Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОЧИСТКЕ ПОЧВ И ВОДОЕМОВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПРОДУКТАМИ ДЕСТРУКЦИИ ИПРИТА И ЛЮИЗИТА

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОЧИСТКЕ ПОЧВ И ВОДОЕМОВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПРОДУКТАМИ ДЕСТРУКЦИИ ИПРИТА И ЛЮИЗИТА"



На ттр&мх рукописи

Любунь Елена Валентиновна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОЧИСТКЕ ПОЧВ И ВОДОЕМОВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПРОДУКТАМИ ДЕСТРУКЦИИ ИПРИТА И ЛЮИЗИТА

03.00.07 ~ микробиология 03.00.16 - экология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2004

Работа выполнена & Институте биохимии н физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (г.Саратов)

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Л.Л. Щербаков кандидат биологически* наук, с,и.с. И.Т. Ермакова Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

с.н.с. О.В. Игнатов доктор химических наук, профессор Т.Н. Губит

Ведущая организация: Институт фундаменталькых проблем биологии РАН (Пущипо).-

Зашита состоится декабря 2004 г. ъ^З чЛ£йнн на заседании диссертационного совета Д 002,146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН по адресу: 410049. г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13. Тел./факс (8452)97 03 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН,

Автореферат разослан "

5ря 2004 г.

\ * ' г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук ' ~ В. Е. Никитина

• \

Актуальность проблемы. В настоя шее время в связи с катастрофическими масштабами антропогенного загрязнения окружающей среды чрезвычайно большое значение для прогнозирования развития возможных опасных экологических ситуаций приобретает информация о воздействии зкотоксикантов и продуктов их трансформаиии на различные природные объекты - почву, водоемы и т.д.

В соответствии с Конвенцией'«О запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и его уничтожении» к Федеральной целевой программой «Уничтожение запасов химического оружия в РФ» в России проводится переработка отрав-ляеоших вешеств кожно-нарывного действия - иприта, лкиамта и мпрнто-лютнпгых смесей, на первом этапе которой осуществляется их химическая детоксикация, на втором -уничтожение полученных в ходе этого процесса реакционных масс(РМ).

Одной из важнейших экологических проблем является очистка и восстановление территорий, которые могут быть загрязнены отравляющими веществами или продуктами и* дстоксикации в местах хранения, транспортировки и уничтожения в результате возможных утечек, аварийных выбросов » т.д. Экотокси канты могут вступать во взаимодействие с природными веществами, образуя новые соединения, аккумулироваться и метабол из ироваться живычи организмами. 8 настоящее время наряду с физическими и физико-химическнми способами детоксикации отходов разрабатываются подходы для их биоутилизаиин с использованием микроорганизмов и растительно-ми пробных ассоциаций.

Токсическое действие различных соединений может не только подавлять жизнеспособность микроорганизмов, но и вызывать их метаболическую адаптацию к новым условиям существования. Концентрация продуктов деструкции отравляющих веществ может оказать решающее значение на их трансформацию той или иной ферментной системой клетки ибио-аккумуляцию. Такие сведения в научной литературе весьма ограничены. Известно, что многие соединения, образующиеся при гидролизе и окислении иприта (2,2'-зихлорднэтилсульфкла) токсичны, а некоторые сульфониевые производные по токсичности превосходят исходное (Александров, 1990; Федоров, 1907).

Влияние токсических концентраций продуктов деструкции иприта и люизита на почвенные микроорганизмы, растения и растительно-микробные ассоциации практически не исследовано, несмотря на то, что такие данные необходимы для разработки критериев опенки их вредного воздействия и создания новых экологически чистых методов очистки окружающей среды.

ЦНБ МСХА

ратуры

Цель и задачи нсслеоолянив Целью работы являлось исследование почвенные микроорганизмов и растений при воздействии просуктов деструкции иприта и люизита и разработка методических подходов для биоремедиацин загрязненных почв и водоемов.

В рамках поставленной ue.ni были определены следующие задач»: К Исследовать диапазон токсичности мышьяк- и серусоаержашнх продуктов трансформации иприта и люизита для некоторых ризосферных микроорганизмов и растений,

2. Онеккть влияние м ы ш ьяксодержа щ их соединений на триптофанзавнсимый синтез ИУК штаммом Аю^ргпПит brasileti.se 5р245,

3. Изучить возможности биолсструкщш продуктов первой стадии нейтрализации иприта.

-I Подобрать условия для бноремедиации почв, загрязненных продуктами трансформации иприта и люизита, в лабораторных н никрололевые экспериментах. Научна« новизна. Впервые показана возможность ре.чеднацни почв, загрязненных продуктами деструкции - иприта и люизита, с гючошыо специально подобранных микроорганизмов и растений. Установлены диапазоны токсичности мышьякорганических продуктов нейтрализации люизита и РМ иприта для некоторых ризосферных микроорганизмов и растении. Обнаружена способность микроорганизмов рода РьеиЖмюп&ч подвергать биодеструк-Ш1и 1,4-пергидротназины. основные компонента реакционных масс иприта. Показано, что интродукция этих микроорганизмов в почву в значительной степени увеличивает эффективность биоремеднашш. Показана возможность и даны рекомендации по использованию штаммов Р. ачтко}ас)ет В51393 и А. Ьганкте 5р245 в процессах биоремедиацин почв, загрязненных продуктами трансформации люизита.

Прпктическая значимость, Использование подобранных видов растений с инокуляцией их селекционированными штаммами микроорганизмов является основой для разработки метола <?иоремеднации почв, загрязненных продуктами трансформации кожно-нарывных отравляющих вешеств - иприта и люизита.

Результаты проведенных исследований были использованы для разработки нового способ очистки почв, загрязненных продуктами природного и техногенного разложения кожно-нарывных отравляющих веществ - ф)ггоремед нации (патент РФ № 2)85901) Основные положении, выносимые на зашшу:

1, Растения подсолнечника (сорт Юбилейный 60) н сорго (сорт Волжский 4) устойчивы к высоким концентрациям лреешгга натрия (10 ПДК) и способны аккумулировать этот токсикант из загрязненной почвы. Степень извлечения мышьяка значительно возрастает при инокуляции их клетками бактериального ризосфсрного штамма Ржнс/отапач аигсо/аае/к ВБ1393,

2. Продукты гидролиза люилтга (2-хлореипиларспноксид и 2-хлорвинил арсоковая

кислота) ингнбнруют трнптофалзависнмып стггез ПУК штамма Azuspinthim brasikma Sp245: 2-хлорвнш1ларсинокС1!а на 80 % при концентрации 10"4 г/л, 2-хлорви 11 иларсо ноаая кислота - на 75 % при концентрация)! 10'д г/л .

3. Идентифицированные производные 1,4-перги дротиазина, являющиеся продуктами леток-сикаими иприта, подвергаются трансформации клетками селекционированного штамма бактерий PsettdomoncapMidtí IÜK1 при росте в срезе с реакционными массами иприта.,

4. Степень очистки почв от серусодержащих продуктов деструкции иприта растениями сорго (сорт Волжский 4) значительно увеличивается при инокуляции семян клетками штамма Pseudumoiias pulida ШК1,

5. Результаты экспериментов по извлечению продуктов деструкции люизита и иприта из загрязненных ими почв при совместном использовании растений и микроорганизмов могут быть использованы для разработки методов биоремеднации таких почв.

Работа выполнена в лаборатории структурных методов исследования Института биохимии м физиологии растений и микроорганизмов РАН (Саратов) в рамках научно-исследовательской работы «Изучение воздействия антропогенных загрязнителей на окружающую среду» (№ гос. регистрации 01200119220), на базе Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты, в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пушино) по проекту «Биотехнология зашиты окружающей среды от антропогенных загрязнений» Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития нзукн и техники гражданского назначения», в Институте общей экологии и защиты окружающей среды (Технический университет Дрездена, Германия),

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международном семин аре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2000» (Пущино, 2000), на 1-й Европейской конференции по биоремеднации (Ханья, Греция, 2001), на ISEB Мнтинге по фиторемедиацни (Лейпциг, Германия, 2001), на 12-м Международном симпозиуме по биодеградации и бноразрушению (Прага, Чехия, 2002). на Международном семинаре по химическому анализу и оценке риска загрязнений в осадках и донных отложениях (Барселона, Испания, 2002), на 1-й региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2002). на Семинаре-презеитацни инновационных научно-технических проектов "Биотехнология — 2003" (Пущино, 2003), на Международном симпозиуме «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (Саратов, 2003), на конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань. 2004).

Публика» и». По теме диссертации получек патент РФ, опубликовано 1Ü работ, иг »их 2 статьи в российских н 3 в м рубежных реферируемых научных журналах.

Структура днссертаиии. Работа состоит обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов собственных исследовании, и завершается заключением. выводами и библиографическим указателем, содержащим 176 литературных источников Обший объем днссертаиии составляет 123 страницы. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 2S рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Обьекты исследования. Объектом исследования служили штаммы, полученные из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАИ (Саратов) - AzospinUnm krasilепье Sp2^5 и ИБФМ 1'ЛН (Пушмно) - 14 штаммов, принадлежащих к трем видам Pievdomoimv. р, flnorescem (5), Р. atiiw/nciens (2), pttiäa (7); два штамма Atcaltgcms xyUHoyydims itihfx Jemtrificans и выделенный процессе выполнения настои цей работы штамм Л puttdj b ¡ovar А III К1,

В работе использовали растскш; мятую яровую пшеницу (ТгШснт aestmm L.) сорта «Саратовская 29». подсолнечник (IMiatithus L.) сорт «Юбилейный 60»>, суданскую траву (Sorghum svdmeme), сорго (Sorghum sacc(taratum) и ряску (Lemna gibha L.)

ку.и.тнвнронлиие микроорган himoв. Вырашивание микроорганизмов А, brasilemi-Sp24i осуществляли на твердой и о жидкой малагной питательной среде (Zakharova et al, 2000) в течение 18 ч. Культивирование проводили при встряхивании tta качалке с частотой вращения 100 oö/мин при температуре 30°С, В качестве минимальной срезы для Саперий l'.fhitjtescem 3Sa, Р. yuttJn 53а, /'. ann-v/acieiis BS1393 и их пла^м идо содержат их аналогов использовали синтетическую среду МО (Мордашова, 199S), В качестве источника углерода использовали глицерин 4 г/л. Изучение закономерностей роста и определение минимальной ннгиблрующей (МИК) и максимальной толерантной концентрации (МТК) проводили в жидкой среде выше> казаниого состава с добавлением соответствующих мышьяксоаержэших соединений, Культивирование бактерий проводили при 30*С на агзриаоваиной среде в чашках Петри или в жидкой среде на качалке (150 об/мнн) в колбах Эрленмейсра, содержащих 100 мл среды. Посевным материалом служила трехсуточная культура, которую выращивали на агаризоваиной среде того же состава

При работе с РМ иприта культи аиров л ние бактерий рода Р, puuäa, Р. ßiiftresceits и штаммов А. xykitonjtAifis — деструкторов тподигликоля проводили при 30'5С в колбах с жидкой минеральной средой MS (Ermakova et al, 2002) на качалке (220 об/мин). Интенсивность аэрации составляла 0,5 г О^/лУч, pH среды 7,5 - 8,0. В качестве источников углерода использовали реакционные мзссы (РМ) иприта, в состав которых входили продукты его дето кепка-

шш, а также остаточные количества компонентов дегазирутошей смеси - моиоэтаноламнна (МЭЛ) и этилен гликоля (ЭГ) (9:1) Рм вносили в минеральную среду в количестве I % (об/об) непосредственно перса началом культивирования. В качестве субстратов использовали: 1) смесь МЭЛ (0,25 %) и ЭГ (0,015 %). 2) каждый из этих компонентов в отдельности (0,25 %). 3) смесь 1,4-пергидротиазинов. полученную обработкой РМ иприта шелочью и отгонкой при S0-85 °С (фракция ]), 91-94 СС (фракция 2) и 105-130 °С {фракция 3), а также 4) глутамат натрия (1 %). Посевным материалом служили клетки, выр&шенные на агэригованной среде MS с 1 *Л (о&'об) РМ иприта Рост купьтуры Kotrrpoл провали по изменению оптической плотности на спектрофотометре Specol 221 (Carl Zeiss, Germany) при Xf*560 hm и числу колоннеобразующих единиц (КОЕ) путем высева из разведений на згариэованную среду.

Культивирование культуры Lemna gibba К Из 7-дневной предшествующей культуры отбирали 10 фрокяов и помешали в колбы Эрленмейсрз объемом 250 мл, содержащие 150 мл питательного раствора Хатнерэ, мг/л: CaCh х 2HiO- 12,2; КзНРСЦ -40,0; MgSO* х 7НгО - 50,0; NHíNOj - 20,0; HjBOj - 1,5; ZnSO, х 7Н:0 - 6,2; CuSO, х 5Н20 - 0,4; CoSCb х 7НгО -0,02; МпСЬ х 4HjO - 3,5; FeSO* х 7Н:0 - 2,5; NaiMoO* х 2Н;0 - 2,5; Naj EDTA x 2H30 -50,0;. pH — б,5±0,5. Культивирование проводили в фитокамере NEMA (Netzschkau, Germany) в течение 21 дня со следующим режимом: свет/темнота — 14/10 ч, интенсивность излучения -85-125 fiEnfV1; температура день/ночь - 24/16сС (i 2°С). Изменения в объеме из-за испарения компенсировал ись денонсирован ной водой.

Опенка ф »поток«! чностн соединений. Фитотоксичкость определяли на растениях ш класса двудольных; подсолнечник (Heltanthus L.) и однодольных; пшеница (Triticum acsttvum L.). суданская трава (Sorghum svdaneuse), сорго (Sorghum saccharawm), Семена подсолнечника и пшеницы замачивали в течение 1 ч в растворах 2-хлорви ииларсиноксида и воде (контроль), раскладывали в чашки Петри на увлажненную водой (контроль) или раствором 2-хлорвин и ларсиноксида фильтровальную бумагу и проращивали в течение трём суток в темном месте при температуре 26'С. Токсичность определяли подсчетом проросших семян, измерением длины колеоптиля и массы проростков.

Фитотоксичность арсенита натрия определяли на серых лесных почвах. При отборе образцов пользовались стандартной методикой (Радов и др.. 1985). В подготовленную почву вносили водный раствор арсенита натрия. Лабораторные эксперименты проводили в клима-термосветокамере (KTLK 1250, Germany) со следующим режимом: 16-часовоЙ световой период при 25е С и 8-часовой тем но вой период при 18СС в течение 30 дней.

Для определения параметров роста культуры /_ gibba и биоаккумуляиии мышьяка в питателкгый раствор вносили NallAsO« * 7Н20 или NaAsOj. Рост культуры отслеживали подсчетом фрондов, нлошадь определяли цифровым анализом компьютерной программой

Win Cam 2000a (Regent Instruments, USA) Скорость роста (p) определяли как р = (InNv lnNt,>y(Vt,>). где Nt.- количество фрондов (плошадь) в момент времени п. Nig - количество фроидоа (площадь) в начале эксперимета Степень аккумуляции мышьяка L gtbba (tp) определяли как ф — Su/gt, где gu — масса мышьяка в растениях, gi - сухая биомасса культуры. Модель образования ионов мышьяка и фосфора была рассчитана с использованием компьютерной программы PhreeqC (Version 2,5; U5GS, August 2001) с базой данных термодинамических характеристик (М Stand a wire, 2001) Процент угнетения скорости роста для каждой юн центра ци и мышьяка определяли как ir " 100 (rc-rt)/rc, где tr - угнетение средней скорости роста, %, гс- средняя скорость роста в контрольном образце, г1 - средняя скорость роста в исследуемых группах. Все расчеты проводили в соответствии с международными стандартами (ISO/CD 20079,2001; OECD, 2002)

Подготовка и проведение эксперименте» по биоремедняшш почв. Предпосевная -обработка семян проводилась раствором индол ид-3-уксусной кислоты в концентрации 10"! г/я в соответствии с методикой (Петрова, 1994) Для инокуляиии семян использовали культуры Р. ßuorescen.4 ЗКа, P. inireofaciens BS1393, Р. putidd 53а. P. Jliioit'iCem ЗКа pBS3031, 1'. aiireojackits BS1393 pBS3031, P. ¡nitida 53a pBS3031 (для почв, содержащих apcernrr натрия) и Р, pmida biovar А ШК1 (для почв, содержащих РМ иприта). Культуры бактерий выращивали в синтетической среде М9 и среде MS (для РМ ипрнта) в течение 12 и 18 ч, соот-вешвенно. Семена растений инокул провали суспензиями бактерий в течение 2 ч. проращивали в течение суток при температуре 24'С и сеяли в подготовленную почву, Использовали cepyto лесную почву. Фоновое содержание мышьяка составляло 2,5 мг/кг почвы, pH 5,5-6,0. В конце экспериментов была подсчитана степень извлечения загрязнителя как частное от начальной и конечной концентраций

Диализ состава органически* компонентов РМ иприта проводили хроматографиче-сними и хромато-масс-спектрометрическнми методами. Водные образцы культу рал ьной жидкости подвергали экстракции органическими растворителями, сушили в токе аргона н чроматографировали на газожидкосгноч хроматографе Биохром-I (Хроматограф, Россия) с плазм енно-нон изаиионн ым м икродетектором.

Идентификация индивидуальных вешесгв проводилась на жидкостном хроматографе HPLC HP 5890 (Hewlett Packard, USA) Полученные масс-спектры анализировались с помощью базовых данных программы Wiley 275L. Количественное определение проводили, используя в качестве стандарта раствор синтезированного 1,4-пергкдротиазина. Динамику изменения содержания органических соединений серы определяли методом газовой хроматографии с пламенно-фотометрическим детектором HP 5890 SERIES II (Hewleit Packard, USA), канал S, при ).=393 им.

D

Массовую концентрацию непредельных углеводородов измеряли в соответствии с аттестованной методикой измерений МВИ А» 2420/117-93 на газовом хроматографе ЛХМ-SO (Хроматограф, Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по стандартным газовым смесям.

Определение инлольиых производных проводили методом жидкостной хроматографии HPLC HP 1090 (Hewlett Packard, US А). Синтетические индолъные производные - триптофан, индолил-3-уксусную кислоту - использовали в качестве стандэрта.

Содержание мышьяка в растительны!, почвенных и водных образцах определяли с использованием масс-спектро метрик с индуктивно-связанной плазмой ICP-MS PQ2+Thermo (Cheshire, U.K.), атом но- абсорбционной спектрофотомегрии AAS GF95 Graphic Furnace (SOLAR, Thermo, U.K.), спектрофотометр«« Specot 221 (Carl Zeiss, Jena, Germany) в соответствии со стандартными методиками к данным приборам Пробоподготовка образное проводилась в микроволновом выпаривателе СЕМ Mars S (Matthews, USA).

Статистический анализ Математическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерных программ Excel 2000, Statistica for Windows (Версия 4.3) и статистического пакета SPSS (Версия 10 0 для Windows). Рассчитывали среднее арифметическое, довер1гтельный интервал, стандартное отклонение. Достоверность различий оценивали с использованием t-критерия Стыодеига,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка воздействия продуктов трансформации люнзита (2-хлорвнннлднхлорарсина) на микроорганизмы и растения

В качестве основных продуктов трансформации люизита можно выделить 2-члорвиннларсинокснд, 2-хлорвинияарсоновую кислоту, арсениты и арсенаты как конечные продукты их минерализации. Кроме того, арсенит натрия входит в состав реакционных масс, образующиеся при крупномасштабном уничтожении люизита. Поэтому наше внимание было направлено на изучение воздействия этих соединений на ризосферные микроорганизмы и растения. Выбор штаммов связан в первую очерезь с тем, что они являются ризосферными микроорганизмами, а также продуцентами фнтогормонов в количествах, обладающих в ризосфере физиологической активностью- При ииокуляиии штамом Л. ЪгаыЫте Sp245 прирост урожайности сельскохозяйственных растений по разным данным составляет от 10 до 30 % (Baldani and Döbereiner, 1930) Кроме того, все штаммы обладают высокой антагонистической активностью по отношению к широкому кругу фктоиатогенных грибов и бактерий (Воронин, 1998) Самым токсичным по отношению к микроорганизмам среди исследованных соединений, содержащих мышьяк, является 2-хдорвиниларснноксид.

Для культуры А. />га\!к'иы 5р245 в двух диапазонах коние(гграинй отмечено увеличение токсичности на 30 % при уменьшении концентрации 2-хлорвнниларсинокснда, Показатель МТК 2-хлорвиниларснноксида составляет 3,6x10"', МИК 3,6x10'10 и 3,6* 10л г/л (рис.1) Низкие показатели концентрации говорят о высокой токсичности исследуемого соединения, а лва значения МИК о наличии парадоксального эффекта (увеличения токсичности при уменьшении концентрации действующего соединения). Такие зависимости, в которых присутствуют несколько максимумов иигибирования, называют парадоксальными, они уже известны в биологии (Криштоненко. 2001). Такой же эффект выявлен при действии этого соединения на проростки пшеницы.

ч

Концентрация 2-хлорвинкпарсииокснда, 10*г/л

Рис 1, Зависимость оптической плотности суспензий клеток культуры А. Ьга$)1епи<! Эр245 от концентрации 2-хлорвнниларснноксида

Наибольшую устойчивость к мышьяксодержащим соединениям среди исследованных культур показали штаммы Р. аигео/аает В51393 и А. Ыш1кп$е Бр245 (рис. 2). Для Р. аиген/аскт ВЭ1393 МТК по арсениту натрия составила 0,08 г/л, он же характеризуется наиболее высокой устойчивостью к арсенату - 3,5 г/л, МТК арсеиита для штамма А. ЬгскИепж 5р245 составляет 0,18 г/л, токсичное действие арсената начинало проявляться при концентрации ] г/л. В широком интервале концентраций арсен!гта натрия от 0,05 до 0,8 г/л величина оптической платности суспензии клеток этих штаммов была выше в сравнении с тем же показателем двух других штаммов.

Некоторые продукты вторичного метаболизма микроорганизмов оказывают воздействие на растение и, попадая в него через корневую систему, активируют процессы роста и существенно влияют на обмен веществ во всем растительном организме. Это может иметь большое значение в процессах очистки почв методом фнторемедиации Среди биологически активных веществ, продуцируемых микроорганизмами, важная роль принадлежит фнтогор-

чонам. Поэтому нами было исследовано влияние 2-хлораи ниларсиноксида н хлорвинилар-соновон кислоты на бактериальный синтез штаммом A. brasHense Sp245 фктогормона - индол и л-З-уксусной кислоты (рис. 3),

Концентрация арсенита натрия, г/л

—О—A. brsjilenso Sp. I4S ■ И P. Iluoresccns 3&» —P. putidi 53» —К—P. aureofocieni BS1393

Рис. 2 Зависимость оптической плотности суспензий клеток культур от концешраинн арсенита натрия

— Триптофан

Рис. 3. Зависимость синтеза ИУК культурой A. brasiknse Sp245 от концентрации 2-хлорвинила рсиноксида

Концентрация 2-хлор винил а реи но ксида в образцах, г/л:

1 -0 5-З.бхЮ"* 9-3,бхИИ

2 - 3,6* Ю"'1 6 -3,6< 10"' 10 -3,6*10"3

3 -3,6x10""1 7-З.бхЮ"6 И-З.бхЮ"1

4 -3,6x10'9 8-3,6x10-'

Полученные результаты не выявили пропорциональной зависимости бактериального синтеза ИУК и утилизации триптофана от концентрации 2-хлорвинкларсиноксида и 2-

члорвинмларсоновой кислоты в растворе культуралыюй жидкости штамма A. /нты/ешм Sp245. Присутствие 2-хдорвиинларсинокс1|дз в культуралыюй среде приводило к резкому понижению синтеза ПУК изучаемой культурой. Концентрации выше, чем Ю-6 г/л, на £0 % по отношению к контрольному обрасту ннгибнруют синтез ПУК В диапазоне концентраций 3,6» 10"-3,6*10'7 г/л количество синтезированного фитогормона было меньше контрольного на 35-40 % В случае добавления в культуральную среду 2-хлорвиннларсоновой кислоты нн-гибироеание синтеза ИУК происходило при концетраинях выше, чем 0,09м 101 г/л.

Таким образом, данный штамм можно применять для стимуляции роста растений в процессах фиторемеднации почв, загрязненных солями мышьяка, при этом содержание 2-хлорвиниларсоновой кислоты в водно-почвенном экстракте не должно превышать 0,09*10'2 г/л, 2-хлорвиниларсииоксиаа - 3,6" Ю"7 г/л.

Проведенные лабораторные исследования фитотоксичностн арсенита натрия для под-солчечннка и сорго показали, что 50 % ингибирование роста нодсолнечннка и сорго происходило при содержании мышьяка в почве 100 мг/кг. Однако всхожесть семян сорго была ниже, что может свидетельствовать о лучшей устойчивости подсолнечника.

С иелью проверки влияния бактерий на рост растений в условиях загрязнения почвы арсенмтом натрия исходные и плазмидосодержашме варианты ризосферных нсевдомонад Р. Jim»líjcc/fi 38а, Р. amcojnckm BS1393 и Р. pulida 53а использовали ятя инокуляции семян растений. На основании результатов лабораторных исследований были проведены ник pono левые эксперименты.

Начальная концентрация мышьяка составляла 50 мг/кг сухой почвы Наибольшей биомассой характеризовался подсолнечник, ино купированны и исходным штаммом Р. мгсо/астж BS1393 - в 2,4 рала больше, чем масса контрольных растений, что согласуется с результатами, полученными в лабораторных условиях для этого же штамма (рнс, 4А). Обработка растений плззмидосодержащими вариантами штаммов Р. aureojaaens BS1393, P.JJtitiresceits 38а, Р. pulida 53а оказывало положительное воздействие на рост подсолнечника по сравнению с контролем, В случае сорго все штаммы бактерий не только не оказывали стимулирующего действия на растения, но лаже ннгибировали их рост. При инокуляции семян штаммом Р. Jhnire.4ct!itt ЗВа (pBS3031) вес растений снижался на 7945 % по сравнению с контролем

В с кии с возможным применением регуляторов роста вместе с растениями экзогенному воздействию подвергаются симбиотичсские и ассоциированные микроорганизмы корневой зоны. Учитывая это, мы провели эксперимент, в котором рассматривалось совместное действие различных штаммов бактерий и ИУК на биоахкумуляцию мышьяка растениями После окончания эксперимента в растениях и образцах почвы было проанализировано со-

держание общего мышьяка и рассчитана степень извлечения его из почвы (рис, 4К, табл. I)

г 3 4 5

Варианты О Подсолнечник ВСорго

ь—

1 Агшьшж

Вапмипч □ Подсолнечкнк О Сорго

Рис. 4. Биомасса (А) и содержание мышьяка в растениях (Б) в зависимости от обработки различными штаммами и ПУК (Б); 1 -Р, Ат>ге1сет 38а; 2 ~Р. аигео/аскт В51393; 3 - Р. рочЖг 53а; 4-Р.рмШ 53а(рВ53031); 5 - Л «нге^ас(«иВ51193 (р!Ш031)', б -Р.^иагс.\сст 38а (рВ83031); 7-Контроль

Биоаккумуляция мышьяка подсолнечником, увеличивалась при инокуляции плаз ми ло-содержашим штаммом Р. Аиопяхт 38а па 47£5 % по сравнению с контролем. Учитывая, что этот штамм стимулировал и рост биомассы в 2 раза, можно сделать вывод о целесообразности применения этого штамма в процессах ремедиаиии почв, загрязненных мышьяком Инокуляция сорго всеми штаммами, использованными в работе, увеличивала содержание мышьяка в растениях но сравнению с контролем, но, как было отмечено ранее, ингиСировала рост растений

Высокая степень извлечения мышьяка при использовании штамма р. аигео/асгет В81393 и растений подсолнечника, с предварительной обработкой семян ИУК а концентрации 10'5 г/л позволяет использовать данный штамм в процессах ремедиации почв содержащих мышьяк.

Токсичность для ¿стяа $>ЬЬа солей мышьяка и влияние фосфатов на их бнолое-тупность. Прн изучении токсичности солей мышьяка для высших водных растений была построена зависимость скорости роста культуры /_ £)ЬЬа от концентрации А$(Ш) и А${\') в питательном растворе н уровня ннгибирования скорости роста (рис. 5).

Таблица 1

Степень извлечения мышьяка из почвы при обработке растений различными штаммами микроорганизмов.

Штамм Подсолнечник Подсолнечннк +ИУК Сорго Сорго +ИУК

P. fluorescein 38а 3,2 2,2 2,4 2.1

P. wireofaciciis BS1393 3.2 6.2 2.2 2,3

P. pulida 53а 2,7 2.2 2,9 4.2

P. putida 53а (pBS3031 ) 2,4 2,6 2.2 т 7

P. aimofadens BS1393 (PBS3031) 4,1 3,3 2,7 2,6

P. Jhmrescens 38a (pBS3031> 3.5 1,9 2,4 2,5

! Контроль, необработанные растения 1,6 2,5 2 1 2.7 !

Показатели ннгибировання скорости роста, имеющие отрицательные значения, свидетельствовали о стимуляции роста L. gibba, тогда как более чем 100 % ингибирование роста говорило о детальности используемых концентраций токсиканта. Картина токсичности As, показанная на рис. 5, напоминает токсичность Cd для L. gibba (Wang, 1986). Низкая концентрация солей мышьяка (20 мкг/л) не влияла на скорость роста культуры. Лрсешгг в концентрации 50 мкг/л вызывал выраженное ингибирование скорости роста (более 100 %, ЕС50 31,6 мкг/л), арсепат в этой же концентрации значительно менее токсичен (ЕС50 48,7 мкг/л). При концентрации мышьяка 100 мкг/л токсичность арсенита снижалась вдвое; в то время как токсичность арсената увеличивалась, в результате чего эти соли мышьяка имели сходные показатели ннгибнрования скорости роста культуры. Дальнейшее увеличение концентрации до 250 мкг/л приводило к парадоксальному восстановлению контрольных показателей скорости роста ряски. При концентрации 1000 мкг/л ингибирование составило более 150 % для арсената и чуть менее 100% для арсенита (рис. 5), Основной причиной этого могут служить различия в биодоступности разных форм мышьяка для растений и, соответственно, отличия в накоплении их в тканях растений, В некоторых работах показано, что арсениты более токсичны для L i,'/f>Aa, чем арсенаты (Neumann et al., 1998). Однако в работе Knauer (1999) отмечается. что As(V) проявляет более высокую токсичность в отношении водорослей, чем

Л^Ш), что совпадает с результатами данного исследования при концентрации мышьяка 1000 мкг/л.

200%

I

3

15»%

! ¡3 As III

§

Конца гграцня As в с реле, мкг/л

Рис.5. Ингибнрование скорости роста культуры gtbba в зависимости от формы и концентрации мышьяка

Известно, что фосфат- и эрсенат-иоиы очень схожи по своим химическим свойствам и имеют близкие величины рКа (Song et al, 2002):

В силу сходства химических и структурных свойств арсенат-ноны конкурируют с фосфат-ионами в питательном растворе. Подобное конкурирующее поведение и определяет доступность мышьяка для растений, особенно в отсутствии в среде фосфат-ионов (Атас«] е1 а!, 2001; МеНаге, Наг^еу-'ЛЪиакег. 2002). Когда РО,*'и АзО«"' находятся в раствор«, растения поглощают и мышьяк тоже (химическая мимикрия). Были проведены эксперименты по биодоступности мышьяка для I*. &ЬЬа в условиях различного содержания РОГ1 в питательной срезе (рис. 6).

Накопление мышьяка растениями ряски находилось в обратной корреляции с концентрацией фосфат-ионов в питательном растворе. Более того, доступность солей мышьяка для растений ряски зависит не от их обшей концентрации в среде культивирования, а от концентрации отдельных видов мышьяка, которые могут либо непосредственно взаимодействовать с Ь. giЫкl, либо превращаться в бнодостулные виды.

H,As04 рКа I =2,19 рКа2-6,94 рКаЗ-11,5

HjPO« рКа I ~2,1 рКа2>7,2 рКаЗ-12,3

3,000

2.500 --

а г,ооо

1,600 1,000 500

о

Щ^Н 0.014 мг/л фосфата |\fo| 13,61 мг/л фосфата fxf'.'H 40,00 мг/л фосфата

10

50

100 250 С, мкг/л

500

1000

Рис. б Аккумуляция мышьяка культурой /- gibba в эзвисимоети от содержания арсената и фосфата в питательной среде

Трансформация продуктов детоксикаикн un pirra микроорганизмами м аккумуляция ui растения ti н

Изучение токсичности продуктов гидролиза иприта дли микроорганизмов. Штамм Р. pulida biovar А ШК1 был отобран в результате нескольких этапов селекции по скорости роста и устойчивости к л тису клеток при роете в среде с РМ иприта. Количество вносимой в среду РМ оказывало влияние на ростовые характеристики штамма. В диапазоне концентраций РМ от 0,5 до 3,0 ti биомасса бактерий увеличивалась, оптическая плотность суспензии изменялась от 0,8 до 2,4, тогда как удельная скорость роста снижалась с 0,074 до 0,01 ч"1 и лаг-фаза удлинялась с 4 до 120 ч (рис. 7), В эткч условия* происходило спи лен не рН среды.

Способность к росту в среде с РМ, а также МЭА и ЭГ, наряду со штаммом Р. pulida 1I1K1, била проверена ешеу двух штаммов Ai xytosoxydaw - деструкторов т»ояигликоля м 8 штаммов Р. (nuiíU - деструкторов поди циклических ароматических углеводородов. Кроме штамма ШК1 ни одна из этих культур не росла в средах с вышеуказанными источниками углерода, что свидетельствует об адаптации к ним селекционированного штамма.

140120

е во-604020 о-

РМ н скорость

роста, ч '

0.5 0,07

КО 0.04

0.02

3.0 0.01

1

0.5 1,0 1.5 2.0 2.5 3.0 концентрация РМ, %

2,5 2

1.5 ■ 1

■ 0.5 0

Ада

Рис. 7. Влияние концентрации РМ иприта на прирост биомассы, продолжительность лаг-фазы и максимальную удельную скорость роста Р. риНЖх 1ИК1,Н - продолжительность лаг-фазы. ч;П - максимальная плотность биомассы А-ч.г>>™

С целью выявления компонентов РМ, используемых бактериями в качестве источников углерода для роста, были проверены МЭА и ЭГ — компоненты дегазирующей смеси, содержание которых в РМ после дегоксикацин иприта в эксперименте соответствовало нх содержанию в 1 % РМ При внесении МЭА н ЭГ в период стационарной фазы культуры, выросшей в среде с РМ, рост возобновлялся. Этот факт свидетельствует о том, что именно эти субстраты в составе РМ в первую очередь используются бактериями как источники углерода.

Поскольку 1,4-нергцдротиазнны (ПГТ) составляют большую часть органической фазы РМ иприта, каше внимание было направлено на изучение возможности биодеструкиии этих соединений.

Содержание каждого из идентифицированных 1,4-ПГТ в культуралыюй жидкости исследовалось в динамике роста культуры 1ПК1 в срезе с 1 % РМ иприта. Контролем служила та же среда, которую инкубировали в подобных условиях, но без микробных клеток или с ннактивированными клетками.

Результаты, представленные на рис. 8, показали, что в процессе культивирования штамма 1ПК1 происходило уменьшение площадей пиков каждого из производных 1.4-1111: N-(2-гмдро ксиэт1I л)-1,4-пергнд рот лап ш глярохлорид (пик 1); Ы-(2-гидроксиэтнл)-2-метил-1,4-пергиаротназин гндрохлорвд (пик 2); Ы-(2-гилрокснэтцл)-2,б-димеп!л-1,4-пергндротназин гидрохдорцд (пик ЗУ, Н-(2-гш:рокснэтил)-3-мсгил-1,4-перП1лротназии гилро-

вторил (ник 4), Ы-(2-пмрокснтп1л)-2.5-д|шетнл-Ы-перп(дротиаапн гндрохлорид (гшк 5). Снижение обшего количества этих компонентов достигало 50 % за период роста культуры. В контрольном варианте изменения содержания ПГТ не наблюдалось. Сравнение полученных результатов позволяет сделать вывод, что именно микроорганизмы являются ответственными за уменьшение содержания ПГТ в РМ.

сутки роста

Рис. 8 Изменение содержания 1 ,4-1II I в среде 1 %РМ в динамике роста культуры Р. ршШ 1ЛК1

Переход культуры в стационарную фазу при наличии достаточно высокой концентрации ПГТ в отсутствии накопления в культуральной жидкости и клетках веществ, ннгиби-рующих рост, свидетельствует о том, что ПГТ не используются как источники углерода для роста, но происходит их трансформация растущими клетками. Это предположение подтверждается результатами опытов, проведенных с использованием фракций, содержащих смесь 1,4-ПГТ в ра)ных соотношениях. Снижение их коние(гграиии на 86 - 96 % наблюдалось только в растущей культуре, где источниками углерода служили МЭА+ЭГ. В отсутствие Этих косубсгратов роста не было, содержание 1,4-ПГТ не изменялось.

Ф1ГГоремеднация почв, загрязненных реакционными массами иприта На основании результатов лабораторных экспериментов по определению токсичности РМ иприта для растений, подсолнечника и сорго было установлено, что 50 % редуцирование роста растений происходит при концентрации РМ в почве 10 г/кг. Для изучения влияния почвенного микроорганизма-деструктора РМ Р. рнЫа ШК1 на рост растений семена сорго инокулировали суточной культурой штамма и высаживали в почву, загрязненную РМ нпр1*та в концентрации 4 г/кг (рис. 9)

7 14 21 2В 3S *2

сутки

Рис, 9. Влияние РМ иприта на рост сорго

В первую неделю эксперимента происходит сильное подавление роста растений, ино-кулировапных штаммом 1ЦК1 - на 5б,9±5 % го сравнению с контролем н отменен рост стебля в горизонтальном направлении, тах называемый «стелющийся рост». Такой рост характерен для физиологического действия этилена, который является фитогормоном и в крайне малых концентрациях угнетает рост стебля в длину (Кудаева. 1998). К 5-й педеле различия по сысогс растений вариантов с микроорганизмами и без практически исчезли, что может объясняться исчерпанием в почве компонентов РМ. используемых микроорганизмами для продуцирования этилена. Такими компонентами могут служить моиоэтаноламин и этиленгли-кояь. Для проверки предположения о деструкции компонентов РМ с выделением этилена и определения роли в этом процессе штамма Р. pulida ШК1 были проведены анализы газовой фазы при культивировании в закрытых сосудах. Результаты показали, чго в обоих случаях присутствуют ненасыщенные низкомояскулярныс углеводороды. Сравнение со стандартами позволило идентифицировать их как этилен и пропилен. Наибольшее количество этилена выделялось при культивировании культуры ШК1 в среде с добавлением МЭА н ЭГ под действием биогенных окислителей.

По окончании эксперимента определяли обшее содержание органических соединений серы, которые находятся в РМ иприта (IHT и их производные). Общее содержание органических соединений серы уменьшается на 53 % в варианте с применением растений, инокули-роэанных штаммом Р. pulida ШК1 н только на 8 'Л в варианте с неинокул про ванным и растениями {рис, 10).

Таким образом, штамм Р. pulida ШК1 может использоваться При биоремедиации почв, загрязненных РМ иприта. Инокуляция растений штаммом Р. pulida ШК1 значительно повышает их устойчивость к этому загрязнителю

Рис. ID. Хроматшраммы образца почвы сРМ до биоремедилции (Л) и после биореме-

дцации {вариант: растения + P. puiida ШК1)

ВЫВОДЫ

1. Обоснована возможность использования биологически* объектов - специально подобранных и селекционированных растений и микроорганизмов для очистки почв и водоемов от продуктов деструкции отравляющих веществ,

2. Впервые определен диапазон фитотокснчносги и обнаружен эффект парадоксальной токсичности 2-хлорвиниларсиноксида. Области активации н угнетения роста колеогтгиля пшеницы чередуются, концентрации Ю^-Ю'10 мг/мя более токсичны, чем Ю-'-10'' г/л.

3. Показано, что культура l.etnna ^¡bba накапливает мышьяк (V) и (III) до 1350 и 1220 мг/кг сухой биомассы растений соответственно, причем при высоких концентрациях (1000 мкг/д) арсенат более токсичен, чем арсенит. При ремедиаиин водоемов общая концентрация мышьяка не должна превышать 250 мкг/л

■1 Для культуры Azaspinltnm brasitenae Sp245 отмечено увеличение токсичности продукта 2-хлорвиннларсиноксида при уменьшении концентрации токсиканта, что обусловливает наличие двух пиков минимальной ингибируюшей концентрации: при 3,6x10'10 и З.бхЮ'1 г/л.

5. Показано, что триптофанзависимый синтез индолнл-3-уксусной кислоты бактериями Azospirilhm trastteme Sp24S ингибируется 2-хлорвнниларсоновой кислотой при концентрации выше 0,09x10"2 г/л и 2-хлорвиниларсиноксидом при концентрации выше 3,6x10'' г/л, что необходимо учитывать при применении данной культуры в процессе фитореме-диацки почв, загрязненных этими продуктами.

6. Выделен штамм Pseudomonas punja 1J1K1, растущий в средах с реакционными массами иприта и устойчивый к лизису клеток в этих условиях. Этот цггамм может использоваться для ремедиацни загрязненных объестов

7. Проведен анализ реакционной массы иприта и идентификация 1,4-пергидротиазннов. Установлено, что при культивировании клеток штамма Pseudomonas pulida ШК1 в средах, содержащих реакционные массы иприта, 1,4-пергндротиазины не используются в качестве источников углерода и энергии, но трансформируются растущей культурой.

В. Разработаны методические подходы с использованием микроорганизмов и растений для очистке почв, загрязненных продуктами деструкции иприта и люизита. Штамм Pseudomonas pulida ШК1 в сочетании с растениями сорго может Сыть использован для биореме-д наци и почв, загрязненных продуктами разложения иприта, степень очистки почвы от серусодержащих соединений, достигает 55-60 'Л Для почв, содержащих соединения мышьяка, наиболее аффективно использование растений подсолнечника, ииокулнрован-ных штаммом Pseudomonas wrevfactens BS1393 (степень извлечения мышьяка 6,2)

Список публикации по теме диссертации

1. Пат, 2185901 РФ. МКИ В 09 С 1/00, Способ очистки почв, загрязненных продуктами природного и техногенного разложения кожно-нарывных отравляющих веществ / ВВ. Игнатов, Е Е. Федоров, П.В. Костерин, А Л, Щербаков, Е.А. Захарова, ЕВ. Любунь, В.В. Брудник, Л.Ф. Щербакова, В Г. Манлыч, A.B. Шантроха. Приоритет 20 08.2000 г- 4 с.

2. Lyn bun' Ye,V,, Demidov O. M., ShaiUrokha A.V., Ivanov K.N., Shcherbakov A.A., Starovoitov T.I., Ermakova LT., Kosterin P.V., Shcherbakova I, F., Zakharova E.A., Fedorov E.E., Jgnatov V.V. Transformation оГ mustard gas in environmental objects // Abstr, Seminar-Presentation of Sei. and Techn. Innovation Project "Biotechnology - 2000™, Sept. 26-28,2OO0, Pushchino, Russia. - P. 169-170.

3. Шаитроха Д В., Демидов ОМ., Иванов К Н., Любунь Е.В., Щербаков A.A. Методический подход к изучению процессов трансформации OB в объектах окружающей среды; Сб. науч. тр. «Утилизация и переработка отходов» ! Под ред. Т.И, Губи ной, - Саратов: Изд-во Сарат, гос. тех, ун-та, 2001.-С. 77- 80

4. Lyubun Ye. V,. Zakharova Е. A., Shcherbakov A.A., Kosterin P.V , Kochetkov V.V,, SïzovaOl, Indirect phyto remédiât ion of arsenic-containing compounds from soils // Abstr. ISEB Meeting "Phytoremediation", May 15-17,2001, Leipzig, Germany, -P, 93.

5. Lyubun Ye.V., Kosterin P.V., Boromn A.M., Starovoitov l.L, Ermakova 1.Т., Shcherbakov A.A., Makarov OE., Zakharova EA., BruJnik V.V., Shcherbakova L.F., Igrotov V.V. Soil

phyioremediation from I he mustard decomposition products: potential of rhizosphefe microorganisms// РгосЛ" Europ. Bioremediation Conf, July 2-5, 2001,Chania, Greece.-P. 471-474.

6. Любунь ЕВ, Щербаков А. А., Костерин П.В., Федоров E.E., Щербакова Л Ф. Оценка воздействия эрсенига натрия на растения: Сб. науч. тр. Сарат. воен. ин-та радиац., хим и бнол. зашиты. Ч. II. Киологня, экология, медицина. -Саратов, 2002. - С, 65-69.

7. Щербаков А.А., Любунь Е.В„ Кузнецов П.Б., Костерин П.В. Трансформация люизита в объектах окружающей среды, — Саратов: Научная книга, 2002. — 84 с.

8 Sizova 0.1-, Kochetkov V,V„ Validov S Z., Boronin A.M., Kosterin P.V„. Lyubun Ye.V. Arsenic-contaminated soils. Genetically modified Psemiamotiivi spp. and their arsenic-phytotemediation po<ential // JSS - J. Soils & Sediments, - 2002. - Vol, 2, № 1. -P, 19-23.

9. Lyubun Ye.V., Kosterin P.V, Zakharova E.A, Shcherbakov A.A, Fedorov EE. Atsenic-contaminated soils. Phytotoxicity studies with sunflower and sorghum // JSS - J. Soils & Sediments 2002 - Vol. 2, „"ft 3, - P. 143-147.

10. Lyubun Ye.V., Kosterin P.V., Ermakova I.T., Kryuchkova Ye.V,, Arefyeva O.A., Shcherbakov A. A. Biodégradation study of the products of industrial mustard-destwetion И Abstr. 12"' Intem Biodeteiioration and Biodégradation Symp., July 14-18, 2002, Prague, Czcch Republic, - P, 194.

11. Lyubun Ye.V., Shcherbakova M.A., Fedorov EE., Skorobogatova V.I., Zlobin V.A, Nazarov G.V., Kuznetsov P.E, Shcherbakov A.A, Lewsite transformation in sediments and dredged material // Abstr. Workshop ' Chemical Analysis and Risk Assessment of Emerging Contaminants in Sediments and Dredged Material", Nov. 2S-30,2002. Barcelona, Spain, - P. 189.

12. Lyubun Ye.V., Kryuchkova Ye.V., Ermakova I.T., Makarov O.E, Starovoitov I I- Shcherbakov A. A, Use of rhizospheric microorganisms to detoxify sulfur- and chlorine-containing xerwbloties // Abstr. Intern. Symp '"Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants w ith Tech-nogenic Environmental Pollutants", July 28-30, 2003, Saratov, Russia. - P. 24-25.

13. Любунь EE, Крючкова E.B., Фёдоров E.E., Щербаков A.A. Фиторемедиация почв, загрязненных мышьяксодержашимн соединениями: Сб. науч. тр. «Высокие технологии -путь к прогрессу». - Саратов: Научная книга. 2003. - С. 73-76.

14. Ермакова И.Т., Старовойтов И И, Любунь Е.В., Щербаков А.А., Макаров О.Е, Воронин A.M. Микробиологическая деградация органических компонентов реакционных масс иприта // Тез докл. на Семинаре-презентации инновационных науч.-техн. проектов "Биотехнология-2003", 24-25 ноября, 2003, Пушино, Россия. - С. 105-106

15. Mkandawire M., Lyubun Ye.V_ Kostenn P.V., Dudel E.G. Toxicity of arsenic species to ¡лтна gibba L. and the influence of phosphate on arsenic bioavailability // Environ. Toxicology. -2004.-Vol. !■>,№ !. —P. 26-34.

16. Lyubun Ye V., Kryuchkova Ye.V,, Ermakova 1.Т., Makarov O.E.. Sficherbakov A.A. Assessing the possibility of bioremediation of soils polluted by perhydrothiazines // Abstr. 3rd Workshop "Monitoring sediment quality at river basin scale", 29-31 Jan., 20Q4, Lisbon, Portugal.-P. 21,

17. Siiova 01., Lyubun Ye.V., Kochetkov V.V., Validov S.2., Boronin F.M. Effect of wild and genetically modified rhizo sphere bacteria Pseudomoitas aurcnfaciws on the accumulation of arsenic by plants//Прикл. биохимн микробнол. -2004. - Vol. 40, № 1. -P. 78-82,

18. Ермакова И.Т., Старовойтов И И., Любунь Е.В., Щербаков А, А, Макаров О.Е., Петрова А.А-, Шпндьков П.А. Микробиологическая деградация реахиионных масс иприта. 1. Выделение it селекция микроорганизмов-деструкторов, анализ органических компонентов реакционных масс и их биодесгрукция //Микробиология, — 2004. — №3. — С. 358-363,

19. Любуиь Е.В. Влияние продуктов гидролиза люизита на бактериальный синтез индолил-З-уксуснон кислоты штаммом A. brasileme Sp245 // Материалы науч. конф. «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», 17-18 июня, 2004, Казань, Россия. - С. 52.

БЛАГОДАРНОСТИ

• Автор выражает искреннюю признательность научным руководителям данной работы А.А. Щербакову н И.Т. Ермаковой за постоянное внимание, консультации и плодотворное обсуждение этапов работы. Благодарю моих коллег, в соавторстве С которыми были выполнены отдельные части работы. - ЕЕ. Федорова, Q.E. Макарова, П.В. Костер ина (ИБФРМ РАН), И И. Старовойтова, В В. Кочетхова, О.И. Сизову (ИБФМ РАН), Г. Дуделя, М. Мкан-давире, А. Вайске (Инспггут обшей экологии и охраны окружающей среды. Технический университет Дрездена, Германия). Очень признательна сотрудникам Саратовского военного института радиационной, химической и биологической зашиты за предоставленную материально-техническую базу и помощь в идентификации соединений - С.А. Конешову, И,В. Егорову, Н.В, Сотиикову. Благодарю за глубокое и тщательное рецензирование работы профессора O.D. Турковскуто, профессора Т.Н. Губину и д.б.н. О.В. Игнатова. Выражаю искреннюю признательность М П. ЧериышовоЯ и А.Ю. Муратовой за дружескую поддержку и помощь в оформлении работы.

20.

Подписано в печать 11Л 1.2004 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать RISO. Объем 1,0 печл. Тираж 100 экз. Заказ Ni 328.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю£. Свидетельство № 304645506500043 410600, Саратов, ул. Московская, дЛ 52, офис 19