Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие протонов с субхлоропластными препаратами фотосистемы 2 растений

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие протонов с субхлоропластными препаратами фотосистемы 2 растений"

РГ6 од

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.12.355, 541.144.7

ШУТОВА Татьяна Витальевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОТОНОВ С СУБХЛОРОШГАСТНШИ ПРЕПАРАТАМИ ФОТОСИСТЕМЫ 2 РАСТЕНИИ.

03.00.02. - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1993

Работа выполнена в лаборатории фотосинтетического окисления воды Института почвоведения и фотосинтеза РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук В.В.Климов

кандидат биологических наук В.К.Опанасенко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А.Н.Тихонов кандидат биологических наук В.Б.Шубин

Ведущее учереждение: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится "_"_1993г. в_часов

на заседании Специализированного Совета по биофизике К.053.05.68 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"_1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Б.А.Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Одной из важнейших проблем современной иофизики является выяснение механизма уникального биологического роцесса - фотосинтетического окисления воды, который происходит в этосистеме 2 (ФС-2) высших растений и водорослей. Процесс проте-ает с участием Mn-содержащего энзиматического комплекса и сопро-эждается высвоооэдением 4 протонов на каждую молекулу кислорода, ак следует из принципа 1е-Шателье, для эффективного протекания гй реакции необходимо удаление протонов из водоокислявдего комп-зкса, что также защищает ФС-2 от кислотной инактивации. Кроме зго, в недавних работах /Dilley, 1989; Theg and Deiley,1990/ было эедположено наличие специфически организованного транспорта про-знов от места окисления воды к АТФаз0 без их выхода во внутрити-жоидное пространство . В то же время, остается неясным, каким зразом организован отток протонов от донорной части ФС-2 и, сле-шательно, представляется . актуальным изучение кислотно-основных фактеристик .пигмент-белкового комплекса ФС-2, компоненты которо-> первыми взаимодействуют с выделяющимися при разложении воды ютонами на их пути от ФС-2 к АТФазе.

Цель работы. Целью работы было исследование взаимодействия ютонов водной фазы с препаратами фотосистемы 2 в зависимости от i функционального состояния, а также изучение буферных свойств юлированных водорастворимых белков, входящих в состав водоокис-шдего комплекса, с использованием прямого метода - прецизионного юлотно-щелочного титрования.

При этом были поставлены следующие задачи.

I.Создание автоматизированной установки для прецизионного :слотно-щелочного титрования и методических подходов, учитывающих сокую лабильность исследуемой системы (ФС-2).

2.Определение кислотно-основных характеристик и идентификация труемых f^yim нативных субхлоропластных препаратов фотосистемы 2.

3.Исследование влияния фотосинтетического переноса электронов сродство пигмент-белкового комплекса фотосистемы 2 к протонам.

4.Изучение протонвкцепторных свойств фотосистемы 2 при активации и реконструкции ее донорной части.

5.Исследование буферных свойств изолированных водорастворимых яков, входящих в состав энзиматического комплекса окисления ¡да.

Каучная новизна. Впервые применен метод буферной емкости дл? исследования взаимодействия протонов с препаратами фотосистемы 2 г изолированными из них белками. В области физиологических значешй рН найдено как минимум два основных пула ионогенных груш комплекса ФС-2, различающихся по степени сродства и доступности к протонам водной фазы. Обнаружены изменения протонакцопторных свойсм карбоксильных групп препаратов ФС-2 при фоторазделении зарядов, что свидетельствует о структурно-функциональных перестройках комплекса ФС-2, связанных с электронным транспортом в ФС-2 и требующих функциональной целостности прежде всего ее донорного участка.

Показано, что ресвязывание каталитически малых концентращй марганца с препаратами ФС-2 в темноте вызывает изменение их конфирмационного состояния, регистрируемое по уменьшению доступноси ионогенных групгг титранту, что может лежать в основе ч^резвычайнс высокой эффективности захватывания марганца в процессе реконструкции водоразлагающего комплекса.

Впервые показано явление кислотно-щелочного гистерезиса пр! титровании селка с М.м. 33 кДа, свидетельствующее о наличии дву: протонзависимых состояний белка, взаимопревращение которых може: лежать в основе функционирования этого полипептида в системе окисления воды.

Апробация работы. Основные положения работы изложены на г конференции молодых ученых Института почвоведения и фотосинтез! РАН (Пущино, 1988), конференции молодых ученых научного центр: биологических исследований (НЦБИ РАН, Пущино, 1988); на 5-м мевду-народном симпозиуме "Регуляция метаболизма растений" (Варна, Болгария, 1990 г.), на советско-немецком коллоквиуме по проблема! фотосинтеза (Западный Берлин, 1990; Пущино 1992).

Дубликации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных рабо1 Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложена экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списк; цитируемой литературы. Текст диссертации занймает 117 страниц, ] том числе 23 рисунока и 3 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературных данных составляет первую част: диссертации. В нем изложены современные представления

¡труктурной и функциональной организации ФС-2. Подробно рассмотре-:а реакция выделения протонов в результате фотосинтетического деления воды ФС-2.

Объекты и методы исследования. В качестве основного объекта юследования использовали субхлоропластные фрагменты, обогащенные ютосистемой 2, выделенные по методу /Bertold et al.,1981/ с юдификациями (Щутилова с соавт. 1987) из листьев гороха или шпигата при помощи Тритона Х-100. Препараты выделяли на свету 02 со жоростыо около 250 мкмолей /мг Хл в час и содержали 230 молекул хлорофилла на один реакционный центр (РЦ) ФС-2. Полное (более 95 S) удаление Мп2+ и суммы водорастворимых белков с М.м. 18,24 и 33 ;Да из препаратов ФС-2 проводили при помощи высоксмолярного Трис-¡уфера /Klimov et al.,1982/. Содержание Мп2+ в частицах оценивали m атомно-аосорбционном спектрофотометре aas-БОЗ. Водорастворимый голипептид с М.м. 33 кДа выделяли при помощи последовательной об-)аботки частиц IM NaCi и IM СаС12 /Опо, inoue.1984/, а затем >чищали на колонке g-25, уравновешенной 100 мМ NaCl,(pH 7,5) и на солонке, заполненной deae-Сефарозой, уравновешенней 50 мМ Nací, tpH 6,8).

Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции (ДФ) гемеряли на фосфороскопической установке /Климов с соавт.,1975/. Скорость выделения кислорода определяли при помощи электрода {ларка, покрытого тефлоновой мембраной, на специальной установке 'Ананьев, 1989/. Аминокислотный состав частиц ФС-2 определяли как шисано ранее /Bruggeman et al., 1967/ на аминокислотном анализаторе LC-5000.

Прецизионное кислотно-щелочное титрование проводили на собранной нами автоматизированной установке, состоящей из термоста-гируемой стеклянной ячейки объемом 2,5 мл с комбинированным рН-электродом, подключенным к высокоомному рЯ-метру ОР 208. Подачу гатранта, которым служили 10 мМ раствор HCl или Каон, осуществляли з помощью автоматизированной бюретки с шагом 2 мкл. Для удаления растворенного С02 из реакционной среды, содержащей 100 мМ Nací, ячейку продували аргоном.

После завершения цикла титрования полученные данные с помощью микроэвм преобразовывали из координат pH=í(V) в координаты v=í(pH) и из суммарной кривой титрования вычитали предварительно записанную кривую титрования фона. Затем производили сглаживание и дифференцирование данных, после чего полученные кривые титрования и кривые буферной емкости записывали на самописце или передавали на

сопрякенный с установкой персональный компьютер для дальнейшей обработки результатов. Данная установка, в отличие от ранее используемых, позволяет легко изменять временной режим и границы титрования, а самое главное - быстро (в течение 30 -40 сек) проводить обработку данных, что представляется важным для корректного многократного титрования препаратов ФС-2, отличающихся высокой чувствительностью к повреждениям.

Для анализа данных наряду с исходной кривой титрования использовали также результаты дифференцирования этой кривой по рН -буферную емкость (р) образца. Расположение максимума полосы буферной емкости на шкале рН и площадь под этой кривой свидетельствуют о значении рК титруемых групп и об их количестве, полушерина пика на кривой буферной емкости позволяет судить о степени кооперативное™ реакции протонирования /Опанасенко В.К., 1986/.

Титрование проводили в двух режимах. Первое, - это, так называемое равновесное титрование, при котором подача последующей порции титранта проводилась только по достижении равновесия в ячейке после предыдущей порции. При неравновесном титровании скорость подачи титранта и регистрации данных была постоянной й (в отдельных случаях) соизмеримой со скоростью установления равновесия протонов с труднодоступными группами. На кривой буферной емкости такие группы регистрируются по сдвигу рК в направлении титрования, который уменьшался при замедлении титрования. Во всех случаях максимально допустимая скорость подачи титранта определялась с помощью тирования аминокислоты в растворе (например, гис-■гидина) при условии совпадения кривых кислотного и щелочного титрования и соответствия табличных данных наблюдаемому значению рК. Это свидетельствовало об отсутствии артефактов, связанных с инертностью рН-электрода и диффузионными процессами в ячейке.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

¡.Обратимое связывание протонов нативными препаратами ФС-2.

На рис. 1 представлены кривые титрования субхлоропластных препаратов ФС-2 кислотой от рН 7.0 до рН 3.0. Количество протонов, связываемых препаратами ФС-2, определяли в условиях равновесного титрования по количеству добавленной кислоты известной концентрации, необходимой для доведения рН суспензии до рН 3,0, за вычетом фонового количества. Количество ионогенных групп, способных связывать протоны в этом диапазоне рН (усредненное по результатам 5 экспериментов), соответствует 2,6 + 0,2 моль НС1 в расчете на один моль

Рис.1. Равновесное титро-шие частиц ФС-2 кислотой. По оси ординат отложено ко-иество связанных протонов расчете на 1 мг хлорофилла ¡лева) или на 1 РЦ (справа) На колонке справа показано >личество аминокислотных ос-itkob гистидина ( ) и ди-фбоновых аминокислот ( У, щученное по результатам пшокислотного анализа ютиц ФС-2.

юрофилла. В расчете на 230 молекул хлорофилла (или на один РЦ 1-2) это составляет примерно 600 - 50 связываемых протонов. В ¡следуемом интервале рН титруются боковые карбоксильные группы карбоновых аминокислот и имидазол гистидина (вреднее значение рК ш аминокислот в составе белков лежит в интервале рН 7,0 - рН ,0 /Кантор и Шиммел, 1989/).

Необходимо отметить, что в этой области рН могут титроваться ааке фосфатные группы фосфатидилхолина и фосфатидилглицерола, а ¡кже сульфитная группа сульфохиновазилдиацилглицерола. Однако,' ж следует из литературых данных /N.Murata et al.,1990; K.Gouna-Ls et ai.,1983/, максимальное количество этих липидов в наших юпаратах составляет от 45 до 62 моль на I моль РЦ, т.е. 7-10 % : найденного общего количества протонакцепторных групп ФС-2. юдовательно, титрование частиц ФС-2 определяется главным образом ¡держанием в них титруемых аминокислот.

И действительно, нами было найдено, что количество указанных «инокислот составляет близкую к полученной методом титрования »личину, а именно 580 дикарбоновых аминокислот и 100 остатков ютидина на один РЦ фотосистемы 2. Эти данные были получены на «инокислотном анализаторе LC-500 с помощью прямого определения пшокислотного состава частиц ФС-2, используемых при титровании, >сле их гидролиза в 6 N НС1.

Таким образом, количество ионогенных груш ФС-2, способных зязывать протоны в области рН 3 - рН 7 соответствует содержанию в п аминокислот, титруемых в данном диапазоне рН. Аминокислотные ;татки белков .ФС-2, рК которых лежит в исследуемом диапазоне рН, 5ладают способностью связывать протоны из реакционной среды при шновесном титровании кислотой, причем это, вероятно, относится и имидазольным группам остатков гистидина, находящимся в гидрофоб-зй области белков.

Дифференцирование по рН полученной кривой равновесного

титрования препаратов ФС-2 позволяет определить рК и количество различных пулов титруемых групп. Кривая буферной емкости нативных частиц ФС-2 состоит из 3 полос. Исходя из значений рК этих полос и их площадей, мы идентифицировали их следующим образом: полосу с рК 6,1-6,2 как имидазол гистидинов (90 групп /1РЦ), а полоса с рК 5,1-5,2 и область повышенной буферной емкости при рН 3,5-4 как принадлежащие дикарбоновым аминокислотам (аспарагиновая и глутаминовая кислоты).

Наш исследования показали также, что эти пулы титруемых групп ФС-2 отличаются не только по степени сродства к протону, но и по скорости уравновешивания с протонами водной фазы: время, необходимое для их полного уравновешивания изменяется от 15 сек для групп, титруемых при рН < 6,0 (дикарбоновые кислоты) до 1,5-2 мин для групп с рК 6,1-6,2 (гистидин).

При использовании неравновесного титрования, когда скорость титрования превышала скорость уравновешивания труднодоступных груш с протоном медленно уравновешивающиеся группы выявляются на кривой буферной емкости и по сдвигу рК в направлении титрования. Е этом случае,измеряемое значение рК для имидазолов сдвигается на 0,3-0,9 ед. рН. Эффект носит кинетический характер: замедление титрования приводит к сближению рК кислотного и щелочного титрования. Полученные данные указывают на наличие в ФС-2 при физиологических значениях рН как минимум двух пулов ионогенных групп, отличающихся по сродству к Н* и по скорости обмена с протонами водно} фазы.

2.Действие света на протонакцепторные свойства субхлоропласт ных препаратов ФС-2. Возникает вопрос, изменяются ли протонакцепторные свойства пулов ионогенных груш ФС-2 под влиянием различного рода воздействий, таких как освещение, инактивация и последующая реконструкция системы окисления воды ?

Поскольку фотосинтетические реакции ФС-2, обладают выраженно! зависимостью от рН /и^ et а1.,1982/, для изучения влияния освещения на буферные свойства нативной ФС-2 необходимо было подобрат: диапазон титрования, в котором за время измерения препараты ФС-; сохраняли бы способность восстанавливать кислородвыделяющую актив ность при быстром возвращении рН к оптимуму. Изучение зависимост: скорости выделения кислорода частицами ФС-2 от времени прединкуба ции в кислых и щелочных средах показало, что диапазоном, в которо; не происходит необратимая потеря функциональной активности з

¡ремя титрования, является диапазон рН 4,0 - рН 9,0.

Известно, что связывание ионов Мп2+ к препаратам ФС-2 /ташш-н md Cheniae,1986/, также как и их диссоциация /Maison-Peteri st tl.,1981/ являются рН-зависимыми процессами. Ранее /Kuwabara and lurata, 1971/ был показан также индуцируемый щелочными рН выход ¡одорастворимых белков из препаратов ФС-2 в раствор. Нами было юследовано влияние рН среды инкубации частиц ФС-2 на содержание в шх марганца и возможное освобождение белков ФС-2 из мембран суб-шоропластных препаратов ФС-2. Экспериментально было показано, что выхода белков и ионов марганца из мембраны в среду в результате шкубации при рН 4,0 и 9,0 в течение одной минуты не происходило.

Таким образом, диапазон в котором непрерывное (неравновесное) титрование частиц ФС-2 не сопровождается необратимой инактивацией ipenapaTOB, охватывает область рН 4,0 - рН 9,0, что позволяет ис-тользовать метод буферной емкости для изучения изменений протонак-депторных свойств нативной ФС-2 в процессе ее функционирования.

Влияние освещения на взаимодействие тилакоидных мембран с тротонами исследовалось ранее в связи с формированием траНсмем-Зранного градиента рН /Polla and Jagendorf,1969, Walz et al.,1974/ я в связи с протонированием на свету титруемых груш сопрягающего фактора /Zolotareva et al.,1986/. Отделить фотоиндуцированнов изменение протонакцепторных свойств ФС-2 от изменений, связанных с градиентом рН и работой сопрягающнго фактора, можно используя изолированные препараты ФС-2, в которых при освещении протекает реакция окисления воды, но из-за отсутствия замкнутых тилакоидных визикул не формируется трансмембранный градиет рН.

С помощью метода прецизионного кислотно-щелочного титрования нам удалось обнаружить обратимое изменение протонакцепторных свойств изолированных препаратов ФС-2 при освещении. Опыты проводили в отсутствие эгзогенных акцепторов электрона, поскольку эти вещества обладают собственной буферной емкостью, и кроме того, при наличии потока электрона на акцептор выделение протонов при окислении воды (которое, как известно, зависит от рН /Rappaport F. and bavergne J, 1991/) исказило бы буферную емкость ФС-2.

Кривые буферной емкости , полученные при равновесном титровании частиц ФС-2 кислотой в темноте и на свету, представлены на рисунке 2. Видно, что освещение вызывает значительное уменьшенение буферной емкости в области рН 4,0 - рН 5,5. Величина фотоиндуциро-ванного изменения буферной емкости соответствует уменьшению количества протонируемых в этой области рН групп ФС-2 на 0.38 моль/1

моль хлорофилла, что составляет примерно 87 титруемых групп на 231 молекул хлорофилла или на один РЦ фотосистемы 2. Фотоиндуцирован ное уменьшение буферной емкости наблюдается также при непрерывно!

неравновесное титрование препаратов ФС-2 в диапазоне рН 4,0 - р1 9,0 не сопровождается их необратимой инактивацией, мы проводаш повторное титрование одного и того же образца в темйоте и на свету. При этом кривая буферной емкости, полученная при титровании ] темноте после освещения, практически не отличалась от контрольно! темновой кривой. Эффект наблюдается только в функционально активных препаратах, обратим в темноте и повторяется в циклах световьи и темновых титрований.

Тот факт, что действие света проявляется в равной степени ка! при равновесном, так и при непрерывном титровании, может свидетельствовать о том, что часть титруемых груш, которая вовлечена I реакцию на свет, легко доступна титранту, то есть расположена не периферии пигмент-белкового комплекса ФС-2. В то же время, медленно уравновешивающиеся с титрантом группы, по видимому, не участвуют в реакции на свет, т.е. являются более консервативными. Диапазон рН, в котором наблюдается фотоиндуцированное изменение буферной емкости, указывает на участие боковых карбоксильных груш вспарагиновой и глутаминовой аминокислот в этом эффекте.

Можно предположить что в препаратах ФС-2 при освещении воз никает новое конформационное состояние пигмент-белкового комплекса, релаксирущее в темноте и характеризующееся уменьшением титруемых груш в диапазоне рН 4,0 - 5,5. На свету часть карбоксильных груш белков ФС-2 приобретает рК, лежащее за пределами титрования. Такой сдвиг рК в область более низких значений может быи вызван появлением дополнительных положительных зарядов в ближайшек окружении этих груш (вероятно на окисленных переносчиках электронов в донорной части ФС-2). Возможно также, что протоны, выде

лящиеся на донорном участке ФС-2 на свету, связываются с доступными карбоксильными группами белков ФС-2, находящимися вблизи водоразлагающего комплекса. В результате этого при титровании на свету данные группы уже не способны принять протоны водной фазы при добавлении кислоты.

Таким образом, обнаружено обратимое фотоиндуцированное уменьшение количества групп препаратов ФС-2, титруемых в диапазоне рН 4,0 - рН 5,5. Эффект затрагивает приблизительно 87 остатков аспа-рагиновой и глутаминовой кислот на один РЦ.

3. Влияние обратимой инактивации донорного участка ФС-2.

. Помимо изучения действия освещения мы изучали также влияние инактивации и реконструкции системы окисления воды на протонакцеп-торные свойства ФС-2. Для этого препараты подвергали известной обработке, приводящей к ингибированию донорной части ФС-2 (с помощью Трис-НС1-буфера). Обработанные таким способом препараты лишены суммы водорастворимых белков с М.м. 18, 24 и 33 кДа и более 98% марганиа /кНлт еЪ а1., 1982/ и характеризуются потерей способности к фотопереносу электрона в реакции Хилла, к фотоиндуциро-ванному увеличению выхода флуоресценции, а также повышением чувствительности К £отоингибированию /КИтоу е1; а]., 1990/. Как ВИДНО

Таблица I.

Светоиндуцированное изменение буферной емкости субхлоропластных препаратов ФС-2.

Образец Величина светоиндуцированного изменения буферной емкости

г-экв. Я4/ М Хл г-экв. Н4/ РЦ

Частицы ФС-2 0,36 0,38 87 90

Трис-НС1-обрабо-танные частицы 0,24 0,19 57 45

Трис-НС1-обрабо-танные частицы после освещения втечение 10 мин 0,23 54

Трис-КС1-обрабо-танные частицы + 6 мкМ МпС12 0,37 92

из табл. 1, в результате ингибирования донорной части ФС-2 фотоин-

дуцированное изменение буферной емкости в интервале рН 4,0 - рН 5,3 уменьшается с 0,36 до 0,24 г-экв. Н*/ Н Хл, причем оставшаяся часть эффекта становится необратимой в темноте. РедоСавление 6 мкМ МпС12 без белков 18, 24 и 33 кДа реактивирует фотоперенос электрона в ФС-2 на 80-85)6; такое же количество Мп2+ полностью восстанавливает уменьшение буферной емкости на свету, обратимое в темноте.

Известно, что Трис-обработанные препарата ФС-2 характеризуются повышенной чувствительностью к фотоингибированию в отсутствие экзогенного Мп2+. Как показали наши исследования, предварительное освещение таких препаратов, приводящее к фото- инактивации донор-ной части ФС-2, подавляет реактивацию как фотопереноса электронов, так и фотоиндуцированного уменьшения буферной емкости (таб. 1). Таким образом, изменения буферной емкости препаратов ФС-2 при освещении связаны с электронным транспортом в ФС-2 и требуют функциональной целостности прежде всего ее донорно-го участка.

Этот подход ( Трис-НС1-обработку) мы применили также для изучения влияния ингибирования донорного участка ФС-2 на ее протон-акцепторные свойства в отсутствие освещения. В табл.2 представлено

Таблица 2.

Изменение доступности ионогенных груш ФС-2 протону водной фазы при различных обработках.

Образец Содержание титруемых аминокислот (в расчете на I РЦ) Количество легкодоступных груш (в расчете на' I РЦ)

Частицы ФС-2 680 320-390 46-5856

СаС1г-обрабо-танные частицы 610 340 5556

Трис-НС1-обрабо танные частицы 610 550-570 85*

Трис-НС1-оорабо танные частицы + 6 мкМ МпС12 610 360 62*

количество легкодоступных титруемых групп контрольных и Трис-обработанных препаратов ФС-2, расчитанное по результатам неравновесного титрования кислотой. Видно, что в этих условиях титрования Трис-обработанные препараты характеризуются значительным увеличением количества ионизируемых груш по сравнению с контролем, несмотря на то, что при этой обработке удаляются водорастворимые

белки, что приводит к уменьшению общего количества ионогенных групп. (Следует отметить, что обработка с помощью 1 М СаС12, приводящая к удалению тех же белков, но без полного удаления Мп, не вызывает увеличения количества протонируемых групп ФС-2 легко доступных титранту ( табл.2)).

Добавление каталитически малых концентраций экзогенного Мп2+ приводит к значительному уменьшению количества титруемых групп Трис-обработанных препаратов ФС-2. Зависимости количества протон-акцепторных групп Трис-обработанных препаратов ФС-2 от концентрации добавленного марганца имеет насыщение при 6-8 атомов Мп на один РЦ, что соответствует концентрации, необходимой для реактивации функциональной активности ФС-2. При этом количество кислоты,

Рис.II. Зависимость коли- £ чества легко доступных титруемых груш Трис- обрабо- з танных частиц ФС-2 в области рН 4,0- рН 9,0 от концентра- в ции добавленного МпИг. На Р оси абсцисс показано (*) ко- 5 личество легко доступных тит- 1 руемых груш контрольных *

частиц. ' 4 ■ ^ ..

связываемой Трис-обработанными препаратами при быстром титровании, уменьшается до уровня, близкого к контрольному. Расчеты показывают, что максимальное количество груш, которые могли бы быть вовлечены в координационное взаимодействие с марганцем, значительно меньше величины наблюдаемого при связывании Мп2+ эффекта.

Наблюдаемое в результате Трис-обработки увеличение количества титруемых в неравновесных условиях груш можно объяснить облегчением доступности для протонов ионогенных груш белков ФС-2 в результате общего "разрыхления" мембранной структуры препаратов ФС-2 при нарушении молекулярной огранизации донорного участка ФС-2. На это указывает также то, что в присутствии 400 мМ сахарозы протон-акцепторные свойства препаратов ФС-2 до и после Трис-обработки одинаковы., Сахароза изменяет осмотическую силу среды и вязкость раствора, и тем самым, как известно /Ананьев, 1988/, оказывает структурирующее воздействие на препараты ФС-2.

Связывание Мп вновь возвращает "компактную" структуру комплекса, характеризующуюся меньшей доступностью титруемых груш. Высокая эффективность действия каталитически малых концентраций Мп2+ может указывать на то, что перестройка пигмент-белкового комплекса ФС-2 - необходимое условие для эффективного захватывания и удержания Мп в каталитическом центре.

5. Протонакцепторные свойства бежа с М.м. 33 кДа.

Как было показано выше, на воздействие света и марганца реагируют группы, относительно легко доступные титранту, т.е. расположенные на периферии комплекса ФС-2, и, следовательно, можно ожидать, что водорастворимые белки тоже должны участвовал! в этих реакциях. Однако, на фоне перестроек всего комплекса ФС-2 не удается выявить изменения белков с М.м. 18, 24 и 33, поскольку их относительный вклад в суммарное количестко титруемых групп слишком мал. В то же гремя, именно эти белки находятся в непосредственной близости от места окисления вода и выделения протонов и, следовательно, представляется интересным изучение их особенностей взаимодействия с протонами.

В результате наших исследований было обнаружено, что для суммы водорастворимых белков ФС-2 с М.м. 18,24 и 33 кДа характерно несовпадение кривых титрования кислотой и щелочью. Является ли наблюдаемый эффект результатом взаимодействия этих белков друг с другом или характерен для какого-то одного из них? Раздельное титрование водорастворимых полипептидов ФС-2 показало, что кислотно-щелочной гистерезис характерен только для белка 33 кДа. В настоящее Бремя общепринято, что водорастворимый полипептид с Мм 33 кДа наиболее существенен для процесса окисления воды и выделения кислорода на донорном участке фотосистемы 2 /Hansson and Werdzshinsky, 1990; Seibert and Cotton,1985; Ono and Inoue, 1995/. Однако, конкретная функция этого белка остается неясной.

Чтобы идентифицировать титруемые группы бежа 33 кДа мы использовали кривую буферной емкости, полученную при титровании белка от нейтрального рН кислотой или щелочью.

Рис.5. Кривая буферной емкости белка с М.м.33 кДа, полученная при титровании образца начиная от рН 7,5 кислотой и щелочью. Концентрация белка в ячейке составляет 0,02 мМ.

а« ■ а

РН

Кривая буферной емкости белка 33 кДа состоит из двух хорошо различимых пиков - пика "А" с рК 4,0-4,2, пика "В" с рК 5,6-6,8 и широкой полосы "С" при рН > 8,0. Расчеты показывают, что в интер вале рН 7,0 - рН 3,0 связывается 32-35 грамм-экв. Н+ на один моль белка ( пики "А" и "В"), причем площадь пика "В" соответствует 10-15 грамм-экв. И1". В щелочном диапазоне рН (полоса "С") титруется 20-24 ионогенных групп на один моль бежа.

Эти данные согласуются с результатами аминокислотного анализа белка 33 кДа /oh-oka et ai. ,1986/, в соответствии с которыми на одну молекулу голипептида приходится 35 дикарбоновых аминокислот. Белок с Мм 33 кДа не содержит остатков гистидина и свободного цистеина, способных связывать протоны в нейтральном диапазоне рН. Титрование остатков тирозина, лизина и аргинина происходит в щелочном диапазоне рН (полоса "С").

Наличие лвух пиков, относящихся к протонированию боковых карбоксильных групп дикарбоновых аминокислот - пик "А" и пик "В", может быть обусловлено их гетерогенностью, связанной с расположением в аминокислотной последовательности белка, или с формированием его третичной структуры. Группы пика "В" имеют рК, смещенные в щелочную область от среднего значения рКо карбоксильных групп (рКо боковых карбоксильных групп в белках составляет 4,2 /Кантор и Шиммел, 1984/), т.е. обладают повышенным сродством к протонам, что может быть связано с их близким расположением в аминокислотной цепи и взаимным влиянием друг на друга /Tanford, 1962/. В аминокислотной последовательности белка 33 кДа /0h-0ka et ai., 1986/,как показал наш анализ, можно выделить несколько участков с повышенной плотностью отрицательного заряда. Суммарное количество карбоксильных групп на этих участках составляет 14 груш на молекулу белка, что близко количеству титруемых груш пика "В". Таким образом, можно предположить, что протонирование двух пулов боковых карбоксильных груш дикарбоновых аминокислот обуславливает пики "А" и "В", а полоса "С" - титрованием основных аминокислот.

Из рисунка 6 видно, что кривые титрования бежа 33 кДа кислотой и щелочныо в интервале рН 4,0 - 9,0 не совпадают, причем суммарное количество ионогенных груш, способных связывать протоны в этом диапазоне рН одинаково при кислотном и при щелочном титровании, т.е. кривые протонирования и депротонирования бежа представляют собой замкнутую петлю гистерезиса. Кислотно-щелочной гистерезис, возникающий при титровании белка 33 кДа. не устраняется при замедлении титрования в 2-3 раза при помощи увеличения

временного интервала между порциями титранта или при добавлении в ячейку амфолинов, и, следовательно, он не связан с процессами диффузии в ячейке.

Рис.6. Кривые титрования Селка с М.м. 33 кда 10 мМ НС1 (I)и 10 мМ каОН (2). Среда содержала 100 мМ НаС1 и 0,004 % амфолинов (рН 4.0 - рН 9,0).

Идентифицировать титруемые группы белка 33 кДа, ответственные за проявление кислотно-основного гистерезиса можно, используя производную кривой титрования по рН - буферную емкость бежа. Кривая буферной емкости, полученная при титровании кислотой, в отличие от щелочной.кривой (рис. 7,а), имеет выраженный пик с максимумом при рН 5.8 (шк "В"). Щелочная кривая характеризуется увеличением буферной емкости при рН >7,0.

Разница между кислотным и щелочным титрованием снижается, если перед титрованием белок некоторое время инкубировался при рН 3,8 (рис.7,б). Из рисунка видно, что в результате прединкубации в кислой среде буферная емкость, расчитанная по данным тирования кислотой, становится близкой к буферной емкости щелочного титрования: в обоих случаях отсутствует пик "В", т.е. после прединкубации белка 33 кДа при рН 3,8 его протонакцепторные свойства теряют зависимость от направления титрования. Действие кислотной инкубации носит обратимый характер и

рн ; рн р»

Рис.7. Кривые буферной емкости белка 33 кДа. а - титрование после преинкубации в течение 7 мин при рН 7,5; б - титрование предыдущего образца после 7 мин инкубации при рН 3,8; в - титрование образца "б" после 7 мин инкубации при рН 7,5. 1-титрование щелочью, 2-титрование кислотой.

выводы.

1. Впервые проведено исследование взаимодействия протонов водной фазы с субхлоропластными препаратами фотосистемы 2 (ФС-2) растений и изолированными из них белками с помощью метода прецизионного кислотно-щелочного титрования.

2. Показано, что количество ионогенных групп ФС-2, способных обратимо связывать протоны в диапазоне рН 3 - рН 7, составляет 580 -15 моль в расчете на один моль реакционного центра (РЦ) ФС-2. Это соответствует общему количеству аспарагиновой, глутаминовой кислот и гистидина в этих препаратах (~600 ± на один РЦ), определенному с помощью аминокислотного анализа.

3. Сравнение результатов равновесного и неравновесного титрования позволило дифференцировать ионогенные группы препаратов ФС-2 по степени их доступности протонам водной фазы. Время установления равновесия варьирует от 10 -15 сек для групп с рК < 5,0 до 1,5 -2 минут для групп с рК 6,2, вероятно, принадлежащих остаткам гистидина (около 90 молей на один моль РЦ).

4. Обнаружено фотоиндуцированное уменьшение количества карбоксильных групп препарата ФС-2, титруемых в диапазоне рН 4,0 - рН 5,3. Эффект обратим в темноте, затрагивает 78 - 85 остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот в расчете на один РЦ фотоситемы 2 и для его проявления требуется сохранение функциональной активности донорного участка ФС-2. Удаление (с помощью ■ трис-НС1-обработки) периферических белков и Мп2+ингибирует фотоиндуцированное изменение буферной емкости, которое, наряду с электронным транспортом, реактивируется при добавлении ионов Мп2+.

5. Показано, что трис-НС1-обработка препаратов ФС-2 приводит к увеличению доступности ионогенных групп титранту,тогда как последующее добавление ионов Мп2+ в темноте уменьшает буферную емкость до уровня, близкого к контрольному. Этот эффект значительно превышает максимальное количество титруемых групп белков ФС-2, которые могли бы быть вовлечены в координационное взаимодействие с ионами марганца,'что указывает на участие в связывании марганца конформа-ционных переходов комплекса ФС-2, определяющих высокую специфичность этого процесса.•

6. Обнаружено новое явление кислотно-щелочного гистерезиса буферных свойств белка с М.м. 33 кДа, входящего в систему окисления воды, в области физиологических значений рН, свидетельствующее о наличии двух протон-зависимых конформаций белка. Их взаимопревращение характеризуется изменением рК 12-15 карбоксильных групп и устраняется в результате фиксации бежа глутаровым альдегидом. Другие водорастворимые полипептиды ФС-2 таким свойством не обладают'.

7- На основании полученных результатов выдвинуто предположение о роли протон-индуцированных изменений состояния бежа 33 кДа в функционировании системы фотосинтетического выделения кислорода в связи с его возможным участием:I) в процессе окисления воды за счет связывания выделяющихся протонов, 2) в регуляции доступа молекул воды к водоокисляющему комплексу и 3) в защите ФС-2 от кислотной инактивации за счет функционирования направленного оттока протонов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

.Шутова Т.В., Ананьев Г.М., Климов В.В. " Роль ионов кальция в фотосинтетическом окислении воды." Тезисы докладов всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических процессов". Минск. 1988. .Щутова Т.В., Ананьев Г.М., Опанасенко В.К., Климов В.В. Структурно-функциональные аспекты участия ионов кальция в фотосинтетическом окислении воды и выделении кислорода". Тезисы докладов IV конференции молодых ученых, Пущино. 1989. С.22. .Климов В.В., Ананьев Г.М., Шафиев М.А., Аллахвердаев С.И., Шутова Т.В. "Фотоинактивация и фотореактивация фотоситемы 2 после полного удаления марганца из субхлоропластных фрагментов." Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезирупцих системах и моделях." Пущино. 1989. С.14 -15.

•Опанасенко В.К., Шутова Т.В., Ананьев Г.М..Климов В.В. "Светоин-дуцированные изменения буферной емкости субхлоропластных препаратов фотоситемы 2." Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Цреобразование световой энергии в фотосинтезирупцих системах и моделях." Пущино. 1989. С.99.

Ананьев Г.М., Шафиев М.И., Исаенко Т.В., Климов В.В. "Фотореактивация марганцем функции выделения кислорода после его полного удаления из препаратов фотоситемы 2." Биофизика. 1988. Т.33. В.2. С.265-269.

, Shutova T.V., Opanasenko У.К., Ananyev G.M., Kllmov V.T. In: "Plant metabolism regulation". Varna, Bulgaria, 1991. Vth International Youth sympoBium. oot.8-13 1990.

, Опанасенко B.K., Шутова Т.В., Климов B.B. "Обратимое связывание протонов субхлоропластными препаратами фотосистемы 2 шпината при изменении pH реакционной среды." Биологические мембраны. 1991. Т.8. Н.6. С. 595 - 600.

Щутова Т.В., Опанасенко В.К., Ананьев Г.М. Климов В.В. "Све-тоиндуцированные изменения протонной емкости субхлоропластных препаратов фотоситемы 2 шпината". Биологические мембраны. 1991. т.8. Я.6. С. 601 - 605.

Э.Щутова Т.В., Христин U.C., Опанасенко В.К., Ананьев Г.М., Климов. В.В. "Протонакцепторные свойства водорастворимого белка 33 кДа из фотосистемы 2 шпината* Биологические мембраны. 1992. т.9. N.8. С. 836 - 844.