Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие возбудителя мелиоидоза с макроорганизмом на начальных этапах инфекции. Электронно-цитохимическое исследование

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие возбудителя мелиоидоза с макроорганизмом на начальных этапах инфекции. Электронно-цитохимическое исследование"

^п г,4 91"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ . КСШГКГ СШЯАРНОтЭЛЩИЖЛОПШЖОГО НАДЗОРА РОССИИ

ВСВСОЮНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЩОШЕЛЬСКйЯ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ "МИКРОБ"

ЮАШОДЕЙСТВИЕ ВОЗБЩГШ НЕЯИОЩОЗА С МШООРГШШМ НА НАЧШШЕ ЭТАПАХ ШШЦИИ. аШТРОШО-ЩЯОШЙИЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

03,00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукоплси

ПОПОВ Сергей Федорович

Ш 576.851.132: 616.982.27-039

Саратов - 1892

Работа выполнена в Волгоградской научно-исследовательском противочумном институте

Научные руководители: кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Курилав В.Я., кашаддат медицинских наук, ■ старший научаий сотрудник Мельников Б,И.

Официальные оппоненты: доктор биологических- наук, с.н.о.

Коннов Н.П. и кандидат медицинских наук Скяпина Л.В.

Ведущая организация: шучно-исоледовательсклй противочумный

институт Кавказа и Закавказья

Автореферат разослан " 1992 г.

Защита диссертации "/3" 1992 г.

в 13 часов на заседании специализированного совета Д 074.32.01 но защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук ар Всесоюзном ордена Трудового Красного Зняиени научно-исследов&тель ском институте "Микроб" (410071, г.Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией ыояло ознакомиться в библиотеке института "Микроб".

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук '

Корнеев Г.А.

г

, ' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие в литературе говорятся о растущем клиническом значении бактерий рода псевдомонас (Беляков В.Д. и др., 1990; Мороз А.в. я др., 1988). Среди них возбудитель иелиоидоза - Р.рзеис1оп1в1-

- занимает особое место, что связано с его способностью зц-зывать у лдаеЗ и животных тяжелое заболевание, характеризующееся септицемией о множественными некротическими поражениями внутренних органов» трудно поддающееся антибактериальной терапии (Ширяева Д.Т. И др., 1976; СЬаоигакЩ V. вЬ аХ. „ 1989), В силу'этих обстоятельств мелиоидоз и по сегодняшний день остается в списке особо опасных инфекций я внзнваег оправданную настороженность у медиков. Несмотря на то, что о момента открытия Уитмором возбудителя мелиоидоза прошло почтя 80 летр многие стороны его биологии я свойств остаются на сегодняшний день шло изучении®.

Эндемичный район для данной инфекции находится между 2б°с.ш. и 20° ю.п. Заболезание встречается в тропических и субтропичес-ких''зонахе чаще всего в Юго-Восточной Азия. В других частях ове-та мелиоидоз менее знаком медикам. Однако в связи с развитием международного туризма нельзя относиться к мелиоидозу как к болезни» распространенное яа отдельно® территории. Так, по данным французских и американских специалистов, среди лиц, находившихся более месяца в эндемичных районах, до 9% является потенциально болышмя мелиоадозом ( Вагхэи-согтог в. „ 1978). В последние годы интерес к меляоидозу возрос также и аа-за роста заболеваемости во многих государствах, расположенных вне "ьтсо етчесиа вндемич-ных географических регионов - США, Австралия, фракции ( капа! к., ОвЛа1г11вв1; 3. , 1988).

На территории Советского Союза медиоидоэ не регистрировался,, но постоянно расширяющиеся торгово-экономические связи о эндемичными по данному заболеванию странами создают предпосылки для появления в нашей стране этой опасной инфекции. Имеется также вероятность завоза мелиоидоза из приграничных с СССР районов Ирана, где выявлены активные очаги мелиоидоза ('fourtagbva ы. et ai. , 1975).

Вое ето диктует необходимость всестороннего исследования биологии возбудителя мелиоидоза и, в частности, вопросов, связанных о изменчивостью микроба в процессе его взаимодействия о мак-роорганизыои, что раскрывает механизмы патогенеза данного заболевания.

Одним из методов для более глубокого изучения строения и овойств микроорганизмов является электронно-шгкроскоайческяй. Электронно-макроскопическое исследование как метод структурного анализа позволяет подучить тонкую организацию возбудителей инфекционных заболеваний, дать им морфо-функциональную характеристику и определить возможное значение бактериальных структур в инфекционном процесое (Селезнев A.C., Быков A.C., 1983; Coster-ton J.w. , 1979).

Известно, что особенности строения возбудителя заболевания оказывают существенное влияние на характер взаимодействия микро-и шкроорганизма (Езепчук Ю.В., 1985; Тимаков В.Д. в др., 1983). Повтоцу для понимания патогенеза инфекции необходимо знать морфологию микроба не только in vitro , но и, что особенно важно, la Tiro. Имеются единичные работы, описывающие ультраструктуру бактериальной клетки возбудителя мелиоидоза в живом организме, в которых показана возможность образования х-форм у «того возбу-

дителя в условиях моделирования специфического абсцесса с использованием имплантированных под коду восприимчивым животным перфузионных камер (Заъ&раов B.C. и др., 1987; Саямов G.Р., 1983). Шесте с тем, изучения ультраструктурн бактерий не ля о идо за в организме хозяина и их взаимодействия с клетками макроорганизма на начальных этапах инфекции не проводилось.

Цель работы - изучить особенности субмикроскоплче-ского строения возбудителя ызлиоидоза, его взаимодействия с гуморальными si клеточныка факторами шдунагета, а такие взаимоотношения бактерий с клетками в пораженных органах на начальных этапах инфекционного процесса.

Основные задачи исоледов а.н а я:

:£„ Дать ультраотруктурную характеристику возбудителя мелио-идога з макроорганизме и при культивирования на ешюроточнкх средах с помощью обычны! приемов электронной микроскопии, а так-яэ элекгронноцитохимического и электронноиммунохимического методов исследования.

2. На оубмикроскопичеоком уровне исследовать особенности взаимодействия меляоидозюа бактвриД с гуморальными п, клеточными факторами иммунитета хозяина на начальных этапах инфекции.

Зо Изучить на ультраструктурном уровне особенности внутриклеточного паразитизма мелиоидозннх микробов.

4, Исследовать взаимоотношение возбудителя келиоидоза с клеточными элементами в инфицированных органах. ■

Научная новизна

Проведенные исследования позволили получить следующие новые данные:

- доказано, что возбудитель мелиоидоза в условиях макроор* ганизма и при росте на сывороточных средах продуцирует капсулу;

- с помощью эЛектронно-микроскопического, имв<уноцитохимиче-ского и цитохимического методов исследовании изучена ультраструктура капсулы возбудителя мелиоидоза, которая имеет прей,-существенно полисахариднуи природу;

- установлено, что бактерии, обладающие капсулой, устойчивы к опсонизации и фагоцитозу in vivo ;

- на ультраструктурном уровне прослежен механизм инвазии возбудителя мелиоидоза в клетки хозяина;

- показано, что возбудитель мелиоидоза в ряде случаев способен, покидая фагосому до слияния ее с лизосомами, паразитировать свободно в цитоплазме клетки макроорганизма;

- выявлено, что сформированная у Р. paeudomallei капсула при его внутриклеточном развитии предохраняет патоген от неблагоприятного воздействия зацитша механизмов клетке-хозяина;

- охарактеризован с помощью электронно-микроскопического и цитохимического методов процесс слияния лизосом с ф&госо-мами, содержащими микробов;

- показано, что возбудитель мелиоидоза, являясь факультативным внутриклеточным паразитом, обладает тропностью к клеткам ретикулоэндотелиальной системы макроорганизма.

Практическая ценность. Подученные в результате исследования данные расширяют" и углубляют представления о строении на субмикроскопическом уровне возбудителя мелиоидоза в ыакроорганнзме, раскриваюг механизмы его взаимодействия с гуморальными и клеточ-

2. Злектронноцитохимическое и электронноиьмунохимяческое исследования выявляют, что основу капсулы, образуемой Р. paeudo-maiioi la vivo , составляют полисахариды.

3. Капсульные варианты бактерий устойчивы к опсоыазации й фагоцитозу.

4. Возбудитель мелиовдоза способен покидать $агосому до слияния ее с лизосомаыа и паразитировать свободно в цитоплазме клетки организма.

5. Сформированная у Р. pseudomaiiei капсула при его внутриклеточном развитии предохраняет патоген от неблагоприятного воздействия защитных механизмов клетки-хозяина.

6. Возбудитель мелиоидоза, являясь (факультативным внутриклеточным паразитом, проявляет тропность к клеткам ретикулоэндоте-ляальной системы макроорганизма.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, иллюстрирована 72 рисунками. Указатель литературы включает 254 источника, э тон числе 139 на иностранных языках. Общий объем диссертации í¿6 страниц машинописи,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследован а я. В работе использованы музейные штаммы 100, 108, C-I4I, 60806, 97 возбудителя мелиоидоза, выращенные на обычных питательных средах, а также на средах с добавлением сыворотки морской свинки и белой крысы. Опыты выполняли на линейных белых крысах, морских свинках, золотистых хомячках.

При подготовке материала к исследованию в ультратонких сре-

нкш факторами иммунитета на начальных этапах инфекционного процесса. Это имеет важное значение для понимания патогенеза данного заболевания и может служить теоретической основой для даль-ие£ае2 разработки мероприятий по профилактике, диагностике и лечению мелиоидоза.

Материалы диссертационной работы использованы при оформле-"Методических рекомендаций по стерилизующему режиму фиксации меток -ыакроорганизт, зараженных возбудителями мелиоидоэа и сапа для электронной цитохимии и иммуиоцитохиши", утвервденных директором Волгоградского НИПЧИ 6 августа 1990 г., в также двух рационализаторских предложение.

Вышеуказанные документы применяются в практической и научно! работе лабораторий Волгоградского научно-исследовательского противочумного института, использующих ыелиоидоэные культуры.

Апробация работы. Материалы диссертации доло- ' жены и представлены на Областной научной конференции молодых ученых "Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных; и вирусных инфекций" (Ростов-на-Дону, 17-20 октября 1989 г.), на Первом Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 15-17 ноября 1989 г.), на итоговых научных конференциях'Волгоградского НИШИ (Волгоград, 1989, 1990).

Публикации. По материалам диссертация опубликовано 14 научных работ.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯг ВЫНОСШЫЕ НА ЗАЩИТУ

I. По данным светооптического и элеетрошю-шнроскопического исследования возбудитель меляоидоза в макроорганязме образует капсулу.

ашс применялись общепринятые методики фиксации, обезвоживания, заклвчения в эпоксидные смолы и контрастирования. Улвтратошше срезы получали на ультратоме 2128 (1KB, Швеция), подвергала последовательному двойному контрастированию в спиртовом растворе уранилацетата и водном растворе цитрата свинцд ( Venable Y.H., Coggeahall н. , 1965)., Препараты просматривали и фотографировали с помощью электронного микроскопа леи зх.

Еапсулу у возбудителя мелиоидоза в макроорганизме и при культивировании на сывороточных средах выявляли методом негативного окрашивания по Бурри. .

Электронноцитохимическое исследование экстрацвллкшярншс кислых полисахаридов у мелиоидозных микробов in vivo проводила после обработки препаратов рутениевая красным по методу Cagae GoD„ (1972).

Локализацию поверхностных антигенов возбудители мелиоидоза определяли с помощью электрошю-ииАуноцктохямического метода, дяя этого гам,шглобули1юву*) фракцию кроличьих ишдунннх сывороток, полученных как к обеззараженным формалином кяаткак типичного штамма P. pseudomailei 59361 "s так и к кисло:'/ полисахариду внеклеточной слизи возбудите»! ыелиоидоза, конъигвроваяя с фер- • ритином по методике otto и. et al., (1973).

Исследование взаимодействия келкоидозных бактерий с клетками макроорганизма In vivo проводили ка вдели внутрибриаинного и интраназального заражения белых крыс, дарскюс сванок, ЗОЛОТИСтых хомячков«

Для идентификации слияния лизосом с фагосстми на субклеточном уровне наряду о морфологическими критерии®, применялось иар-кировашге лизосом ферритяном С Silra. M.Jf. e>t al,., 1987), a ras-

хе их выявление о помощью электронно-цитохимической реакции на кислую фосфатазу (Гомори, 1956).

С целью изучения взаимоотношения возбудителя мелиоидоза с клеточными элементами инфицированных органов, у экспериментальных животных воспроизводилась острая форт инфекции, препараты легких, печени, селезенки и лимфатических узлов изучали в электронном микроскопе на 3-5 день болезни,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение препаратов, полученных от экспериментальных животных в первые часы после заражения, выявило, что среди янтактных микробов, как высоко вирулентных штаммов 100, 108, C-I4I, так и штаммов с более низкой вирулентностью 60806, 97 возбудителя мелиоидоза, расположенных вне клеток макроорганизма можно было выделить три морфологических варианта. Ультраструктура первого соответствовала типичным грамотрицательным бактериям. Микробные клетки второго и третьего морфологических вариантов в условиях макроорганизма формировали вокруг своего тела внеклеточное морфологически очерченное образование определенной структуры. Главное различие между вторым и третьим морфологическим вариантами заключалось в размерах этого образования - у второго варианта оно было до 70 нм, а у третьего - до 300 нм.

У возбудителя иелиоидоза при световой микроскопии с окраско{ бактерий, получениях от животных по методу Бурри, также было обнаружено внеклеточное образование в виде светлого ореола размерами до 0,5 ыкм с четкой наружной границей.

Следует отметить, что аналогичное внеклеточное образование нам удалось воспроизвести у P.pseudomallei и при его культивировании на средах, содержащих сыворотки восприимчивых к данной ин-

- и -

фекции яивотных.

Известно, что возбудитель мелиоидоза при его росте на питательных средах продуцирует слабо связанную с клеточное стенкой ехстрацеллишярную слизь (мукоид), Поскольку в нашем исследовании применялась традиционная обработка материала для трансмиссионной электронной микроскопии, которая приводит к потере слизистых покровов бактериальными клетками, а выявленное 1п у возбудителя мелиоидоза второго и третьего морфологических вариантов экстрацеллшярное образование имело ряд характерных морфологических признаков; наличие определенной слоистой структура; размеры,

сопоставимые с диаметром бактериальной клетки; прочная связь с

\

клеточной стенкой, то оно может быть отнесено к разряду капсул.

Наличие капсулы у Р. рееиДотаНе! подтверждается я тем, что при введении животным предварительно убитых глутаральдегядом бактерий мелиоидоза на та поверхности откладывается аморфный зернистый слой толщиной до 40 ям, не имеющий какого-либо структурного подобия, образуемой живым возбудителем в этих условиях капсулы-Присутствие трех морфологических вариантов, очевидно, отражает этапы процесса далсулооСразования у возбудителя мелиоидоза в'макроорганизме. ,

Применение электронноцитохимического я элеятровноиы&дшоцито-химического методов позволило получить дополнительные данные о строении и качественном составе капсулы возбудителя мелиоидоза, образуемой в организме хозяина. Для решения этих вопросов нами была использована способность рутениевого красного избирательно контрастировать полисахаридсодержадяе комплексы (Гайер Г., 1974). Исследование ультратонких срезов инкапсулированных бактерий позволило выявить рутенийпозитивные биополимеры, которые формировали

в составе капсулы слои, равномерно окружающие тело прокариота»

Если избирательное контрастирование слоев капсулы рутениевым красным указывает на их преимущественную полисахаридную природу, то контрастирование с помощью ферритинмеченных антител свидетельствует об антигенной специфичности выявляемых объектов. Так, обработка бактерий, имеющих капсулу меченными ферршгином иммуноглобулинами, полученными как против целых бактериальных клегоя, так и против экзоно лисахарида слизи возбудителя мелиоя-доза, показала, что метка обнаруживалась преимущественно на поверхности капсулы. У бескалсульных форм бактерий метка выявлялась непосредственно на клеточной стенке. Эти данные свидетельствуют о наличии однотипных алтигениьк детерминант, расположенных на поверхности как клеточной стенки бактерий, так и капсулы возбудителя.

Обработка бактерий меченными ферритиноы антивидовнми иммуноглобулинами против сыворотки хозяина не привела к их прикреплению на поверхности капсулы. Следовательно, наличие на поверхности капсулы собственно бактериальных антигенных детерминант, а также отсутствие на ней компонентов сыворотки хозяина указывают на истинно бактериальную природу кадсульного вещества, то есть оно не является капсулоподобшщ покровом, сформированным, исключительно, в результате сорбции компонентов макроорганизма на клеточной стенке возбудителя мелиоидоза.

При исследовании бронхоальвеолярного и перитонеалького экссудатов, полученных от экспериментальных животных через 0,5-1 час после заражения, было установлено, что фагоцитозу подвергались преимущественно бескапсульные формы возбудителя, составляя 8090$ от общего числа поглощенных макрофагами и полиморфноядерными

лейкоцитами бактерий. Значительно реже наблвдался фагоцитоз второго морфологического варианта, обладающего микрокапсулой. Количество таких микробов в защитной клетке хозяина составляло менее 20$. При этом поглощение возбудителя осуществлялось при помощи активного захвата бактериальной клетки псевдоподиями фагоцита. Бактерии третьего морфологического варианта, имеющие выраженную капсулу (макрокапсулу), обнаруживались, как правило, вне фагоцитирующих клеток и не вступали с ними во взаимодействие.

Из приведенного материала становится очевидным, что капсула Р. раеи<1ота11е1 , формируемая ▼1т<^поззоляет патогену избегать такого важного элемента зашиты хозяина как фагоцитоз. При этом фагоцитабельность паразита находится в обратной зависимости от размеров капсулы.

Поскольку одним из определяющие моментов при фагоцитозе бактерий в условиях макроорганизма является процесс опсонизацви» который делает инородный объект легко узнаваемым для фагоцитов, то нами было проведено исследование на наличие или отсутствие оцсо-нинов на капсульных а бескалсульных вариантах Р. рзеийошаИе!.

Показано, что меченные ферритином антивидовые имв^уноглобу-лины, подученные против нормальной сыворотки морской свинки, заявлялись на поверхности бескалсульных бактерий» тогда как метка отсутствовала на поверхности возбудителя сформировавшего капсулу. Этот результат свидетельствует о том, что капсула препятствует опсонизациа мелиоядозных микробоБ, в тоже время бактерии без капсулы подвергаются воздействию неспецифических факторов гуморального ящунитета, а это в свою очередь приводит к активному их поглощению фагоцитами. Данное исследование в определенной мере объясняет причину резистентности к фагоцитозу части мелиоидозкых

микробов, формирующих в условиях макроорганизма капсулу, что согласуется о функциональным свойством данного образования у других патогенных бактерий.

Вскрыв в основных чертах начальные моменты контакта возбудителя мелиоидоза с клетками макроорганизма и показав роль капсулы Р.рзвис1ота11е1 в защите от фагоцитоза, необходимо отметить, что практически ничего неизвестно о механизмах защиты от завершенного фагоцитоза при мелиоидозной инфекции, хотя для многих возбудителей эта стадия фагоцитоза имеет решающее значение.

Но нашим данным после проникновения Р. раеи<1ота11е1 в клетку • хозяина и формирования вокруг него пищеварительной вакуоли за счет цитоплазыатической мембраны фагоцита стратегия возбудителя, • направленная на выживание, шла в нескольких направлениях.

В ряде случаев уже через 0,5-1 час от начала взаимодействия возбудителя с фагоцитами на электроннограммах обнаруживалась деструкция в мембране первичных фагосом, за которой следовал выход паразита в цитозоль клетки. Причем это происходило, как правило, до слияния паразитофорных вакуолей с лизосомами. Такая картина наблвдалась чаще в случае заражения животных более вирулентными штаммами возбудителя мелиоидоза. Паразитируя в дальнейшем в цитоплазме фагоцитов такие бактерии, как правило, имели нормальную ультраструктуру и формировали вокруг своего тела.равномерную, четкую зоцу, хорошо проницаемую для электронов, толщиной до 300 ¡ш, которая была заполнена зернистым материалом с тенденцией образования отдельных нитей, радиально отходящих от клеточной стенки микроба. Описанный механизм, позволяющий Р. рзеисьиа1-1е1 избежать действия лизосомального содержимого за счет выхода ого в цитоплазму фагоцита с последуицим там свободным размножени-

ем, является характерным для* ряда внутриклеточных паразитов -H.tautaugamushl > R.tyhi , М.tuberculosis , М.leprae ( Moulder J.Hi , I9B5). Механизм разрушения мембран фагосом в этом случае точно не известен. В отношении риккетсий предполагается участие фос^олипазы А, встроенной в клеточную стенку микроба. Установлено, например, что R.prowazekii вызывает гемолиз после контакта ряккетсии с эритроцитом (Бадаева Н.М.» 1990). Возбудитель мелиоидоза также проявляет гемолитическую активность и продуцирует ряд протеолитяческих ферментов (Беляков В.Д. и др.„ 1990; Ashdown x.R, , Koohler J.и. , 1990). Возможно, что подобный механизм, связанный с контактным цитолизом, обеспечивает p.pseudo-mallei лизис мембран фагоцита.

Проникнув таким образом в цитоплазму клетки, малиоидозные бактерии получают богатый источник субстратов для энергии и биосинтеза макромолекул, и в тоже время оказываются защищенными клеткой хозяина от бактерицидных механизмов-макроорганизда.

Наряду с этим, на влектронпограммах можно было видеть, что часть мелиоидозных микробов не покидала первичных фаговом, что характернее было для.менее вирулентных штаммов. В таких случаях уже на ранних сроках наблюдения - 0,5-1 час каш, с помощью индикации лизосошльного глркера - кислой фосфатазы» а также элект-ронноплотного трасера-ферритина, документировался процесс слияния фагосом, содержащих P. pseudonallei, о лизосомами. При »том интенсивность образования таких фоголизосом, как правило, не зависела от вирулентности возбудителя. В дальнейшем часть бактерий, преимущественно в случае заражения животных менее вирулентными шташами, подвергалась деструкции в фаголизосомах, тогда как при использовании более вирулентных шташов у бактерий чаде отмечалась способность к переживанию в ни. В последнем случае между поверхностью клеточной стенки прокариота И содержимым фаголизосо-

ш определялась четкая зона, хорошо проницаемая для электронов, толщиной до 250 нм, заполненная мелкозернистым материалом; который отчетливо было видно на алектроннограгшах при больших увеличениях. Подобные алектроннопроэрачные зони были обнаружены в случае внутриклеточного паразитирования у ряда капсудцобразукк иих патогенных бактерий.

"сходя из к^йсказанного, а также учитывая описанную нами способность у Р. рзеийопаНе! формировать капсулу, мы пришли к заключению, что выявляемая вокруг паразита при его развитии как свободна в цитоплазме, так и в фаголизосомах ''зона, хорошо проницаемая для электронов, соответствует капсуле, а зернистый материал, заполшдаций ее, составляет основу капсудьного вещества. Отсутствие четкого контрастирования капсулы на ультратонких срезах говорит о ее, как и у большинства граштрицателыиа бактерий, преилущественно полисахаридяой природе.

Как показала динамика наблюдения за взаимодействием Р.рзеи-<1ота11е1 с макроорганизмом, к концу первые суток в перитонеаль-вом'и бронхо,альвеолярной экссудатах преобладали шгактные инкапсулированные бактерии, обнаруживаемые в осноеном в фагоцитах.

Микробы, у которых капсула отсутствовала или имела минимальные

/

размеры, находились, как правило, на различных стадиях деградации» Это говорит о том, что в процессе внутриклеточного паразитирования происходит отбор капсульных форм бактерий, которые оказываются, очевидно, более жизнеспособными, чем бескалсульные особи.

'Выраженность цитогатического эффекта бактерий на клетку-хозяина находилась э прямой зависимости от интенсивности пролифе- . рации в ней возбудителя мелиоидоза. Размножение келяоидознкх

микробов в фагоцитирующих клетках перитонаалыгого я брояхоальве-олярного экссудатов в ряде случаев приводило к их гибели, то есть фагоцитирупзая клетка в определенная условиях предоставляла Р,рзечаота11в1 возможность для его беспрепятственного размножения» Эти дашше позволяют предположить, что возбудитель мелиои-доза является факультативным внутриклеточным паразитом, и на ранней стадии заболевания, в период, предшествующий значительному антителообразованию, фагоциты, по-видамоцу, представляют собой клетки, колонизируемые мелиоядозными бактериями и участвующие в диссеминации возбудителя в организме.

В результате электронно-микроскопического изучения ультратонких 'срезов поврежденных участков легких, печени, селезенки и лимфатических узлов, полученных от экспериментальных животных о острой формой мелиоидозной инфекции, мы не обнаружили прямого поражения микробами паренхиматозных клеток.

Особенностью мелиоидозной инфекции было то, что возбудитель выявлялся преимущественно в клетках шкроорганизда, способных к фагоцитозу. При этом микроб паразитировал как в "профессиональных" фагоцитах - мононуклеарные фагоциты, полиморфнонуклеарныз ■ лейкоциты, так и в ряде клеток, которые относятся я группе "непрофессиональных" фагоцитов, в данном случае это были эндотели-альные клетки капилляров и ретикулярные клетки селезенки и лимфатических узлов. Указанные клетки-мишени, колонизуемые Р. раеиДо-ша11е1 при инфекционном процессе, очевидно, являются'своеобразной экологической шкронишей, где он получает необходимые для размножения питательные вещества, а также становится мало уязвимым для факторов иммунитета и антибактериальных препаратов.

Во всех случаях внутриклеточного паразитирования вокруг как-

дой интактной особи микроба выявлялась капсула, представленная четкой зоной, хорошо проницаемой для электронов, равномерно окружающей тело бактериальной клетки шириной до 200-300 нм. Особенностью паразитирования микробов медиоидоза в "профессиональных" фагоцитах было то, что часть внтактных бактерий находилась в фа-госомах, которые в ряде случаев сливались с лизосомами, при этом капсула возбудителя препятствовала прохождению лизосомальных ферментов к клеточной стенке патогена. Другая часть неповрежденных инкапсулированных микробов располагалась свободно в цитоплазме и не вступала во взаимодействие с лизосомами, это характернее было для более вирулентных штаммов. В случае поражения возбудителем мелиоидоза "непрофессиональных" фагоцитов интактные инкапсулированные бактерии, как правило, паразитировали свободно в цитоплазме клетки хозяина.

Способность Р.рвеи4оша11е1 паразитировать в "непрофессиональных" фагоцитах, наряду с капсулообразованием, на наш взгляд, можно рассматривать в качестве фактора пагогенносгя, поскольку эти клетки, не обладая столь мощной бактерицидной системой как "профессиональные" фагоциты, создают благоприятные условия для персистирования возбудителя.

При электронно-микроскопическом исследовании выявлено что если на срезе клетки макроорганизма обнаруживались лишь единичные интактные паразиты, то такая клетка не имела какой-либо значительной патологии со стороны ультраструктур, то есть наблюдалось установление своеобразного биологического равновесия в системе паразит-хозяин. Очевидно, такие клетки могут служить дательным резервуаром инфекции в организме. Дегенеративные изменения клетки- . хозяина наступали, как правило, вследствие накопления в ней боль-

и su количеств возбудителя,.что приводило к разрыву клетки и со-проводдалось распространением инфекции на другие клетки.

Как показали наши эксперименты, в целом характер взаимоотношения возбудителя мелиоидоза с клетками дакрооргаиизма был одинаков у всех используемых в работе штаммов, вместе с тем при заражении животных более вирулентными ытамыама инфекционный процесс протекал острее и исход взаимодействия клетка-клетка решался чаще в пользу микроорганизма. Это происходило за счет способности микробов высоко вирулентных штаммов быстрее адаптироваться к неблагоприятным условиям в организме хозяина и активно проли-ферировать в его защитных клетках с образованием капсулы.

Полученные нами данные свядетельствуот о том, что возбудитель мелиоидоза, являясь факультатиБннм внутриклеточным паразитом, проявляет троггность к клеткам ретякулоондотелиальной системы организш, паразитируя как в "профессиональных" (мононуклеар-тшэ фагсциты, полиморфноцуклеарнце лейкоциты), так й в "непрофессиональных" (эвдотелиоциты капилляров, ретикулоциты селезенки и лимфатических узлов) фагоцитах. Поскольку вышеназванными метками наиболее богаты легкие, печень, селезенка и диуретические узлы, то отсюда становится понятным частое поражение при ие-ляоидозе именно этих органов.

Таким образом, выявленная нами la viro способность у возбудителя мелиоидоза к паразитировавши и продукции капсулы внутри клотки-хозяииа делает его иало уязвимым для реализация как внутриклеточных, так и внеклеточных фактрров защиты хозяина - все это необходимо учитывать при выработке стратегии по лечению и профилактике этого опасного заболевания.

ВЫВОДИ

X, С помощью свегооптичеокого и алеотрояно-шкрошжичес-кого методов исследования впервые установлено, что возбудитель мелиоидоза в макрооргадвзме образует капсулу. По данным атекг-ронной цитохимии и электронной1 иимуноцитохимии основу капсуль-ного вещества составляет полисахаридные биополимеры.

2. В результате электронно-микроскопического, электроано-иммуноцитохиютеского изучения в условиях макроорганизма показана защитная функция .капсулы P. paeudomallei от опсонизация и поглощения фагоцитами.

Зо Ультраструктурное изучение процесса взаимодействия мели-оидозных бактерий о клетками макроорганизма in riva выявило высокие инваэиише свойства возбудителя, которые находились в прямой зависимости от его вирулентности в заключались в способности успешно преодолевать мембранные структуры меток хозяина и паразитировать не только в органоидах цитоплазмы, но и в ядрах клеток,

4. Показана способность у части мелиокдозных микробов покидать фахосодц? до слияния ее с лизосомами и паразитировать свободно в цитоплазме клетки макроорганизма, избегая тем самым деструктивного действия содержимого лизосом.

5« Выявлено, что P. pseuàomailei не препятствует процессу образования фаголизосом, однако в ряде случаев мелиоидознце микробы проявляют устойчивость к разрушительному действию содержимого лиэосом, синтезируя при этом защитную капсулу.

6. Установлено, что возбудитель ыелиоидоза является факультативным внутриклеточным паразитом и обладает тропностью к клеткам ретйкуловндотеляальной системы макроорганизма, которые при инфекционном процессе являются своеобразной экологической микронишей паразита.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Барулина Н.Г., Мельников Б.И., Бохко В.Г., Подов С.Ф., Авро-

рова И.В., Жаркова В.А., Рыбкин B.C. Изучение функциональной активности фагоцитов при острой мелиоидозной инфекции у мышей // Тез. докл. Первого Всесоюзного иммунологического съезда. (Сочи, 15-17 ноября, 1989 г.) - м., 1989,- T.I. - C.I97. ,

2. Бсжко В.Г., Мельников Б.И., Рыбкин B.C., Попов С.Ф., Бакули-

на Н.г. Изучение антимикробного потенциала полиморфно-ядерншс лейкоцитов крови мышей в динамике острой мелиоидозной инфекции // Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей,- Волгоград, 1990.- C.I78-I80.

3. Мельников Б.И., Попов С.Ф., Бохко В.Г,, Курилов З.Я* Некото-

рые особенности взаимодействия макроорганизма с возбудителем ыелиоидоза на начальной этапе острой инфекции // Там яе С.173-178.

4. Мельников Б.И., Попов С,®., Яковлев ¿.Т., Курилов В.Я. К воп-

росу о механизме защиты возбудителя мелиоидоза от фагоцитов и Там же,- С.178-180.

5. Мельников Б.й., Попов СЛ., Яковлев А.Т., Денисов И.И.,Бо«-

ко В.Г., Курилов В.Я. Капсулообразованке у возбудителя мелиоидоза в организме // Нурн. микробиол.- 1990.- Л 9,-C.6-I0.

6. Попов С.ф; Мельников Б.И., Курилов В.Я., Бсжко В.Г. Изучение

Ультраструктуры возбудителя мелиоидоза и его взаимодействия с фагоштами морской свинки и белое крысы в ткроор-ганизме //.Эпидемиология, микробиология в иммунология бактериальных и вирусных инфекций. Тез. докл. Облаотной ка^ч. конф, молодых ученых.- Ростов-на-Дону, 1989,-

7.- Попов С.®., Мельников Б.И., Курилов В.Я., Божко В.Г. Взаимо-

действие возбудителя мелиоидоза с фагоцитами хозяина // Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей.-Волгоград, 1990.- С.184-189.

8. Попов С.Ф., Мельников Б.И., Курилсв В.Я., Божко В.Г. Изучение

внеклеточной структуры возбудителя мелиоидоза при росте на питательной среде й в макроорганизме // Там яе,-С.123-126.

9. Попов С.Ф.8 Мельников Б.И., Курилов В.Я., Божко В.Г. ЕДект-

ронно-микроскопическое исследование возбудителя мелиоидоза в макроорганизме // Там же,- С.121-123.

10. Попов С.Ф., Мельников Б.И., Курилов В.Я.,-Бсяко В.Г. Сравнительная морфология возбудителя мелиоидоза прикроете на питательной среде и в макроорганизме // Там ке.- С.118-

11. Попов С.Ф., Мельников Б.И., Курилов В.Я., Божко В.Г. Особен-

ности ультраструктуры возбудителя мелиоидоза и его взаимодействия с фагоцитами in rive // Микробиол. журн.~ 1990.- Т. 52.- Д2.~ С.16-22.

12. Попов С.Ф., Мельников Б.И., Лагутин М.П., Курилов В.Я. Изуче-

ние капоулообразованяя у возбудителя сапа // Микробиол. журн.~ 1991.- х. 53, & Г.- С.90-32.

13. Попов С.Й., Нурялов В.Я., Мельников Б.И. Особенности павази-

тирования возбудителя мелиоидоза в клетках хозяина // %рн. микробиол.- 1991,- № 10.- C.I2-I4.

14. Попов С.Ф., Мельников Б.И., Курилов В.Й. Ультраструктурная

характеристика возбудителя сада и его взаимодействие с фагоцитами в ткроорганизме // Тез. докл. У1 Всероссийского съезда микробиологов, адлдевдологов и паразитологов (г.Нижний Новгород, 1991 г,} - M., 1991.- Т. П.-С. 267-268.