействия (радиационное поражение, гипо- и гипертермия, химические агента типа анти-тубулиновых, алкиллирутацих, энергетических ингибиторов, ингибиторов синтеза нуклеиновых кислот и белка и т.д.). При этом к сниже-

нив числа хромосом наиболее часто ведет многополюсный митоз,увеличение плоидности осуществляется с участием тех же механизмов, которые описаны для дифференцированных клеток в норме (Каудри, 1958; Алов,1972; Бдамкин,Еданов,1972; Бродский,Урываева,1Э81).

Различные клеточные и тканевые культуры в настоящее время широко используются как в качестве моделей для фундаментальных исследований, так и в качестве материала для биотехнологического производства. В клеточных культурах изменения плоидности клеток могут происходить спонтанно, при изменении условий культивирования и при тех. же воздействиях, которые приводят к снижению или увеличению плоидности клеток в организме.

Таким образом, исследование центриолярного и центросомного циклов при изменении плоидности клеток является в&здой и актуальной проблемой, тесно связанной с вскрытием механизмов изменения плоидности клеток и биологического смысла таких изменений при диф-ференцировке клеток, в ходе важнейших патологических процессов (воспаление, опухолевый рост, вирусная инфекция), а также при поражении клеток различными физическими и химическими воздействиями как in vivo, так и in vitro.

Целыо настоящего исследования било изучение особенностей центриолярного цикла при изменении плоидности клеток. Центриоляр-ный цикл был изучен для полиплоидных клеток, умножение геномов, в которых осуществлялось с помощью различных механизмов. Центриоляр-ннй цикл в условиях снижения плоидности клеток был исследован на при?,юре мейоза, ведущего к образованию гаплоидных яйцеклеток, а т?зкже на примере многополюсных митозов, возникающих в популяции диплоидных клеток (спонтанных и индуцированных К-митотическим агентом), в популяции полиплоидных одноядерных клеток и тлеющих различное происхождение многоядерных клеток (образующихся в результате слияния или в результате нарушения цатогомии). Кроме того, цель работы состояла в изучении поведения хромосом при разных типах многополюсных митозов, что должно было позволить проанализировать особенности сопряжения и разобщения центриолярного и хромосомного циклов при снижении плоидности клеток. И, наконец, данное исследование было направлено на выявление роли различных элементов цитоскелета (в том числе и немикротрубочковых), в поддержании коррекции между числом ценгриолей и числом хромосомных наборов при процессах, ведущих к изменению плоидности клеток. •

Для решения поставленной проблемы необходимо решить следую-

щие задачи:

1. Исследовать соотношение между числом центриолей и плоид-ностью в клетках, умножение геномов в которых происходило в результате: а) позишяожшзирутощего митоза; б) блокирования клеток в (¡2 -периоде; в) политенизации; г) слияния клеток.

2. Исследовать центриолкрный цикл в полиплоидных клетках.

3. Исследовать соотношение между числом хромосомных наборов и центриолей при сншсении плоицности в процессе мейоза и после восстановления диплоидного состояния в результате оплодотворения.

4. Исследовать роль многополюсного митоза в изменении числа хромосом и центриолей: а) определить причины возникновения многополюсных митозов в популяциях диплоидных и разного происхождения полиплоидных клеток; б) определить этапы перехода к многополгасно-му митозу в популяциях диплоидных и полиплоидных клеток; в) исследовать характер распределения хромосом и центриолей при индукции многополгасности в диплоидных и полиплоидных клетках; г) исследовать локализацию промежуточных филаментов при редукционных я патологических многополюсных митозах.

Научная новизна полученных результатов состоит в том, что впервые доказана корреляция меяду числом центриолей и хромосомных наборов в полиплоидных клетках, увеличение числа геномов в которых происходит путем полиплоидизирующего митоза vivo и in vitro или слияния клеток in vitro . Выявлено, что при полипяои-дизации клеток путем G^-бпака не нарушается репродукция центриолей, но происходит разобщение центриолярного и хромосомного циклов, при политенизации - наблюдается исчезновение центриолей из клеток. Обнаружено, что при обратимой утрате пролиферативной активности сохраняется целостность центриолярного комплекса, при необратимой - как после полиплоидизации путем полиплоидизирующего митоза, так и при умножении геномов без митоза (политенизация), происходит распад центриолярного комплекса. Отсюда сделан вывод о том, что если процесс умножения геномов включает любые формы ми-тотической активности, в клетке поддерживается корреляция между плотностью и числом центриолей, если при полиплоидизации митоти-ческая активность отсутствует, го корреляция нарушается вплоть до полного исчезновения центриолей.

На основании собственных результатов и анализа данных литературы продемонстрировано, что мейоз является процессом, при котором происходит нарушение корреляции медду число хромосомных набо-

ров и числом центриолей в дт]4еренцированпых половых клетках, вое-' становление же корреляции между плоидностью и числом центриолей осуществляется на начальных этапах эмбриогенеза.

Исследование центриолярного комплекса и поведения хромосом в многополюсных митозах позволило впервые показать, что существует широкое разнообразие в структурной организации, механизме возникновения и биологическом значении многополюсных митозов. Впервые доказано, что многополюсные веретена о диплосомачи в полюсах появляются при делении полиплоидных клеток, с одиночными центриолями -при делении ди- к полиплоидных клеток, прошедших стадию К-метафа-зы; с дополнительными бесцентриолярными полюсами - при делении диплоидных клеток, подвергшихся К-митотическоцу воздействию.

Выявлено, что как в диплоидных, так и в полиплоидных клетках многополюсные митозы могут обеспечивать как эуплошгное, так и ане-уплощное распределение хромосом. При эупловдном распределении хромосом мокет быть пропорциональное или непропорциональное распределение центриолей. В зависимости от характера распределения хромосом и центриолей многополюсные митозы следует относить к патологическим, редукционным или сметанного типа. Получены данные о том, что характер распределения хромосомных наборов и центриолей может быть связан с целостностью сети промежуточных филаментов, обеспечивающих в интерфазе и в начальных фазах митоза структурную целостность ядерно-центриолярного комплекса.

Практическое значение. Полученные в работе данные о разнообразии вариантов взаимосвязи между центриолярным и хромосомным циклями при образовании полиплоидных и гаплоидных клеток, а также при патологических делениях клеток носят фундаментальный характер и расширяют наши представления о механизмах, включенных в дийферен-цировку клеток или участвующих в развитии патологических процессов. Изучаемый в работе круг вопросов является составной частью проблем биологии развития и медицины, касающихся регуляции размножения и дифферекцировки клеток.

В настоящей работе дана характеристика особенностей пролиферации многоядерных клеток, индуцированных в культуре различными способами. Эти исследования могут служить основой для проведения анализа механизмов возникновения и пролиферативных возможностей многоядерных клеток, наблюдаемых в тканях животных организмов в норме и при самых различных патологических процессах, таких как воспаление, опухолевый рост, вирусные инфекции, радиационное по-

ражеиие, т.е. процессах, которым уделяется огромное внимание в области медицины и в первую очередь онкологии.

К этому же кругу проблем относятся полученные в работе данные о механизме возникновения и биологической роли таких распространенных форм патологии митоза, как К-митоз и многополгосные митозы. Обнаруженное разнообразие в структурной организации и причинах возникновения многополюсных митозов, а также в вариантах взаимосвязи между К- и многополгасннми митозами не только углубляют наши знания в области, касающейся регуляции делений клеток. Представленные данные ставят вопрос о роли К- и многополюсных митозов в возникновении потоков, несущих различные черты патологии, в том числе и такие, которые ведут к трансформации клеток. В конечном итоге, вопрос об участии потомков патологических митозов, возникающих в различных тканях и при различных воздействиях, в опухолевой прогрессии может быть тесно связан с важнейшей онкологической проблемой гистогенеза опухолей.

В настоящей работе проведен анализ возможных путей нарушения между хромосомным, и центриолярным циклами, приводящих к дестабилизация хромосомных наборов. Такой анализ имеет практический интерес при решении одной из актуальных биотехнологических задач, связанной с поиском методов стабилизации геномов гибридных клеток.

В заключение следует отметить практическое значение предлагаемого в работе радиоавтографического метода идентификации клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, с помощью ройного мечения клеток. Этот метод нашел свое применение в иссле-юваниях, проводимых на кафедре цитологии и гистологии биологичес-сого факультета ЫУ, в лаборатории молекулярной биологии и биоор-'анической химии им.А.Н.Белозерского МГУ и в других научно-иссле-ювательских учреждениях.,

Апробация работы. Основные материалы работы были представ-1еин автором на I, ХП, ХШ Всесоюзных конференциях по электронной шкроскопии (Ташкент, 1975; Суш, 1982; Звенигород,1988), на Ш и 17 юесоюзннх конференциях по патологии клетки (Москва, 1982,1987), а Симпозиуме по Соматической полиплоидии (Ереван,1977), на Все-ююзных совещаниях: "Митотический цикл" (Ленинград,1978), "Био-;огия клетки в культуре" (Ленинград, 1983,1987), "Актуальные воп-осы клеточной биологии" (Ленинград,1984),'на Всесоюзном симяо-думе "Реакция клеток на внешние воздействия" (Киев,1982), на УП, I, ХП школах по биологии развития (Звенигород,1979; ЦупшноД985;

- б -

Рига,1388), заседании ШИП (Москва, 1983).

Структура и объем работа. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, из них 3 таблицы, Мо рисунков и список литературы, вклэчаащий работ, в том числе иностранных.

гдшрида и методы

Объекты исследования. Исследование тонкой организации цен-триолярного комплекса, а также соотношения между числом центриолей я плотностью клеток при различных механизмах изменения числа геномов в клетке проводилось на следующих объектах: I - гепатоцитн ин-тактной и регенерирующей печени кыш, площхность которых возрастает в результате полиплошшзирующего митоза; 2 - гепатоциты регенерирующей печени мыши, блокированные а (*2 -периоде воздействием дипином; 3 - мегакариоциты костного мозга шши, поляплоидизация которых происходит путем полшлощизйрующего митоза; 4 - клетки Бальбиши слюнных келез СМгопотгш "Шиит! гь.итт! содержащие ядра с политеннымн хромосомами; 5 - яйца моллюска ^утпаеа з-^-паИз в I и П делениях созревания, а также в начальных делениях дробления; 6 - сперматозоиды моллюска Ьутпаеа а^а^аИв ; 7 - многоядерные клетки, образующиеся в результате нарушения цитотомии в митозе при действии цитохалазша В (культура эпителиальных клеток эмбриона свиньи - спэв и культура клеток китайского хомячка линии 23? и Ае-17); 8 - многоядернне клетки, образующиеся при слиянии одноядерных клеток (культура клеток А&—1?)„ Гибридные одноядерные клетки, полученные путем слияния культивируемых клеток китайского хомячка и мыши (линия 91),

Исследование тонкой организации центриолей и митотического аппарата, а такке соотношения мекду числом центриолей и хромосомных наборов при снивешш плогщнооти клеток в результате многополас-иого митозе проводилось для следующих типов маогополасных митозов:

1 - многопокосных полиплоидных митозов в популяции многоядерннх клеток, индуцированных цитохалазином В в культуре клеток линии 23?;

2 - МНОГОПОЛЮСЗЫХ ПОЛИПЛОИДНЫХ МИТОЗОВ, в популяции шогоядерных клеток, Обракугащихся путем слияния одноядерных клеток в культуре клеток Ае-17; 3 ~ грехполасных диплоцшшх митозов, иядуцирозан-ных 2-меркаптоэтаяолом в культуре клеток А£-17.

• Исследование тонкой организации центриолей. и митотического

аппарата, а также распределения центриолей в полюсах проводилось для следующих типов митозов: I - спонтанных многополюсних митозов в культуре клеток СЮВ и в культуре клеток китайского хомячка линии 237; 2 - индуцированных 2-меркаптоэтанолом многополюсных митозов в культуре клеток СГОВ; 3 - двухполюсных и многополюсных митозов гибридных клеток линии 91 (мышь х китайский хомячок); 4 -двухполюсных и многополюсных митозов гистиоцитомы человека35.

Приготовление материала для электронноуяжроскопического анализа проводили по стандартным методикам (Уикли,1975) с модифика-Вд1ями в отдельных случаях. Для таких объектов, как яйца и сперматозоиды прудовика и гистоцнтома человека, ультраструктурному анализу предшествовало изучение материала на полу гонких срезах (Перов, 1еяцав,19о9). Анализ ультраструктуры интерфазных и митотических клеток выполняли на серийных ультратонких срезах, полученных при резке клетки в ее полном объеме (от 150 до 1000 срезов в зависимости от объекта исследования).

Реконструкцию структурной организации мегафазных пластинок ¡роводили путем прорисовки хромосом, кинетохоров и центриолей с )лектроянограюлом серийных срезов. На полученных реконструкциях юдсчитывали число кинетохоров, ориентированных в направлении кая-юго полюса, и число центриолей.

Плогешость гепатоцитОв определяли путем измерения объемов щер гепатоцитов (Бродский, 1936) на отпечатках печени, фиксировании и заключенных в эпоксидную смолу для последующего электронно-шроскопического анализа.

Окрашивание антителами в виментину проводили методом непря-;ой июдунофлуоресценции (метод Кунса). Для этого клетки после фик-ации 4% раствором формалина и лизиса с помощью 0,5% раствора Три-она Х-ЮО окрашивали моноклональными антителат к виментину (ан-итела были любезно предоставлены проф.О.В .Рохлиным из ЕКНЦ МИ ССР).

Для визуализации митотического веретена на светооп?ическо?л ровне клетки фиксировали смесью Буэна и окрашивали сафронином-енцианновым фиолетовым-ораняевым о (Ромейс,1953).

Метод радиоавтографии (Епифанова и др.,1977) был использован ля выявления клеток, находящихся в различных периодах клеточного

Спонтанная опухоль человека: злокачественная гистиоцятома (гистологический диагаоз). Операционный материал любезно предоставлен Е.М.Гнучевой из онкологического центра им.А.И.Герцена.

цикла. При изучении клеток, находящихся в s-периоде, проводили импульсное мечение клеток %-гимидином. При исследовании клеток в G1 s— и а2-периодах использовали метод двойного мечения клеток

и *4С-тимидином, разработанный в настоящем исследовании. Представленный в работе метод является развитием метода двойного маркирования клеток различными изотопами, примененного Пилгримом и Маурером ( Pilgrim, Maurer, 1965 )• ^

По схеме, предложенной в настоящей работе С-тимидин вводится через время, в течение которого часть клеток, включивших п-ти-мидин прошла Gg-период и вступила в митоа. Это и обеспечивает маркирование клеток во всех периода митогического цикла (рис.1).

I- '.:■•."-! I I

S с, к ~f-Л..\ I

. °1 S О м

шишш»тттш\

Рис Д. Схема двойного маркирования клеток в митотическом цикле: а — импульсное мечение клеток ЗД-тимидином; б - культивирование клеток в £|еде без изотопа; в - импульсное мечение

С-тимидином

Проведенные на культуре клеток китайского хомячка (линии 23?) исследования показали, что клетки, находящиеся к моменту фиксации в (^-периоде, оказываются немечеными. Клетки з-периода метятся двояко - Си С + Клетки, содержащие только тритиевую метку, соответствуют ¿2-периоду и митозу. Методом цитоспектрофото-метрии было обнаружено, что содержание ДНК в клетках, идентифицированных нами с помощью двойной метки, соответствует положению этих клеток в митотическом цикле.

Для электронномикроскошпеского исследования клеток, находящихся в разных периодах клеточного цикле, проводили импульсное мечение клеток т!-мшвдином или двойное мечение клеток ЧЯ- и С-тимвдином. Отпечатки печени или культуры клеток фиксировали по стандартной электронномикроскопической методике и заключали в эпон. После отделения покровных стекол эпоксидные пластинки покрывали ядерной эмульсией и экспонировали. На светомикроскопическом уровне ■ анализировали радиоавтограф и определяли положение клеток в цикле, далее изучали ультраструктуру этих ке клеток.

в

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Центриолярный комплекс в полиплоидных клетках, образовавшихся с помощь» разных механизмов умножения геномов

При изучении особенностей центриолярного цикла в полиплоидных :летках объектами исследования служили клетки, полиплошшзация которых включала различные механизм: I - п о ляп л о иди з иру а щий митоз; I - блокирование клеток в а2-периоде клеточного цикла; 3 - поли-генизации.

Гепатоциты печени мыши. В печени мыши в онтогенезе и при регенерации образуются гепатоциты разных классов плоидности. Поли-моадизащи гепатоцктов происходит через стадию образования дву-адерной клетки в результате митоза без цитотомии по схеме 2П—. 2П { 2- >4п~^4п х 2 и т.д. (Бродский,Уриваева, 1970,1981). Исследование ультраструктуры гепатоцитов интактной и регенерирующей пече-ш в разных периодах клеточного цикла показывает, что в каддом периоде центриолярный комплекс тлеет присущие данному периоду морфологические черты. Сравнивая центриолярный цикл в гепатоцитах и в других клетках ( йаПыег, РМШра, 19735 2е1±ез, ИоХ1шап, 1979; УогоЪоеу, СЬеггЬасгу, 1982 ), можно отметить, что в основных чертах он сходен во многих типах клеток. В гепатоцитах в о .^периоде цен-гриоли несут сателлиты, служащие центрами организации микротрубо-зек, и придатки; в з -периоде происходит закладка дочерней центря-оли л ее рост; в с2-периоде продолжается рост дочерней центриоли а вокруг диплосомы образуется фибриллярное гало. Но в то же время центриодярноэд циклу в разных типах клеток когут быть присущи л свои особенности. Например, придатки в гепатоцитах в с0-периоде полностью отсутствуют, они максимально выражены в (^-периоде и постепенно исчезают в Э- и с2-периодах. В клетках же культуры СПЭВ придатки выявляются во всех периодах клеточного цикла, в том числе и в й0-перяоде. Следует отметить, что гепатоциты отличаются от клеток различных культур тем, что после получения пролифе-рагибкого стула их активность, как правило, продолжается лишь в течение одного митотического цикла, и после прохождения митоза они оказываются вновь в <*0-периоде.

Гепатоциты интактной печени независимо от уровня плоидности могут быть отнесены в основном к клеткам о0-пернода и лишь в единичных случаях к клеткам 01-периода. Подсчет числа центрчолей в таких гепатоцитах или -периода показал, что в них сущест-

вует корреляция между плоидностью и числом центриолей: 2п -2 центриоли; 2п х2и4п - 4 центриоли; 4n х 2 и 8п - 8 центри-оли. Таким образом, как в одноядерных, так и в двуядерных гепатоци-тах печени мыши выявляется та ке корреляция между числом центриолей и хромосомных наборов, что и в одноядерных полиплоидных клетках культуры ткани Microtus agrestis С Fera,1975 )•

Для решения вопроса о том, действительно ли множественные центриоли, которые обнаруживаются в центриолярном комплексе полиплоидных клеток,принимают участие в полиплоидизирующем митозе, в данной работе анализировали ультраструктуру митотлческих клеток. В печени старых мышей число диплоидных клеток очень низкое иле они совсем не выявляются (Урываева,Фактор,1975). В регенерирующей печени таких мышей чаще всего мы обнаруживали по 4 центриоли в каждом полюсе митотического веретена. Известно, что полиплоидные клетки, всыпая в индуцированный китотический цикл, перед делением проходят стадию синтеза ДНК (Фактор,Урываева,1975). Число центриолей при этом также удваивается. Присутствие в полосах,4 центриолей может означать, что тетраплоидная по набору хромосом клетка прошла стадию синтеза ДНК и вступила в митоз. Отсюда следует вывод о том, что в клетках, механизм полиплоцдизации которых включает митоз, сохраняется корреляция между числом центриолей и хромосомных наборов, которая характерна для диплоидных клеток.

При введении дипина (60 ккг/г)-дагибитора клеточного деления - за 2 часа до частичной гепатэктомии происходит длительное блокирование в g2 -периоде, которому предшествует значительное увеличение s -периода (Factor et al.,1980 ). При электронномикро-скопическом исследовании наш обнаружено во всех клетках большое число центриолей. В период от 80 до Зо часов после гепатэктомии большая часть клеток имеет отдельно лежащие центриоли с ярко выраженными сателлитами и придатками, что соответствует морфологии центриолярного комплекса Cj-периода митотического цикла. Другая группа гепатоцитов содержит центриоли с процентриолями, что является характерным признаком s -периода. Результаты радиоавтографического исследования (Factor et al.,1980) показывают, что в эти сроки после операции преобладающим является класс клеток Gj-перио-да, меньшая же доля популяции гепатоцитов находится в периоде синтеза JIHIi. Через 44 час после операции в популяции превалируют ге-пагоцигы S -периода. В период от 30 до 72 часов после операции основная масса клеток (до 75%) оказывается з (^-периоде (Фактор и

др.,1979). По нашим данным большая часть гепатоцитов в эти сроки имеет центриолярный аппарат с характерными чертами (^-периода, то есть содержит диплосокы. Другие клетки обладают цен триолями с про-центриояями, что свойственно для клеток S -периода китотического цикла.

Из наших результатов следует, что морфология цептриоляркого комплекса в течение первых 3-х суток соответствует фазам удлиненного митотического цикла гепатоцитов, предварительно обработанных л шин ом. Однако, начиная с 4-х суток после операции происходит, по-видимому, разобщение ядерного и цен трио лярного циклов. По содержанию ДНК клетки находятся в предмитотическом периоде, по структуре центриолярного аппарата - продвигаются, минуя митоз, в следующий клеточный цикл. Так, на 4-5 сутки после операции в клетках Gj>-блока нарушается взаимоперпендикулярная ориентация центриолярных цилиндров в диплосоме. На отдельно лежащих центриолях одинаковых размеров появляются ярко выраженные перицеятриолярные сателлиты и придатки. По своей морфологии центриолярный комплекс приобретает черты Gj-периода. Позднее, на 7-е сутки после операции появляются клетки, тлеющие структуру центриолярного комплекса, характерную для S-Q-периода.

Таким образом, выделенные нами типы организации центриолярного комплекса при действии дипина соответствуют в основных чертах морфологии центриолей на отдельных этапах клеточного цикла. Но при задержке в Gg-периоде происходит разобщение центриолярного и хромосомного циклов таким образом, что центриолярный цикл оказывается более продвинутым по сравнению с хромосомным.

Мегекариоциты костного мозга мыши. Мегакариоциты полиплоиди-зпруптся в результате к-митоза, завершающегося реконструкцией ядра ( Boll, Domewer,1980 ) или многополюсного митоза без цитотомии (Odell et al.,1968). Плоидность меггкэриоцитов варьирует от 4П до 32 или 54п з зависимости от вида животного (carola, 1964$ Penißg-ton,Olsen, 1970}.1лы исследовали центриолярный комплекс в мегакарио-цитах трех типов, отличающихся степенью диффереицировенности ( Paulus, 1970 ).

В незрелых мегакариоцитах (I тип) вблизи аппарата Гольдки чаще всего можно было насчитать 13 центрйолей, реже - 8 или 32, собрашше в единый комплекс. В некоторых клетках все зрелые центр но л и были ассоциированы с процентриолямл, что очевидно называет на прохождение данной клеткой S -периода. Многочисленные центриоли

в этом типе мегакариоцитов описаны и в других работах (Fawcett, I9ö6; Breton-Goriua,1973 )• К увеличению плотности в результате синтеза ДНК и полипловдизкрующего митоза способны только незрелые мегакариоциты и это не зависит от величины их плоидности ( Odell et al.,1963; Paulus,1970 ). Как показывают представленные в работе данные, именно в этих клетках, способных к м::тотической активности, обнаруживается центриолярный комплекс, в котором число центриолей равно 8, IS или 32. Такт.; образом, в незрелых мегакарио-цктах выявляется та же прямая зависимость между числом центриолей и плокдностью клетки, которая была показана нами для гепатоцитов.

Do всех созревающих (П тип) и тромбопоэтическпх (lü тип) ме-гакприоцитах центриолярный комплекс отсутствует. Встречаются лишь немногочисленные центриоли в околоядерной области, лежащие на значительном расстоянии друг от друга. Центриоли чаще всего располагаются поодиночке и лишь иногда попарно. Процеитрполя отсутствуют. Все центриоли в созревающих и тро.\:бопозтическюс кегакариоцитах лишены сателлитов и каких-либо контактов с цитоплазматическпми микро трубочками. Известно, что эти формы мегакариоцитов полностью утратили митотическую активность. При экспериментальном стгоулирова-нии тромбоцитопозза зрелые мегакериоцигы не изменяют cBoei5 плоидности (Penington,Olsen,1970 ). Именно в таких клетках центриоли оказываются беспорядочно разбросанными по цитоплазме. Более того, существуют сведения, что отдельные центриоли обнаруживаются даже в отделяющихся тромбоцитах ( Radley,Souriield,l980 ). Тот факт, ' что в созревающих и громбопоэтических мегакариоцптах все-таки встречаются центриоли, говорит о том, что разрушение этих к неточных компонентов может происходить постепенно.

Клетки Бальбиани слюнных желез. . СМгопошив thummi. thironi Известно, что процесс политенизации связан с прохождением клеткой множества циклов эндоредуплихации и полным блокированием митоги-ческой активности (КЕкнадзе,1972). Нами проведено исследование ультраструктуры клеток, в которых произошло 5-7 циклов удвоения ДНК. При исследовании серийных срезов клеток, содержащих ядра с политенныш хромосомами (128ц и больше) в цитоплазме центриоли не были обнаружены. Несмотря на то, что нага проводился поиск центриолей на серийных срезах, ш не можем утверждать, что в клетках, размеры которых составляют 500 нет Ни одной центриоли. Но очевидно, что в таких клетках отсутствует клеточный центр, содержащий центриоли, к что увеличение плоидности путем политенизации не ведет к эквивалентно^ увеличению числа центриолей.

По данным литературы центриоли не обнаружены при изучении рофоблаотов ( Boya, Hamilton ,1936; Зыбина, Румянцев,1980) и в летках Бальбиани слюнных желез Chironomua thummi в 4 личиноч-ом возрасте (Агапова,1987). Таким образом, несмотря на немногочис-енность данных, можно сделать заключение о том, что если механизм олитенизацип клеток включает в себя необратимое ингибирование ми-отической активности, происходит не только полное разобщение цик-ов репродукции ДНК и центриолей. При этом перестает существовать елостный центоиояярный комплекс и, по-видимому, происходит разру-ение самих центриолярных цилиндров. Следует отметить, что, вероят-о, при политенизацяи судьба центриолей сходна в любых клетках не-ависимо от того, организован ли хроматин подобно любому интерфаз-ому, или в виде полигенных хромосом.

2. Центриолярный кошлекс при снижении плоидности в мейозе и при восстановлении плоидности после оплодотворения.

* Деления созревания яйца моллюска Ьупшаеа stsRnalis

Мейотические деления в процессе геметогенеза являются основ-ым способом снижения плоидности у шогоклеточных животных орга-измов, появление гаплоидных наборов в клетке сопровождается так-е изменением числа центриолей в них.

Для решения вопросов о соотношении между числом материнских ентриолей и хромосомных наборов в делениях созревания яйца прудо-ика о происхождении центриолей в зрелых яйцах и в ранних делениях робления мы исследовали ультраструктуру веретена I и П делений озревания яйцеклеток, а также I-Ш делений дробления. Оказалось, то уже в I делении мейоза в яйце содержатся лишь две центриоли, не четыре, как в митозе диплоидных клеток. Это означает, что йцо, вступая в мейоз и имея репродуцированный генетический мате-иал, содержит центриоли, которые в ходе подготовки к мейозу не двоились. В результате этого соотношение между числом хромосомах наборов и центриолей оказывается нарушенным. Оставшаяся в яй~ е после I деления созревания материнская центриоль также не про-одит цикла удвоения. Вследствие того, что именно эта цеп трио ль окализуется в периферическом полисе П деления созревания, она по-адает после мейоза во второе направительное тельце. Само же яйцо казнвается лишенной собственных центриолей и содержит внесенное перматозоидом базальное тело.

Наиболее поразительным является тот факт, что базальное те-о сперматозоида обнаруживается в составе внутреннего полюса П де-

ления созревания яйца. Оункциональное значение такого явления оказывается совершенно неясным.

Ранние деления дробления моллюска Lvrnnagfl. BtBgpßHü ■

В первом делении дробления Ь. stagnalis в каждом из полюсов обнаруживается по одной цектриоли сходного строения. Внутри каждой из этих центриолей выявляется на одном из концов структура типа "оси со спицами", характерная для процентриолей, образованных de novo и для дочерних центриолей диплосом ( Pulton,1971 ) Кроме того, в цитоплазме вблизи того конца центриоли, который содержит "ось со спицами", находится глобула из фибриллярного материала, соответствующая по морфологическим признакам дейтеросо-ме. Известно, что именно дейтеросома и сходные с ней структуры участвуют в образовании центриолей и базальных тел de novo (Anderson,Brenner,1971)• Топографическая близость дейтеросомы и "оси со спицами" убедительно свидетельствуют о том, что обе одиночные центриоли образовались в первом мптотячесхом цикле прудовика. Базальное тело, присутствующее в оплодотворенном зрелом яйце, по-видимому, в зиготе разбирается и соответственно не приникает участия в организации полюсов веретена I деления дробления. На это указывает отсутствие структур, соответствующих базапь-ноаду телу в тех делящихся яйцах, которые мы исследовали.

Следующим важным наблюдением является то, что в первом ми-тотическом делении в полюсах присутствуют не по две центриоли, как в митозе диплоидных соматических клеток, а по одной. Это означает, что также, как в делениях созревания, у т^я+п^чц,. в J делении дробления соотношение между числом центриолей и плозд-ностью является нарушенным. Далее ко 2 делению дробления происходит восстановление нормального соотношения, о чем говорит присутствие в полюсах веретена этих клеток двух центриолей. Такое умно-» аеаие числа центриолей свидетельствует о том, что между I и 2 делениями в бластомерах должна была произойти двукратная репродукция центриолей при однократном удвоении генетического материала. Такое течение центриолярного цикла неизвестно для соматических диплоидных клеток. Не описано оно и для гаметогенеза, хотя извест ны случаи однократной репродукции центриолей при отсутствии удвоения генетического материала (сперматогенез у мыши, крысы и дамана - Rattner,1972).

3. Центриолярный комплекс в полиплоидных клетках, индуцированных в культуре

В работе проводилось изучение многояперных клеток, возникающих в результате нарушения цитотомии в митозе и при слиянии одноядерных клеток одновидового происхождения. Кроме того, исследовали одноядерные полиплоидные клетки, полученные путем соматической гибридизации клеток разновидового происхождения.

Центриолярный комплекс в двуядешых клетках культуры СЛЭВ, индуцированных длительным воздействием цитохалазином В Электронномикроскопические исследования показывают, что в двуядерных клетках, образовавшихся в результате нарушения цитотомии при воздействии цитохалазином В (2 мкг/мл в течение 7 суток) число центриолей в 01 -периоде равно 4. Это означает, что при подготовке клетки к митозу в присутствии цитохалазила В происходит репродукция не только ДНК, но и центриолей. После расхождения хромосом в митозе образуются два ядра, пары центриолей мигрируют из полюсов и располагаются в едином клеточном центре. Таким образом, несмотря на длительное переживание культуры СЛЭВ в среде, содержащий цитохэлазин В, в двуядерных клетках поддерживается корреляция между числом хромосомных наборов и центриолей. характерная для диплоидных и полиплоидных клеток, образующихся путем полиплоидизирую-щего митоза, например, двуядерных гвпзтоцитов.

Динамика митотнческого цикла и особенности мдтоза многоядерных клеток, индуцированных цитохалазином В в культуре клеток китайского хомячка

Длительное воздействие (до 7 суток) цитохалазином В (5 тгЛлп) на культуру клеток линяя 237 позволяет получить большое число многоядерных клеток (до 75% от общего числа клеток) (рис,2). Для этих клеток характерно то, что они могут содержать достаточно много го-мофаэннх ядер (до 7) в отдельных поликариоиах. Этим такие полика-рпоны отличаются от многоядерных клеток, которые возникают при слиянии одноядерных клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла.

Оказалось, что удаление цитохалазина В из среды культивирования и выращивание клеток (в течение 7 суток) в свежей среде вызывает интенсивный подъем пролиферативной активности всех категорий клеток, достигающий максимальных значений через 2 суток после снятия воздействия.

Данные об активной пролиферации многоядеряых клеток позволи-

л' ^А'К

4 У

о *»' *»' К 2е 1с *} 4« и 9« к $с2еЗс 4е ¿в вв и

Рис.2. Изменение численности многодцерннх клеток в культуре клеток китайского хомячка (линия 237) в течение 7 с^;-ток контрольного культивирования с ДМСО (I), при действии цитохалазина В и после его удаления из среды культивирования (2). По оси абсцисс - время, суг; по оси ординат - доля многоядерных клеток, % (на тыс. клеток). Стрелкой обозначен момент удаления цитохалазина В из среды культивирования. (3) - контрольное культивирование без ДЫСО. Вертикальные линии - границы доверительного интервала для Р = 0,05

ли поставить вопрос о том, образуются ли при их делении одно- и многоядерные клетки в тех условиях, когда снято подавляющее цито-Т01шз воздействие цитохадазином В. Для решения этого вопроса был проведен подсчет соотношения между числом одноядерных и числом многодцерных клеток, а также проанализировано число ядер в шого-ядерных клетках в течение 7 суток после удаления агента из среды культивирования. В результате было обнаружено быстрое нарастание доли одноядерных клеток в популяции. В то же время при подсчете ядер в многоядерных клетках наблюдалось некоторое уменьшение количества дву-, трех- и 4-5-ядерных клеток. Проведенная нами оценка мятотического индекса (со профазам - для дифференцированной оценки одно- и многодаерных клеток) показала, что после снятия воздействия цнтохалазшом В в культуре клеток китайского хомячка митоти-ческий индекс многоядерных клеток сходен или несколько выше мито-тического индекса одноядерных клеток. Высокий уровень митотической активности шогоядерных клеток наряду с уменьшением доли многоядерных клеток и клеток с 1-5 ядрами может указывать на то, что часть шогоядерных клеток после прекращения действия цитохалазина В способна делиться с образованием одноядерных клеток.

В то же время с общим падением доли многоядерных клеток в культуре растет содержание клеток с числом ядер от 6 до 10. Это означает, что реверсия одноядерного состояния после снятия инду-

цирующего многоядерность воздействия возможна, но не для всей популяции многоядерных клеток.

Для решения вопроса о том, каков путь изменения числа ядер в многоядерных клетках, индуцированных цитохалазином В, m анализировали типы митозов при действии агента и после прекращения воздействия. Были выявлены как биполярные, так и шогополюсные митозы. Оценка относительного содержания многополюсных митозов (суммарно всех фаз) показала, что при действии цитохалазина В доля многополюсных митозов в 17 раз превышает контрольные значения. Отмывание культуры от агента не приводит к снижению содержания многополюсных митозов среди митотическпх клеток. Таким образом, в культуре клеток цитохалазин В наряду с подавлением цитогомии ( Carter, 1967 ). индуцирует появление большого числа многополюсных митозов.

Способность многоядерных клеток,-индуцированных цитохалазином В, делится многополюсным митозом, поставила вопрос о механизме возникновения многополюсности при действии агента. Оставалось неясным, связано ли появление таких митозов с увеличением плоидности клеток и числа центриолей в них, или причиной многополюсности является К-митогическая задержка, которая вызывает появление дополнительных полюсов за счет преждевременного созревании дочерних центриолей или за счет образования.бесцентриолярных полюсов. Для ответа на такой вопрос,в первую очередь,было проведено исследование изменения процентного соотношения фаз митоза в ходе эксперимента. В результате было показано, что индукция многополюсности при действии цитохалазина В не связана с К-млтотической задержкой. К-метафазные клетай обнаруживаются в ходе эксперимента, но их число не меняется и остается на уровне 1%. Этим действием цитохалазин В отличается от действия таких К-митотическях агентов, как колхицин, колцелш, 2-меркаптоэганол и др. ( Mazia et al.,1960; 3tubblefield,Brlnkley,1967s Keryer et al.,1984 ). Далее наш показано, что в присутствии цитохалазина В переход клеток в многополюсную метафазу, также как и в биполярную, осуществляется через прометафазу без какого-либо блока в ранних фазах митоза.

Таким образом, цитохалазин В. нарушая цитотомии, приводит к тому, что первым этапом является формирование полиплоидных дву-ядерных клеток, которые в дальнейшем начинают делится многополюо-чым митозом (рис.3). Вследствие этого число ядер в клетках нарастает.

Снятие воздействия ведет к восстановления'цитотомии, но су-

<

а

а

^ МЧ ¿b *U ** »» «V

. уК . J

'о б

Рис.Б. Изменение относительного содержания шогопоотсных митозов в культуре клеток китайского хомячка (линия ¿¿<) при действии цитохалазина В и после его удаления из среды культивирования: а - А'.етафазы-анафазы (о), б - телофазы с цитотомией (а) и без цитотомии (v). Светлые значки -контроль. По оси абсцисс - время,сут, по оси ординат -доля митотических клеток, % (на 200 митозов). Остальные обозначения те же, что на рис.2.

шественно не снижает высокий уровень многополюсных митозов (рис. 3). В результате этого происходит возврат к одноядерному состоянию у одной части многоядерных клеток и возрастание числа ядер у другой части многоддерных клеток.

Центриолярный комплекс в многоядерных клетках индуцированных цктохалазином В, в культуре клеток китайского хомячка Исследование многоядерних клеток, индуцированных в культуре клеток китайского хомячка, показало, что в них присутствуют многочисленные центриоли, образующие единый центр. Следовательно, при действии цитохалазина В происходит не только синтез ДНК (O'Keill, 1978), но и репродукция центриолей. Подтверждением этого являются наблюдаемые в отдельных штерфазных многоядерних клетках центриоли с процентриолями и диплосомы. Об этом же говорит и то, что в митотических клетках (метафазных, телофазных и таких, в которых ядра асинхронно проходят начальные фазы митоза) можно видеть в полюсах веретена диплосомы или парные центриоли. Но такая картина характерна лишь для митозов; протекающих в присутствии цитохалазина В. После снятия воздействия кроме парных центриолей в полюсах обнаруживаются и одиночные центриоли. В целом это'означает, что при действии цитохалазина В с каждым раундом репродукции ДНК происходит удвоение числа центриолей в клетке. В результате чего в таких полиплоидных клетоах поддерживается корреляция между числом центри-

олей и площщостью. После же окончания длительного воздействия возможно нарушение цикла репродукции отдельных центриолей и, соответственно, нарушение корреляции между числом центриолей и плоидносгьга.

Для проверки того, каково действительное соотношение между пловдноетыо и числом центриолей, в полиплоидных клетках, образующихся в результате воздействия цитохалазином В, ш подсчитывали на стадии метафазы число кинетохоров и число центриолей. Проверка этого метода на диплоидных метафазах показала правомочность его использования,в 12 клетках насчитывалось 55 кинетохоров (4 п). Пло-идность метафазянх клеток в процессе длительного воздействия цито-халазином В составляла, как правило, 8п и в них насчитывалось 8 центриолей (таблица I). Это подтверждает, что с каждым раундом син-

Таблица I

Содержание кинетохоров (хромосомных наборов -п) и центриолей в кетафазных клетках при действии цитохалазшом I

Я Тип метафазной пластинки Общее число Число кинетохо- Число цен-

клетки кинетохоров центриолей ров, ориентированных к полюсу триолей в полюсе

I трехполюсная 63 (7п) 8 21 20 22 2 2 4

2 трехполосная 64 (7п) 8 13 23 25 2 2 4

3 трехполюсная 70 (8п) 8 30 12 28 2 2 4

4 четырех-полюсная 64 (7п) 8 9 13 25 28 2 2 2 2

5 псевдобипо- ' лярнаяя 74 (8п) 8 16 22 36 2 2 4

6 биполярная 68 (ап) 8 34 34 4 4

7 биполярная 71 (8п) 8 36 35 4 4

{ Псевдобшолярннм назван митоз с единой метафаэной пластинкой и нескольким! полисами, расположенными по обе стороны отой пластин-

ки.

геза ДНК происходит удвоение числа центриолей в клетке. Отсутствие ;:е циготомии в митозе, вызванное действием цитохалазина В, приво-1Ило к параллельному нарастанию в клетке числа хромосоипп набо-

ров и центриолей.

Таким образом, если собнт1ш хромосомного и центриолярного щжлов, связанных с репродукцией этих компонентов, протекают в клетке сопряженно, а нарушается лишь течение митоза, увеличение плоидности клеток сопровождается пропорциональным увеличением числа центриолей в них.

В противоположность этому в полиплоидных многоядерннх клетках. возникших после снятия длительного воздействия цитохалазином В соотношение между числом центриолей и площщостью значительно нарушено (табл.2). К образованию таких клеток ведует следующие причины.

Таблица 2

Содержание кинетохоров (хромосомных наборов-п ) и центриолей в мет&фазних клетках после снятия воздействия цитохалазином В

№ Тип метафазной Общее число ■ Число кинетохо- Число цен-

клетка пластинки кинетохоров центри-олеи ров, ориентированных к полюсу триолей в полюсе

- 24 2

6 четырех-подоеная 102 (11п) 14 27 17 34 24 4 4 4 2

9 шести-полюсная 203 (23п) 14 30 41 51 24 33' ' 11 1 5 12 2

10 шеетипом) сная 224 (25п) 16 30 33 ■ 33 43 72 10 2 2 2 I I 8

II восьми-полюсная 210 (23п) 22 41 36 55 14 6 7 10 41 2 2 0 1 5 2 I 3

12 псевдоби-поля]зная 59 (6п) 6 28 .31 2 4'

13 псевдобиполярная 146 (16п) 4 74 .72 2 2

14 биполярная 56 (6п) 8 мш СП со 4 4

15 биполярная 76 (8п) 8 37 39 2 6

Три действии цитохалазина в процессе многополюсного митоза к полю-зам бтходит анеуплоидное число хромосом и не коррелирующее с эти-ш значениями число центриолей (табл.1). Цитохалазин В нарушает датотомию и поэтому, несмотря на анеуплоидное число хромосом в яд-)ах, в клетке поддерживается суммарно эуплоидное число хромосом, гмножающееся после каждого раунда митотического цикла. Число цен-:риолей в таких клетках, как уже упоминалось, соответствует общему телу хромосомных наборов. При восстановлении цитотомии после снятия воздействия образуются дочернин клетки с анеуплоидными ядрами I самым разнообразным числом центриолей, которое может значительно [ревышать содержание хромосомных наборов или быть меньше этих зна-[ений. При анализе таких клеток на стадии метафазы обнаружено,что тело центриолей может быть нечетным (табл.2). Это указывает на •о, что часть центриолей к митозу могло яедорешшцироваться или место одной дочерней центриоли на материнской было образовано две [ более'. Две дочерних центриоли около одной материнской было обна->ужно нами в одной из метафазных клеток. Присутствие в полюсах не ■олько парных, но и одиночных центриолей еще раз указывает на воз-южность недорепяикации дочерних центриолей, либо говорит о том, то в таких клетках дочерние центриоли, созревая, - отделяются от ¡атерпнекой центриоли и отходят от.нее на значительное расстояние, бразуя собственный полюс митотического аппарата. Таким образом, в летках с нарушенным соотношением между числом центриолей и хромо-омных наборов у части центриолей, по-видимому, происходит наруше-ие цикла репродукции центриолей и их функционального созревания, а это же указывает и варьирование длины центриолей, наблюдаемое ак в интерфазных, так и в митотических клетках после снятия воз-ействия.

Далее при исследовании ультраструктуры митотических клеток ами обнаружено, что как в биполярных, так и в многополясных ми-отических веретенах при действии цитохалазина В нарушается струк-ура митотического аппарата. Так, в веретене отсутствуют аотральне микротрубочки. В полюсах наряду о диплосомами выявляются парке центриоли, каждая из которых окружена гало. Появление гало округ дочерней центриоли свидетельствует о ее функциональном соз-евании. Как правило, созревание дочерней центриоли связано о за-вржной клеток на одной из стадий клеточного цикла ( Маг1а еЪ а1., 360). Но при действии цитохалазина В появлении многополе-сных многой не предшествует К-митотический блок или удлинение начальных аз митоза. .

При снятии воздействия астральные мккротрубочки восстанавливаются. Но гало приобретает гигантские размеры и становится общим для цеитриолей каждого из пошосов. По-видимому, в клетках, образовавшихся после прекращения воздействия цитохалазином Б, происходит десинхронизация хромосомного и центросомного циклов, причем, именно в той фазе клеточного цикла, в которой осуп;ествяяется рост центросома, то есть в начальных фазах митоза.

Долее, в настоящей работе показано, что цитохалазин В приводит к появлению клеток, в которых разобщается структурная дифферен-цировка и функциональное созревание клнетохоров. На это указывает то, что в процессе воздействия цитохалазином В можно видеть наряду с одаослойшми изогнутыми, трехслойные плоские кинетохоры, после снятия воздействия как плоские, так и изогнутые кинетохоры оказываются однослойными и напоминают но строению прометафазные кинетохоры. Такое нарушение в строении кинетохоров в метафазных клетках свидетельствует о нарушении их дифференцировки (Ш.ейег,1982). Присутствие зе ккнетохорных микротрубочек во всех изученных клетках говорит о функциональной зрелости таких низкодифференцировая-ных кинетохоров.

Таким образом, цитохалазин В вызывает в митотическом аппарате метафазных клеток аномалии в составе образующих веретено микротрубочек, в организации полюсов и кинетохоров. По-видимому. эти аномалии являются результатом разобщения хромосомного цикла и циклов ряда центров организации микротрубочек (центриолей, центросом, кинетохоров).

'Лногоядерные клетки, возникающие при слиянии одноядерных клеток. В работе использовали поликарионн, в которых можно было провести маркировку ядер (а значит и хромосомных наборов), происходящих из разных клеток. Перед слиянием клетки, находившиеся в разных Фазах клеточного цикла метила с помощью двойного меченая

и . С-тимидшом. Для слияния был использован метод, включающий обработки клеток диметилсульфоксидом и полиэтиленгликолем (Ghoвh,PaиeXets,1984). Обнаружено, что слияние начинается сразу после воздействия полиэтиленгликолем к завершается в течение первого чаоа. При слияний в составе гомокариона.могут оказаться го-мофазные пли гетерофазные ядра. Обнаружены следующие комбинации ядер в составе гетерофазных гомокарпонов: <^/3, з/с2

с^/З;^. В настоящей работе исследовали митотическую активность только гетерофазных гомокарконов, содержащих не более 50 ядер.

При слиянии гетерофазных клеток в составе поликариона оказываются гетерофазные ядра и гетерофазные центриоли. Нага било проверено электронномикроскошгческое исследование именно таких поли-карионов. Оказалось, что в поликарионах центриоли могут располагаться по-разному: I - единым клеточным центром, подобно толу, что наблюдается в полиплоидных клетках, образующихся путем нарушения цптогомии (гепатоцитн, незрелые мегакариоциты, индуцированные цито-халазином В шогоядерные клетки); 2 - группами около отдельных ядер, как это обнаруживается в молодых мышечных трубках ( ТаазХп е* а!., 1985). Но независимо от характера локализации, центриолп способны к репродукции, а сами поликарионы к вступлению в митоз. При этом методе, который был использован нами для получения поли-карионов (обработка Дл'СО и ПЗГ) гетерофазные ядра асинхронно проходят фазы митоза вплоть до метафаза, последовательность вступления в митоз полякарионов зависит от числа ядер в поликарионе и от комбинации гегерофазных ядер. Поликарионы с числом ядер не более 4 вступают в митоз через время, равное 3/4 периода генерации, более крупные поликарионы - через время, равное периоду генерации и более. В млтотических поликарионах наблюдается как синхронное, так и асинхронное прохождение ядрами разного происхождения начальных фаз митоза. Среди полккарионов с разными комбинациями ядер в митозе первыми оказываются 51/й2 гомокарионы, затем с^/з и (рис.4). При асинхронной ыитотической активности ядер в первой категории поликарионов в митоз сначала вступают ядра 02 » в остальных - ядра (рис.5). Все поликарионы вступают в метафазу не ранее, чем через II часов (рис.6). Этот срок для культуры китайско-

Рис.4. Относительное содержание гегерофазных. гомокарионор содержащих профазные ядра (гибриды: I - (¡-¡/э ; 2 -01/02; . 3 - 01/Б/а2 ). По оси абсцисс - время» часы; по оси ординат - додя профазиих гомокарионоз, %

Рис.5

Относительное содержание ядер разного происхождения в профазных гомокарионах.

по оси абсцисс - время, часы; по оси ординат - доля ядер, %.

Белые столбики - ядра ¿И; о точками - ядра в ; заштрихованные ядра вг ; черные - ядра в профазе

о,/в/аг

Рис .6

Относительное содержание гетерофазных гибридов в метафазе:

1 - G1/S

2 - 01/02

3 _ G1/S/G2

По оси абсцисс - время, часы; по оси ординат -доля метафазных клеток,

го хомячка чуть меньше продолжительности периода генерации (12 часов - Еголина и др.,1972). За столь продолжительное время происходит, во-первых, репродукция всех центриолей и поэтому в полюсах митотического аппарата обнаруживаются парные центриоли; во-вторых, часть дочерних центриолей созревает, и, наряду с материнскими центриодями, они оказываются окруженными гало и принимают учасгие в организации полюсов веретена деления. По Данным Гоша и Павелеца

( Ghosh,Paweletz ,1984), в гетерофазных гококарионах, полученных путем слияния с помощью ПЭГ и ДМСО, синтез ДНК происходит в ядрах, находившихся в момент слияния как в s -периоде, так и в (^-периоде. Таким образом, гетерофазные гомокарионы, вступая в митоз, имеют удвоенное содержание ДНК в ядрах и редуплицированные центриоли. В результате этого в гетерофазных гомокарионах налюда-ется соответствие между общей плоидностью поликариона и общим числом центриолей как сразу после образования поликариона. так и при его вступлении в митоз.

Электронномикроскопический 'анализ показал, что при вступлении гетерофазных гомокарионов в митоз в них формируется веретено, состоящее из всех типов микротрубочек: астральных, межполюсннх и кшетохорных. Такое веретено имеет сложную многополгасную организацию. Межполюсные микротрубочки связывают полюса, между которыми располагаются метафазные хромосош, но не всегда эти полюса являются ближайшими относительно друг друга..Если между соседними парами центриолей нет хромосом, то меаду ниш никогда не обнаруживаются микротрубочки. Кроме того, пучки кшетохорных микротрубочек ре всегда направлены к ближайшим центриолям.

В митотических клетках также наблюдаются промежуточные фила-менты. Они видны по периферии клетки, вблизи полюсов и хромосом. Промежуточные филаменты могут отделять одну, хромосомную группу от другой. Следует отметить, что локализация промежуточных филаментов на электронном уровне подробно не изучалась.

Необходимо подчеркнуть, что в гетерофазных гомокарионах все центриоли локализуются в полюсах митотического аппарата. Кроме того, радиоавтографический анализ показал, что хромосомы, происходящие из разных ядер, сохраняют обособленное положение в составе общей метафазной пластинки и это не зависит от того, является ли ми-юз биполярным или многополюсным. Отсюда следует, что распределение хромосом по дочерним ядрам в процессе деления гетерофазного го-мокариона носи! зуплоииный характер и в соответствии с хромосомными наборами распределяются центриоли. В результате митоза образуются дочернин клетки, плоидность которых различна, но кратна диплоидному набору хромосом. Варьирование числа хромосомных наборов в дочерних клетках связано с тем, что большинство гетерафазннх гомокарионов (94$) делится многополюсным митозом, в котором число борозд прц цитотомии может быть различным. Так как в соответствии с распределением хромосомных наборов происходит распределение центри-

олей, но это число коррелирует с плоианостью клетки.

Итак, исследование многояаестых клеток, возникающих различными путя.ми, показало, что в одних из этих клеток умножение числа хромосо.мгак наборов сопровождается пропорциональными увеличением числа центриолей (многоядерные клетки при действии цитохалазина В, гомокарионк). в других шогоядерных клетках соотношение между плотностью и числом центриолей окезиваотся нарушенным (многоядерные клетки после снятия воздействия цитохалазпном В). Такое разнообразие оказывается связанным, главным образом, не с нарушением репродукции центриолей в s-периоде, а с характером распределения хромосом и центриолей в процессе многополюсного митоза к с тем, завершается ли такой митоз цктотомией. Оказалось, что митоз при делении гетерофазных гомокарионов не сопровождается существенными нарушениями в распределении хромосом и центриолей между дочерними клетками. Но митоз, протекающий в индуцированных цитохалазином В полиплоидных клетках, характеризуется глубокими аномалиями - в нем происходит анеуплоидное распределение хромосом по дочерним ядрам а клеткам и независящее от числа хромосом распределение центриолей. Наблюдаемые различия в характере распределения хромосом и центриолей в различных по механизму возникновения многоядерных клетках поставили вопрос о том, как различается состояние того элемента цитоскелега, который объединяет в единый комплекс хромосомы и цен-триоли в интерфазе (Вогпепз,Ыаго,1982; Fais et al. ,1984 ) ив митозе (Bloae, Chako,1976; Franke et al.,1978} Celia et al.,1983), а именно промевуточных филаментов.

Организация промежуточных филаментов в многоядерных клетках.

в штерфазе и митозе. Существующие в литературе данные показывают, что в интерфазных многоядерных клетках, как возникающих при слиянии, так и индуцированных цитохалазином В, присутствует сеть промежуточных филаментов, пучки которых могут окружать ядра и распространяться на периферию клеток (Franko et al.,1976; Яясс,1983). Данные о состоянии такой сети при вступлении поликариона в митоз полностью отсутствуют, te исследовали организацию промежуточных филаментов в интерфазных и митотических поликарионах, индуцированных цитохалазином В и образовавшихся при слиянии клеток.

Обнаружено, что в контрольной культуре клеток китайского хомячка (Aß 17) в штерфазных клетках присутствует сеть промежуточные йиламентов, которая окружает ядро и в виде фибрилл распространяется на периферию клетки. В митозе эта сеть сохраняется, окружая верете-

но, и реорганизуется лишь з телофазе, подобно тому, что наблюдается В ряде других культивируемых клеток (Aubin et al.,1980; Blone, Bushnell,1932),

При воздействии цитохалазином (5 ккг/мл) в интерфазных и т-тотических клетках уже через I час происходит фрагментация сети виментиновых промежуточных филаментов, а через 4 суток и ее полное исчезновение. После длительного воздействия агентом (7 суток) удаление его из среды культивирований приводит через 2 суток к появлению лишь коротких пучков промежуточных филаментов, но сеть к этому времени не восстанавливается.

В поликарионах, возникающих путей слияния одноядерна клеток (культура клеток Ag 17), виментшовда промежуточные филаменты образуют сеть вокруг каждого из ядер и эта ячеистость сохраняется при вступлении поликариона в митоз вплоть до метафазн как в биполярных, так и в многополюсных митозах. Наиболее четко прослеживается такое распределение промежуточных филаментов в гомокарпонах, ядра которых асинхронно проходят начальные фазы митоза. В анафазе сохраняется периферическая часть сети, центральная ее область исчезает и таким образом разрушается компартментализацкя сети. В тело-фазе яркое периферическое свечение отражает, по-вкдшому, начало реорганизации сети промежуточных филаментов, которая окончательно сформируется в дочерних клетках.

Обнаруженное нами различие в распределении промежуточных филаментов в гомокарпонах и в многоядерных, клетках, индуцированных цитохалазином В, может служить одной из причин разного распределения хромосом и цен триолей в многополюсных митозах, характерных для этих поликарионов. Наши данные позволяют предполагать, что при слиянии и образовании гомокариона (вероятно, также п гетеро-карпона) каждая клетка вносит свою сеть промежуточных Филаментов. окружающую ядро и центриоли. Именно благодаря этой сети сохраняется обособленность хромосом и центриолей. происходящих из разных клеток, несмотря на то. что происходит формирование единого сложного ве-ретена. Проведенные нами ультраструктурные исследования показывают, что пучки промежуточных филаментов обнаруживаются в составе митотического веретена и разделяют друг от друга отдельные йолюса и группы хромосом. Это также свидетельствует о возможной роли промежуточных филаментов в качестве структурного компонента, изолирующего ядерно-центриолярнне комплексы розного происхождения друг от друга. Этим поддерживается эуплоидное распределение хромо-

сом в митозе и сохранение корреляции между числом хромосомных наборов и центриолей.

Нарушение сети промежуточных Филаментов в многоядерных клетках. индуцированных цитохалазином В; приводит, по-видимому, к тост. что в таких поликарионах нет структурного объединения отдельных . ядер и их центриолей в обособленные комплексы. Поэтому и происходит в процессе митоза случайное распределение хромосом и центриолей. Отсутствие ядерно-центриолярных комплексов после снятия воздействия ведет, по-видимому, к сохранению тех же аномалий в распределении хромосом и центриолей, что и при действии цитохалазина В. Г^ожно высказать предположение, что наблюдаемые у разных объектов и при различных воздействиях различия в распределении хромосом и центриолей во время митоза связаны с варьированием целостности, сети промежуточных филаментов.

Центриолярный комплекс в гибридах соматических клеток. Проведено исследование одной из линий гибридных клеток, образованных в результате слияния культивируемых клеток китайского хомячка и мыши. Эти одноядерные гибридные клетки являются полиплоидными и включают хромосомные наборы китайского хомячка и мыши в соотношении 3:1. Такие клетки должны были исходно содержать центриоли,полученные от 3-х клеток хомячка и 1-ой клетки мыши, т.е. 8 центриолей. В клетках, явившихся объектом данного исследования, обнаружено от 4 до 12 центриолей с модальным числом, равным 8 центри-олям. Соответствие между модальными числами хромосомных наборов и центриолей (в интерфазных клетках) указывает на то, что длинном ряду клеточных поколений может сохраняться корреляция между числом хромосомных наборов и центриолей. которая существовала как в исходных родительских клетках, так и после слияния их друг с другом.

Но в строении цен трио лярного комплекса наблюдаются аномалии как в интерфазных, так и в митотических клетках. В интерфазных клетках одновременно могут существовать одиночные центриоли, соответствующие построению о1 -периоду, и диплосомы - признак центриолей -периода* В митозе в полюсах обнаруживались наряду с дип-лосомами парные и одиночные центриоли. Это указывает на существование асинхронности циклов воспроизведения и созревания центриолей, связанное, вероятно, с тем, что в ходе образования гибридных клеток линии 91 происходило слияние клеток разной видовой специфич- ' ности п гетерофазных по своему положению в клеточном цикле.

Важной особенностью ценгриолярного комплекса данных гибрид-

-

кМ**:-

~ 29-ых клеток является сохранение в нем черт, свойственным центри-лярным комплексам родительских клеток. Так, в гибридах'отмечены ателлиты, реснички, придатки, характерные для центриолей мыши, а акже вирусоподобные частицы (ВПЧ), свойственные клеткам культуры итайского хомячка. Следовательно, в целом в гибридной клетке су-ествует смешанный набор центриолей.

Присутствие смешанных наборов характерно для комплекса, в оторый входит большое число центриолей. 3 гибридных клетках, со-ержащих две отдельные центриоли или две диплосомы, обнаруживают-я лишь признаки, свойственные центриолям мыши. Делятся такие летки обычным биполярным митозом.

Линия 91 (3 набора хомячка и I набор мыши) оказалась одной з наиболее стабильных и сохранила большое число хромосом мыши, о и в этой линии по данным кариологического анализа в некоторых летках произошла значительная утрата хромосом мыши (Какпакова и р.,1974). Можно ожидать, что при электронномикрсскопическим ис-ледовании центриоли мыши будут обнаруживаться достаточно редко, собенно в клетках, в которых общее число центриолей не велико, днако полученные данные говорят о противоположном - в изучаемых абридах отмечена преимущественная потеря признаков центриолей леток китайского хомячка.

В условиях культивирования клеток на селективной среде мно-ополюсность может приводить к возникновению гетерогенных клеток, этих клетках оказываются не только разные хромосомные наборы, о и разные центриолярные наборы, и таким образом, многополюсность эжет служить причиной элиминации как хромосомных наборов, так и энтриолей.

4. Центриолярный комплекс при снижении плоцдности в результате многополюсных митозов, индуцированных в популяции диплоидных клеток-

При изучении роли диплоидного многополюсного митоза в изме-знии плоядности и числа центриолей в клетке-мы использовали 2-;ркаптоэтанол в качестве воздействия, индуцирующего К-митоз и 1огополюсный митоз (мав!а et а1.,1дбо). Объектам исследования зужили культура клеток СПЭВ и культура клеток -1?.

После 20-часового воздействия 2-меркаптоэтанолом (0,001 М) культуре клеток СПЗВ число многополюсных митозов достигает мак-шальных значений через 5 часов после снятия воздействия и ста-жясь в 6 раз больше контрольных значений. В это время соотнояе-

ние ме^ду число многополюсных митозов в опыте и контроле в среднем в 3 раза больше, чем соотношение между числом биполярных митозов. Это показывает, что меркаптоэтанол вызвал не только накопление тех и других форм метафаз. но и индукция многополюсннх митозов.

При увеличении длительности воздействия агентом до 36 часов количество многополюсных митозов после отмывания увеличилось, превышая к 5 часам уровень контроля в 13,5 раз, хотя соотношение между биполярными митозами в опыте и контроле в это врем то же, что и в предыдущем эксперименте.

На культуре клеток СПЭВ мы исследовали динамику митотическо-го цикла при действии на клетки 0,001 М 2-меркаптоэтанола. Оказалось, что через 20 часов после начала воздействия митотическиц индекс увеличивается в 3,5 раза по сравнении с контролем. Это связано с задержкой клеток в форме К-метафазы. Исследование абсолютного родержания различных фаз митоза (рис.?) и процентного соотношения между ними позволило обнаружить, что переход клеток в К-метафазу происходит через стад™ биполярной метафазн.

Для того, чтобы определить, существует ли удлинение каких-либо стадий интерфазы при действии 2-меркаптоэтанола, мы исследовали динамику прохождения митотического цикла для клеток, находящихся в момент введения агента в ^ , 3 и -периодах. При идентификации этих клеток перед введением агента проводили двойное мече-ние клеток "41- и . С-тимцдином. Оказалось, что при воздействии на асинхронные клетки культуры СПЭВ клетки всех периодов способны про ходить интерфазу, вступать в митоз и из метафазы переходить в К-ме тафаэу. Основная масса клеток не задерживается в отдельных периодах интерфазы, но среди клеток,, находящихся при введении агента в о - и 3 -периодах сть небольшая доля клеток, длительно задержи-вдащиеся в интерфазе. В том и другом случае, по-ввдимому, это клет ки начала периодов.

Далее следует отметить, что устойчивое блокирование клеток возникает не сразу, а через-8-Ю часов после начала воздействия. В эти сроки в митоз успевают вступить лишь клетки з - и а^-пе~око~ дов и именно поэтому для них обнаружена так называемая фаза неустойчивого блока, клетки же о^-периода вступают в митоз позднее, уже тогда, когда для всей культуры наступает фаза устойчивого блока в К-метафазе. По-видимому, существование устойчивого и неустойчивого блокирования клеток в К-метафазе определяется не тем, в каком периоде интерфазн клетки испытали воздействие, а продолжитель-

1

& а Н Ь п »„д

К < 1 ,» * » » (0 и

1« и II н | I

5кс.7 > Изменение абсолютного содержания клеток разных стадий митоза в культуре С11ЭВ в течение 20 часов обработки 2-меркаптозтшояом (0.001 М) и после снятия воздействия. По оси абсцисс - время, ч. По оси ординат

а) доля профаз, %; б) доля нормальных метафаз (светлые точки) и Й-метафаз (черные точки), %; в) доля анафаз (светлые точки) и телофаз (черные точки), %.

Стрелкой обозначен момент удаления 2-меркаптоэтанола из среды култивирования. К - контроль. Вертикальные линии ~ - 95% доверительные интервалы

гостью самого воздействия в данной концентрации. Увеличение концентрации, вероятно, может сокращать продолжительность фазы неустойчивого блока.

Для клеток разных периодов оказалась различной скорость выхода из К-митотического состояния. Клетки, находившиеся в момент введения агента в в^периоде, выходят из блока позднее, чем клетки з- и й -периодов. До сих пор совершенно неясно, репарация каких процессов требует столь длительной задержки.

Далее показано, что мкогополюснне митозы индуцируются примерно с одинаковой вероятностью во всех категориях клеток, находившихся в интерфазе ( 01, 8, 02 ) в процессе обработки 2-меркап-тозтенолом. Эта шдукция в большой степени вызвана блокированием в К-метафазе (профаза нормальная метафаза К-митоз). но продолжительность блокирования для разных категорий клеток различна.

Структурные перестройки митотического веретена при переходе

метафаза—»-К-метафаза —-метафаза Мы исследовали детально на свето- и электронпомикроскопичео-ком уровнях строение метафазных клеток в процессе перехода из ме-тафазы в К-метафазу. Оказалось, что этот переход в разных клетках происходит по-разному. В одних клетках сначала нарушается строение митотического веретена, в котором в первую очередь исчезают межполюсные и астральные микротрубочки, затем уменьшается количество и протяженность кинетохорннх микротрубочек. Хромосомы при этом утрачивают свое строго упорядоченное расположение в составе пластинки. Характер расположения сестринских кинетохоров значительно варьирует от клетей к клетке. В одних клетках их расположение то же,чт( и в нормальных метафазах, т.е. сестринские кинетохоры расположены на противоположных сторонах хромосомы. В других у отдельных хромосом кинетохоры могут располагаться рядом на одной стороне хромосомы, либо под некоторым углом относительно друг друга. В этих биполярных метафазах с дефектным веретеном центриоли в виде диплосом остаются на противоположных сторонах по отношению к пластинке, кинетохорные же микротрубочки даже в тех клетках, в которых они очень короткие, остаются направленными к центриолям, и это не зависит от того, отходят ли они от кинетохоров перпендикулярно или по касательной.

Переход в других клетках в К-митотическое состояние сопровождается в первую очередь разрушением метафазной пластинки, веретено же продолжает включать все типы микротрубочек обычной протяженности. В полюсах сохраняется диплосомная ориентация центриолей, кинетохоры имеют характерные для нормы размеры, и микротрубочки от них отхода под прямым углом.

Сформированные К-метафазные клетки отличаются: I - полным отсутствием экваториальной пластинки; 2 - полным отсутствием веретена, хотя очень короткие кинетохорные микротрубочки, отходящие от удлиненных кинетохоров, могут сохраняться; 3 - нарушением дип-лосомной организации центриолей. Центриоли могут располагаться две рядом и две отдельно, либо составлять общую группу. Фибриллярное гало не обнаруживается в связи с центриолями»

Снятие К-миготического воздействия приводит к восстановлению метафазной пластинки и митотического аппарата. Восстановление митотического аппарата, так же как и его разрушение, происходит поэтапно. Но этапы восстановления несколько отличаются от этапов

- 33 - .

>азрушешш. Светомикроскопическое изучение показало,- что сначала > К-метафазных клетках восстанавливается веретено, затем метафаз-сая пластинка. Исследования ультраструктуры продемонстрировали, ¡то на первом этапе в части К-метафаз могут восстанавливаться дип-юсомы. Частотно восстановленное веретено состоит только из кине-юхорных микротрубочек разной протяженности, но всегда направленное к. дентриолям. Кинетохорн остаются увеличенными и микротрубоч-ги к ним расположены по касательной.

Второй этап включает восстановление метафазной пластинки, 'а этом этапе веретено состоит только из кшетохорных микротрубо-;ек. Таким образом, выстраивание хромосом в пластинку (независимо 1Т того, в биполярную или многополюсную) происходит без межполюс-:ых микротрубочек, при наличии очень коротких кшетохорных микро-рубочек. Ориентация кинетохоров так же не ваша для формирования :етафазной пластинки. Дальнейшее восстановление митотического ап-:арата в разных метафазных клетках происходит по-разному - в одних начала восстанавливается строение и ориентация кинетохоров, а ук ¡атем появляются межполюсные и астральны« микротрубочки, в других :олное восстановление всех типов мккротрубочек предшествует нор-[ализации в строении кинетохоров (рис.8).

¡го.8. Схема этапов перестройки структуры митотического аппарата метафазннх клеток СШВ при действии 2-меркаптоэта-яола и после его удаления из среды культивирования. Ц - центриоль, ХР - хромосомы, Ш - микротрубочки, К - кшетохор, КМТ - кинетохорные микротрубочки, ФГ - фибриллярное гало

Структура полисов многоголюсних митозов, индуцированных 2-меркаптоэтанолом. Проведенные исследования показали, что К-мито-тическая зад ерш: а приводит к блокировании или удлинению хромосомного цикла. Это выражается в длительном конденсированном состоянии хромосом. В то же время центриоллярный цикл продолжается. Проявлением этого является разъединение центриолей, отхожаение их друг от друга, образование вокруг дочерней центриоли фибриллярного гало. Образование многополюсных митозов с одиночными цеитриоляки в полюсах бесспорно можно прежде всего связывать с продоллжтельным К-ми-тогическим блоком.. Действительно, в культуре клеток СГОВ все многополюсные митозы, индуцированные 2-меркаптоэтанолом, имели веретена с центриолярными полюсами. Однако в культуре клеток А^ 17 при индукции тогоаотспоот 2-меркаптоэтанолом (0,01 М, 18 часов воздействия, 7 часов отмыв а) наряду с центриолярными наш обнаружены бесцентриолярные полюса. Центром организации дополнительных полюсов в таких веретенах служит фибриллярный материал, соответствующий гало, которое окружает в биполярном митозе материнскую цен-триоль. В культуре клеток Ае 17 в многополюсных митозах только часть полюсов были бе сцеп трио лярными. Так, в трехполюсяых метафа-зах бесцентриолярнымк могут быть 0Д1Ш или два полюса. Следует отметить, что даже в полюсах, содержащих центриоли, может наблюдаться нарушение ассоциации центриолей и фибриллярного материала - цен триоли локализуются в полюсе, ко не в связи с гало, которое несмот ря на это остается фокусом схождения микрогрубочек веретена. Такие наблюдения прямо указывают на то, что возникновение бесцентриоляр-ных полюсов может быть результатом разъединения фибриллярного материала и диплосом.

О причинах этсхо явления в настоящее время данные отсутствуют. Механизм возникновения многополнсных митозов с бесцентриоляр-ными полюсами также остается неясным. Данные литера!уры и наши наб людения указывают на то, что появлению таких митозов предшествует К~мптонический блок. Другая причина формирования бесцентриолярных полюсов может заключаться в образовании избыточного количества фиС риллярного материала. Пока нет данных о времени репродукции фибрих лярного гало, но его агрегация на материнской центриоли диплосош происходит в с2 -периоде, затем в профазе и промегафазе возрастав: объем гало ( йоЪЫпв et а1.,19б8; Voгobjevf СЬе^зоу,1982). Кох-го предположить, что удлинение именно этих фаз и приводит к появлению избыточного количества фибриллярного материала.

■ - 85

Распределение хромосом й центриолей при многоголосных ми-'озах. При исследовании характера распределения хромосом в провесе многополюсного митоза, индуцированного в культуре клеток ig I? воздействием 2-меркаптоэтанолом, был использован метод ре-юнструкщш по сериям ультратонких срезов многополюсных метафаз-мх пластинок. Показано, что в диплоидных клетках многополюсные штозы могут завершаться эуплодцным (по числу хромосом) распреде-[ением хромосом в том случае, если форма метафазной пластинки яв-[яется V -образной. В случае образования трех дочерних ядер после :акого митоза в них могло содержаться In, 2n, In число хромосом, лалогичное распределение хромосом обнаружено после диплоидного •рехполюсного митоза в культуре клеток Microtus agrestis, так как [оказано, что 1/3 дочерних ядер были диплоидным, 2/3 - гаплоид!Ш-щ по содержанию ДНК (Pera, Rainer,1973).

При У-образной форме метсфазной пластинки после индукции шо-■ополюсности наблюдается анеуплоидные числа хромосом, ориентиро-!шные по направлению к полюсам и соответственно возможно образо-1ание анеуплоидных дочерних ядер. Таким Образом, в трехполюсних штозах, индуцированньк в популяции диплоидных клеток 2-меркапто-нанолом в культуре клеток китайского -хомячка характер распреде-шния хромосом различен и зависит от формы трехполюсной метафаз-юй пластинки. Насколько эта закономерность характерна для других шогополвсннх митозов, возникающих при делении дипловдных клеток, юка трудно сказать.

Как уже упоминалось, эуплоидное распределение хромосом обнажено нами также в шогопошсных штозах полиплоидных многоядер-шх клеток. Но это характерно лишь для поликарионов, возникаюпшх в результате слияния клеток. Если такой многополюсный митоз завершается цитотомией, то происходит снижение плоидности клетки. Сле-сует отметить, что при этом, если поликарион содержал исходно щра разновицового происхождения, то в одних дочерних клетках ¡роисходит объединение хромосомных наборов разного происхождения, сак это обнаруживали при делении соматических гибридов быка и нор-ш (ïeplitz et al.,1968), в других клетках ядра могут содержать сромосомы одновидового происхождения, и тогда можно говорить о эеверсии части гибридных клеток к родительскому кариотипу. Пояз-иение рекомбинантных клеток показано при многополюсннх митозах, андуцированннх вшбластшом ( Martin.Spraque,1970).

Как уже упоминалось, анеуплощное распределение хромосом

обнаруяено нами при делении индуцированных цитохалазином В многоядерных клеток. В результате этого индуцированные цитохалазином В поликарионы содержат анеуплоидные ядра, но в присутствии цитохала-зина В цитотомия не происходит и поэтому в целом поликарион оказывается полиплоидной клеткой с 2п х 2, и т.д. числом хромосомных наборов. Восстановление цитотомии после снятия воздействия приводит к тоэду, что анеуплоидными оказываются не только отдельные ядра, но и сами дочерние клетки (как одноядерные, так и многоядерные).

Таким образом, в зависимости от характера распределения хромосом в процессе многополюсного митоза могут возникать следующие варианты клеток: I - одноядерные клетки с эуплоидным хромосомным набором (от I до нескольких п ); 2 - многоядерные клетки с эуплоид-ными ядрами; 3 - одноядерные анеуплоидные клетки; 4 - многоядерные клетки, суммарно эуплоидные, но с анеуплоидными отдельными ядрами; 5 - многоядерные анеуплоидные клетки с анеуплоидными ядрами.

Распределение центриолей при многополосном митозе может быть различным. В культурах клеток СПЭВ и китайского хомячка при индукции шогополюсности 2-меркаптоэтанолом обнаружено, что распределение центриолей по полюсам может быть 2:1:1 и 2:2:0. В культуре клеток китайского хомячка распределение центриолей типа 2:1:1 выявлено при У-образных метафазах и не было обнаружено при 7-образном-митозе, но вероятно, это было связано с малым числом проанализированных митозов* Теоретически такое распределение центриолей для у-образных метафаз возможно. В этом случае число центриолей, попадающих при делении в дочерние клетки может соответствовать числу хромосомных наборов.

Таким образом, при деленш. диплоидных клеток многополюсным митозом могут образовываться гаплоидные клетки, в которых сущест- . вует корреляция между числом хромосомных наборов и центриолей ха-рокгерная для диплоидных и полиплоидных клеток.

Снижение плоидности, при котором не нарушается нормальное соотношение между плоидностью и числом центриолей, может происходить п в процессе многополюсного митоза одноядерных и многоядерных полиплоидных клеток. Такое явление было обнаружено нами при исследованк деляюашхся гетерофазных гомокарионов,-у которых перед вступлением клеток в митоз происходит редупликация всех центриолей. То что в полисах многополэсного веретена присутствовали только парные цен-триоли и то, что хромосомы, происходящие из разных ядер, сохраняли в пластинке обособленное расположение, позволило сделать заключение

[то зупловдное распределение хромосом сопровождается таким рас-[реяеленпем центриолейг при котором сохраняется корреляция мезду шоцдностью и числом центриолей. В отличие от шогополюсного ми-■оза диплоидных клеток, который может приводить к появлению гап-юидных клеток, многополюсный митоз полиплоидных клеток в том слу-!ае, если в полюсах присутствуют парные центриоли, должен снижать [ЛОЩШОСТЬ лишь до диплоидного состояния. По-видимому, если в шогополэсном веретене полиплоидных клеток наряду с парными цен-Триолями присутствуют одиночные центриоли (как это было обнаруже-[0 нами в гибрцдных клетках клона 91), возможно образование гап-тидшх ядер и клеток «

Итак, многополюсные митозы, ведущие к такому снижению плоиц-юсти, при котором сохраняется не только эуплокдность хромосомного isöopa, но и характерное для нормальных клеток соотношение !.:еяд.у шелом хромосомных наборов и центриолей, можно рассматривать как >едукционные.

.Как показывают данные литературы и собственные исследования, )вдукционнне многополюсние митозы - событие достаточно редкое. ¡а:де наблюдаются многополюсные митозы, для которых распределение [ентриолей не зависит от распределения хромосом: многополюсние [иплоиднне митозы, индуцированные 2-меркаптоэтанолом, причем для ¡лучаев как эупдоидного, так и анеуплоидного распределения хромо-;ом, полиплоидные многополисные митозы, инцуцировашшо цитохала-¡ином В. Но в присутствии цитохалазкяа В нормальное соотношение .'.ежду числом хромосомных наборов и центриолей поддерживается тем, но из-за отсутствия цитогонии все хромосомы и центриоли сохраняйся в составе одной и той же клетки (например, 8п -8 центриолей). ¡осстановление цитотомии после снятия воздействия приводит к формированию клеток, содержащих самые разнообразные количестоа хромо-:ом и центриолей.

До сих пор отсутствуют систематические исследования своПств : леток, у которых нарушено соотношение между, числом хромосомных [аборов и центриолей. Но единичные данные позволяют думать о том, [то поведение таких клеток может быть отличным от нормального, ?ак, показано, что если в результате, многополюсного митоза, шду-щрованного меркаптоэталолом, образуются бесцентриолярные допер-гие клетки, то именно они в дальнейшем сливаются о сестринским шня-риолярными клетками (Ходяков и др. ,190Э). Не исключена и ги-

клеток, образующихся в результате шогополюсного млтоза ; Marin, Bender, 1966; Sato et al.,1981 ).

- 38 -

Очевидным является го, что шогололюснне митозы, сотровождг щиеся анеуплоидным распределением хромосом или приводящие к появ; нию дочерних клеток с нарушенным соотношением между числом хромосомных наборов и центриолей, носят 'патологический характер и, вероятно, в одних случаях завершаются гибелью дочерних клеток, в других - появлением клеток со свойствами, отличными от исходного клеточного типа.

Помимо редукционного и патологического многополюсного митозов следует выделять многополюсные митозы смешанного типа. Таким) являются митозы, в ходе которых происходит эуплоидное распределение хромосом, но Яропорциональное плоидности число центриолей см знвается лишь в части дочерних клеток. Например, полиплоидный трехполюсный митоз завершается следующим распределением хромосом и центриолей: Зп- 2ц, 2п - 2ц, 1п - 2ц; диплоидный трехполюсный митоз - 1 п-2ц, 2П- 1ц, Iп — 1ц. Как можно видеть, такой тип деления ведет с одной стороны к редукции плоидности, с другой - к появлению клеток с аномальными характеристиками.

5. Структура веретена в спонтанных патологичеоких митозах

Исследованы спонтанные патологические митозы в клеточных культурах, а также в опухолевой ткани. Оказалось, что в культуре диплоидных клеток СПЭВ многополюсные митозы по структуре полюсов соответствуют тем, которые возникают в результате К-митотическог блока, вызывающего преждевременное созревание дочерних центриоле и отделение их от материнских. В зависимости от того» произошло ли значительное разъединение центриолей обеих диплосом или одной из над, образуется грехполюсное или чегырехполюсное веретено.

В гетероплоидной культуре клеток китайского хомячка (линия 237) обнаружен*' два варианта многополюсного митоза: I - митозы, которые возникают в клетках в результате образования дополнитель ных полюсов присутствующими в клетке многочисленными диплосомакн 2 - митозы, которые'Возникают в результате преждевременного созревания дочерних центриолей. Преждевременное созревание дочерних центриолей и участие, их в организации собственных полюсов наблюдается в клетках с-числом центриолей, характерным как для диплоидных, так и для полиплоидных клеток.

Следует отметить, что в спонтанно образованных иноготогас-ннх митозах, наблюдаемых нами в исследованных культурах, ие обнг рухенн бесцснтрполярные полюса. Это может указывать на то, что споотенное возникновение событий, янпуцпрушсих такое деление, пг

- 39 г

¡ходит достаточно редко. Необходимые для преждевременного созре-шия центриолей К-метафазы отмечаются в культуре клеток СПЗВ в [иничных случаях, в культуре Ев клеток китайского хомячка они )ставлягат от всех митозов.

Штереено, что по структуре всех остальных компонентов мито-леского аппарата - составу микротрубочек, организации кинетохо->в - спонтанные многополгасные митозы в обеих культурах не отличайся от нормальных двухполюсных митозов.

Все типы митозов (двуполгоскце, многополюсные иК-митозы), !наруженные нами в опухолевой ткани (гистиоцитома человека), окажись чрезвычайно разнообразными по числу центриолей. В них иаб-' щается от 4 и до 13 центриолей. Далее, как двухполюсный, так и югополюсные митозы опухолевой ткани имеют различные нарушения в ■руктуре митотического аппарата. К таким нарушениям относятся: - дефекты в составе шгкротру бочек: отсутствие в части метафаз •.тральных и межполюсних микротрубочек; 2 - преждевремешше созре-!ние. дочерних центриолей: часть полюсов или все полиса организо-¡ны одиночными центриолями, окруженными гало; 3 - неактивность ■дельных центросом - часть центриолей, окружениях гало, не участит в организация микротрубочек; 4 - разъединение центриолей и 1Л0 - все полюса не содержат центриолей или часть центриолей, на-|дящихся в клетке, не ассоциированы с фибриллярным гало; 5 - при-тствие в клетке нечетного числа центриолей; 6 - значительная ва-[абельность размеров центриолей.

Проведенные нами исследовгния и данные литературы говорят о м, что такие многочисленные нарушения различных компонентов мимического аппарата предполагают реализацию комплекса различных «анизмов - источников клеточной патологии. В зависимости от 'ГО какие механизмы комбинируются при возникновении тоге- или гао-| митоза, можно ожидать большего или меньшего отклонения от нср-Tait, для одних митозов характерно наличке многочисленных диплом, что, по-видимому, указывает на полиплоидность этой клетки. ' характеру организации мптотического аппарата га не можем сказать механизме полиплоидизации данной клетей, но, вероятно, провепе-:е параллельно анализа состояния промежуточных филаментов могло

с большей или меньшей достоверностью показать, произошла л:: кая клетке в результате нарушения цитотомии пли в результате. 11янкя одноядерных клеток. Существование и того и другого источка полиилоидизации клеток в опухолях известно (Кеудри,I9Î53;

- 40 -

Бродский,Урываева,1931; Казанцева,1981).

Далее, появление одиночных центриолей в полюсах митотическо-го аппарата, бесспорно говорит о том, что такие клетки прошли К-ме-тафазный блок. Действительно К-метафазные клетки характерны для опухолевой ткани (Каудрп,1958; Казанцева, 1931). Кроме того, наш обнаружено, что во всех К-метафазных клетка гистоцитомы отсутствует диплосомпая организация центриолей и что среди биполярных и многополюсных митозов выявляются клетки, у которых веретено представлено лишь кинетохорными микротрубочкаыи. На клетках культуры СПЭВ показано, что именно такой тип организации митотического аппарата является одним из этапов перехода метафаза К-метафаза ме-тафаза.

Таким образом, источником появления избыточных полюсов в митозе опухолевых клеток (независимо от организации метафазной пластинки) может являться, во-первых, полипловдизация клеток и в связи с этим умножение числа центриолей, во-вторых, преждевременное созревание дочерних центриолей в результате К-митотической задержки. Третьим источником является полное или частичное разьединение двух компонентов - центриолей к фибриллярного гало. Бесцентриолярная центросома успешно служит ЦОМТ веретена.

Разъединение центриолей и фибриллярного материала ведет к тому, что центриоли, не ассоциированные с полюсами, оказываются случайным образом разбросанными по цитоплазме и, соответственно, они должны случайно распределяться между дочерними клетками. Это должно вести к нарушению корреляции между числом хромосомных наборов и центриолей, причем не только при многополесном, но и при двухполюсном митозе.

Аналогичный результат по созданию дисбаланса между числом центриолей п хромосом в клетке дает и неактивность отдельных центриолей и дипяосом, несмотря на то, что они сохраняют ассоциацию с фибриллярным материалом. Причины функциональной гетерогенности отдельных центросом, присутствующих в одной и той же клетке, до сюс пор остаются не изученными.

Существование в клетке нечетного числа центриолей и варьирование их размеров говорит уже о нарушении той части центриолярного цикла, которая касается репродукции центриолей. По-видимому, в кле ках гистоцитомы у разных центриолей могут быть нарушенными, во-пер вых, инициация редупликации (нечетное число центриолей), во-вторых элонгп.-дня центриоли (присутствие коротких центриолей) и термжация

- 41 -

>ста (присутствие длинных ценгриолей). Такие нарушения в центри-мрном цикле описаны для полиплоидных клеток СНО, образовавшихся >и длительном воздействии колцемидом ( Киг1уата ,1982). Варьиро-мие размеров центриолей нами обнаружено также в клетках, содер-¡щих не 4 (как в диплоидном митозе), а значительно большее число ттриолей (от 6 до 13).

Мы не исследовали число хромосом в митотических клетках гис-юцитомы человека. Но в таких клетках соотношение между числом >омосомннх наборов и центриолей может быть нарушенным вследствие: - нарушения цикла репродукции отдельных центриолей; 2 - наруше-и ассоциации отдельных центриолей с центросомой, организующей 1люса (как при индукции 2-меркаптоэтанолом); 3 - инактивации от-¡льных центросом, содержащих центриоли; 4 - многополюсности в свя-[ с созреванием дочерних центриолей (как при индукции 2-меркапто-•анолом); 5 - многополюсности. в связи о многочисленностью дипло-1М (как при индукции цитохалазином В).

.Такая множественность причин нарушения нормального соотноше-ея между числом хромосомных наборов и цьнтриолей, безусловно, явится источником появления большого разнообразия клеточных типов, которых резко нарушено соотношение между хромосомным, центриоляр-м и центросомным циклами. Это в свою очередь должно выразиться в роком варьировании пролвферативных способностей клеток, в разно-разии их цитоскелета и таких функций, кап способность к прикрепит, ■ распластыванию, клеточной подвижности, фагоцитарной актив-сти и т.д. В конечном итоге, углубление нарушения в координации дну хромосомным, центриодярным и центросомным циклами может яв-ться одной из важнейших причин опухолевой прогрессии.

6. Взаимосвязь между центриодярным, центросомным и хромосомным циклами

Проведенные в настоящей работе исследования и данные литера-ры показываот, что дифференцировка и полиплоидизация одних типов еток не связана с разобщением центриолярного, центросомного и омосомного циклов, появление же других форм полиплоидных клеток лючает различнее варианты разобщения грех циклов относительно уг друга и эти сдвиги могут носить обратимый и необратимый ха-ктер. Так, полиплоидизация клеток с помощью полиплоидизирующего юза или слияния интерфазных клеток не нарушает сопряженности ех циклов. Обратимое прекращение митотической активности таких еток и выход в й0~период может приводит к исчезновению морфоло-

гически выраженной ассоциации центросомного материала и центриолей (гепатоциты взрослых животных). Необратимое прекращение про-лифератшзной активности полиплоидных клеток сопровождается изменением локализация центросомного материала и распадом центриоляр-ного комплекса (зрелые мегакариоциты,. мышечные волокна - Bassin st q1. ,1985). Глубокое нарушение координации трех циклов, которо« проявляется не только в отделении центросомы от центриолей, но и б исчезновении самих центриолей, происходит при политенизации хроматина.

То же можно сказать и о некоторых типах дифференцированных диплоидных клеток. В клетках, обратимо утрачивших митотическую активность, возможно появление большого количества центросомного материала и формирование втулки (признака материнской центриоли) внутри дочерней центриоли (эндотелий аорты - Быстревская и др., 1988). При необратимом выходе из митотического цикла центриоли могут исчезать (ядери эритроциты - Miller,Solomon Д984), либо число их резко возрастает за счет образования de novo (ресничный эпителий - Anderson» Brenner Д971).

Половые клетки представляют собой особую группу дифференцированных клеток. У разных видов в ходе делений созревания яиц прос яеживаегся сопряженность событий центросомного и хромосомного циклов, но центриолярный цикл оказывается различным. У одних видов центриоли редушшцируются перед мейозом (Kytllus edullo - Longo, Anderson« 1969 ). У других видов перед началом мейоза число центриолей не удваивается, несмотря на удвоение ДНК ( Lymnaea stagnalis.5. Наконец, есть виды, у которых в яйцах центриоли исчезают до начала I метафазы мейоза (мышь - Szöllosi.1975).

При образова> ти мужских половых клеток также в одних случаях центриолярный, центросомный и хромосомный циклы сопряжены друг с другом (насекомы, аскарида и т.д.). У других видов между I и П делениями мейоза наблюдается дополнительная редупликация центриолей (млекопитающие, моллюски, рыбы и т.д. - Aizelius ,1979). В процессе спермиогенеза как центриоли, так и центросома могут претерпевать морфологические преобразования.

В результате оплодотворения происходит объединение не только хромосомного, но и центросомного материала отцовского и матерпнскс го происхождения, восстановление координнрованности центросомного и хромосомного циклов и возобновление центриолярного цикла.

При различных патологических процессах также возможно разоб-

;ние трех циклов относительно друг друга. Оно может- носить обращай характер. Например, преждевременное созревание дочерних цен-июлей может привести к многополюсности митоза, который завершит-[ возникновением гаплоидной клетки. Такая клетка после монополяр-)го митоза ( siuder.Rieder ,1985) вновь становится диплоидной с зрмальным соотношением между числом хромосомных наборов и цен.три-1ей. Но в других случаях разобщение циклов носит необратимый ха-зктер (например, патологические многополюсные митозы,недореплика-!я центриолей в гибридах, образование центриолей de novo при зйствии колхицина - Hubert st al, ,1974). Тогда в клетках нару-зется соотношение между числом центриолей и числом хромосомных аборов. Наиболее яркие аномалии в центриолярном и центросомных жяах обнаружены нами в опухолевых клетках-

На культивируемых клетках и других моделях еще предстоит ¡следовать роль различных вариантов разобщения трех циклов для гзнедеятельности клеток .и развития различных форм патологии, соп-)зотдающихся нарушением регуляции клеточного деления.

ВЫВОДЫ

1. На основании электронкомикрсскопическях исследований гервке показано, что при умножении геномов пугем полиплокдизи-тощего митоза, блокирования клеток в с-2 -периоде щв* слияния кле-ж сохраняется корреляция между числом хромосомных наборов х цея-зиолей, которая характерна для большинства диплоидных соматичес-ос клеток о

2. Механизм корреляции между числом хромосомных наборов я знтриолей как в диплоидных, так и з полиплоидных клетках обеспе-вается сопряжением хромосомного и центриолярного циклов, кото-зе включает два основных этапа: I - сопряженное удвоение геномов центриольй в интерфазе; 2 - сопряженное распределение хромосом-гх наборов и центриолей з митозе.

3» Разобщение хромосомного и центриолярного циклов возможно

> всех фазах клеточного цикла, носит обратимый н необратимый ха-зктер и выражается: а) в случае обратимого разобщения s прежде-земенной репродукции центриолей алк их прекдевремзином дакцко-альном созревании; б) - при необратимом разобщении - з полком гделении репродукции геномов к центриолей друг от друга.

4, Коррекция обратимого рагобщеккк можег происходить в :про-1фер1щующих клегках, тогда как необратимое разобщение свойствек-

> клешам, полностью утратившим способность к пролаз-рации.

5. Как поддержание сопряженного протекания хромосомного и дентриолярного циклов, так и разобщение циклов наблюдается при диффереицировке различных типов клеток. Например, сопряженное прс текание циклов характерно для гепатоцитов, эпителиальных к деток щитовидной железы, обратимое разобщение - для эндотелия аорты, необратимое - для клеток с политенным хроматином, зрелых мегака-риоцитов, ядерных эритроцитов, ресничного эпителия млекопитающих, поперечнополосатых мышечных волокон и т.д.

6. Гаметогенез является особым путем дифференцировки, клеток при котором возможны различные комбинации между числом хромосомны наборов и центриолей. Корреляция между числом хромосомных наборов и центриолей возникает на разных стадиях эмбриогенеза у различных видов животных организмов.

7. В полиплоидных клетках выявлены два варианта локализации многочисленных центриолей: I - в едином клеточном центре - при умножении геномов путем полиплоидизирующего митоза, (-¡¿-блока, и слияния клеток; 2 - в различных зонах цитоплазмы - при умножении геномов только путем слияния клеток.

8. При патологическом состоянии клеток возможно: а) разобщение центриолярного, центросомного и хромосомного циклов относительно друг друга; б) нарушение собственно центриолярного цикла: недорепликация или гиперрепликация центриолей, появление коротких и сверхдлинных центриолей, аномалии в строении центриолярных триплетов; в) разобщение топографической связи между центриолью и центросомой; г) функциональная инактивация центросомы в качестве ЦОЬТ

9. Поликарионы с разным механизмом возникновения различаются характером сопряжения центриолярного и хромосомного циклов:

а) в поликарионах, образовавшихся путем полиплоидизирующего митоза, как при гомофазном, так и при гетерофазном состоянии ядер многочисленные центриоли, как правило, гомофазцы; б) в поликарионах, образовавшихся путем слияния гетерофазных клеток, центриоли разного происхождения гегерофаэны. Синхронизация центриолярных циклов также, как и хромосомных циклов, завершается на стадии мета-фазы.

ХО. Впервые сформулировано представление о гетерогенности типов многополюсных митозов, изменяющих не только плоидность клеток, но и число центриолей в них.

II. Экспериментально показано, что переход от двухполюсного к многополюсному митозу может иметь три источника: I - увеличение числа центриолей в связи с полшлоидизацией клеток; 2 - преждевре-

- 4В -

шое функциональное созревшие центриолей в связи -с удлинением ¡альных фаз митоза или К-митотической запертой; 3 - появление <летках бесцентриолярных центросом за счет частичного или полно-огделения фибриллярного компонента центросомы от центриолей.

12. Йюгопоиосные митозы по характеру распределения хромота и центриолей могут быть отнесены к редукционным, патологичес-м и смешанного типа:

- редукционные кногополяснне митозы, снижая в дочерних клет-х число хромосомных наборов и центриолей, не нарушают корреля-

и между ними;

- при патологических многополюсных митозах происходит нару-ние корреляции между числом хромосомных наборов и центриолей за ет: а) анеуплоидного распределения хромосом; б) эуплоидного определения хромосом, но случайного распределения центриолей;

- при многополюсных митосах смешанного типа происходит эу-овдное распределение хромосом, но центриоли распределяются таким разом, что корреляция между числом хромосомных наборов и числом нтриолей сохраняется лишь в части клеток.

13. Разработан метод идентификации положения клеток в Разиных периодах ( g1, з, g2) клеточного цикла с помощью двойного ¡чения "л- и С-тимидином, последовательное введение которых >лжно проводиться с интервалом времени, равным продолжительности , + 1/2 м. Этот метод позволяет провести последующее изучение 1ентифяциров анных клеток как на световом, так и на электронно-жроскопическом уровнях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Онищенко Г.Е. О соответствии числа центриолей и плоид-эсти гепатоцитов в печени мыши //X Всесоюзная конференция по лек тронной микроскопии. - Ташкент, 1976. - С. 148-150.

2. Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Центриоли в полиплоидных летах //Второй симпозиум по соматической полиплоидия. - Ереван.-377. - С.89-90.

3. Онищенко Г.Е., Филичкца Н.М., Чепцов Ю.С. Использование етода двойного мечешш л- и С-тимидином для идентификации леток в разных периодах интерфазы клеточного цикла //Цитолога.-978. - Т.20, JS I. - С.51-57.

4. Онищенко Г.Е. О соответствии числа центриолей пловдности

гепатоцитов в печени мышей //Цитология. - 1978. - т.20, л 4. -С.395-399.

5. Москвин-Тарханов М.И., Онищенко Г.Е. Центриоли в мега-кариоцитах костного мозга мыши //Цитология. - 1978. - Т.20, ]5 К С.1436-1440.

6. Онищенко Г.Ё., Быстревская В.Б., Ченцов Ю.С. Г/ногополю< ные митозы в клетках культуры ткани в норме и при зкспериментал ной индукции 2-меркаптоэтанолом //Докл.АН СССР. - 1979. - Т.248, № 16.'- С.1443-1446.

7. Быстревская В.Б., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Динамика митотического цикла и аномалии митоза при действии 2~меркаптоэт£ нола на клетки культуры ткани СПЭВ / Цитология. - 1981. - Т.23, И 6. - С.638-547.

8. Быстревская В.Б., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Улътрастрз .тура митотического аппарата в метафазных клетках при действии 2-меркаптоэтанола на культуру ткани СПЭВ //Цитология. - 1981. -Т.23, И, - С.745-752.

9. Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С, Взаимосвязь между циклами репликации ДНК и репродукцией центриолей //Цитология. -Т.23, 10. - С.1211.

10. Онищенко Г.Е. Сравнительно-морфологические аспекты стр ния центров организации микротрубочек - ЦОМТ /Успехи совр.биол. 1982. - Т.94. - Вып.З (5). -С.330-375.

11. Волкова Л.Г., Онищенко Г.Е. Структура мяогополюсного митоза в гибридах соматических клеток //Ш Всесоюзная конференция по патологии клетки. - М., 1982. - С.178-179.

12. Быстревская В.Б., Он'эденко Г.Е. Форш перестройки митотического аппарата метафазных клеток при действии К-митотичес-ких агентов //Ш Всесоюзная конференция по патологии клетки. - №. 1982. - С.190-191.

13. Быстревская В.Б., Онищенко Г.Е. Особенности строения митотического аппарата при индукции 2-меркаптоэтанолом обратимого К-метафазного блока // Матер.ХП Всесоюзной конференции по элек тронной микроскопии. - Сумы, 19£2. - С.Ж7.

14. Быстревская В.Б., Онищенко-Г.Е., Ченцов Ю.С. Влияние 2-меркаптоэтанола на отдельные периода митотического цикла //Цит логил. - 1983. - Т.25, К 3. - С.250-259.

15. Онищенко Г.Е., Волкова П.В. Центриодярннй комплекс в гибридах соматических клеток (мышь, китайски;' хомячок) //Цитология'. - 1933. - Т.25, Л 5. - С.503-515.

16. Индукция патологических митозов в культуре клеток инги-тором митохоядриалыюй АТФазы / Б.Б.Бнстревская, Г.Е.Онишенко, И.ЯеЙкина, И.А.Полякова, Ю.С.Ченцов //Биология клетки в культуре.: Цитология, 1983. - Т.25, Л 9. - C.I09I.

17. Бнстревская В.Б., Онищенко Г.Е. Многополюсные митозы в рме и при экспериментальной индукции /'Цитология и генетика. -

83. - Т.17, П 3. - С.59.

18. Онищенко Г.Е., Бистревская В.Б. Многоголосный митоз, ханизм возникновения и биологический смысл /'Тезисы докл. на седании У.ОШ. - 1983.

19. Бнстревская-В«Б., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Изменение руктури митотического аппарата метафазных клеток, индуцируемое меркаптоэтанолом в культуре тканей СПЗВ, Светомикроскопическое следование /'Цитология. - Т.26, № 9. - С.995-1002.

20. Крючкова М.Ы., Онищекко Г.Е., Ченцов Ю.С. Строение цен-иолярного комплекса в разных периодах клеточного цикла в гепато-:тах-печени в норме и при экспериментально вызванном о2-блоке// :тология. - 1984. - Т.25, В 9. - С.1072.

21. Бнстревская В.Б., Онищенко Г.В., Ченцов Ю.С. Ультраструк-ра митотического аппарата метафазных клеток в культуре ткани

ЭВ после прекращения действия 2-меркаптоэтачола //Цитология,

84. -Т.25, Ji 10, - С.Ю95-1Ю2.

22. Крючкова И.К., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Строение ценно лярн ого комплекса в гепатоцитах мыши, при экспериментальной ин-кции g2-блока //Цитология. - 1983. - Т.28, И I. - С.29-33.

23. Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Строение центриолярного комп-кса в гепатоцитах кнтектной и регенерирующей печени мыши //Цито-гия. - 1985. - Т.28, JS 4. _ С.403-408.

24. Ходяков А.Я., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Распределение •омосом и центриолей в трехполюсных метафазах, индуцированных •меркаптоэтаполом в культуре клеток китайского хомячка //Докл.АН СР. - 1983. - Т.290, № I. - С.225-227.

25. Петращук О.М., Онищенко Г.Е. Особенности пролиферации :огоядерннх клеток, индуцированных цптохалазином В //Цитология. -187. - Т.29, К 2. - С.214-220.

26. Петращук О.М., Онищенко Г.Е. Исследование роли многопо-юных митозов в пролиферации многоядерных клеток, индуцированных гепхалазином В //Цитология. - 1987. - Т.29, а 7. - С.794-801.

27. Петр ащук О.М., Онищенко Г.Е. Варианты асинхронного сия-

теза ДНК и митозов в многоядерных клетках, индуцированных цито-халазином В /'Цитология. - 1987. - Т.29, й 10. - C.II26-II3I.

28. Онищенко Г.Е., Пронина С.Л. Гетерофазные гомскарионы: особенности протекания митоза и распределения в нем хромосомных наборов //Цитология. - 1987. - Т.29, л 9. - C.I09S.

29. Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Многообразие структурных фор многополюсных митозов //13 Всесоюзная конференция по патологии клетки. - 1987. -C.I4I.

30. Онищенко Г.Е., Пронина С.А. Исследование митотической активности различных вариантов гетерофазных гомокарионов //Цитоло гия и генетика. - 1938. - Т.22, л 5. - C.29-S3.

31. Ониценко Г.Е., Пронина С.А. Особенности митоза гетерофазных гомокарионов //Цитология и генетика. - 1988. - Т.22, Л 6. С.31-33.

32. Петращук О.М., Онищенко Г.Е. Нарушения ультраструктуры митотического аппарата при действии цитохалазина 3 //Цитология. -1988. - Т.30, И 12. СД418-1425.

33. Ходяков А.Л., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Ультраструктура и свойства клеток культуры ткани, лишенных центриолей //ХШ Все союзная конференция по электронной микроскопии. - M., 1988. - С.2

34. Крючкова М.М., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Ультраструктура кинетохоров в гаметогенезе и в I делении дробления яйцеклеток Lymnaea otagnalis .//Ш Всесоюзная конференция по электронной микроскопии. - M., 1988. - 0.1*70.

35. Ходяков А.П., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Спонтанное ели ние бесцентриолярных клеток, образующихся в результате трехполюс-ного митоза в культуре клеток /УДокл.АН СССР. - 1989. -

Т.308.

36. Крючкова М.М., Онищенко Г.Е., Чзнцов Ю.С. Ультраструкту ра полюсов веретена I и П делений созревания яиц Lyranaea stagna-

lie // Онтогенез. - 1989. -Т.20, » 4.

37. Крючкова М.М., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Ультраструкту ра полюсов веретена первых делений дробления у Lymnaea ntagnalis Онтогенез. - 1989. -Т.20, fô 5.