Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение чувствительности возбудителей сапа и мелиоидоза к антибактериальным препаратам с целью совершенствования схем экстренной профилактики и лечения вызываемых ими заболеваний

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение чувствительности возбудителей сапа и мелиоидоза к антибактериальным препаратам с целью совершенствования схем экстренной профилактики и лечения вызываемых ими заболеваний"

сд

На правах рукописи

Батманов Виктор Павлович

ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ С ЦЕЛЬЮ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ СХЕМ ЭКСТРЕННОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВЫЗЫВАЕМЫХ ИМИ ЗАБОЛЕВАНИЙ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

САРАТОВ - 1998.

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте

Научный консультант: профессор, доктор медицинских наук

В.И.Илюхин

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, профессор, доктор медицинских

наук Л.В.Самойлова

профессор, доктор медицинских наук Т.И.Анисимова

профессор, доктор медицинских наук И.В.Рыжко

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт военной медицины МО РФ. г. Санкт-Петербург

Защита состоится 16 декабря 1998 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 074.32.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г.Саратов, Университетская,46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб". 1 _—

Автореферат разослан / у) ¿--у 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Г.А.Корнеев

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Сап и мелиоидоз - тяжелые инфекционные Золевания. поражающие как человека, так и многие виды животных, юследние 'два десятилетия мелиоидоз обнаруживается далеко за зделами ранее известных эндемичных территорий Юго-Восточной га, и в настоящее время его очаги выявлены в Австралии, в стра-с Центральной и Южной Америки, Западной Африке и даже в Европе )анция). Заболеваемость сапом'на текущий момент встречается в 1ГОЛШ, Турции. Ираке, Индии. Индонезии и в странах Латинской ¡рик'и. Постоянные торговые, культурные и транспортные связи с [ми регионами создают опасность заноса этих инфекций на терри-)ИЮ России.

Возбудители сапа - Pseudomonas(Burkholderia) mallei и мелиои-ia - Pseudomonas(Burkholderla) pseudoraallel являются одними из :менее изученных патогенных микроорганизмов. До эры антибиоти-: и сульфаниламидов это были неизлечимые заболевания, приводив! при острых формах практически к 100% летальности(Цветков.Чер-;. 1947;Fournler, Chambón, 1958; Mayer, 1981).. Тяжесть клинического течения и природная устойчивость возбу-елей к большинству антибактериальных препаратов обусловливают чительные трудности при лечении этих инфекций. Внутриклеточная локализация клеток P.mallei и Р.pseudoraallel, окий уровень вирулентности и вариабельность их биологических йств нё позволяют перенести на сап и мелиоидоз принципы химио-апии. отработанные на других инфекциях, без дополнительного тического осмысления. .

Информация о лечении сапа и чувствительности его возбудителя овременным химиопрепаратам за последние годы в доступной лите-уре представлена редкими несистематизированными упоминаниями azas.Seguí. 1979; Bloch et al.. 1982; Russo et al., 1981; Al-Iz-Al-Bassam,1989; Лозовая,1989; Илюхин и др.1994; Степаншин и 1994; Манзенюк и др. 1994;1995;1996 ).

Способность возбудителей сапа и мелиоидоза персистировать. в эофагахШопов и др. ,1995), определяет необходимость использо-■1Я препаратов, которые преодолевают цитоплазматические мембра-эукариотических клеток и концентрирувтся в фаголизосомах, сох-1я при этом антибактериальный потенциал. Все это обусловливает

необходимость дальнейшей разработки новых рациональных схем хим отерапии сапа.

Сочетанное использование химиопрепаратов может предупрежда или замедлять формирование устойчивости, а в случае синергидно действия - усиливать антибактериальный эффект и уменьшать до препаратов. Совместное применение лекарственных препаратов с ра ными механизмами действия или различиями в-Фармакокинетике явл ется основным способом повышения эффективности лечения и соста ляет ведущую тенденцию в развитии современной клинической хими терапии(Навашин,Сазыкин.1985).

Сульфаниламиды - основная группа препаратов, рекомендуем, для лечения сапа и мелиоидоза, но отмеченное формирование резм тентности к ним в процессе лечения (Eghbal et al.,1953; М1г Chai sy et al.,1954; Fournler. Chambon.1958; So et al.,1983). а так: недостаточная санирующая активность при экспериментальных инфе] циях (Манзенюк с соавт.1994) требуют совершенствования лечебн! схем.

Установлено, что триметоприм потенцирует антибактериальн; активность сульфаниламидов (Bushby, Hltchlngs, 1968; Bushby, 196'. Darrell et al.,1968). Выраженное синергидное действие сочетай! сульфаниламидов с триметопримом In vitro против большой груш грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, включг Р. mal lei и P.pseudomallel, отмечена рядом авторов {Basset.197] Burman,1986;1986; Everett.Kishimoto,1973; Лозовая,1989).

Показана высокая эффективность сочетания сульфаметоксазола триметопримом при лечении заболеваний, вызываемых микроорганизме ми, характеризующимися внутриклеточным расположением возбудителя что связано со способностью ■ обоих препаратов проникать внутр клетки (Quintillani et al..1987).

В 1975 г Kerry и Hamilton-Miller обратили внимание на то. чт сочетанное использование рифампицина с триметопримом обладает си нергидным действием. В последующих исследованиях Emmerson е al..(1978) подтвердили эффективность лечения людей сочетанием ри фампицина с триметопримом.

Все вышеизложенное свидетельствует о целесообразности изуче нпя in vivo комбинации сульфаниламидных препаратов с триметопри мом и рифампицином протиЕ P.mallei и P.pseudomallei.

В настоящее время имеются новые антибактериальные препарата.

значительно отличающиеся по активности, фармакокинетике и другим свойствам от своих предшественников. Их активность в отношении возбудителей сапа и мелиоидоза в сравнительном аспекте не изучена. К числу таких препаратов относятся полусинтетические тетра-циклины пролонгированного действия: миноциклин. доксициклин. ме-тациклин: комбинированные сульфаниламиды: сульфазин+триметоприм. сульфаметоксазол+триметоприм(СМЗ: ТМП). сульфамонометоксин+трпмо-топрим(сульфатон). фторхмнолоны; ципрофлоксацин. офлоксацин. норфлоксашш, пефлоксацин и их различные сочетания.

Ряд авторов (Arakawa.1990; Goiledge et al.,1992; Sauerwein et aI..1992; Suputtamongko1 et al.,1994: Turner et al.,1994 и др.) сообщает об улучшении состояния больных мелиоидозом при использовании одного цефтазидима или в комбинации с другими препаратами. Однако Currie et al..(1993) отмечают, что летальность больных достигает 36%. несмотря на лечение цефтазкдимом на Фоне интенсивного ухода. Кроме того есть сообщения о природной резистентности P.pseudomallei к цефтазидиму и ко-тримоксазолу(Уогас1111 et al.. 1993).

В работах отечественных и зарубежных исследователей изучение химиотерапевтической активности препаратов проводилось на различных видах лабораторных животных и в не стандартных условиях эксперимента, что затрудняет сопоставление результатов и не дает четкой картины эффективности сульфаниламидов и других антибактериальных препаратов при экспериментальном сапе и мелиоидозе. Эти исследования проводились, как правило, на одном штамме, что затрудняет экстраполяцию полученных данных на штаммы, выделенные в различных регионах.

Учитывая, что на сегодняшний день нет средств специфической профилактики этих заболеваний, а набор эффективных препаратов, используемых для лечения крайне ограничен, понятна актуальность проблемы разработки эффективных схем лечения сапа и мелиоидоза. которые были проведены в рамках 20 государственных тем выполнявшихся по заданию Межведомственной проблемной комиссии в течение 1973-1998 гг.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Оценка активности антибактериальных препаратов различных групп против P.mallei и P.pseudomallei, отбор наиболее эффективных средств и их сочетаний для разработки и совершенствования схем экстренной профилактики и лечения сапа и мелиоидоза.

- 6 -

В ЗАДАЧИ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВХОДИЛО:

1.В опытах in vitro отобрать наиболее активные против Р.mal-lel и Р.pseudomallei химиотерапевтические препараты для их исследования при экспериментальном сапе и мелиоидозе.

2.Оценить химиотерапевтическую эффективность препаратов и их сочетаний при экспериментальном сапе и мелиоидозе на различных по чувствительности к инфекциям лабораторных животных.

3. Определить эффективность комплексного лимфотропного соединения доксициклина гидрохлорида с высокомолекулярным декстраном для профилактики экспериментального сапе.

4. Изучить влияние простых, комбинированных сульфаниламидов и наиболее активных сочетаний, а также доксициклина и полимиксина на ультраструктуру возбудителей сапа и мелиоидоза.

5.Показать роль L-вариантов возбудителей мелиоидоза и сапа в Формировании латентных форм1 заболевания в процессе химиотерапии, оценить существующие и предложить дополнительные критерии изле-ченности инфекции. Изучить возможность расширения круга используемых критериев излеченности при экспериментальном сапе и мелиоидозе.

6. Провести патоморфологические исследования при лечении экспериментального сапа(доксициклином, сульфамонометоксином и ри-фамлицином) и мелиоидоза(доксициклином).(Как один из контролей излеченности).

7. Разработать схемы экстренной профилактики и лечения сапа и мелиоидоза полусинтетическими тетрациклинами, фторхинолонами, комбинированными сульфаниламидами ' и их сочетаниями с рифампици-ном.

8. Выдать рекомендации по подходам к оценке препаратов при экспериментальных инфекциях и перспективам дальнейших исследований по лечению сапа имелиоидоза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Впервые в рамках одной работы представлены результаты комплексного сравнительного исследования по чувствительности 13 штаммов Pseudomonas (Burkholderia) mallei и 21 штамма Pseudomonas (Burkholderia) pseudomallei к 44 антибактериальным препаратам различных групп и проведено изучение эффективности наиболее активных сульфаниламидов, тетрациклинов, фторхинолонов и их различных сочетаний при экстренной профилактике и лечении экспериментального сапа и мелиоидоза при подкожном и аэрогенном заражении с .

последующим контролем излеченности.

ИССЛЕДОВАНИЯ IH VITRO

Установлено, что против P.mallei In vitro высокоактивны препараты следующих групп: тетрацнклины (наиболее активны-миноппклпн и доксициклин - ингибиторы синтеза белка на уровне 30S рибосом), сульфаниламиды (бактрим и сульфатон - подавление синтеза пуринов). фторхинолоны (ципрофлокоацин и офлоксацин - подавление ДНК-гиразы. субъединица А), аминогликозиды (спссмпцин, нетнлк;ги;1и - подавление синтеза белка на уровне 30S рибосом), а также ново-биоцин. имипенем и цефтазидим. а против P.pseudomallei круг активных in vitro препаратов существенно уже: миноциклин и доксициклин. ципрофлоксацин и офлоксацин. бактрим, сульфазин, новебио-цин, цефтазидим и имипенем.

Впервые показано, что чувствительность исследуемых псевдомонад к антибактериальным препаратам существенно может изменяться в зависимости от рН и температуры окружающей среды (параметры -в пределах физиологически возможных для макроорганизма).

-В результате выполненной работы впервые изучены ультраструктурные изменения клеток возбудителей сапа и мелиоидоза под влиянием ряда антибиотиков (доксициклина. рифампицина. полимиксина). сульфаниламидов (сульФазина. сульфамонометоксина). комбинированных сульфаниламидов (бактрима. . сульфатона) и их сочетаний с ри-фаипицином.

Установлено, что воздействие 'отдельных препаратов вызывает деструкцию внутренних структур клеток P.mallei и P.pseudomallei при сохранности клеточных оболочек. Сочетанное же воздействие бактрима с риФампицином и сульФазина с рпфамппщшом приводило к повреждению всех слоев клеточной стенки, включая пептидогликано-вый слой, и образованию сферопластов. что свидетельствует о сп-нергидности их действия in vitro на P.mallei и P.pseudomallei и перспективности использования для лечения.

САП

Впервые выявлен сине-ргидныи эффект восьми различных комбинаций антибактериальных препаратов при экспериментальном сапе. Так, статистически достоверное повышение эффективности лечения отмечено у следующих сочетаний: сульФазина с триметопримем и с рпфамппщшом, бактрима с рифампицином. сульфатона с рифамипицином, тетрациклина с рифампицином. сульФазина с рифампицином, сульфамонометоксина с рифампицинсм. сульфазина с триметопримом и сульфамо-

нометоксина с триметопримом.

Приоритетными являются результаты по повышению эффективности лечения сапа комплексным соединением доксициклина гидрохлорида с высокомолекулярным декстраном. Новизна этих исследований подтверждена патентом. (ПАТЕНТ N2083207 на ИЗОБРЕТЕНИЕ "Способ лечения экспериментального сапа у золотистых хомячков //Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 10 июля 1997- г. Приоритет изобретения от 23.08.94 г. Заявка 94031016). .

Дана комплексная сравнительная оценка антибактериальных препаратов при экспериментальном сапе (МПК. ультраструктурные изменения клеток, влияние температуры и рН на чувствительность к препаратам, эффективность лечения на различных видах лабораторных животных и при использовании различных по месту выделения штаммов. определение индексов эффективности, изучение формирования резистентности в процессе лечения и проведение патоморфологичес-ких исследований).

Наиболее эффективны при профилактике сочетание сульфазина с триметопримом и с рифамппцином (ИЭ-7,5*105) и миноциклин (ИЭ-5.О*105). которые на порядок эффективнее всех других исследованных нами препаратов и их сочетаний. Все остальные препараты (доксициклин. хлортетрациклин, сульфамонометоксин и сульфазин) и их сочетания, кроме сульФалена, обладали практически одинаковой эффективностью при профилактике экспериментального сапа (6, 3» 104 -Э, 0* 103 >.

Показано, что сульфамонометоксин. сульфатон. бактрим и доксициклин были высокоэффективны при сапной инфекции, вызванной пятью различными по месту выделения штаммами, причем доксициклин защищал золотистых хомячков и при аэрогенном заражении.

Установлена статистически достоверная зависимость эффективности лечения сапа от продолжительности введения препаратов и их сочетаний.

При изучении формирования устойчивости In vivo у P.mallei к рифампицину и сульфамонометоксину показано, что резистентность у возбудителя сапа к этим препаратам не формируется, aj при использовании рифампицина, имеет место персистирование бактерий.

Нами с помощью иммунологических методов исследования(ТИФА) подтверждена высокая санирующая активность комбинированных сульфаниламидов ( сульфаметоксазола с триметопримом. сульфатона. сульфазина с триметопримом) и их сочетаний с рифампнцином. а также

показана зависимость полноты санации организма животного от длительности введения лекарственных препаратов.

Показано, что L-формы P.mallei у животных, выживших в процессе лечения экспериментального сапа комбинированными сульфаниламидами и их сочетаниями с рифампицином. не выделяются, что свидетельствует о высокой санирующей активности и надежности этих препаратов.

При моделировании экспериментального сапа на морских свинках установлена высокая эффективность лечения следующими сочетаниями: сульфаметоксазола с триметопримом. сульфазина с триметопримсм и сульфамонометоксина с триметопримом (сульфатон).

Доказано, что из тетрациклинов миноциклин является наиболее эффективным препаратом. Доксициклин обладал практически такой же эффективностью, что и хлортетрациклин. Результаты бактериологического и гистологического исследований свидетельствуют о высокой эффективности доксициклина при экспериментальном сапе.

.-Установлено, что ципрофлоксацин. офлоксацин и пефлоксацин высокоэффективны' при экспериментальном сапе, моделируемом на золотистых хомячках и морских свинках, однако при аэрогенном заражении офлоксацин был неэффективен. Наиболее активным In vitro и эффективным in vivo оказался ципрофлоксацин.

В результате проведенных исследований отработаны и предложены схемы(14 вариантов) экстренной профилактики и лечения сапа следующими комбинациями препаратов: _ сульФазином с триметопримсм и рифампицином. бактримом и его сочетанием с рифампицином:" сочетанием сульфазина с триметопримом. сульфазина с рифампицином. сульфатен?, с рифампицином. миноциклином. доксициклином. тетрациклином с рифампицином. сульфатоном, ципрофлоксацином. офлоксацином. пефлок-сацином, сочетанием сульфамонометоксина с рифампицином. сульфамо-нометоксином, даны-'рекомендации по применению указанных препаратов и их сочетаний для профилактики и лечения сапа у людей ¡вошедшие в семь инструктивно-методических материалов), определены пути дальнейших исследований по этой проблеме.

Показано, что хиноксидин. диоксшшн. гентамицин. тобрахквин. сисомицин. левомицетин. ампициллин, карбенициллин. 'пефлоксацин. рифампицин и натриевая соль рифампицина неэффективны при экспериментальном сапе моделируемом на золотистых хомячках.

МЕЛИ0ИД03

Установлено, что развитие рецидивов заболевания связано с персистенцией Р.рзеи<Зота11е1 в организме биопробных животных в виде Ь-форм, которые сохраняют патогенные свойства, проявляя их при реверсии.в исходный бактериальный вид. Реверсия возможна при снижении иммунного статуса экспериментальных животных, что мы получали с помощью иммунодепрессанта - циклофосфана.

Доказано, что при мелиоидозе носительство Ь-форм в макроорганизме сопровождается развитием гиперчувствительности замедленного типа. Исследования впервые показали при оценке химиотерапии целесообразность определения гиперчувствительности замедленного типа и поиска возбудителя мелиоидоза в виде Ь-вариантов. На наш взгляд, данные критерии могут иметь решающее значение в предупреждении рецидивов заболевания.

Нами показано, что на золотистых хомячках экспериментальный мелиоидоз тетрациклинами не лечится. В опытах на белых крысах леченных тетрациклином и доксициклином выявлена достаточно высокая выживаемость.

Проведенные патоморфологические исследования свидетельствуют об эффективности лечения экспериментального мелиоидоза белых мышей доксициклином. Причем отмечалась прямая зависимость гистологических изменений качественного и количественного характера патологического процесса от величины дозы препарата и продолжительности лечения.

Установлено, что при экспериментальном мелиоидозе, моделируемом на золотистых хомячках и белых мышах , неэффективны исследованные нами фторхинолоны - ципрофлоксацин. офлоксацин. пефлокса-цин и норфлоксацин. При моделировании мелиоидоза на белых крысах при подкожном заражении офлоксацин защищал 100% зараженных животных, но был неэффективен при. аэрогенном заражении.

Впервые показано, что сочетанное использование сульфатона с ципрофлоксацином при экспериментальном мелиоидозе белых мышей высокоэффективно. ;

На основании представленных материалов рекомендован следующий подход по оценке в профилактике и лечении исследуемых препаратов при мелиоидозе: первичная оценка дается на основании эффективности лечения при подкожном заражении наиболее чувствительной модели минимальными заражающими дозами, а окончательная оценка - после полного изучения эффективности на двух или трех различных по

- и -

чувствительности к инфекции видах животных с заключительным опытом лечения аэрогенно 'зараженых животных.

В качестве доступной экспериментальной модели для проверки химиотерапевтических препаратов при мелиоидозе может быть предложена белая крыса, на которой возможно моделирование как острых септических, так и хронических форм заболевания.

К критериям полноты излеченности перенесенного экспериментального мелиоидоза(у всех лабораторных животных) следует отне'ти стойкую нормализацию температуры, положительную динамику измени ния веса тела, отрицательные результаты исследований на обнаружь ние типичных и морфологически измененных Форм возбудителя и отсутствие аллергической реакции.

На золотистых хомячках хиноксидин и диоксидин. рифамиицин. аминогликозиды - гентамицин. тобрамицин и сисомицин. левомицетнн. ампициллин и карбенициллин были неэффективны.

Полученные результаты исследований эффективности химиотерч певтических препаратов, проведенных на четырех видах экспериментальных животных, включая высокочувствительную модель(золотисты^ хомячки), а также резистентную (белые крысы), позволили рекомендовать для лечения мелиоидсза у людей сочетания - сульфазина с триметопримом и с рифампицином, сульфаметоксазола с триметопримом и с рифампицином. сульфаметоксазола с триметопримом. сочетание сульфазина с триметопримом или с рифампицином. сульфатона с рифампицином. сульфаметоксазол с триметопримом. миноциклин и докси-циклин, сульфатон с ципрофлокеацином, сульфатон.

Применение сульфаметоксазола с триметопримом было также высокоэффективно в лечение легочного мелиоидоза белых крыс.

В результате проведенных исследований отработаны и предложены для лечения людей И схем лечения мелиоидоза следующими препаратами -и их комбинациями: сульфазина с триметопримом и с рифампицином. сульфаметоксазола с триметопримом и с рифампицином, сульфазина с триметопримом. сульфазина с рифампицином. сульфаметоксазола с триметопримом, сульфамонометоксина с триметопримом, сульфа-монометоксина с рифампицином. сульфамонометоксина с триметопримом (сульфатон) и с рифампицином. сульфатона с ципрофлокеацином, миноциклином. доксициклином.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ: Полученные при выполнении работы данные вошли в ряд инструктивно-методических документов используемых для оценки антибактериальных препаратов при экспериментальном са-

пе и мелиоидозе.

Разработано 14 схем экстренной профилактики и лечения сапа и-11 схем для экстренной профилактики и лечения мелиоидоза. Даны ■ рекомендации по экстренной профилактике и лечению сапа и мелиоидоза для лиц. работающих с этими возбудителями в лабораторных условиях. Материалы диссертации используются в курсе лекций для специалистов по особо опасным инфекциям в противочумных институ-.

Результаты исследований вошли в следующие документы:

-"Инструкция по единой методике экспериментального изучения и клинических испытаний новых антибиотиков и химиопрепаратов для экстренной профилактики и лечения опасных инфекционных заболевании. -М: МЗ СССР.-1980.-19 с.

-"Методические рекомендации по экстренной профилактике и лечению сапа и мелиоидоза", утверждены директором Волг.НИПЧИ 10 апре-. ля 1982 г;

-"Методические рекомендации по профилактике и лечению особо опасных инфекций новыми антибиотиками и сульфаниламидными препаратами". утверждены директором Российского НИПЧИ "Микроб" 22 октября 1982 г:

-"Инструкция по экстренной профилактике и лечению' опасных инфекционных заболеваний", утверждена заместителем Министра здравоохранения СССР. М.. Военное издательство, 1984:

-"Методические указания по использованию антибактериальных препаратов в профилактике и лечении сапа и мелиоидоза". утверждены заместителем начальника ГУКИ МЗ СССР И.Д.Дрыновым 17 сентября 1585 г;

-"Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза" - методические рекомендации, утверждены заместителем председателя Госкомсанэпиднадзора России Г. Г. Онищенко 1 ноября 1994 г;

-"Лабораторная диагностика, лечение и профилактика сапа",- методические рекомендации, утверждены заместителем председателя Госкомсанэпиднадзора России Г.Г.Онищенко 16 марта 1995 г.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Сочетание комбинированных сульфаниламидов(сульфазин+триме-топрим, бактрим, сульфатон) с рифампицином высокоэффективно(си-, нергидный эффект) при экспериментальном сапе, а при мелиоидозе эффективны сочетания сульфазин+триметоприм+рифампицин. сульфаме-токсазол-»-триметоприм+р1[фампищш(с:!нергидный или аддитивный эф-

фект). при этом повышается санирующая активность сульфаниламидов.

2.Сочетания сульфаниламидов (сульфазина. сульфаметоксазола и сульфамонометоксина) с триметопримом высокоэффективны и при сапе (синергидный эффект), и при мелиоидозе (синергидный или аддитивный эффект).

3. Использование комплексного соединения доксициклина гидрохлорида с высокомолекулярным декстраном (полиглюкин) достоверно повышает эффективность лечения сапа и сокращает продолжительность введения препарата.

4. Препараты, имеющие своей мишенью структуры клеточной стенки. неэффективны при сапе и мелиоидозе. Наиболее перспективными при.лечении сапа и мелиоидоза являются препараты, подавляющие генетический аппарат бактериальной клетки - помимо сульфаниламидов (подавление синтеза пуринов), это также фторхинолоны (ннгиби-рование ДНК-гиразы) и ингибиторы синтеза белка - полусинтетические тетрациклины - миноциклин и доксициклин.

5. Полусинтетические тетрациклины' (миноциклин и доксициклинг. наряду с фторхинолонами(ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин). при наличии показаний (непереносимость сульфаниламидов, формирование резистентности к препарату и пр.). также могут быть использованы при экстренной профилактике и лечении сапа и мелиоидоза.

6. При лечении биопробных животных малыми дозами сульфазина или при проведении коротких курсов лечения возможно развитие устойчивости у возбудителя мелиоидоза к данному препарату. Резистентность у возбудителей сапа и мелиоидоза к рифампицину и суль-фамонометоксину в процессе лечения не формируется.

7. Развитие рецидивов заболевания мелиоидозом связано с пер-систенцией P.pseudomallel в организме биопробных животных в виде L-форм, которые сохраняют 5 случае реверсии свои патогенные свойства. В процессе лечения сапной инфекции L-формы P.mallei не выявлены. Наиболее эффективным способом оценки излеченности при экспериментальном сапе является поиск антигенов в суспензии органов с помощью ТИФА и оценка аллергического статуса макроорганизма.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Материалы диссертации доложены:

-на ежегодных заседаниях межведомственной проблемной комиссии с 1974 по 1992 гг (Доклады по полученным результатам);

- на конференции молодых ученых противочумной системы СССР, Волгоград. 1976 г:

-на научных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в 1982, 1987. 1988, 1989. 1990. 1991. 1993.1994, 1995, 1996. 1997 гг;

-на Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности особо опасных инфекций(Волгоград. 1992);

-на юбилейной конференции, посвященной 25-летию Волгоградского научно-исследовательского противочумного института(Волгоград. 1995);

-на 2 Российском национальном конгрессе "ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО", Москва. 1995 г; .

-на научно-практической конференции, посвященной 100 летию образования противочумной службы России. Саратов.1997.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликована 31 научная статья, получен один патент. Материалы диссертации вошли в. две коллективные монографии "САП"(1995) и "МЕЛИ0ИД03"(1995) под ред. Акад.РЭА, проф., д.м.-н. Н.Г.Тихонова.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 266 страницах машинописи. иллюстрирована 12 рисунками. 72 таблицами. Состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 7 глав собственных исследований. заключения, выводов. Список используемой литературы включает 127 работ отечественных и 230 работ иностранных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы.

В опытах использовали типичные по культуральным и морфологическим свойствам вирулентные для золотистых хомячков 13 штаммов возбудителя сапа и 21 штамм возбудителя мелиоидоза из коллекции Волгоградского ПЧИ, которые хранились в лиофилизированном состоянии при 4°С. Перед лиофилизацией все используемые в опытах штаммы были пассированы. P.mallei пассировали на золотистых хомячках и морских свинках, a p.pseudomallei - на белых мышах. Вирулентность пассированных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза (в DCL) колебалась от 10 до 100 м.к., на золотистого хомячка. Видовая при-

надлежность используемых штаммов подтверждена исследованиями, выполненными по схеме Gllardi.(Gilardi.1971).

Методы

Определение минимальных подавляющих концентраций

Бактерии выращивали на питательном бульоне "Difeo". Минимальные подавляющие концентрации (МПК) препаратов определяли методом двукратных серийных разведений в жидкой и плотной питательной среде. Посевная концентрация возбудителей на плотной среде составляла 1*106 м.к. За МПК принимали минимальную концентрацию препаратов с отсутствием видимого роста через 24 ч инкубации при 37°С у возбудителя мелиоидоза и через 48 ч - у возбудителя сапа. Ципрофлоксацин разводили до необходимой концентрации изотоническим раствором хлорида натрия, норфлоксацин растворяли в ледяной уксусной кислоте, офлоксацин и пефлоксацин - в диметилсульфокси-де. Остальные препараты растворяли в соответствии с их инструкциями по применению. МПК фторхинолонов и сульфаниламидов определяли на среде Muller-Hintcn.(Dlfco).

МПК и минимальные бактерицидные концентрации (МБК) тетрацик-линов и рифампицина определяли в жидкой питательной среде (Antibiotic medium 3. Dlfco). Посевная доза возбудителей в данном случае составляла 1*10"* м.к. За МПК антибиотика принимали ту концентрацию. при которой отсутствовал видимый рост в бульо.не.

Для определения бактерицидной концентрации из пробирок с отсутствием видимого роста производили посев на агар через 24 ч -инкубации с антибиотиком у возбудителя мелиоидоза и через 48 ч у возбудителя сапа. Через 48 ч инкубации чашек в термостате отмечали ту наименьшую концентрацию антибиотика в пробирке, посев из которой не дал роста на чашке с агаром.

Влияние температуры н рН среды на чувствительность патогенных . псевдомонад к антибиотикам

, Для испытаний были отобраны типичные штаммы псевдомонад из коллекции Волгоградского ПЧИ: P.aeruginosa 4000 и РАО-1. P.mallei 10230 и Ц-5. P.pseudomallei С-141 и 57576. P.cepacia 25416 и 8236. Предварительное подращивание культур проводили в течение 18-20 ч в триптиказо-соевом бульоне ТСБ (Dlfco) при соответствующей температуре, антибиотики испытывали на плотной среде Antibiotic medium 3 (Dlfco). в которой рН определялся фосфатным буфером (6,0; 7.2 и 8.0). Одну каплю бульонной культуры различных видов наносили на сектора агара, помещали в термостат с температурой

30°. 37° II 41°С. Учет опыта и расчет МПК проводили через 24 и 48 ч.

Моделирование экспериментальной инфекции

Экспериментальный сап моделировали на морских свинках и золотистых хомячках. Морских свинок (Cavia cobaya) заражали подкожно суспензией суточной агаровой культуры P.mallei Ц-5 в изотоническом растворе хлорида натрия в дозе 1 * 1 о6 м. к.. что составляло 10 Loso- Пол животных в опытах не учитывался. Лечение начинали через 24 ч после заражения и проводили в течение 15 сут. Золотистых хомячков (Mesocricetus auratus) заражали подкожно суспензией суточной агаровой культуры P.mal lei 10230 в изотоническом растворе хлорида натрия.в дозе 1*103 м.к., что составляло 10-100 DCL. Экспериментальный мелиоидоз моделировали на золотистых хомячках, белых мышах, морских свинках и белых крысах, которых подкожно заражали суточной агаровой культурой P.pseudomallei в дозах составлявших 10 - 100 DCL и вызывавших генерализованную инфекцию у животных.

Таблица 1.

Животные

Характеристика экспериментальных животных, использованных в

работе

п/п Вид Порода. ■ линия Возраст Живая масса

i. Cavia cobaya Гладко- 2.5-3 мес 300-400 г

(Морские свинки) шерстная 150-220 г

2. Rat tus norvegicus . Белые 3.5-4,5 мес

(Крысы) 100-150 Г

3. Mesocricetus auratus Коричневые 2,5-4 мес

(Золотистые хомячки)

4. Mus musculus L. Белые 50-80 дней 16-22 г'

(Мыши)

Лечение экспериментальной инфекции

Все препараты вводили один раз в сутки при экстренной профилактике через 3 ч. ас целью лечения - через 24 и 48 ч после заражения. Профилактическое лечение проводили в течение 10. а лечение - 15 дней. Все сульфаниламиды и их сочетания с триметопримом и рифампицином. тетрациклины. левомицетин, офлоксацин, пефлокса-цин. норфлоксацин. эритромицин, розамицин, новобиоцин, налидиксо-вая кислота, хиноксидин. диоксидин - вводили перорально. ципроф-локсацин - внутримышечно морским свинкам и внутрибрюшинно золотистым хомячкам. Все пенициллины. цефалоспорины и аминогликозиды евсдили внутримышечно.

Критерии оценки

Об эффективности лечения сапа и мелиоидоза судили по проценту выживших животных, средней продолжительности жизни "опытных" животных. ИЭ. результатам бактериологического и серологического ■исследования, наличию L-форм.

Препарат считали эффективным, если он защищал не менее 50-животных. зараженных 10 DCL каждого из возбудителей при ЮС" гибели животных в контроле. Выживших животных вскрывали на ео-Г" > сут после заражения и производили посев внутренних органов (легкие. кровь, печень, селезенка) на питательный агар ("Difco"). Через 48 ч учитывали результаты и судили о санирующем действии препаратов.

Наиболее эффективные препараты изучали при сапной и мелиои-дозной инфекциях, вызванных различными по месту и источнику выделения штаммами. Кроме того ставили аллергическую пробу, проводил;: поиск антигенов с помощью ТИФА, выяеляли латентную форму инфекции (циклофосфан), проводили поиск L-Форм и патоморфологические исследования.

Заключительное изучение эффективности проводили на пяти штаммах возбудителя сапа (10230: Иванович: Будапешт. Р-1. Ц-4) и четырех штаммах возбудителя мелиоидоза (59361: С-141; 56812 и 100).

Использование комплексного соединения доксициклина с высокомолекулярным декстраноп (полиглюкнн) при лечении экспериментального сапа.

Золотистых хомячков массой 120 г заражали подкожно в область паховой складки P.mallei 10230 в дозе 500 м.к.. что соответствует 200 ЛД50. Через три часа после заражения в эту же лапку подкожно вводили одной группе животных - доксициклина гидрохлорид в дозе 1 мр-в.0.2 мл полиглюкина на одно животное. Другой группе зараженных животных вводили 1 мг доксициклина гидрохлорида в 0.2 мл Физиологического раствора. Кратность введения препаратов - один раз в сутки в течение 5 сут. Срок наблюдения за зараженными и леченными животными не менее 30 суток с момента заражения. Раствор вышеуказанного препарата готовили следующим образом: 30 мг доксициклина гидрохлорида растворяли в 6 мл полиглюкина. получали концентрацию 5 мг на 1 мл. пять часов выдерживали в холодильнике (+8° С). Затем препарат вводили зараженным животным, (аналогично готовили взвесь доксициклина гидрохлорида в физиологическом растворе в такой же концентрации).

- 18 -

Статистическая обработка результатов

Достоверность полученных различий опытных групп по сранению с контролем заражения определяли по методу Фишера, а достоверность различий между леченными группами методом сравнения по процен-" тамт и методом X2 (хи-квадрат) (Генес. 1964). LD50 - по методу Кербера. индекс эффективности (ИЭ) определяли сопоставлением LDS0 для леченных и нелеченных животных (Сепетлиев.1968).

Определение доверительных границ генеральных параметров (генеральная средняя М и генеральная доля Р) для' определения LD50 леченных и нелеченных животных (данные минимум трех опытов) проводили с использованием алгоритма 12 (Плохинский.1980) и, в соот-ретствии с руководством "Биометрия" (Лакин,1990).

В качестве контроля излеченности в ряде опытов проводили гистологические исследования органов выживших животных.

Методика подготовки материала к электронно-микроскопическому

исследованию в ультратонких срезах

Для фиксации бактериальных клеток использовали двойную глюта-ральдегидно-осмиевую фиксацию (Гайер, 1974).

Подготовку бактериальных клеток возбудителей сапа или мелиоидоза. проводили в условиях, соответствующих требованиям "Санитарных правил СП 1.2.011 - 94. Безопасность работы с микроорганизмами 1 - 2 групп патогенности".

Изучение степени излеченности при химиотерапии экспериментального сапа

В опытах использовали два штамма P.mallei (10230 и Ц-5) и следующие препараты - сульфазин, сочетание сульфамонометоксина с триметопримом 2,5:1(сульфатон), сочетание сульфаметоксазола с триметопримом 5:1(бактрим). триметоприм, рифампицин, которые в отдельности и в сочетании друг с другом обладали высокой эффективностью при экспериментальном сапе. Моделирование инфекции и лечение проводили по методике, описанной выше.

Выживших животных вскрывали на 40-60 сут после заражения и производили посев суспензии внутренних органов (легкие, кровь, печень, селезенка) на Nutrient Agar (Difco) с 5% глицерина. Через 48 ч учитывали результаты и судили о санирующем действии препаратов. О принадлежности выделенных культур к P.mallei судили по морфологии колоний и агглютинации специфической сывороткой. В ряде опытов для выявления латентных форм инфекции применяли иммуно-депрессант - циклофосфан, который вводили подкожно в конце срока

наблюдения (45-60 сутки) в дозе 10 мг/кг веса животного. При постановке аллергической пробы в качестве аллергена использовали маллеин, который вврдили в подушечку лапки в объеме 0,05 мл морским свинкам и золотистым хомячкам. Оценку проводили через 24 ч после введения препарата по разнице в весе контрольной и "опытной " лап. Разницу в весе до 7% учитывали как отрицательную, от 8 до 14% как сомнительную и свыше 15% - положительную. Для поиска сапного антигена использовали Сэндвич-вариант ТИФА (Malollnl.Masse-yeff,1975) с разработанной А.Т.Яковлевым с соавт..(1991) иммунной тест системой.

Выделение L-форм проводили по методике, описанной В.С. Зама-раевым с соавт.,(1987).

Изучение степени излеченности при химиотерапии экспериментального мелиоидоза

В опытах использовали три штамма Pseudomonas pseudomallel (С—141, 57576 и 100) и следующие антибактериальные препараты: сульфазин и сочетание сульфаметоксазола с триметопримом 5:1(Бакт-рим).

Эксперименты проводили на морских свинках весом 350-400 г и белых крысах весом 150-200г. Животных заражали суспензией суточной агаровой культуры возбудителя мелиоидоза в 0.85% NaCl. Подкожное заражение осуществляли по общепринятой методике, в область внутренней поверхности бедра. Заражающую дозу бактерий в опытах оценивали по величине ЛД50 . рассчитанной по методу Кербера(Се-петлиев, 1968).' Животных лечили один раз в день введением per оз суспензии соответствующего препарата в подсолнечном масле. При выборе доз для каждого вида животного использовали схему перерасчета по поверхности тела с учетом максимально переносимых концентраций данного препарата при различных методах введения. Лечение. Начинали через 24 или 48 ч после заражения, а в ряде опытов по появлению клинических признаков заболевания'(достоверному повышению температуры), и продолжали в течение 15. 30, 40 дней. От павших и забитых биопробных животных методом отпечатков делали посевы из внутренних органов: легких, печени, селезенки и крови на пластинки питательного агара фирмы " Дифко". Выделение и идентификацию L-форм проводили по ранее описанной методике (Замараев с соавт..1987). Для выявления латентных форм инфекции применяли иммунодепрессант - циклофосфан. который вводили подкожно в конце срока наблюдения ( 60 сут) в дозе 200 мг/кг веса животного.

Аллергическая проба(ГЗТ).В качестве аллергена использовали маллеин, который в объеме 0,1 мл вводили внутрикожно морским свинкам и белым крысам в предварительно бритую боковую поверхность спины или в том же объеме интраплантарно. Аллергическую пробу'оценивали через 24 ч после введения препарата. Внутрикожную аллергическую пробу оценивали по величине инфильтрата. Инфильтрат диаметром менее 3 мм расценивали как отрицательную аллергическую пробу, от 3 до 7 мм как сомнительную. 8 мм и более как положительную. При интраплантарном введении маллеина аллергическую пробу оценивали по разнице в весе контрольной и"опытной" лап. Различие в весе до 7% учитывали как отрицательную аллергическую пробу, от 8 до 14% как сомнительную, и свыше 15% как положительную.

Серологические исследования, направленные на на поиски антител проводили следующим методом. У животных забирали кровь из сердца после полной ретракции сгустка декантировали сыворотку, добавляли мертиолят натрия (1:10000) и прогревали при 56° С в течение 30 мин. В качестве сенситина для получения антигенного ди-агностикума использовали антиген Буавена из клеток штамма P.pseu-domallel С-141, его же применяли в РСК. Обе реакции ставили с сыворотками больных животных по общепринятым методикам.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛШЩОЗА К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ

На плотных питательных средах установлено, что все штаммы возбудителя сапа чувствительны к стрептомицину, канамицину. ген-тамицину. сисомицину.амикацину. тобрамицину и эритромицину в про' тивоположность штаммам возбудителя мелиоидоза, которые высокорезистентны к этим антибиотикам. МПК новобиоцина и рифампицина для P.mallei составляли 0,5-0,1 и 5,0-25 мкг/мл, в то время как для P.pseudomallel они находились в пределах 5,0-100 и 25-250 мкг/мл соответственно(табл.2).

Кроме того, все штаммы возбудителя сапа высокочувствительны к сочетанию сульфаметоксазола с триметопримом(СМЗ:ТМП) , сульфази-ну, сульфамонометоксину, сульфатону, цефтазидиму, имипенему, цип-рофлоксацину, офлоксацину и пефлоксацину, в то время как МПК этих препаратов для возбудителя мелиоидоза в 10-20 раз выше.

Налидиксовая кислота оказывала практически такое же действие как и рифампицин: МПК составляла 5,0-25 мкг/мл для P.mallei и 10,0-250 мкг/мл для P.pseudomallei.

Различие в чувствительности возбудителей сапа и мелиоидоза к

левомицетину было незначительным и МПК для P.mallei была в пределах 10.0-100 мкг/мл. а для P.pseudomallei 25,0-100 мкг/мл.

Все антибиотики тетрацнклиновой группы были высокоактивны in vitro против возбудителя сапа и умеренно активны против возбудителя мелиоидоза.

Поскольку в настоящее время из антибиотиков тетрациклины стоят на первом месте по эффективности при сапе(Манзенюк с со-авт.,1995) и мелиоидозе (Hezeicks.Nigg.1958; Gegathesan et al.,1972; Chofnas.1972 и др.). мы считали целесообразным определить МПК и МБК изучаемых, полусинтетических тетрациклпнов(миноцик-лина, доксициклина и метациклина) в сравнении с активностью хлср-тетрациклина в жидкой питательной среде. Значительный интерес представляло также более детальное изучение антибактериальной активности - рифампицина и фторхинолонов (ципрофлоксацина, офлокса-цина, норфлоксацина, пефлоксацина).

Чувствительность возбудителей сапа и мелиоидоза к тетрацикли-

нам н рифашицину в жидкой питательной среде.

По результатам опытов, проведенных in vitro, установлено, что МБК миноциклина. доксициклина и метациклина в 2 - 4 раза превышают МПК этих антибиотиков для всех штаммов возбудителя сапа. В то время как МБК хлортетрациклина и рифампицина в 2 - 8 раз превосходят МПК для возбудителя сапа.

По бактериостатическому действию против P.mallei доксициклин и метациклин в 3.4-4 раза активнее хлортетрациклина. а по бактерицидному эффекту превосходят хлортетрациклин з 8.8-9,5 раза. Ми-ноциклин в 2,2 раза активнее хлортетрациклина.

Все исследованные штаммы возбудителя мелиоидоза были менее чувствительны к исследованным антибиотикам и. в отличие от возбудителя сапа, бактерицидные концентрации этих антибиотиков во много раз превышали бактериостатические. Так. в зависимости от штамма возбудителя мелиоидоза. бактерицидная концентрация миноциклина в 4 - 34 раза, доксициклина в 4 - 138 раз. метациклина в 8 - 69 раз. хлортетрациклина б 8 - 69 раз и рифампицина в 12 - 125 раз превышала бактериостатические концентрации.

При сопоставлении значений МБК доксициклина. миноциклина и метациклина для большинства штаммов возбудителя сапа (0.03 - 0.25 мкг/мл) и мелиоидоза (3.1 - 50 мкг/мл) с достижимыми концентрациям! антибиотиков в крови и тканях человека видно, что терапевтически значимыми эти концентрации будут только для возбудителя са-

Таблица 2.

Чувствительность возбудителей сапа и мелиоидоза к химиотерапевтическим препаратам(мкг/нл)

Препараты Диапазон колебаний Диапазон колебаний мдк

МПК для 13 штаммов МПК для 21 штамма в крови

P.mallei P.pseudomallei

СМЗ: ТМП 0.8-1.56 12,5-50 100

Сульфазин ■ 1.56-25 25.0-100 100

Сульфамонометоксин 0,8-25 100-250 100

Сульфатон 0,78-12.5 100-250 80

Миноциклин 0.05-0,25 1.0-5,0 4

Доксициклин 0. 1-0,25 1. 0-10, 0 4

Метациклин 0.5-1.0 2.5-25 4

Хлортетрациклин 0.1-0,25 2. 5-25 4

Тетрациклин 0,1-0.25 2.5-10 4

Окситетрациклин 0.1-0.5 2.5-10 4

Цефтазидим 1.56-3.1 6. 25-25 69

Цефазолин >500 >200 30

Цофсулодин 200-400 >400 -

Цофоперазон 25.0-50 200-400 151

Цефтриаксон 200-400 >400 153

Цефотаксим 12,5-50 50-200 102

Имипенем 0.8-1,56 6.25-25 33

Левомицетин 3.1-12,5 12.5-50 10

Рифампицин 3, 1-6.25 25.0-250.0 20

Ципрофлоксацин 0,1-1,0 1,0-10.0 4

Офлоксацин 0,5-5,0 5. 0-50. 0 10

Пефлоксацин 0,1-5,0 10.0-50.0 11.5

Норфлоксацин 0,5-10,0 25,0-50,0 ' 1.4

Бензилпенициллин* >500 >500 17

Карбенициллин >500 >500 140

Пиперациллин 50-100 >400 220

Ампициллин 31.2-250 31,2-500 20

Ампициллин+клавул.кта 31,2-125 31.2-62.5 -

Клавулановая к-та >1000 >1000 -

Эритромицин 1.0-2,5 100-250 4

Розамицин 3. 1 50-250 -

Новобноцин 0.5-1.0 2.5-25 -

Полимиксин В* >500 2000 6

Полимиксин М* >500 8000 8

Стрептомицин. 1. 0-10.0 100->500 60

Канамицин 2.5-5,0 >500 35

Гентамицин 0.25-2,5 250->500 4

Тобрамицин Сисомицин 1.56 3, 12 >500 3

1,56-6.25 >500 7

Нетилмицин 0.78 >200 7

Амикацин 1,0-2.5 32-64 21

Налидиксовая к-та 5.0-2,5 10.0-250 49

Хиноксидин >500 >500 -

Диоксидин >500 100->500

.Примечание: И Л К максимально достижимая концентрация препарата в крови в мкг/мл; * - МПК в ед/мл, у остальных - МПК в мкг/мл

па. В то же время, эти концентрации антибиотиков будут оказывать на возбудителя мелиоидоза только бактериостатическое действие, • поскольку бактерицидные" концентрации этих антибиотиков для изученных штаммов составляют 3.1 - 50 мкг/мл и выше.

Фторхинолоны

Установлено (табл.3), что для всех исследованных штаммов возбудителя сапа МПК препаратов колебались в следующих диапазонах доз: ципрофлоксацина 0.1-0.5 мкг/мл. офлоксацина 0,5-25 мкг/мл, норфлоксацина 0,5-5,0 мкг/мл. пефлоксацина 0.1-2,5 мкг/мл. МПК50 - ципрофлоксацина, пефлоксацина. офлоксацина и норфлоксацина составляла соответственно 0,25, 0,5, 1.0 и 1,0 мкг/мл. МПКд0 - соответственно 0,5, 2,5, 2,5 и 5. О мкг/мл. При сопоставлении этих данных с активностью сульфаниламидов можно заключить, что ципроф-локсацин и пефлоксацин превосходят по активности In vitro сульфа-зин. (МПК 0,39-3,12 мкг/мл) и сульфамонометоксин (0,39-1,56 мкг/мл), но уступают активности комбинации сульфазина с триметоп-римом(МЛК 0,022-0,39 мкг/мл) (Лозовая.1989). Офлоксацин и норф-локсацин были несколько менее активны.

Таблица 3.

Чувствительность P.mallei и P.pseudomallel к фторхинолонам

Штаммы Препараты Диапазон колебаний мпк50. MffiCjo. Концентрация в кро-

МПК,мкг/мл мкг/мл мкг/мл ви, мкг/мл

P. mallei (13шт) Ципрофлоксацин Офлоксацин Норфлоксацин Пефлоксацин 0.1-0.5 0,5-2,5 0, 5-5. 0 0, 1-2.5 0.25 1,0. 1,0 0,5 0. 5 2,5 5. 0 2,5 4, 33 10. 7 1,45 11,5

P.pseudomallel (21шт) Ципрофлоксацин Офлоксацин Норфлоксацин Пефлоксацин 1,0- 5.0 5. 0-25. 0 10.0-50.0 5. 0-50.0 1.0 5.0 25.0 25. 0 2,5 10,0 50.0 50.0

В наших исследованиях МПКд0 ципрофлоксацина для Р.mal lei составляла также 0,5 мкг/мл. следовательно, при сапе у человека эти концентрации будут иметь терапевтическое значение в течение 12 ч. Таким образом, установленные нами для P.mallei КПКз0 ципрофлоксацина (0,5 мкг/мл) s 4-8 раз, офлоксацина (2,5 мкг/мл) и пефлоксацина (2.5 мкг/мл) в 4 раза ниже максимально достижимых концентраций этих препаратов в сыворотке крови человека, а МПКд0 - норфлоксацина (5 мкг/мл) в'З раза превышает концентрацию препарата в

сызоротке крови.

На основании сопоставления данных КПК исследуемых препаратов для P.mallei с их максимально достижимыми концентрациями в сыворотке крови мы считаем, что возбудитель сапа высокочувствителен к ципрофлоксацину. офлоксацину/ пефлоксацину и нечувствителен к норфлоксацину.

Для всех исследованных штаммов возбудителя мелиоидоза МПК препаратов колебались в следующих диапазонах доз: ципрофлоксацин 1-5 мкг/мл. офлоксацин 5-25 мкг/мл. норфлоксацин 10-50 мкг/мл. пефлоксацин 5-50 мкг/мл. Сопоставляя данные МПК исследуемых препаратов для P.pseudomallel с их максимально достижимыми концентрациями в сыворотке крови, мы считаем, что возбудитель мелиоидоза низко чувствителен к ципрофлоксацину и пефлоксацину и резистентен к офлоксацину и норфлоксацину.

Влияние температуры и рН среды на чувствительность патогенных

псевдомонад к химиопрепаратам

При постановке основных опытов по оценке влияния температуры и рН на чувствительность различных видов псевдомонад к антибиотикам обращает на'себя внимание разнонаправленность эффекта. Так. в опытах с доксициклином при повышении температуры МПК для P.pseudomallel отчетливо повышается, а для других видов эти изменения не столь существенны. В то же время, повышение показателя рН для всех видов псевдомонад снижает резистентность к этому антибиотику. Чувствительность к ципрофлоксацину существенно (в 5-10 раз) повышается при защелачивании среды для всех псевдомонад, кроме P.cepacia, в то же время, именно для последнего вида псевдомонад более существенно снижение МПК при повышении температуры исследования. Чувствительность P.aeruginosa и P.pseudomallel к ципрофлоксацину практически не зависели от температурного фактора (в пределах изученного диапазона).

В таких же диапазонах мы отмечали изменения чувствительности псевдомонад и к другим антибиотикам. Так. МПК для штаммов P.pseudomallel. P.mallei и P.cepacia при повышении температуры от 30 до 41°С и рН от 6.0 до 8.0 снижалась в 4-8 раз при изучении гентами-цина, хлорахфеникола и тетрациклина, для P.aeruginosa эти колебания были менее выраженными. Интересно влияние цефтазидима на МПК P.cepacia и P.aeruginosa. Так для P.cepacia МПК не зависела от рН и при 37°с была в два раза ниже чем при 30 и 41°, а для P.aeruginosa при 37°С МПК при всех рН была 12,5 мкг/мл . а при температу-

pax 30 и 41°С при изменении рН от 6.0 до 8,0 МПК уменьшалась с 400 мкг/мл до 25 мкг/мл. Так же не вполне очевидны выводы о влиянии изучаемых факторов и при испытании чувствительности этих культур к рифампицину.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о неоднозначности влияния таких факторов окружающей среды, как рН и температура на антибиотикочувствительность различных видов псевдомонад. т. е. суть этого процесса никак не ограничена лишь оптимумом активности исследуемого антибиотика.

Ультраструктурные изменения P.mallei под воздействием докси-циклина, сульфаннлакщов и их сочетаний с рифампицином Показано, что полимиксин и рифампицин не вызывают выраженных повреждений ультраструктуры P.mallei. Воздействие на клетки док-сициклина в течение 24 ч вызывало нарушение деления и появление клеток с несколькими нуклеоидами. . Из комбинированных сульфаниламидов наиболее четко регистрируемые изменения давал сульфатен.

Наиболеё выраженные морфологические изменения бактерий вызывало сочетанное действие бисептола с рифампицином и сульфазина с рифампицином. Оно проявлялось'в повреждении всех слоев.клеточной стенки, включая пептидогликановый, и приводило к образованию дефектных по клеточной стенке бактерий типа сферопластов: Такое явление в определенной степени свидетельствует о синергидности их действия на возбудителя сапа.

Сочетанное действие бисептола с рифампицином. сульфазина с рифампицином вызывало более выраженные изменения, чем использование их в отдельности, что может служить дополнительным доказательством перспективности их использования для химиотерапии сапа. Ультраструктурные изменения P.pseudomallei под воздействием доксициклина, сульфаниламидов и рифампицина. ■Установлено, что морфологические изменения мелиоидозных бактерий при воздействии рифампицина в нашем исследовании наиболее наглядно выражены в нарушении поверхностных структур. Доксициклпн оказывал незначительное воздействие на ультраструктуру бактериальных клеток.

Из особенностей комбинированного воздействия следует отметить изменение морфологии мелиоидозных бактерий при сочетании") обработке сульфазином с рифампицином. В препаратах отмечали появление особей с'деструкцией всех слоев клеточной стенки вплоть до образования сферопластоподобных клеток. Такое явление, в определенной

'мере, свидетельствует о синергидном действии рифампицина с сульфаниламидными препаратами.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ Х1ШОТЕРАПЕВТНЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САПЕ

Кы проверили эффективность антибактериальных препаратов различных групп, отобрали наиболее эффективные и провели их сравнительное изучение. Из рести изученных тетрациклинов наибольшее значение имеют миноциклин и доксициклин, из сульфаниламидов-суль-фазин и сульфамонометоксин. Из четырех фторхинолонов, впервые изученных нами, три высокоэффективны при экспериментальном сапе (ципрофлоксацин, офлоксацин и пефлоксацин).

Наибольшее значение имеют результаты сочетанного применения антибактериальных препаратов.

При комбинированной химиотерапии экспериментального сапа на золотистых хомячках, было изучено И различных комбинаций антибактериальных препаратов, из которых у 8 сочетаний отмечено си-нергидное взаимодействие: у сульфазина с триметопримом и с рифам-пицином, бактрима с рифампицином, сульфатона с рифампицином. тетрациклина с рифампицином. сульфазина с рифампицином. сульфамоно-метоксина с рифампицином. сульфазина с триметопримом и сульфамо-нометоксина с триметопримом. Установлена четкая, статистически достоверная зависимость эффективности лечения сапа сульфаниламидами и их различными сочетаниями от продолжительности введения препаратов. Время начала введения препаратов в течение суток существенно не влияет на эффективность лечения. Определены индексы эффективности сульфаниламидов и их различных сочетаний (табл.4.).

При этом следует отметить, что наиболее эффективно при профилактике сочетание сульфазина .с триметопримом и с рифампицином (ИЭ-7,5*Ю5), которое на порядок эффективнее всех других сочетаний. Все остальные препараты и их сочетания, кроме сульфалена. обладали практически одинаковой эффективностью при профилактике экспериментального сапа.

При лечении наиболее эффективной комбинацией является сочетание сульфаметоксазола с триметопримом и с рифампицином (ИЭ-4,2* Ю6). рядом по эффективности идут сочетания сульфазина с триметопримом и с рифампицином (ИЭ-3.9*106). сульфаметоксазола с триметопримом (ИЭ-3,3*10б). сульфазина с триметопримом ШЭ-3,1*106). Несколько уступает этим препаратам сульфамонометок-

син в различных сочетаниях а наименее эффективен сульфален. Однако следует отметить, что несмотря на то..что сочетание сульфаме-токсазола с триметопримом (бактрим. бисептол) было высокоэффективно при подкожном заражении. С помощью иммунологических методов исследования подтверждена высокая санирующая активность бисепто-ла, сульфатона. сочетаний сульфазина с триметопримом и их сочетаний с рифампицином. а также показана зависимость полноты санации организма животного от длительности введения лекарственных препаратов. При аэрогенном заражении сочетание бактрим защищало только 40% зараженных животных.

При моделировании экспериментального сапа на морских свинках установлена высокая эффективность следующих сочетаний: сульфаме-токсазола с триметопримом, сульфазина с триметопримом и сульфамо-нометоксина с триметопримом (су'льфатон). Сульфазин-при 100% выжи-'

Таблица 4.

Сравнительная эффективность тетрациклинов. сульфаниламидов и их сочетаний с триметопримом и рифампицином при экспериментальном сапе

Препараты

Дозы препаратов ( в

мг/кг)

Индекс эффективности

Профилакти ка

Лечение

Миноциклин Доксициклин Сульфазин Сульфазин:Триме-топрим

Сульфазин:Триме-то прим: Рифампи-цин

сульфаметокса-зол:триметоприм Сульфаметокса-зол:триметоприм: ифамгшцин ульфамонометок-син

Сульфамонометок-

син:Триметоприм

Сульфамонометок-

син: Триметоприм:

Рифамгпщин

СульФален

(Келфизин)

2,5 2.5 50

50:10 50:20:10

50:10 50:10:10

50

50:10 50:10:10

50

5, ОНО5 2.7*104 2,1*104 3.1*104

7.5*10®

2,1*104. 6.3*104

2, 5*104 9, 0*103 4,9* 104

2, 5*102

3.1*106 2,7*104 2,1 * 106 3,1*106

3,9*106

3.3*106 4,2*106

7,9*105 1,4*106 2,5*106

2*10*

ваемости только у 5055 леченных животных обеспечивал полную санацию. Комбинированное использование сульфазина с триметопримом повышает санирующую активность сульфазина. увеличивая ее до 100%. Результаты, полученные на морских свинках, соответствуют эффективности этих препаратов на золотистых хомячках.

Установлено, что введение соединения доксициклина гидрохлорида с высокомолекулярным, декстраном - полиглюкином(6% раствор декстрана мол. масса 60000) обеспечивает 80% защиту зараженных животных при пятидневном введении, что сократило продолжительность лечения в два раза и статистически достоверно (t=2,59; Х2=7,2) повысило эффективность лечения по сравнению с использованием одного доксициклина. Определенные перспективы повышения эффективности лечения заболеваний, вызываемых патогенными псевдомонадами. мы усматриваем в способах введения эффективных антибактериальных препаратов: внутривенно, внутримышечно и непрямое интра-лимфатическое введение в сочетании с полиглюкином .

Для всех изученнных комбинаций препаратов отработаны схемы лечения и даны 'рекомендации по их применению при лечении сапа у людей. Наши рекомендации вошли в ряд инструктивных материалов по лечению опасных инфекционных заболеваний.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕЙ-

ТАЛЬНОМ МЕЛИОИДОЗЕ

В отличие от сапа, при экспериментальном мелиоидозе. моделированном на золотистых хомячках, доксициклин и миноциклин оказались неэффективны, в то время как на белых крысах обеспечивали высокую выживаемость при подкожном заражении. Однако, следует отметить. что при аэрогенном заражении доксициклин не защищал белых крыс, в то-время как бактрим (30 мг/крысу) и сульфазин (60 ,мг/крысу) обеспечивали 80% выживаемость.

Показано, что сульфазин эффективен при.экспериментальном мелиоидозе. моделируемом на золотистых хомячках, морских свинках и белых крысах, при подкожном и аэрогенном заражении. В связи с тем. что сульфазин в наших исследованиях на золотистых хомячках был эффективен при экспериментальном мелиоидозе. но обладал низкой. санирующей активностью, а сульфамонометоксин был не эффективен. но увеличивал среднюю продолжительность жизни леченных животных в 3-6 раз. мы сочли целесообразным проверить при экспериментальном мелиоидозе эффективность комбинаций сульфазина и суль-фамонсметошша с различными антибактериальными препаратами.

.Следует отметить, что при полной неэффективности сочетания сульфамонометоксина с триметопримом(сульфатон) при экспериментальном мелиоидозе у золотистых хомячков, в опытах на белых крысах это сочетание давало высокий защитный эффект(90%), но с низкой санирующей активностью (30%) в тоже время на белых мышах у сульфатона был высокий защитный эффект с достаточно высокой санирующей активностью. Эти результаты вполне согласуются с данными Г.М.Орловой (1995) о высокой эффективности сульфатона при экспериментальном мелиоидозе у белых мышей.

Из И комбинаций исследованных при экспериментальном мелиоидозе на золотистых хомячках оказывали защитное действие следующие сочетания: сульфазина с рифампицином. сульфазина с триметопримом, сульфаметоксазола с триметопримом, а также сульфазина с триметопримом и с рифампицином•и сульфаметоксазола с триметопримом и с рифампицином. Сочетание сульфаметоксазола с триметопримом было также высокоэффективно при аэрогенном мелиоидозе. моделируемом на белых крысах. Для лечения мелиоидоза у людей представленные материалы позволяют нам рекомендовать сочетанное применение сульфазина с триметопримом и рифампицином, сульфазина с триметопримом. сульфазина с рифампицином, сульфаметоксазол с триметопримом и рифампицином и сульфаметоксазол с триметопримом.'

Правомерность наших заключений о целесообразности комбинированной химиотерапии мелиоидоза подтверждается последними сообщениями о высокой эффективности комбинированной химиотерапии при лечении людей больных мелиоидозом (Коэииоп е! а1..1993; Яа,]сГ1апи-уопя еЬ а1..1995).

Таким образом, сопоставляя наши данные по комбинированным сульфаниламидам полученными при экспериментальном сапе и мелиоидозе на золотистых хомячках с результатами лечения людей в различных странах комбинированным сульфаниламидом (СМЗ.-ТМП) и его сочетаниями с другими препаратами, можно заключить, что наши данные . о высокой эффективности комбинаций сульфаниламидов с триметопримом (сульфазин: триметоприм. сульфаметоксазол:триметоприм. сульфамонометоксин: триметоприм) подтверждаются эффективным применением СМЗ:ТМП одного и в комбинации с другими препаратами при лечении мелиоидоза у людей (Вгегше^аапЗ ' е! а1..1982; СогкШ. АпгШП.' 1987; Оапсе а1.,1989; СоПейяе еЪ а!.. 1992; Ьее1ага-затее, ВоУогпк1Ш, 1989; МШе е1 а1., 1989).

Однако в сообщении БЛ.Бо еЬ а!.. (1983) отмечено, что" от боль-

-зоной с системной красной волчанкой из легочного абсцесса выделен возбудитель мелиоидоза. резистентный к хлорамфениколу. ко - три-моксазолу и тетрациклину, но высокочувствительный к цефтазидиму. Мелиоидоз был успешно вылечен.лобэктомией и парентеральным.введением цефтазидима. который вводили в течение двух месяцев без побочных эффектов.

Кроме перечисленных выше препаратов, нами установлено, что при экспериментальном мелиоидозе, моделируемом на золотистых хомячках и белых мышах . неэффективны исследованные нами фторхино-лоны - ципрофлоксацин. офлоксацин. пефлоксацин и норфлоксацин. В то же время при моделировании мелиоидоза на белых крысах при подкожном заражении офлоксацин защищал 100% зараженных животных, хотя при аэрогенном заражении был неэффективен.

На золотистых хомячках хиноксидин и диоксидин. рифампицин; аминогликозиды - гентамицин, тобрамицин и сисомицин. левомицетин. ампициллин и карбенициллин были неэффективны.

Все остальные исследованные комбинации антибактериальных препаратов защитным действием на золотистых хомячках не обладали (рифампицин+ампициллин, клавулановая кислота+ампициллин. хинокси-дин+рифампицин, сульфамонометоксин+рифампицин и сульфамонометок-син+тримето;;рим). „ " -

Показано, что сочетанное использование сульфатона с ципроф-локсацином при экспериментальном мелиоидозе белых мышей высокоэффективно, и явлений антагонизма не отмечено.

На основании представленных материалов 'можно рекомендовать следующий подход при оценке эффективности исследуемых препаратов: первичная оценка делается при подкожном заражении наиболее чувствительной модели минимальными заражающими дозами, а окончательная оценка проводится после полного изучения на двух .или трех различных по чувствительности к инфекции видах животных с заключительным опытом при аэрогенном заражении.

Одним из основных вопросов при окончательной оценке химиоте-рапевтической ценности того или иного препарата или сочетания препаратов является лабораторный контроль полноты излеченности.

Для оценки эффективности лечения сапа у морских свинок нами, кроме ранее употреблявшихся критериев: процента выживших.' определения средней продолжительности жизни леченных животных, бактериологического контроля на простых питательных средах, учета видимых изменений органов выживших при вскрытии, рекомендуется приме-

нение аллергической пробы. При использовании в качестве ■ лабораторной модели золотистых хомячков этот тест нецелесообразен, ввиду отсутствия у них хронической.формы сапа.

Определенную диагностическую ценность в качестве критерия из-леченности, по нашему мнению, имеет поиск антигена при исследовании суспензии органов выживших золотистых хомячков или морских свинок с помощью таких диагностических тестов как ТИФА.

Показано, что существует корреляция между эффективностью проводившегося лечения экспериментального сапа и процентом позитивных находок при поиске антигена. Так при лечении сульфатоном в дозе 1 мг на золотистого хомячка в течении 5 сут антигены Р.maller обнаруживались в 14,2%. Удлинение срока введения препарата до 7 сут вызвало уменьшение процента положительных "серологических реакций до 7,1%. а при 10 суточном - до 6,6%. Сочетанное использование сульфатона с рифампицином в дозах 1 и 0.2 мг. соответственно, даже при 5 суточном введении, снижало процент положительных серологических реакций до нуля. Косвенно это подтверждает эффективность" лечения и в сочетании с данными бактериологического анализа может свидетельствовать о санации организма при длительном введении препарата что согласуется с нашими данными-о влиянии на эффективность лечения продолжительности приема антибиотиков и сульфаниламидов.

Показано отсутствие L-трансформации P.mallei в процессе лечения экспериментального сапа комбинированными сульфаниламидами (бактрим. сульфатон) и их сочетаниями с.рифампицином, что свидетельствует об их высокой санирующей активности и надежности,' по сравнению с использованием одного сульфамонометоксина.

Нами установлено, что из всех изученных возможных способов оценки излеченности животных при экспериментальном сапе наиболее эффективным является ТИФА с параллельным подращиванием исследуемого' материала и последующим поиском антигенов и L-форм. Кроме обычных критериев излеченности, малдеиновая проба служит ценным диагностическим тестом излеченности и эффективности используемых антибактериальных препаратов на модели морской свинки. С помощью иммунологических методов исследования показана зависимость полноты санации организма животного от длительности введения лекарственных препаратов. .

Одной из ключевых проблем в лечении мелиоидоза является неэффективность лечения и высокий уровень рецидива (Ip et al'., 1995 и

др. )-

Рядом авторов (Strauss et al..1969; Dodln.Ferrl.1975; Pour-taghva et al..1976; Ll.Не,1992 и др.) в эндемичных по мелиоидозу районах отмечается довольно высокая инфицированность населения, однако клинически выраженные заболевания регистрируются значительно реже.

Отмечено, что для проявления латентной мелиоидозной инфекции необходимы факторы. ' ослабляющие макроорганизм. В исследовании В.С.Замараева с соавт..1934 показана возможность формирования им-мунодефицитного состояния в .экспериментальных условиях при мели-оидозе с помощью циклофосфана. Манифестация скрытой инфекции возможна при развитии иммунодефицитного состояния, которое мы в эксперименте моделировали введением биопробным жив.отным этого препарата.

В наших исследованиях введение вылеченным выжившим животным циклофосфана приводило к активаций скрытой мелиоидозной инфекции у крыс и соответственно к снижению процента излеченных, животных тетрациклином с 70 до 30%, а доксициклином с 90 до 60%.

Эти исследования дают' основания говорить о. персистировании возбудителя мелиоидоза в организме белых крыс, в виде L-форм и неполной санации.организма тетрациклином и доксициклином.

Нами установлено, что в развитии рецидивов мелиоидоза несом-' ненную роль играет персистенция возбудителя в виде L-Еариантов, сопровождающаяся развитием гиперчувствительности замедленного типа.

Показано, что серологические реакции(РСК, РПГА) имеют диагностическое значение, но оно несравненно ниже аллергической пробы. Не отмечено корреляции между татрами антител в исследуемых сыворотках и выделением бактериальных или L-вариантов возбудителя мелиоидоза. К критериям полноты излеченности перенесенного мелиоидоза следует отнести стойкую нормализацию температуры, положительную динамику изменения веса тела, отрицательные результаты исследований на обнаружение типичных и морфологически измененных форм возбудителя, отсутствие аллергической реакции.

- 33 -

выводы

1. Установлено, что против P.pseudomallel активны In vitro тетра-циклины (миноциклин и доксициклин). фторхинолоны ( ципрофлоксацин и офлоксацин), сульфаниламиды (бактрим, сульфазин), а также отдельные препараты других групп( новобиоцин. цефтазидим, имипе-

нем), а против P.mallei In vitro, наряду с указанными препаратами высокоактивны аминогликозиды (гентамицин, нетилмицин). Изучена чувствительность 13 штаммов возбудителя сапа и 21 штамма возбудителя мелиоидоза .к 44 антибактериальным препаратам различных групп.

2. Показано синергидное действие сочетаний сульфазина с рифампи-цином и бисептола с рифампицином на ультраструктуру клеток P.mallei и P.pseudomallel, выражавшееся в повреждении всех слоев клеточной стенки, включая пептидогликановый, и образовании дефектных по клеточной стенке- морфологических форм типа сферопластов. Из комбинированных сульфаниламидов наиболее четко регистрируемые изменения вызывал сульфатон. При сочетанном действии бактрима с ри-

' фампицином и сульфазина с рифампицином наблюдались более выраженные изменения, чем использование этих препаратов в отдельности.

3. Чувствительность к антибиотикам Р.mallei и P.pseudomallel. как и других видов псевдомонад существенно изменяется в зависимости от рН и температуры среды культивирования. Показано, что МПК антибиотиков определяется не только оптимумом активности препаратов. но и зависит от видовых особенностей метаболизма этих микроорганизмов.

4. Установлено, что при экстренной профилактике и лечении экспериментального сапа(подкожное заражение) высокоэффективны: миноциклин, доксициклин, сульфамонометоксин, фторхинолоны - ципроф-

. локсацин, офлоксацин и пефлоксацин. В то же время при аэрогенном заражении золотистых хомячков наибольший терапевтический эффект наблюдался при лечении животных только доксициклином(70% защита), а эффективность сульфазина, миноциклина, сульфаметоксазола с три-метопримом и офлоксацина составляла от 10 до 40%. с продлением жизни леченных животных в 2-4 раза по сравнению с контролем заражения.

5. Доказана высокая эффективность комбинированной химиотерапии экспериментального сапа(подкожное заражение) на золотистых хомячках. Из 11 различных комбинаций антибактериальных препаратов 8 сочетаний обеспечивали синергидный эффект: сульфазин с триметоп-римом и с рифампицином, бактрим а рифампицином. сульФатон с рифа-мпицином, тетрациклин с рифампицином. ' сульфазин с рифампицином. сульфамонометоксин с рифампицином, сульфазин с триметопримом и сульфамонометоксин с триметопримом.

Не выявлена L-трансформация P.mallei в случае использования схемы лечения экспериментального сапа комбинированными сульфаниламидами (бактрим, сульфатон) и их сочетаниями с рифампицином . что свидетельствует о высокой санирующей активности и надежности этих сочетаний по сравнению с использованием одного сульфамономе-токсина.

6. Определены индексы эффективности сульфаниламидов и их различных сочетаний при экспериментальном сапе, моделируемом на золотистых хомячках, на основании которых все исследованные препараты распределены по эффективности.

Наиболее перспективным при экстренной профилактике считаем сочетание сульфазина с триметопримом и с рифампицином (ИЭ-7.5*105). которое на порядок эффективнее всех'других сочетаний.

При лечении наиболее эффективны сочетания сульфаметоксазола с триметопримом и с рифампицином. сульфазина с триметопримом и с рифампицином. сульфаметоксазола с триметопримом и сульфазина с триметопримом.

7. Показано, что введение соединения доксициклина гидрохлорида с полиглкжином обладает синергидным взаимодействием и обеспечивает высокую защиту зараженных сапом золотистых хомячков.

8. Установлена зависимость эффективности сульфатона (сочетание сульфамонометоксина с триметопримом) и доксициклина при экспериментальном мелиоидозе от модели: неэффективны на золотистых хомячках и обладают высоким защитным эффектом на белых крысах и белых мышах. Показано, что сочетанное использование сульфатона с ципрофлоксацином при экспериментальном мелиоидозе белых мышей высокоэффективно.

9. Из И комбинаций, .исследованных при экспериментальном мелиоидозе на золотистых хомячках, пять оказывали защитиое действие: сочетания сульфазина с триметопримом и с рифампицином. сульфаметоксазола с триметопримом и с рифампицином. сульф>азина с рифампицином. сульфазина с триметопримом. сульфаметоксазола с триметопримом. Сочетание сульфаметоксазола с триметопримом было также высокоэффективно при аэрогенном мелиоидозе. моделируемом на белых крысах.

10. При экспериментальном мелиоидозе. моделируемом на золотистых хомячках и белых мышах, неэффективны исследованные нами аминогли-козиды(гентамицин. сисомицин. тобрамицин) и фторхинслоны(ципроф-локсацин, офлоксацин, пефлоксацпн и норфлоксацин)' & то.же время, при моделировании мелиоидоза на белых крысах в случае подкожного заражения офлоксацин защищал 100% зараженных животных, но при аэрогенном заражении отмечено только увеличение продолжительности жизни.

В опытах на золотистых хомячках неэффективны хиноксидин. ди-оксидин. рифампицин. левомицетин, ампициллин и карбенициллин, а также сочетания: рифампицин+ампициллин. клавулановая кислота+ам-пициллин, хиноксидин+рифампицин. сульфамонометоксин+рифампицин и сульфамонометоксин+триметоприм.

11. Установлено, что в развитии рецидивов мелиоидоза несомненную роль играет персистенция возбудителя в виде Ь-вариантов. сопровождающаяся развитием гиперчувствительности замедленного типа.

К критериям полноты излеченности перенесенного экспериментального мелиоидоза следует отнести стойкую нормализацию температуры. положительную динамику изменения веса тела, отрицательные результаты исследований на обнаружение типичных и морфологически измененных форм возбудителя и отсутствие аллергической реакции.

12. На основании представленных материалов можно рекомендовать следующий подход при оценке эффективности антибактериальных препаратов при.сапе и'мелиоидозе: первичная оценка делается при подкожном заражении наиболее чувствительной модели(золотистые хомячки) минимальными заражающими дозами, а окончательная оценка проводится после полного изучения на двух или трех, различных по чувствительности к -инфекции, видах животных(белые мыши, 'морские

свинки, белые крысы и, по возможности, обезьяны) а окончательное заключение представляется после оценки эффективности препаратов в опытах при аэрогенном заражении лабораторных животных сапом и ме-лиоидозом.

. СПИСОК РАБОТ.

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Батманов В.П., Булан.цев А.Л. К оценке действия рифампицина в сочетании с другими антибиотиками на возбудителей сапа и мелиоидоза. //Сб. научн. работ: Матер, научн. конф. посвящ. 60- летию Волгогр. противочумн. организации.- Волгоград. 1974.-Вып. 1. -С. 114-118.

2. Буланцев А.Л.. Батманов В.П. Химиотерапевтическая активность хиноксидина и дисксидина при экспериментальном сапе и мелиоидозе. //Сб. научн. работ: Матер-' научн. конф. посвящ. 60- летию Волгогр. противочумн. организации. -Волгоград.-1974.-Вып.1.-С.119 -122.

3. Батманов В.П. Эффективность сульфазина и сульфамонометоксина при экстренной профилактике и лечении экспериментального сапа. //"Вопросы противоэпидемической защиты": Сб.статей НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи. -М. 1976. - Вып. 25,- С. 240-242.

4. Ферстер Л.Н., Батманов В. П. Патоморфогенег экспериментального сапа, леченного рифампицином. //"Вопросы противоэпидемической защиты": Сб. статей НИИЭМ им. Н.Ф Гамалеи.-М. 1976. - Вып. 25.' С.235-239.

5. Батманов В.П.. Антонов Ю.В. Основные принципы профилактики и лечения сапа и мелиоидоза. //Профилактика природноочаговых ин^-фекцп-й. Тез. докл. Веееоюзн. научн. -практ. конф. (6-8 дек. 1983г> .• -Ставрополь.1983.-С.14-15.

6. Батманов В.П. Антибактериальная активность полусинтетических тетрациклпнов и рифампицина против возбудителей сапа и мелиоидоза. '/"Вопросы противоэпидемической защиты": Сб.статей НИИЭМ' им. Н.Ф. Гамалеи.-М. 1983. - Вып. 31.- С. 427-432.

7. Батманов В.П.. Лозовая H.A. Сравнительная эффективность суль-фазина, сульфамонометоксина и сульфалена при экспериментальном сапе.//"Вопросы противоэпидемической защиты": Сб.статей НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи. -М. 1987. -Вып. 33. -С. 302 -308.

8. Батманов В.П. Чувствительность Pseudomonas mallei к фторхино-лонам и их эффективность при экспериментальном сапе.// Антибиотики и химиотерапия. - 1991.-Т. 36, N9.-С. 31-34.

9. Антонов ¡0.В.. Илюхин В.И., Поповцева Л.Д., Батманов В.П. Чувствительность псевдомонад к современным антибактериальным препаратам. //Антибиотики и химиотерапия.- 1991,- Т. 36, N1. -С. 14-16.

10. Вязьмина Т.Н., Батманов В.П. Влияние доксициклина на патомор-фологию внутренних органов мышей больных острим мелиоидо-зом. //Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфек-

■ций: Тез. докл. Всесоюзн. конф.. 22-24 октября 1991 г.-И. 1991,- Ч. 1. - С. 138-140.

11. Батманов В.П. Лечение экспериментального сапа сочетанием суль-фазина или сульфамонометоксина с триметопримом. //Антибиотики и химиотерапия.-1993.-Т.38,N4-5.-С.18-22.

12. Лозовая H.A., Фарбер С.М.. Васильев В.П., Батманов В.П. К вопросу о сохранении возбудителя сапа в организме экспериментальных животных. // Иммунол. и специф. профил. особо • опасных инф.,: Матер. Рос. научн. конф., 21-23сент. 1993г. Саратов. 1983.-С. 206.

13. Батманов В.П. Чувствительность Pseudomonas mallei к тетрацик-линам и их эффективность при экспериментальном сапе. // Антибиотики и химиотерапия.-1994.-Т.39.N5.-С.33-37.

14. Батманов В.П., Илюхин В.И. Эффективность современных химиоп-репаратов в лечении сапа. // Актуальные проблемы разработки медицинских средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженных сил: Сб. тез. докл.

НИИ военной медицины 28-30 октября 1994.Г /Под ред. Ю. Погодина. - Санкт-Петербург, 1994.-С.151-152.

15. Батманов В.П., Илюхин В.И., Антонов Ю.В. Контроль эффективности экстренной профилактики мелиоидоза.//Там же,-С.152-153

16. Батманов В. П., Илюхин. Е>. И.. Лозовая H.A. Лечение сапа. // 2 Российский национальный конгресс "ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО": Тез. докл. . 10-15 апреля 1995 г. Москва.-М, 1995. - С. 252.

17. Батманов В.П., Илюхин В.И.. Антонов Ю.В. Лабораторный контроль ' эффективности химиотерапии при мелиоидозе.//Антибиотики и химиотерапия-1995. -Т. 40, N. 2. - С. 41-45.

18. Быков A.B., Походеева Е.В.. Воробьев A.A.. Батманов В. П.. Коваленко A.A., Васил;>ев В.П. Смесь антибиотика и полимерного плазмозаменителя как, лимфотропная форма антибактериального препарата.//в Всероссийский съезд хирургов. 1995. Краснодар. 21-23 сентября.1995г.-Краснодар.-1995.-С.575-576.

19. Илюхин В.И.. Батманов В.П.. Быков A.B.. Походеева Е.В. Оценка антибактериальной активности клатрата доксициклина гидрохлорида. //Новые материалы и методы в медицине: Сб.научн.статей Волгогр. мед. акад. - Волгоград, 1995.- Т. 51. вып. 2.-С. 28-29. .

20. Батманов В.П.. Илюхин В.И.. Антонов Ю.В. Контроль эффективности лечения мелиоидоза.// 2 Российский национальный конгресс "ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО". Тез.докл.-10-15 апреля 1995 г. Москва.-М,С.252.

21. Илюхин В.И.. Батманов В.П. Клиника и лечение мелиоидоза.// МЕЛИ0ИЛ03 / Под.ред. д.м.н.,проф..акад.РЭА, Н.Г.Тихонова: Сб.научных трудов: Госкомсанэпиднадзор РФ, Волгогр. н.и. про-тивочумн. ин-т.-Волгоград: Нижне-Волжское книжное изд-во, 1995,- С.142-161.

22. Илюхин В.И.. Батманов В.П.. Лозовая H.A. Клиника и лечение сапа.// САП / Под. ред. д. м.н. .проф. .Акад. РЭА, Н.Г.Тихонова: