Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические подходы к очистке почв и водоемов, загрязненных продуктами деструкции иприта и люизита

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические подходы к очистке почв и водоемов, загрязненных продуктами деструкции иприта и люизита"

На правах рукописи

Любунь Елена Валентиновна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОЧИСТКЕ ПОЧВ И ВОДОЕМОВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПРОДУКТАМИ ДЕСТРУКЦИИ ИПРИТА И ЛЮИЗИТА

03.00.07 - микробиология 03.00.16 - экология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2004

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (г.Саратов)

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор А.А. Щербаков кандидат биологических наук, с.н.с. И.Т. Ермакова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

с.н.с. О.В. Игнатов

доктор химических наук,

профессор Т.И. Губина

Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии РАН (Пущино).

совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН по адресу: 410049. г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13. Тел./факс (8452) 97 03 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Защита состоится

20 декабря 2004 г. на заседании диссертационного

доктор биологических наук

В.Е. Никитина

Актуальность проблемы. В настоящее время в связи с катастрофическими масштабами антропогенного загрязнения окружающей среды чрезвычайно большое значение для прогнозирования развития возможных опасных экологических ситуаций приобретает информация о воздействии экотоксикантов и продуктов их трансформации на различные природные объекты - почву, водоемы и т.д.

В соответствии с Конвенцией «О запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и его уничтожении» и Федеральной целевой программой «Уничтожение запасов химического оружия в РФ» в России проводится переработка отравляющих веществ кожно-нарывного действия - иприта, люизита и ипритно-люизитных смесей, на первом этапе которой осуществляется их химическая детоксикация, на втором -уничтожение полученных в ходе этого процесса реакционных масс (РМ).

Одной из важнейших экологических проблем является очистка и восстановление территорий, которые могут быть загрязнены отравляющими веществами или продуктами их детоксикации в местах хранения, транспортировки и уничтожения в результате возможных утечек, аварийных выбросов и т.д. Экотоксиканты могут вступать во взаимодействие с природными веществами, образуя новые соединения, аккумулироваться и метаболизироваться живыми организмами. В настоящее время наряду с физическими и физико-химическими способами детоксикации отходов разрабатываются подходы для их биоутилизации с использованием микроорганизмов и растительно-микробных ассоциаций.

Токсическое действие различных соединений может не только подавлять жизнеспособность микроорганизмов, но и вызывать их метаболическую адаптацию к новым условиям существования. Концентрация продуктов деструкции отравляющих веществ может оказать решающее значение на их трансформацию той или иной ферментной системой клетки и биоаккумуляцию. Такие сведения в научной литературе весьма ограничены. Известно, что многие соединения, образующиеся при гидролизе и окислении иприта (2,2'-дихлордиэтилсульфида) токсичны, а некоторые сульфониевые производные по токсичности превосходят исходное (Александров, 1990; Федоров, 1997).

Влияние токсических концентраций продуктов деструкции иприта и люизита на почвенные микроорганизмы, растения и растительно-микробные ассоциации практически не исследовано, несмотря на то, что такие данные необходимы для разработки критериев оценки их вредного воздействия и создания новых экологически чистых методов очистки окружающей среды.

» НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА

«

Цель и задачи исследования Целью работы являлось исследование почвенных микроорганизмов и растений при воздействии продуктов деструкции иприта и люизита и разработка методических подходов для биоремедиации загрязненных почв и водоемов

В рамках поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Исследовать диапазон токсичности мышьяк- и серусодержащих продуктов трансформации иприта и люизита для некоторых ризосферных микроорганизмов и растений.

2. Оценить влияние мышьяксодержащих соединений на триптофанзависимый синтез ИУК штаммом Azospirilhtm brasilense Sp245.

3. Изучить возможности биодеструкции продуктов первой стадии нейтрализации иприта.

4. Подобрать условия для биоремедиации почв, загрязненных продуктами трансформации иприта и люизита, в лабораторных и микрополевые экспериментах.

Научная новизна. Впервые показана возможность ремедиации почв, загрязненных продуктами деструкции - иприта и люизита, с помощью специально подобранных микроорганизмов и растений. Установлены диапазоны токсичности мышьякорганических продуктов нейтрализации люизита и РМ иприта для некоторых ризосферных микроорганизмов и растений. Обнаружена способность микроорганизмов рода Pseudomonas подвергать биодеструкции 1,4-пергидротиазины, основные компоненты реакционных масс иприта. Показано, что интродукция этих микроорганизмов в почву в значительной степени увеличивает эффективность биоремедиации. Показана возможность и даны рекомендации по использованию штаммов Р. aureofaciens BS1393 и А. brasilense Sp245 в процессах биоремедиации почв, загрязненных продуктами трансформации люизита.

Практическая значимость. Использование подобранных видов растений с инокуляцией их селекционированными штаммами микроорганизмов является основой для разработки метода биоремедиации почв, загрязненных продуктами трансформации кожно-нарывных отравляющих веществ - иприта и люизита.

Результаты проведенных исследований были использованы для разработки нового способа очистки почв, загрязнённых продуктами природного и техногенного разложения кожно-нарывных отравляющих веществ - фиторемедиации (патент РФ № 2185901). Основные положения, выносимые на защиту:

1. Растения подсолнечника (сорт Юбилейный 60) и сорго (сорт Волжский 4) устойчивы к высоким концентрациям арсенита натрия (10 ПДК) я способны аккумулировать этот токсикант из загрязненной почвы. Степень извлечения мышьяка значительно возрастает при инокуляции их клетками бактериального ризосферного штамма BSI393.

2. Продукты гидролиза люизита (2-хлорвиниларсиноксид и 2-хлорвиниларсоновая

кислота) ингибируют триптофанзависимый синтез ИУК штамма Azaspirilhim brasilense Sp245: 2-хлорвиниларсиноксид на 80 % при концентрации 10"6 г/л, 2-хлорвиниларсоновая кислота - на 75 % при концентрациях 10'2 г/л .

3. Идентифицированные производные 1,4-пергидротиазина, являющиеся продуктами деток-сикации иприта, подвергаются трансформации клетками селекционированного штамма бактерий Pseudomonasputida ШК1 при росте в среде с реакционными массами иприта..

4. Степень очистки почв от серусодержащих продуктов деструкции иприта растениями сорго (сорт Волжский 4) значительно увеличивается при инокуляции семян клетками штамма Pseudomonas putida ШК1.

5. Результаты экспериментов по извлечению продуктов деструкции люизита и иприта из загрязненных ими почв при совместном использовании растений и микроорганизмов могут быть использованы для разработки методов биоремедиации таких почв.

Работа выполнена в лаборатории структурных методов исследования Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (Саратов) в рамках научно-исследовательской работы «Изучение воздействия антропогенных загрязнителей на окружающую среду» (№ гос. регистрации 01200119220), на базе Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты, в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино) по проекту «Биотехнология защиты окружающей среды от антропогенных загрязнений» Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения», в Институте общей экологии и защиты окружающей среды (Технический университет Дрездена, Германия).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2000» (Пущино, 2000), на 1-й Европейской конференции по биоремедиации (Ханья, Греция, 2001), на 1SEB Митинге по фиторемедиации (Лейпциг, Германия, 2001), на 12-м Международном симпозиуме по биодеградации и биоразрушению (Прага, Чехия, 2002), на Международном семинаре по химическому анализу и оценке риска загрязнений в осадках и донных отложениях (Барселона, Испания, 2002), на 1-й региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2002), на Семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнология - 2003" (Пущино, 2003), на Международном симпозиуме «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (Саратов, 2003), на конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004).

Публикации. По теме диссертации получен патент РФ, опубликовано 18 работ, из них 2 статьи в российских и 3 в зарубежных реферируемых научных журналах.

Структура диссертации. Работа состоит обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов собственных исследований, и завершается заключением, выводами и библиографическим указателем, содержащим 176 литературных источников. Общий объем диссертации составляет 123 страницы. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 28 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Объектом исследования служили штаммы, полученные из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН (Саратов) - AzospiriHum brasilense Sp245 и ИБФМ РАН (Пущино) - 14 штаммов, принадлежащих к трем видам Pseudomonas: Р. fluorescens (5),

два штамма и вы-

деленный процессе выполнения настоящей работы штамм

В работе использовали растения: мягкую яровую пшеницу (Tritictim aeslivum L.) сорта «Саратовская 29», подсолнечник (Helianthus L.) сорт «Юбилейный 60», суданскую траву сорго и ряску

Культивирование микроорганизмов. Выращивание микроорганизмов A. brasilense Sp245 осуществляли на твердой и в жидкой малатной питательной среде (Zakharova et al., 2000) в течение 18 ч. Культивирование проводили при встряхивании на качалке с частотой вращения 100 об/мин при температуре 30°С. В качестве минимальной среды для бактерий Р. fluorescens 38а, Р. putida 53а, Р. aureofaciens BS 1393 и их плазмидосодержащих аналогов использовали синтетическую среду М9 (Мордашова, 1998). В качестве источника углерода использовали глицерин 4 г/л. Изучение закономерностей роста и определение минимальной ингибирующей (МИК) и максимальной толерантной концентрации (МТК) проводили в жидкой среде вышеуказанного состава с добавлением соответствующих мышьяксодержащих соединений. Культивирование бактерий проводили при 30°С на агаризованной среде в чашках Петри или в жидкой среде на качалке (150 об/мин) в колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл среды. Посевным материалом служила трехсуточная культура, которую выращивали на агаризованной среде того же состава.

При работе с РМ иприта культивирование бактерий рода и

штаммов A. xylosoxydans - деструкторов тиодигликоля проводили при З0°С в колбах с жидкой минеральной средой MS (Ermakova et al., 2002) на качалке (220 об/мин). Интенсивность аэрации составляла 0,5 г Oi/л/ч; рН среды 7,5 - 8,0. В качестве источников углерода использовали реакционные массы (РМ) иприта, в состав которых входили продукты его детоксика-

ции, а также остаточные количества компонентов дегазирующей смеси - моноэтаноламина (МЭА) и этиленгликоля (ЭГ) (9:1). РМ вносили в минеральную среду в количестве 1 % (об/об) непосредственно перед началом культивирования. В качестве субстратов использовали: 1) смесь МЭА (0,25 %) и ЭГ (0,015 %), 2) каждый из этих компонентов в отдельности (0,25 %), 3) смесь 1,4-пергидротиазинов, полученную обработкой РМ иприта щелочью и отгонкой при 80-85 °С (фракция 1), 91-94 °С (фракция 2) и 105-130 °С (фракция 3), а также 4) глутамат натрия (1 %). Посевным материалом служили клетки, выращенные на агаризован-ной среде MS с 1 % (об/об) РМ иприта. Рост культуры контролировали по изменению оптической плотности на спектрофотометре Specol 221 (Carl Zeiss, Germany) при k=560 нм и числу колониеобразующих единиц (КОЕ) путем высева из разведений на агаризованную среду.

Культивирование культуры Lemna gibba L. Из 7-дневной предшествующей культуры отбирали 10 фрондов и помещали в колбы Эрленмейера объемом 250 мл, содержащие 150 мл питательного раствора Хатнера, мг/л; СаСЬ х 2НгО - 12,2; К2НРО4 - 40,0; MgSO.« х 7HiO -50,0; -20,0; -1,5;

0,02;

50,0;. pH - 6,5±0,5. Культивирование проводили в фотокамере NEMA (Netzschkau, Germany) в течение 21 дня со следующим режимом: свет/темнота - 14/10 ч, интенсивность излучения -85-125 nEm'V; температура день/ночь - 24/16'С (± 2°С). Изменения в объеме из-за испарения компенсировались деионизированной водой.

Оценка фитотоксичности соединений. Фитотоксичность определяли на растениях из класса двудольных: подсолнечник (Heiianlfnis L.) и однодольных: пшеница (Triticum aeaíivum L.), суданская трава (Sorghum sudárteme). с о&р^йвтодасСгянйда). е н а подсолнечника и пшеницы замачивали в течение 1 ч в растворах 2-хлорвиниларсиноксида и воде (контроль), раскладывали в чашки Петри на увлажненную водой (контроль) или раствором 2-хлорвиниларсиноксида фильтровальную бумагу и проращивали в течение трёх суток в темном месте при температуре 26°С. Токсичность определяли подсчетом проросших семян, измерением длины колеоптиля и массы проростков.

Фитотоксичность арсенита натрия определяли на серых лесных почвах. При отборе образцов пользовались стандартной методикой (Радов и др., 1985). В подготовленную почву вносили водный раствор арсенита натрия. Лабораторные эксперименты проводили в клима-термосветокамере (KTLK 1250, Germany) со следующим режимом: 16-часовой световой период при 25°С и 8-часовой темновой период при 18°С в течение 30 дней.

Для определения параметров роста культуры L. gibba и биоаккумуляции мышьяка в питательный раствор вносили или Рост культуры отслеживали

подсчетом фрондов, площадь определяли цифровым анализом компьютерной программой

Win Cam 2000a (Regent Instalments, USA) Скорость роста (ц) определяли как Ц = (lnNtn-lnNti)V(tn-to), где Nt„- количество фрондов (площадь) в момент времени п, Nto - количество фрондов (площадь) в начале эксперимента. Степень аккумуляции мышьяка L. gibha (ф) определяли как <р = gu/gi, где gu - масса мышьяка в растениях, gl - сухая биомасса культуры. Модель образования ионов мышьяка и фосфора была рассчитана с использованием компьютерной программы PhreeqC (Version 2.5; USGS, August 2001) с базой данных термодинамических характеристик (Mkandawire, 2001). Процент угнетения скорости роста для каждой концентрации мышьяка определяли как - угнетение средней скорости

роста, %, средняя скорость роста в контрольном образце, - средняя скорость роста в исследуемых группах. Все расчеты проводили в соответствии с международными стандартами (ISO/CD 20079, 2001; OECD, 2002)

Подготовка и проведение экспериментов по биоремедиации почв. Предпосевная обработка семян проводилась раствором индолил-3-уксусной кислоты в концентрации 10"5 г/л в соответствии с методикой (Петрова, 1994). Для инокуляции семян использовали культуры P. fluorescein 38а, P. aureofaciens BS1393, P. puiida 53а, P. fluorescens 38а pBS3031, P. aureofaciens BS1393 pBS3031, P. puiida 53a pBS3031 (для почв, содержащих арсенит натрия) и Р. pulida biovar А ШК1 (для почв, содержащих РМ иприта). Культуры бактерий выращивали в синтетической среде М9 и среде MS (для РМ иприта) в течение 12 и 18 ч, соответственно. Семена растений инокулировали суспензиями бактерий в течение 2 ч, проращивали в течение суток при температуре 24°С и сеяли в подготовленную почву. Использовали серую лесную почву. Фоновое содержание мышьяка составляло 2,5 мг/кг почвы, рН 5,5-6,0. В конце экспериментов была подсчитана степень извлечения загрязнителя как частное от начальной и конечной концентраций

Анализ состава органических компонентов РМ иприта проводили хроматографиче-скими и хромато-масс-спектрометрическими методами. Водные образцы культуральной жидкости подвергали экстракции органическими растворителями, сушили в токе аргона и хроматографировали на газожидкостном хроматографе Биохром-1 (Хроматограф, Россия) с плазменно-ионизационным микродетектором.

Идентификация индивидуальных веществ проводилась на жидкостном хроматографе HPLC HP 5890 (Hewlett Packard, USA). Полученные масс-спектры анализировались с помощью базовых данных программы Wiley 275L. Количественное определение проводили, используя в качестве стандарта раствор синтезированного 1,4-пергидротиазина. Динамику изменения содержания органических соединений серы определяли методом газовой хроматографии с пламенно-фотометрическим детектором HP 5890 SERIES II (Hewlett Packard, USA), канал S, при Я.=393 нм.

Массовую концентрацию непредельных углеводородов измеряли в соответствии с аттестованной методикой измерений МВИ № 2420/117-98 на газовом хроматографе ЛХМ-80 (Хроматограф, Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по стандартным газовым смесям.

Определение индольных производных проводили методом жидкостной хроматографии HPLC HP 1090 (Hewlett Packard, ^А).Синтетические индольные производные - триптофан, индолил-3-уксусную кислоту - использовали в качестве стандарта.

Содержание мышьяка в растительных, почвенных и водных образцах определяли с использованием масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой ICP-MS PQ2+Thermo (Cheshire, U.K.); атомно-абсорбционной спектрофотометрии AAS GF95 Graphic Furnace (SOLAR, Thermo, U.K.); спектрофотометрии Specol 221 (Carl Zeiss, Jena, Germany) в соответствии со стандартными методиками к данным приборам. Пробоподготовка образцов проводилась в микроволновом выпаривателе СЕМ Mars 5 (Matthews, USA).

Статистический анализ. Математическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерных программ Excel 2000, Statistica for Windows (Версия 4.3) и статистического пакета SPSS (Версия 10.0 для Windows). Рассчитывали среднее арифметическое, доверительный интервал, стандартное отклонение. Достоверность различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Оценка воздействия продуктов трансформации люизита (2-хлорвинилдихлорарсина) на микроорганизмы и растения

В качестве основных продуктов трансформации люизита можно выделить 2-хлорвиниларсиноксид, 2-хлорвиниларсоновую кислоту, арсениты и арсенаты как конечные продукты их минерализации. Кроме того, арсенит натрия входит в состав реакционных масс, образующихся при крупномасштабном уничтожении люизита. Поэтому наше внимание было направлено на изучение воздействия этих соединений на ризосферные микроорганизмы и растения. Выбор штаммов связан в первую очередь с тем, что они являются ризосферными микроорганизмами, а также продуцентами фитогормонов в количествах, обладающих в ризосфере физиологической активностью При инокуляции штамом Sp245 прирост урожайности сельскохозяйственных растений по разным данным составляет от 10 до 30 % 1980). Кроме того, все штаммы обладают высокой антагонистической активностью по отношению к широкому кругу фитопатогенных грибов и бактерий (Бо-ронин, 1998) Самым токсичным по отношению к микроорганизмам среди исследованных соединений, содержащих мышьяк, является 2-хлорвиниларсиноксид.

Для культуры А. Ьга$И<!ПЫ1 8р245 в двух диапазонах концентраций отмечено увеличение токсичности на 30 % при уменьшении концентрации 2-хлорвиниларсиноксида. Показатель МТК 2-хлорвиниларсиноксида составляет 3,6x10"5, МИК 3,6x10"'° и 3,6х107 г/л (рис.1) Низкие показатели концентраций говорят о высокой токсичности исследуемого соединения, а два значения МИК о наличии парадоксального эффекта (увеличения токсичности при уменьшении концентрации действующего соединения). Такие зависимости, в которых присутствуют несколько максимумов ингибирования, называют парадоксальными, они уже известны в биологии (Криштопенко, 2001). Такой же эффект выявлен при действии этого соединения на проростки пшеницы.

кошроль -II -10 -9 -8 -7-6-5 -4 -3

Концентрация 2-хлорвиниларсиноксида,

Рис. 1. Зависимость оптической плотности суспензий клеток культуры А. brasilense 8р245 от концентрации 2-хлорвиниларсиноксида

Наибольшую устойчивость к мышьяксодержащим соединениям среди исследованных культур показали штаммы Р. ангео/ас/'ет Б81393 и А. ЬгазИете 8р245 (рис.2). Для Р. аигео/ааепх Б81393 МТК по арсениту натрия составила 0,08 г/л, он же характеризуется наиболее высокой устойчивостью к арсенату - 3,5 г/л. МТК арсенита для штамма А. Ьга&Непзе 8р245 составляет 0,18 г/л, токсичное действие арсената начинало проявляться при концентрации 1 г/л. В широком интервале концентраций арсенита натрия от 0,05 до 0,8 г/л величина оптической плотности суспензии клеток этих штаммов была выше в сравнении с тем же показателем двух других штаммов.

Некоторые продукты вторичного метаболизма микроорганизмов оказывают воздействие на растение и, попадая в него через корневую систему, активируют процессы роста и существенно влияют на обмен веществ во всем растительном организме. Это может иметь большое значение в процессах очистки почв методом фиторемедиации. Среди биологически активных веществ, продуцируемых микроорганизмами, важная роль принадлежит фитогор-

монам. Поэтому нами было исследовано влияние 2-хлорвиниларсиноксида и хлорвинилар-соновой кислоты на бактериальный синтез штаммом А. ЬгазНеюе Sp245 фитогормона - ин-долил-3-уксусной кислоты (рис. 3).

Рис. 2 Зависимость оптической плотности суспензий клеток культур от концентрации арсенита натрия

Рис. 3. Зависимость синтеза ИУК культурой А. ЬгаьИеше Sp245 от концентрации 2-хлорвиниларсиноксида

Концентрация 2-хлорвиниларсиноксида в образцах, г/л:

Полученные результаты не выявили пропорциональной зависимости бактериального синтеза ИУК и утилизации триптофана от концентрации 2-хлорвиниларсиноксида и 2-

хлорвиниларсоновой кислоты в растворе культуральной жидкости штамма А. ЬгахИспхс Sp245. Присутствие 2-хлорвиниларсиноксида в культуральной среде приводило к резкому понижению синтеза ИУК изучаемой культурой. Концентрации выше, чем 10"4 г/л, на 80 % по отношению к контрольному образцу ингибируют синтез ИУК В диапазоне концентраций г/л количество синтезированного фитогормона было меньше контрольного на 35-40 %. В случае добавления в культуральную среду 2-хлорвиниларсоновой кислоты ин-гибирование синтеза ИУК происходило при концентрациях выше, чем г/л.

Таким образом, данный штамм можно применять для стимуляции роста растений в процессах фиторемедиации почв, загрязненных солями мышьяка, при этом содержание 2-хлорвиниларсоновой кислоты в водно-почвенном экстракте не должно превышать 0,09x10'2 г/л, 2-хлорвиниларсиноксида-3,6х10"7 г/л.

Проведенные лабораторные исследования фитотоксичности арсенита натрия для подсолнечника и сорго показали, что 50 % ингибирование роста подсолнечника и сорго происходило при содержании мышьяка в почве 100 мг/кг. Однако всхожесть семян сорго была ниже, что может свидетельствовать о лучшей устойчивости подсолнечника.

С целью проверки влияния бактерий на рост растений в условиях загрязнения почвы арсенитом натрия исходные и плазмидосодержащие варианты ризосферных псевдомонад

использовали для инокуляции семян растений. На основании результатов лабораторных исследований были проведены микрополевые эксперименты.

Начальная концентрация мышьяка составляла 50 мг/кг сухой почвы. Наибольшей биомассой характеризовался подсолнечник, инокулированный исходным штаммом Р. аигео/ас/еги BS1393 - в 2,4 раза больше, чем масса контрольных растений, что согласуется с результатами, полученными в лабораторных условиях для этого же штамма (рис. 4А). Обработка растений плазмидосодержащими вариантами штаммов

оказывало положительное воздействие на рост подсолнечника по сравнению с контролем. В случае сорго все штаммы бактерий не только не оказывали стимулирующего действия на растения, но даже ингибировали их рост. При инокуляции семян штаммом Р. /¡иогехсет 38а (pBS3031) вес растений снижался н7945 % о сравнению с контролем.

В связи с возможным применением регуляторов роста вместе с растениями экзогенному воздействию подвергаются симбиотические и ассоциированные микроорганизмы корневой зоны. Учитывая это, мы провели эксперимент, в котором рассматривалось совместное действие различных штаммов бактерий и ИУК на биоаккумуляцию мышьяка растениями. После окончания эксперимента в растениях и образцах почвы было проанализировано со-

держание общего мышьяка и рассчитана степень извлечения его из почвы (рис. 4Б, табл. ]).

Рис. 4. Биомасса (А) и содержание мышьяка в растениях (Б) в зависимости от обработки различными штаммами и ИУК (Б)- 1 - Р. Аиогеясею 38а; 2 - Р. аигео/ааепз Б81393; 3 -Р. риПЛа 53а; 4- Р.риИЛа 53а(рБ83031); 5". т/Бо/^еЫ 3 9 3 (рБ83031); 6 -Р. Аиогейсеп* 38а (рБ83031); 7 -Контроль

Биоаккумуляция мышьяка подсолнечником, увеличивалась при инокуляции плазмидо-содержащим штаммом Р. /¡иогехеш 38а на 47±5 % по сравнению с контролем. Учитывая, что этот штамм стимулировал и рост биомассы в 2 раза, можно сделать вывод о целесообразности применения этого штамма в процессах ремедиации почв, загрязненных мышьяком Инокуляция сорго всеми штаммами, использованными в работе, увеличивала содержание мышьяка в растениях по сравнению с контролем, но, как было отмечено ранее, ингибировала рост растений

Высокая степень извлечения мышьяка при использовании штамма Р. аигео/ааеж и растений подсолнечника, с предварительной обработкой семян ИУК в концентрации 10'5 г/л позволяет использовать данный штамм в процессах ремедиации почв содержащих мышьяк.

Токсичность для Ьетпа рЬЬа солей мышьяка и влияние фосфатов на их биодоступность. При изучении токсичности солей мышьяка для высших водных растений была построена зависимость скорости роста культуры Ь. рЬЬа от концентрации А8(111) и лбсу) в питательном растворе и уровня ингибирования скорости роста (рис. 5).

Таблица 1

Степень извлечения мышьяка из почвы при обработке растений различными штаммами микроорганизмов.

Показатели ингибирования скорости роста, имеющие отрицательные значения, свидетельствовали о стимуляции роста L. gtbba, тогда как более чем 100 % ингибирование роста говорило о летальности используемых концентраций токсиканта. Картина токсичности As, показанная на рис 5, напоминает токсичность Cd для L. glbba (Wang, 1986). Низкая концентрация солей мышьяка (20 мкг/л) не влияла на скорость роста культуры. Арсенит в концентрации 50 мкг/л вызывал выраженное ингибирование скорости роста (более 100 %, ЕС50 31,6 мкг/л), арсенат в этой же концентрации значительно менее токсичен (ЕС50 48,7 мкг/л). При концентрации мышьяка 100 мкг/л токсичность арсенита снижалась вдвое, в то время как токсичность арсената увеличивалась, в результате чего эти соли мышьяка имели сходные показатели ингибирования скорости роста культуры. Дальнейшее увеличение концентрации до 250 мкг/л приводило к парадоксальному восстановлению контрольных показателей скорости роста ряски При концентрации 1000 мкг/л ингибирование составило более 150 % для арсената и чуть менее 100% для арсенита (рис. 5). Основном причиной этого могут служить различия в биодоступности разных форм мышьяка для растений и, соответственно, отличия в накоплении их в тканях растений В некоторых работах показано, что арсениты более токсичны для L. glbba, чем арсенаты (Neumann et al, 1998). Однако в работе Knauer (1999) отмечается, что As(V) проявляет более высокую токсичность в отношении водорослей, чем

Ак(111), что совпадает с результатами данного исследования при концентрации мышьяка 1000 мкг/л

Рис 5 Ингибирование скорости роста культуры Ь. &ЬЬа в зависимости от формы и концентрации мышьяка

Известно, что фосфат- и арсенат-ионы очень схожи по своим химическим свойствам и имеют близкие величины рКа (Song et al, 2002)

H3AsO„ pKal=2,19 pKa2=6,94 pKa3=ll,5 H3PO4 pKal=2,l pKa2=7,2 pKa3=12,3

В силу сходства химических и структурных свойств арсенат-ионы конкурируют с фосфат-ионами в питательном растворе Подобное конкурирующее поведение и определяет доступность мышьяка для растений, особенно в отсутствии в среде фосфат-ионов (Aracil et al, 2001, Meharg, Hartley-Whitaker, 2002) Когда Р04'3И As04"3 находятся в растворе, растения поглощают и мышьяк тоже (химическая мимикрия) Были проведены эксперименты по биодоступности мышьяка для L. gibba в условиях различного с о д е р ж аК^я в питательной среде(рис. 6)

Накопление мышьяка растениями ряски находилось в обратной корреляции с концентрацией фосфат-ионов в питательном растворе Более того, доступность солей мышьяка для растений ряски зависит не от их общей концентрации в среде культивирования, а от концентрации отдельных видов мышьяка, которые могут либо непосредственно взаимодействовать с L. gibba, либо превращаться в биодоступные виды

Рис 6 Аккумуляция мышьяка культурой Ь. ¡^ЬЬа в зависимости от содержания арсената и фосфата в питательной среде

Трансформация продуктов детоксикации иприта микроорганизмами и аккумуляция их растениями

Изучение токсичности продуктов гидролиза иприта для микроорганизмов. Штамм Р. puílda biovar А ШК1 был отобран в результате нескольких этапов селекции по скорости роста и устойчивости к лизису клеток при росте в среде с РМ иприта Количество вносимой в среду РМ оказывало влияние на ростовые характеристики штамма В диапазоне концентраций РМ от 0,5 до 3,0 % биомасса бактерий увеличивалась, оптическая плотность суспензии изменялась от 0,8 до 2,4, тогда как удельная скорость роста снижалась с 0,074 до 0,01 ч' и лаг-фаза удлинялась с 4 до 120 ч (рис 7) В этих условиях происходило снижение рН среды

Способность к росту в среде с РМ, а также МЭА и ЭГ, наряду со штаммом Р. pulida ШК1, была проверена еще у двух штаммов Al xylosoxydans - деструкторов тиодигликоля и 8 штаммов - деструкторов полициклических ароматических углеводородов Кроме

штамма ШК1 ни одна из этих культур не росла в средах с вышеуказанными источниками углерода, что свидетельствует об адаптации к ним селекционированного штамма

Рис. 7. Влияние концентрации РМ иприта на прирост биомассы, продолжительность лаг-фазы и максимальную удельную скорость роста Р. pulida ШК1,Н - продолжительность лаг-фазы, ч,О - максимальная плотность биомассы Aséomi

С целью выявления компонентов РМ, используемых бактериями в качестве источников углерода для роста, были проверены МЭА и ЭГ — компоненты дегазирующей смеси, содержание которых в РМ после детоксикации иприта в эксперименте соответствовало их содержанию в 1 % РМ. При внесении МЭА и ЭГ в период стационарной фазы культуры, выросшей в среде с РМ, рост возобновлялся. Этот факт свидетельствует о том, что именно эти субстраты в составе РМ в первую очередь используются бактериями как источники углерода.

Поскольку 1,4-пергидротиазины (ПГТ) составляют большую часть органической фазы РМ иприта, наше внимание было направлено на изучение возможности биодеструкции этих соединений.

Содержание каждого из идентифицированных 1,4-111Т в культуральной жидкости исследовалось в динамике роста культуры ШК1 в среде с 1 % РМ иприта. Контролем служила та же среда, которую инкубировали в подобных условиях, но без микробных клеток или с инактивированными клетками.

Результаты, представленные на рис. 8, показали, что в процессе культивирования штамма 1ПК1 происходило уменьшение площадей пиков каждого из производных 1,4-1 ПГТ: М-(2-гидроксиэтил)-1,4-пергидротиазин гидрохлорид (пик 1), М-(2-гидроксиэтил)-2-метил-1,4-пергидротиазин гидрохлорид (пик 2), М-(2-гидроксиэтил)-2,6-диметил-1,4-пергидротиазин гидрохлорид (пик 3); М-(2-гидроксиэтил)-3-метил-1,4-пергидротиазин гидро-

хлорид (пик 4), М-(2-гидроксиэтил)-2,5-диметил-1,4-пергидротиазин гидрохлорид (пик 5) Снижение общего количества этих компонентов достигало 50 % за период роста культуры В контрольном варианте изменения содержания ПГТ не наблюдалось Сравнение полученных результатов позволяет сделать вывод, что именно микроорганизмы являются ответственными за уменьшение содержания ПГТ в РМ

сутки роста

Рис 8 Изменение содержания 1,4-111 1 в среде 1 % РМ в динамике роста культуры Р.ртШ ШК1

Переход культуры в стационарную фазу при наличии достаточно высокой концентрации ПГТ в отсутствии накопления в культуральной жидкости и клетках веществ, ингиби-рующих рост, свидетельствует о том, что ПГТ не используются как источники углерода для роста, но происходит их трансформация растущими клетками Это предположение подтверждается результатами опытов, проведенных с использованием фракций, содержащих смесь 1.4-ПГТ в разных соотношениях. Снижение их концентрации на 86 - 96 % наблюдалось только в растущей культуре, где источниками углерода служили МЭА+ЭГ. В отсутствие этих косубстратов роста не было, содержание 1,4-ПГТ не изменялось.

Фиторемедиация почв, загрязненных реакционными массами иприта На основании результатов лабораторных экспериментов по определению токсичности РМ иприта для растений подсолнечника и сорго было установлено, что 50 % редуцирование роста растений происходит при концентрации РМ в почве 10 г/кг. Для изучения влияния почвенного микроорганизма-деструктора РМ ,Р. рпПда 1ПК1 на рост растений семена сорго инокулировали суточной культурой штамма и высаживали в почву, загрязненную РМ иприта в концентрации 4 г/кг (рис. 9)

7 14 21 28 35 42

сутки

Рис. 9. Влияние РМ иприта на рост сорго

В первую неделю эксперимента происходит сильное подавление роста растений, ино-кулированных штаммом ШК1 - на 56,9±5 % по сравнению с контролем и отмечен рост стебля в горизонтальном направлении, так называемый «стелющийся рост». Такой рост характерен для физиологического действия этилена, который является фитогормоном и в крайне малых концентрациях угнетает рост стебля в длину (Кулаева, 1998). К 5-й неделе различия по высоте растений вариантов с микроорганизмами и без практически исчезли, что может объясняться исчерпанием в почве компонентов РМ, используемых микроорганизмами для продуцирования этилена. Такими компонентами могут служить моноэтаноламин и этиленгли-коль. Для проверки предположения о деструкции компонентов РМ с выделением этилена и определения роли в этом процессе штамма были проведены анализы газовой

фазы при культивировании в закрытых сосудах. Результаты показали, что в обоих случаях присутствуют ненасыщенные низкомолекулярные углеводороды. Сравнение со стандартами позволило идентифицировать их как этилен и пропилен. Наибольшее количество этилена выделялось при культивировании культуры ШК1 в среде с добавлением МЭА и ЭГ под действием биогенных окислителей.

По окончании эксперимента определяли общее содержание органических соединений серы, которые находятся в РМ иприта (ПГТ и их производные). Общее содержание органических соединений серы уменьшается на 58 % в варианте с применением растений, инокули-рованных штаммом и только на 8 % в варианте с неинокулированными расте-

ниями (рис. 10).

Таким образом, штамм может использоваться при биоремедиации почв,

загрязненных РМ иприта. Инокуляция растений штаммом Р. pulida ШК1 значительно повышает их устойчивость к этому загрязнителю

Рис. 10 Хроматограммы образца почвы с РМ до биоремедиации (А) и после биореме-

диации (вариант: растения + Р. рмШаШКУ)

ВЫВОДЫ

1 Обоснована возможность использования биологических объектов - специально подобранных и селекционированных растений и микроорганизмов для очистки почв и водоемов от продуктов деструкции отравляющих веществ.

2 Впервые определен диапазон фитотоксичности и обнаружен эффект парадоксальной токсичности 2-хлорвиниларсиноксида. Области активации и угнетения роста колеоптиля пшеницы чередуются, концентрации Ю^-Ю10 мг/мл более токсичны, чем Ю'3-10*5 г/л.

3 Показано, что культура Ьетпа^ЬЬа накапливает мышьяк (V) и (Ш) до 1350 и 1220 мг/кг сухой биомассы растений соответственно, причем при высоких концентрациях (1000 мкг/л) арсенат более токсичен, чем арсенит. При ремедиации водоемов общая концентрация мышьяка не должна превышать 250 мкг/л.

4 Для культуры Аголр/пПит Ьгаи1еше 8р245 отмечено увеличение токсичности продукта 2-хлорвиниларсинокснда при уменьшении концентрации токсиканта, что обусловливает наличие двух пиков минимальной ингибирующей концентрации: при 3,6x10 и 3,6x10 г/л

5 Показано, что триптофанзависимый синтез индолил-3-уксусной кислоты бактериями АгозртНит Ьга$!1епье 8р245 ингибируется 2-хлорвиниларсоновой кислотой при концентрации выше 0,09х10': г/л и 2-хлорвиниларсиноксидом при концентрации выше 3,6x10"' г/л, что необходимо учитывать при применении данной культуры в процессе фитореме-диации почв, загрязненных этими продуктами.

6. Выделен штамм Pseudomonas putida ШК1, растущий в средах с реакционными массами иприта и устойчивый к лизису клеток в этих условиях. Этот штамм может использоваться для ремедиации загрязненных объектов.

7. Проведен анализ реакционной массы иприта и идентификация 1,4-пергидротиазинов. Установлено, что при культивировании клеток штамма Pseudomonas pulida ШК1 в средах, содержащих реакционные массы иприта, 1,4-пергидротиазины не используются в качестве источников углерода и энергии, но трансформируются растущей культурой.

8. Разработаны методические подходы с использованием микроорганизмов и растений для очистке почв, загрязненных продуктами деструкции иприта и люизита. Штамм

ШК1 в сочетании с растениями сорго может быть использован для биореме-диации почв, загрязненных продуктами разложения иприта, степень очистки почвы от серусодержащих соединений, достигает 55-60 %. Для почв, содержащих соединения мышьяка, наиболее эффективно использование растений подсолнечника, инокулирован-ных штаммом Pseudomonas aureofaciens BS1393 (степень извлечения мышьяка 6,2).

Список публикаций по теме диссертации

1. Пат. 2185901 РФ, МКИ В 09 С 1/00. Способ очистки почв, загрязнённых продуктами природного и техногенного разложения кожно-нарывных отравляющих веществ / В.В. Игнатов, Е.Е. Федоров, П.В. Костерин, А А. Щербаков, Е.А. Захарова, Е.В. Любунь, В.В. Брудник, Л.Ф. Щербакова, В.Г. Мандыч, А.В. Шантроха. Приоритет 20.08.2000 г.- 4 с.

2. Lyubun' Ye.V., Demidov О.М , Shantrokha A.V., Ivanov K.N., Shcherbakov A.A., Starovoitov 1.1., Ermakova I.T., Kosterin P.V., Shcherbakova L.F., Zakharova E.A., Fedorov E.E., Ignatov V.V. Transformation of mustard gas in environmental objects // Abstr. Seminar-Presentation of Sci. and Techn. Innovation Project "Biotechnology - 2000", Sept. 26-28, 2000, Pushchino, Rus-sia.-P. 169-170.

3. Шантроха А.В., Демидов О.М., Иванов К.Н., Любунь Е.В., Щербаков А.А. Методический подход к изучению процессов трансформации ОВ в объектах окружающей среды: Сб. науч. тр. «Утилизация и переработка отходов» / Под ред. Т.И. Губиной. - Саратов: Изд-во Сарат. гос. тех. ун-та, 2001. - С. 77- 80.

4. Lyubun Ye.V., Zakharova E.A., Shcherbakov A. A., Kosterin P.V., Kochetkov V.V., Sizova О I. Indirect phytoremediation of arsenic-containing compounds from soils // Abstr. ISEB Meeting "Phytoremediation", May 15-17,2001, Leipzig, Germany. - P. 93.

5. Lyubun Ye.V., Kosterin P.V., Boronin A.M., Starovoitov 1.1., Ermakova I.T., Shcherbakov A.A., Makarov O.E., Zakharova E.A., Brudnik V.V., Shcherbakova L.F., Ignatov V.V. Soil

phytoremediation from the mustard decomposition products: potential of rhizosphere microorganisms //Proc. Iя Europ. Bioremediation Conf., July 2-5, 2001, Chania, Greece.- P. 471-474.

6. Любунь Е В , Щербаков А. А , Костерин П.В., Федоров Е.Е., Щербакова Л.Ф. Оценка воздействия арсенита натрия на растения: Сб. науч. тр. Сарат. воен. ин-та радиац., хим. и биол. защиты. Ч. II. Биология, экология, медицина. - Саратов, 2002. - С. 65-69.

7. Щербаков А.А., Любунь Е.В., Кузнецов П.Е., Костерин П.В. Трансформация люизита в объектах окружающей среды. - Саратов: Научная книга, 2002. - 84 с.

8 Sizova O.I., Kochetkov V.V., Validov S.Z., Boronin A.M., Kosterin P.V.,. Lyubun Ye.V. Arsenic-contaminated soils. Genetically modified spp. and their arsenic-phytoremediation potential // JSS - J. Soils & Sediments. - 2002. - Vol. 2, № 1. - P. 19-23.

9. Lyubun Ye.V., Kosterin P.V, Zakharova E.A, Shcherbakov A.A, Fedorov E.E. Arsenic-contaminated soils. Phytotoxicity studies with sunflower and sorghum // JSS - J. Soils & Sediments 2002 - Vol. 2, № 3. - P. 143-147.

10. Lyubun Ye.V., Kosterin P.V., Ermakova IT., Kryuchkova Ye.V., Arefyeva O.A., Shcherbakov A.A. Biodegradation study ofthe products of industrial mustard-destruction // Abstr. ^"'Intern. Biodeterioration and Biodegradation Symp., July 14-18, 2002, Prague, Czech Republic. - P. 194.

11. Lyubun Ye.V., Shcherbakova M.A., Fedorov E.E., Skorobogatova V.I., ZIobin V.A., Nazarov G.V., Kuznetsov P.E., Shcherbakov A.A. Lewsite transformation in sediments and dredged material // Abstr. Workshop "Chemical Analysis and Risk Assessment of Emerging Contaminants in Sediments and Dredged Material", Nov. 28-30,2002, Barcelona, Spain. - P. 189.

12. Lyubun Ye.V., Kryuchkova Ye.V., Ermakova I.T., Makarov O.E., Starovoitov 11., Shcherbakov A.A Use of rhizospheric microorganisms to detoxify sulfur- and chlorine-containing xenobiot-ics // Abstr. Intern. Symp. "Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Tech-nogenic Environmental Pollutants", July 28-30, 2003, Saratov, Russia. - P. 24-25.

13. Любунь Е.В., Крючкова Е.В., Фёдоров Е.Е., Щербаков A.A. Фиторемедиация почв, загрязнённых мышьяксодержащими соединениями: Сб. науч. тр. «Высокие технологии -путь к прогрессу». - Саратов: Научная книга, 2003. - С. 73-76.

14. Ермакова И.Т., Старовойтов И.И., Любунь Е.В., Щербаков А.А., Макаров О.Е., Воронин A.M. Микробиологическая деградация органических компонентов реакционных масс иприта // Тез докл. на Семинаре-презентации инновационных науч -техн. проектов "Биотехнология ~ 2003", 24-25 ноября, 2003, Пущино, Россия. - С. 105-106

15. Mkandawire M., Lyubun Ye.V., Kosterin P.V., Dudel E.G. Toxicity ofarsenic species to Lemnct

L. and the influence of phosphate on arsenic bioavailability // Environ. Toxicology. -2004. - Vol. 19, № 1. - P. 26-34.

16. Lyubun Ye V., Kryuchkova Ye V., Ermakova I.T., Makarov O.E., Shcherbakov A.A. Assessing the possibility of bioremediation of soils polluted by perhydrothiazines // Abstr. 3"1 Workshop "Monitoring sediment quality at river basin scale", 29-31 Jan , 2004, Lisbon, Portugal.-P. 21.

17. Sizova O.I., Lyubun Ye.V., Kochetkov V.V., Validov S.Z., Boronin F.M. Effect of wild and genetically modified rhizosphere bacteria Pseudomonas aureofaciens on the accumulation of arsenic by plants // Прикл. биохим.и микробиол. - 2004. - Vol. 40, № 1. - P. 78-82.

18 Ермакова И Т., Старовойтов ИИ., Любунь Е.В., Щербаков А.А, Макаров О.Е., Петрова А.А., Шпильков П.А. Микробиологическая деградация реакционных масс иприта. 1. Выделение и селекция микроорганизмов-деструкторов, анализ органических компонентов реакционных масс и их биодеструкция // Микробиология. — 2004. - № 3. - С. 358-363.

19. Любунь Е.В. Влияние продуктов гидролиза люизита на бактериальный синтез индолил-3-уксусной кислоты штаммом A. brasilense Sp245 II Материалы науч. конф. «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», 17-18 июня, 2004, Казань, Россия. - С . 52.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность научным руководителям данной работы А.А. Щербакову и И.Т. Ермаковой за постоянное внимание, консультации и плодотворное обсуждение этапов работы. Благодарю моих коллег, в соавторстве с которыми были выполнены отдельные части работы, - Е.Е. Федорова, О.Е. Макарова, П.В. Костерина (ИБФРМ РАН), И И. Старовойтова, В В. Кочеткова, О.И. Сизову (ИБФМ РАН), Г. Дуделя, М. Мкан-давире, А. Вайске (Институт общей экологии и охраны окружающей среды, Технический университет Дрездена, Германия). Очень признательна сотрудникам Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты за предоставленную материально-техническую базу и помощь в идентификации соединений - С.А. Конешову, И.В. Егорову, Н В. Сотникову. Благодарю за глубокое и тщательное рецензирование работы профессора О.В. Турковскую, профессора Т.И. Губину и д.б н О.В. Игнатова. Выражаю искреннюю признательность М.П. Чернышовой и А.Ю. Муратовой за дружескую поддержку и помощь в оформлении работы

123 О 3 3

Подписано в печать 11.11.2004 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать RISO. Объем 1,0 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ № 328.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 304645506500043 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Любунь, Елена Валентиновна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Трансформация люизита (2-хлорвинилдихлорарсина) и продуктов его деструкции в объектах окружающей среды.

1.1. Характеристика объектов, подверженных воздействию ксенобиотиков.

1.2. Основные характеристики люизита и продуктов его деструкции. 13 'ф 1.3. Механизмы токсичного действия мышьяксодержащих соединений

1.4. Фитотоксичность и трансформация соединений мышьяка в растениях

1.5. Влияние соединений мышьяка на почвенные микроорганизмы.

2. Трансформация иприта (2,2'-дихлордиэтилсульфида) и продуктов его деструкции в объектах окружающей среды.

2.1. Трансформация 2,2-дихлордиэтилсульфида в воде и почве.

2.2. Трансформация 2,2'-дихлордиэтилсульфида под действием микроорганизмов.

2.3. Трансформация 2,2-дихлордиэтилсульфида в растениях.

3. Биоремедиация как способ очистки почв и водоемов от токсичных загрязнителей.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4. Материалы и методы исследования.

4.1. Объекты исследования.

4.2. Выделение микроорганизмов деструкторов реакционных масс 43 иприта

4.3. Культивирование микроорганизмов.

4.4. Культивирование культуры Lemnagibba.

4.5. Определение устойчивости изучаемых микроорганизмов к продуктам гидролиза люизита

4.6. Оценка фитотоксичности соединений мышьяка.

4.7. Подготовка и проведение экспериментов по биоремедиации почв, загрязненных продуктами деструкции люизита и иприта.

4.8. Анализ состава органических компонентов реакционных масс 50 иприта

4.9. Определение индольных производных.

4.10. Определение содержания мышьяка и фосфора в растительных, 51 почвенных и водных образцах. Пробоподготовка.

4.11. Статистический анализ. ф 5. Полученные результаты и их обсуждение.

5.1. Оценка воздействия продуктов трансформации 2хлорвинилдихлорарсина на растения и микроорганизмы.

5.1.1. Особенности влияния мышьяка на рост бактерий и синтез индо-лил-3 -уксусной кислоты.

5.1.2. Оценка токсичности 2-хлорвиниларсиноксида для растений.

5.1.3. Исследование фитотоксичности арсенита натрия. Лабораторные и микрополевые исследования.

5.1.4. Токсичность различных форм мышьяка для Ьетпа %1ЪЪа и влияф ние фосфатов на биодоступность солей мышьяка.

5.2. Трансформация продуктов детоксикации 2,2'дихлордиэтилсульфида микроорганизмами и аккумуляция их растениями.

5.2.1. Изучение токсичности продуктов гидролиза иприта для микроорганизмов

5.2.2. Изучение возможности деструкции продуктов гидролиза иприта селекционированными культурами бактерий.

5.2.3. Фиторемедиация почв загрязненных реакционными массами ип

С(Ц рита.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические подходы к очистке почв и водоемов, загрязненных продуктами деструкции иприта и люизита"

Актуальность работы

В настоящее время в связи с катастрофическими масштабами антропогенного загрязнения окружающей среды чрезвычайно большое значение для прогнозирования развития возможных критических экологических ситуаций приобретает информация о действии экотоксикантов и продуктов их трансформации в микробно-растительных сообществах среды обитания.

Процессы распространения и воздействия загрязняющих веществ являются сложными, они изучены ещё недостаточно, чтобы надежно прогнозировать опасность в тех или иных случаях. В соответствии с Конвенцией «О запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и его уничтожении» и Федеральной целевой программой «Уничтожение запасов химического оружия в РФ» наша страна проводит переработку отравляющих веществ кожно-нарывного действия: иприта, люизита, ипритно-люизитных смесей, на первом этапе которой производится их химическая де-токсикация, на втором - уничтожение полученных реакционных масс.

Одной из важнейших экологических проблем является очистка и восстановление территорий, которые могут быть загрязнены отравляющими веществами или продуктами их детоксикации в местах хранения, транспортировки и уничтожения в результате возможных утечек, аварийных выбросов и т.д. В настоящее время наряду с физическими и физико-химическими способами детоксикации отходов, разрабатываются подходы для их биоремедиации с использованием микроорганизмов и растительно-микробных ассоциаций. Экотоксикан-ты могут вступать во взаимодействие с природными веществами, поглощаться и преобразовываться ими, влиять на функционирование живых организмов.

Токсическое действие различных соединений может не только подавлять жизнеспособность микроорганизмов, но и вызывать их метаболическую адаптацию к новым условиям существования. Концентрация продуктов разложения отравляющих веществ может оказать решающее значение на их трансформа

ЦС\ 6 цшо той или иной ферментной системой клетки и^биоаккумуляцию. Такие cвe-V дения в научной литературе весьма ограничены. Известно, что многие соединения, образующиеся при гидролизе и окислении иприта (2,2-дихлордиэтилсульфида) токсичны, а некоторые сульфониевые соединения по токсичности превосходят исходное отравляющее (Александров, 1990; Федоров, 1997).

Влияние токсических концентраций продуктов деструкции иприта и люизита на почвенные микроорганизмы, растения и растительно-микробные ассоциации практически не исследованы, несмотря на то, что такие исследования необходимы для разработки критериев оценки вредного действия экотоксикан-тов и создания методов и технологий очистки окружающей среды.

Целью работы являлось исследование почвенных микроорганизмов и рас1 тений при воздействии продуктов деструкции иприта и люизита и разработка методических подходов для биоремедиации загрязненных почв и водоемов.

В рамках поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Исследование диапазона токсичности мышьяк- и серусодержащих продуктов трансформации иприта и люизита для некоторых почвенных микроорганизмов и растений.

2. Оценка влияния мышьяксодержащих соединений на триптофанзависимый синтез индолил-3-уксусной кислоты штаммом АтяртИит Ъга$Иете Бр 245.

3. Изучение возможности биодеструкции продуктов первой стадии нейтрализации иприта микроорганизмами.

4. Подбор условий для ремедиации почв, загрязненных продуктами трансформации иприта и люизита с использованием растительно-микробных сообществ.

Научная новизна

• Показана возможность ремедиации почв, загрязненных продуктами деструкции кожно-нарывных отравляющих веществ - иприта и люизита, специально подобранными растениями и микроорганизмами.

• Установлен диапазон токсичности мышьякорганических продуктов нейтрализации люизита и реакционных масс иприта для некоторых растений и почвенных микроорганизмов.

• Впервые обнаружена способность микроорганизмов рода Pseudomonas подвергать биодеструкции 1,4-пергидротиазины^^еакционных массах иприта, которые являются их основными компонентами, образующимися в процессе детоксикации иприта. Показано, что интродукция этих микроорганизмов в почву в значительной степени увеличивает эффективность биоремедиации.

• По результатам лабораторных и микрополевых экспериментов показана возможность и даны рекомендации по использованию штаммов Р. aureofa-ciens BS 1393 и А. brasilense Sp 245 в процессе фиторемедиации почв, загрязненных продуктами трансформации люизита.

Практическая значимость

Результаты проведенных исследований являются основой для разработки нового способа очистки почв, загрязнённых продуктами природного и техногенного разложения кожно-нарывных отравляющих веществ - фиторемедиации (Пат. РФ №2185901).

Использование подобранных видов растений с инокуляцией их селекцио-нироваными штаммами микроорганизмов является основой для разработки метода биоремедиации почв, загрязненных продуктами трансформации кожно-нарывных отравляющих веществ - иприта и люизита.

Основные положения, выносимые на защиту

• Растения подсолнечника (сорт Юбилейный 60) и сорго (сорт Волжский 4) устойчивы к высоким концентрациям арсенита натрия (10 ПДК) и способны аккумулировать этот токсикант из загрязненной почвы. Степень извлечении мышьяка значительно возрастает при инокуляции их клетками бактериального ризосферного штамма Р. aureofaciens BS 1393.

• Продукты гидролиза люизита (2-хлорвиниларсиноксид и 2-хлорвиниларсоновая кислота) ингибируют триптофанзависимый синтез ИУК штамма Azospirillum brasilense Sp 245: 2-хлорвиниларсиноксид на 80 % при У концентрации 10"6 г/л, 2-хлорвиниларсоновая кислота на 75 % при концентрациях 10" г/л.

• Идентифицированные производные 1,4-пергидротиазина, являющиеся продуктами детоксикации иприта, подвергаются трансформации клетками селекционированного штамма бактерий Pseudomonas putida ШК1 при росте в среде с реакционными массами иприта.

• Степень очистки почв от серусодержащих продуктов деструкции иприта рас-♦ тенями сорго (сорт Волжский 4) значительно увеличивается при инокуляции семян клетками штамма Pseudomonas putida ШК1.

• Результаты экспериментов по извлечению продуктов деструкции люизита и иприта из загрязненных ими почв при совместном использовании растений и микроорганизмов могут быть использованы для разработки методов биореме диации таких почв.

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (Саратов) в лаборатории структурных методов исследования в рамках научно-исследовательской работы «Изучение воздействия антро-^ погенных загрязнителей на окружающую среду» (№ гос. регистрации

01200119220), на базе Саратовского военного института радиационной химической и биологической защиты, в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино) по проекту «Биотехнология защиты окружающей среды от антропогенных загрязнений» Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения», в Институте общей экологии и защиты окружающей среды (Технический университет Дрездена, Германия). Апробация работы ш т Основные результаты работы докладывались на Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2000» (Пущино, 2000), на 1-й Европейской конференции по биоремедиации (Ханья, Греция, 2001), на митинге по фиторемедиации ISEB (Лейпциг, Германия, 2001), на 12-м Международном симпозиуме по биодеградации и биоразрушению (Прага, Чехия, 2002), на Международном семинаре по химическому анализу и оценке риска загрязнений в осадках и донных отложениях (Барселона, Испания, 2002), на 1-й региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2002), на семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнология-2003" (Пущино, 2003), на Международном симпозиуме «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (Саратов, 2003), на конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004).

Публикации

По теме диссертации получен патент РФ № 2185901, опубликовано 18 работ, из них 5 статей в российских и зарубежных реферируемых научных журналах.

Структура диссертации

Работа состоит из обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов собственных исследований, и завершается заключением, выводами и библиографическим указателем, содержащим 176 источников. Общий объем диссертации составляет 123 страницы. Текст иллюстрирован 16 таблицами и 28 рисунками.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Любунь, Елена Валентиновна

выводы

1. Обоснована возможность использования биологических объектов - специально подобранных и селекционированных растений и микроорганизмов для очистки почв и водоемов от продуктов деструкции отравляющих веществ.

2. Впервые определен диапазон фитотоксичности и обнаружен эффект парадоксальной токсичности 2-хлорвиниларсиноксида. Области активации и угнетения роста колеоптиля пшеницы чередуются, концентрации 10"6-10"10 с мг/мл более токсичны, чем 10-10° г/л.

3. Показано, что культура Lemna gibba накапливает мышьяк (V) и (III) до 1350 и 1220 мг/кг сухой биомассы растений соответственно, причем при высоких концентрациях (1000 мкг/л) арсенат более токсичен, чем арсенит. При реме-диации водоемов общая концентрация мышьяка не должна превышать 250 мкг/л.

4. Для культуры Azospirillum brasilense Sp 245 отмечено увеличение токсичности продукта 2-хлорвиниларсиноксида при уменьшении концентрации токсиканта, что обусловливает наличие двух пиков минимальной ингибирую

10 7 щей концентрации: при 3,6x10" и 3,6x10" г/л.

5. Показано, что триптофанзависимый синтез индолил-3-уксусной кислоты бактериями Azospirillum brasilense Sp 245 ингибируется 2-хлорвиниларсоновой кислотой при концентрации выше 0,09x10"2 г/л и 2п хлорвиниларсиноксидом при концентрации выше 3,6x10" г/л, что необходимо учитывать при применении данной культуры в процессе фиторемедиа-ции почв, загрязненных этими продуктами.

6. Выделен штамм Pseudomonas putida ШК1, растущий в средах с реакционными массами иприта и устойчивый к лизису клеток в этих условиях. Этот штамм может использоваться для ремедиации загрязненных объектов.

7. Проведен анализ реакционной массы иприта и идентификация 1,4-пергидротиазинов. Установлено, что при культивировании клеток штамма Pseudomonas putida ШК1 в средах, содержащих реакционные массы иприта,

1,4-пергидротиазины не используются в качестве источников углерода и энергии, но трансформируются растущей культурой.

8. Разработаны методические подходы с использованием микроорганизмов и растений для очистке почв, загрязненных продуктами деструкции иприта и люизита. Штамм Pseudomonas putida ШК1 в сочетании с растениями сорго может быть использован для биоремедиации почв, загрязненных продуктами разложения иприта, степень очистки почвы от серусодержащих соединений, достигает 55-60 %. Для почв, содержащих соединения мышьяка, наиболее эффективно использование растений подсолнечника, инокулированных штаммом Pseudomonas aureofaciens BS 1393 (степень извлечения мышьяка 6,2).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Осуществление всестороннего контроля за состоянием окружающей среды и проведение при необходимости мероприятий по очистке её объектов обеспечивает одну из важных сторон «качества жизни» для населения. В окружающей среде происходит детоксикация многих органических загрязнений, она сорбирует тяжелые металлы и радионуклиды и заслуженно называется «экологическим щитом биосферы».

Попадание в почвы иприта и люизита происходило в период окончания Второй мировой войны, продолжалось в последующее время - при хранении и уничтожении запасов OB, оно возможно и сейчас при аварийных ситуациях в местах их хранения и переработки или при транспортировке. Кроме того, накопление в почвах соединений мышьяка обусловлено широким применением в прошлом мышьяксодержащих пестицидов, выбросами различных предприятий, наличием огромного количества отвалов горнорудной промышленности и т.д. Поэтому необходимость адекватных методов оценки токсичности и способов обеззараживания почв, загрязненных упомянутыми веществами и продуктами их трансформации, совершенно очевидна.

Для решения поставленной задачи необходимо было изучить диапазон токсичности и ответные реакции растений и почвенных микроорганизмов на воздействие продуктов деструкции иприта и люизита, исследовать возможность и пути биодеградации РМ иприта, а также определить роль биологических компонентов окружающей среды, а именно микроорганизмов и растений, в очистке от этих соединений.

Изучалась возможность биодеструкции пергидротиазинов в составе РМ иприта выделенными и селекционированными в процессе выполнения работы бактериями Pseudomonas putida ШК1. Проведена идентификация и анализ пергидротиазинов РМ иприта, которые являются ее основными компонентами. Показано, что при росте в средах с РМ иприта культура использует компоненты дегазирующей смеси моноэтаноламин и этиленгликоль в качестве источников углерода, одновременно осуществляя трансформацию пергидротиазинов. При наличии достаточного количества биоутилизируемых источников углерода для роста степень деструкции может достигать 96 %. Продукты трансформации не токсичны для клеток изучаемого штамма. Данные анализа газовой фазы при культивировании штамма P. putida ШК1 в средах с РМ иприта показывают присутствие этилена и пропилена. Этилен имеет гормональную природу и стимулирует рост и развитие боковых корней растений (Гудвин, 1986). Одним из возможных путей деструкции пергидротиазинов является образование суль-фоксида тиоморфолина и после раскрытия цикла тиодигликолевой кислоты. Аналогичным образом идет биодеструкция тиоморфолинов культурой Mycobacterium aurum MOl (Delort and Combourieu, 2001).

Для изучения возможности фиторемедиационного способа очистки почв, загрязненных РМ иприта, были выбраны растения подсолнечника и сорго, устойчивые к этим токсикантам, определен оптимальный диапазон концентраций для их роста. Редуцирование роста растений на 50 % происходит при концентрации РМ в почве 10 г/кг. Инокуляция растений клетками штамма P. putida ШК1 повышает устойчивость растений к загрязнению и позволяет уменьшить содержание в почве органических соединений серы, основных компонентов РМ иприта, на 58 % по сравнению с уменьшением на 8 % в контроле с неинокули-рованными растениями. Полученные экспериментальные данные являются основой при разработке способа биоремедиации почв, загрязненных продуктами гидролиза иприта.

Для выяснения токсичности продуктов гидролиза люизита и возможности ремедиации объектов окружающей среды, был произведен отбор штаммов микроорганизмов и растений, устойчивых к разным формам мышьяка. В работе использовались как природные, так и содержащие плазмиду устойчивости к мышьяку штаммы ризосферных бактерий, которые стимулируют рост растений, являются продуцентами фитогормонов в количествах, обладающих в ризосфере физиологической активностью, и некоторые их них имеют высокую антагонистическую активность по отношению к широкому кругу фитопатогенных грибов и бактерий (Воронин, 1998). Анализ полученных данных позволил количественно оценить разницу в устойчивости природных бактериальных культур к использовавшимся соединениям мышьяка по величинам МИК и МТК. Для всех изученных штаммов арсенит значительно токсичнее арсената, самая высокая устойчивость отмечена для штаммов Р.аигео/аает В81393 и А.ЬгаяИете Бр 245.

Некоторые продукты вторичного метаболизма микроорганизмов оказывают воздействие на растение и существенно влияют на обмен веществ во всем растительном организме. Это может играть одну из важных ролей в процессах очистки почв методом фиторемедиации. Присутствие 2-хлорвиниларсиноксида в культуральной среде приводит к резкому понижению синтеза ИУК культурой АгоэртЦит ЬгазИете Бр 245. Наиболее сильно ингибируют синтез ИУК концентрации выше, чем 10"6 г/л - на 80 % по отношению к контрольному образцу, не содержащему 2-хлорвиниларсиноксид. При добавлении в культуральную среду 2-хлорвиниларсоновой кислоты ингибирование синтеза ИУК происходит А при концентрациях выше 0,09x10 г/л.

Установлен ярко выраженный токсический эффект 2-хлорвиниларсиноксида для культуры АюяртИит ЬгаБИете 8р 245 и проростков пшеницы, причем отмечено увеличение токсичности при уменьшении концентрации действующего соединения. Это может быть связано с тем, что, ввиду высокой токсичности 2-хлорвиниларсиноксида, с некоторым отставанием включаются защитные, компенсаторные, детоксицирующие системы, снижающие действующую дозу до определенного уровня, после чего доза опять начинает закономерно возрастать (Крипггопенко, 2001). Аналогичный эффект обнаружен при действии арсенита и арсената натрия на культуру Ьетпа фЬЪа Ь.

С целью изучения токсичности различных форм мышьяка (трёх- и пятивалентного) для водных растений в качестве объекта исследования использовали ряску Ь. gibba Ь. В отличие от описанного ранее (Кешпапп et а1., 1998) обнаружено, что при некоторых концентрациях арсенат более токсичен для Ь. gibba Ь., чем арсенит. Так, при концентрации 1000 мкг/л арсенат летален, в то время как арсенит ингибирует рост растений на 95 %. При изучении биодоступности ар-сенита и арсената обнаружено, что она значительно выше для Р-дефицитных (0,98 ±0.08 и 1,09±0.19 г/кг для 0,0136 мг/л Р04"3, соответственно), чем для культур с достаточным содержанием фосфора в среде (243 и 343 мг/кг для 40 л мг/л PCV , соответственно). Изменение токсичности возможно при взаимопревращении химических форм мышьяка, например, в результате окисления As(III) до^ОО в богатой кислородом окружающей среде (Meharg, Hartley-Whitaker, 2002).

Данные лабораторных экспериментов и микрополевых испытаний показали, что растения подсолнечника, обработанные штаммом P.aureofaciens BS1393 и ИУК в концентрации 10"5 г/л наиболее эффективны в процессе очистки почв, загрязненных продуктами щелочного гидролиза люизита (степень извлечения мышьяка 6,2).

Полученные результаты совершенно очевидно показывают, что высокая эффективность ремедиации объектов окружающей среды, загрязненных продуктами деструкции кожно-нарывных ОВ, может быть достигнута путем комплексного применения растений, устойчивых к высоким концентрациям токсикантов в почве и способных к их аккумуляции, с одной стороны, и интродукцией микроорганизмов-деструкторов органических компонентов РМ иприта или устойчивых к мышьяку ризосферных бактерий, стимулирующих рост растений, с другой.

Применение биологических методов для санации загрязненных почв выгодно отличается от других отсутствием вторичных отходов, высокой степенью минерализации поллютантов в объектах окружающей среды, возможностью полной ассимиляции продуктов биодеградации органических соединений и, следовательно, чистотой процесса. Учитывая то обстоятельство, что стоимость очистки почв биологическими методами в сотни раз меньше, чем при использовании других, биотехнологические методы в настоящее время являются высоко перспективными.

Наши исследования закладывают основу для разработки новых критериев оценки и прогноза ответных реакций биологических систем на различные загрязнения окружающей среды. Экспериментальные данные позволили предложить и запатентовать способ очистки почв, загрязненных продуктами гидролиза иприта и люизита, с помощью растений, обработанных раствором ИУК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Любунь, Елена Валентиновна, Саратов

1. Александров В.Н., Емельянов В.И. Отравляющие вещества. М.: Воениздат, 1990.-271 с.

2. Альберт Э. Избирательная токсичность. М.: Мир, 1971.-431 с.

3. Берне Ф., Кордонье Ж. Водоочистка. Очистка сточных вод нефтепереработки. Подготовка водных систем охлаждения. М.: Химия, 1997.

4. Беспамятнов Г.П., Кротов Ю.А. Предельно-допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. Л.: Химия, 1985. - 528 с.

5. Биотехнология. Принципы и применение / Под ред. И. Хагинса, Д. Беста, Дж. Джонса. М.: Мир, 1988. - 479 с.

6. Ф 8. Воронин A.M., Сахаровский В.Г., Старовойтов И.И. и др. Научные основыкомплексной экологически безопасной технологии уничтожения иприта // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. - Т. 32, № 1. - С. 61-68.

7. Воронин A.M., Сахаровский В.Г., Кашпаров К.И. и др. Комплексный подход к утилизации люизита // Прикл. биохим. и микробиол. -1996. Т. 32, № 2. -С. 211-218.

8. Вредные химические вещества. Азотсодержащие органические соединения: Справ, изд. / Под ред. Б.А. Курляндского и др. Л.: Химия, 1992.

9. Временные методические рекомендации по контролю загрязнений почв. -М.: Гидрометеоиздат, 1983.

10. Гаврилова И.П., Побединцева И.Г. Тяжелые металлы в почвах и растениях горных лесных ландшафтов Южного Урала // 2-я Всесоюз. конф. «Тяжелые металлы в окружающей среде и охрана природы»: Тез. докл. М., 1988. - С. 72-76.

11. Гамаюрова B.C. Мышьяк в экологии и биологии. М.: Наука, 1993. - 208 с.

12. Гормай В.В., Шаповалов В.Н., Шантроха A.B. и др. Проблема уничтожения и утилизации адамсита // Журн. рос. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1994. -Т. 38, №2.-С. 39-42.

13. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений: В 2-х т. / Пер с англ. -М.: Мир, 1986.-Т. 2.

14. Гузеев B.C., Левин C.B., Бабьева И.П. Тяжелые металлы как фактор воздействия на микробную систему почв // Экологическая роль микробных метаболитов. -М., 1986. С. 82-104.

15. Гусарова Н.К., Трофимов Б.А., Ефремова Г.Г., Амосова C.B. Дивинилсуль-фоксид. V. Основно-каталитическое присоединение спиртов и термолиз продуктов // Журн. орг. химии. -1981. Т. 17. - С. 2272-2277.

16. Гусарова Н.К., Ефремова Г.Г., Бабкин В.А. и др. Реакция дивинилсульфок-сида с триэтиламином в присутствии кислот // Журн. орг. химии. 1978. - Т. 14. - С. 2009-2012.

17. Дворский М.С. Экология растений. М.: Высшая школа, 1983. - 190 с.

18. Иванова А.Б., Анцыгина Л.Л., Ярин А.Ю. Современные аспекты изучения фитогормонов // Цитология. 1999. - Т. 41. - С. 845-846.

19. Кабата-Пендиас А., Пендиас X. Микроэлементы в почвах и растениях. М.: Мир, 1989.-439 с.

20. Коваль И.В. Сульфиды в органическом синтезе. Применение сульфидов // Успехи химии. 1994. - Т. 63. № 2. - С. 154-176.

21. Кошелев В.Ь., Жданов В.А., Шувалов A.A., Кравчук Ф.Е., Кошелев Ю.П., Евменов Р.Л. Американские разработки методов уничтожения химического оружия // Росс. хим. журн. 1995. - T. XXXIX, № 4. - С. 31-36.

22. Крапивина С.А. Плазмохимические технологические процессы. Л.: Химия, 1981.- 148 с.

23. Криштопенко C.B., Тихонов М.С., Попова Е.Б. Парадоксальная токсичность.- Нижний Новгород: Изд-во Нижегород. гос. акад., 2001. С. 164.

24. Контроль химических и биологических параметров окружающей среды // Энциклопедия "Экометрия". Сер. справ, изд. / Под ред. проф. Л.К. Исакова.- СПб: Экол.-аналит. информ. центр «Союз», 1998. 896 с.

25. Кулаева О.Н. Этилен в жизни растений // Сорос, образоват. журн. 1998. -№11.-С. 78-84.

26. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-477 с.

27. Машкина A.B. Химия сераорганических соединений, содержащихся в неф-тях и нефтепродуктах. М.: Высшая школа, 1972. - Т. 2. - 301 с.

28. Микроорганизмы и охрана почв / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1989. - 206 с.

29. Микрякова Т.Ф. Распределение тяжелых металлов в высших водных растениях Угличского водохранилища // Экология 1994. - № 1. - С. 16-21.

30. Мордухова Е.А., Кочетков В.В., Поликарпова Ф.Я., Воронин A.M. Синтез индолил-3-уксусной кислоты ризосферными псевдомонадами: влияние плазмид биодеградации нафталина // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. -Т. 34, №3,-С. 287-292.

31. Мотузова Г.В. Мышьяк в почвах // Агрохимия. 1981. - № 1. - С. 148-154.

32. Орлов Д.С. Химия почв: Учебник. 2-е изд., перераб. и доп. - М: Изд-во1. Моск. ун-та, 1992. 400 с.

33. Пат. 4236464 США, МКИ3 F 23 G 7/04.

34. Петров C.B. Экспертная оценка технологий уничтожения запасов люизита // Росс. хим. журн. 1995. - T. XXXIX, № 4. - С. 4-5.

35. Петрова Т.Н. Лабораторные занятия по физиологии растений с основами биохимии. Саратов, 1994. - 152 с.

36. Пименов Е.В., Дармов И.В., Погорельский И.П. Выделение и характеристика штаммов бактерий, резистентных к соединениям мышьяка // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 2. - С. 214-218.

37. Пичугин A.A., Тарасов В.В. Перспективы использования суперкритической экстракции для создания бессточных технологических процессов // Успехи химии. 1991. - Т. 60, вып. 11. - С. 2412-2421.

38. Подольская В.И., Грузина Т.Г., Ульберг З.Р., Соколовская A.C., Гршценко Н.И. Особенности влияния мышьяка на рост бактерий и АТФазную активность плазматических мембран // Прикл. биохим. и микробиол. 2002. - Т. 38, №1,-С. 57-62.1.l

39. Почвоведение / Под ред. И.С. Кауричева. М.: Колос, 1982. - 495 с.

40. Радов A.C., Пустовой И.В., Корольков A.B. Практикум по агрохимии / Под ред. И.В. Пустового. 4-е изд. -М: Агропромиздат, 1985. - 312 с.

41. Ремезов Н.П. Почвы их свойства и распространение. М.: Учпедгиз, 1952. -267 с.

42. Руководство по химическому анализу поверхностных вод суши / Под ред. А.Д. Семенова. Л.: Гидрометеоиздат, 1977.

43. Савин Ю.И., Вишенкова Е.М., Пасынкова Е.М. Исследование поведения иприта и люизита в воде и почве при условиях, имитирующих их природные среды // Росс. хим. журн. 1995. - Т. XXXIX, № 4. - С. 121-125.

44. Сборник санитарно-гигиенических нормативов и методов контроля вредных веществ в объектах окружающей среды. М., 1991.

45. Справочник по гидрохимии / Под ред. A.M. Никанорова. Л.: Гидрометеоиздат, 1988.

46. Степанов А.И., Гехман А.Е., Рамендик Г.И., Нефедов В.И. Исследование взаимодействия продуктов гидролиза а-люизита с алкандитиолами // Росс, хим. журн. 1995. - Т. XXXIX, № 4. - С. 27-31.

47. Трофимов Б.А., Гусарова Н.К., Ефремова Г.Г. и др. Дивинилсульфоксид. I. Взаимодействие с тиолами // Журн. орг. химии. 1980. - Т. 16, вып. 12. - С. 2538-2543.

48. Трофимов Б.А., Гусарова Н.К., Ефремова Г.Г. Дивинилсульфоксид. IV. Взаимодействие с аминами // Журн. орг. химии. 1981. - Т. 17, № 9. - С. 1984-1989.

49. Федин Э.П. Цветы побеждают // Изобретатель и рационализатор.-1998.-№ 6.-С.5.

50. Федоров Л.П. О химическом разоружении с человеческим лицом // Хим. оружие и проблемы его уничтожения. 1997. - № 3. - С. 15-19.

51. Харечко А.Т., Мягких В.И., Остроумов Ю.И. и др. Применение микроорганизмов для деструкции опасных веществ, загрязняющих окружающую среду // Росс. хим. журн. 1993. - Т. XXXVII, № 3. - С. 40-43.

52. Шляхтин Г.В., Рембовский В.Р., Хохоев Т.Х. и др. Реакция растений и животных природных экосистем на воздействие люизита // Росс. хим. журн. -1993.-Т. XXXVII, № 3. С. 108-113.

53. Щербаков А.А. Трансформация иприта в объектах окружающей среды. -Саратов: Научная книга, 2001. 120 с.

54. Элбро Т., Дерет Д., Симак Р. Определение люизита и продуктов его разложения в пробах почв и воды с использованием пламенно-фотометрического и фотоионизационного детекторов в полевых условиях // Росс. хим. журн. -1995. Т. XXXIX, № 4. - С. 125-128.

55. Янкевич М.И., Квитко К.В. Биоремедиация нефтезагрязненных водоемов // Экология и промышленность России. 1998. - № 10. - С.21-27.

56. Abedin M.J., Cresser M.S., Feldmann J., Cotter-Howels J. Arsenic accumulation and metabolism in rice (<Oryza sativa L.) // Environ. Sci. Technol. 2002. - Vol. 36.-P. 962-968.

57. Adriano D.S. Traseelements in the terrestrial environment. N. Y.: Springer, 2001.

58. Albrecht S.L., Okon Y., Lonnquist L., Burns R.H. Nitrogen fixation by corn-Azospirillum associations in a temperature climate //Crop. Sci. 1981. - Vol. 21. -P. 301-306.

59. Alexander J.R., McCombie H. The reactions of divinyl sulphide, sulphoxide and sulphon // J. Chem. Soc. 1931. - P.1913-1918.

60. Alkorta I., Hernandez-Allica J., Garbisu C. Plants against the global epidemic of arsenic poisoning // Environ. Int. 2004. - Vol. 30, N 7. - P. 949-951.

61. Aracil P., Burlo F., Lario Y., Martinez-Romero D., Valero D., Carbonell-Barrachina A. Total arsenic accumulation in edible pods and seeds of Phaseolus vulgaris II J Environ Sci. Health. 2001. - Vol. 36. - P. 849-861.

62. Arienzo M., Adamo P., Chiarenzelli J, Bianco M.R., De Martino A. Retention of arsenic on hydrous ferric oxides generated by electrochemical peroxidation // Chemosphere. -2002. Vol. 48. - P. 1009-1018.

63. Baldani V.L.D., Dôbereiner J. Host-plant specificity in the infection of cereals with Azospirillum spp. // Soil Biol. Biochem. 1980. - Vol. 12. - P. 433-439.

64. Barazani O., Sathiyamoorthy P., Manandhar U., Vulkan R., Golan-Goldhirsh A. Heavy metal accumulation by Nicotiana glauca Graham in a solid waste disposal site // Chemosphere. 2004. - Vol. 54, N 7. - 867-872.

65. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 8th ed.- Baltimore: Williams and Wilkins, 1974. - P. 273, 437.

66. Biondi S., Lenzi C., Baraldi R., Bagni N. Hormonal effects on growth and morphology of normal and hairy roots of Hyoscyamus muticus II J. Plant Growth Regul. 1997. - Vol. 16. - P. 159.

67. Bondada B.R., Tu S., Ma L.Q. Absorption of foliar-applied arsenic by the arsenic hyperaccumulating fern (Pteris vittata L.) // Sci. Total Environ. 2004. - Vol. 332, N1-3.-P. 61-70.

68. Braddock J.F., Luong H.V., Brown E.J. Growth kinetics of Thiobacillus ferrooxi-dants isolated from arsenic mine drainage // Appl. Environ. Microbiol. 1984. -Vol. 48.-P. 48-55.

69. Cai J., Salmon K., DuBow M.S. A chromosomal ars operon homologue of Pseudomonas aeruginosa confers increased resistance to arsenic and antimony in Escherichia coli II Microbiology. 1998. - Vol. 144. - P. 2705-2713.

70. Carbonell-Barrachina A.A., Burlo F., Burgos-Hernandez A., Lopez E., Mataix J.

71. The influence of arsenite concentration on arsenic accumulation in tomato and bean plants // Scientia Horticulturae. 1997. -Vol. 3-4. - P. 167-176.

72. Carlin A., Shi W., Dey S., Rosen B.P. The ars operon of E. coli confers arsenical and antimonial resistance // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. - P. 981-986.

73. Chakravarty S., Dureja V., Bhattacharyya G., Maity S., Bhattacharjee S. Removal of arsenic from groundwater using low cost ferruginous manganese ore // Water Res. 2002. - Vol. 36. - P. 625-632.

74. Clayton W.R., Reid E.E. Some esters of thiodiglycol // J. Amer. Chem. Soc. -1942. Vol. 64, N 4. - P. 908-909.

75. Clausen C.A. Improving the two-step remediation process for CCA-treated wood. Part II. Evaluating bacterial nutrient sources // Waste Manag. 2004. - Vol. 24, N4.-P. 407-411.

76. Cleuvers M., Ratte H.T. Phytotoxicity of coloured substances: is Lemna duckweed an alternative to the algal growth inhibition test? // Chemosphere. 2002. - Vol. 49.-P. 9-15.

77. D'Agostinio P.A., Provost L.R. Gas chromatographic retention indications of sulfur toxicants and related compounds // J. Chromatogr. 1988. - Vol. 43, N 3. - P. 399-411.

78. Davies J.H., Oxford A.E. Formation of sulphonium chloride and of unsaturated substances by the action of water and aqueous alcoholic potash on |3,|3'jdichlorodiethyl sulphide // J. Chem. Soc. 1931. - P. 224-236.

79. Delort A-M., Combourieu B. In situ 1H NMR study of the biodegradation of xenobiotics: application to heterocyclic compounds // J. of Industrial Microbiol, and Biotechnol. 2001. - Vol. 26, N 1/2. - P. 2-8.

80. Arsenic(V) to Arsenic(III) in anoxic sediments // Appl. Environ. Microbiol. -1996. Vol. 62, N 5. - P. 1664-1669.

81. Dutre V., Kestens C., Schaep J., Vandecasteele C. Study of the remediation of the site contaminated with arsenic // The Science of the Total Environment. 1998. -Vol. 220.-P. 185-194.

82. E1-Khawas H., Adachi K. Identifications and quantification of auxins in culture media of Azospirillum and Klebsiella and their effect on rice roots // Biol. Fertil. Soils. 1999. - Vol. 28. - P. 377-381.

83. Ernst W.H.O. Sulfur metabolism in higher plants: potential for phytoremediation //Biodegradation. 1998. - Vol. 9. - P. 311-318.

84. Fitz W.J., Wanzel W.J. Arsenic transformations in the soil-rhizosphere-plant system: fundamentals and potential application to phytoremediation // J. Biotech-nol. 2002. - Vol. 99. - P. 259-278.m

85. Gasson E.J., Mc Combie H., Williams A.H., et. al. New organic sulphur vesicants. Part IV. l,2-di-(2-chloroethylthio) ethane and its analogues //J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1948. - Vol. 2. - P. 46-48.

86. Gengling Z., Sudan G. Toxic effect of arsenic on plants in red soils // 13th # Congr. Int. Soc. Soil Sci.: Proc. Hanaburg, 1986. - Vol. 2. - P. 368-369.

87. Glass D.J. Current market trends in phytoremediation // Intern. J. Phytoreme-diat. 1999 -Vol. l.-P. 1-8.

88. Harley-Mason J. Some aliphatic thiols and their derivatives. Part II. Thiols derived from 2,2'-dichlorodiethyl sulphide and its analogues nickel complexes from 1,5-dithiols // J. Chem. Soc. 1925. - P.146-148.

89. Hart W.F., Niederl J.B. Thiomorpholines, oxides and dioxides // J. Amer. Chem. Soc. 1946. - Vol. 68, N 4. - P. 714-715.

90. Hartley-Whitaker J., Anisworth G, Wooijs R., Bookum W.T., Schat H., Me-V harg A.A. Phytochelatins are involved in differential arsenate tolerance in Holcuslanatus II Plant Physiol. 2001. - Vol. 126. - P. 229-306.

91. Helfrich O.B., Reid E.E. Reactions and derivatives of P,P'-dichloroethylsulphide // J. Amer. Chem. Soc. 1920. - Vol. 42, N 5. - P. 1208m 1232.

92. Inskeep W.P., McDermott T.R., Fendorf S. Arsenic (V)/(III) cycling in soil and natural waters: chemical and microbiological processes // Environmental Chemistry of Arsenic / Ed. W.T. Frankenberger, Jr. N.Y.: Marcel Dekker, 2002. - P. # 183-215.

93. ISO. 2001. Water quality Determination of the toxic effect of water constituents and waste water to duckweed (Lemna minor) - Duckweed growth inhibition test. ISO International Standard - ISO/CD 20079. ISO TC 147/SC 5 N ISO. - P. 26.

94. Jain M., Gadre R. Effect of as on chlorophyll and protein contents and enzymic activities in greening maize tissues // Water, Air and Soil Pollution. 1993. - Vol.0 93.-P. 109-115.

95. Johnson D.L. Bacterial reduction of arsenate in sea water // Nature. 1972. -Vol. 240, N 5375. - P. 44-45.

96. Kalisova-Spirochova I., Puncocharova J., Kafka Z., Kubal M., Soudek P., Vanek T. Accumulation of heavy metals by in vitro cultures of plants // Water, Air and Soil Pollution: Focus. 2003. - Vol. 3, N 3. - P. 269-276.

97. Kartal S.N. Removal of copper, chromium, and arsenic from CCA-C treated wood by EDTA extraction // Waste Manag. 2003. - Vol. 23, N 6. - P. 537-546.

98. Kaur P., Rosen B.P. Plasmid-encoded resistance to arsenic and antimony // 0 Plasmid. 1992. - Vol. 27. - P. 29-40.

99. Knauer K., Behra R., Hemond H. Toxicity of inorganic and methylated arsenic to algal communities from lakes along an arsenic contamination gradient // Aqua. Toxicol. 1999. - Vol. 46. - P. 221-230.

100. Komossa D., Langebartels C., Sandermann H. Metabolic processes for organic ® chemicals in plants // Plant contamination modeling and simulation of organicchemical processes / Eds. S. Trapp, C. McFarlane. Boca Raton: Lewis Pub., 1995.-P. 69-103.

101. Kopriva S., Rennenberg H. Forest biotechnology and environment //

102. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung - Gesundheitsschutz. - 2000.1. Vol. 43, N2.-P. 121-125.

103. Korte F., Kvesitadze G. Organic toxicants and plants: Review // Ecotoxicol. and Environ. Safety. 2000. - Vol. 47. - P. 1-26.

104. Kyounphile N., Moon H.S., Kim J.Y., Kukor J.J. Linkage between biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and phospholipids profiles in soil isolates // J. Microbiol. Biotechnol. 2002. - Vol. 12 (1). - P. 77-84.

105. Lammey J., Curtis F. Intrinsic remediation of a diesel fuel plume in Goose Bay, Labrador// Can. Environ. Pollution. 1998. - Vol. 103, N 2-3. - P. 203-210.

106. Larcher W. Physiological plant ecology. 3rd ed. - Berlin: Springer, 1995.

107. Lawson W.E., Reid E.E. Reactions of f3,P'-dichlorethyl-sulphide with amino compounds // J. Amer. Chem. Soc. 1925. - Vol. 47, N 11. - P. 2821-2836.

108. Macur R.E., Wheeler T.J., McDermott T.R., InskeepW.P. Microbial populations associated with the reduction and enhanced mobilization of arsenic in mine tailings // Environ. Sci. Technol. 2001. - Vol. 35. - P. 3676-3682.

109. Masy J.M., Santini J.M., Pauling B.V., O'Neill A.H., Sly L.I. Two new arse-nate/sulfate-reducing bacteria: mechanisms of arsenate reduction // Arch.m Microbiol. 2000. - Vol. 173. - P. 49-57.

110. Meharg A.M., Hartley-Whitaker J. Arsenic uptake and metabolism in arsenic resistant and nonresistant plant species // New Physiol. 2002. - Vol. 154. - P. 29^43.

111. Mistra T.K. Heavy metals: bacterial resistances in microbiological ecosystems // Mol. Microbiol. Ecol. Man. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1995. - P. 1-17.

112. Mkandawire M. PHREEQC (or PHAST) database, organic ligands and trace 0 elements. USGS: Status of PhreeqC Programs. 2001 (http:wwwbrr.cr.usgs.gov.).

113. Moore S., Stein W.H., Fruton J.S. Chemical reactions of mustard gas and related compounds. II. The reaction of mustard gas with carboxyl groups and with amino groups of amino acids and peptides // J. Org. Chem. 1946. - Vol. 11, N 6. - P. 675-680.

114. Mortazavi S., Tezel F.H., Tremblay A.Y., Volchek K. Effect of pH on the uptake of arsenic from contaminated water by activated alumina // Adv. Environ. Res. 1999. - Vol. 3. - P. 109-118.

115. Munro N.B., Talmage S.S., Griffin G.D., et al. The sources, fate, and toxicityof chemical warfare agent degradation products // Environ. Health Perspect. -1999. Vol. 107, N 12. - P. 933-974.

116. Nakajima D., Kojima E., Iwaya S., Suzuki J. Presence of 1-hidroxypyrene conjugates in woody plant leaves and seasonal changes in their concentrations // Environ. Sci. Technol. 1996. - Vol. 30. - P. 1675-1679.

117. Nam K., Hee S.M., Jae Y.K., Kukor J.J. Linkage between biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and phospholipids profiles in soil isolates // J. Microbiol. Biotechnol. 2002. - Vol. 12, N 1. - P. 77-84.

118. Neumann H., BodeKirchhoff A., Madeheim A., Wetzel A. Toxicity testing ofheavy metals with the Rhizobium-legumQ symbiosis: High sensitivity to cadmium and arsenic compounds. // Environ Sci. Pollut. Res. 1998. - Vol. 5. - P. 28-36.

119. Newman D., Rietsch A., Polz M. Diversity of arsenate-reducing bacteria from # two contaminated environments // Gen. Meet, of the Amer. Soc. for Microbiol.:

120. Abstr. Chicago, Illinois, USA, May 30 June 3,1999. - Chicago, 1999. - P. 450.

121. Nissen P., Benson A.A. Arsenic metabolism in freshwater and terrestrial plants // Physiol. Plant. 1982. -Vol. 54. - P. 446-450.

122. Perez J., Munoz-Dorado J., de la Rubia T., Martinez J. Biodégradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: An overview // Intern. Microbiol. 2002. - Vol. 5, N 2. - P. 53-63.

123. Peryea F.J. Phosphate starter fertilizer temporarily enhances soil arsenic uptake by apple trees grown under field conditions // Hort Sci. 1998. - Vol. 33. - P. 826-829.

124. Phung Le T., Silver S. Bacterial heavy metal resistance: new surprise // Annu. Rev. Microbiol. 1996. - Vol. 50. - P. 753-789.

125. Picering I.J, Prince R.C., George M.J., Smith R.D., George G.N., Salt D.E. Reduction and coordination of arsenic in Indian mustard // Plant Physiol. 2000. -Vol. 122, N4.-P. 1171-1178.

126. Price C.C., Roberts R.M. Some reactions of 1,2- bis(p-chloroethylthio)ethane // J. Org. Chem. 1947. - Vol. 12, N 2. - P. 255-263.

127. Radianingtyas H., Wright P.C. 2-Propanol degradation by Sulfolobus solfatari-cus // Biotechnol. Lett. 2003. - Vol. 25, N 7. - P. 579-583.

128. Raskin I., Smith R.D., Salt D.E. Phytoremediation of metals: using plants toremove pollutants from the environmental // Curr. Opinion in Biotechnol. 1997. -Vol. 8.-P. 221-226.

129. Rippen G. Handbuch Umweltchemikalien // Ecomed / Ed. L. Landsberg.1. Germany, 1999.

130. Romero F.M., Armienta M.A., Carrillo-Chavez A. Arsenic sorption by carbonate-rich aquifer material, a control on arsenic mobility at Zimapan, Mexico // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2004. - Vol. 47, N 1. - P. 1-13.

131. Salt D.E., Smith RD., Raskin J. Phytoremediation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. - Vol. 49. - P. 643-668.

132. Shann J.R. The role of plants and plant/microbial systems in the reduction of exposure // Environ. Health Perspect. 1995. - Vol. 103, N. 5. - P. 13-15.

133. Siciliano S.D., Germida J J. Mechanisms of phytoremediation: biochemical and ecological interactions between plants and bacteria // Environ. Rev. 1998.1. Vol. 6. P. 65-79.

134. Singh G., Dowman A., Higginson F.R. Translocation of aged cyclodiene insecticide residues from soil into forage crops and pastures at various growth stages under field conditions // J. Environ. Sci. Health B., 1992. - Vol. 27, N 6. - P. 711-728.

135. Soares A., Guieysse B., Delgado O., Mattiasson B. Aerobic biodégradation of nonylphenol by cold-adapted bacteria // Biotechnol. Lett. 2003. - Vol. 25, N 9. -P. 731-738.

136. Song Y., Hahn H.H., Hoffmann E. Effects of solution conditions on the premcipitation of phosphate for recovery. A thermodynamic evaluation // Chemos-phere. 2002. - Vol. 48. - P. 1029-1034.

137. Stahmann M.A., Golumbic C., Stein W.H., Fruton J.S. Chemical reactions of mustard gas and related compounds. VII. The chemistry of bis(p-chloroethyl)sulphone, divinyl sulphone and divinyl sulphoxide // J. Org. Chem. 1946. - Vol. ti 11,N6. -P. 719-735.

138. Stein W.H., Fruton J.S., Bergmann M. Chemical reactions of mustard gas and related compounds. V. The chemical reactions of 1,2-bis(p-chloroethylthio) ethane.// J. Org. Chem. 1946. - Vol. 11, N 6. - P. 692-703.

139. Tesar M., Reichenauer T.G., Sessitsch A. Bacterial rhizosphere populations of black poplar and herbal plants to be used for phytoremediation of diesel fuel // Soil Biol, and Biochem. 2002. - Vol. 34, N 12. - P. 1883-1892.

140. Trapp S., Matthies M., Scheunert I. Modeling the bioconcentration of organicchemicals in plants // Environ. Sci. Technol. 1990. - Vol. 24. - P. 1246-1252.

141. Tu C., Ma L.Q. Effects of arsenate and phosphate on their accumulation by an arsenic-hyperaccumulator Pteris vittata L. // Plant and Soil. 2003. - Vol. 249, N 2.-P. 373-382.

142. Tu S., Ma L.Q., Fayiga A.O., Zillioux E.J. Phytoremediation of arsenic-contaminated groundwater by the arsenic hyperaccumulating fern Pteris vittata L. // Int. J. Phytoremediat. 2004. - Vol. 6, N 1. - P. 35-47.

143. Turner A.W., Legge J.W. Bacterial oxidation of arsenite // Austral. J. Biol. Sci.-1954. Vol. 7. -P. 479-495.

144. Wackett L., Allan D. Comment on "bioremediation in the rhizosphere" // Environ. Sci. Technol. 1995. - Vol. 29. - P. 551-552.

145. Wang W. 1986. The effect of river water on phytotoxicity of Ba, Cd and Cr // Environ. Pollut. 1986. - Vol. 11. - P. 193-204.

146. Watson A.P., Griffin G.D. Toxicity of vesicant agents scheduled for destruction by the Chemical Stockpile Disposal Program // Environ. Health Perspect. -1992. Vol. 98. - P. 259-280.

147. Wauchope R.D. Uptake, translocation and phytotoxicity of arsenic in plants // ^ Aresenic: Industrial, Biomedical, Environmental Perspectives / Eds. W.H.1.derer, R.J. Fensterheim. N.Y.: Van Nostrand Reinhold Co., 1983. - Chap. 25. -P. 348-375.

148. Woolson EA. Emissions, cycling and effects of arsenic in soil ecosystems // Topics in Environ. Health. Vol 6. Biological and environmental effects of arsenic / Ed. B.A. Fowler. -N.Y.: Elsevier, 1983. 51 p.

149. Zhang W., Cai Y., Tu С., Ma L.Q. Arsenic speciation and distribution in an arsenic hyperaccumulating plant // The Sei. Total Environ. 2002. - Vol. 300. - P. 167-177.

150. Zhang W, Cai Y, Downum KR, Ma LQ. Arsenic complexes in the arsenic hy-peraccumulator Vieris vittata (Chinese brake fern) // J. Chromatogr. 2004. -Vol. 1043, N2.-P. 249-254.1. БЛАГОДАРНОСТИ