Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие микроорганизмов с продуктами гидролиза иприта

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие микроорганизмов с продуктами гидролиза иприта"

На правах рукописи

Орлова Ольга Геннадьевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПРОДУКТАМИ ГИДРОЛИЗА ИПРИТА

Специальность 03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□030ВБ220

Санкт-Петербург - 2007

003066220

Диссертационная работа выполнена в лаборатории микологии и микробиологии Санкт-Петербургского Научно-исследовательского центра экологической безопасности (НИЦЭБ) РАН

Научный руководитель

доктор технических наук НГ Медведева

Научный консультант

кандидат биологических наук Т Б Зайцева

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Е П Яковлева

кандидат биологических наук Л Н Пароменская

Ведущая организация Санкт-Петербургский

Государственный технологический __ институт (технический университет)

Защита состоится .И октября 2007г в 11 00 часов на заседании диссертационного совета (К 006 028 01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу 196608, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, д 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной

микробиологии

Автореферат разослан «

06 09 » 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук С М Алисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы К числу хлорорганических соединений, представляющих собой устойчивые поллютанты, относится иприт и продукты его гидролиза

В силу повышенной токсичности иприта и продуктов его гидролиза они длительное время сохраняются в экосистемах без снижения ингибиторного действия на живые организмы В природную среду они попадают в результате несовершенных способов хранения, при транспортировке, авариях и других ситуациях И если проблема уничтожения запасов иприта в значительной степени решена, способы очистки природных экосистем - почв и водоемов от иприта и продуктов его гидролиза находятся только на стадии разработки

Одним из современных методов, используемых при разработке экологически чистых технологий защиты природной среды, является биоремедиация, как наиболее щадящий метод сохранения биоразнообразия и обеспечения устойчивости очищаемых биоценозов

По мнению большинства исследователей этой проблемы, использование для этой цели активных штаммов микроорганизмов-деструкторов, устойчивых к загрязнителям, является наиболее перспективным способом биоремедиации почв и водоемов

Сообщения в доступной литературе о характере действия иприта и продуктов его гидролиза на морфологические и физиологические свойства различных микроорганизмов, равно как о механизмах деструкции этих загрязнителей весьма ограничены и представляют собой единичные и разрозненные сообщения

Цель исследований - провести сравнительное изучение чувствительности микроорганизмов к продуктам гидролиза иприта, из числа наиболее устойчивых выделить культуру - высокоактивного деструктора этих продуктов, определить возможный механизм их биодеструкции

В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие задачи:

• Определить уровень биоцидного действия смеси продуктов гидролиза иприта (ПГИ) и основного из них - тиодигликоля (ТДГ) на микроорганизмы различных таксономических групп

• Изучить характер действия ПГИ на морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства микроорганизмов, наиболее чувствительных к этим продуктам

• Выделить культуры-деструкторы ПГИ, определить наиболее активную культуру по способности потреблять ТДГ из смеси ПГИ и определить ее основные морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства

• Идентифицировать промежуточные и конечные продукты деструкции ПГИ выделенной культурой и определить возможный механизм деструкции

• Провести модельные испытания выделенной культуры как деструктора

111И в условиях почвы

Научная новизна полученных результатов. Впервые изучены характер, и степень воздействия смеси продуктов гидролиза иприта на рост микроорганизмов различных таксономических групп Показано, что повышенная чувствительность к этому загрязнителю характерна для микромицетов и акгиномицетов и в меньшей степени для дрожжей Бактерии отличаются наибольшей устойчивостью к этим веществам

С использованием микромицетов показано, что действие на них смеси ПГИ весьма многообразно и касается как морфолого-кулыуральных, так и физиолого-биохимических свойств, что в конечном итоге может являться причиной фунгицидного эффекта

В результате скрининга толерантных к смеси 111И бактерий выделена культура, отличающаяся способностью к полному их потреблению при высоких концентрациях в среде (2,3 г/л ХОС и 20 г/л ТДГ) По совокупности морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков культура отнесена к роду Pseudomonas и обозначена как Pseudomonas sp Y-13 Установлено, что эта кулыура отличается отсутствием патогенных свойств по отношению к теплокровным животным и растениям

Показано, что основным путем деструкции ТДГ культурой Pseudomonas sp Y-13 является окисление его первичных спиртовых групп с образованием тиодигликолевой кислоты (ТДГК) и тиогликолевой кислоты (ТГК), последующая трансформация которых сопровождается образованием ацетата В продуктах трансформации ТДГ культурой Pseudomonas sp Y-13 впервые обнаружен ß-меркалтоэтанол, который в дальнейшем также трансформируется в ТГК Все образующиеся продукты деструкции используются выделенной культурой в качестве единственных источников углерода

Практическая значимость полученных результатов. Показано, что поиски и выделение деструкторов ПГИ целесообразно проводить среди бактерий, отличающихся от микроорганизмов других таксономических групп повышенной толерантностью к этим продуктам и способностью использовать их в качестве источника углерода

На модельных испытаниях показано, что внесение в почву, загрязненную смесью ПГИ, клеток культуры Pseudomonas sp Y-13 в значительной степени ускоряет очистку почвы и способствует снижению ее фитотоксичности

Такие критерии оценки выделенной культуры как деструктивная активность, толерантность к продуктам гидролиза иприта, безопасность для теплокровных животных и растений свидетельствуют о целесообразности использования Pseudomonas sp Y-13 для разработки биопрепаратов с целью детоксикации ПГИ в природных экосистемах - почвах и водоемах

Апробация работы. Результаты работы доложены на 13-м международном симпозиуме по биоповреждениям и биодеградации

(Испания, Мадрид, 4-9 сентября 2005г.), на международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 14-16 сентября 2005г), на международной конференции ConSoil 2005 (Франция, Бордо, 3-7 октября 2005г), на 10-м международном симпозиуме «Генетика промышленных микроорганизмов» (Прага, 24-28 июня 2006г), на VIII международной конференции «Защита и восстановление окружающей среды» (Греция, 3-7 июля, 2006г), обсуждены на заседании лаборатории микологии и микробиологии НИЦЭБ РАН

По теме диссертации опубликованы 2 статьи и 5 тезисных сообщений Работа выполнена в рамках проекта МНТЦ # 2488 «Разработка технологии микробиологической биоремедиации почв, загрязненных отравляющим веществом ипритом»

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и списка литературы

Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 21 рисунок, из них 8 фотографий. Библиография включает 172 источника

Список принятых сокращений ХОС - хлорорганические соединения, 111И - продукты гидролиза иприта, ТДГ - тиодигликоль, ТДГК -тиодигликолевая кислота, ТГК - тиогликолевая кислота, а с б - абсолютно сухая биомасса, а с п - абсолютно сухая почва

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве тест-культур в работе использовали 18 культур мицелиальных грибов, 10 культур акгиномицетов, 12 культур дрожжей и 12 культур бактерий разных родов, полученных из разных коллекций Чувствительность микромицетов и акгиномицетов к ТДГ и смеси 111И проверяли на агаризованной среде Чапека с глюкозой, дрожжей на среде Сабуро, а бактерий на двух агаризированных средах Чапека с глюкозой и МПА с глюкозой В состав сред вносили ТДГ в концентрациях от 5 до 100 г/л, или смесь ПГИ - от 0,6 г/л ХОС и 0,5 г/л ТДГ до 6,6 г/л ХОС и 55 г/л ТДГ

Изучение морфологии культур проводили методами просвечивающей (Hayat, 1974) и сканирующей (Spurr, 1969) электронной микроскопии

Об изменении уровня проницаемости клеток микроорганизмов судили по "утечке" из клеток в среду метаболитов, имеющих полосу поглощения в ультрафиолетовой области (220-350 нм) (Federson et al, 1990, Александров и др, 1993, Иванов и др, 1993) Количественное содержание белка определяли методом Лоури (Lowry, et al, 1975), аминокислот - методом тонкослойной хроматографии на пластинах "Silufol" (Munavalli et. al., 1988), ионы калия -фотометрически (Аринушкина, 1970)

Выделение липидов микромицетов проводили методом Фолча (Кейтс, 1975) Состав жирных кислот определяли методом газожидкостной хроматографии по ГОСТ Р51483-99 Амилолитическую активность микроорганизмов определяли по общепринятой методике (Грачева и др , 1982) Каталазную и глюкозооксидазную - по методу, основанному на титрометрическом определении (Борисова, 1973) Активность дегидрогеназ определяли с использованием 2,3,5-трифенил тетразолиум хлорида и выражали в мкг/100 мг ас б (Логинова Л Г и др, 1961) Количество пигментов учитывали общепринятым методом (Лысенко, Лях, 1977), количество экзополисахаридов методом осаждения их этанолом из нативного раствора (Егоров, 1976) Комплекс целлюлолитических ферментов - методом Мандерс-Вебера (Марчева, 1985)

Микроорганизмы-деструкторы продуктов гидролиза иприта выделяли из почвенных компостов Для этого почвенные образцы (20-25г воздушно-сухой почвы) увлажняли (60% от полной влагоемкости почвы), вносили смесь ПГИ из расчета 0,30 г ХОС/кг почвы и инкубировали в течение 20 суток при температуре 28°С, с периодическим поддержанием влажности

Предварительный отбор толерантных к продуктам гидролиза иприта бактериальных культур проводили путем высева их на твердую среду № 1а следующего состава (г/л) (NH^SO^O, КН2Р04-1,5, К2НР04-1,5, MgS04- 0,2, с добавлением (г/л) глюкозы-5,0, дрожжевого экстракта-2,0, смеси ПГИ (0,08±0,006 ХОС и 0,72+0,04 ТДГ), и агара-20

Способности отобранных культур осуществлять деструкцию ПГИ определяли двумя методами

1 по росту на твердой среде № 1а содержащей (г/л) ТДГ-2,0, СаСОэ-2,5, агара -20, рН 7,2-7,4

2 по способности к росту в глубинных условиях в колбах Эрленмейера объемом 250 мл со стерильной жидкой средой №1 следующего состава (г/л) (NH4)2S04-6,0, КН2Р04-5,0, К2НР04-5,0, MgS04-0,2, с добавлением СаС03-Ю г/л и смеси ПГИ, в качестве единственного источника углерода, 0,78 ± 0,04 г /л ХОС и 7,0 ± 0,2 г/л ТДГ, рН - 6,8 - 7,2 Объем среды в колбе — 50 мл

Изучение морфолого-культуральных признаков наиболее активной культуры-деструктора проводили по общепринятым методам (Егоров, 1983, Hugh et al, 1953, Sneath et al, 1974) Оценку фитотоксичности Pseudomonas sp Y-13 осуществляли по методу Берестецкого [Берестецкий, 1971] Токсикологические исследования с целью изучения безопасности этой культуры для теплокровных животных по общепринятым методикам (Лабинская и др , 2004)

Культуру хранили на твердой питательной среде № 1а с добавлением (г/л) глюкозы-5,0, дрожжевого экстракта-2,0, смеси ПГИ 0,015+0,001 г/л ХОС и 0,12±0,01г/л ТДГ, агара -20, рН - 7,0, при 4°С с частотой пересевов - 1 раз в месяц

Изучение свойств выделенной культуры как деструктора проводили при выращивании ее в глубинных условиях в колбах на среде №1, рН - 6,87,2, при +28±1°С на роторной качалке (п=230 об/мин) В качестве единственного источника углерода в питательную среду вносили смесь ПГИ (от 0,15 до 2,70 г/л ХОС, содержащую соответственно от 1,2 до 24,4 г /л ТДГ)

Модельную смесь ПГИ получали нагреванием водной смеси 0,65 М ТДГ (ICN 103039 RT, 99%, плотность 1,18) и 0,65 М НС1 при 90°С в течение 8 часов Полученная смесь ПГИ содержала 7,5 ± 0,03 г/л ХОС и 67,8 ± 0,2 г/л ТДГ

Количественное определение ТДГ в растворах проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе "Hewlett - Packard" HP1090 Для идентификации и количественного определения промежуточных продуктов деструкции ТДГ использовали метод ВЭЖХ (хроматограф HP-1090 с диодно-матричным УФ-детектором и компьютерной системой управления и сбора данных)

Содержание хлорорганических соединений в смеси ПГИ определяли спектрофотометрическим методом (Франке, 1973, Issa et al, 1975)

Изучение токсичности исследуемых почвенных образцов проводили методом фитотестирования (Звягинцев, 1991, Андреюк, 1981)

Математическую обработку результатов проводили методами Ашмарина (Ашмарин и др , 1974) и Максимова (Максимов, 1980)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние продуктов гидролиза иприта на рост и физиолого-биохимические признаки микроорганизмов

Загрязнение почв ТДГ и смесью ПГИ приводит к формированию новых микробных сообществ, характерной чертой которых является повышенный уровень показателя доминирования, понижение уровней сходства и видового разнообразия, что свидетельствует о снижении биоустойчивости системы в целом На изменение видового разнообразия микробного состава в почвах влияет различный уровень чувствительности отдельных групп микроорганизмов к этим ксенобиотикам В литературе весьма ограничена информация о характере и механизмах действия ПГИ, как на природные микробиоценозы в целом, так и на отдельные компоненты микробных сообществ. В настоящем разделе представлены результаты сравнительного исследования степени чувствительности различных микроорганизмов - бактерий, актиномицетов, мицелиальных грибов и дрожжей к смеси ПГИ и основному из них - ТДГ, а также влияния этих субстратов на морфологические и физиолого-биохимические свойства одной из основных групп почвенных микроорганизмов - мицелиальных грибов

1.1. Рост актиномицетов, бактерий, микромицетов и дрожжей на средах, содержащих продукты гидролиза иприта.

Как показали результаты, на средах, содержащих ТДГ и смесь ПГИ, наблюдается подавление роста у всех исследованных микроорганизмов Однако, как и следовало ожидать, степень чувствительности к этим веществам зависит от родовой, а в некоторых случаях и видовой их принадлежности, а также от концентрации ПГИ (рис 1) Однако наибольшую чувствительность проявляют актиномицеты и мицелиальные грибы

Рис 1 Количество тест-культур микроорганизмов, рост которых отсутствует на среде с различным содержанием ТДГ Контроль - исходное число тест-культур, 100%

Концентрация ТДГ в среде 1 - 40 г/л, 2-50 г/л, 3-60 г/л, 4-130 г/л, 5 - 150 г/л, 6 - 170 г/л

При концентрации ТДГ до 20 г/л размер колоний микромицетов уменьшается на 30-40% у всех культур, за исключением грибов родов Botrytis, Helmintosporium, Mucor, у которых признаки подавления роста отсутствуют При концентрации ТДГ равной 40 г/л отмечается подавление роста 70% культур мицелиальных грибов Полное подавление роста всех культур микромицетов происходит только при 60 г/л ТДГ

Значительно большую чувствительность микромицеты проявляют к смеси ПГИ В силу повышенной токсичности ХОС шаг варьирования его концентраций в среде был меньше, чем ТДГ и составлял около 0,6 г/л по ХОС

Результаты этих наблюдений показали, что у основной части мицелиальных грибов рост отсутствует уже при концентрации смеси ПГИ

16 г/л ХОС (30 г/л ТДГ), а у всех культур при 4,2 г/л ХОС (35 г/л ТДГ) 0нс2)

Дрожжи по своей реакции на присутствие в среде ТДГ и смеси 111 И, в ВДом, сходны с мицелиальными грибами (рис. 1,2), однако и в том и в дргом вариантах дрожжи проявляют большую устойчивость

110

1 2 3 4 5

Рис 2 Количество тест-культур микроорганизмов, рост которых отсутствует ia среде с различным содержанием смеси 111И Контроль -исходное число тест-культур, 100%

Концентрации смеси ПГИ. 1 - 2,4 г/л ХОС, 20 г/л ТДГ, 2 - 3,6 г/л ХОС, 30 г/л ТДГ, 3 4,2 г/л ХОС, 35 г/л ТДГ, 4 - 5,4 г/л ХОС, 45 г/л ТДГ, 5 - 6,0 г/л ХОС, 50 г/лТДГ.

Самыми чувствительными к ТДГ и смеси ПГИ являются актиномицеты Рост всех исследованных актиномицетов отсутствовал на среде с 50 г/л ТДГ и при самой низкой из испытанных концентраций смеси ПГИ - 1,2 г /л ХОС, 10 г ТДГ/л

Самыми устойчивыми микроорганизмами к ТДГ и смеси ПГИ являются бактерии и особенно представители родов Bacillus, Brevibactenum, Pseudomonas, Staphylococcus

Полное подавление всех использованных в работе бактериальных культур (12 культур) на среде с ТДГ наблюдается при концентрации 170 г/л ТДГ, а смеси ПГИ - 6,0 г/л ХОС, 50 г/л ТДГ

Таким образом, для бактерий биоцидные концентрации ТДГ в 2,6 раза, а смеси ПГИ в 1,4 раза выше, чем для других микроорганизмов

1.2. Действие продуктов гидролиза иприта на некоторые морфологические свойства микроорганизмов Сравнительно высокая чувствительность грибов к ПГИ позволяет предположить, что загрязнение ими почв приводит к нарушению

жизнедеятельности этих микроорганизмов со всеми вытекающими из этоп негативными последствиями

Эти позиции и определили выбор мицелиальных грибов, к;< основного объекта для начала изучения всего многообразия воздействА которые могут оказать ПГИ на микроорганизмы

Изучение морфологии мицелиальных грибов, выращенных на средесо смесью ПГИ, проводили с использованием двух культур - Aspergillus tereus и Pénicillium ochrochloron С помощью электронной микроскопии покаано, что на среде, содержащей смесь ПГИ в концентрации 1,2 г/л ХОС, 1) г/л ТДГ гифы грибов утолщаются, наблюдается плотное их прилегание руг к другу с образованием плотных тяжей Плотность прилегания насолько велика, что изменяется форма клеток - создается впечатление, что на]ужные слои клеточных стенок сливаются Кроме того, в опытных шетках увеличивается количество митохондрий

Результаты исследования на клеточную проницаемость микр<мицетов показали, что изучаемые токсиканты способствуют увшичению проницаемости у всех культур на 30-430% по сравнению с контродам Такой же характер воздействия ТДГ и смеси ПГИ на мембраны наблюдается у дрожжей (родов Cryptococcus и Candida), однако увеличение прошцаемости их мембран менее значительно и не превышает 60%

Результаты сравнительного исследования жирнокислотюго состава липидов мицелия, полученного при культивировании Р oclrochloron на среде Чапека с ПГИ и без них (контроль) показали, что под действием ПГИ состав жирных кислот существенно изменяется В опытных гариантах, при концентрации ТДГ равной 20 г/л и смеси ПГИ в 1,2 г/л пс ХОС степень ненасыщенности жирных кислот в 1,3 и 2,3 раза выше по сравнению с этими показателями липидов контрольного мицелия Наблюдаемое изменение в жирнокислотном составе липидов клеток гриба является, по-видимому, одним из проявлений их адаптации к неблагоприятным воздействиям исследуемых веществ

1.3.Влияние продуктов гидролиза иприта на физиолого-биохимические признаки микромицетов Влияние продуктов гидролиза иприта на активность ферментов у мицелиальных грибов. В настоящем разделе работы представлены результаты изучения действия ТДГ и смеси ПГИ на активность у микромицетов таких ферментов как дегидрогеназы, амилазы, целлюлазы, каталазы, пероксидазы

Проведенные эксперименты показали, что суммарная активность дегидрогеназ у Pénicillium ochrochloron, под действием ТДГ и смеси ПГИ, возрастает 2-10 и 3-3,5 раза соответственно, по сравнению с таковой в контрольных условиях Аналогичные результаты получены в вариантах с использованием Aspergillus terreus

и

Под действием продуктов гидролиза иприта, у культур A niger и Р funiculosum наблюдается одновременная активация каталазы и глюкозооксидазы, у A terreus и Р ochrochloron активность каталазы снижается при резком увеличении активности глюкозооксидазы, а у А versicolor снижается активность обоих ферментов Таким образом, характер действия изучаемых веществ - активация или подавление, определяется, прежде всего, свойством каждого штамма, независимо от его родовой принадлежности Интерпретация полученных результатов в настоящее время затруднена из-за недостаточной изученности механизма функционирования ферментативной системы антиоксидантной защиты в целом (Семашко и др, 2004, Scandahos, 2005)

При исследовании влияния ТДГ и смеси ПГИ на комплекс целлюлолитических ферментов у грибов было выявлено, что оба токсиканта подавляют их активность Так, под действием ТДГ в концентрации 15 г/л активность ферментов снижается в 1,7-3,5 раза, а под действием смеси ПГИ (1,8 г /л ХОС, 15 г /л ТДГ) в 3-5 раз в зависимости от культуры

Аналогичные результаты были получены и в вариантах с амиилолитическими ферментами У всех исследованных микромицетов под действием ТДГ общая активность амилаз снижается в 1,4-45 раз, а под действием смеси ПГИ в 7-25 раз в зависимости от культуры

Влияние продуктов гидролиза иприта на образование пигментов и полисахаридов у мицелиальных грибов. Учитывая, что одной из функций пигментов и полисахаридов является защитная, нами изучен характер действия ПГИ на образование этих метаболитов грибами Результаты экспериментов показали, что под действием ТДГ в концентрации 20 г/л продуктивность мицелия по пигментам возрастала на 14-197%, а под действием ПГИ в концентрации 1,8 г/л на 136-159% в зависимости от культуры Значительно больший эффект наблюдается в процессе образования полисахаридов Продуктивность мицелия по экзополисахаридам на среде с ТДГ и смесью ПГИ в тех же концентрациях возрастала от 75 до 161% и от 76 до 300% соответственно

Таким образом, действие ТДГ и смеси ПГИ на микромицеты многообразно и касается как морфолого-культуральных, так и физиолого-биохимических признаков Характер их воздействия, в принципе, однотипный, однако наибольшую чувствительность они проявляют к смеси ПГИ, что, очевидно, связано с содержанием в ее составе хлорорганических соединений В настоящее время, определить основной или какой-либо конкретный механизм ингибирующего действия ТДГ и смеси ПГИ на рост мицелиальных грибов не представляется возможным в связи с недостаточной изученностью этого вопроса. Однако не исключено, что оно является итогом всех вышеуказанных воздействий

Учитывая, что наибольшую устойчивость к ТДГ и смеси продуктов гидролиза иприта, а также способность к их деструкции проявляют бактерии,

нами проведена работа по поиску и выделению из почв высокоактивного деструктора этих загрязнителей именно из этой группы микроорганизмов

2. Выделение и отбор бактериальных культур-деструкторов продуктов

гидролиза иприта Бактерии, способные использовать ПГИ в качестве единственного источника углерода и энергии, выделяли из почв различных регионов России - Ленинградской, Московской, Самарской областей, в Сибири и Якутии

Из приготовленных почвенных компостов высевом на среду № 1а с добавлением глюкозы и дрожжевого экстракта было выделено 210 бактериальных культур, способных к росту в присутствии ПГИ Из их числа провели отбор кулыур-деструкторов ПГИ путем посева изолированных бактерий на агаризованную среду № 1а, содержащую в качестве единственного источника углерода смесь ПГИ в концентрации 0,08±0,006 г/л ХОС и 0,72 ± 0,04 г/л ТДГ Как показали результаты, только 89 культур проявили способность к росту на этом субстрате

На следующем этапе отбора, в условиях поверхностного роста на агаризованной среде, содержащей 2,0 г/л ТДГ, эти культуры были проверены на способность окислять ТДГ Определение проводили визуально по просветлению среды в результате растворения карбоната кальция в зоне роста колоний за счет кислот, образующихся при окислении ТДГ По этому критерию были отобраны 27 бактериальных культур, которые подвергли сравнительной оценке по активности и степени потребления ТДГ при глубинном культивировании в среде, содержащей 0,78±0,04 г/л ХОС и 7,0±0,2 г /л ТДГ

Для последующих исследований выбрана культура Bactenum sp Y-13-1, полностью (100%) потребляющая ТДГ из питательной среды

По совокупности морфолого-кулыуральных и физиолого-биохимических признаков культура, согласно определителю Берги (Holt et al, 1994), была отнесена к роду Pseudomonas и обозначена как Pseudomonas sp Y-13

Определение патогенности культуры Pseudomonas sp. Y-13 В

результате проведенных токсикологических исследований на теплокровных животных установлено отсутствие патогенных свойств у культуры Pseudomonas sp. Y-13 по таким показателям как вирулентность, токсичность, токсигенность, диссеминация во внутренних органах

Оценку фитотоксичности Pseudomonas sp Y-13 осуществляли по методу Берестецкого [Берестецкий, 1971] В качестве тест-культуры использовали семена редиса Показано, что микроорганизмы не оказывали отрицательного действия на проростки редиса

Эти свойства культуры свидетельствуют о перспективности и целесообразности изучения ее как возможного средства биологической детоксикации ПГИ в природных экосистемах

3. Изучение процесса деструкции и потребления продуктов

гидролиза иприта культурой Pseudomonas sp. Y-13 Влияние условий культивирования на деструкцию и потребление продуктов гидролиза иприта культурой Pseudomonas sp. Y-13. С целью повышения эффективности деструкции ПГИ отобранной культурой проведены исследования по влиянию на этот процесс некоторых из основных факторов среды культивирования - температуры, pH, аэрации Результаты показали, что наиболее благоприятными для роста и потребления субстрата на среде №1, содержащей смесь ПГИ в концентрации 0,78±0,04 г/л ХОС и 7,0 ± 0,2 г/л ТДГ, в качестве единственного источника углерода, являются температура в интервале от +24°С до + 32°С, уровень аэрации 0,71 Ю2/л ч, pH среды в интервале 7,0 - 9,0 При этих условиях наблюдается наибольший прирост биомассы и максимальное потребление ТДГ (на 99,9% от исходного).

Исходя из полученных данных, все последующие исследования были проведены в условиях глубинного культивирования, на роторной качалке (п=230об/мин), при температуре 28±1°С в колбах емкостью 250 мл, в жидкой питательной среде № 1 объемом 50 мл (pH среды 7,0±,02), содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии смесь ПГИ Концентрацию смеси ПГИ подбирали в зависимость от цели эксперимента

Рост и деструктивная активность Pseudomonas sp. Y-13 на среде в зависимости от концентрации продуктов гидролиза иприта. Скорость микробиологических процессов в значительной степени определяется усвояемостью и концентрацией питательного субстрата Эта зависимость в наибольшей степени проявляется на труднодоступных и, тем более, на токсичных субстратах, какими являются продукты гидролиза иприта

Результаты, полученные при культивировании Pseudomonas sp Y-13 на среде со смесью ПГИ, показали, что с увеличением концентрации этого субстрата продолжительность процесса, в котором ТДГ, входящий в состав смеси, подвергается полной деструкции, возрастает с 3-х до 22 суток (табл 1)

Динамики процессов роста бактерий, потребления ТДГ, а также процесса дехлорирования ПГИ в среде культивирования изучали с использованием среды, содержащей те максимальные количества этих субстратов, при которых происходит полное потребление ТДГ, а именно-2,3 г/л ХОС, 20 г/л ТДГ В этих условиях рост культуры завершается через 13-14 суток, а полное исчезновение из среды ХОС и ТДГ наблюдается через 22 дня от начала культивирования (рис 3)

Некоторое увеличение количества ТДГ, наблюдаемое в контрольном варианте происходит, по-видимому, за счет химического гидролиза ХОС,

Таблица 1

Влияние концентрации ПГИ на степень потребления ТДГ культурой Pseudomonas sp Y-13

Содержание Продолжительность Степень

компонентов ПГИ культивирования, сутки потребления ТДГ,

в питательной % к исходному

среде, г/л

ХОС-0,15 2 82

ТДГ -1,2 3 100

ХОС - 0,38 2 27

ТДГ - 3,7 4 79

6 100

3 44

ХОС - 0,75 6 89

ТДГ - 6,9 7 90

9 100

4 40

ХОС -1,50 7 70

ТДГ - 13,4 11 91

14 100

7 30

ХОС - 2,30 11 64

ТДГ - 20,0 17 68

22 100

ХОС - 2,70 14 7

ТДГ - 24,4

тогда как в опытном варианте, в присутствии микроорганизмов, количество ТДГ уменьшается и на 22 сутки культивирования ТДГ полностью потребляется Рост бактерий коррелирует с убылью ТДГ Максимальное потребление ТДГ (75% от исходного количества) происходит в период активного роста Pseudomonas sp Y-13 (в экспоненциальной фазе)

Длительность лаг-фазы - 4 суток, очевидно, вызвана неблагоприятным воздействием на культуру ПГИ и, прежде всего, ХОС Это предположение подтверждается тем, что переход культуры в экспоненциальную фазу начинается только после того, как количество ХОС снижается в среднем на 40% (рис 3)

Анализ динамики дехлорирования ХОС показал, что этот процесс сопровождается выделением стехиометрического количества хлора в среду

Длительность культивирования, сут

Рис 3 Динамики роста и деструкции ТДГ культурой Pseudomonas sp Y-13, процесса дехлорирования ХОС в среде, содержащей 111И (2,3 г ХОС/л, 20,0 г ТДГ/л) 1 - рост культуры, 2 - потребление ТДГ в опытном варианте (с культурой), 3 - содержание ТДГ в контроле, 4 - дехлорирование ХОС в опыте, 5 - дехлорирование ХОС в контроле Контроль - среда без бактерий.

В контрольном варианте динамика химического гидролиза практически полностью совпадает с динамикой убыли ХОС в опытном варианте, что позволяет сделать вывод о неферментативной, небиологической природе дехлорирования ХОС

Образование и потребление промежуточных продуктов деструкции тиодигликоля культурой Pseudomonas sp. Y-13. Изучение путей окисления основного продукта гидролиза иприта - ТДГ выделенной культурой проводили посредством анализа промежуточных продуктов, образующихся в процессе ее роста на жидких средах, содержащих в качестве единственного источника углерода ТДГ

Анализ культуральной жидкости проводили с помощью метода ВЭЖХ В течение всего периода культивирования (за исключением первых суток) в качестве промежуточного продукта деградации ТДГ была идентифицирована тиодигликолевая кислота (ТДГК) Максимальное количество ТДГК в культуральной жидкости коррелирует с полным потреблением ТДГ

Одновременно с образованием ТДГК в культуральной жидкости впервые обнаружено невысокое, но возрастающее в течение экспоненциальной фазы роста, количество ß-меркаптоэтанола (МЭ) (10~5-10"*% масс)

Выделенная культура бактерий использует ТДГК в качестве источника углерода, при этом прирост биомассы тем больше, чем выше концентрация кислоты При исследовании продуктов, образующихся при росте бактерий на среде с ТДГК, в культуральной жидкости обнаружены тиогликолевая кислота (ТГК) и ацетат, что свидетельствует о разрыве достаточно прочной (энергия связи 64 ккал/моль) C-S связи в ТДГК, что и приводит к образованию этих продуктов Обнаруженная в качестве продукта деградации ТГК, также используется Pseudomonas sp Y-13 в качестве источника углерода При этом, в качестве промежуточного продукта ее деградации в культуральной жидкости определена уксусная кислота Меркаптоэтанол (МЭ) в концентрации 1x10-2 % не используется бактериями для роста, но через 7 суток полностью трансформируется до ТГК.

На основании полученных результатов, схема метаболизма основного продукта гидролиза иприта - ТДГ культурой Pseudomonas sp Y-13 может быть представлена следующим образом

СН2-СН2ОН СНгСООН

s< -► s< -►

сн2-сн2он сн2-соон

Тиодигликоль (ТДГ) Тнодигликолевая

I кислота (ТДГК)

HS-CHz- СН2ОН + СНзСН2ОН * ß-меркаптоэтанол этанол

(МЭ) |

HS-CH2COOH СНзСООН + so4

Тиогликолевая _^ Уксусная

кислота (ТГК) кислота

* - не определяли

4. Деструкция смеси продуктов гидролиза иприта культурой Pseudomonas sp. Y-13 в почвенных образцах

Поскольку поиск и выделение культуры-деструктора проводили с целью ее возможного использования для очистки почв от 111 И, особый интерес представлял вопрос о характере и активности воздействия Pseudomonas sg Y-13 на эти загрязнители в условиях почвы

Эксперименты проводили с использованием образцов верхних горизонтов серой лесной почвы (Московская обл, г Серпухов) В образцы

СНзСООН + HS-CH2COOH Уксусная Тиогликолевая

кислота кислота (ТГК)

'Л ^

т

СНзСООН + SO42'

Уксусная

кислота

почв вносили смесь 111И в концентрации 1,0 г ХОС/ кг а с почвы, 7,7 г ТДГ/кг а с почвы В опытные образцы, кроме смеси 111 И, вносили клеточную суспензию с таким расчетом, чтобы исходный титр клеток был 108 - 109 клеток/г почвы Почвенные образцы инкубировали при температуре 21±1°С и влажности 50-60% от полной влагоемкости в течение 30 недель

Результаты наблюдений за динамикой процесса дехлорирования в почвенных образцах показали, что скорость и степень дехлорирования ХОС в опытных и контрольных вариантах полностью совпадают Эти результаты подтверждают наши данные о химической природе процесса дехлорирования, протекающего без участия бактерии-деструктора Pseudomonas sp Y-13

Деструкция ТДГ происходит медленнее Так, через 10 недель инкубирования, в опытном варианте ТДГ обнаруживается в концентрации 1,7 г/кг а с почвы, что составляет 22 % от исходного количества В контроле за этот период времени деструкция ТДГ прошла только на 41% Период 50%-й убыли ТДГ (Т50) в опытном варианте составлял 4 недели, а в контрольном 6 недель

После 14 недель инкубирования в опытном образце почвы оставалось 0,34 г ТДГ/кг а с почвы, что составляет 4,4% от исходного количества В варианте почвы без культуры обнаружено - 0,49 г ТДГ/кг а с почвы, что составляет 6,3% от исходного

Через 30 недель инкубирования ТДГ не обнаруживается как в опытных, так и в контрольных пробах

Параллельно с изучением динамики деструкции ТДГ исследовали фитотоксичность почвы В качестве тест-культуры использовали семена овса ярового (Hordeum vulgare L) Наличие или отсутствие фитотоксичности оценивали по таким показателям, как всхожесть семян, длина колеоптиля и корня

Показано, что в контрольном образце проявляется большая фитотоксичность, чем в опытном (рис 4) Так, через 10 недель инкубирования в опытном образце при концентрации ТДГ - 1,7 г/кг почвы, всхожесть овса увеличивалась на 58%, длина колеоптиля и длина корня также превышали контрольные показатели в 2 и 1,7 раза соответственно При дальнейшем инкубировании (14, 30 недель) аналогичная тенденция сохраняется

Однако, изучаемые показатели фитотоксичности образцов почвы с ПГИ, как иноку лиро ванных бактериальными клетками, так и неинокулированных, значительно ниже, чем в чистой почве (не загрязненной ПГИ)

о 10 недель а 14 недель н 30 недель

Рис 4 Динамика изменения фитотоксичности серой лесной почвы, загрязненной смесью ПГИ (1,0 г ХОС/кг почвы, 7,7 г ТДГ/кг почвы) и инокулированной клетками Pseudomonas sp Y-13, относительно контроля -загрязненной почвы без кулыуры-деструктора Контроль-100%

Так, через 30 недель инкубирования почвы, загрязненной смесью ПГИ, всхожесть на ней семян овса составляет 80%, длина колеоптиля 15%, корней 18% от соответствующих показателей, получаемых на чистой почве (не загрязненной ПГИ)

В почве, содержащей ПГИ и инокулированной бактериальными клетками, эти показатели значительно улучшились - всхожесть семян такая же, как на чистой почве, однако длина колеоптиля и корня не превышает 55 и 40% соответственно от контрольных значений, полученных на чистой почве

Таким образом, под действием выделенной культуры бактерий Pseudomonas sp Y-13 в почве происходит полная деструкция основного продукта гидролиза иприта - ТДГ, что ускоряет снижение ее фитотоксичности

По совокупности вышеизложенных результатов можно заключить, что наибольшей толерантностью к смеси ПГИ и ТДГ обладают культуры бактерий, как музейные, так и выделенные из почв

Выделенный из почвы штамм Pseudomonas spY-13 трансформирует исследуемые токсиканты в сравнительно высоких концентрациях до продуктов, которые затем полностью потребляет

Эти результаты свидетельствуют о целесообразности для полной и ускоренной очистки почв от смеси ПГИ и ТДГ отбирать и использовать высокоактивные деструкторы из числа бактериальных культур, в том числе и Pseudomonas sp Y-13

Исследования по биоочистке почв от ПГИ только начаты,

полученные результаты свидетельствуют о возможности и

перспективности микробиологического способа их детоксикации

ВЫВОДЫ

1 Изучено влияние смеси ПГИ и основного ее компонента - ТДГ на микроорганизмы различных таксономических групп Показано, что наиболее чувствительны к этим продуктам микромицеты и актиномицеты, а наиболее устойчивы бактерии

2 Показано, что наиболее значительным ингибиторным действием на изученные микроорганизмы обладает смесь ПГИ (по сравнению с ТДГ), что, по-видимому, связано с содержанием в ее составе хлорорганических веществ

3 С использованием микромицетов, как наиболее чувствительных к ТДГ и смеси ПГИ микроорганизмов, показано, что эти продукты оказывают значительное влияние на морфологические и физиолого-биохимические признаки разных микромицетов, увеличивают проницаемость клеточных мембран, изменяют жирнокислотный состав липидов, активизируют дегидрогеназы и подавляют активность гидролитических ферментов, стимулируют образование пигментов и экзополисахаридов

4 Проведен скрининг наиболее устойчивых к смеси ПГИ штаммов бактерий, выделенных из почвенных образцов Среди изученных микроорганизмов выбран штамм Pseudomonas sp Y-13 как высокоактивный деструктор ПГИ Концентрация смеси ПГИ в среде, при которой культура растет и полностью их потребляет, составляет 2,3 г/л ХОС и 20 г/л ТДГ

5 По результатам изучения морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков выделенная культура отнесена к роду Pseudomonas

6 Впервые в продуктах трансформации ТДГ выделенной культурой обнаружен jö-меркаптоэтанол, что позволяет определить два пути, по которым может происходить деструкция основного продукта смеси ПГИ с образованием тиодигликолевой (ТДГК) и тиогликолевой (ТГК) кислот и с образованием Дмеркаптоэтанола с последующей его трансформацией также в ТГК

7 Показано, что продукты, образующиеся в процессе биодеструкции ТДГ - ТГК, ТДГК, уксусная кислота, а также yS-меркаптоэтанол (после трансформации его в ТГК), используются культурой в качестве источника углерода

8 На модельных опытах показано, что внесение клеток бактерий Pseudomonas sp Y-13 в почвы, загрязненные смесью ПГИ, приводит к ускорению процесса очистки от этих загрязнителей и снижению фитотоксичности почв

Список опубликованных работ

1 Медведева Н Г, Зайцева Т Б , Зиновьева С В , Орлова О Г Деструкция продуктов гидролиза иприта культурой Pseudomonas sp Y - 13 // Тезисы докладов Международной конференции "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды", Саратов, 14 - 16 сентября 2005 г. - С 36-37

2 Медведева Н.Г , Кузикова И JI, Рыбальченко О В , Орлова О.Г , Жариков ГА The influence of mustard gas hydrolysis products on soil micromycetes // ConSoil 2005, Франция, Бордо, 3-7 октября 2005 г. - С 95 -100

3 Медведева Н Г, Зайцева Т Б , Зиновьева С В , Орлова О Г, Жариков Г А Microbiological destruction of ypente m soil // 13 th International Biodetenonation and Biodegradation Symposium, Испания, Мадрид, 4-9 сентября 2005 г - С. 282

4 Медведева Н Г , Орлова О Г , Жариков Г A The influence of mustard gas hydrolysis products on soil microbiota - 10th International Symposium on the Genetics of industrial microorganisms, Praque, June 24-28,2006 — P 133

5 Медведева H Г., Поляк Ю M., Орлова О Г, Пастухов А, Жариков Г A The effect of mustard gas on the biological activity of soil - International Conference Protection and restorations of environment VIII, Chania, Greece, July 3-7, 2006 -P. 117

6 Медведева H Г, Зайцева T Б , Зиновьева С В , Сухаревич В И, Орлова О Г Деструкция продуктов гидролиза иприта культурой Pseudomonas sp Y-13 //Биотехнология -2006 - № 2 - С 50-56

7 Кузикова И JI, Медведева Н Г , Сухаревич В И , Орлова О Г, Рыбальченко О В Влияние продуктов гидролиза иприта на микромицеты // Микология и фитопатология -2007 -№3 - С 252-260

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орлова, Ольга Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Физико-химические и биологические свойства иприта и продуктов его гидролиза.

1.2.Влияние иприта и продуктов его гидролиза на живые организмы.

1.2.1 .Влияние иприта и продуктов его гидролиза на макроорганизмы. 15 1.2.2.Влияние иприта и продуктов его гидролиза на микроорганизмы.

1.3. Способы уничтожения иприта и продуктов его гидролиза.

1.3.1.Физико-химические способы уничтожения иприта и продуктов его гидролиза.

1.3.2.Биологическая деструкция иприта и продуктов его гидролиза.

1.4. Влияние продуктов гидролиза иприта на биологическую активность почв.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования морфологических и физиолого-биохимических признаков микроорганизмов.

2.2.1. Определение морфологических признаков.

2.2.2. Определение физиолого-биохимических признаков.

2.3. Выделение микроорганизмов-деструкторов продуктов гидролиза иприта из почвенных образцов.

2.4. Изучение морфолого-культуральных и физиологобиохимических признаков выделенной культуры-деструктора.

2.5. Токсикологическая оценка выделенной культуры-деструктора.

2.6. Хранение и культивирование бактерий, методы контроля за процессом культивирования.

2.7. Определение тиодигликоля, хлорорганических соединений, продуктов

Ш трансформации продуктов гидролиза иприта бактериями.

2.8. Исследование почвенных образцов.

2.9. Математическая обработка результатов.

Глава 3. Влияние продуктов гидролиза иприта на рост и физиолого-биохимические признаки микроорганизмов.

3.1. Рост актиномицетов, бактерий, микромицетов и дрожжей на средах, содержащих продукты гидролиза иприта. 3.2. Действие продуктов гидролиза иприта на некоторые морфологические и физиолого-биохимические свойства микроорганизмов.

3.2.1. Влияние продуктов гидролиза иприта на морфологические признаки микромицетов.

3.2.2. Изменение клеточной проницаемости и жирнокислотного состава липидов микромицетов под действием продуктов гидролиза иприта. ф 3.2.3. Влияние продуктов гидролиза иприта на физиологобиохимические признаки микромицетов.

3.2.3.1 .Влияние продуктов гидролиза иприта на активность ферментов.

3.2.3.2.Влияние продуктов гидролиза иприта на образование пигментов и полисахаридов.

Глава 4. Выделение и отбор бактериальных культур-деструкторов продуктов гидролиза иприта.

4.1. Выделение и отбор высокоактивных деструкторов продуктов гидролиза иприта.

4.2.Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические признаки выделенной культуры.

4.3. Определение патогенности культуры Pseudomonas sp. Y-13.

Глава 5. Изучение процесса деструкции и потребления продуктов гидролиза иприта культурой Pseudomonas sp. Y-13.

5.1. Влияние условий культивирования на деструкцию и потребление продуктов гидролиза иприта культурой Pseudomonas sp. Y-13.

5.2. Образование и потребление промежуточных продуктов деструкции тиодигликоля культурой Pseudomonas sp. Y-13.

Глава 6. Деструкция смеси продуктов гидролиза иприта культурой Pseudomonas sp. Y-13 в почвенных образцах.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие микроорганизмов с продуктами гидролиза иприта"

Актуальность темы

К числу хлорорганических соединений, представляющих собой устойчивые поллютанты, относится иприт и продукты его гидролиза.

В силу повышенной токсичности иприта и продуктов его гидролиза они длительное время сохраняются в экосистемах без снижения ингибиторного действия на живые организмы. В природную среду они попадают в результате несовершенных способов хранения, при транспортировке, авариях и других ситуациях. И если проблема уничтожения запасов иприта в значительной степени решена, способы очистки природных экосистем - почв и водоемов от иприта и продуктов его гидролиза находятся только на стадии разработки.

Одним из современных методов, используемых при разработке экологически чистых технологий защиты природной среды, является биоремедиация, как наиболее щадящий метод сохранения биоразнообразия и обеспечения устойчивости очищенных биоценозов.

По мнению большинства исследователей этой проблемы, использование для этой цели активных штаммов микроорганизмов-деструкторов, устойчивых к загрязнителям, является наиболее перспективным способом биоремедиации почв и водоемов.

Сообщения в доступной литературе о характере действия иприта и продуктов его гидролиза на морфологические и физиологические свойства различных микроорганизмов, равно как о механизмах деструкции этих загрязнителей весьма ограничены и представляют собой единичные и разрозненные сообщения.

Цель исследований - провести сравнительное изучение чувствительности микроорганизмов различных таксономических групп к продуктам гидролиза иприта; из числа наиболее устойчивых выделить культуру высокоактивного деструктора этих продуктов; определить возможный механизм их биодеструкции.

В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие задачи:

• Определить уровень биоцидного действия смеси продуктов гидролиза иприта (ПГИ) и основного из них - тиодигликоля (ТДГ) на микроорганизмы различных таксономических групп.

• Изучить характер действия ПГИ на м орфолого-кул ьтурал ьны е и физиолого-биохимические свойства микроорганизмов, наиболее чувствительных к этим продуктам.

• Выделить культуры-деструкторы ПГИ, определить наиболее активную культуру по способности потреблять ТДГ из смеси ПГИ и изучить ее основные морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства.

• Идентифицировать промежуточные и конечные продукты деструкции ПГИ выделенной культурой и определить возможный механизм деструкции.

• Провести модельные испытания выделенной культуры как деструктора ПГИ в условиях почвы.

Научная новизна полученных результатов

Впервые изучен характер и степень воздействия смеси продуктов гидролиза иприта на рост микроорганизмов различных таксономических групп. Показано, что повышенная чувствительность к этому загрязнителю характерна для микромицетов и актиномицетов и в меньшей степени для дрожжей. Наиболее устойчивыми являются бактерии.

С использованием микромицетов показано, что действие на них смеси ПГИ весьма многообразно и касается как морфолого-культуральных, так и многих физиолого-биохимических свойств, что в конечном итоге может являться причиной фунгицидного эффекта.

В результате скрининга толерантных к смеси ПГИ бактерий выделена культура, отличающаяся способностью к полному их потреблению при достаточно высоких концентрациях в среде 2,3 г/л ХОС и 20 г/л ТДГ и идентифицирована как Pseudomonas sp. Y-13. Установлено, что выделенная культура отличается отсутствием патогенных свойств по отношению к теплокровным животным. tm

Показано, что основным путем деструкции ТДГ культурой Pseudomonas sp. Y-13 является окисление его первичных спиртовых групп с образованием тиодигликолевой кислоты (ТДГК) и тиогликолевой кислоты (ТГК), последующая трансформация которых сопровождается образованием ацетата. В продуктах трансформации ТДГ культурой Pseudomonas sp. Y-13 впервые обнаружен Р-меркаптоэтанол, который в дальнейшем также трансформируется в ТГК. Все образующиеся продукты деструкции используются выделенной культурой в качестве единственных источников углерода.

Щ Практическая значимость полученных результатов

Показано, что поиск и выделение деструкторов ПГИ целесообразно проводить среди бактерий, отличающихся от микроорганизмов других таксономических групп повышенной толерантностью к этим продуктам и способностью использовать их в качестве источника углерода.

На модельных испытаниях показано, что внесение в почву, загрязненную смесью ПГИ, клеток культуры Pseudomonas sp. Y-13 в значительной степени ускоряет очистку почв и способствует снижению их фитотоксичности.

Такие критерии оценки выделенной культуры как деструктивная активность, толерантность к такому типу загрязнителей, как продукты гидролиза иприта, безопасность для теплокровных животных и растений свидетельствуют о целесообразности использования Pseudomonas sp. Y-13 для разработки биопрепаратов с целью детоксикации ПГИ в природных экосистемах - почвах и водоемах.

Апообаиия работы

Результаты работы доложены: на 13-м международном симпозиуме по биоповреждениям и биодеградации (Испания, Мадрид, 4-9 сентября 2005г.); на международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 14-16сентября 2005г.); на международной конференции ConSoil 2005 (Франция, Бордо, 3-7 октября 2005г.); на 10-м международном симпозиуме «Генетика промышленных микроорганизмов» (Прага, 24-28 июня 2006г.); на VIIJ международной конференции «Зашита и восстановление окружающей среды» (Греция, 3-7 июля 2006г.); обсуждены на заседании лаборатории микологии и микробиологии НИЦЭБ РАН.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 2 статьи и 5 тезисов. Объем и структура диссертант

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и списка литературы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Орлова, Ольга Геннадьевна

ВЫВОДЫ

Изучено влияние смеси ПГИ и основного ее компонента - ТДГ на микроорганизмы различных таксономических групп. Показано, что наиболее чувствительны к этим продуктам микромицеты и актиномицеты, а наиболее устойчивы бактерии.

Показано, что наиболее значительным ингибиторным действием на изученные микроорганизмы обладает смесь ПГИ (по сравнению с ТДГ), что, по-видимому, связано с содержанием в ее составе хлорорганических веществ.

С использованием микромицетов, как наиболее чувствительных к ТДГ и смеси ПГИ микроорганизмов, показано, что эти продукты оказывают значительное влияние на морфологические и физиолого-биохимические признаки разных микромицетов; увеличивают проницаемость клеточных мембран, изменяют жирнокислотный состав липидов, активизируют дегидрогеназы и подавляют активность гидролитических ферментов, стимулируют образование пигментов и экзополисахаридов. Проведен скрининг наиболее устойчивых к смеси ПГИ штаммов бактерий, выделенных из почвенных образцов. Среди изученных микроорганизмов выбран штамм Pseudomonas sp. Y-13 как высокоактивный деструктор ПГИ. Концентрация смеси ПГИ в среде, при которой культура растет и полностью их потребляет, составляет 2,3 г/л ХОС и 20 г/л ТДГ.

По результатам изучения морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков выделенная культура отнесена к роду Pseudomonas.

Впервые в продуктах трансформации ТДГ выделенной культурой обнаружен /?-меркаптоэтанол, что позволяет определить два пути, по которым может происходить деструкция основного продукта смеси ПГИ: с образованием тиодигликолевой (ТДГК) и тиогликолевой (ТГК) кислот и с образованием /?-меркаптоэтанола с последующей его трансформацией также в ТГК.

Показано, что продукты, образующиеся в процессе биодеструкции ТДГ -ТГК, ТДГК, уксусная кислота, а также /?-меркаптоэтанол (после трансформации его в ТГК), используются культурой в качестве источника углерода.

На модельных опытах показано, что внесение клеток бактерий Pseudomonas sp. Y-13 в почвы, загрязненные смесью ПГИ, приводит к ускорению процесса очистки от этих загрязнителей и снижению фитотоксичности почв.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлова, Ольга Геннадьевна, Санкт-Петербург

1. Авцин А.П., Шахламов В.А. Ультраструктурные основы патологии клеток.-М.: Медицина, 1979. 316 с.

2. Александров В.Н., Емельянов В.И. Отравляющие вещества.- М.: Военное изд., 1990. 271 с.

3. Александров В.Н., Жаворонков Г.Н., Боровский Ю.В., Титов В.А. Химическое оружие иностранных армий. Уч. пособие. М., 1989. -156 с.

4. Александров М.С., Иванов B.C., Совков В.Б. Метод спектральных моментов. Аппроксимация бесструктурных полос фотопоглащения // Оптика и спектроскопия. 1993. - Т. 74, № 1. - С. 69-84.

5. Андреюк Е.Й. Методологические аспекты изучения микробных сообществ почвы. Микробные сообщества и их функционирование в почве. Киев.: Наукова думка, 1981. - С. 1-23.

6. Аринуппсина Е.В. Руководство по химическому анализу почв. М.: МГУ, 1970.-487 с.

7. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Абросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов. Л.: Изд-во ЛГУ, 1974.-76 с.

8. Бекер С., Дерре Р., Штельт Е. Безопасное уничтожение высокотоксичных веществ // Российский хим. журнал. -1993. Т. 37, № 3. - С. 29-33.

9. Берестецкий О.А. Методы определения токсичности почвы. Киев: Урожай, 1971-С. 28-31.

10. Богач П.Г., Курский МД., Кучеренко Н.Е., Рыбальченко В.К. Структура и функция биологических мембран. Вища шк., Киев, 1981. 336 с.

11. Билай В.И. Методы экспериментальной микологии. Киев: Наукова думка, 1973 - 145 с.

12. Болдырев А. А. Матриксная функция биологических мембран // Соросовский образовательный журнал. 2001. - №7. - С. 2-8.

13. Борисова В.Н. Ферменты активаторы кислорода (терминальные оксидазы) // Методы экспериментальной микологии / Под общей редакцией Билай В.И. Киев: Наукова думка, 1973 - С. 95-102

14. Воронин А.М., Сахаровский В.Г., Ермакова И.Т., Гречкина Г.М., Старовойтов И.И. Утилизация продуктов детоксикации ипритно-люизитной смеси // Прикладная биохимия и микробиология 1999. - Т.35, № 6.-С. 671-678.

15. Воронин А.М., Сахаровский В.Г., Ермакова И.Т., Гречкина Г.М., Старовойтов И.И. Утилизация продуктов детоксикации ипритно17