Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы действия ультрафиолетового излучения на мембраны клеток высших растений

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы действия ультрафиолетового излучения на мембраны клеток высших растений"

А

МНО „ФОРУМ-

АГЕНТСТВО БИОИНФОРМАТИКИ И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи

УДК 577.355

ХАЛИЛОВ Ровшан Ибрагимхалил оглы

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА МЕМБРАНЫ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03.00.16 — экология 03.00.02 — биофизика

Диссертация

на соискание ученой степени доктора физико-математических наук в форме научного доклада

Москва —1992

Работа выполнена на кафедре биофизики и молекулярной биологии Бакинского государственного университета и на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета им.М. В.Ломоносова.

Официальные оппоненты - доктор физико-математических наук, цро-

фесоор Э.К.Рууге;

- доктор баологических наук К.М.Львов;

- доктор физико-математических наук,

Н.А.Ахмедов.

Ведущее учреждение - Агрофизический научно-исследовательский

институт ВАСХНМ (г.Санкт-Петербург). •

Защита диссертации состоится " -6 " «пюУгтууЦ 1992 г. на заседании специализированного Совета Д. 170.0I.101 при Агентстве бюинформатика и экологии человека MHO "Форум" по адресу: II7342 Москва, ул.Бутлерова, 15.

С диссертацией ыэхно ознакомиться в библиотеке Агентства биоинформатики и экологии человека.

Диссертация разослана " 3> " dj>A|uOKfr 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор физико-математических наук

С.Н.Добряков

. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

л',, ^ -1 f

—--—Актуальность проблемы. Важной проблемой экологической биофизики является выяснение первичных биофизических механизмов действия экологически вредных антропогенных факторов на различных уровнях организации растений (мембраны, клеток, организма).

В последнее время в свлзй с происходящими изменениями в экологической обстановке, затрагивающими и облученность живых организмов, развиваются исследования, направленные на выяснение механизмов повреждающего действия длинноволнового Я& света, являющегося важным экологическим компонентом солнечной радиации. К такого рода изменениям следует, в первую очередь, отнести повышение уровня загрязненности окружающей среды, увеличивающее вероятность протекания фотосенсибшшз про ванных деструктивных реакций в клетках (Фрайкин, 1984) и рост интенсивности биологически наиболее активных ТО лучей солнца (300-320 им) в биосфере, вследствие частичного разрушения озонового" слоя атмооферы (fclyea, I975;Memmond , 1975). Среди многих экологических последствий разрушения озонового слоя особое значение придается тому, что даже слабое повышение интенсивности ЗФ лучей в области 300-520 нм приведет к резкому увеличению образования рака кожи у людей под действием солнечного света, а также вызовет повреждение и снижение урожайности некоторых видов растений (Дубров, I968;Van et. ai., 1976).

Отмеченные обстоятельства обусловили возникновение нового направления в ГО фотобиологии. Это направление связано о исследованием механизмов а особенностей повреждающего действия "экологического" ТО света на биологические системы. Следует отметить, что большинство работ в рамках "экологического" направления ТО фотобиологии проводится на микроорганизмах. Благодаря систематические исследованиям последних лет достигнуты успехи в изучении природы таких фотодеструктивных процессов у микроорганизмов, как инактивация, ингибирование роста и деления клеток, повреждение их дыхательных и других метаболических систем (Webb, 1978;Jogger, 1981; Praikin, 1981). У высших растений такого рода процесоы исследованы менее подробно. Однако, интерес к цроблеме действия экологического ТО излучения на эту группу организмов в последнее время тоже вое более возрастает. Под действием света 290-400 нм в растительных организмах наблюдаются многочисленные биологические и биохимические эффекты, связанные о повреждением ДНК л белков. Излучение в

- г -

этой области шгут поглощать различные вещества растительной клетки: витамину, флавиновые ферменты и др., но хромофор, сеисибшшза-рупций повреждение клетки, до сих гор не идентифицирован.

Из различных работ следует (Murphy, I984;Fox, 1979), что мембрана является легко изменяемой и, следовательно, наиболее уязвимой системой растительной клетки. Наиболее общим проявлением повреждения мембраны является нарушение ее барьерной и трансгортной функций. Если повреждения в масштабе клетки значительны, то развивается процесо дезорганизации работы всей клетки и шкет наступить ее гибель. В зависимости от типа клетки и природы действующего фактора поражение клетки шжет быть вызвано, в ¡основном, повреждением. мембранной системы. Работами ряда ученых (Green, 1965;Cook , 1965; Еерестовский и др., 1974; Рощупкин, Владимиров, 1977) выявлена общая закономерность изменения ионной проницаемости мембранных систем клеток. Установлено, что КБ излучение приводит к увеличению пассивной проницаемости мембран, инакгивирует натриевые и калиевые каналы, подавляет активность ферментных систем мембран. Эти эффекты объясняются, в основном, с точки зрения перекисного фотоокисления в липидной фазе мембран или яе разрушением белковых оульфгидрилышх груш, которые, как известно, важны для сохранения барьерных свойств мембран. Сравнительно меньше изучено влияние УЬ сдета на мембранные сиотеш растительных клеток.

В настоящее время пока еще трудно определить последовательность развития событий в случае поражения клетки по "мембранному" механизму. Это делает актуальным исследование механизмов повреждающего действия'экологической Уй радиации на мембранные системы клеток высших растений.

Цель и задачи работы. Целью настоящей диссертации является выяснение первичных механизмов структурно-функциональных изменений различных клеточных мембран высших растений (плазматических, тила-коидных, субхлоропластных частиц ФС1 и ФС2) при действии W радиации.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- методами электрофизиологии изучить влияние 3® света на электрические параметры плазматических мембран (мембранный потенциал, сопротивление мембраны, межклеточные электрические контакты) клеток высших растений;

- выявить W чувствительные компоненты мембран, участвующие в изменено., трансгортных функций;

-з-

- методом ЭЙР-радшспектроскошш и спектрометрии исследовать механизм действия И света на энзргопреобразущие мембраны фотосинтеза;

- методом спиновых зондов и электрофореза выявить первичное действие ЗФ света на структурные компоненты тилаковдных мембран;

- оценить возмо-хность использования биофизических параметров, характеризующих мембраны клеток, в целях прогноза устойчивости растений на ранних этапах развития ЗФ поражения.

Научная новизна работы» Впервые установлено, что первич!Еая ответная реакция плазматических мембран клеток высших растений при облучении И светом проявляется в виде быстрой и обратимой деполяризации МП. Быстрая ЗФ-реакция появляется в сравнительно малых дозах УФ излучения и зависит от рН среды. Входное сопротивление мембран и межклеточные электрические связи до 75 облучения, в период облучения и некоторое время после облучения клеток остаются неизменными. Установлено, что спектр действия быстрой ЗФ-реакции лежит в интерзале длин волн 290-330 нм и эта область спектра соответствует спектру поглощения хинонных молекул.

Обнаружено, что К> облучение подавляет фотохимическую активность ФС2 и вызывает тем самым уменьшение потока электронов между фотосистемами. Наряду с этим происходит высвободждениэ ионов Мп2* из мембраны и наблюдается изменение формы сигнала ЭПР 2.

Методом спиновых зондов показано, что облучения У& светом не вызывают заметных изменений в структурной организации липидной части тилакоцдных мембран. Однако, ЗФ свет уменьшает плотность отрицательных зарядов на поверхности мембран.

Получено, что в результате' ЗФ облучения оубхлоропласишх частиц ФС2, в первую очередь, поврездается марганцевый комплекс системы разложения воды,.происходит выход белка 33 кДа. Обнаружено уменьшение полос 30 и 32 кДа, соответствующих Д^ и ^ белкам (хи-нонсвязывающие), и увеличение доли их димерной формы.

Установлено, что анаэробные и восстановительные условия инкубирования мембранных систем оказывают протекторные воздействия при облучении ЗФ светом, свидетельствующие об окислительной природе механизма 30 ингибированая.

Выявлено, что при действии И света на растительные клетки эндогенным сенсибилизатором слунат локализованные в мембране молэ-кулк хинона. Механизм сенсибилизирующего действия хинонов обусловлен фотогенерацией образования активированного кислорода, внпол-

няющего роль основного инициатора деструктивных реакций, цриводя-щих к йютоинактивации различных процессов в растительных клетках. Предложена схема действия ЗФ-В на мэлекулы хинона в мембранных системах.

Практическое значение работы. Полученные результаты позволяют по-новому подходить к пониманию механизма действш 3® облучения на мембранные системы клеток высших растений. Данные измерения электрических параметров плазматических мембран, сигналов ЭДР собственных парамагнитных центров и спиновых меток и зондов, переменной флуоресценции, электрофореза, а также эксперименты ш кинетике электрон-транспортных реакций позволили развить представлена хромофора-хинона, сенсибилизирующего повреждение клетки. Результаты работы важь.. для выяснения роли мембранных систем в повреждении клеток и адаптации растений к экологической ГО радиации. Эти знания необходимы для создания на их основе методов прогнозирования влияния УФ-В на основные биологические процессы и цродуктивность растений. Научные представления, основные методологические приемы и принципы исследования, обоснованные в работе, используются в курсах лекций и практикумах по биофизике для студентов кафедры биофизики и молекулярной биологии ЫУ.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены и обсуждены на следующих научных собраниях: Всесоюзная школа-семинар по первичным процессам фотосинтеза (Пущино, 1978); Пятая Всесоюзная конференция по фотоэнергетике растений (Алма-Ата, 1978); на Ломоносовских чтениях МГУ (1978); на Всесоюзных школах-конференциях "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1977, Ш1); Второй всесоюзной межуниверситетской конференции по современным проблемам биологии (Тбилиси, 1980); Всесоюзном совещании по биоантиоксидантам (Москва, 1983); на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на Всесоюзной конференции "Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урожайности" (Львов, 1984); Международной конференции ученых стран-членов СЭВ по биофизике мембран, белков и нуклеиновых кислот (Братислава, ЧССР, 1985); Научной конференции ученых Казанского института биологии № АН СССР (Казань, 1984, 1986); Международном симпозиуме по ЭПР-спектроснопии в биохимии, молекулярной биологии и медицине (Братислава, ЧССР, 1988); Международном симпозиуме по фотобиологии и биотехнологии (Познань, Польша, 1989); У1 международной конференции по переносу электрона

и энергии (Прага, ЧССР, 1989); П Международной школе по электромагнитным полям и мембранам (Плеша, Болгария, 1989); Шестой всесоюзной межуниверситетской конференции на тему "Биологические мем-6paini в норме и патологии" (Тбилиси, 1988); X международном биофизическом конгрессе (Ванкувер, Канада, 1990); Шанхайской конференции по физиологии растений (Шанхай, КНР, 1990); 71 международной конференции то метаболизму и регуляции растений (Варна, Болгария, 1991), а такие на республиканских конференциях (1982,1983,1984, 1989,1991).

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в более 50 работах в отечественных ("Биофизика", "Доклада АН СССР", "Молекулярная биология", 'Физиология растений") и зарубежных (Biochim. biophya.rea.Coramun) научных журналах, в материалах международных, всесоюзных, республиканских конференций и научных сборниках.

Методические аспекты работы. Исследование процессов действия ЭФ света на мембранную систему представляет собой широкую мевдис-цнплинарную проблему. Эта область включает задачи, относящиеся к компетенции фотофизики и фотохимии, биофизики и физиологии растений. Следует отметить, что при изучении действия У5 света на растения основополагающее значение на всех этапах шел физико-химический подход: эксперименты с измерением электрических параметров клетки (Doughty,Hope, l973;Koroz, 1987), эксперименты с листьями (Caldwell, I984;lmbrie,Murphy, I984;Tevini, I98I;Toramura, 1980), 6 изолированными хлорошастами (Hanger, I982;Kulondoilevu, 1982), спектра.;.уше измерения (Iwanzik, I983;Krauae, IS82;Vogolman, 1989).

Приступая в конце 1974 годов к исследованиям фотосинтетического транспорта электронов, мы приняли в качестве основного методического подхода спектроскопию элекгр01Ш0Г0 парамагнитного резонанса (ЭПР), опираясь-на опыт и традиции, сложившиеся в области биологических приложений ЭПР в лаборатории Л.А.Блшенфельда. Перспективность ЭПР в исследованиях фотоспнтетических процессов определяется тем, что все известные компоненты электронтранспортной цепи представляют собой, в основном, одооэлектрошше переносчики и как таковые, в принципе, могут давать сигналы ЭПР, по крайней мере, в одном из своих редокс-состояний. К преимуществам метода ЭПР относится применишсть этой области спектроснэпии к образцам произвольной (в том числе переменной) оптической плотности, нечувствительность растительных клеток к излучению СЛ-диапазона малой

мощнооти, отсутствие фонового поглощения, характерного для оптической спектроскопии фотосинтезирующих систем.

Сигналы ЭПР регистрировали на спектрометре 3-см диапазоне "Verlan Е-4" с приставкой для термостатирования образцов. Часть экспериментов проводили на спектрометре РЭ1306 .Измерения в интервале 14-60Рк проведены на спектрометре ЭПР о гелиевым термостатом. Для обработки спектров ЭПР в выделения слабых сигналов на фоне шума использовали ЭШ модели G-Сои FC-883 .

Электрические параметры мембран клеток растений, в частности, мембранный потенциал (МП), сопротивление мембраны (MC) и межклеточные электрические связи измерялись с помощью методики микроэлектродной техники (Лялин, 1980). Во время опытов отделенные листья элодеи, валлиснерии или корни трианеи находились в камере под микроскопом и омывались проточными растворами. При одновременной регистрации МП и UC в клетку вводили два одинаковых микроэлектрода, один служил для подачи импульсов фиксированного тока, другой - для регистрации МП и ею смещений цри пропускании тока (üv). Токовый электрод для резистора 10® Ом и делитель напряжения соединялись с источником напряжения (50 В). В качестве стандартных были выбраны П-образные импульсы деполяризующего и гиперполяризующего тока длительности 2 сек. Для оценки сопротивления межклеточных контактов в соседнюю клетку вводили третий микроэлектрод и одновременно iV1 регистрировали смещение МП этой клетки ¿v2 . Отношение =К обращается в нуль при отсутствии связи между клетками и может служить качественной характеристикой межклеточных контактов.

Разумеется, методы ЭПР и микроэлектродной техники не универб-сальны, и лишь совокупность различных методов абсорбционной спектроскопии, фотофизиологии и структурных методов позволяет делать уверенные выводы о деталях молекулярного механизма действия И> света на мембранные системы клеток растений. В связи с этим, приняв за основу методы ЭПР и микроэлектродной техники, мы использовали и ряд других методических подходов: ампереометрические измерения кислородввделяющей активности, данные спектрофотометрии, электрофорез, хемнлюмияесценцию и ряд других методов.

Основным источником Я излучения служила ртутная лампа высокого давления ДРТ-230, которая имеет линейный спектр излучения. Использовали также другие типы ламп: бактериоцидную БУВ-15 и лампу сверхвысокого давления ДРШ-250, отличающихся по спектру излучения

от лампн ДРТ-230. Интенсивность излучения составляла 20 В?/г,?. В отдельных ЭПР экспериментах листья облучались эксимерным импульсным лазером светом длиной X =308 нм. Длительность импульса равнялась - 50 не, частота импульсов I энергия в импульсе - 120 цДя . Методика облучения позволяла проводить записи параметров плазматических мембран непрерывно во время облучения и длительное время после прекращения облучения.

Объектом исследования служили системы различного уровня сложности и нативяооти: листьев высших растений, изолированные хлоропласт, субхлоропласгные препараты, шлуче1шые путем фрагментации с применением ультразвука и детергентов. Для изучения отдельных стадий электронного транспорта широко использовались искусственные доноры и акцепторы электронов, ингибиторы электронного транспорта.

I. ВЛИЯНИЕ И СВЕТА НА ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МШЕРАН КЛЕТОК ШСШ РАСТЕНИЙ.

Ц то плаз мат ич е с кая мембранная система является весьма чувствительным компонентом растительных клеток, которая подвергается воздействию внешних физино-химичеоких факторов, в частности, ЗЧ> излучения. Изучение механизма влияния 75 света на структуры и функция плазмалемыы является весьма важной задачей. Структурно-функциональные изменения, происходящие в плазматической мембране клеток растений под действием ЗФ излучения, могут играть, с одной стороны, сигнальную роль, но, о другой стороны, эти изменения могут иметь определяющую роль в повреждении клетки.

Как известно, транспортная функция плазматических мембран клеток растений является основной, ее нарушение при действии тех пли шшх факторов внешней среды сильно сказывается на физиологическом состоянии клетки. Для изучения транспортной функции, плазматических мембран в настоящее время широко применяются биофизические методы. Среди этих методов самым распространенным является измерение электрических параметров мембран при гошщи микроэлектродной техники. Достоинством этих методов является то, что в экспериментальных условиях полностью обеспечивается нативность плазматических мембран. Мшфоэлектродная техника дает информацию о характере и изменениях электродвижущей силы ионов на мембране, об интенсивности ион-трансшртннх процессов, позволяет судить о структурных изменениях в мембране и межклеточных взаимодействиях, изменяющихся под влиянием различных факторов.

В литературе имеется рад данных о влиянии излученш на электрические параметры мембран растений. Например, в серии работ (Doughty,Нора, 1973, 1976) всесторонне изучено влияние ЗФ света нп электрические параметры мембран клеток харовых водорослей. Подобные эксперименты проведены и в клетках Hiteila в работе (stoiarek, Karz, 1987). Во всех этих работах, в основном, исследовано влияние коротковолновой области 3® излученш (ЗФ-С) на электрические параметры мембран. Показано, что при облучении клетки харовых водорослей мембранный потенциал (МП) деполяризуется, увеличивается мембранная проводимость и генерируется потенциал действия. Деполяризующие эффекты ТО света они приписывают к двум независимым процессам: увеличению цроводимэсти С Г" ионов и инактивации электрогенных насосов. Исходя из этих результатов, южно судить лишь о некоторых аспектах влияния 3® излучения на мембранные системы метки растений. Однако, работы отмеченных авторов ограничиваются, с одной стороны, использованием коротковолновой области И света, а с другой стороны, характерами объектов, которые во многом отличаются от высших растений. Поэтому особый интерес вызывало исследование влияния ЗФ В света на мембранные системы клеток высших растений.

I.I. Кинетика изменения МЛ клеток высших растений при облучении ЗФ светом. Для решения поставленной задачи было изучено влияние ЗФ облучения на фотосинтезирующие клетки листьев выоших водных растений: элодеи (Elodea canadensis Rich), валлиецерии (Vallisneric spiralis L.), клетки подводных листьев ряски (Lemna gibba) и нефо-тосинтезирующие клетки корневых волосков трианеи (Triana bogotenaii Karst ). Крупные клетки этих растений позволяют проводить эксперименты длительное время без нарушения их физиологического состояния и интактности мембран. Кроме того, электрогенез клеток водных растений хорошо изучен и они часто используются в элекгрофи-зюлогических экспериментах. В экспериментах использовали также листьях наземных растений (традесканция, пшеница, кукуруза). Несмотря на возможности измерения МП длительное время (30-40 мин) у клеток этих растений не наблюдали четкого изменения МП при облучении ЗФ светом с той же дозой, которой облучали листья высших вод-¡шх растений. По-ввдимому, это связано с наличием эпидермиса листьев назгп'юс растений, который ослабляет ГО радиацию. Известно, что 90,» УЬ радиации, падающей на поверхность листа, ослабляется упцдорюльща! слоем прсцде, чем она достигает мезофильной клетки (■>iJjwBij. et al., 1983). В наших экспериментах шшро электроды взо-

+ у«р - 9 -

-Уф

Рис.1. Изменение МП клеток лиота элодеи (а), валлиснерии (б) а корневых волооков трианэи (в)' при ЗФ облучении. Интенсивность излучения - 1,2*10® эрг/с^чши.

дили в мезофильную клетку у листьев наземных растений и, вероятно, из-за малых доз 3® радиации не было обнаружено четкого изменения МП. Поэтому в дальнейшем эксперименты проводили с использованием клетки листьев высших водных растений. Из объектов, использованных в экспериментах, самое высокое значение МП регистрировалось у клеток лиота элодеи. МП этих клеток на свету в ШВ достигал 300 мВ. Значение МП у клеток валлиснерии было сравнимо со значением МП элодеи'и составляло в этих не условиях 200-250 мВ. МП клеток листьев ряски приблизительно тагой же, как у валлиснерии. В отличие от клеток листьев клетки корневых волосков трианеи имели несколько меньший МП (120-150 мВ).

При облучении листьев водных растений элодеи и валлиснерш ЗФ светом лампой ДРТ-230 через фильтр УФС-2, который пропускает свет в области 260*350 шл, обнаружили сложное изменение МБ (рис Л). В первые минуты облучения (1,2»106 эрг/га^) происходила быстрая и оильная деполяризация МП. Несмотря на продолжение облучения, МП возвращался к исходному уровню, а затем наступала медленная фаза деполяризации. В течение 5-10 мин облучения МП деполяризовался на 120-130 мВ и выходил-на пассивный стационарный уровень. Дальнейшее облучение не приводило к деполяризации МП. Однако, при длительном (20-30 мин) облучении (3*4«10^ эрг/см?) наблюдали гибель клетки. Характер изменения МП у фотосинтезирующих клеток листьев элодеи и валлиснерии отличался от характера изменения МП у нефотосинтез ирующих клеток корневых волосков трианея. Если у клеток листьев элодеи и валлиснерии в первые минуты облученш обнаруживалась быстрая и обратимая деполяризация и медленная фаза деполяризации, у корневых волосков трианея регистрировалась только медленная фаза деполяризации. Такой сложный характер изменения МП при действии УФ света требовал подробного исследования.

Таким образом, ГО свет может вызывать два типа деполяризации: сначала быструю и обратимую, а затем медленную. Интересным является изучение спектра действия этих процессов. С этой целью, используя различные источники ЗФ света и стеклянные фильтры типа ЗФС и ВС, исследовали кинетику изменения МП при 3® облучении. Опыты с использованием лампы БУВ-15, ДРШ-2Ь'0 и ДРТ-230 показали, что при одинаковых дозах облучения полная картина кинетики изменения МП наблюдалась только при использовании лампы ДРТ-230. Поэтому в экспериментах в качестве источника ЗФ света использовали лампы ДРТ-230. Облучение ¡слеток листьев валлиснерии через ЗФС- и ВС-фильтры показало, что № свет с длиной волны 260*330 нм приводил к появлению обеих фаз деполяризации (рис.2а). Однако, при облучении клетки с использованием фильтров'ЗФС-6 или ВС-4, которые пропускают ЗФ Х"?290 нм (рис.2б) обнаруживалась только первая фаза деполяризации (быстрая ЗФ-реакция). Наконец, при облучении клетки листьев валлиснерии ЗФ светом \у 330 нм (рис.2в) не происходило изменений 1.Ш. Таким образом, по спектрам действия эти фазы деполяризации МП четко различаются. Спектр действия быстрой ЗФ-реакции находится в области с длиной волны 290-330 нм, а медленна1 'Т1азы деполяризации - 260-330 нм.

Деполяризация МП цри ЗФ облучении была обнаружена и в других

+УФ 215мВ I

-Уф

Pec.2. Изменение МП клеток листьев валлиснерии при облучении УФ светом, Х~ 260*330 нм (a),X~290f330 нм (б) иЛ> 330 нм (в).

работах IDoughty et al., I976;3tolarek et al., 1987). Результаты этшс работ показывают, что деполяризация ЦП у клеток харовых водорослей схожа с медленной фазой деполяризации, которая имеет меото у клеток высших водных растений. Однако, быстрая ТО-реакции у клеток харовых водорослей не наблюдалась. Поэтому эта фаза изменения МП при ТО облучении вызывает большой интерес. Эксперименты показывают, что быстрая ТО-реакция происходит при сравнительно малых дозах ТО излучения в имеет особый механизм.

1.2. Индуцируемые ультрафиолетом изменения мембранного потенциала клеток высших растений при действии различных Физяко-хими-ческях факторов. Подробное изучение этой быстрой фазы изменения МП показывает, что при кратковременных (15-25 с) облучениях (5'Ю5 эрг/с&г) ЗФ светом с длиной волны > 290 нм клеток листа элодеи, валлиснерии и ряски происходила быстрая и обратимая деполяризация. Глубина деполяризации при этом в зависимости от исходного уровня МП и от длительности облучения достигала больше половины значения МП. Такая быстрая 30-реакция была характерна для фотосиитезирувдих клеток и не обнаруживалась у клеток корневых волосков трианеи, которые не способны к фотосинтетической деятельности. Как ввдно из рио.З, при включении 3® света происходила быстрая деполяризация, которая продолжала нарастать после прекращения облучения. Затем наступала ретляризация, которая протекала в два четко различимых этапа: относительно быстрый этап и этап, медленно приближающийся к исходному уровню. Сходные формы кривых кинетики изменения МП были получены при облучении клеток различными дозами УФ света. Во всех случаях скорость нарастания деполяризации была независима от дозы облучения. Но цри этом с увеличением последней в определенных пределах щ>уто возрастала глубина деполяризации. Скорость реголяризации МП всегда меньше, чем деполяризации.

Подробно исследована дозовая зависимость амплитуды быстрой ГО реакции. На рис.4 представлена дозовая зависимость быстрой ЗФ-ре-акции клеток листа элодеи. Как видно из этой кривой, дозовая зависимость наблюдаемого эффекта описывается з-образной кривой, свидетельствующей о наличии порога и уровня насыщены*, после которого дальнейшее увеличение дозы облучения не влияет на глубицу деполяризации. Аналогичная дозовая зависимость наблюдается и у медленной фазы деполяризации. Однако, дозовая кривая медленной фазы деполяризации смещается в сторону больших доз ЗФ облучения.

Крупные клетки водных растений позволяют вводить в клетку два и большее количество микроэлектродов без видимых повреждений. Это обстоятельство дает возможность измерить сопротивление мембран и межклеточные электрические овязи (проводимость плазмодесш) при облучении листьев водных растений И светом. По величине смещения МП при пропускании тока мы следили за изменением сопротивления мембран при облучении клетки листьев элодеи. На рис.4 показано измерение сопротивления мембран (вертикальные линии - смещение

26 Ом В

Рис.3.Быстрая УФ-реакция клеток листа элодеи при с ТО облучении (3-10 эрг/см4).ЛV показывает смещение ЦП при пропускании импульсов постоянного тока (5*Ю'ЛА, длительностью 2 сек).

Рис.4. Дозовая зависимость амплитуды быстрой ТО-реакции. Интенсивность излучении -1,2.10° эрг/см2-мин.

5 10 15 время облучения, сек

МП) во время развития быстрой ЗФ-реавдов. Результаты опытов показали, что, несмотря на большие деполяризации МП, достигающие 100150 иВ, сопротивление мембраны не изменяется до и после облучения клеток. Это представляется интересным в дает возможность предположить, что при облучении клетка растений в таких дозах (Ю6 эрг/сиг), при которых развивается быстрая ТО-реакция в мембране, не происходят какие-либо структурные изменения, приводящие к изменению их проводимости.

Л следующих экспериментах при помощи трех микроэлектродов изучено влияние ТО овета на свойства межклеточных контактов.

- Структурной основой межклеточного взаимодействия являются пронизывающие клеточше стенки шшзыодесмы. Подробные исследования межклеточных электрических контактов были выполнены на листьях элодеи в работе (Лялин, Ахмедов, 1573). Электрическая связь ыааду клетками, осуществляемая через шшзыодесмы, не является постоянной. Обнаружено, что в некоторых состояниях межклеточные электрические контакты юх'ут обратимо нарушаться. Установлено, что плаз-

модесмы, соединяющие клетки растений, не являются открытыми полостями, они шгут "открываться" и "за1фываться" при действии различных экзогенных факторов. Такие фЛкторы, как -дщщтрофе-нол, низкая температуре приводят к закрыванию плазмэдесм, а при действии С02, наоборот, плазмодесыы открываются (Лялин, 1980), В наших экспериментах измерение межклеточных электрических связей показало, что проводимость плазмодесм не изменяется при облучении клеток высших растений экологическим ТО светом. Таким образом, входное сопротивление мембран и межклеточные электрические связи (проводимость пла8ыодесм) до ТО облучения, в период облученш и некоторое время пооле облучения, как следует из данных таблицы, остаются неизменными.

Таблиц*» I.

Действие ТО света на входное сопротивление мембраны и межклеточные электрические связи.8

Условия измерения ! Смещение МП при подаче I импульсов тока ! мВ I мВ I !

До облучения 30 +2 20 +1,6 0,66

В период деполяризации 29,5+3 19,5+2,2 0,66

В период реполяризации .30,5+1,5 19,0+1,5 0,65

Длительность облученш 15 сек.

Элодея и валлиснерия на свету обладают высокими значениями МП. Разность между световым и темповым стационарными уровнями обозначается светоиндуцированным мембранным потенциалом - СШП. И- характеру изменений МП в ответ на включение и выключение светг элодея и валлиснерия близка к другим растениям. СШП элодеи и валлиснерии обусловлены процессами фотосинтеза. При непрерывной записи спектров действия максимальные изменения МП обнаруживаются в фотосинтетически активной области спектра (Иванкина, 1984). На' блюдается соответствие максимумов в спектрах действия МП и спектрах поглощения ласта и хлорофилла. Можно было предположить, что ТО облучение, в основном, влияет на механизм активной генерации МП. Чтобы убедиться в правильности этого предположения, клетки листа элодеи облучали после подавления активного транспорта специфическими ингибиторами и выключением фотосинтеза. С этой целью клетки листа облучали в темноте пли после действия ингибиторе окислительного и фотофосфоршшрования <*. -динитрофенола. В темно

250мВ | ЯО^М ОНсЬ

Рио.5. Изменение Щ клеток листа элодеи при действии и ЗФ облучении.

Рис.6. Зависимость амплитуды ЗФ-реакции клеток листа элодеи в зависимости от рН внешней среды.

пгЪ 6 8 10 РН

те МП клеток листа понижался до 150-160 мВ вследствие прекращения фотосинтетических процессов. Однако, при этом активный компонент МП полностью не подавлялся, так как он еще функционировал за очет дыхания. При действии с*, -динитрофенола активная часть МП

полностью подавлялась и уровень МП снижался до 80-90 мВ (рио.5). Облучение клеток листьев высших водных растений ЗФ светом (290330 км) в темноте и после действия ингибиторов метаболизма клетки (диурон, <*.-динитрофенол) показало, что индуцируемая ЗФ оветом деполяризация МП не наблюдается (рис.5).

В следующих экспериментах клетки листа элодеи облучались при различных температурах. Получено, что со снижением температуры . исходный уровень МП уменьшается. Это связано с замедлением метаболических процессов. При снижении температуры амплитуда быстрой ЗФ-реакции тоже уменьшается. Следует отметить, что при этом характер общей реакции изменения МП не меняется.

Клетки водных растений обычно облучались в искусственной прудовой воде, в состав которой входили ионы .Еа+,К,',Са2+,С1_. Особый

ДМЛ,мВ

интерес вызвал вопрос о влиянии ионов на кинетику измененш МП при облучении клеток листьев ЗФ светом. Этими опытами шжно было выяснить, с одной стороны, изменение свойств пассивных каналов, с другой стороны, ответить на вопрос - какие шны участвуют в генерации быстрой №-реакции. Для этого в широком диапазоне варьировали концентрации и состав ионов во внешней ореде. Подробное изучение быстрой ЗФ реакции в зависимости от ионного состава внешне] среды показало, что она не зависит от присутствия ионов К*",На+, . Са2+, СГ~. Однако, деполяризациями клеток листа элодеи, вызываемая ЗФ светом, оказалась сильно зависимой от рН среды. При снижения рН среды амплитуда деполяризации увеличивалась, а при возрастании, наоборот, уменьшалась и при рН среды 9,5 и более становилась мало заметной (рис.6). При снижении рН среды кривая дозовой зависимости смещена в левую сторону.

1.3. ^-выводящий комплекс плазматических мембран клеток вне» ших растений при ЗФ облучении. В настоящее время южно считать доказанным, что в генерации МП клеток растений основную роль играют электронные протонные насосы. Имеются два представления о природе электрогенных Н^-помп. Существуют многочисленные экспери ментальные данные в пользу существованж Н^-АТОазного ферментативного комплекса на плазмалемме растительных клеток (см.обзор Serrano, l989;Brisicen, 1990). Биохимические характеристики этого ферментного комплекса всесторонне изучены в работах авторов (Leo nard ,Hogee» IS80;0'Meill, Spanswic¡í, 1984). Недавно появилось сообщение об успешном клонировании Н*"-А1Фазного гена и даже обобщи на аминокислотная последовательность для этого фермента (Harper et al. , I989;Boutry et al. , 1989).

Наряду с представлениями о Н^-АЗФазной протонной помпе, поддерживающей МП, интенсивно развивалась вдея о существовании ре-докс-активной природы Н^-помпы. Идея об активном транспорте ионе Н* через клеточные мембраны с иошльзованием цринцила редокс-на-соса впервые предложена Конвеем (1953). В настоящее время сущест вование редокс-системы на плазматических мембранах растительных клеток также обоснованна экспериментальными данными в работах р? да авторов (Новак, Иванкина, I978«-I988;Lin, I984;Trolmer ¿¿arre, 1988). На интактных клетках в эксперименте показано функционирование в плазмалемме клеток высших растений феррицианвдреяукгаза системы редоко-природы (Новак, 1985). Феррицианвдредуктазная реакция растений является экстрацеллюлярной, не связана с выходом

13 клеток в среду эндогенных восстановителей и окислителей и обусловлена взаимодействием экзогенных гексоцианферратов с редокс-юмпонентами плазшлешы, имеющими выход на внешнюю поверхность . 1ембран. Следовательно, феррицианидредуктазная реакция шжет служить критерием функционирования в плазмалемме клеток редокс-сис-сем, а скорости редокс-реакщш могут использоваться для количест-зенной оценки редокс-акгивности плазмалеммы. При восстановлении [юррициагдда у всех изученных объектов наблвдалось закисление ¡реды. В экспериментальных условиях при проявлении редоко актив-юсти растений необходимо присутствие в среде двухвалентных, катионов, снимающих электростатический барьер отталкивания для од-юименно заряженных с клеточной поверхностью ионов феррицианвда .Новак, Миклашевич, 1985). Проведенные исследования свидетельст-¡уют о фунедионировании в плазмалемме клеток высших водных расте-шй редокс-систем, вышлняющих Н^-трансгортную функцию.

Результаты экспериментов показывают, что при облучении ЗФ ¡ветом четко выделяются два типа деполяризации МП: первая, быст->ая и обратшлая фаза деполяризации (быстрая И-реакция) и вторая, аза медленной деполяризации, которая наступает вслед за быстрой Ф-реакцией при продолжении облученш. Интересно, что первичная [ембранная реакция клеток растений на излучение в виде быстрой [ обратимой деполяризации МП характерна для фотосинтезирующих леток лсстьев и не наблюдается у корневых клеток. Реакция клеток :орней на ЗФ излучение проявляется в виде медленной деполяризации [П. Это позволяет предположить различие механизмов транспорта ио-:ов в плазмалемме клеток корня и клеток листьев.

Характеризуя оба эти типа деполяризации, можно сказать, что ¡ыстрая ЗФ-реакция клеток листьев во многом сходна с потенциалом ;ействия. Продолжительность реакции составляет 50-60 с, скорость ;еполяризации не завпбит от дозы облученш, характеризуется нали-ием порога и насыщения. От дозы облучения зависит только глубина ;ешляризации. За считанные секунды МП деполяризуется на 100-120 Зависимость глубины деполяризации от дозы облучения имеет Э-бразную форму. Исследование спектра действия быстрой ЗФ-реакции оказывает, что она вызывается определенной областью длин волн ЗФ интервале 290-330 нм. агорой тип, медленная фаза деполяризации МП, также зависит от озы облученш и имеет з-образнуга дозовую форму. В отличие от \ ыстрой ЗФ-реакции ее спектр действия находится в интервале 260»-

330 км. Различные спектры.действия 'этих реакций говорят о том, что механизмы быстрой ЗФ-реакции и медленной фазы деполяризации имеют разную природу.

Деполяризация ЫП клеток растений при ЗФ облучении может быть результатом изменения пассивных транспортных свойств мембран, как это происходит в случае харовых водорослей (Doughty, 1976). По-стоянотво входного сопротивления мембран, неизменность межклеточных электрических овязей при развитии быстрой ЗФ-реакции, а также независимость ее кинетики от присутствия и концентрации ионов натрия а калия во внешней среде свидетельствует b том, что ЗФ облучение в этом случае не влияет на пассивные свойства мембран клеток растений. Наши эксперименты показывают, что при подавлении активной компоненты ЫП.ингибиторами метаболизма отсутствует как быотрая ЗФ-реакция, так и медленная фаза деполяризации.. Это говорит о том, что как при быстрой ЗФ-реакции, так и при медленной фазе деполяризации подавляется активная компонента МП. Вероятно, это связано с подавлением алектрогенного протонного насоса. К тому же глубина деполяризации МП при ЗФ облучении в значительной степени зависит от рН внешней среды. Как видно га рис.6, с повышением кислотности среды амплитуда деполяризации увеличивается, а в щелочных средах становится шло заметной.

Для объяснения полученных результатов нами рассматривается следующая модель Н^-выводящего комплекоа плазматических мембран клеток высших растений (рис.7). Согласно этой модели, на плазма-леше рамительншс клеток параллельно функционируют оба типа Н*"-помпы: ' Н!"-АЗФазный ферментативный комплекс и Н^-помпа редокс активной природы. Идея о параллельном функционировании двух типов электрогенной Н^-помш на плазмалемме клеток растений выдвинута и в работах (Rubinsteine et al., I986;Marre et al., 1989). Есть данные о том, что они взаимосвязаны, однако, окончательные доказательства этой связи до сих пор отсутствуют.

Придерживаясь идеи о существовании параллельно Н*~-АТ£азного и редокс активного типа Н*"-помпы (рис.7) на плазмалемме клеток растений, мы.предлагаем следующее объяснение полученного наш эффекта при ЗФ облучении. Спектр действия быстрой ЗФ-реакции в области 290-330 нм говорит о том, что в этом случае ЗФ влияет непосредственно на небелковый компонент плазыалеммы. Это может быть компонент редокс активного комплекса. По-видимому, ЗФ свет с длиной волны 290-330 ны изменяет функцию и структуру одного из компонен-

ш

п/галмапенма

If лещ hQ

Стимуляция ДрН

Рид.7. Предполагаемая модель Ht-выводшцего комплекса плазматичео-ких мембран клеток растений: I - Hf-АИаза, П - редокс-система (а,б,в - флавопротеиновые компоненты), Ш - ^«-пассивный канал; (}, (^Hg., соответственно, молекулы хшона-гидрохи-нока.

тов редокс-системы. Этот компонент скорее всего является молекулой хинона. Известно, что различные виды хинопов учаотвуют в транспорте протонов и электронов в мембранных структурах хлоро-пластов, митохондрий, водорослей.д цианобактерий (Hloh,Bendell, 1980). Максимумы поглощения различных форм хинона соответствуют спектрам действия быстрой ОТ-реакции.

В нашей модели хинон является переносчиком протонов между внутренними и внешними сторонами плазматических мембран. Происходит векторный (направленный на внешнюю сторону мембраны) перенос протонов, в нем участвует хинон (ф ), переносящий одновременно о электронами а протоны:

снаружи _ _ . , ,

№ • -. » q + 2е + (I)

внутри

Донором протона и электрона для (| являются восотановленные пири-диннуклеотиды НАД(Ф)Н2. На элодее показано, что уровень восста-новленности HAJJSHg и НАД^ в клетках на овету увеличивается (Graham,Cooper, 1967; Хебер, 1972).

Будучи низкошлекуллррым веществом, хиной постоянно не связан

с каким-либо белковым центром в отличается высокой латеральной и поперечной подвижностью в мембранах. Ч - двухэлектронный переносчик, причем, существующий преимущественно в полностью окисленной или полностью восстановленной (хинольной) форме, семнхинонные радикалы не накапливаются. Восстановление () соггровоздается поглощением двух щротонов, а окисление - отщеплением двух протонов, т.е. редоко-реакции сопряжены о переносом Н*. Поскольку донор и акцептор (флавопротеиновые комплексы), между которыми переносит электроны, находятся вблизи внутренней а внешней поверхности плазматической мембраны, соответственно, возникает траномембран-ный шток протонов во внешнюю среду, а электроны, двигаясь дальше по цепи, восстанавливают кислород во внутренней среде, и генерируется 1Ш. Имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные указывают на оущеотвование трансмембранного хинон-зависимого переноса водорода (ОДат1,Нашэка, 1979).

Под действием Я овета (290-330 нм) хинонные молекулы переходят в возбужденное состс. лие и цри этом сенсибилизируется образование активированных форы кислорода. По-видимому, в результате изменения формы молекулы хинона и токсичного действия активированной формы кислорода про походит инактивация редокс-системы. Инактивация редокс-системы, в свою очередь, приводит к деполяризации ЫП или оодкиоленш цитоплазмы, которая стимулирует рН-зави-оимую Н*-помпу .{Г^-АИазного типа (рио.7). Поэтому первоначальная сальная деполяризация ЫП при развитии быстрой И-реакции независимо от прекращения (рис.4) или продолжения облучения (разЛ), реюляризуяоь, возвращается к исходному уровню.

Каким образом происходит стимуляция К*°-АТФазной Н*"-шмпН? Установлено, что активность АТОазной Н^-помпы контролируется значением внутриклеточного рЙ1(Лялин, 1979;Нотап1 et п1., 1985) и трансмембранным электрическим потенциалом (вейте а1., 1981). Поэтому в данном случае ре поляризация ЫП вслед за деполяризацией цри действии Я света может быть результатом стимуляции Н^-помш от двух факторов: за счет подкисления цитоплазмы или же деполяризации мембраны (ДЫШ.

Появление медленной фазы деполяризации при ТО облучении в области длин волн 260-300 нм соответствует поглощению ТО света белковыми молекулами. В работах (Каюшин, 1973; Львов, 1978) было научено образование радикалов в белках при действии ТО света. Исходя из этого можно заключить, что при продолжении ТО облученш

(при больших дозах) подавляется одновременно активность If!"—А1Фаз— ного ферментативного комплекса. Подавление АТОазы плазматических мембран клеток растений под действием больших доз ЗФ света показано в других работах. Природа указанных ЗФ индуцированных изменений была исследована в экспериментах с изолщюванными плазматическими мембранами (imbrie.Murphy, 1982). Оказалось, что наиболее чувствительным к ЗФ'облучению компонентом этих мембран является АТФаза, связанная с трансмембранным ионным транспортом, причем, ее фотоинактивация происходит в результате прямого поглощения квантов ЗФ света. В пользу этого свидетельствует тот факт, что квантовый выход инактивации АТФазы был одинаковым при облучении как мембраны, так и раствора очищенного фермента. Показано, что при облучении клеток ЗФ светом с длиной волны с максимумом 290 нм активность АТОазы плазмалеммы инактивируется на 9С$. Эти данные выступают в пользу влияния ЗФ света при больших дозах (If5«I0' эрг/см2) на ферментные компоненты плазмалеммы клеток растений.

Таким образом, обнаруженные явления, связанные о влиянием ЗФ света на электрические характеристики плазматических мембран клеток высших растений, объясняются в рамках модели н!"-выводгадего комплекса плазматической мембраны, состоящего из двух взаимодействующих электрогенных помп: Н^-АТФазного ферментативного комплекса и Н!"-помпы ре до кс активной природы. На основании спектра действия, рй-зависимости и кинетических особенностей изменения МП под действием ЗФ света (5«10® эрг/сы?) мы можем предположить, что хромэфором, поглощающим'"экологический" ЗФ свет (290-330 нм), являются хияонные молекулы, которые служат компонентом редокс-сис-теш плазматических мембран растений. В других работах (Poag et el., I975^Prailcla et al. , 1986) также показано, что основной мишенью в процессе фотоингибирования дыхания является компонент электронтрансшртной цепи - убихинон. Более того, в экспериментах с интактннми митохондриями дрожжей было установлено, что убихинон выполняет роль и первичного хрошфора. Такой вывод следовал из совпадения спектра действия фотоингибирования с'укцинатоксидазной активности митохондрий со спектрами поглощения убихинона. Интересно , что компоненты электронтранспортной цепи, расположенные с ее восстанавливающего конца (НАД и флавопротеиды), обнаруживали изменения во флуоресцентных характеристиках, соответствующие их переходу в более восстановленное состояние в результате образования "убпхинонозого блока" (Fraikin, 1986).

Функция хинонных молекул хорошо изучена в энергообразующих тилаковдных мембранах. В мембранных реакциях швстохинон как переносчик электрона отлетается от других компонентов элекгронтран-сдартной цепи (ЭЩ). Он присутствует в сверхстехиометрическом количестве, образуя -штстохинонный пул: около 10 шлекул пластохн-вона на ЭТЦ. Поэтому для выяснения роли и участия хинонных молекул как основного и чувствительного хромофора (сенсибилизатора) в процессе ЗФ ивдуцированных (290-330 нм) деструктивных реакций в клетках высших растений, в дальнейших экспериментах исследовано действие экологического ЗФ света на фотосинтетический аппарат мембран растениГ , • , .

П. СТРЗГКТЗТНО-^ЗШЦШАЖШЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТМАЮВДЮЙ

ЫШБРАШ ХЛОРОПЛАСТОВ .ШСШИК РАСТЕНИЙ ПРИ ЗФ ОБЛУЧЕНИИ.

Механизм действия ЗФ облучения на световые стадии фотосинтеза был предметом исследований в работах различных исследователей. Показано, что ЗФ-С облучение (X 280 нм) ингибирует фотохимическую активность изолированных хлоропластов (Mantel, I967;Kulandai-veiu • 1983). Предполагается, что ЗФ-С облучение дезинтегрирует мембранные структуры, затрагивая, в основном, фотосистему 2 - ингибирует. систему разложения воды (íamauhita, 1968) и разрушает плаотохилон-9 (Trofcat, 1965). Показало, что при этом также снижается активность фотосистемы I (okada, l976;Biggin8, 1989). Имеются данные, что под воздействием излучения ЗФ-В (280-320 нм), в отличие от ЗФ-С, достигающего поверхности Земли, подавляется реакция Хилла (Kulendaivelu, I983;Bornman, 1991) и меняется ВЫХОД флуоресценции хлорофилла а в изолированных хлоропластах и це'лых листьях (Iwanzik, 1983). В обзоре (Tevini«Teramra, 1989) обсуждаются результаты исследований влияния ЗФ-В на физиологические процессы у растений. В тоже время, молекулярные механизмы воздействия ЗФ света на фотосинтетический аппарат высших растений остаются невыясненными. В этой связи нами было изучено влияние ЗФ овета на свойства парамагнитных центров и фотохимическую активность изолированных и иитактных хлоропластов.

ПЛ. Ингибирование Фотохимической активности Фотосистемы 2 изолированных хлорошвстов под действием ЗФ света. За кинетикой окислительно-восстановительных превращений реакционного центра фотосистемы I Р700 -следили по величине сигнала ЭПР I от окисленных центров P7O0!". Во всех опытах придерживались стандартной схе-

Х707 А 650 Л 707 БС *707

Рис.8. Кинетика фотоиндударованных изменений величины ЭПР I в изолированных яяоропластах бобов; а - необлученные; 6 -облученные 30 мин 3® светом (2*10* эрг/см^-с). Пряшыи стрелками, направленными вверх и вниз, показаны моменты включения и выключения непрерывного дальнею красного света (Xшкс=707 нм, нм, 7'Ю3 эрг/см^о), переключение его на ближний щисный свет (Ашко=650 нм, 5 нм, 1СГ* эрг/сь?-с), переключение'белого света (ВС, 4*10^ эрг/с^«с).

мы кинетических измерений. № рис.8 видно, что под действием света Л 707 происходит окисление Р700. 11осле достижения стационарного уровня сигнала ЭПР I от окисленных центров Р700!" этот свет переключали на свет с Х650 (или более интенсивный белый свет), эффективно возбуждающий обе фотосистемы. Уменьшение сигнала ЭПР I обусловлено притоком электронов к Р700!" от ФС2. По степени уменьшения сигнала ЭПР I (рис.8 параметр ДР/Р) мэжно однозначно судить о фотохимической активности ФС2. Принимая во внимание то обстоятельство , что в присутствии метилвиологена (искусственного акцептора электронов) отток электронов от фотосистемы I не лимитирует общую скорость нециклического транспорта электронов, можно заключить, что более высоким значениям параметра ДР/Р отвечает более высокая активность ФС2. При переключении дальнего красного света с А 707 на гораздо более интенсивный белый свет, эффективно возбуждающий обе фотосистемы, наблюдается немонотонная кинетика окислительно-восстановительных превращений Р700. В этом случае, как видно из рис.8, вслед за уменьшением сигнала ЭПР I от Р7О01"

0,5

ДР.'Р - 24 -

■р «1

• -

2 »

„ 1... --1-1-------- 1

0,2 0,1

0

5

10 15 20 I время облучения, мин

Рио.9. Зависимость параметров ЛР/Р (I) и*^ (2) от времени облучения ТО светом изолированных хлоропластов бобов. Интенсивность излучения - 1,2*10® эрг/см2-мин. (стадия ¿-В), вызванного притоком злекгронов от ФС2 к ФС1, наблюдается рост сигнала ЗПР I (стадия В-С). Увеличение концентрации Р70С^ во время действия непрерывного белого света обусловлено замедлением скорости переноса электронов между фотосистемами вследствие закисления внутритилавовдяого пространства.(Тихонов, 1986).

Опыт показывает, что величина сигнала ЭПР I, индуцируемого сзетоц А 707, не меняется в результате ТО облучения. В тоже время, после предварительного облучения хлоропластов ТО светом кинетика фотоиндуцированных превращений сигнала ЭДР I несколько изменяется: спад сигнала оооле включения света с А 650 (рис.8, параметр АР) уменьшается. Это свидетельствует о том, что ТО облучение приводит к уменьшению фотохимической активности ФС2. Нарлду с этим замедляется скорость восстановления Р700!" после выключения дальнего !фасного света X 707. Немонотонность кинетики окислительно-восстановительных превращений Р700 в ответ на включение белого света ("перехлест" А-В-С) сохраняется у облученных ТО светом хлоропластов. Наличие такого "перехлеста" в кинетике окислительно-восстановительных превращений Р700 является характерным показателем возникновения трансмембранной разности рН (Тихонов, 1986). Отсюда следует, что освещение хлоропластов ТО светом не затрагивает сколь-лйбо существенно протонную проводимость тилако-идных мембран.

Измерение величины так называемого "рабочего интеграла" V , пропорционального произведению площади {в ) над кривой реокисле-

нш центров Р700 под действием света 707 (рис.8) на интенсивность свьга (I),' позволяет определять относительное число электронных эквивалентов в цепи электронного транспорта между фотосистемами (Marsho,Kok, 1970). На основании кинетических измерений было показано, что после облучения изолированных хлоропластов ТО светом происходит инактивация ФС2, что приводит к уменьшению количества восстановленных переносчиков электронов между фотосистемами.

Зависимость ингибирующего действия ТО света от дозы облучения показана на рис.9. Видно, что уже двухминутное ТО облучение приводит к заметному нарушению активности ФС2. При более продолжительном ТО облучении ингпбирующий эффект возрастает. Двухфазный характер зависимости параметра Д Р от дозы облучения коррелирует с аналогичной зависимостью скорости спада сигнала ЗПР I гооло выключения света с X 707 (параметр*!^ см.рис.9). Двухфазная зависимость эффекта от дозы облучения свидетельствует о наличии нескольких мишеней, тлеющих различную чувствительность к дейотвию света.

П.2. Исследование кинетики окислительно-восстановительных превращений Р700+ в листьях высших "растений при ТО облучении. Данный раздел посвящен исследованию действия ТО света на кинетику фо то индуцированных окислительно-восстановительных превращений реакционных центров фотосистемы I и механизм регуляции скорости электронного транспорта в интактннх хлоропластах.

На рис.10 показана типичная кинетика окислительно-восстановительных превращений P70öt, индуцированных действием света различного спектрального состава. Видно, что под действием дальнего красного света, возбуждающего преимущественно ФС1, происходит рост сигнала ЗПР I, вызванный увеличением количества окисленных центров Р70С(!". При замене дальнего красного света на белый свет кинетика приобретает немонотонный характер (кривая А-В-С). Дня того, чтобы выявить роль различных факторовi ответственных за появление сложной кинетики окислительно-восстановительных превращений Р700 в листьях, было исследовано влияние предыстории освещения (длительность адаптации к темноте и свету различного спектрального состава) на кинетику фотоиндуцированных изменений величины сигнала ЗПР I. Немонотонная кинетика о кислит е льно -во с с тано -вительных превращений Р700 в листьях высших водных растений элодеи, валлиснерии отличается от листьев наземных растений китай-

огой розы (Hibiscus rosft ainesia) и проростков (Зобов (Vioia f»t«).

Ранее было показано (Тихонов, 1966; Рыжиков, 1990), что многофазная немонотонная кинетика изменений сигнала ЭПР I в листьях обусловлена светозавиошш изменением скоростей электронного трансшрта на двух участках цепи - между фотосистемами и в акцепторной части фотосистемы Z. Установлено, что освещение листьев, предварительно адаптированных к темноте или дальнему красному овету, действующий светом, возбуждающим обе пигментные системы, сопровождается увеличением скорости оттока электронов от фотосистема I. Под действием белого света происходит увеличение концентрации окисленное формы P700Î" (рис.10, стадия В-С); проведенные в работе (Рнкииэв, 1990) эксперименты тказывают, что скорость переноса электронов и количество переносчиков электронов между фотосистемами не меняется. На основании этого был сделан вывод, что немонотонная кинетика АНЗ вызвана ускорением оттока электронов от ФИ. Било предположено, что это происходит в результате увеличения количества акцепторов ФС1 - НАДО"!". Опыты с инфильтрацией в лист искусственного акцептора электронов ФС1 - метилвиологена подтвердили это предположение. В присутствии метилвиологена происходит лишь незначительное, по сравнению с контролем, уменьшение скгнада ЭПР I от P7G0 после выключения белого света. Полученные результаты позволили заключить, что в листьях высших растений све-гозависимая регуляция скорости электронного транспорта осуществляется, главным образом, на акцепторном участке ФС1.

Наши эксперименты показали, что облучение листьев ГО светом приводит к изменению немонотонной кинетики окислительно-восстановительных превращений F700. Как видно го рио.П, освещение УФ светом ускоряет выход сигнала ЭПР I на стационарный уровень под действием белого овета. Это может быть следствием: а) уменьшения притока электронов от ФС2 к P700Î" за счет ингибирования ФС2; б) за счет активации оттока электронов от ФС1. Эксперименты показывают, что в облученных листьях (15 мин И&, 3»107 эрг/ci^) при переключении дальнего красного света на ближний красный свет степень уменьшения сигнала ЭПР. I (ДР/Р) но меняется. Однако, увеличение времени облучения до 30 мин (6<ю' эрг/см2) приводит к уменьшению спада величины сигнала ЭПР I шсле включения света с

650, свидетельствующему об уменьшении фотохимической активности ФС2.

Рас.10. Кинетика фото-индуцированных изменений величины сигнала ЭПР I в листьях бобов.

Р|0т.ед

Рис.II. Зависимость параметров АР, Рд, Р^ от времени ГО облучения.

10 20 30 время облучения, мин

В работе Бордановой (1989) исследованы первичные изменения в фотосинтетичеоком аппарате ряда высших растений под влиянием экологической ГО радиации (280-320 нм) и показано, что реакция фотосинтетического аппарата'целых листьев в отличие от экспоненциальной кривой реагирования изолированных хлоропластов на ГО облучение (Ки1апаа1ув1и еЪ а1., 1983) двухфазна. С увеличением дозы облучена. фотосинтетическая активность листьев сначала снижается вдвое, затем наблюдается плато (независимость от дозы) и последующее полное подавление фотосинтетических реакций. Предположено, что причиной снижения фотосинтетической активности на первом этапе действия ГО света" является преимущественно торможение темнових стадий (цикла Кальвина). Снижение карбоксилазной активности рибу-лезодифосфат-карбоксалазы под влиянием ГО облучения описано в (Уи et ей*, 1983).

В облученных листьях (до 5-10 эрг/сгг) ускорение выхода сиг-• нала ЭПР I на стационарный уровень при включении белого света происходит за счет активации оттока электронов от ФС1. Это могло бы быть обусловлено, например, ускорением оттока электронов на уровне ферредоксин-НАде-оксидо-редуктазы за счет активации окои-дазнзй функции рибулезодифосфат-карбокскла;;ы-оксцдазы. Не исключено также, что ГО облучение листьев тогло бы вызывать усгоренне

оттока электронов от на кислород (цепь псевдоциклического транспорта электронов). Опыты, однако, показали, что в присутствии метилвиологена, катализирующего перенос электронов от ФС1 к О2 (инфильтрация кгЧ раствора), ке изменяет кинетику сигнала ЭПР I в ТО облученных образцах. Отсюда следует, что ТО облучение листьев не влияет на функционирование цепи псевдоциклического электронного транспорта. Цепь псевдоциклического транспорта электронов не включает в себя участка цепи переноса к физиологическому акцептору электронов НАД?"!"» Более того, опыты с изолированными хлоро пластами гороха класса Б, лишенными ферментов цикла Кальвина и гликолатного цикла, показали, что ТО облучение стимулирует накопление перекиси водорода (В^О^). Это означает, Что непосредственно отток на киолород от ФС1 не может ускоряться. Это дает основание предположить, что влияние ТО облучения на поведение сигнала ЭПР I в листьях обусловлено его активирующим действием на другом акцепторном участке. Известно, что под действием умеренной дозы ТО облучения, в первую очередь, подавляются реакции цикла Кальвина (Ки1ад<1а1уе1и е* а1„, 1990). Поскольку наши эксперименты показывают, что при этом все же происходит ускоренно оттока электронов на уровне ФС1, остается предположить, что в ТО облученных листьях ускорение оттока электронов может быть связано с активацией глшсолатного пути фотодыхания. Основной биологический смысл фотодыхания - защитный механизм для обезвреживания 02 при интенсивном освещении (ТоХЪе^, 1980). Фотодыхание препятствует окислительной фотодеструкции клетка, которая может произойти при этих условиях, вследствие образования значительного количества 0

С увеличением дозы ТО света нарушается нециклический транспорт электронов, подавляется фотохимическая активность ФС2, вследствие этого выход сигнала ЭПР I с включением белого света на фоне дальнего красного света ускоряется (рис.П). В работе (Бор-данова, 1989) высказано предположение, что вторая фаза (большие дозы ТО света) соответствует уменьшению числа функционально активных реакционных центров фотосистемы 2, электронной емкости пластохинонового пула. Существенно снижается фотосинтетическое вццеление кислорода. Наблюдаемые структурно-функциональные нарушения являются необратимыми и развиваются после прекращения облучения.

Выключение непрерывного белого света во всех случаях приводит к немедленному (без задержки) восстановлению Р700+ с характерным

20mc

+ Ф

SS**.

Рис. 12. Кинетика изменений величины сигнала EDP I в листе китайской розы (а). Внизу - после выключения непрерывного белого света'(б).

временем ^ 18-20 мс (рис.12). Это объясняется тем, что при освещении листьев достаточно интенсивным белым светом в стационарном состоянии цепь переноса электронов между фотосистемами содержит пул восстановленных молекул пластогидрохинона. Скорость притока электронов к ФС1 (скорость переноса электронов между фотосистемами) определяли по времени полувосстановления (Т]н ) PTOö!" после быстрого выключения белого света на стадии В-С (рис. 12).

Известно (Witt et al., 1978), что скорость переноса электронов между фотосистемами определяется скоростью окисления шшото-хинона, происходящего на внутренней стороне тилакоидной мембраны и сопряженного с выделением протонов во шутритилакоидное пространство, а скорость окисления пластохинона определяется внутри-

- 30 -

тилаковдным рН. При рН внутритилакоидного пространства выше шести время перепоса электронов между фотосистемами (параметр Тф ) составляет 20 мс. При уменьшении рН до 4,5*5 оно возрастает вплоть до 150 мс (Kumberg»Siggel, 1969; Тихонов, 1966). Таким образом, по скорости переноса электронов между фотосистемами южно определить рН во внутритилакоидном пространстве.

После облучения листьев ЗФ светом (различные дозы) измерения показали, что в листе время голу восстановления P70Q!" (параметр существенно не изменяется (рис.12). Можно сделать вывод, что облучение листьев "экологическим" ЗФ светом не влияет на величину внутритилаюидного рН, поддерживаемого при освещении листьев белым светом. Этот вывод согласуется с полученным в предыдущем разделе результатом, что облучение изолированных хлоропластов ЗФ светом не затрагивает сколь-либо существенно функционирование окнолительного участка пластохинонового цикла.

П.Э. Валяние УФ света на поверхностный потенциал и структурные характеристики тилакоидной мембраны. В настоящее время становится все более очевидной роль поверхностных явлений в структурной организации и функционировании биологических мембран (вагьег. I980;tfeinsteln, 1982). Известно, что хлоропласты несут отрицательный поверхностный заряд (при рН выше 4,3), электронный транспорт в сопряженных хлоро пластах сопровождается уменьшением поверхностною потенциала наружной стороны тилаковдной мембраны (Хомутов, Рууге, 1981). .

В данном разделе были изучены изменения поверхностного потенциала под действием 3® света (290-330 ны) и исследошны вызываемые. им изменения в структуре мембран хлоропластов. Изменения поверхностного потенциала наружной стороны тилакоидной мембраны хлоропластов регистрировали с использованием заряженных спиновых зондов (Хомутов, 1986) 16-доксилстеариновой. кислоты (Ij j4), 4-( N р -диметил-Н-нонил)-ТН.Шаммонийбромида (САТд). '

На рис.13 представлены спектры ЭПР положительно заряженного спинового зонда САТд в суспензии хлоропластов до и после 90-минутного облучения ЗФ светом. Эти спектры ЭПР представляют собой суперпозицию двух спектров: один соответствует молекулам зонда, встроенным в мембрану (уширение компоненты 1,2,3); другой дают молекулы зонда, находящиеся в свободном состоянии в водной фазе суспензии мембран хлоропластов (узкие компоненты 4,5,6). Распределение шлекул заряженного спинового зонда между мембраной и

время облученш, мин 50

-50

15 Гс

?100

У9|мВ

в/ /л

/ о

9 о

Рис.13.А. Спектры ЭПР спинового зонда САТд в оуспензии контрольных (а) а УФ облученных (108 эрг/сы2) (б) хлоропластов гороха, Б. Зависшость величины поверхностного потенциала тилакоидной мембраны от времени ЗФ облучения.

Рис.14. А - Спектры ЭПР спинового зонда 3 в суспензии хлоро-пластов гороха; Б - зависимость параметра 2Тц от времени УФ облучения.

водной фазой определяется величиной поверхностного потенциала ыембраны и, соответственно, изменение соотношения между компонентами сверхтонкой структуры спектра ЭПР таких зондов дает информацию об изменениях поверхностного потенциала мембраны. Показано (Са£1во, 1981), что в первом приближены и перераспределение молекул метки мезду мембраной и водной фазой выражается соотношением

где 1<з - концентрация метки в водной фазе, Ьц - концентрация метка в мембране, . - поверхностный потенциал тилакоидной мембраны, А0 - константа, зависящая от разности химических штен-

й - газовая постоянная, Т - температура, К.

Мы попользовали эту формулу для расчета изменений поверхностного потенциала при действии ЗФ овета на тилаковдные мембраны.

На рис. 13,Б представлена, зависимость изменений величины поверхностного потенциала тилакоидной. мембраны, происходящая в результате облученш мембран хлорошлстов.ЗФ светом, от времени облучения. Изменения величины поверхностного потенциала определяли по изменениям амплитуды выоокопольной компоненты 6 спектра ЭПР зонда САТд, соответствующей водной фракции молекул зонда (рис. 13). Из рисунка видно, что облучение изолированных хлоро пластов УФ светом приводит к значительному увеличению величины поверхностного потенциала тилакоидных мембран (на 50 мВ при 90-минутном облучении).

Спиновый зонд ^х 14' в 0ТЛ1:ЧЕ8 01 положительно заряженного зонда САТд, в исслед* анных нами хлоропластах имел отрицательный заряд (при величинах рН больше 4) в результате депротонирования карбоксильной группы молекулы зонда. Облучение хлоропластов ЗФ светом вызывало уменьшение величины параметра £ зонда Параметр представляет собой отношение амплитуд высокоюльных компонент спектра зоеда, соответствующих соотношению количеств молекул зонда в водной и мембранной фазах. Уменьшение параметра р для отрицательно заряженною зонда ^ соответствует увеличению поверхностного штетдала мембран хлоропластов. Различие в величине эффекта изменения поверхностного потенциала мембран хлоропластов шд действием ЗФ света, наблюдаемое для противоположно

X . ь

Ъ1

циалов между мембраной и водной фазой, р - постоянная Фарадея,

заряженных спиновых зондов САТд и Ij j4, может быть обусловлено неоднородностью строения тилакоццной мембраны и ее поверхности. Аналогичные результаты, указывающие на такую возможность, описаны в работе (Хомутов, IS89).

ТО облучение может влиять на структурную организацию молекулярной системы хлоропластов и состояние тилакоидной фазы, причем, структурные изменения коррелируют с изменением фотохимической активности хлоропластов (ВагЪег, 1979). В связи с этим нам представлялось интересным сравнить действие ТО света на структурные характеристики мембран хлоропластов. Изменения структурного' состояния тилакоидной мембраны регистрировали с помощью спинового зонда 5-ДОКС ИЛ-стеариновая кислота (I-jv, 3). Поскольку в условиях нашего опыта (рН=8) метка Ijg 3 заряжена отрицательно за счет диссоциации карбоксильных групп, ее перераспределение между водной и мембранной фазами под действием ТО света противоположно эффекту перераспределения положительно заряженной метки САТд. На рис.14 представлен спектр ЭПР спинового зонда 3 в оуспензии хлоропластов, наблюдаемый в наших экспериментах. Йа рисунке показаны результаты исследования влияния облучения хлоропластов ТО светом на параметр 2Тд спектра ЭПР зонда Ijg 3 (расстояние между внешними компонентами спектра ЭПР зонда 3), характеризующий подвижность и ориентированность молекул зонда в мембране. Облучение суспенза^^лорошюстов ТО светом продолжительностью до . 90 мин (10® эрг/см^) приводит к заметным изменениям параметра 2Тд. Парамагнитный фрагмент зонда Ijg 3 располагается в области плотной . упаковки лшщдов тилакоидной мембраны (Рууге, 1977). Таким обра-> зом, результаты экспериментов с зондом Ij2 3 свидетельствуют о том, что облучение изолированных хлоропластов ТО светом (продолжительностью вплоть до 90 мин) не сопровождается заметными изменениями структуры лшидной фазы (липидных областей) тилакоццной мембраны.

Результаты наших опытов позволяют сделать вывод^о том, что облучение тплаковдных мембран ТО светом изменяет поверхностный потенциал тилакоидной мембраны на 50 мВ, ингибирует функцион!фова-ние электронтранспортной цепи хлоропластов, но практически не влияет на состояние липидного бислоя тилакоидной мембраны.

Ш. ВЛШНИЕ ТО ОБЛУЧЕНИЯ НА ПАРАМА1Н1ШШЕ ЦЕНТРЫ

И аПЕКГРОН-ТРАНЗШРТШЕ РЕАКЦИИ ФОТОСИСТЕМЫ 2.

8а последнее вреш опубликован ряд работ по действию экологических ТО Лучей на фотосинтез (Strld, 1990;Вогпгаап, I99I;Beyechag, Caldwell, I988;Renger, 1989). Исследования касались преимущественно первичных процессов фотосинтеза. На выделенных хлоропластах и целых листьях установлено, что оообо неблагоцраятное воздействие ТО-В оказывает на структурно-функциональное состояние ФС2. Ыы проверили ото предположение в опытах на субхлоропластных фрашен-тах СС2, шеокоочищенних от принеси Р700, используя методы ЭПР, абсорбционной спектроскопии, флуоресценцию, полярографию и электрофорез.

Субхлороплаотные частицы фотосиотемы 2, выделенные из хлоро-пластов ш методу Андерсона в Бордмана в модификации Н.И.Шутило-вой и др. (1975), были охарактеризованы о во км патентным составом, кривши термолюминесценции, низкотемпературной флуоресценции и данными ю фотохимической активности. Вое эти тесты, как и результаты радиоспектросыэпических измерений, свидетельствовали о высокой степени очистки препаратов от цримеси центров Р700 (до 40-кратной очистки по сравнению с исходными хлоро пластами). Активность препаратов изучали с помощью оптических методов по восстановлению диглорфенолиндофенола (ДХФЮ) или методом ЭПР по восстановлению имшюксильного радикала 2,2,6,б-тетраметил-4-оксипи-перядин-1-оксила (нитроксил П), ю фотоокислению ионов Мп24- и стерически экранированного органического гидроксиламина 2,2,4,5, 5-пентаметил-1-окои-3-вмвдазолил-3-гидроксиламина. Установлены различия кривых термолюминесценции исходных хлоропластов и субхлоропластных частиц ФС2 и показано отсутствие тершлшинесценции препаратов частиц ФС1 (Кукушкин, Солнцев, 1978). Спектр низкотемпературной флуоресценции частиц ФС2 характеризуется интенсивным максимумом цри 685 ни и отсутствием флуоресценции при 735 нм, что соответствует малому содерганию длинноволновых форы хлорофилла, связанных с

111.1. Сигналы ЗПР оубхлотопластных частиц CG2. Ери анализе условий, которые югут обеспечить появление сигнала ЭПР от реакционного центра ЬС2, следует иметь в виду, что стационарная концентрация окисленных центров определяется соотношением скоростей ряда реакций, ведущих к их образованию и гибели вследствие восста-

новления, которое может осуществляться различныии путями. Анализ последовательности реакций при участии ФС2 приводит к выводу, что в интактной цепи отационарная концентрация катион-радикалов в реакционном центре ФС2 не может быть высокой при разумных интенсиз-ностях овета даже в условиях прерванного транспорта электронов от воды, поскольку реакция рекомбинации зарядов в реакционном центре характеризуется скоростями, превышающими скорооти лимитирующей отадии, находящейся между ФС2 и ФС1. Чтобы сделать катион-радикалы в реакционном центре стационарно наблвдаемыми на свету необходимо выполнение двух условий (I) - скорость отдачи электронов восстановленным физиологическим акцептором должна быть выше, чем скорооть рекомбинации зарядов и катион-радикала хлорофилла в РЦ ФС2; (2) - реакции на окислительной стороне ФС2 долашы бить замедленны в такой степени, чтобы они не могли конкурировать с окиолением и о возбуждением хлорофилла в РЦ ФС2 (определявши интенсивностью овета).

Условие (I) удовлетворяется выбором креыниймолибдата (КМ) в качестве акцептора, принимающего электрон непосредственно от (гшлвкав, 1975; ГЬльдфельд, 1976). Условие (2) удовлетворяется выбором препаратов и определенных концентраций акцептора ИМ.

В присутствии КМ в субхлородластных частицах 0С2 на свету возникал синглетный сигнал ЭПР шириной 9 1Ъ,в»- 2,0025, гибнущий в темноте. По форме он заметный образом не отличался от сигнала ЭПР I в хлоро пластах и- в оубхлоропластных частицах ФС1 (рис.15). Скорость гибели в темноте этого сигнала ЭПР была измерена в интервале температуры от -5° до +2СРС. Между интенсивностью фото-стацданарного сигнала и скоростью его гибели в темноте обнаружена четкая корреляция. Доноры электрона ФС2: гидроксиламин, экзоген-ны Мп2+ ускоряют гибель сигнала в темноте и уменьшают его фотостационарную интенсивность. Сигналы ЭПР в присутствии КМ в субхлоропластных фрагментах ФС2 и сигнал ЭПР I существенно различаются по своей зависимости от интенсивности света: насыщение сигнала ЭПР I достигается при существенно меньших интенсивностях света, чем насыщение сигнала в СХЧ в присутствии КМ. Сигнал ЭПР I (Р700+) и обнаруженный новый сигнал при комнатной температуре не отличались по своим релаксационным характеристикам. Однако, кривые наоыщения мощностью СШ-поля сигналов ЭПР при 77°К во фрагментах ФС2 в присутствии КМ, замороженных на свету ИР700*' оу-'ч щеотвенно различаются.

Ркс^ЮГ-СигйаЛк ЭЖР'|оторЙяЬе!гичб6ких препаратов цри 2(Яс. А - Хп,1 М, Фц, 10 нкМДШ в темноте (а), на свету (б) и кинетика индуцированных светом'изменений интенсивности сигнала (в).

6 *

н / „

— /о Ь .20с .

©

Б - субхлоропластные частицы ФС1 без добавок, В,Г - с^охлоровластные чаотицы ФС2

В - фрагменты ФС2 в присутствии I Ш Км

Г - без акцептора в темноте после длительной адаптации.при 4°С в темноте (а), на свету

(б), после выключения света

(в).

0 у "

' Н "

Установлена корреляция фото индуцированных изменений оптического поглощения и сигнала ЭПР в йрисутствии КМ в препаратах ФС2. Гидроксиламин, донор электронов ФС2, снижает стационарную интенсивность сигнала ЭПР и ускоряет его гибель в темноте. Такое же влияние он оказывает на фотоиндуцированные изменения поглощения при 680 нм. Спектр фотовыцветания, тлученный из этих кинетических данных, согласуется со спектральными данными Деринга и др. (1968,1970), полученными из импульсных кинетических измерений. Зависимость изменения оптического поглощения при 680 нм от гчтен-сивности овета совпадает с таковой для соответствующей зависимости сигнала ЭДР. Полученные результаты доказывают идентичность компонентов, ответственных за фотоиндуцированное выцветание с максимума при 680 и 435 нм и сигнала ЭПР в частицах ФС2 в присутствии КМ.

Это позволило путем сопоставления величин фотовыцветания и сигнала ЭПР в присутствии КМ в препаратах ФС2 определить коэффициент экстшшции парамагнитных центров, ответственных за этот сигнал. Эта задача требовала определения абсолютной концентрации соответствующих парамагнитных центров и решалась путем сравнения сигнала ЭПР в присутствии КМ во фрагментах ФС2 и сигнала ЭПР раствора нитроксильного радикала извеотной концентрации. Полученный коэффициент экстинкции равен £=0,66'10^М~^«см~^.

Предполагается, что полученный сигнал может принадлежать катион-радикалам хлорофилла в реакционных центрах ФС2. в пользу такой интерпретации сигнала говорят данные нескольких типов: локализация .сигнала ЭПР в частицах ФС2, тщательно очшцешшх от пркме-оа Р700 по оптическим а ЭПР тестам; необходимость для наблюдения сигнала специфического акцептора электронов - КМ, способного принимать электроны непосредственно от физиологического акцептора ФС2 (т.е. минуя лимитирующую стадию окисления восстановленного акцептора (} шгастохиноном); пониженная активнооть СХЧ1С2 в реакции Хилла по сравнению с хлоропластами, что соответствует прежде всего замедлению реакций восстановления реакционных центров Р4"; сопоставление спектра оптических изменений, ранее приписанных пигменту, в реакционном центре ФС2 и сигнала ЭПР в присутствии КМ.

Облучение оубхлоропластных частиц ФС2 экологическим ЗФ светом приводит к изменению амплитуды сигнала ЭПР в присутствии Щ. Кремниймолибдат добавляли к препаратам ФС2 теле И) облучения.

® ^_

л ] 1 'юОгс*

Рис.16. Спектр ЗПР оубхлоро-пластных частиц ФС2 до (а) I

□осле ЭФ облучения эрг/с»?) (б).

(5.10°

4 •

А,от.ед.

Рис.17. Зависимость амплитуды сигнала ЭПР фратаентов ФС< в присутствии Км на свету от длительности ГО облучения.

60

30

врет облучения, мин

Эксперименты показали, что интенсивность фотоиндуцированного син-глетного сигнала ЭПР во фрагментах ФС2 в присутствии КМ медленно снижается с увеличением дозы ГО облучения. Шествдесятиминутное облучение частиц С/-10^ эрг/см^) приводит к уменьшение амплитуда сигнала только на 5($ (рис.17). Однако, регистрация сигнала ЭПР. в более широком интервале магнитных шлей показала, что ГО облучение вызывает появление оигнала свободного марганца (0) о характерной 6-компонентной структурой при маленьких дозах (5»10° эрг/ с*г) (рио.16). Это говорит о том, что во фрагментах ФС2 ГО излучение цри маленьких дозах нарушает, главным образом, реакции фотосистемы 2, ответственной за выделение молекулярного кислорода.

Поскольку в этом случае в препаратах ФС2 электронтранедартяая цепь максимально укорочена: реакции системы окисления воды подавлены, связанный марганец в значительной мере вытеснен из мембран и на акцепторной стороне ФС2 электроны непосредственно от реакционного центра переносятся к щ>емниймолибдату по реакции, нечувст-

2

вительной н диурону (Zilinakae.Govindjee, 1975); тлеются достаточные основания предшложить, что И облучение при больших дозах приводит к деструкции непосредственно реакционных центров £>С2, которые теряют способность к фото индуцированному разделению зарядов. Этот вывод согласуется о данными работы (iwansik,Renger, 1984), полученными путем измерений индукции флуоресценции хлорофилла а и оптического поглощения в области 320 нм, соответствующего восстановлению связанного хинонного акцептора.

111.2. Сигнал ЭПР 2 в электрон-транопортных реакциях Фотосистемы 2. Субхлоропластные частицы ФС2 являются благоприятным объектом для наблюдения сигнала ЭДР 2. Фрагменты ФС2 в отсутствие до-баюк дают в темноте характерный сигнал ЭПР 2 (рис. 14принадлежащий компоненту (тирозиновый радикал), локализованному на донор-ной стороне ФС2, и хорошо коррелирующий о активностью системы фоторазложения воды (1Ьльдфельд, I987;Styring, 1987). Этот сигнал практически не изменялся на свету в отсутствие экзогенных акцепторов электрона. Облучение субхлоропластных частиц ФС2 в течение часа ЗФ светом (290-330 нм, 7-I07 эрг/сь?) заметным образом не влияло на этот свободно радикальный сигнал.

.В присутствии да®, красителя, известного как медиатор транспорта электронов на различных участках электронтранопортной цепи, полностью подавляется сигнал ЭПР 2 в темноте. На свету в присутствии ДЙГО этот сигнал вновь быстро возрастает. Гибель сигнала ЭПР 2 в темноте цроисходила о временами полуспада около 25 сек. При 77°К не происходят никакие реакции, ведущие к изменению состояния центров, ответственных за сигнал ЭПР 2. Амплитуда сигнала ЭПР 2 в присутствии ФЦ в темноте и на свету увеличивается (на 7С&2). Одновременно ускоряется темновой спад сигнала (Tj/g^ сек). Вводение в препараты ДХФЮ и ФЦ приводит к появлению двухфазности изменения сигнала ЭПР 2. Характерной особенностью фрагментов ФС2 и хлоропластов в присутствии Ш в определенных концентрациях является полное подавление сигнала ЭПР 2 на свету и в теглноте.

Получены кривые насыщения мощностью СВЧ-поля сигнала ЭПР 2 при 77°К. Сигнал насыщается уже при мощности СВЧ-поля ~ 10 мйт, причем, его поведение соответствует неоднородному уширению: насыщение сопровождается лишь незначительным снижением амплитуды cmv нала. Это означает, что наблюдаемая форма сигнала ЭПР 2 представляет собой огибающую индивидуальных комионент. Исследованы пара-

метры сигнала ЭПР 2 в мутантах одноклеточной зеленой водоросли 'ЬыеипуДотопав ге1пЬаг<11не обладающие активностью ФС1 при нормальном функционировании ФС2 (мутант А-55).

Предложена схема реакций переноса электрона в ФС2. Предполагается, что сигналы ЭПР 2 дает соединение, окисленное в результате реакции с одним из промежуточных состояний системы фоторазло-. жения воды и глубоко .погруженное в гидрофобную матрицу фотосинте-тичесюй мембраны. Это предположение согласуется с данными работы ^уг1пв, 1987). ДШФ и КМ образуют редокс-буферы и замыкают циклический поток электронов в пределах ФС2, что приводит к подавлению сигнала ЭПР 2 в темноте. Следует.отметить, что состояние центра, ответственного за сигнал ЭПР 2, не идентично в хлорошнс-тах и во фрагментах ФС2. Кратковременная инкубация хлороштстов о ДХФШ не приводила к полному подавлению сигнала ЭПР 2, то1да как в препаратах ФС2 ДЯШ полностью подавлял сигнал ЭПР 2 в темноте. Гидрофобные доноры электронов ФС2 не оказывали влияния на сигнал ЭПР 2 в хлоропластах, но подавляли его в частицах ФС2. Предполагается, что эти расхождения в известной мере отражают труднодо-ступность соответствующих центров в целостных хлоропластах.

Ш.Э Структурно-функциональные изменения ФС2 при ГО облучении. Изучено влияние ГО света на выделение кислорода, фотоперзнсо электронов и структурные характеристики ФС2 во фра тентах ФС2. Проводилась серия экспериментов для выявления первичного участка ГО ингибирования. Важнейшим показателем состояния электронного . Транспорта в ФС2 является переменная флуоресценция (ДФ). Облучение ГО светом субхлоропластных частиц ФС2 приводит к резкому уменьшению величины фото индуцированных ДФ, связанных с фотовосстановлением {|1Е подавлению реакции Хилла, регистрируемой по фотовосстановлению ДХФИ&. При этом величина Ф0, обусловленная флуоресценцией хлорофилла, под действием ГО облучения не изменяется, что демонстрирует устойчивость пигмента к ГО облучению.

При последующем добавлении Мп2* к облученным частицам ФС2 не происходит восстановления параметров этих фотореакций. Замена Мп2"1" на ДЕК при измерении фотовосстановления ДОШ> приводит к их некоторой реактивации (6С$). Необходимо отметить, что добавление дитионита к ГО облученным частицам ФС2 приводит к увеличению Ф до уровня, равного сумме Ф0 и ДФ этих частиц, но не до уровня Ф,ЙК0» равного суше Ф0+ДФ исходных препаратов. Для исключения роли кислородных радикалов при ГО инактивации препараты облуча-

лись в анаэробных условиях. Анаэробные условия достигались путем продувания платно закрытой кюветы аргоном. Вши получены следующие результаты: облучение препаратов ФС2 в анаэробных условиях замедляло уменьшение Если в аэробных условиях в результате

облученш ТО светом Фшко уменьшалась на 505? относительно контроля через 9 мин (Ю7 эрг/сьг), то в анаэробных условиях Фшко не достигал этого уровня даже через 30 мин (4-Ю7 эрг/см2). За 30 мин облучения частиц ФС2 в анаэробных условиях происходит уменьшение Фцаго только на 4(# относительно контрольного.

Чтобы проверить возможность протекторного воздействия восстановительных условий на ТО инактивацию, облучение 3® светом проводилось после инкубации препаратов ФС2 в присутствии восстановителей - МпСЬ> (0,1 Ш) и аскорбата натрия (0,1 кМ). Обнаружено, что восстановительные условия ингибирования частиц ФС2 оказывают также протекторное воздействие при ТО облучении. Это позволяет предполагать окислительную природу механизмов ТО ингибирования.

С целью выявления структур, ответственных за ТО ингибирование первичных световых реакций ФС2, было проведено измерение фотоиндуцированных изменений поглощения при 680 нм, связанных с фотоокислением хлорофилла Р680 в присутствии 20 Ш кремниймолибдата. Частицы, предварительно обработанные ЭДТА, подвергались облучению различными дозами ТО света. Значения ДА, соответствующие фотоокислению хлорофилла Р680, определялись относительно контрольных значений. Были получены данные, показывающие устойчивость Р680 к ТО облучению по сравнению о другими структурными частями ФС2. Так, уровень ДА уменьшался до 5055 только после 30 мин облучения (5* Ю7 эрг/сы2). Полученные данные согласуются с экспериментами, проводимыми радиоспектросгопическими методами.

По современным представлениям, фотосинтетическое окисление воды происходит в донорной части ФС2 высших растений. Показано, что необходимым элементом оистемы окисления води является марганец (Мп2^). В послздние годы обсуждается также роль других металлов, а также ионов С1~ и белков в функционировании системы окисления воды в ФС2 (Опо, 1983;м.атикеа, 1986; Климов и др., 1982).

Чтобы экспериментально проверить действие ТО света на додар-ную часть ФС2, исследовалось изменение скорости выделения кислорода при облучении субхлороплаотных частиц ТО светом. Опыты проводились в присутствии искусственных акцепторов электронов ферри-цианида и дихлорбензохинона. Была обнаружена экспоненциальная за-

I Со21, миЫ/мин*?1 20

[Мп2-*-] [Р680]

то : 20

время облученга, мин

Рис.18. Действие 3® рблученш на выделение киолорода (I), образование перекиси водорода (2) и концентрацию связанного марганца (3) во фрагментах ФС2. Интенсивность излучения -1,7*10° эрг/сиг «мин.

висиыость между дозой ГО облученш и уменьшением скорости наделения кислорода (рис.18). За 6-7 минут облученж (доза^Ю7 эрг/ см) скорость ввделения кислорода уменьшилась наполовину - 5С$. В специальных экспериментах мы облучали частицы СС2 при различных температурах (2+32°С). Было получено, что зависимость степени действия ГО света'на скорость выделения кислорода от температуры невелика. Было проведено исследование действия ГО света на частицы ФС2 при температуре 1(Рс в анаэробных условиях. В результате получилось, что в анаэробных условиях скорость ввделения кислорода падает значительно медленнее, чем в аэробных условиях (если в аэробных условиях - Т^ ~ 6+7 мин, то в анаэробных условиях <—20 мин). На основании этого можно предположить, что повреждающее действие ГО света связано с образованием в аэробных условиях высоко активных форм кислорода типа 1^02»02. 'ОН. Ослабление действия ГО света на препараты ФС2 в анаэробных условиях может быть связано с отсутствием активных форм кислорода.

Для определения активных форм кислорода использовали хемилю-минесценцию люминола о X 1лакс=450 нм. Под действием ГО света во фрагментах ФС2 наблюдается активация хемилюминесценции, т.е. процессов, во время которых образуются активные формы кислорода. На

рио.18 приведена зависимость выделения перекиси водорода в субхлоропластных частицах ФС2 от длительности времени облучения ГО светом в аэробных условиях. Как видно из рио.18, о повышением дозы ГО света образование перекиси водорода такие увеличивается. Это поставило вопрос о роли перекисного окисления липидов мембран и антшкислительных систем во время облучения клетки ГО светом. Наша эксперименты, проведенные методами спиновых зондов, показали, что в тилакоцдных мембранах даже большие дозы ГО облученш (10® эрг/ал2) не приводят к каким-либо существенным изменениям в лшидной части мембран. Этот вывод подтверждается данными, полученными в работе (Веселовский и др., 1989). При действии различных экстремальных'факторов на листья, они не обнаружила заметного накопления Шлоно'вого диальдегида- одного из продуктов перекисного огаюления липидов мембран, что свидетельствует о том, что не происходит разрушение мембранных структур. Перекисному окислении липидов тилакопдных мембран активированным кислородом препятствует мощная антиокислительная система с трот,ш хлоро пластов, включающая супероксвддисмутазу и аскорбат-пероксидазную систему детокси-кации радикалов О^.'ОН и Н^ (Аеааа, 1987).

В дальнейших экспериментах'было целесообразно изучить действие ГО света на белковые компоненты ФС2. Электрофоретическим анализом полипептидного состава установлено,(рис.19), что основными апобелками фрагментов ФС2 являются полипептиды о молекулярной массой 47,40,33,32,30,10 и 4,8 кДа, т.е. полипептпды, характерные длякислородввделлющего ядра ФС2 (Уапайа, 1987;Епаи1, 1987;ХкеиоЫ. 1988). В препарате частиц ФС2 также присутствует белковая полоса в области 28-29 кДа (рис.19), соответствующая апобелку светособи-рающего пигмент-белок-липпдного комплекса (СС-ПБЛК). Следует отметить, что данная полоса является основной зоной на электрофоре-граше и денситограммё субхлоропластных фрагазнтов ФС2 (Шутплова, 1987). Электрофоретический анализ показал, что под действием ГО сЕета в субхлоропластных частицах ФС2 происходит линейное снижение полосы 33 кДа и исчезновение её при 30 минутном ГО облученш (5* Ю*' орг/с!.^). Анализ супернатантов ФС2 в следующих опытах показал, что в первые минуты ГО облученш частиц ФС2 они способствуют "выбросу" в супернатант периферических полипептидов водоокисляю-щзго комплекса (33 кДа,23 кДа,18 кДа). Дальнейшее облучение приводит не только к экстракции белка 33 кДа, но и к ее деградации»

Полипептид с молекулярной массой 33 кДа входит в структуру

кислородвыделяющего комплекса. В работах (Qno, 1988; Гасанов, 1990) было показано, что этот полипептид играет ключевую роль в сохранении функционально связанного марганца и в поддержании кис-лородвыделянцей функции ядра ФС2. Марганец удерживается в нем специфическими координационными связями. Если происходит деградация белка 33 кДа, то возможен выход марганца в среду. Это предположение было проверено следующим экспериментом. Облученные частицы ФС2 центрифугировали. Отделяли осадок и супернатант. Содержание Мп^Т в осадке и супернатанте определяли на пламенном атоыно-абсорбционлом спектрофотометре с использованием калибровочных раотворов МпС^. В результате данного анализа мы получили следующие данные: в результате действия ЗФ света происходит выход марганца з среду; первые минуты облучения частиц ФС2 приводят к потере на каждом РЦ ФС2 двух атомов Мп2^ (рис.18). Дальнейшее облучение не "изменяет этого соотношения.

После 10 мин 75> облучения (1,2-Ю7 эрг/ал2) в денситограмме наблюдается уменьшение полос 32 и 30 кДа. Хинонсвязывающие поли-пептвды с молекулярной массой 30 и 32 кДа (обозначаемые как белки ij и составляют белковую основу реакционного центра ФС2 (ваг-Ъ«г, 1987). Уменьшение полос Д^ и ig под действием ЗФ света со-

провожда тся увеличением полппептида с молекулярной массой в области 55-58 кДа, представляющего собой, по-видимому, гетеродимер полшептида Др^ (опо. 1988). Облучение Фрагментов ФС2 ТО светом в аэробных условлях большими дозамп (5*10 эрг/см2) приводит к незначительному уменьшению полипептидов с молекулярной массой 47 и 43 кДа. Согласно общепринятой точке зрения ( ИапЪр,1987;1воgаi, 1987), эти полипептидн являются апобелками, несущими хлорофилл антенны ядра ФС2.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что процесо инактивации ФС2 под действием умеренной дозы (Ю6 эрг/сь£ > ТО света имеет окислительную природу, локализован в'донорной части ФС2 и приводит к необратимой инактивации переносчиков электрона, которые функционируют в донорной части ФС2 до вторичного донора электрона г и являются местом функционального связывания !Ап, входящего в систему окисления воды. На это, прежде всего,' указывают следующие факты: I) выход Мп2"!" уле в первые минуты ТО облу-1ения; 2) подавление фотоввделенш 02 и возрастание выхода перегаси водорода; 3) "выброс" в супернатанг периферических полипептидов водооквслякядего комплекса (33 кДа,23 кДа,18 кДа); 4) подавление Д Ф без сопутствующего возрастания , что характерно для инактивации донорной стороны (А11акуег<иег, 1989); 5) протекти- . рующее действие анаэробных (аргон) и восстановительных (Мп2?-, ас-корбата натрия) условий до ТО облучения; 6) сохранение после ТО облучения формы тегшового п фото индуцированного сигнала ЭПР 2, принадлежащего окисленному вторичному донору электрона 1 t (тира-зиновый радикал).

При больших дозах (5»107 эрг/сг^) ТО света в субхлоропластных частицах ФС2 одновременно с системой фоторазложения воды происходит структурное изменение в самом реакционном центре. На это указывают следующие факты: I) изменение реакции фотоокисления Р680 и уменьшение сигнала ЭПР во (Трагментах ФС2 в присутствии Ш на свету, свидетельствующее об утрате способности РЦ к фоторазделеппю зарядов; 2) уменьшение в денситограмме полос хинонсвязывающих по-лшептидов с шлекуляркой массой 30 кДа и 32 кДа (белок Д^ и Д^) и увеличение полипептвда с молекулярной массой в области 55-58 кДа, представляющего собой гетеродимер. ролипептидов Д^ и Д^.

1У. УЧАСТИЕ И РОЛЬ ХШОНОВ В ШЛЕРАНАХ РАСТИТЕЛЬНЫХ

КЛЕТОК ПРИ УФ ОБЛУЧЕНИИ.

Ингибирующее действие ЗФ света на фотохимическую активность ФС2 коррелирует о его влиянием на спектр сигнала ЭПР 2, который по своему происхождению связан с ФС2. В настоящее время установлено, что источником этого сигнала являются тиразиновые радикалы, локализованные на донорной стороне ФС2. На рис.20 представлены результаты экспериментов по исследованию изменений сигнала ЭПР суспензии изолированных хлоропластов в темноте, вызываемых облучением суспензии УФ светом. Подученные результаты сввдетельствуют о том, что форда многокомпонентного темнового сигнала ЭПР в хлоро пластах в результате их облучения 3¡Ф светом изменяется. Наиболее существенные изменения претерпевает компонента 2 темнового спектра ЭПР хлоропластов. Эти изменения темнового спектра ЭПР коррелируют с уменьшением фотохимической активности, увеличением времени темнового восстановления Р700^ под действием облучения ЗФ светом. При этом амплитуда сигнала ЭПР I центров Р700|" остается неизменной.

Изменения темнового спектра ЭПР хлоропластов могут быть обусловлены двумя причинами: во-первых, под действием ЗФ света может измениться окружение парамагнитных центров, ответственных за сигнал ЭПР 2с в =2,0046, Д Н=16 1Ь; во-вторых, в результате облучения суспензии хлоропластов ЗФ светом могут образоваться новые парамагнитные центры, дающие новый дополнительный вклад в наблюдаемый теыновой сигнал ЭПР. В пользу второй причины говорят данные о влиянии ЗФ света на амплитуды темнового и светового сигналов ЭПР хлоропластов. В суспензии изолированных хлоропластов, облученных ЗФ светом, амплитуда наблюдаемого темнового и светового сигналов ЭПР больше, чем в контрольных хлоропластах. Аналогичные результаты получены для интактных хлоропластов в листьях китайской розы. Компьютерный анализ разности темновых сигналов ЭПР контрольных и облученных ЗФ светом (5* 10*'' эрг/см2) листьев указывает на то, что в результате облучения возникает синглетный сигнал ЭПР с шириной Д}Ь=8 Гс, £ =2,004+0,0005. Наш исследована зависимость амплитуды темнового сигнала ЭПР суспензии хлоропластов, облученных ЗФ светом, от уровня мощности СШ-шля. Насыщение сигнала наблюдается при уровне мощности 5 мВт. При увеличении'дозы облучения хлоропластов ЗФ светом амплитуда возникающего узкого сигнала также

1

V

2

V

Рис.20. Сигнал ЗП? 2 б изолированных хлоропластах бобов в темноте; а - контрольные; б - облученные (4*10^ эрг/см2).

I I I ? * 1

>»707 Л650 Ш7 БС БС Л707 Рис.21. Кинетика изменения величины сигнала ЭДР I (а) и 2,5-ди-хлорпарабензохинона (б) в хлоропластах бобов в присутствии 20 г.п4Л метилвиологена и 1СГ^1 диурона. увеличивается. После прекрашешш облучения ЗФ светом амплитуда этого узкого сигнала с течением времени уменьшается и полностью исчезает в течение 90 шли 3© свет с длиной волны \> 310 им (независимо от дозы облучения) не вызывает появления такого сигнала.

3 работах (Грибова и др., 1985,1991) при изучении ингибирув-щсго действия гербицидов п различных .доз ЗФ света на электронный транспорт и темновые сигналы ЭПР в листьях высших растений наряду с ингибпрованием электронного транспорта тоже наблюдалось изменение Форш линии спектра ЭПР тешового сигнала из-за возникновения

сигнала ЭПР с в =2,0040 и .шириной & Н=8 1Ъ. Предполагалось, что за этот сигнал ответственна семихинонная радикальная форма эндогенных хинонов и фенолов. Наблюдаемый нами сигнал ЭПР с в -фактором 2,004 можно предположительно отнести к сигналу ЭПР анион-радикала хинонного типа (Ha3.es,Саве, 1981). Характерно, что он возникает одновременно о йнгибированием электронного транспорта.

Для выяснения влияния ГО света на взаишдейстъие хинонов с тилакоидннми мембранами в дальнейших экспериментах исследовали поведение экзогенного 2,5-дихлорпараоензохинона в оуспензии хло-ропластов. На рис.21 представлены результаты сравнительного исследования кинетики фок?индуцированных окислительно-восстановительных изменений центров Р70С!" (сигнал ЭПР I) и сигнал ЭПР экзогенного хинона в присутствии КГтД ДЗЫИ. Характерные изменении амплитуд сигнала ШР I и экзогенного хинона, происходящие под действием света различного спектрального состава, коррелируют между собой. Результаты исследования злияния ГО света на амплитуды спектра ЭПР экзогенного хинона в суспензии хлорошшстов показывают, что облучение мембран в течение 3 мин приводит к существенному увеличению амплитуда сигнала ЭПР (рис.22). Этот сшщетеш,-ствует о влиянии ГО света на процессы, стимулирующие переход молекул экзогенного хинона фемихинонно-радикальную фор:у. Эксперименты, проведенные нами на модельных (молекулы гидрохинона в щелочных средах) системах, танке показали, что под воздействием ГО света цроисходят обратимые изменения величины сигнала ЭПР семихи-нонных радикалов.

Вызываемые ГО светом различные процессы (подавление выделения кислорода, уменьшение уровня Д Ф и т.д.) сильно зависят от присутствия кислороде и, следовательно, в основе ГО инактивации тилаио-вдных мембран хлорошшстов и субхлорспластных частиц лежат фотодинамические деструктивные процессы, индуцируемые эндогашш сенсибилизатором. По современным представления»,I (Ио, 1983; Фрайкин, 1989), фотодинамические деструктивные процессы протекают с участием активированных форм кислорода, которые образуются в результате взаимодействия фотовозбужденных сенсибилизаторов с ¡телородом и шгут эффективно окислять биологически важные молекулы, вызывая потерю их функциональных свойств. В эксперименте с суспензией хлоропластов нами зафиксирована фотогене^ция под действием 74' света одной из таких форм супероксидного анион-радикала кисло-Года (0]?) Для измерения генерации 02 бил применен метод с исполь-

®

©

У

Рис.22. Сигнал ЭПР 2,5-дихлор-парабеязохинона в хлоропластах бобов: а -- контроль; б - ЗФ облученные (4,5«106 эрг/см2).

зованием тайрона в качестве ловушки (Грпголава и др., 1930). Применение тайрона, взаимодействующего с позволило нам зарегистрировать в И1 облученных тилаковдных мембранах хлоропластов сигнал ЭПР, который совпадал по структуре со спектром ЭПР окисленного таАрена. На необлученных хлоропластах добавление тайрона не вызывало увеличения сигнала ЭПР окисленного тайрона. Проведенные с тайропом эксперименты подтвердили, что супероксидный анион-радикал кислорода играет важную роль в инициации фотодеструктивных реакций в системе ^оторазлогенпя воды при указанном облучении тилаковдных кембран. 1я.:есте с тем не исключено, что в процессах по-врездения ферментативного комплекса фоторазложения воды участвует и другой внеоко реакцпонноспособный радикал ОН*. Основанием для такого предположения служат наши данные об индуцированном И светом образовании в хлоропластах и фрагментах ОС2 перекиси водорода (НоОо) (рис,19), продуктом которой с оТ^, как известно, является гвдроксилышП радшсал'ОН (Е1в^ег, 1982).

Сопоставление полученных данных о спектрах действия быстрой Л1 реакции в цптоплазматических мембранах п кинетических особенностях изменения мембранного потенциала, ЭПР исследований под действием "экологического" ГО света в энергообразугощих тилакоид-шлс мембранах и пх фрагментах и со спектрами поглощения хило но в с имеющпшея в литературе сведениями о спектральных свойствах хи-

м

I

я—я

- 50 -

3°2 102

•п

типЦ тип]

■ Ы

У оА ж''"

4,02 ^02

Гч

\ I

•ОН

Н202,Ч

Рио.23. Реакции хила I и П фотодинамического действия И сиета на хинон в присутствии кислорода. - соответствен-

но, основное, синглетное, триплетное и полувосстановленное (свободно-радикальное) состояния фотосенсибилизатора - хинона; КН - молекула субстрата.

ношшх соединений (К1оЬ,ВепОа11, 1980) позволило отнести пипдент» сенсибилизатор действия ЭФ света в мембранных структурах высших растений к молекулам хинона.

Предполагая, что при действии ЗФ света хинонные молекулы сенсибилизируют реакции образования кислородных радикалов, приводящие к'ингибированив фотохимической активности тшшэондных мембран, можно предположить, согласно (ЭопоЛо, 1988), следующую схему (рио.23)* Согласно схеме, ЗФ свет переводит молекулу хинона из синглетного в триплетное состояние. В результате реакции типа П молекулярный кислород переходит из триплетного состояния в синглетное состояние. Реакции типа I: хинон в тршшзтном состоянии взаимодействует с субстратом. (В качестве субсуграта могут ьысту-

пать некоторые составляющие мембраны, за исключением алкильных "хвостов" каркасных лшидов).о образованием радикала'субстрата а радикальных форм хинона. Анион-радикал семихинона взаимодействует з молекулярным кислородом с образованием супероксвдного радикала кислорода (в дальнейшем превращающегося в перекись водорода). № зхемы следует, что в условиях облучения ТО светом, когда значительное количество кислорода в системе переходит в активированную £орму и количество молекулярного кислорода в системе уменьшается, стационарная концентрация радикалов семихинона увеличивается. 1риведенные выше результаты экспериментов хорошо согласуются с предлагаемой схемой.

Таким образом, опыты с плазматическими, тилаковдными мембранами и фрагментами хлоропластов указывают на то, что при действии УФ света (290-330 нм) на клетки высших растений непосредственной лишенью и. медиатором действия И света служат локализованные в ■тембраиных структурах молекулы хинона. Хиношше компоненты мем-5ран способны под действием ТО света генерировать образование активированной формы кислорода (02,^Оз^Н), выполняющей роль основного инициатора деструктивных реакций, приводящих к фотоинактива-дии клеток высших растений.

Эти выводы согласуются с заключениями, сделанными в работе (Ксензенко, 1983), что образование радикалов и происхо-цит, главным образом, в результате самоокисления нестабильного убисемахинона, возникающего при млтохондриальной дыхательной цепи.

ВЫВОДЫ

С целью выяснения молекулярного механизма действия ультрафиолетового (ТО) света на мембранные системы клеток высших растений зроведено систематическое исследование электрических параметров плазматических мембран- высших водных растений, стационарных свойств парамагнитных центров различных фотосинтезирующих систем зысших растений, кинетики их окислительно-восстановительных превращений в стационарном режиме освещения. В качестве основного юдхода использованы метод ЭПР и микроэлектродной техники. Основ--ше итоги исследования состоят в следующем:

I. Изучено влияние ТО облучения на электрические параметры 1лазматических мембран меток высших растений.

- Обнаружен эффект быстрой (Ту^—30 сек) и обратимой деполяризации мембранного потенциала клеток листьев высших водных рас-

тений в ответ на действие, умеренной дозы (3-105 эрг/си2) ГО света (быотрая ГО-реакция). Дозовая зависимость быстрой ГО-реакции описывается 8 -образной кривой. Входное сопротивление мембран и мех-клеточные электричеокие связи до ГО облучения, в период облучения и некоторое время после облучения (—30 мин) клеток остаются неизменными. вменение концентрации ионов в омывающей клетку среде не оказывало существенного влияния на индуцируемую ГО светом реакцию мембранного потенциала. Однако, быстрая ГО-реакция сильно завиоит от рН среды. При снижении рН среды амплитуда деполяризации увеличивалась, а при возрастании, наоборот, уменьшалась. По, лучено, что спектр действия быстрой ГО-реакции лежит в интервале длин волн 290-330 ни. '

- Установлено, что при больших дозах (-¿.10® эрг/см2) ГО света наряду с быстрой ГО-реакцией наблюдается медленно протекающая

мин) фаза деполяризации мембранного потенциала в плазматических мембранах клеток высших водных растений. Спектр действия данной деполяризации лежит в интервале длин волн 260-330 нм.

2. Обнаруженные явления, связанные с влиянием ГО света на электрические характеристики плазматических мембран клеток высших растений, объяснятся в рамках модели ^'-выводящего комплекса плазматической мембраны, состоящего из двух взаимодействующих электрогенных помп: Н!"-А1Фазного ферментативного комплекса и Я^-помпы редоко-активной. природы. На основании спектра действия, рН-вависиыости и кинетических особенностей изменения мембранного потенциала предполагается, что компонентом редокс-системы, чувствительным к ГО облучению, является электронный переносчик хинонной природы. Этот компонент служит переносчиком протонов между внутренними и внешними сторонами плазматических мембран.

3..Изучено влияние ультрафиолетового облучения на кинетику фотоиндуцированного электронного транспорта и парамагнитные свойства изолированных хлоропластов и листьев высших растений.

- На основании исследования кинетики фотоиндуцированных окислительно-восстановительных превращений реакционного центра Р700 показано,, что'в изолированных хлоропластах ГО свет подавляет фс тохимичеокую активность фотосистемы 2 и вызывает тем самым уменьшение потока электронов мезду фотосистемами. При этом фотосистема I иенее чувствительна к повреждающему действию ГО облучения. Установлено, что в изолированных хлоропластах ГО облучение не затрагивает сколь-либо значительно протонную проводимость тплаковд-

нцх мембран. ГО облучение тилаковдной мембраны хлоропластов сопровождается увеличением юестикомпонентного сигнала Ып2+ и возрастанием выхода перекиси водорода.

- Облучение листьев высших растений ГО светом активирует отток электронов на акцепторном участке фотосистемы I. Умеренные дозы ГО облучения (1,2-10 эрг/сы2) не влияют на функцшнированш цепи переноса электронов между фотосистемами.

4. В ГО облученных листьях и изолированных хлоропластах в темноте наблвдается изменение форлы темнового сигнала ЭПР 2,-обусловленное накоплением новых стабильных радикалов с е~2,004; ДН=8 ГЪ.

- Установлено, что ГО свет влияет на взаимодействие электрон-транспортной цепи хлоропластов с экзогенными переносчиками электронов (2,5-дихлорпарабензохинон). Показано, что под действием ГО света сигнал ЭПР семихинонной формы экзогенного органического хи-ноиа обратимо увеличивается. Изучено влияние ГО облучения на молекулы хинона в растворах. Обнаружено, что при щелочных рН под действием ГО света сигнал ЭПР семихлнона обратимо изменяется.

5. Изучено влияние ГО света на сигналы ЭПР субхлоропластных частиц фотосистемы 2, внсокоочищенных от примеси Р700 в физиологическом интервале температур и при 77°К.

- Обнаружено, что в присутствии специфического акцептора электронов фотосистеглы 2 - кремниймолибдата в препаратах ФС2 на свету появляется синглетный сигнал ЭПР, обратимый в темноте. Изучены релаксационные радтспектроскопические свойства и фотохимические реакции парамагнитного центра, ответственного за этот сигнал. Установлено отличие релаксационных параметров сигнала ЗНР в субхлоропластных частицах ФС2 в присутствии кремниймолибдата от соответствующих параметров сигнала ЗПР окисленных центров Р7О0* в СС1, доказана его принадлежность <2С2. Параметры сигнала ЗПР в ~ 2,0025; ДН=9 Но указывают на катион-радикалы мономерного хлоро-фи;ла как источника этого сигнала, в согласии с данными дифференциальной оптической спектроскопии и измерениями молярной экотинк-ции. Показано, что интенсивность этого фотоиндуцированного снн-глетного сигнала ЭПР снижается при действии ГО света.

- В субхлоропластных частицах ФС2 нет влияния ГО облучения на форму темнового сигнала ЭПР 2. Однако, обнаружено подавление этого сигнала на свету и в темноте в присутствии крешшймолибдата. Установлена темповая гибель отого сигнала в присутствии дихлор£е-

нолиндофенола, зависимость. от добавок различных доноров, акцепторов и ингибиторов транспорта электронов, а также хаотропных агентов.' Показана упорядоченная ориентация фрагмента, ответственного за сигнал ЭПР 2, относительно плоскости тилакоидаых мембран. Описаны радиоспектроскошпеские параметры оигнала ЭПР 2 в листьях высших растений, хлороплаотах, оубхлоропластных фрашентах и мутантах водорослей яаатуйошопаа ге1п1тг<И., лишенных фотосистемы I.

6. Показано, что в изолированных хлороплаотах и их фрашентах наиболее чувствительным в ГО облучению участком ФС2 является комплекс фоторазложения воды. Установлено, что в результате облучения ГО светом оубхлороплаотных частиц ФС2, в первую очередь, про, исходит выход белка 33 кДа, входящего в комплеко разложения воды и содержащего юны Ип2*. Выход этого белка под действием ГО света коррелирует о появлением в растворе агитированных ионов марганца.

7. Обнаружена экспоненциальная зависимость уменьшения пере- . . менной флуореоценции и скорости ввделения кислорода, выхода эндогенного препаратов ФС2 от дозы ГО облучения. Показано, что при этом происходит значительное накопление в препаратах ФС2 и тнлавоадных мембранах перекиси водорода (Н2О2). Установлено, что анаэробные и восстановительные условия инкубирования мембранных систем оказывают протекторное воздействие при ГО облучении. Это свидетельствует об окислительной природе механизмов ингибирования.

8. Исследование структурных характеристик тилаковдных мембран показало, что облучение ГО светом не вызывает каких-либо существенных изменений в структурной организации лищдной части тилаковдных мембран. Однако, ГО облучение приводит к уменьшению величины поверхностного потенциала тилакоидной мембраны. Этот эффект коррелирует со структурными изменениями, происходящими в ФС2: ГО облучение стимулирует агрегацию хинон-связыванщих белков Д-[(32 кДа) и «¿¡2 (30 кДа).

9. Вся совокупность полученных данных свидетельствует о том, что при действии ГО света (290-330 ни) на растительные клетки эндогенным сенсибилизатором служат локализованные в мембранных структурах, молекулы хинона. Механизм сенсибилизирующего действия хинонов может быть обусловлен фотогенерацией образования ак. зи-рованного кислорода, выполняющего роль основного инициатора деструктивных реакций, приводящих ю фотоинактивации различных цро-цессов ь растительных клетках. Предложена схема действия ГО света не хинонную систему в присутствии молекулярного кислорода (рю.23)

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. ГЬльдфельд М.Г., Хангулов С.Б., Халилов Р.И., Цапин А.И. О путях восстановления реакционных центров фотосистемы I фотосинтеза. - Биофизика, 1975, т.20, вып.2, с.254-259.

2. ГЬльдфельд М.Г., Возвышаева Л.В., Цапин А.И., Халилов Р.И. Парамагнитные центры и фотохимические реакции субхлоропласт-ных фрагментов фотосистем П. - Биофизика, 1978, т.23, вып.2, с.266-277.

3. 1Ьльдфельд М.Г., Халилов Р.И., Хангулов C.B. Фотоиндуцтован-ные парамагнитные центры в фотосистеме П хлоропластов. -Докл. АН СССР, 1977, Т.237, № 6, с.1494-1497.

4. Возвышаева Л.В., ГЬльдфельд М.Г., Халилов Р.И., Цапин А.И. Исследование структуры и функции фотосистемы П фотосинтезе методами магнитного резонанса. - В Тр. Всесоюзного симпозиума "Магнитный резонанс в биологии и медицине", 1977, Москва,

с.136-137.

5. Халилов Р.И., ГЬльдфельд М.Г. Фотоивдуцированные парамагнитные центры фотосистемы П растений. - В Тр. У Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений, 1978, Алма-Ата, с.18.

6. ГЬльдфельд М.Г., Кононенко A.A., Нокс П.П., Халилов Р.И., Хангулов C.B. Молярная экстинкция пигаента в реакционном центре ФСП хлоропластов. - Биофизика, 1979, т.24, вып.1, с.170-172.

7. Халилов Р.И., Хангулов C.B., Больдфельд М.Г. Исследование методом ЭПР светозависимых реакций фотосистемы П хлоропластов. - В сб. Биофизика мембран, 1981, Пущино, с.67-87.

8. ГЬльдфельд М.Г., Халилов Р.И., Хангулов C.B. Светозависимый парамагнитный центр в фотосистеме П высших растений. - Молекул, биология , 1979, т.13, с.324-334.

9. 1Ьльдфельд М.Г., Тимофеев В.П., Халилов Р.И. Влияние ориентации в магнитном поле на форму сигнала ЭПР П в фотооинтезирую-щих системах. - Докл. АН СССР, 1979, т.247, с.235-239.

СО. ГЬльдфельд М.Г., Халилов Р.И. Локализация меди в фотосинтетическом аппарате. - Биофизика, 1979, т.24, с.542-544.

[I. ГЬльдфельд М.Г., Лодыгин В.Г., Халилов Р.И. Спектры ЭПР и термолюминесценция нефотосинтезирующих мутантов Chlanydomcnaa reInhardi, - Физиология растений, 1980, т.27, вып.2, с.308-314.

12. Халилов Р.И., 1Ълъдфельд М.Г. Ванин А.Ф. О содержании гемо-вого и негемового железа в фотосистеме П хлоропластов. - Биофизика, 1980, т.25, вып.2, с 365.

13. Халилов Р.И., Зейналова Н.Д. Исследование реакций Хилла ш фотоокисленш марганца во фрагментах фотосистемы. - В Тр. П Всесоюзной межуниверситетской конференции ученых "Современные проблемы биологии", 1980, Тбилиси, с.155-156.

14. Халилов Р.И. Из следование фото индуцированных сигналов ЭПР оубхлоропластных фрагментов. - В Тр. П Всесоюзной межуниверситетской конференции ученых "Современные 'проблемы биологии", 1980, Тбилиси, с.152.

15. Халилов Р.И. Парамагнитные центры во вторичных реакциях фотосистемы П. - В Тр. Всесоюзного симпозиума "Магнитный резонанс в биологии и медицине", 1881, Мооква, с.178-179.

16. Халилов Р.И. Изучение особенностей сигнала ЭПР П в фотосинте-зирующих организмах при некоторых воздействиях. - Темат.сборник А1У "Резистентность растительных организмов к действию физичеоких а химических факторов", 1981, Баку, с.25-31.

17. Халилов Р.И. Свободно-радикальные центры семихинонного типа в фотосинтезирующих организмах. - В сб.: I Всесоюзный биофизический съезд, 1982, т. 2, Москва, о.340.

13. Халилов Р.И., Ахмедов И.С. Влияние ГО света на электрические параметры мембран клеток высших растений. - В сб.: I Всесоюзный биофизический съезд, 1982, т. 1 , Москва, с.309.

19. Халилов Р.И., Мамедов Т.Г. О влиянии некоторых ингибиторов свободно-радикальных процессов на ГО чувствительность агро-бактерий. - В Тр. Всесоюзного совещания "Биоантиоксндант", 1983, Мооква, с.

20. Халилов Р.И., Ахмедов И.С. Кинетика изменения мембранного потенциала клеток растений при действии ГО света. - Темат.сборник АГУ 'Физико-химические механизмы экстремальных воздействий на мембрану клеток", 1983, Баку, с.18-24.

21. Алиев Д.А., Мамедов Т.Г., Ахмедов И.С., Халилов Р.И. Быстрая биоэлектрическая реакций клеток листьев элодеи на ГО излучение. - Докл. АН СССР, 1984, т.274, № 6, с.1491-1493.

22. Халилов Р.И., Ахмедов И.О. Быстрая ответная мембранная реакция клеток растении на ГО облучение. - В Тр. Первой международной школы-1СС1Нференцш1 ученых стран-членов СЭВ по биофизике "Биофизика мембран, белков и нуклеиновых кислот", 1985, Бра-

тислава, с.04.

23. Азалеяов И.О., la лило в Р.И. Электрические характеристики плазматических мембран клеток растений на температурное воздействие. - В Тр. Первой международной школы-конференции ученых стран-членов СЭВ по биофизике "Биофизика.мембран, белков и нулкиновых кислот", 1985, Братислава, с.43.

24. Халилов Р.И., Ахмедов U.C. Быстрая биоэлектрическая реакция клеток листьев элодеи на повторяющееся ТО излучение. - В Тр. 5 научной конференции ученых Казанского института биолгии I® АН СССР, 1986, с.59-61. Деп. в ВИНИТИ.

25. Ахмедов И.С., Халалов Р.И. Биоэлектрическая характеристика клеток корня Trtanea bogotensis при действии некоторых ингибиторов метаболизма и ТО света. - Темат.сборник А1У "Молекулярная биофизика клетки и клеточных процессов", 1986, Баку, с.24-28.

26. Халилов Р.И., Ахмедов И.С. Влияние ультрафиолетового излучения на мембранный потенциал растительных клеток. - Темат. сборник А1У "Физколого-генетические эффекты действия различных факторов на живые организмы", 1987, Баку, с.71-81.

27. Халилов Р.И. ,• Ахмедов И.С., Маыедов Т.Г. Особенности изменения МП клеток листьев элодеи при ТО облучении. - В Тр. У Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетка", 1987, Тбилиси, с.137-138.

28. Халилов Р.И., Маыедов Т.Г. Быстрое изменение мембранного потенциала клеток растений на импульсное температурное воздействие. - Гемат. сборник А1У "Структура и функции биошлекул и клеточных систем", 1988, Баку, с.

29. Халилов Р.И. Влияние ультрафиолетового излучения на кинетику замедленной флуоресценции листьев высших растений. - Темат. сборник AI7 "Гепегико-физ ко логические исследования действия физических и химических факторов на организм", 1988, Баку, с. ICI-105.

30. Халилов Р.И., 1Ьльдфельд М.Г. Влияние ультрафиолетового облучения на парамагнитные центры фотосистемы П. - В Тр. У1 межуниверситетской конференции на тему: "Биологические мембраны в норме и патологии", IS89, Тбилиси, с.194-197.

31. Ахмедов И.С., Халилов Р.И. Быстрая мембранная ответная реакция меток растений на импульсное температурное воздействие. - В Тр. 71 межуниверситетской конференции на тему: "Биологи-

ческие мембраны в норме а патологии", 1989, Тбилиси, с,9-12.

32. Халилов Р. И. Некоторые закономерности быстрого изменении мембранного потенциала клеток рестений, вызываемое экзогенными факторами. - Темат.сборник А1У "Молекулярные основы жизненных процессов", 1989, Баку, с.39-42.

33. Ахмедов И.С., Халилов Р.И. Действие ГО света на фото индуцированный мембранный потенциал клеток листа элодеи. - Б Тр. 6 научной конференции ученых Казанского института биологии № АН СССР, 1990, 0.135-187. Деп. в ВИНИТИ, ЖГ014-В90.

34. Халилов Р.И., Ахмедов И.С. Изучение редокс^активности плазма-леммы клеток растений при ГО облучении. - £ Тр. 6 научной конференции ученых Казанского института биологии № АН СССР, 1990, с. 188-190. Деп. в ВИНИТИ, М014-ВЭ0.

35. Халилов Р.И. Парамагнитные центры хлоропластов при ГО облучении. - Темат.сборник А1У "Молекулярная и клеточная биофизика" 1990, Баку, с.42-47.

36. Халилов Р.И. Особенности генерации мембранного потенциала фо-тосинтезируицих клеток, адаптированных к различным световым уоловиям. - Темат.сборник А1У "Исследование специфичности дейотвия физико-химических факторов На биологические объекты" 1990, Баку, о.81-63.

37. Халилов Р.И., Ахмедов И.С. 0 некоторых особенностях действия ГО света на активность Н^-помпы плазматических мембран растений. - В ТР> I республиканской биохимической конференции, 1990, Баку, 0.125.

38. Халилов Р.И.', Ахмедов И.С. ГО индуцируемое изменение мембранного потенциала клеток растений при различных физиологичёских состояниях. - В Тр. Всесоюзной межуниверситетской школы-семи-нлра "Устойчивость биологических систем", 1979, Тбилиси, с.

39. Халилов Р.И., Ахмедов И.С. Индуцируемые ультрафиолетом изменения мембранного потенциала клеток растений. - Физиологии растений, 1992, т.38, вып.1, с.

40. Халилов Р.И., Тихонов А.Н. Ингибирование фотохимической активности фотосистемы П хлоропластов высших растений под действием ультрафиолетового облучения. - Биофизика, 1992, т. , вып.1, о.

41. Ахмедов И.С., Халилов Р.И., Ыамедова С. Светоиндуцированный мембранный потенциал у клеток ризодерлы корня Тг1апеа Ъоео-г«пв!в. - Физиология растений, 1992.

1. Goldfeld 1,1.G., Halilov R.I., Hangulov S,V., Kononenko A.A., Knox P.P. Correlation of the light-induced change in abaorban-oe with ESR signal of photosystem II in presence of silicomo-lybdate. - Biochim.biophys.res.Commun., 1978, 8£, p.1199-1203.

\3, Chalilov R.I.,Effects of UV radiation on the kinetical pro-poitiea of ESR signal in isolated ohloroplaats of plants. -6'th CMEA symposium on eleotron spin resonanoe spectroscopy in bioohemistry, molecular biology and medioine, 1988, Bratislava, p. 10.

I. Halilov R.I., Ackmedov I.S. UV-light stimulates ohango of membrane potential of plant cells* - International symposium on photobiology and biotechnology, 1989, Poland, p.130.

j, Aokmedov I.S., Chalilov R.I. Photoinduoe actlvitica of H -pump plasmamembrane plant cells with stimulate ohlorophyll synthe-sia. -6'th International oonference on energy and electron transfer, 19Q9, Prague, p.40,

3. Chalilov R.I» Effects of UV-radiation on photosynthesis: ESR study - proceedings of 6'th International conference on energy and electron transfer, 1989, Prague, p.38.

J, Chalilov R.I. Electrical properties of plasmamembranes plant cells on the ultraviolet irradiation. - Second International sohool "Eleotromagaetio fillds and blomerabranos", 1989, Pleven, p,

Aokraedov I.S., Chalilov R.I., Mamedova S.ZJ. The photoinduoed membrane potential of rhizodermio cells of the higher wather plants. - 10'th International Biophysios Congress, 1990, Vancouver, Canada, p.476.

J. Chalilov R.I., Ackmedov I.S. The UV-induced inactivation of the. plant oell plaamamembranea H^-puirp. - 10'th International Biophysios Congress, 1990, Vanoouver, Canada, p.'339.

). Chalilov R.I. The effect of UV-light on photosynthetio primary reactions: ESR study - 10!th International Biophysios Congress, 1990, Vancouver, Canada, p.116.

I. Aokmedov I.S., Chalilov R.I. PH-dependent UV induced inactivation of proton pump of the Elodea leaf cell. - Proceeding of the 5'th International Vouth Symposium Plant Metabolism Regulation, 1991, Sofia, p.30-33.