Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь между хромосомным и центриолярным циклами при изменении плоидности клетки

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь между хромосомным и центриолярным циклами при изменении плоидности клетки"

г ¿so

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО 31АЫЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В»ЛОМОНОСОВА

ВЗАИМОСВЯЗЬ МЩУ ХРОШСОШШ И ЦН2ПРИОЛЯРНШ ДШШМ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ МОЩНОСТИ КЛЕШИ

03.00.17 - Цитологйя

Авгорефера! диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

3

СНИШЕНКО Галина Евгеньевна

На правах рукопиои

УДК 576.3H/.3I6; 576*35

Москва - 1989

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии биологического факультета МГУ им.М.В Ломоносова

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор

Ю.С ДЕНЦОВ

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук, профессор

В.Я.БРОДСКИЙ

- доктор биологических наук О.И.ЕПИФАНОВА

- доктор биологических наук М.Е.АСВДЗ

Ведущее учреждение - Инотитут цитологии АН СССР (Ленинград)

Защита состоится " , " ___ 1989 г. в ....... чаоов

на ваоедании Специализированного совета Д 053.05.68 при Московском государственном университете-по адресу: 119899, Москва, В-2Е Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией мокно ознакомиться ь библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"_ 1989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета ' кандидат биологических наук..

Е.Н.КАЯИЗТРАТОй

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В соматических клетках животных организмов хромосомный и центриолярный циклы состоят из событий, обеспечивающих удвоение числа данных клеточных компонентов. Существующая в диплоидных клетках корреляция между числом хромосомных наборов и числом центриолей обеспечивается взаимосвязанностыо хромосомного и центриолярного циклов, вклпчащей не только одновременность удвоения хромосом и центриолей, но одновременность распределения этих компонентов в митозе ( Murray et al.,1965; Kuriyama, Borisy,1981; Vorobjev,Chen-t3ovt1982; Alvey,1986 ).

В клетках животных организмов с центриолями, как правило, ассоциирована центросома, которая состоит из фибриллярного материала и выполняет функцию центра организации микротрубочек ( Ьиукз, 1970, Pulton, 1971). В клеточном цикле наблюдают морфофункциональ-ные преобразования центросомы, которые называют центросомным циклом ( Mazia, 1984). В норме в диплоидных клетках центриолярный и центросомный циклы сопряжены друг с другом ( Brinkley,1985 ), а также С хромосомным'циклом ( Mazia,1986 ).

Однако до настоящего времени отсутствует детальный анализ характера сопряжения трех циклов друг о другом и последствий разобщения этих циклов для диплоидных'клеток, имеющих разный тип диф-ференцировки, как в норме, гак и при патологическом состоянии клеток. Данная проблема является еще менее изученной для клеток, площшость которых отлична от диплоидной.

Изменение плоицности клеток - широко распространенное явление. Снижение плоидности клеток происходит при появлении половых клеток и осуществляется путем специального типа деления клеток -мейоза. Умножение числа геномов наблюдается при дифференцировке таких клеток, как гепатоциты, кардиомиоциты, остеокласты, мега-кариоциты, поперечно-полосатые мышечные волокна, трофобласты и т.д. Основными механизмами увеличения числа геномов служат поли-плоидизирующий митоз, блокирование клеток в °2 -периоде, эндоре-дупликация, политенизшия и слияние клеток (Бродский,УрпваеваД981).

Кроме того, изменение плоодности клеток происходит при таких патологических процессах, как воспаление, опухолевый рост, вирусные инфекции, а также в ответ на различные воздействия (радиационное поражение, гипо- и гипертермия, химические агенты типа енти-тубулиновых, алкиллирутощих, энергетических ингибиторов, ингибиторов синтеза нуклеиновых кислот и Ьелкв и т.д.). При этом к сниже-

юга числа хромосом наиболее часто ведет многополюсный митоз,увеличение плоидности осуществляется с участием тех же механизмов, которые описаны для дифференцированных клеток в норме (Каудри, 1958; Алов,1972; Блюмкин,Жданов, 1972; Еродскии,Урываева,1Э81).

Различные клеточные п тканевые культуры в настоящее время широко используются как в качестве моделей для фундаментальных исследований, так и в качестве материала для биотехнологического производства. В клеточных культурах изменения плошшости клеток могут происходить спонтанно, при изменении условий культивирования и при тех. же воздействиях, которые приводят к снижению или увеличения плоидности клеток в организме.

Таким образом, исследование центриояярного и центросомного циклов при изменении плоидности клеток является важной и актуальной проблемой, тесно связанной с вскрытием механизмов изменения плоидности клеток и биологического смысла таких изменений при диф-ференцировке клеток, в ходе важнейших патологических процессов (воспаление, опухолевый рост, вирусная инфекция), а также при поранении клеток различными Физическими и химическими воздействиями как in vivo, так и in vitro.

Целью настоящего исследования было изучение особенностей центриолярного цикла при изменении плоидности клеток. Центриоляр-ный цикл был изучен для полиплоидных клеток, умножение геномов, в которых осуществлялось с помощью различных механизмов. Центриоляр-ный цикл в условиях снижения плоидности клеток был исследован на примере мейоза, ведущего к образованию гаплоидных яйцеклеток, а также на примере многополюсных митозов, возникающих в популяции диплоидных клеток (спонтанных и индуцированных К-митотическим агентом), в популяции полиплоидных одноядерных клеток и тлеющих различное происхождение многоядерных клеток (образующихся в результате слияния или в результате нарушения цитотомли). Кроме того, цель работы состояла в изучении поведения хромосом при разных типах многополюсных митозов, что должно было позволить проанализировать особенности сопряжения и разобщения центриолярного и хромосомного циклов при снижении плотности клеток. И, наконец, данное исследование было направлено на выявление роли различных элементов цитоскелета (в том числе и немикротрубочковых), в поддержании коррекции между числом центриолей и числом хромосомных наборов при процессах, ведущих к изменению плоидности клеток. ■

Для решения поставленной проблемы необходимо решить следую-

щие задачи:

1. Исследовать соотношение между числом центриолей и плоид-ностьп в клетках, уклонение геномов в которых происходило в результате: а) полиплоиаизирующего митоза; б) блокирования клеток в g2 -периоде; в) политенизации; г) слияния клеток.

2. Исследовать центриолярный цикл в полиплоидных клетках.

3. Исследовать соотношение между числом хромосомных наборов и центриолей при сникении плоионости в процессе мейоза и после восстановления диплоидного состояния в результате оплодотворения.

4. Исследовать роль многополюсного митоза в изменении числа хромосом и центриолей: а) определить причины возникновения многополюсных митозов в популяциях диплоидных и разного происхождения полипловдных клеток; 6) определить этапы перехода к многополюсному гамозу в популяциях дилловдных и полиплоидных клеток; в) исследовать характер распределения хромосом и центриолей при индукции многополгасности в диплоидных и полиплоидных клетках; г) исследовать локализацию промежуточных филаментов при редукционных и патологических многополюсных митозах.

Научная новизна полученных результатов состоит в том, что впервые доказана корреляция меиду числом центриолей и хромосомных наборов в полиплоидных клетках, увеличение числа геномов в которых происходит путем полиплоцдизирующего митоза in vivo и in vitro или слияния клеток in vitro . Выявлено, что при полиплои-дизацли клеток путем о2~блока не нарушается репродукция центриолей, по происходит разобщение центриолярного и хромосомного циклов, при политенизации - наблюдается исчезновение центриолей из клеток. Обнаруяено, что при обратимой утрате пролиферативной активности сохраняется целостность центриолярного комплекса, при необратимой - как после полшлоидизации путем полиплоидизирующего митоза, так и при умножении геномов без митоза (политенизация), происходит распад центриолярного комплекса. Отсюда сделан вывод о том, что если процесс умножения геномов включает любые формы ми-тотической активности, в клетке поддерживается корреляция между плокдностью и числом центриолей, если при полиплоидизации митоти-ческая активность отсутствует, то корреляция нарушается вплоть до полного исчезновения центриолей.

На основании собственных результатов и анализа данных литературы продемонстрировано, что мейоз является процессом, при котором происходит нарушение корреляции меяду число хромосомных набо-

ров и числом центриолей в дифференцированных половнх клетках, вое-' становление же корреляции между плоианостью и числом центриолей осуществляется на начальных этапах эмбриогенеза.

Исследование центр полярного комплекса и поведения хромосом в шогополюсных митозах позволило впервые показать, что существует широкое разнообразие в структурной организации, механизме возникновения и биологическом значении многополюсных митозов. Впервые доказано, что многопопгасные веретена с диппосомами в полюсах появляются при делении полиплоидных клеток, с одиночными центриолями -при делении ди-и полиплоидных клеток, прошедших стадию К-метафа-зы; с дополнительными бесцентриолярными полюсами - при делении диплоидных клеток, подвергшихся К-митотическоод воздействии.

Выявлено, что как в диплоидных, так и в полиплоидных клетках многополюсные митозы могут обеспечивать как эуплоидное, так и ане-уплоидное распределение хромосом. При эуплоидном распределении хромосом монет быть пропорциональное или непропорциональное распределение центриолей. В зависимости от характера распределения хромосом и центриолей многополюсные митозы следует относить к патологическим, редукционным или смешанного типа. Получены данные о том, что характер распределения хромосомных наборов и центриолей может быть связан с целостностью сети промежуточных филаментов, обеспечивающих в интерфазе и в начальных фазах митоза структурную целостность ядерно-центриолярного комплекса.

Практическое значение. Полученные в работе данные о разнообразии вариантов взаимосвязи между центриолярным и хромосомным циклами при образовании полиплоидных и гаплоидных клеток, а также при патологических делениях клеток носят фундаментальный характер и расширяют наши представления о механизмах, включенных в дифферен-цировку клеток или участвующих в развитии патологических процессов. Изучаемый в работе круг вопросов является составной частью проблем биологии развития и медицины, касающихся регуляции размножения и дифференцировки клеток.

. В настоящей работе дана характеристика особенностей пролиферации многоядерных клеток, индуцированных в культуре различными способами. Эти исследования могут служить основой для проведения анализа механизмов возникновения и пр о лир ер а тивных возможностей многоядерных клеток, наблюдаемых в тканях животных организмов в норме и при самых различных патологических процессах, таких как воспаление, опухолевый рост, вирусные инфекции, радиационное по-

ражение, т.е. процессах, которым уделяется огромное внимание в области медицины ив первую очередь онкологии.

К этому же кругу проблем относятся полученные в работе данные о механизме возникновения и биологической роли таких распространенных форм патологии митоза, как К-митоз и многополюсные митозы. Обнаруженное разнообразие в структурной организации и причинах возникновения многополюсных митозов, а также в вариантах взаимосвязи между К- и многополюсники митозами не только углубляют наши знания в области, касающейся регуляции делений клеток. Представленные данные ставят вопрос о роли К- и многополгосннх митозов в возникновении потомков, несущих различные черты патологии, в том числе и такие, которые ведут к трансформации клеток. В конечном итоге, вопрос об участии потомков патологических митозов, возникающих в различных тканях и при различных воздействиях, в опухолевой прогрессии может быть тесно связан с важнейшей онкологической проблемой гистогенеза опухолей.

В настоящей работе проведен анализ возможных путей нарушения между хромосомным и центриолярным циклами, приводящих к дестабилизации хромосомных наборов. Такой анализ тлеет практический интерес при решении одной из актуальных биотехнологических задач, связанной с поиском методов стабилизации геномов гибридных клеток.

В заключение следует отметить практическое значение предлагаемого в работе радиоавтографического метода идентификации клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, с помощью двойного мечения клеток. Этот метод нашел свое применение в исследованиях, проводимых на кафедре цитологии и гистологии биологического факультета МГУ, в лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им.А.Н.Белозерского МГУ и в других научно-исследовательских учреждениях»

Апробация работы. Основные материалы работы были представлены автором на X, ХП, ХШ Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии (Ташкент,1976; Суш,1982; Звенигород,1988), на Ш и 17 Всесоюзных конференциях по патологии клетки (Москва, 1982,1987), на Симпозиуме по Соматической полиплоидии (Ереван,1977), на Всесоюзных совещаниях: "Митотический цикл" (Ленинград,1978), "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1983,1987), "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград,1984), на Всесоюзном симпозиуме "Реакция клеток на внешние воздействия" (Киев,1982), на УП, XI, ХП школах по биологии развития (Звенигород,1979; Пущино,1985;

- 5 -

Рига,1988), заседании ЮИП (Косква,1983).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, из них 3 таблицы, 105 рисунков и список литературы, включающий работ, в том числе иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Исследование тонкой организации цен-триолярного комплекса, а также соотношения мекду числом центриолей и пловдностыо клеток при различных механизмах изменения числа геномов в клетке проводилось на следующих объектах: I - гепатоцитн нн-тактной и регенерирующей печени шик, плоидность которых возрастает в результате полиплогашзирующего митоза; 2 - гепатоциты регенерирующей печени шни, блокированные в -периоде воздействием дшшном; 3 - мегакариоциты костного мозга г,мши, полиплошшзация которых происходит путем полшловдизирующего митоза; 4 - клетки Бальбиани слюнных желез СШгопопиа Шитт! -{¡Ьшш! содержащие ядра с политеннымп хромосомами; 5 - яйца моллюска Ьутапаеа з-Ьае-па11а в I и П делениях созревания, а также в начальных делениях дробления: 6 - сперматозоиды моллюска Ьупктеа ма^аИв ; 7 - многоядерные клетки, образующиеся в результате нарушения цитотомии в митозе при действии цитохаяазина В (культура эпителиальных клеток эмбриона свиньи ~ СЮВ и культура клеток китайского хомячка линии 23? и Ае-17) ; 8 - многоядерине клетки, образующиеся при слиянии одноядерных клеток (культура клеток а&—17)„ Гибридные одноядерные клетки, полученные путем слияния культивируемых клеток китайского хомячка и мыши (линия 91),,

Исследование тонкой организации центриолей и митотяческого аппарата, а также соотношения меэду числом центриолей и хромосомных наборов при снижении плоидности клеток в результате многополас-ного митоза проводилось для следующих типов шогополасных митозов:

1 - многопошкашх полиплоидных митозов в популяции многодаерннх клеток, индуцированных цитохалазином В в культуре клеток линии 237;

2 - шогояолюскых полиплоидных митозов, б популяции шогоядерных клеток, образующихся путем слияния одноядерных клеток з культуре клеток Ае-17; з - трехполосных диплоидных митозов, шдуцирован-иих 2-меркапгоэтанолом в культуре клеток Аё-Г?.

■ Исследование тонкой организации центриолей и митотяческого

аппарата, а также распределения центриолей в полюсах проводилось для следующих типов митозов: I - спонтанных многополюсных митозов в культуре клеток СПЭВ и в культуре клеток китайского хомячка линии 237; 2 - индуцированных 2-меркаптоэтанолом многополюсных митозов в культуре клеток СПЗВ; 3 - двухполюсных и многополюсных митозов гибридных клеток линии 91 (мышь х китайский хомячок); 4 -двухполюсных и многополюсных митозов гистиоцитомы человека*.

Приготовление материала для электронномикроскопического анализа проводили по стандартным методикам (Уикли,1975) с модификациями в отдельных случаях. Для таких объектов, как яйца и сперматозоиды прудовика и гистоцитома человека, ультраструктурному анализу предшествовало изучение материала на полу гонких срезах (Перов, Ченцов,193Э). Анализ ультраструктуры интерфазных и митотических клеток выполняли на серийных ультратоиких срезах, полученных при резке клетки в ее полном объеме (от 150 до 1000 срезов в зависимости от объекта исследования).

Реконструкцию структурной организации метафазных пластинок проводили путем прорисовки хромосом,, кинетохоров и центриолей с электроннограммом серийных срезов. На полученных реконструкциях подсчитывали число кинетохоров, ориентированных в направлении каждого полюса, и число центриолей.

Плотность гепатоцитов определяли путем измерения объемов ядер гепатоцитов (Бродский,1936) на отпечатках печени, фиксированных и заключенных в эпоксидную смолу для последующего электронно-микроскопического анализа.

Окрашивание антителами в виментину проводили методом непрямой иммунофлуоресценции (метод Кунса). Для этого клетки после фиксации 4% раствором формалина и лизиса с помощью 0,5% раствора Тритона Х-100 окрашивали моноклональными антителами к виментину (антитела были любезно предоставлены проф.О.В.Рохлиным из ВКНЦ АМН СССР).

Для визуализации митотического веретена на светооптическом уровне клетки фиксщэовали смесью Буэна и окрашивали сафронином-генцианновым фиолетовым-ораняевым G (Ромейс,1953).

Метод радиоавтографии (Епифанова и др., 1377) был использован для выявления клеток, находящихся в различных периодах клеточного

я Спонтанная опухоль человека: злокачественная гистиоцитома (гистологический диагноз). Операционный материал любезно предоставлен Е.М.Гнучевой из онкологического центра им.А.И.Герцена.

цикла. При изучении клеток, находящихся в s-периоде, проводили импульсное мечение клеток *%-тимидином. При исследовании клеток в G1 -, s— и 02-периодах использовали метод двойного мечения клеток

и *4С-тимвдином, разработанный в настоящем исследовании. Представленный в работе метод является развитием метода двойного маркирования клеток различными изотопами, примененного Пилгримом и Маурером ( Pilgrim, Maurer, 1965 ). ^

По схеме, предложенной в настоящей работе С-тимидин вводится через времл, в течение которого часть клеток, включивших Ч1-ти-мидин прошла с2-период и вступила в митоз. Это и обеспечивает маркирование клеток во всех периода митотического цикла (рис.1).

V TZtn

t

чншша/т»»

Рис Д. Схема двойного маркирования клеток в митотическом цикле: а - импульсное мечение клеток 3Н-тимидином; б - культивирование клеток в £^еде без изотопа; в - импульсное мечение

С-тимидшом

Проведенные на культуре клеток китайского хомячка (линии 237) исследования показали, что клетки, находящиеся к моменту фиксации в о^периоц, оказываются немечеными. Клетки Б-периода метятся двояко - Си С + ""Н. Клетки, содержащие только трнтиевую метку, соответствуют ^-периоду и митозу. Методом цитоспектрофото-метрии было обнаружено, что содержание ДНК в клетках, идентифицированных нами с помощью двойной метки, соответствует положению этих клеток в митотическом цикле.

Для электронномикроскопического исследования клеток, находящихся в разных периодах клеточного цикла, проводили импульсное мечение клеток ^-тимидином или двойное мечение клеток п- и С-тнмвдином. Отпечатки печени или культуры клеток фиксировали по стандартной электронномикроскопической методике и заключали в эпон. После отделения покровных стекол эпоксидные пластинки покрывали ядерной ахульсией и экспонировали. На светомикроскопическом уровне • анализировали радиоавтографы и определяли положение клеток в цикле, далее изучали ультраструктуру этих же клеток.

в

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЩЕНИЗ

I. Центриолярный комплекс в полиплоидных клетках, образовавшихся с помощью разных механизмов умножения геномов

При изучении особенностей цептриолярного цикла в полиплоидных клетках объектами исследования служили клетки, полиплоииизацкя которых включала различные механизмы: I - полипловдизирующий митоз; 2 - блокирование клеток в а2-периоде клеточного цикла; 3 - поли-тенизации.

Гепатоцитн печени мыт. В печени мыши в онтогенезе и при регенерации образуются гепатоцитн разных классов плошщости. Поли-плоидизация гепатоцитов происходит через стадию образования дву-ядерной клетки в результате митоза без цитотомии по схеме 2а—> 2П х 2--4а-^4п х 2 и т.д. (Бродский,Урнваева, 1970,1Э81). Исследование ультраструктуры гепатоцитов интгктной и регенерирующей печени в разных периодах клеточного цикла показывает, что в каждом периоде центриолярный комплеко имеет присущие данному периоду морфологические черты. Сравнивая центриолярный цикл в гепатоцитах и в других клетках ( КаМпег, ШШрз, 1973! геИвв, Ио11шап, 1979; ТогоЬ^ет, СЬег^аоу, 1982 ), можно отметить, что в основных чертах он сходен во многих типах клеток. В гепатоцитах в с^-периоде цен-триоли несут сателлиты, служащие центрами организации микротрубочек, и придатки; в з -периоде происходит закладка дочерней центри-оли л ее рост; в с2-периоде продолжается рост дочерней центриоли и вокруг д1шлосош образуется фибриллярное гало. Но в то же время центриолярноцу циклу в разных типах клеток могут быть присущи и свои особенности. Например, придатки в гепатоцитах в с0-периоде полностью отсутствуют, они максимально выражены в (^-периоде и постепенно исчезают в 3- и <?2-периодах. В клетках же культуры СПЭВ придатки выявляются во всех периодах клеточного цикла, в том числе и в О0-периоде. Следует отметить, что гепатоцитн отличаются от клеток различных культур тем, что после получения пролифе-ративного стимула их активность, как правило, продолжается лишь в течение одного митотического цикла, и после прохождения митоза они оказываются вновь в б0-периоде.

Гепатоцитн интактной печени независимо от уровня плоидности могут быть отнесены в основном к клеткам бд-периода и лишь в единичных случаях к клеткам -периода. Подсчет числа центрчолей в таких гепатоцитах или -периода показал, что в них сущест-

вует корреляция между плоидностью и числом центриолей: 2п - 2 центриоли; 2n х 2 и 4п - 4 центриоли; 4ц х 2 и 8п - 8 центри-оли. Таким образом, как в одноядерных, так и в двуядерных гепатоци-тах печени мыши выявляется та же корреляция между числом центриолей и хромосомных наборов, что и в одноядерных полиплоидных клетках культуры ткани Miorotus agrestis ( Рега,1975 ).

Для решения вопроса о том, действительно ли множественные центриоли, которые обнаруживаются в центриолярном комплексе полиплоидных клеток,принимают участие в полиплоидизирующем митозе, в данной работе анализировали ультраструктуру млтотических клеток. В печени старых шшей число диплоидных клеток очень низкое или они совсем не выявляются (Урываева,Фактор, 1975). В регенерирующей печени таких мышей чаще всего мы обнаруживали по 4 центриоли в каждом полюсе митотического веретена. Известно, что полиплоидные клетки, вступая в шдуцированннй митотический цикл, перед делением проходят стадию синтеза ДНК (Фактор,Уриваева, 1975), Число центриолей при этом также удваивается. Присутствие в полюсах 4 центриолей может означать, что тетраплоидная по набору хромосом клетка прошла стадию синтеза ДНК и вступила в митоз. Отсюда следует вывод о том, что в клетках, механизм полипяоидизацпи которых включает митоз, сохраняется корреляция между числом центриолей и хромосомных наборов, которая характерна для диплоидных клеток.

При введении дипша (GO ккг/г)-ингибптора клеточного деления - за 2 часа до частичной гепатзктомип происходит длительное блокирование в G2 -периоде, которому предшествует значительное увеличение s-периода (Factor et ai.,1980 ). При электронномикро-скопическом исследовании наш обнаружено во всех клетках большое число центриолей. В период от 30 до 35 часов после гепатзктомип большая часть клеток имеет отдельно лежащие центриоли с ярко выраженными сателлитами и придатками, что соответствует морфологии центриолярного комплекса (^-периода митотического цикла. Другая группа гепатоцитов содержит центриоли с процентриолями, что .является характерным признаком s -периода. Результаты радиоавтографического исследования (Factor et al.,1980) показывают, что в эти сроки после операции преобладающим является класс клеток (^-периода, меньшая же доля популяции гепатоцитов находится в периоде синтеза JIHi. Через 44 час посла операции в популяции превалируют ге-патоцигы s -периода. В период от 60 до 72 часов после операции основная масса клеток (до ?5i) оказывается з (^-периоде (Фактор и

др.,1979). По нашим данным большая часть гепатоцитов в эти сроки имеет центриолярный аппарат с характерными чертами (^-периода, то есть содержит диплосокы. Другие клетки обладают центриолями с про-центриодями, что свойственно для клеток S -периода митотического цикла.

Из наших результатов следует, что морфология цептриолярного комплекса в течение первых 3-х суток соответствует фазам удлиненного митотического цикла гепатоцитов, предварительно обработанных дипином. Однако, начиная с 4-х суток после операции происходит, по-вщш/.о.чу, разобщение ядерного и цептриолярного циклов. По содержанию ДНК клетки находятся в предмитотическом периоде, по структуре центриолярного аппарата - продвигаются, минуя митоз, в следующий клеточный цикл. Так, на 4-5 сутки после операции в клетках Gj>-блока нарушается взаииоперпендикулярная ориентация центриолярных цил1шдров в диплосоые. На отдельно лежащих центриолях одинаковых размеров появляются ярко выраженные перицентриолярные сателлиты и придатки. По своей морфологии центриолярный комплекс приобретает черты Gj-периода. Позднее, на 7-е сутки после операции появляются клетки, тлеющие структуру центриолярного комплекса, характерную для G-p-периода.

Таким образом, выделенные нами типы организации центриолярного комплекса при действии дишша соответствуют в основных чертах морфологии центриолей на отдельных этапах клеточного цикла. Но пои задержке в (Ь-петюде происходит разобщение центриолярного и хромосомного циклов таким образом, что центриолярный цикл оказывается более продвинутнм по сравнения с хромосо?яшм.

Мегакариоциты костного мозга киши. Мегаксриоциты полиплоиди-зируптся в результате к-митоза, зеверкяощегося реконструкцией ядра ( Boll, Domеяог,1980 ) или многополюсного митоза без цптотокик (OdeXX et al.,1968). Плошшость мегакариоцитов варьирует от 4П до £2 или 54а з зависимости от вида животного (Garcia,1964; Peninc-ton,Olsen,1970).Уы исследовали центриолярный комплекс в мегакэрио-цитах трех типов, отличающихся степенью дп^ференцировенности ( Paulus, 1970 ).

В незрелых мегакаркоцитах (I тип) вблизи аппарата Гольдки чаще всего можно было насчитать 13 центрйолей, реже - 8 или 32, собранные в единый комплекс. В некоторых клетках все зрелые цен-триоли были ассоциированы с процен триолями, что очевидно ;/кезнвг.ет на прохождение данной кяетхоЛ s -периода. Ь'логочис ленные центриюди

в этом типе мегакариоцитов описаны и в других работах (Pawcett, 1936; Breton-Goriua,1973 )• К увеличению плоидности в результате синтеза ДНК и полиплоидизирующего митоза способны только незрелые мегакериоциты и это не зависит от величины их плоидности (Odell et al.,1963; Paulus,1970 ). Как показывают представленные в работе данные, именно в этих клетках, способных к 1л:*.тоткческой активности, обнаруживается центриолярннй комплекс, в котором, число цен-триолей равно 8, 15 или 22. Такт,; образом, в незрелых мегакариоцитах выявляется та же прямая зависимость между числом центриолей и плокдностыо клетки, которая была показана нами для гепатоцптов.

Во всех созревающих (П тип) и тромбопоэтических (И! тип) мегакариоцитах цен трио лярнкй комплекс отсутствует. Встречаются лишь немногочисленные центриоли в околоядерной области, лежащие на значительном расстоянии друг от друга.-Центриоли чаще всего располагаются поодиночке и лишь иногда попарно. Процентрполи отсутствуют. Все центриоли в созревающих и тромбопоэтических мегакариоцитах лишены сателлитов и каких-либо контактов с цитоплазматическими микро-трубочкаш, Известно, что эти формы мегакариоцитов полностью утратили митотическую активность. При экспериментальном стимулировании тромбоцитопоэза зрелые мегакериоциты не изменяют своей плоидности (Penlngton,Olsen, 1970 ). Именно в таких клетках центриоли оказываются беспорядочно разбросанными по цитоплазме. Более того, существуют сведения, что отдельные центриоли обнаруживаются даже в отделяющихся тромбоцитах ( Raüley,Scuriield,19B0 ). Тот факт, что в созревающих и тромбопоэтических мегакариоцитах все-таки встречаются центриоли, говорит о том, что разрушение этих клеточных компонентов может происходить постепенно.

Клетки Бальбиани'слюнных желез. .Chironomua thummi thummi Известно, что процесс политеннзации связан с прохождением клеткой множества циклов эндоредупликации и полным блокированием ми готической активности (Кикнадзе,1972). Нами проведено исследование ультраструктуры клеток, в которых произошло S-7 циклов удвоения ДНК. При исследовании серийных срезов клеток, содержащих ядра с Политенными хромосомами (128п и больше) в цитоплазме центриоли не были обнаружены. Несмотря на то, что нами проводился поиск центриолей на серийных срезах, мы не можем утверждать, что в клетках, размеры которых составляют 500 мкм, нет ни одной центриоли. Но очевидно, что в таких клетках отсутствует клеточный центр, содержащий центриоли, и что увеличение плоидности путем политениза-ции не ведет к эквивалентному увеличению числа центриолей.

По данным литературы центриоли не обнаружены при изучении трофобластов ( Boyd, Hamilton ,1936; Знбина, Румянцев,1980) и в клетках Бальбиани слюнных желез Chironomus thummi в 4 личиночном возрасте (Агапова,1987). Таким образом, несмотря на немногочисленность данных, можно сделать заключение о том, что если механизм политенизации клеток включает в себя необратимое ингибирование ми-тотической активности, происходит не только полное разобщение циклов репродукции ДНК и центриолей. При этом перестает существовать целостный центриолярный комплекс и, по-видимому, происходит разрушение самих центриолярных цилиндров. Следует отметить, что, вероятно, при политенизации судьба центриолей сходна в любых клетках независимо от того, организован ли хроматин подобно любому интерфаз-ноцу, или в виде политенных хромосом.

2. Центриолярный комплекс при снижении плоидности в мейозе и при восстановлении плоидности после оплодотворения.

' Деления созревания яйца моллюска Lymnaea stagnaiia

Мейотические деления в процессе геметогенеза являются основным способом снижения плоидности у многоклеточных животных организмов, появление гаплоидных наборов в клетке сопровождается также изменением числа центриолей в них.

Для решения вопросов о соотношении между числом материнских центриолей и хромосомных наборов в делениях созревания яйца прудовика о происхождении центриолей в зрелых яйцах и в ранних делениях дробления мы исследовали ультраструктуру веретена I и П делений созревания яйцеклеток, а также I-Ш делений дробления. Оказалось, что уже в I делении мейоза в яйце содержатся лишь две центриоли, а не четыре, как в митозе диплоидных клеток. Это означает, что яйцо, вступая в мейоз и имея репродуцированный генетический материал, содержит центриоли, которые в ходе подготовки к мейозу не удвоились. В результате этого соотношение меащу числом хромосомных наборов и центриолей оказывается нарушенным. Оставшаяся в яйце после I деления созревания материнская центриоль также не проходит цикла удвоения. Вследствие того, что именно эта целтрйоль локализуется в периферическом полюсе П деления созревания, она попадает после мейоза во второе направительное тельце. Само же яйцо оказывается лишенной собственных центриолей и содержит внесенное сперматозоидом базальное тело.

Наиболее поразительным является тот факт, что базальное тело сперматозоида обнаруживается в составе внутреннего полюса П де-

ления созревания яйца. Функциональное значение такого явления оказывается совершенно неясным.

Ранние деления ЦРОблеНИЯ МОЛЛЮСКа Lymnasa я+.я.ртяИя

В первом делении дробления L. atagnails в каждом из полюсов обнаруживается по одной центриоли сходного строения. Внутри каждой из этих цен трио лей выявляется на одном из концов структура типа "оси со спицами", характерная для процентриолей, образованных de novo и для дочерних центриолей дпплосом ( Pulton,1971 ). Кроме того, в цитоплазме вблизи того конца центриоли, который содержит "ось со спицами", находится глобула из фибриллярного материала, соответствующая по морфологическим признакам дейтеросо-ме. Известно, что именно дейтеросома и сходные с ней структуры участвуют в образовании центриолей и базальных тел de novo (Anderson,Brenner,1971). Топографическая близость дейтеросомы и "оси со спицами" убедительно свидетельствуют о том, что обе одиночные центриоли образовались в первом митотпческом цикле прудовика. Базальное тело, присутствующее в оплодотворенном зрелом яйце, по-видимому, в зиготе разбирается и соответственно не принимает участия в организации полюсов веретена I деления дробления. На это указывает отсутствие структур, соответствующих базалъ-ному телу в тех делящихся яйцах, которые мы исследовали.

Следующим важным наблюдением является то, что в первом ми~ тотическом делении в полюсах присутствуют не по две центриоли, как в митозе диплоидных соматических клеток, а по одной. Это означает. что также, как в делениях созревания, у в 1 делении дробления соотношение между числом центриолей и плоид-ностью является нарушенным. Далее ко 2 делению дробления происходит восстановление нормального соотношения, о чем говорит присутствие в полюсах веретена этих клеток двух центриолей. Такое умно-жеяие числа центриолей свидетельствует о том, что между I и 2 делениями в бластомерах должна была произойти двукратная репродукция центриолей при однократном удвоении генетического материала. Такое течение центриолярного цикла неизвестно для соматических дипловдных клеток. Не описано оно и для гзметогенеза, хотя известны случаи однократной репродукции центриолей при отсутствии удвоения генетического материала (сперматогенез у мыши, крысы и дамана - Rattner,1972).

3. Центриолярный комплекс в полиплоидных клетках, индуцированных в культуре

В работе проводилось изучение многоадерных клеток, возникающих в результате нарушения цитотомии в митозе и при слиянии одноядерных клеток одновидового происхождения. Кроме того, исследовали одноядерные полиплоидные клетки, полученные путем соматической гибридизации клеток разновидового происхождения.

Центриоляоный комплекс в двуядетых клетках культуры СПЭВ. индуцированных длительным воздействием цитохалазином В Электронномикроскопические исследования показывают, что в двуядерных клетках, образовавшихся в результате нарушения цитотомии при воздействии цитохалазином В (2 мкг/мл в течение 7 суток) число центриолей в -периоде равно 4. Это означает, что при подготовке клетки к митозу в присутствии цитохалазина В происходит репродукция не только ДНК, но и центриолей. После расхождения хромосом в' митозе образуются два ядра, пары центриолей мигрируют из полюсов и располагаются в едином клеточном центре. Так™ образом, несмотря на длительное переживание культуры СПЭВ в среде, содержащий цигохалазин В, в двуядерных клетках поддерживается корреляция между числом хромосомных наборов и центриолей. характерная для диплоидных и полиплоидных клеток, образующихся путем полипповдизирую-щего митоза, например, двуядерных гепатоцитов.

Динамика митогпческого цикла и особенности митоза шогоддер-ных клеток, индуцированных цитохалазином В в культуре клеток китайского хомячка

Длительное воздействие (до 7 суток) цитохалазином В (5 мкгДил) на культуру клеток линии 237 позволяет получить большое число многоядерных клеток (до 1Ъ% от общего числа клеток) (рис,2). Для этих клеток характерно то, что они могут содержать достаточно много го-мофазных ядер (до 7) в отдельных поликарионах. Этим такие полика-рпоны отличаются от многоядерных клеток, которые возникают при слиянии одноядерных клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла.

Оказалось, что удаление цитохалазина В из среды культивирования и выращивание клетск (в течение 7 суток) в свежей среде вызывает интенсивный подъем пролиферативной активности всех категорий клеток, достигающий максимальных значений через 2 суток после снятия воздействия. '

Данные об активной пролиферации многоядерных клеток позволь

О Ч вч 1с и Эе 4с *а &е Ус А 12ч 1в 2с 1С 4« 5с 4с ?с

Рис.2. Изменение численности многоядерных клеток в культуре клеток китайского хомячка (линия 237) в течение 7 с^-ток контрольного культивирования с ДЖО (I), при действии цитохалазина В и после его удаления из среды культивирования (2). По оси абсцисс - время, сут; по оси ординат - доля многоядерных клеток, % (на тыс. клеток). Стрелкой обозначен момент удаления цитохалазина В из среды культивирования. (3) - контрольное культивирование без ДМСО. Вертикальные линии - границы доверительного интервала для Р = 0,05

ли поставить вопрос о том, образуются ли при их делении одно- и многоядерные клетки в тех условиях, когда снято подавляющее цито-томию воздействие цигохалазином В. Для решения этого вопроса был проведен подсчет соотношения между числом одноядерных и числом многоядерных клеток, а также проанализировано число яаер в многоядерных клетках в течение 7 суток после удаления агента из среды культивирования. В результате было обнаружено быстрое нарастание доли одноядерных клеток в популяции. В то же время при подсчете ядер в многоядорных клетках наблюдалось некоторое уменьшение количества дву-, трех- и 4-5-ядерных клеток. Проведенная нами оценка митотического индекса (по профазам - для дифференцированной оценки одно- и многоядерных клеток) показала, что после снятия воздействия цитохалазином В в культуре клеток китайского хомячка митоти-ческий индекс многоядерных клеток сходен или несколько выше митотического индекса одноядерных клеток. Высокий уровень шготической активности многоядерных клеток наряду с уменьшением доли многоядер-пых клеток и клеток с 1-5 ядрами может указывать на то, что часть многоядериых клеток после прекращения действия цитохалазина В спо- -собна делиться с образованием одноядерных клеток.

В то же время с общим падением доли многоядериых клеток в культуре растет содержание клеток с числом ядер от 6 до 10. Это означает, что реверсия одноядерного состояния после снятия инду-

цирующего многоядерность воздействия возможна, но не для всей популяции многоядерных клеток.

Для решения вопроса о том, каков путь изменения числа ядер в многоядерных клетках, индуцированных цитохалазином Б, мы анализировали типы митозов при действии агента и после прекращения воздействия. Были выявлены как биполярные, так и шогополюсные митозы. Оценка относительного содержания многополюсных митозов (суммарно всех фаз) показала, что при действии цитохалазкна В доля многополюсных митозов в 17 раз превышает контрольные значения. Отмывание культуры от агента не приводит к снижению содержания многополюсных митозов среди китотических клеток. Так™ образом, в культуре клеток цитохалазин В наряду с подавлением цитотомии ( Carter, 1967 ). индуцирует появление большого числа многополюсных митозов.

Способность многоядерных клеток, индуцированных цитохалазином В, делится многополюсным митозом, поставила вопрос о механизме возникновения многополюсности при действии агента. Оставалось неясным, связано ли появление таких митозов с увеличением плоидности клеток и числа центриолей в них, или причиной многополюсности является К-митотическая задержка, которая вызывает появление дополнительных полюсов за счет преждевременного созревания дочерних центриолей или за счет образования.бесцентриолярных полюсов. Для ответа на такой вопрос,в первую очередь,было проведено исследование изменения процентного соотношения фаз митоза в ходе эксперимента. В результате было показано, что индукция многополюсности при действии цитохалазина В не связана с К-митотической задержкой. К-метафазные клетки обнаруживаются в ходе эксперимента, но их число не меняется и остается на уровне 1%. Этим действием цитохалазин В отличается от действия таких К-митотическях агентов, как колхицин, колцемид, 2-меркаптоэтанол и др. ( Mazia et ai.,1960; stubblefield.Brlnkley,1967i Keryer et al.,1984 ). Далее наш показано, что в присутствии цитохалазина В переход клеток в многополюсную метафазу, также как н в биполярную, осуществляется через прометафазу без какого-либо блока в ранних фазах митоза.

Таким образом, цитохалазин В. нарушая циготомию, приводит к тому, что первым этапом является формирование полиплоидных дву-ядерных клеток, которые в дальнейшем начинают делится многополюо-ным митозом (рис.3). Вследствие этого число ядер в клетках нарастает.

Снятие воздействия ведет к восстановлению 'цитотомии, но су-

< «о

а

12ч Ic 2о Эо 40 5с 6с То

О 1ч 1с 2о Эо 40 5с 6с ?с 10 б

. J

Рис.3. Изменение относительного содержания миогополюсннх митозов в культуре клеток китайского хомячка (линия 237) при действии цитохалазша В и после его удаления из среды культивирования: а - метафазы-анафазы (©), б - телофазы с цитотомией (а) и без цитотомии (*г). Светлые значки -контроль. По оси абсцисс - время.сут, по оси ординат -доля митотических клеток, % (на 200 митозов). Остальные обозначения те же, что на рис.2.

шественно не снижает высокий уровень гяюгополюсных митозов (рис. 3). В результате этого происходит возврат к одноядерному состоянию у одной части многоддерных клеток и возрастание числа ядер у другой части многоядерных клеток.

Центриолярный комплекс в многоядерных клетках индуцированных цктохалазином В в культуре клеток китайского хомячка Исследование многоядерных клеток, индуцированных в культуре клеток китайского хомячка, показало, что в них присутствуют многочисленные центриоли, образующие единый центр. Следовательно, при действии цитохалазина В происходит не только синтез ДНК (O'Neill, 1978), но и репродукция центриолей. Подтверждением этого являются наблюдаемые в отдельных интерфазных многоядерных клетках центриоли с процентриолями и диплосош. Об этом же говорит и то, что в митотических клетках (метафазных, телофазных и таких, в которых ядра асинхронно проходят начальные фазы митоза) можно видеть в полюсах веретена дшлосомы или парные центриоли. Но такая картина характерна лишь для митозов, протекающих в присутствии цитохалазша В. После снятия воздействия кроме парных центриолей в полюсах обнаруживаются и одиночные центриоли. В целом это' означает, что при действии цитохалазина В с каждым раундом репродукции ДНК происходит удвоение числа центриолей в клетке. В результате чего в таких полиплоидных клетках поддерживается корреляция между числом центри-

олей и плондностью. После же окончания длительного воздействия возможно нарушение цикла репродукции отдельных центриолей и, соответственно, нарушение корреляции между числом центриолей и плоидностью.

Для проверки того, каково действительное соотношение между площностыо и числом центриолей, в полиплоидных клетках, образующихся в результате воздействия цитохалазином В, мы подсчитывали на стадии метафазы число кинетохоров и число центриолей. Проверка этого метода на диплоидных метзфазах показала правомочность его использования,в 12 клетках насчитывалось 36 кинетохоров (4 п). Пло-идность метафазянх клеток в процессе длительного воздействия цитохалазином В составляла, как правило, 8п и в них насчитывалось 8 центриолей (таблица I). Это подтверждает, что с каждым раундом син-

Таблица I

Содержание кинетохоров (хромосомных наборов -п) и центриолей в кетафазных клетках при действии цитохалазином I

й Тш метафазной пластинки Общее число Число кинетохо- Число цен-

клетки кинетохоров центриолей ров, ориентированных к полюсу триолей в полюсе

I трехполюсная 63 (7п) 8 21 20 22 2 2 4

2 трехполюсная 64 (7п) 8 16 23 25 2 2 4

3 трехполосная 70 (8п) 8 30 12 28 2 2 4

4 четырех-полюсная 64 (7а) 8 9 13 25 28 2 2 2 2

5 псевдобипо- ' лярнаяя 74 (8п) 8 16 22 36 2 2 4

в биполярная 68 (8п) 8 34 34 4 4

7 биполярная 71 (8п) 8 36 35 4 4

к Псевдобиполярным назван митоз с единой метафазной пластинкой и несколькими полюсами, расположенными по обе стороны этой пластин-

ки.

теза ДНК происходит удвоение числа центриолей в клетке. Отсутствие же цитотомии в митозе, вызванное действием цитохолазша В, приводило к параллельному нарастанию в клетке числа хромосомных набо-

ров и центриолей.

Таким образом, если события хромосомного и центриолярного циклов, связанных с репродукцией этих компонентов, протекают в клетке сопряженно, а нарушается лишь течение митоза, увеличение плоидности клеток сопровождается пропорциональным увеличением числа центриолей в них.

В противоположность этому в полиплоидных многояцерннх клетках. возникших после снятия длительного воздействия цитохалазином В соотношение между числом центриолей и плоидноотью значительно нарушено (табл.2). К образованию таких клеток ведует следующие причины.

Таблица 2

Содержание кинетохоров (хромосомных наборов-п ) и центриолей

в метафазных клетках после снятия воздействия цитохалазином В

& Тип метафазной Общее число Число кинетохо- Число цен-

клетки пластинки кинетохоров центриолей ров, ориентированных к полюсу триолей в полюсе

8 четырех-полюсная 102 (11п) 14 24 27 17 34 24 2 4 4 4 2

9 шести-полюсная 203 (23п) 14 30 41 51 24 33' ' 11 1 5 12 2

10 шести-полюсная 224 (25п) 16 30 35 • 33 43 72 10 2 2 2 I I 8

II восьми-полюсная 210 (23п) 22 41 86 55 14 6 7 10 41 2 2 0 1 5 2 I 3

12 псевдобиполярная 59 (Вп) 6 28 .31 2 4'

13 псевдобиполярная 143 (16 а) 4 74 .72 2 2

14 биполярная 56 (6п) 8 28 28 4 4

15 биполярная 76 (8п) 8 37 39 2 6

При действии цитохалазина в процессе многополюсного митоза к полюсам Отходит анеуплоидное число хромосом и не коррелирующее с этими значениями число ценгриолей (табл.1). Цитохалазин В нарушает цитотомию и поэтов, несмотря на анеуплоидное число хромосом в ядрах, в клетке поддерживается суммарно эуплоидное число хромосом, умножающееся после каждого раунда митотического цикла. Число цен-триолей в таких клетках, как уже упоминалось, соответствует общему числу хромосомных наборов. При восстановлении цитотомии после снятия воздействия образуются дочернин клетки о анеуплоидными ядрами и самым разнообразным числом центриолей, которое может значительно превышать содержание хромосомных наборов или быть меньше этих значений. При анализе таких клеток на стадии метафазы обнаружено,что число центриолей может быть нечетным (табл.2). Это указывает на то, что часть центриолей к митозу могло недореплицироваться или вместо одной дочерней центриоли на материнской было образовано две и более-. Две дочерних центриоли около одной материнской было обна-руяно наш в одной из кетафазннх клеток. Присутствие в полюсах не только парных, но и одиночных центриолей еще раз указывает на возможность недорепликации дочерних центриолей, либо говорит о том, что в таких клетках дочерние центриоли, созревая, ■ отделяются от материнской центриоли и отходят от.нее на значительное расстояние, образуя собственный полюс митотического аппарата. Таким образом, в клетках с нарушенным соотношением между числом центриолей и хромосомных наборов у части центриолей, по-видимому, происходит нарушение цикла репродукции центриолей и их функционального созревания. На это же указывает и варьирование длины центриолей, наблюдаемое как в интерфазных, так и в митотических клетках после снятия воздействия.

Далее при исследовании ультраотруктуры митотических клеток нами обнаружено, что как в биполярных, гак и в многополюсных митотических веретенах при действии цитохалазина В нарушается структура митотического аппарата. Так, в веретене отсутствуют аотраль-ные микротрубочки. В полюсах наряду о диплосомами выявляются парные центриоли, каждая из которых окружена гало. Появление гало вокруг дочерней центриоли свидетельствует о ее функциональном созревании. Как правило, созревание дочерней центриоли связано о задержкой клеток на одной из стадий клеточного цикла ( Masia et al., 1960). Но при действии цитохалазина В появлению многополю-сных митозов не предшествует К-митотический блок или удлинение начальных фаз митоза. . .

При снятии воздействия астральные млкротрубочки восстанавливаются. Но гало приобретает гигантские размеры и становится общим для центриолей каждого из полюсов. По-видимому, в клетках, образовавшихся после прекращения воздействия цитохалазином В, происходит десинхронизация хромосомного и центросомного циклов, причем, именно в той фазе клеточного цикла, в которой осуществляется рост центросомы, то есть в начальных фазах митоза.

Далее, в настоящей работе показано, что цитохалазин В приводит к появлению клеток, в которых разобщается структурная диффереи-цировка и функциональное созревание кинетохоров. На это указывает то, что в процессе воздействия цитохалазином В можно видеть наряду с однослойтми изогнутыми, трехслойные плоские кшетохоры, после снятия воздействия как плоские, так и изогнутые кинетохоры оказываются однослойными и напоминают по строению прометафазные кшетохоры. Такое нарушение в строении кинетохоров в метафазных клетках свидетельствует о нарушении их дифференцнровки (Щ.ейег,1982), Присутствие же кинетохорных микротрубочек во всех изученных клетках говорит о функциональной зрелости таких низкодифференцирован-ных кинетохоров.

Таким образом, цитохалазин В вызывает в митотпческом аппарате метафазных клеток аномалии в составе образующих веретено глжро-трубочек, в организации полюсов и кинетохоров. По-видиюму. эти аномалии являются результатом разобщения хромосомного цикла и циклов ряда центров организации микротрубочек (центриолей, центросом. кинетохоров).

Многоядерные клетки, возникающие при слиянии одноядерных клеток. В работе использовали поликарионы, в которых мозшо было провести маркировку .ядер (а значит и хромосомных наборов), происходящих из разных клеток. Перед слиянием клетки, находившиеся в рпзных^азах клеточного цикла метила с помощью двойного мечения и . С-гимидином. Для слияния был использован метод, включающий обработки клеток диметилсульфоксидом и полиэтиленгликолем (Имей,1984). Обнаружено, что слияние начинается сразу после воздействия полиэтиленгликолем и завершается в течение первого часа. При слиянии в составе гомокариона.могут оказаться го-мофазные или гетерофазные ядра. Обнаружены следующие комбинации ядер в составе гетерофазных гомокарионоз: 3/й2

0^3/62« В настоящей работе исследовали митотическую активность только гетерофазных гомокарионов, содержащих не более 50 ядер.

При слиянии гетерофазных клеток в составе поликариона оказываются гетерофазные яяра и гетерофазные центриоли. Нагл было проверено электронномикроскопическое исследование именно таких поли-карионов. Оказалось, что в поликарионах центриоли могут располагаться по-разному: I - единым клеточным центром, подобно тому, что наблюдается в полиплоидных клетках, образующихся путем нарушения цитотомии (гепатоциты, незрелые мегакариоциты, индуцированные цито-халазином В ыногоядерные клетки); 2 - группами около отделышх ядер, как это обнаруживается в молодых мышечных трубках ( Тазз1п et а1.,1985). Но независимо от характера локализации, центриоли способны к репродукции, а сами поликарионы к вступлению в митоз. При этом методе, который был использован нами для получения поли-карионов (обработка ДлЗСО и ПЗГ) гетерофазные ядра асинхронно проходят фазы митоза вплоть до метафазы, последовательность вступления в митоз поликарионов зависит от числа ядер в поликарионе и от комбинации гетерофазных ядер. Поликарионы с числом ядер не более 4 вступают в митоз через время, равное 3/4 периода генерации, более крупные поликарионы - через время, равное периоду генерации и более. В мятотпческих поликарионах наблюдается как синхронное, так и асинхронное прохождение ядрами разного происхождения начальных фаз митоза. Среди поликарионов с разными комбинациями ядер в митозе первыми оказываются гомокарионн, затем о^э и а^/я/а^

(рис.4). При асинхронной митотической активности ядер в первой категории поликарионов в митоз сначала вступают ядра , в остальных - ядра (рис.5). Все поликарионы вступают в метафазу не ранее, чем через II часов (рис.б). Этот срок для культуры китайско-

« К 1« !« М

Рис.4. Относительное содержание гетерофазных. гомокарионор содержащих пооФазные ядра (гибриды: I - 01/3 ; 2 -01/и2; . 3 - в1/Ь/52 ). По оси абсцисс - время, часы; по осп ординат - доля профазных гомокариоиоз, %

Рис.5

Относительное содержание ядер разного происхождения в профазных гомокарионах.

по оси абсцисс - время, часы; по оси ординат - доля ядер, %.

Белые столбики - ядра 61; о точками - ядра в ; заштрихованные ядра ог ; черные - ядра в профазе

о,/»/ог

Рис ,6

Относительное содержание гетерофазных гибридов в метафазе:

1 - Q1/S

2 - 01/02

3 _ 01/S/G2

По оси абсцисс - время, часы; по оси ординат -доля метафазных клеток,

го хомячка чуть меньше продолжительности периода генерации (12 часов - Еголина и др.,1972). За столь продолжительное время происходит, во-первых, репродукция всех центриолей и поэтому в полюсах митотического аппарата обнаруживаются парные центриоли; во-вторых, часть дочерних центриолей созревает, и, наряду с материнскими центриолями, они оказываются окруженными гало и принимают участие в организации полюсов веретена деления. По Данным Гоша и Павелеца

( Ghosh,Paweletz ,1984), в гетерофазных гомокарионах, полученных путем слияния с помощью ПЭГ и ДМСО, синтез ДНК происходит в ядрах, находившихся в момент слияния как в 3 -периоде, так и в G^-периоде. Таким образом, гетерофазные гомокарионы, вступая в митоз, имеют удвоенное содержание ДНК в ядрах и редуплицированные центриоли. В результате этого в гетерофазных гомокарионах налюда-ется соответствие между общей плошхностью по лик ар и он п и общим числом центриолей как сразу после образования поликариона. так и при его вступлении в митоз.

Электронномикроскопический анализ показал, что при вступлении гетерофазных гомокарионов в митоз в них формируется веретено, состоящее из всех типов микротрубочек: астральных, межполюсиых и кинетохорных. Такое веретено имеет сложную многополюсную организацию. Межполюсные микротрубочки связывают полюса, меццу которыми располагаются метафазные хромосомы, но не всегда эти полюса являются ближайшими относительно друг друга,.Если между соседними парами центриолей нет хромосом, то между ними никогда не обнаруживается микротрубочки. Кроме того, пучки кинетохорных микротрубочек не всегда направлены к ближайшим центриолям.

В митотических клетках также наблюдаются промежуточные фила-менты» Они видны по периферии клетки, вблизи полюсов и хромосом. Промежуточные филаменты могут отделять одну, хромосомную группу от другой. Следует отметить, что локализация промежуточных филаментов на электронном уровне подробно не изучалась.

Необходимо подчеркнуть, что в гетерофазных гомокарионах все центриоли локализуются в полюсах митотического аппарата. Кроме того, радиоавтографический анализ показал, что хромосомы, происходящие из разных ядер, сохраняют обособленное положение в составе общей метафазной пластинки и это не зависит от того, является ли митоз биполярным или многополюсным. Отсюда следует, что распределение хромосом по дочерним ядрам в процессе деления гетерофазного го-мокариона носит эуплононый характер и в соответствии с хромосомными наборами распределяются центриоли. В результате митоза образуются дочернин клетки, плотшость которых различна, но кратна диплоидному набору хромосом. Варьирование числа хромосомных наборов в дочерних клетках связано с тем, что большинство гетерофазных гомокарионов (94$) делится многополюсным митозом, в котором число борозд npit цитотомии может быть различным. Тек как в соответствии с распределением хромосомных наборов происходит распределение центри-

олей, но это число коррелирует с илоианостью клетки.

Итак, исследование многояцепиих клеток, возникающих различными путями, показало, что в одних из этих клеток умножение числа хромосомных наборов сопровождается пропорциональными увеличением числа центриолей (многоядернне клетки при действии цитохалазина В, гомокарионы), в других многоядерных клетках соотношение между пло-ндностью и числом центриолей оказываются нарушенным (многоядерные клетки после снятия воздействия цитохалазином В). Такое разнообразие оказывается связанным, глазным образом, не с нарушением репродукции центриолей в s-периоде, а с характером распределения хромосом и центриолей в процессе многополюсного митоза и с тем, завершается ли такой млтоз цитотомией. Оказалось, что митоз при делении гетерофазных гомокарионоз не сопровождается существенными нарушениями в распределении хромосом и центриолей между дочерними клетками. Но млтоз, протекающий в индуцированных цитохалазином В полиплоидных клетках, характеризуется глубоки!® аномалиями - в нем происходит анеуплощшое распределение хромосом по дочерним ядрам и клеткам и независящее от числа хромосом распределение центриолей. Наблюдаемые различия в характере распределения хромосом и центриолей в различных по механизму возникновения многоядерных клетках поставили вопрос о том, как различается состояние того элемента цитоскелета, который объединяет в единый комплекс хромосомы и цен-триоли в интерфазе ( Bornens, Maro, 1982 i Pais et al.,1984 ) ив митозе (Bloss, Chako,1976; Pranke et al.,1978; Cells et al.,1983), а именно промежуточных филаментов.

Организация промежуточных филаментов в многоядерных клетках.

в интерфазе и митозе. Существующие в литературе данные показывают, что в интерфазных многоядерных клетках, как возникающих при слиянии, так и индуцированных цитохалазином В, присутствует сеть промежуточных филаментов, пучки которых могут окружать ядра и распространяться на периферия клеток (Pranke et al.,1978s Яясс,1986). Данные о состоянии такой сети при вступлении поликариона в митоз полностью отсутствуют, to исследовали организацию промежуточных филаментов в штерфазных и митотических поликарионах, индуцированных цитохалазином В и образовавшихся при слиянии клеток.

Обнаружено, что в контрольной культуре клеток китайского хомячке (Aß 17) в штерфазных клетках присутствует сеть промежуточных филаментов, которая окружает ядро и в визе фибрилл распространяется на периферию клетки. В митозе эта сеть сохраняется, окружая верете-

но, и реорганизуется лишь з телофазе, подобно тому, что наблюдается в ряде других культивируемых клеток (Aubin et al.,1980; Blooe, Bushnell,1932).

При воздействии цитохалазином (5 мкг/мл) в интерфазных и ми-тотических клетках уже через I час происходит фрагментация сети виментиновых промежуточных филаментов, а через 4 суток и ее полное исчезновение. После длительного воздействия агентом (7 суток) удаление его из среды культивирования приводит через 2 суток к появлении лишь коротких пучков промежуточных филаментов, но сеть к этому времени не восстанавливается.

В поликарионах, возникающих путем слияния одноядерных клеток (культура клеток Ag 17), виментиновые промежуточные филаментн образуют сеть вокруг каждого кз дцер и эта ячеистость сохраняется при вступлении поликариона в митоз вплоть до метафазы как в биполярных, так и в многополюсных митсзах. Наиболее четко прослеживается такое распределение промежуточных филаментов в гомокарионах, ядра которых асинхронно проходят начальные фазы митоза. В анафазе сохраняется периферическая часть сети, центральная ее область исчезает и таким образом разрушается компортментализацкя сети. В тело-фазе яркое периферическое свечение отражает, по-видимому, начало реорганизации сети промежуточных филаментов, которая окончательно сформируется в дочерних клетках.

Обнаруженное наш различие в распределении промежуточных филаментов в гомокарионах п в многоядерных, клетках, индуцированных цитохалазином В, может служить одной из причин разного распределения хромосом и центриолей в многополюсник митозах, характерных для этих поликарионов. Наши данные позволяют предполагать, что при слиянии и образовании гомокариона (вероятно, также и гетеро-карпона) каждая клетка вносит свою сеть промежуточных филаментов, окружающую ядро и центрполи. Именно благодаря этой сети сохраняется обособленность хромосом и центриолей. происходящих из разных клеток, несмотря на то. что происходит формирование единого сложного веретена. Проведенные наш ультраструктурные исследования показывают, что пучки промежуточных филаментов обнаруживаются в составе штотического веретена и разделяют друг от друга отдельные Полюса и группы хромосом. Это также свидетельствует о возможной роли промежуточных филаментов в качестве структурного компонента, изолирующего ядерно-центриолярнне комплексы разного происхождения друг от друга. Этим поддерживается эуплоидное' распределение хромо-

сом в митозе и сохранение корреляции между числом хромосомных наборов и центриолей.

Нарушение сети промежуточных филаментов в многоядерных клетках. индуцированных цитохалазином В; приводит, по-видимому, к тому. что в таких поликарионах нет структурного объединения отдельных . ядер и их центриолей в обособленные комплексы. Поэтому и происходит в процессе митоза случайное распределение хромосом и центриолей. Отсутствие ядерно-центриолярных комплексов после снятия воздействия ведет, по-видимому, к сохранению тех же аномалий в распределении хромосом и центриолей, что и при действии цитохалази-на В. Можно высказать предположение, что наблюдаемые у разных объектов и при различных воздействиях различия в распределении хромосом и центриолей во время митоза связаны с варьированием целостности' сети промежуточных филаментов.

Центриолярный комплекс в гибридах соматических клеток. Проведено исследование одной из линий гибридных клеток, образованных в результате слияния культивируемых клеток китайского хомячка и мыши. Эти одноядерные гибридные клетки являются полиплоидными и включают хромосомные наборы китайского хомячка и мыши в соотношении 3:1. Такие клетки должны были исходно содержать центриоли,полученные от 3-х клеток хомячка и 1-ой клетки мыши, т.е. 8 центриолей. В клетках, явившихся объектом данного исследования, обнаружено от 4 до 12 центриолей с модальным числом, равным 8 центри-олям. Соответствие между модальными числами хромосомных наборов и центриолей (в интерфазных клетках) указывает на то, что длинном ряду клеточных поколений может сохраняться корреляция между числом хромосомных наборов и центриолей. которая существовала как в исходных родительских клетках, так и после слияния их друг с другом.

Но в строении центриолярного комплекса наблюдаются аномалии как в интерфазных, так и в митотическвх клетках. В интерфазных клетках одновременно могут существовать одиночные центриоли, соответствующие по строению -периоду, и диплосомы - признак центриолей йг -периода. В митозе в полюсах обнаруживались наряду с дип-лосомами парные и одиночные центриоли. Это указывает на существование асинхронности циклов воспроизведения и созревания центриолей, связанное, вероятно, с тем, что в ходе образования гибридных клеток линии 91 происходило слияние клеток разной видовой специфич- ' ности п гетерофазных по своему положению в клеточном цикле.

Важной особенностью центриолярного комплекса данных гибрид-.

р-,

.4

ных клеток является сохранение в нем черт, свойственным центри-олярным комплексам родительских клеток. Так, в гибридах'отмечены сателлиты, реснички, придатки, характерные для центриолей мыши, а также вирусоподобные частицы (ВПЧ), свойственные клеткам культуры китайского хомячка. Следовательно, в целом в гибридной клетке существует смешанный набор центриолей.

Присутствие смешанных наборов характерно для комплекса, в который входит большое число центриолей. В гибридных клетках, содержащих две отдельные центриоли или две диплосомы, обнаруживаются лишь признаки, свойственные центриолям мыши. Делятся такие клетки обычным биполярным митозом.

Линия 91 (3 набора хомячка и I набор мыши) оказалась одной из наиболее стабильных и сохранила большое число хромосом мыши. Но и в этой линии по данным кариологического анализа в некоторых клетках произошла значительная утрата хромосом мыши (Какпакова и др.,1974). Можно ожидать, что при электронномикрескопическим исследовании центриоли мыши будут обнаруживаться достаточно редко, особенно в клетках, в которых общее число центриолей не велико. Однако полученные данные говорят о противоположном - в изучаемых гибридах отмечена преимущественная потеря признаков центриолей клеток китайского хомячка.

В условиях культивирования клеток на селективной среде мно-гополюсность может приводить к возникновению гетерогенных клеток. В этих клетках оказываются не только разные хромосомные наборы, но и разные центриолярные наборы, и таким образом, многополюсность может служить причиной элиминации как хромосомных наборов, так и центриолей.

4. Центриолярный комплекс при снижении плоидности в результате многополюсник митозов, индуцированных в популяции диплоидных клеток

При изучении роли диплоидного многополюсного митоза в изменении плоидности и числа центриолей в клетке-мы использовали 2-меркаптоэтанол в качестве воздействия, индуцирующего К-митоз и многополюсный митоз (Маг1а еЪ а1.,19бо). Объектам исследования служили культура клеток СПЭВ и культура клеток -17.

После 20-часового воздействия 2-меркаптоэтанолом (0,001 М) в культуре клеток СПЗВ число многоголосных митозов достигает максимальных значений через 5 часов после снятия воздействия и становясь в 6 раз больше контрольных значений. В это врет соотногзе-

ние между число многополюсных митозов в опыте и контроле в среднем в 3 раза больше, чем соотношение между числом биполярных митозов. Это показывает, что меркаптоэганол вызвал не только накопление тех и других форм метафаз, но и индукцию многополюсннх митозов.

При увеличении длительности воздействия агентом до 36 часов количество многополюсных митозов после отмывания увеличилось, превышая к 5 часам; уровень контроля в 13,5 раз, хотя соошошение между биполярными митозами в опите и контроле в это время то же, что и в предыдущем эксперименте.

На культуре клеток СПЭВ мы исследовали динамику митотическо-го цикла при действии на клетки 0,001 Ы 2-меркаптоэтанола. Оказалось, что через 20 часов после начала воздействия митотический индекс увеличивается в 3,5 раза по сравнению с контролем. Это связано с задержкой клеток в форме К-метафазы. Исследование абсолютного Содержания различных фаз митоза (рис.7) и процентного соотношения между ними позволило обнаружить, что переход клеток в К-метафазу происходит через стадию биполярной метафазы.

Для того, чтобы определить, существует ли удлинение каких-либо стадий интерфазы при действии 2-меркаптоэтанола, мы исследовали динамику прохождения митотического цикла для клеток, находящихся в момент введения агента в , Б и С2-периодах. При идентификации этий клеток перед введением агента проводили двойное мече-ние клеток п- и . С-тимидином. Оказалось, что при воздействии на асинхронные клетки культуры СПЭВ клетки всех периодов способны проходить интерфазу, вступать в митоз и из метафазы переходить в К-метафазу. Основная масса клеток не задерживается в отдельных периодах интерфазы, но среди клеток,, находящихся при введении агента в О -из -периодах сть небольшая доля клеток, длительно задерживающиеся в интерфазе. В том и другом случае, по-видимому, это клетки начала периодов.

Далее следует отметить, что устойчивое блокирование клеток возникает не сразу, а через.8-Ю часов после начала воздействия. В эти сроки в митоз успевают вступить лишь клетки б - и о2-перио-дов и именно поэтому для них обнаружена так называемая фаза неустойчивого блока, клетки же -периода вступают в митоз позднее, ужо тогда, когда для всей культуры наступает фаза устойчивого блока в К-метафазе. По-видимому, существование устойчивого и неустойчивого блокирования' клеток в К-метафазе определяется не тем, в каком периоде интер^озы клетки испытали воздействие, а поодопжитель-

а

к,

6 ж

к i i л « » I ю и 14 № 1» к ^ 1 1 ) » 1 » ' i i » i!

'Рис.7. Изменение абсолютного содержания клеток разных стадий митоза в культуре С11ЭВ в течение 20 часов обработки 2-неркаптоэтанолом (0.001 М) и после снятия воздействия. По оси абсцисс - время, ч. По оси ординат -а) доля профаз, %; б) доля нормальных метафаз (светлые точки) и К-метафаз (черные точки), %; в) доля анафаз (светлые точки) и телофаз (черные точки), %. Стрелкой обозначен момент удаления 2-меркаптоэтанола из среды култивирования. К - контроль. Вертикальные линии -- доверительные интервалы

ностью самого воздействия в данной концентрации. Увеличение концентрации, вероятно, может сокращать продолжительность фазы неустойчивого блока.

Для клеток разных периодов оказалась различной скорость выхода из К-митотияеского состояния. Клетки, находившиеся в момент введения агента в -периоде, выходят из блока позднее, чем клетки з- и вд-периодов. До сих пор совершенно неясно, репарация каких процессов требует столь длительной задержки.

Далее показано, что многополюсные митозы индуцируются примерно с одинаковой вероятностью во всех категориях клеток, находившихся в интерфазе ( оч, о? ) в процессе обработки 2-меркап-тоэтанолом. Эта индукция в большой степени вызвана блокированием в К-метафазе (профаза нормальная метафаза К-митоз). но продолжительность блокирования для разных категорий клеток различна.

Структурные перестройки митотического веретена при переходе метафаза—"К-метафаза —»-метафаза

Мы исследовали детально на свето- и электронномикроскопичес-ком уровнях строение метафазных клеток в процессе перехода из ме-тафазы в К-метафазу. Оказалось, что этот переход в разных клетках происходит по-разному. В одних клетках сначала нарушается строение митотического веретена, в котором в первую очередь исчезают межполюсные и астральные микротрубочки, затем уменьшается количество и протяженность кшетохорных микротрубочек. Хромосомы при этом утрачивают свое строго упорядоченное расположение в составе пластинки. Характер расположения сестринских кинетохоров значительно варьирует от клетки к клетке. В одних клетках их расположение то же,что и в нормальных метафазах, т.е. сестринские кшетохоры расположены на .противоположных сторонах хромосомы. В других у отдельных хромосом кинетохоры могут располагаться рядом на одной стороне хромосомы, либо под некоторым углом относительно друг друга. В этих биполярных метафазах с дефектным веретеном центриоли в виде диплосом остаются на противоположных сторонах по отношению к пластинке, кинетохорные же микротрубочки даже в тех клетках, в которых они очень короткие, остаются направленными к центриолям, и это не зависит от того, отходят ли они от кинетохоров перпендикулярно или по касательной.

Переход в других клетках в К-митотическое состояние сопровождается в первую очередь разрушением метафазной пластинки, веретено же продолжает включать все типы микротрубочек обычной протяженности. В полюсах сохраняется диплосомная ориентация центриолей, кшетохоры имеют характерные для нормы размеры, и микротрубочки от них отхода под прямым углом.

Сформированные К-метафазные клетки отличаются: I - полным отсутствием экваториальной пластинки; 2 - полным отсутствием веретена, хотя очень короткие кинетохорные микротрубочки, отходящие от удлиненных кинетохоров, могут сохраняться; 3 - нарушением дип-лосомной организации центриолей. Центриоли могут располагаться две рядом и две отдельно, либо составлять общую группу. Фибриллярное гало не обнаруживается в связи с центриолями.

Снятие К-митотического воздействия приводит к восстановлению метафазной пластинки и митотического аппарата. Восстановление митотического аппарата, так же как и его разрушение, происходит поэтапно. Но этапы восстановления несколько отличаются от этапов

- аэ - .

разрушения. Светомикроскопическое изучение показало,- что сначала в К-метафазных клетках восстанавливается веретено, затем метафаз-ная пластинка. Исследования ультраструктуры продемонстрировали, что на первом этапе в части К-метафаз могут восстанавливаться дгах-лосомы. Частично восстановленное веретено состоит только из кине-тохорных микротрубочек разной протяженности, но всегда направленных к. центриолям. Кинетохоры остается увеличенными и микротрубочки к ним расположены по касательной.

Второй этап включает восстановление метафазной пластинки. На этом этапе веретено состоит только из кинетохорных микротрубочек. Таким образом, выстраивание хромосом в пластинку (независимо от того, в биполярную или многополюсную) происходит без межполюсных микротрубочек, при наличии очень коротких кинетохорных микротрубочек. Ориентация кинетохоров так же не ваша для формирования метафазной пластинки. Дальнейшее восстановление митотического аппарата в разных метафазных клетках происходит по-разному - в одних сначала восстанавливается строение и ориентация кинетохоров, а уж затем появляются мевдолюсные и астральны« микротрубочкп, в других полное восстановление всех типов микротрубочек предшествует нормализации в отроении кинетохоров (рис.8).

Рис.8. Схема этапов перестройки структуры митотического аппарата метафазных клеток СГОВ при действии 2-меркаптоэта-нола и после его удаления из среды культивирования. Ц - центриоль, ХР - хромосомы, КТ - микротрубочки, К - кинетохор, Ki.iT - кинетохорные микротрубочки, ®Г - фибриллярное гало

Структура полюсов многополюсннх митозов, индуцированных 2-иеркапгоэгонолом. Проведенные исследования показали, что К-мито-тическая задержка приводит к блокированию или удлинению хромосомного цикла. Это выражается в длительном конденсированном состоянии хромосом.. В то же время цен трио ллярный цикл продолжается. Проявлением этого является разъединение центриолей, отхождение их друг от друга, образование вокруг дочерней центриоли фибриллярного гало. Образование многополюсных митозов с одиночными цен триолями в полюсах бесспорно можно прежде всего связывать с продолжительным К-ми-тотическим блоком.. Действительно, в культуре клеток СПЭВ все многополюсные митозы, индуцированные 2-меркаптоэтенолом, имели веретена с центриолярными полюсами. Однако в культуре клеток Ag 17 при индукции многополюсности 2-меркаптоэтанолом (0,01 М, 18 часов воздействия, 7 часов отмыва) наряду с центриолярными нами обнаружены бесцентриолярные полюса. Центром организации дополнительных полюсов б таких веретенах служит фибриллярный материал, соответствующий гало, которое окружает в биполярном митозе материнскую цен-триоль. В культуре клеток Ag 17 в многополюсных митозах только часть полюсов были бесцентриолярными. Так, в трехполюсных метафа-зах бесцентриолярными могут быть один или два полюса. Следует отметить, что даже в полюсах, содержащих центриоли, может наблюдаться нарушение ассоциации центриолей и фибриллярного материала - центриоли локализуются в полюсе, но не в связи с гало, которое несмотря на это остается фокусом схождения микротрубочек веретена. Такие наблюдения прямо указывают на то, что возникновение бесцентриоляр-ных полюсов может быть результатом разъединения фибриллярного материала и диплосом.

О причинах этого явления в настоящее время данные отсутствуют. Механизм возникновения многополасных митозов с бесцентриолярными полюсами также остается неясным. Данные литераиуры и наши наблюдения указывают на то, что появлению таких митозов предшествует К-мптотический блок. Другая причина формирования бесцентриолярных полюсов может заключаться в образовании избыточного количества фибриллярного материала. Пока нет данных о времени репродукции фибриллярного гало, но его агрегация на материнской центриоли диплосомы происходит в с2 -периоде, затем в профазе и прометафазе возрастает объем гало ( ЛоЪЫпс et а1.,19бЭ; УогоЪ^еу, СЬе1гЬаот,1982). Можно предположить, что удлиненна именно этих фаз и приводит к появлению избыточного количества фибриллярного материала.

Распределение хромосом й центриолей при многоп-олюсннх митозах. При исследовании характера распределения хромосом в процессе многополюсного митоза, индуцированного в культуре клеток Agi? воздействием 2-меркаптоэтанолом, бил использован метод реконструкции по сериям ультратонких срезов многополюсных метафаз-ных пластинок. Показано, что в диплоидных клетках многополгасные митозы могут завершаться эуплоидным (по числу хромосом) распределением хромосом в том случае, если форма метафазной пластинки является V -образной. В случае образования трех дочерних ядер после такого митоза в них могло содержаться In, 2n, In число хромосом. Аналогичное распределение хромосом обнаружено после диплоидного трехполюсного митоза в культуре клеток Microtua agreotis, так как показано, что 1/3 дочерних ядер были диплоидным, 2/3 - гаплоидными по содержанию ДНК (Pera, Rainer,1973)•

При У-образной форме метефазной пластинки после индукции мно-гополюсности наблюдается анеуплоидные числа хромосом, ориентированные по направлению к полюсам и соответственно возможно образо-'вание анеуплоидных дочерних ядер. Таким образом, в трехполюсных митозах, индуцированных в популяции диплоидных клеток 2-меркаптоэтанолом в культуре клеток китайского -хомячка характер распределения хромосом различен и зависит от формы трехполюсной метафазной пластинки. Насколько эта закономерность характерна для других многополюсных митозов, возникающих при делении диплоидных клеток, пока трудно сказать.

Как уже упоминалось, эуплощшое распределение хромосом обнаружено нами также в многополюсных митозах полиплоидных многоядерных клеток. Но это характерно лишь для поликарионов, возникающих в результате слияния клеток. Если такой многополюсный митоз завершается цитотомией, то происходит снижение плоидности клетки. Следует отметить, что при этом, если поликарион содержал исходно ядра разновидового происхождения, то в одних дочерних клетках происходит объединение хромосомных наборов разного происхождения, как это обнаруживали при делении соматических гибридов быка и норки ( Тер lita et а1.,19б8), в других клетках ядра могут содержать хромосомы одновидового происхождения, и тогда можно говорить о реверсии части гибридных клеток к родительскому кариотипу. Появление рекомбинантных клеток показано при многополюсных митоза«., индуцированных винбластшом (Martin,Spraque,1970).

Как уже упоминалось, анеупловдное распределение хромосом

обнаружено нами при делении индуцированных цитохалазином В многоядерных клеток. В результате этого индуцированные цитохалазином В поликарионы содержат анеуплоидные ядра, но в присутствии цитохала-зина В цитотомия не происходит и поэтому в целом поликарион оказывается полиплоидной клеткой с 2п х 2, и т.д. числом хромосомных наборов. Восстановление цитотомии после снятия воздействия приводит к тогду, что анеуплощшыми оказываются не только отдельные ядра, но и сами дочерние клетки (как одноядерные, так и многоядерные).

Таким образом, в зависимости от характера распределения хромосом в процессе многополюсного митоза могут возникать следующие варианты клеток: I - одноядерные клетки с эуплоидным хромосомным набором (от I до нескольких п ); 2 - шогоядерные клетки с эуплоид-ными ядрами; 3 - одноядерные анеуплоидные клетки; 4 - шогоядерные клетки, суммарно эупловдные, но с анеуплоцдными отдельными ядрами; 5 - шогоядерные анеуплоидные клетки с анеуплоидными ядрами.

Распределение центриолей при многополюсном митозе может быть различным. В культурах клеток СПЭВ и китайского хомячка при индукции многополюсности 2-меркаптоэтанолом обнаружено, что распределение центриолей по полюсам может быть 2:1:1 и 2:2:0. В культуре клеток китайского хомячка распределение центриолей типа 2:1:1 выявлено при У-образных метафазах и не было обнаружено при у-образном митозе, но вероятно, это было связано о малым числом проанализированных митозов. Теоретически такое распределение центриолей для У-об-разных метафаз возможно. В этом случае число центриолей, попадающих при делении в дочерние клетки может соответствовать числу хромосомных наборов.

Таким образом, при деленш. диплоидных клеток многополюсным митозом могут образовываться гаплоидные клетки, в которых сущест- . сует корреляция между числом хромосомных наборов и центриолей характерная для диплоидных и полиплоидных клеток.

Снижение плоидности, при котором не нарушается нормальное соотношение кекду пловдностью и числом центриолей, может происходить и в процессе многополюсного митоза одноядерных и многоядерных полиплоидных клеток. Такое явление было обнаружено наш при исследовании дедющпхся гегерофазных гомокарионов, -у которых перед вступлением клеток в митоз происходит редупликация всех центриолей. То что в полюсах многополюсного веретена присутствовали только парные цен-триоли л то, что хромосомы, происходящие из разных ядер, сохраняли в пластинке обособленное расположение, позволило сделать заключение,

-s? -

что зуплоидное распределение хромосом сопровождается таким распределением центриолейг при котором сохраняется корреляция медцу плоидностью и числом центриолей. В отличие от многополюсного митоза диплоидных клеток, который может приводить к появлению гаплоидных клеток, многополюсный митоз полиплоидных клеток в том случае, если в полюсах присутствуют парные центриоли, должен снижать плокдность КЕПЬ до диплоидного состояния. По-видимому, если в многоголосном веретене полиплоидных клеток наряду с парными цен-триолями присутствуют одиночные центриоли (как это было обнаружено нами в гибридных клетках клона 91), возможно образование гаплоидных ядер и клеток.

Итак, многополюсные митозы, ведущие к такому снижению пловд-ности, при котором сохраняется не только эуплоидность хромосомного набора, но и характерное для нормальных клеток соотношение между числом хромосомных наборов и центриолей, можно рассматривать как редукционные.

•Как показгазаят данные литературы и собственные исследования, редукционные многополясные митозы - событие достаточно редкое. Чаще наблюдаются многополюсные митозы, для которых распределение центриолей не зависит от распределения хромосом: многополюенне диплоидные митозы, индуцированные 2-меркаптоэтзнолом, причем ддя случаев как эуплоидного, так и анеуплоидного распределения хромосом, полиплоидные многополюсные митозы, индуцированные цитохала-зином В. Но в присутствии цитохалазкна В. нормальное соотношение между числом хромосомных наборов и центриолей поддерживается тем, что из-за отсутствия цитотомии все хромосомы и центриоли сохраняются в составе одной и той же клетки (например, Sn -8 центриолей). Восстановление цитотомии после снятия воздействия приводит к формированию клеток, содержащих самые разнообразные количества хромосом и центриолей.

До сих пор отсутствуют систематические исследования свойств клеток, у которых нарушено соотношение между.числом хромосомных наборов и центриолей. Но единичные данные позволяют думать о том, что поведение тиккх клеток может быть отличным от нормального, Так, показано, что если в результате, многополюсного митоза, индуцированного меркаптоэтанодом, образуются бесцентриояярные дочерние клетки, то именно они в дальнейшем сливаются с сестринским ценл-рполярнымя клетками (Ходяков и др.,198Э). Не исключена и гибель клеток, образующихся в результате шогополгосяого митоза ( Marin., Bender, 1966; Sato et al.,1981 ).

- за -

Очевидным является то, что многополюснне митозы, сопровождающиеся анеуплоидным распреаелением хромосом или приводящие к появлению дочерних клеток с нарушенным соотношением между числом хромосомных наборов и центриолей, носят 'патологический характер и, вероятно, в одних случаях завершаются гибелью дочерних клеток, в других - появлением клеток со свойствами, отличными от исходного клеточного типа.

Помимо редукционного и патологического многополюсного митозов следует выделять многополюсные митозы смешанного типа. Такими являются митозы, в ходе которых происходит эуплоидное распределение хромосом, но Пропорциональное плотности число центриолей сказывается лишь в части дочерних клеток. Например, полиплоидный трехполюсный митоз завершается следующим распределением хромосом и центриолей: Зп- 2ц, 2 п - 2ц, 1п - 2ц; диплоидный трехполюсный митоз - 1п-2ц, 2 п- 1ц, 1п- 1ц. Как можно видеть, такой тип деления ведет с одной стороны к редукции плоидности, с другой - к появлению клеток с аномальными характеристиками.

5. Структура веретена в спонтанных патологических митозах

Исследованы спонтанные патологические митозы в клеточных культурах, а также в опухолевой ткани. Оказалось, что в культуре диплоидных клеток СКЭВ многополюсные митозы по структуре полюсов соответствуют тем, которые возникают в результате К-митотического блока, вызывающего преждевременное созревание дочерних центриолей и отделение их от материнских. В зависимости от тогок произошло ли значительное разъединение центриолей обеих дшлосом или одной из них, образуется трехполюсное или четырехполюсное веретено.

В гетероплоидной культуре клеток китайского хомячка (линия 237) обнаружен*' два варианта многополюсного митоза: I - митозы, которые возникают в клетках в результате образования дополнительных полюсов присутствующими в клетке многочисленными липлосомамп; 2 - митозы, которые возникают в результате преждевременного созревания дочерних центриолей. Преждевременное созревание дочерних центриолей и участие, их в организации собственных полюсов наблюдается в клетках а числом центриолей, характерным как для диплоидных, так и для. полиплоидных клеток.

Следует отметить, что в спонтанно образованных многою лвс-ных митозах, наблюдаемых нами в исследованных культурах, не обне-рукень- бесцентриолярные полюса. Это может указывать на то, что пптгл:ннои возникновение событий, ияпуцируяяа тгкос явление, про-

■ исходит достаточно редко. Необходимые для преждевременного созревания цен триолей К-метафазы отмечаются в культуре клеток СПЭВ в единичных случаях, в культуре же клеток китайского хомячка они составляют 14$ от всех митозов.

Интересно, что по структуре всех остальных компонентов мито-тического аппарата - составу микротрубочек, организации кинетохо-ров - спонтанные многополюсные митозы в обеих культурах не отлетаются от нормальных двухполюсных митозов.

Все типы митозов (двуполгаскце, многополюсные иК-митозц), обнаруженные нами в опухолевой ткани (гистиоцитома человека), оказались чрезвычайно разнообразными по числу центриолей. В них наблюдается от 4 и до 13 центриолей. Далее, как двухполюсный, так и многополюсные митозы опухолевой ткани имеют различные нарушения в структуре митотического аппарата. К токда нарушениям относятся: I - дефекты в составе микротрубочек: отсутствие в части метафаз астральных и меяполюсных кикротрубочек; 2 - преждевременное созре-воние дочерних центриолей: часть полюсов или все полюса организованы одиночными центриолями, окруженными гало; 3 - неактивность отдельных центросом - часть центриолей, окруаейных гало, не участвуют в организации кикротрубочек; 4 - разъединение центриолей и гало - все полюса не содержат центриолей или часть центриолей, находящихся в клетке, не ассоциированы с фибриллярным гало; 5 - присутствие в клетке нечетного числа центриолей; 6 - значительная -вариабельность размеров центриолей.

Проведенные нами исследования и данные литературы говорят о том, что такие многочисленные нарушения различных компонентов мл-тотпческого аппарата предполагают реализацию комплекса различных механизмов - источников клеточной патологии. В зависимости от того какие механизмы комбинируются при возникновении тоге, или пяо^ го митоза, можно ожидать большего или меньшего отклонешм от нер-иг. Taj;, для одних митозов характерно наличие многочисленных лил-лосом, что, по-видимому, указывает на полип логсшость этой клетки. По характеру организации митотического аппарата ш не можем сказлт;. о г.еханязме иоттаоиаигацкн донной клетки, но, вероятно, проведение параллельно анализа состояния промежуточных $ияа«ентов могло бы с большей пг.я меньшей достоверностью покйз^.ть, произошла га такая кяехке в результате нарушена! цлтотогчл «ли в резульгот«, слияния одноядерных клеток. Существование т; того и другого источника золипяоцдизгции клеток в опухолях известно (КаудрлДМ'З;

- 40 -

Бродский,Урьтаева,1981; Казанцева,1981).

Далее, появление одиночных центриолей в полюсах мигокнеско-го аппарата, бесспорно говорит о том, что такие клетки прошли К-ме-тафазный блок. Действительно К-метафазные клетки характерны для опухолевой ткани (Каудри,1958; Казанцева,1981). Кроме того, нами обнаружено, что во всех К-метафазных клетка гистоцитомы отсутствует диплосомная организация центриолей и что среди биполярных и многополюсных митозов выявляются клетки, у которых веретено представлено лишь кинетохорными микротрубочками. На клетках культуры СГОВ показано, что именно такой тип организации мктотического аппарата является одним из этапов перехода метафаза К-метафаза ме-тафаза.

Таким образом, источником появления избыточных полюсов в митозе опухолевых клеток (независимо от организации метафазной пластинки) может являться, во-первых, полиплощшзация клеток к в связи с этил умножение -числа центриолей, во-вторых, преждевременное созревание дочерних центриолей в результате К-митотпческой задержки. Третьим источником является полное или частичное разьединение двух компонентов - центриолей и фибриллярного гало. Бесцентриолярная центросома успешно служит ЦОМТ веретена.

Разъединение центриолей и фибриллярного материала ведет к тому, что центриоли, не ассоциированные с полюсами, оказываются случайным образом разброоанными по цитоплазме и, соответственно, они должны случайно распределяться между дочерними клетками. Это должно вести к нарушению корреляции между числом хромосомных наборов и центриолей, причем не только при многоголюсном, но и при двухполюсном митозе.

Аналогичный результат по созданию дисбаланса между числом центриолей и хромосом в клетке дает и неакгивиость отдельных центриолей к диплосом, несмотря на то, что они сохраняют ассоциацию с фибриллярным материалом. Причины функциональной гетерогенности отдельных центросом, присутствующих в одной и той же клетке, до сих пор остаются не изученными.

Существование в клетке нечетного числа центриолей и варьирование их размеров говорит уже о нарушении той части центрполярного цикла, которая касается репродукции центриолей. По-вщимому, в клетках гистоцитомы у разных центриолей могут быть нарушенными, во-первых, инициация редупликации (нечетное число центриолей), во-вторах, элонгя.дия центриоли (присутствие коротких центриолей) и термжацкя

- л

роста (присутствие длинных центриолей). Такие нарушения в центри-олярном цикле описаны для полиплоидных клеток СНО, образовавшихся при длительном воздействии колцемидом (Киг1уата ,1982). Варьирование размеров центриолей нами обнаружено также в клетках, содержащих не 4 (как в диплоидном митозе), а значительно большее число центриолей (от 6 до 13).

Мы не исследовали число хромосом в митотических клетках гис-тиоцитош человека. Но в таких клетках соотношение между числом хромосомных наборов и центриолей может быть нарушенным вследствие: I - нарушения цикла репродукции отдельных центриолей; 2 - нарушения ассоциации отдельных центриолей с центросомой, организующей полюса (как при индукции 2-меркаптоэтанолом); 3 - инактивации отдельных центросом, содержащих центриоли; 4 - многополюсности в связи с созреванием дочерних центриолей (как при индукции 2-меркапто-зтанолом); 5 - многополгосност в связи с многочисленностью дипло-сом (как при индукции цитохалазином В).

.Такая множественность причин нарушения нормального соотношения между числом хромосомных наборов и центриолей, безусловно, является источником появления большого разнообразия клеточных типов, у которых резко нарушено соотношение между хромосомным, центриолярным и центросомным циклами. Это в свою очередь должно выразиться в широком варьировании прол£$еративкых способностей клеток, в разнообразии их цитоскелета и таких функций, как способность к прикреплению, распластыванию, клеточной подвижности, фагоцитарной активности и т.д. В конечном итоге, углубление нарушения в координации между хромосомным, центриолярным и центросомным циклами может являться одной из важнейших причин опухолевой прогрессии.'

6. Взаимосвязь между центриолярным, центросомным и хромосомным циклами

Проведенные в настоящей работе исследования и данные литературы показывают, что дифференцировка и полиплондиэация одних типов клеток не связана с разобщением центриолярного, центросомного и хромосомного циклов, появление же других форм полиплоидных клеток зключает различные варианты разобщения грех циклов относительно 1руг друга и эти сдвиги могут носить обратимый и необратимый характер. Так, полшлоидизация клеток о помощью полипловдизирующего №юза или слияния интерфазных клеток не нарушает сопряженности грех циклов. Обратимое прекращение митотической активности таких клеток и выход в о0-период может приводит к исчезновению морфоло-

гически выраженной ассоциации центросомного материала и центри-олей (гепатоциты взрослых животных). Необратимое прекращение про-лиферативной активности полиплоидных клеток сопровождается изменением локализации центросомного материала и распадом центрполярного комплекса (зрелые мегакариоциты,. мышечные волокна - Tassin et al. ,1985). Глубокое нарушение координации трех циклов, которое проявляется не только в отделении центросомы от центриолей, но и в исчезновении самих центриолей, происходит при политенизации хроматина о

То же можно сказать и о некоторых типах дифференцированных диплоидных клеток. В клетках, обратимо утрачивших митотическую активность, возможно появление большого количества центросомного материала и формирование втулки (признака материнской центриоли) внутри дочерней центриоли (эндотелий аорты - Быстревская и др., 1988). При необратимом выходе из митотического цикла центриоли могут исчезать (ядери эритроциты - Milier,Solomon ДЭ84), либо число их резко возрастает за счет образования de novo (ресничный эпителий - Anderson, Brenner ,1971).

Половые клетки представляют собой особую группу дифференцированных клеток. 7 разных видов в ходе делений созревания яиц прослеживается сопряженность событий центросомного и хромосомного цик-яоз5 но центриолярный цикл оказывается различным. У одних видов центриоли редуплицируются перед мейозом (Kytilus edulis - Longo, Andersonf 1969 )« У других видов перед началом мейоза число центриолей не удваивается, несмотря на удвоение ДНК ( Lymnaea stagnalis.). Наконец, есть виды, у которых в яйцах центриоли исчезают до качала I метафазы мейоза (мышь - S2Öllosi.1975).

При ооразова> in мужских половых клеток также в одних случаях центриолярный» центросомный и хромосомный циклы сопряжены друг с другом (насекомы, аскарида и т.д.). У других видов между I и П делениям мейоза наблюдается дополнительная редупликация центриолей (млекопитающие, моллюски, рыбы и т.д. - Afzelius ,1979). В процессе спермиогенеза как центриоли, так и центросома могут претерпевать морфологические преобразования.

В результате оплодотворения происходит объединение не только хромосомного, но и центросомного материала отцовского и материнского происхождения, восстановление координированное™ центросомного и хромосомного циклов и возобновление центриолярного цикла.

При различных патологических процессах также возможно разоб-

щение трех циклов относительно друг друга. Оно может- носить обратимый характер. Например, преждевременное созревание дочерних центриолей может привести к многополюсности митоза, который завершится возникновением гаплоидной клетки. Такая клетка после монополярного митоза ( Sluder.Rieder ,1985) вновь становится диплоидной с нормальным соотношением между числом хромосомных наборов и цен.три-олей. Но в других случаях разобщение циклов носит необратимый характер (например, патологические многополюсные митозы,недореплика-ция центриолей в гибридах, образование центриолей de novo при действии колхицина - Hubert et al. ,1974). Тогда в клетках нарушается соотношение между числом центриолей и числом хромосомных наборов. Наиболее яркие аномалии в центриолярном и цеитросомных циклах обнаружены нами в опухолевых клетках,,

На культивируемых клетках к других моделях еще предстоит исследовать роль различных вариантов разобщения трех циклов для жизнедеятельности клеток и развития различию; форм патологии, сопровождавшихся нарушением регуляции клеточного деления.

ВЫВОДЫ

1. На основании электронкомикрсскопических исследований впервые показано, что при умножении геномов путем нслиплоэдизи-рующего митоза, блокирования клеток в с-2 -периоде или слияния клеток сохраняется корреляция между числом хромосомных наборов и центриолей, которая характерна для большинства диплоидных соматических клеток»

2. Механизм корреляции между числом хромосомных наборов к центриолей как в диплоидных, так и в полиплоидных клетках обеспечивается сопряжением хромосомного и центриодярного циклов, которое включает два основных этапа: I - сопряженное удвоение геномов и центриолей з интерфазе; 2 - сопряженное распределение хромосомных наборов я центриолей з митозе,

3. Разобщение хромосомного и цеятриолярного циклов возможно зо всех фазах клеточного цикла, носит обретший и необратимый характер и выражается: а) в случае обратимого разобщения 2 преждевременной репродукции центриолей зле ;и преждевременном функциональном созревании; б) - при необратимом разобщении - з полном отделении репродукции геномов и центриолей друг от друга.

4» Коррекция обратимого разобщения може™ происходить з :лро-лиферирующих кяезках, тогда как as обратимое разобщение свойственно клеткагл, полностью утративши« способность к пролафграции.

5. Как поддержание сопряженного протекания хромосомного и дентриолярного циклов, так и разобщение циклов наблюдается при дифферепцировке различных типов клеток. Например, сопряженное про-' текание циклов характерно для гепатоцитов, эпителиальных клеток щитовидной железы, обратимое разобщение - для эндотелия аорты, необратимое - для клеток с политенным хроматином, зрелых мегака-риоцитов, ядерных эритроцитов, ресничного эпителия млекопитающих, поперечнополосатых мышечных волокон и т.д.

6. Гаметогенез является особым путем дифференцировки клеток, при котором возможны различные комбинации между числом хромосомных наборов и центриолей. Корреляция между числом хромосомных наборов и центриолей возникает на разных стадиях эмбриогенеза у различных видов животных организмов.

7. В полиплоидных клетках выявлены два варианта локализации многочисленных центриолей: I - в едином клеточном центре - при умножении геномов путем полипловдизирующего митоза, %-блока, и слияния клеток; 2 - в различных зонах цитоплазмы - при умножении геномов только путем слияния клеток.

8. При патологическом состоянии клеток возможно: а) разобщение центриолярного, центросомного и хромосомного циклов относительно друг друга; б) нарушение собственно центриолярного цикла: недорепликация или гиперрепликация центриолей, появление коротких и сверхдлинных центриолей, аномалии в строении центриолярных триплетов; в) разобщение топографической связи между центриолью и центросомой; г) функциональная инактивация центросомы в качестве ЦОМТ.

9. Поликарионы с разным механизмом возникновения различают-, ся характером сопряжения центриолярного и хромосомного циклов:

а) в поликарионах, образовавшихся путем полиплоидизирующего мито-. за, как при гомофазном, так и при гетерофазном состоянии ядер многочисленные центриоли, как правило, гомофазры; б) в поликарионах, образовавшихся путем слияния гетерофазных клеток, центриоли разного происхождения гетерофазны. Синхронизация центриолярных циклов также, как и хромосомных циклов, завершается на стадии мета-фазы.

10. Впервые сформулировано представление о гетерогенности типов многополюсных митозов, изменяющих не только площшость клеток, но и число центриолей в них.

11. Экспериментально показано, что переход от двухполюсного к многополюсному митозу может иметь три источника: I - увеличение числа центриолей в связи с полияловдизацией клеток; 2 - преждевре-

менное функциональное созревание центриолей в связи -с удлинением начальных фаз митоза или К-митотической задержкой; S - появление в клетках бесцентриолярных центросом за счет частичного или полного отделения фибриллярного компонента центросомы от центриолей.

12. Кногополюснне митозы по характеру распределения хромосом и центриолей могут быть отнесены к редукционным, патологическим и смешанного типа:

- редукционные многополюснне митозы, снижая в дочерних клетках число хромосомных наборов и центриолей, не нарушают корреляции между ними;

- при патологических многополюсных митозах происходит нарушение корреляции между числом хромосомных наборов и центриолей за счет: а) анеуплоидного распределения хромосом; б) зуплоидного распределения хромосом, но случайного распределения центриолей;

- при многополюсных штосах смешанного типа происходит эу-плоидное распределение хромосом, но центриоли распределяются таким образом, что корреляция между числом хромосомных наборов и числом центриолей сохраняется лишь в части клеток.

13. Разработан метод идентификации положения клеток в различных пцэиода^ ( G.p s, g2) клеточного цикла с помощью двойного мечения "п- и С-тимлдином, последовательное введение которых должно проводиться с интервалом времени, равным продолжительности g2 + 1/2 м. Этот метод позволяет провести последующее изучение идентифицированных клеток как на световом, так и на электронно-микроскопическом уровнях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Оншценко Г.Е. О соответствии числа центриолей и плоид-ности гепатоцитов в печени мыши //X Всесоюзная конференция по электронной микроскопии. - Ташкент, 1976. - C.I48-I50.

2. Онищенко Т.Е., Ченцов Ю.С. Центриоли в полиплоидных клетках /^Второй симпозиум по соматической полиплоидии. - Ереван.-

1977. - С.89-90.

3. Онищенко Г.Е., Филичкина U.M., Ченцов Ю.С. Использование метода двойного мечения и С-тимидином для идентификации клеток в разных периодах интерфазы клеточного цикла //Цитолога.-

1978. - Т.20, К I. _ С.51-57.

4. Онищенко Г.Е. 0 соответствии числа центриолей плоидности

гепатоцигов в печени мышей //Цитология. - 1978. - Т.20, л 4. -С.395-399.

5. Москвин-Тарханов М.И., Онищенко Г.Е. Центриоли в мега-кариодитах костного мозга мыши //Цитология. - 1978. - Т.20, ц 12,-С.1436-1440.

6. Онищенко Г.Е., Быстревская В.Б., Ченцов Ю.С. Кногополюс-ные митозы в клетках культуры ткани в норме и при экспериментальной индукции 2-меркаптоэтанолом //Докл.АН СССР. - 1979. - Т.248, № 16.'- С.1443-1446.

7. Быстревская В.Б., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Динамика митотического цикла и аномалии митоза при действии 2-меркаптоэта-нола на клетки культуры ткани СПЭВ / Цитология. - 1981. - Т.23,

Я 6. - С.638-547.

8. Быстревская В.Б., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Ультраструк-.тура митотического аппарата в метафазных клетках при действии 2-меркаптоэтанола на культуру ткани СПЭВ Цитология. - 1981. -Т.23, И 7. - С.745-752.

9. Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Взаимосвязь между циклами репликации ДНК и репродукцией центриолей //Цитология. -Т.23, Л 10. - С.1211.

10. Онищенко Г.Е. Сравнительно-морфологические аспекты строе ния центров организации микротрубочек - ЦОМГ /Успехи совр.биол. -1982. - Т.94. - Вып.З (6). - С.330-375.

11. Волкова Я.Г., Онищенко Г.Е. Структура многополюсного митоза в гибридах соматических клеток //Ш Всесоюзная конференция по патологии клетки. - М., 1982. - С.178-179.

12. Быстревская В.Б., Ончшенко Г.Е. Форш перестройки митотического аппарата метафазных клеток при действии К-митотичес-ких агентов //Ш Всесоюзная конференция по патологии клетки. - М., 1982. - С.190-191.

13. Быстревская В.Б., Онищенко Г.Е. Особенности строения митотического аппарата при индукции 2-меркаптоэтанолом обратимого К-метафазного блока // Катер.ХП Всесоюзной конференции по электронной микроскопии. - Суш, 1982. - С.^7.

14. Быстревская В.Б., Онищенко'Г.Е., Ченцов Ю.С. Влияние 2-меркаптоэтанола на отдельные периода митотического цикла /'Цитология. - 1983. - Т.25, Я 3. - С.250-259.

15. Онищенко Г.Е., Волкова П.В. Центриолярный комплекс в гпбрвдах соматических клеток (мышь, китайский хомячок) //Цитология'. - 1983. - Т.25, Л 5. - С.503-515.

16. Индукция патологических митозов в культуре клеток инги-5итором митохондриальной АТФазы / В.Б.Быстревская, Г.Е.0н1шенко, О.ПеЙкина, И.А.Полякова, Ю.С.Ченцов //Биология клетки в культуре.-П.: Цитология, 1983. - Т.25, Л 9. - С.1091.

17. Бнстревская В.Б., Онщенко Г.Е. Многополгасные митозы в яорме и при экспериментальной индукции //Цитология и генетика. -[983. - Т.17, В 3. - С.59.

18. Онищенко Г.Е., Бнстревская В.Б. Шогополюсннй митоз. Механизм возникновения и биологический смысл //Тезисы докл. на заседании шОИП. - 1983.

19. Бнстревская В.Б., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Изменение структуры митотического аппарата метафазных клеток, индуцируемое 2-меркаптоэтанолом в культуре тканей СПЭВ. Светомикроскопическое исследование НЦитология. - Т.26, Л 9. - С.993-1002.

20. Крючкова Ы.Ы., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Строение цен-гриолярного комплекса в разных периодах клеточного цикла в гепато-дитах.печени в норме и при экспериментально вызванном о2-блоке // Дитологкя. - 1984. - Т.23, )! 9. - С.1072.

21. Быстревская В.Б., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Ультраструк-гура мктотического аппарата метафазных клеток в культуре ткани ЗЮВ после прекращения действия 2-меркаптоэтачола //Цитология, [984. - Т.26, Л 10. - С.Ю95-И02.

22. Крючкова М.К., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Строение цен-гриолярного комплекса в гепатоцитах мыши, при экспериментальной индукции G2-блока //Цитология. - 1983. - Т.28, К I. - С.29-33.

23. Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Строение центриолярного комплекса в гепатоцитах интактной и регенерирующей печени мыши //Цитология. -1986. - Т.28, J5 4. - С.403-408.

24. Ходяков АЛ., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Распределение тромосом и центриолей в трехполюсных метафазaxf индуцированных 2-меряаптоэтанолом в культуре клеток китайского хомячка //Докл.АН ЗССР. - 1986. - Т.290, JS I. - С.225-227.

25. Петращук О.М., Онищенко Г.Е. Особенности пролиферации многоядерных клеток, индуцированных цлтохалазином В // Цитология. -[987. - Т.29, JS 2. - C.2I4-220.

26. Петращук О.М., Онищенко Г.Е. Исследование ролл многопо-иосных митозов в пролиферации многоязерннх клеток, индуцированных дитпхалазином В //Цитология. - 1987. - Т.29, Л 7. - С.794-801.

27. Петращук О.М., Онищенко Г.Е. Варианты асинхронного спн-

теза ДНК и митозов в многоядерных клетках, индуцированных цито-халазином В /Цитология. - 1987. - Т.29, № 10. - C.II26-II3I.

28. Онищенко Г.Е., Пронина С.Л. Гетерофазные гомскарионы: особенности протекания митоза и распределения в нем хромосомных наборов //Цитология. - 1987. - Т.29, Я 9. - С.1095.

29. Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Многообразие структурных форм многополгасных митозов //13 Всесоюзная конференция по патологии клетки. - 1987. - С.141.

30. Онищенко Г.Е., Пронина С.А. Исследование митотической активности различных вариантов гетерофазных гомокарионов /'Цитология и генетика. - 1988. - Т.22, JS 5. - С.29-33.

31. Онищенко Г.Е., Пронина С.А. Особенности митоза гетерофазных гомокарионов //Цитология и генетика. - 1988. - Т.22, Ц 6. -С.31-33.

32. Петращук О.М., Онищенко Г.Е. Нарушения ультраструктуры митотического аппарата при действии цитохалазина 3 //Цитология. -1988. - Т.ЗО, № 12. С.1418-1425.

33. Ходяков А.Л., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Ультраструктура и свойства клеток культуры ткани, лишенных центриолей //Ш Всесоюзная конференция по электронной микроскопии. - М., 1988. - С.220

34. Крючкова М.М., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Ультраструктура кинетохоров в гаметогенезе и в I делении дробления яйцеклеток Lymnaea stagnaiis //ХШ Всесоюзная конференция по электронной микроскопии. - М., 1988. - СД70.

35. Ходяков А.Л., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Спонтанное слияние бесцентриолярных клеток, образующихся в результате трехполюс-ного митоза в культуре клеток //Докл.АН СССР. - 1989. -

Т.308.

36. Крючкова М.М., Онищенко Г.Е., Чэнцов Ю.С. Ультраструктура полюсов веретена I и П делений созревания яиц Lymnaea etagna-

lie // Онтогенез. - 1989. -Т.20, й 4.

37. Крючкова М.М., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Ультраструктура полюсов веретена первых делений дробления у Lymnaea ntagnalis Онтогенез. - 1989. -Т.20, ß 5.

ОНИЩЕНКО Галина Евгеньевна

ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЕДУ ХРОМОСОМНЫМ И ЦЕНТРИОДЯРНШ ЦИКЛАМИ ПРИ ЮИНЕНИИ 1ШОЦЩОСТИ КЛЕТКИ

(Автореферат)

Подписано к печати 04.07.89 г. Формат- 60x90 1/16- 3,2 п.л. Уч.изд.я.2.8 Тираж 100. Л-15346. Заказ 689 Бесплатно Ротапринт МАСЙ (ВТУЗ-ЗИЛ),109280, Москва,Автозаводская,16