Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие комплекса цитохромов BD из E. COLI с лигандами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие комплекса цитохромов BD из E. COLI с лигандами"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени, М.В.ЛОМОНОСОВА

Р Г Б ОД-:-—--

1 3 МАЙ Биологический факультет

На правах рукописи

БОРИСОВ Виталий Борисович

i

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСА ЦИТОХРОМОВ BD ИЗ Е. COLI С

ЛИГАНДАМИ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в отделе биоэнергетики и новых физических методов НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник ААЛСонстантинов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Д.Самуилов

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник И.М.Андреев

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита состоится "_"_ 1995 года в_часов

на заседании диссертационного совета Д.053.05.32 по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"_ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник /-'1.—' М.В.Иванов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Запасание энергии в дыхательной цепи эробных бактерий осуществляется за счет электрогенного переноса ионов юдорода из цитоплазмы в периплазматическое пространство. Создаваемая при itom на цитоплазкатической мембране протонодвижущая сила используется леткой для энергообеспечения основных типов работы: химической (синтез VTO), осмотической (накопление различных веществ), механической (вращение кгутика).

Дыхательные цепи прокариотов в силу сравнительной простоты их ¡троения и доступности молекулярно—биологическим подходам служат более гдобным объектом: изучения трансмембранной транслокации Н+, чем дыхательные цепи митохондрий.

Цитохром bd является одной из двух терминальных убихинолоксидаз дыхательной цепи Escherichia coli, катализирующих четырехэлектронное юсстановление кислорода до воды.

Фермент не имеет гомологии с другими известными на сегодняшний день эксидазами, такими как цитохром с оксидаза и хинолоксидаза типа Ьо. Более того, в отличие от других оксидаз дыхательных цепей организмов, комплекс bd ае содержит меди и, хотя образует Д(р, не функционирует как трансмембранный протонный насос.

Фермент представляет собой гетеродимер с тремя редокс — центрами: низкоспиновым гемом ЬцЯ и двумя высокоспиновыми темами — и d.

Функция цитохрома Ь55Я, как полагают, заключается непосредственно в окислении убихинола. Гем d связывает кислород и, по всей вероятности, принимает участие в кислородоредуктазной реакции, в то время как роль гема ^595 остается неясной. Ряд авторов полагает, что, будучи высокоспиновым, гем t>595 участвует в восстановлении кислорода, образуя вместе с гемом d двухъядерный кислородоредуктазный центр, аналогичный гем/Си кислородоредуктазному центру оксидаз аа3— и Ьо—типа. По мнению других исследователей, функция гема bsgs состоит з переносе электрона с гема bSS8 на гем d.

Для того, чтобы получить информацию об устройстве активного центра и механизме работы гемопротеидов, в том числе различных оксидаз, часто прибегают к изучению связывания экзогенных лигандов гемовыми группами. В настоящей работе мы исследовали взаимодействие мембранного и растворимого цитохрома bd в различных состояниях окисления с перекисью водорода, окисью углерода, NO и цианидом.

Перекись водорода как лиганд цитохрома d особенно интересна, ибо есть указания на возникновение перекисного аддукта гема d в ходе восстановления кислорода.

Цитохром bd обладает очень высоким сродством к кислороду, так что в аэробных условиях большая часть фермента находится в так называемой оксигенированной форме (Ь5ж3+ Ь5953+ с12+ — 02).

Вместе с тем при изучении комплекса Ьд часто требуется получить полностью окисленную форму фермента. Во многих прежних работах, чтобы обеспечить окисленное состояние цитохрома Ьс1, к ферменту добавляли такие окислители, как феррицианид или персульфат. Однако впоследствии стало ясно, что эти традиционные окислители не вызывают распада оксикомплекса. В этой связи возникла необходимость поиска методов окисления цитохрома й.

Целью настоящей работы было изучение особенностей устройства кислородоредуктазного центра цитохрома Ьб.. В частности, было важно установить, способен ли высокоспиновый гем Ь595 связывать внешние лиганды. Требовалось определить число перекисных интермедиатов, возникающих при взаимодействии Н202 с ферментом. Кроме того, нужно было исследовать влияние мембранного окружения цитохрома Ъй на его способность к связыванию лигандов. В задачу работы также входила разработка метода получения полностью окисленной формы выделенного фермента.

Научная новизна работы. Разработан удобный метод получения полностью окисленной формы цитохрома М из Е.соН я исследовано взаимодействие окисленного фермента с экзогенными лигандами.

Существенно новым результатом работы является то, что при реакции Н202 с цитохромом Ьй наблюдается возникновение только одного спектрально различимого продукта, а не двух, как считалось ранее.

Показано, что перекись водорода взаимодействует исключительно с гемом с1, приводя к образованию оксоферрильного комплекса. Кажущаяся величина К^ продукта взаимодействия Н202 с цитохромом А составляет 30 — 40 мкМ. Исследована кинетика взаимодействия Н202 с окисленным ферментом и определена константа скорости этой реакции, которая оказалась равной 600 М-'с-'.

Обнаружено, что в сравнительно низких концентрациях СО и KCN реагируют с гемом с! выделенного фермента. При высоких концентрациях эти лиганды связываются также с 10—20% гема типа Ь. Методом МКД установлено, что эта часть принадлежит низкоспиновому гему Ьцв- Не получено каких—либо данных о взаимодействии с экзогенными лигандами высокоспинового гема

Впервые показано, что липидное окружение цитохрома Ьс1 влияет на способность последнего связывать лиганды. Комплекс Ьс1, содержащийся в нативных мембранах, либо встроенный в азолектиновые липосомы, проявляет устойчивость к связыванию внешних лигандов: в этом случае с ними может взаимодействовать исключительно гем (1. Выделение и очистка фермента, равно как и простая солюбилизация мембран детергентом приводит к тому, что помимо гема d присоединять лиганды начинает и гем Ьз5а-

Практическое значение работы. Полученные результаты существенно дополняют современные знания о свойствах и механизме функционирования щтохромного комплекса bd из E.coli и могут найти применение в исследованиях гемонротеинов дыхательной или фотосинтетической редокс — цепей. На основе цитохрома bd можно разработать биосенсоры 02 и СО. Информация о :труктуре и функционировании активного центра фермента будет способствовать поиску путей регуляции патогенной микрофлоры в кишечнике. Разработанный метод перевода оксигенированного цитохрома bd в полностью окисленное состояние может быть использован для окисления других гидрофобных редокс —ферментов, не взаимодействующих с традиционными акцепторами электронов типа феррицианида или персульфата.

Апробация работы. Диссертационная работа была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики и новых физических методов НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (Москва, 1993, 1994, 1995). Результаты также представляли на 23 — иг конференции FEBS (Базель, 1995) и семинаре отдела биохимии Иллинойского университета в Урбане (1994, 1995).

Публикации. По материалам исследований опубликованы 4 печатные работы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 34 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на субклеточных пузырьках из E.coli, а также на выделенном цитохроме bd, — солюбилизированном в присутствии детергента либо встроенном в мембрану азолектиновых липосом.

В работе использовали штамм GO— 102/pFH101 E.coli (перепроизводство цитохрома bd; делеция в гене цитохрома bo; гены устойчивости к канамицину и ампициллину), любезно предоставленный профессором Р.Геннисом (Иллинойский университет в Урбане — Шампейн, США).

Выращивание клеток и получение субклеточных пузырьков проводили как описано в опубликованной нами работе /Борисов и соавт., 1994/.

Цитохром bd выделяли и очищали в соответствии с методикой, описанной ранее /Miller, Gennis, 1983/, с некоторыми модификациями, исключив последнюю стадию хроматографии на гидроксилапатите.

Степень чистоты препарата выделенного цитохрома bd определяли по содержанию гема d в пересчете на мг белка. Это соотношение, как правило, составляло 6 — 7 нмолей гема ri/мг белка.

Концентрацию цитохрома bd определяли из разностных спектров поглощения (восстановленные дитионитом минус "окисленные на воздухе"), используя значение Asg28-eov = '.4 мМ~ 'см~1 /Lorence et al., 1986/.

Концентрацию белка определяли по методу Лоури /Lowry et al., 1951/.

Цитохром bd встраивали в липосомы диализным методом /Rackcr, 1972/.

Изменения поглощения регистрировали на соединенном с компьютером спектрофотометре Aminco — SLM DW—2000.

Скорость реакции цитохрома bd с перекисью водорода измеряли методом быстрого смешивания с использованием приставки к Aminco DW—2 Aminco — Morrow J4 - 9602 Stopped flow.

Полученные данные обрабатывали на персональных ЭВМ IBM РС/АТ с использованием программ DW— 2000 и GIM (Scientific Graphic Interactive Management System.). Автором последней является А.Л.Драчев из НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского.

Регистрацию спектров МКД проводили при комнатной температуре в кюветах с оптическим путем 10 мм на соединенном с компьютером дихрографе, сконструированном кандидатом физико-математических наук, ведущим научным сотрудником НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского А.М.Арутюняном. Спектр МКД получали, вычитая из спектра, записанного в прямом поле, таковой в обратном поле (Н ss 0,7 Т). Для обработки полученных кривых использовали программы RDA и TEST фирмы "Новинком" (Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ОКИСЛЕНИЕ ТЕМА D

Выделенный комплекс bd обнаруживает интенсивную полосу поглощения с максимумом при 648 нм, которая характеризует оксикомплекс восстановленного цитохрома d (d2+— 02) (рис. 1, спектр 1). Какие—либо признаки восстановления гемов b¡ss и Ь595 отсутствуют. Таким образом, выделенный фермент находится большей частью в оксигенированном состоянии bsss3+ b.d2+ — 02.

Окислители феррицианид калия и персульфат аммония не изменяют исходный спектр цитохрома bd (рис. 1, спектры 2 и 3). Данный факт указывает на неспособность этих веществ разрушить оксикомплекс гема с!, несмотря на то, что они являются весьма эффективными акцепторами электронов. Ввиду того, что субстратом оксидазы bd—типа служит липофильный убихинол, можно ожидать, что активный центр фермента находится в гидрофобном окружении и потому плохо взаимодействует с заряженными донорами и акцепторами электронов вроде феррицианида или персульфата. Мы предположили, что гидрофобные окислители соответственно могли бы более эффективно окислять гем d.

Рис. 1. Действие различных окислителей па оксикомплскс цитохрома bd E.coli. Приведены абсолютные спектры: 1 — 6e:i добавок, 2 — 30 мин с 0,2 мМ K3[Fe(CN)e], 3 — 30 кии с 0,1 мМ персульфатом аммония, 4 — 1 мин с 15 мкМ ФМС, 5 — 5 мин с 15 мкМ BQ, 6 — 20 мин с 40 мкМ феррицинием и 0,1 мМ персульфатом аммония, 7 — 1 мин с 16 мкМ BQCLj. Запись производили в двухлучевом режиме. Оптическая кювета содержит цитохрпм bd (0,42 мкМ) в среде.' инкубации, включающей 50 мМ HEPES, 50 мМ CHES, 0,025% —ный N — лаурилсаркозипат натрия, pH 8,0.

Действительно, при добавлении таких липофильных акцепторов электронов, как феррициний или BQC14 наблюдается исчезновение интенсивной полосы при 648 нм в абсолютном спектре поглощения фермента, что говорит о распаде оксикомплекса и окислении гема d. Инкубация гемопротеина с BQ или ФМС также приводит к частичному разрушению оксикомплекса.

На рис. 2 приведены концентрационные зависимости действия разных окислителей на оксикомплекс гема d. Среди исследованных липофильных акцепторов электронов BQC14 оказался наиболее эффективным. Довольно хорошо действует гакже феррициний, особенно в присутствии 0,1 мМ персульфата аммония (рис. 2, кривые 4 и 5).

Окисление оксикомплекса гема d ВОС14 происходит достаточно быстро (к3ф = 6*104 М - 'с~'). феррициний действует примерно в 300 раз медленнее (каф = 2*102 М-'с-1). BQ и PMS вызывают лишь частичное окисление оксикомплекса, но действуют довольно быстро (к,ф соответственно около 103 и 104 М-''с-').

Мы обнаружили, что ингибитор хинолоксидазной активности комплекса bd пентахлорофенол сильно тормозит окисление оксикомплекса гема d как BQCI4, так и феррицинием. Такое наблюдение свидетельствует о том, что

гидрофобные акцепторы окисляют цитохром й через убихинолоксидазный центр.

Рис. 2. Концентрационная зависимость действия окислителей на оксикомплекс цитохрома ё. Приведены кривые: 1 — феррицианид калия (точка после разрыва — 0,2 мМ); 2 — ФМС; 3 — ВО; 4 — феррициний; 5 — феррициний в присутствии 0,1 мМ персульфата аммония; 6 — ВОСЦ. Де рассчитывали, нормируя изменение поглощения при 648 им (ДА) на концентрацию тема (1. ДА определяли относительно опорной линии, соединяющей точки абсолютного спектра при 607 и 670 им. Время инкубации — 30 мин. Основные условия — те же, что и на рис. 1.

Уменьшение поглощения при 648 нм под действием окислителей сопровождается спектральными изменениями в полосе Соре. В разностном спектре появляется пик при 405—410 нм и провал в области 430 — 432 нм (рис. 3). Такой ответ в Соре имеет небольшую величину и сравним с амплитудой спектральных изменений в видимой области, соответствуя коротковолновому сдвигу у —полосы гема ё. Падение экстинкции при 648 нм и "синий сдвиг" в Соре протекают строго одновременно, отражая один и тот же процесс.

Шина волны, ни

Рис. 3. Спектральные изменения цитохрома Ьй, вызванные распадом оксикомплекса. Представлены разностные спектры, записанные через 20 с (1), 5 мин (2) и 30 мин (3) после добавления 20 мкМ феррициния в присутствии 0,1 мМ персульфата аммония. Основные условия — те же, что и на рис. 1.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА Э С Н202

Описанный нами метод перевода цитохромного комплекса Ьd в полностью окисленное состояние позволил исследовать взаимодействие Н202 с окисленной формой комплекса цитохромов Ъй.

При добавлении Н202 к оксикомплексу цитохрома Ъй регистрируется разностный спектр с максимумом при 680 нм и минимумом около 650 нм. Форма этого спектра схожа с таковой "перекисного состояния" комплекса М, описанного Лоренсом и Теннисом /Ьогепсе, Септе, 1989/.

Перекись водорода, добавленная к окисленному В<ЭС14 или феррицинием цитохрому Ъй, также вызывает появление пика при 680 нм. Форма разностного спектра (обработанный Н202 минус окисленный) напоминает спектр так называемого "перекисного интермедиата", приведеннного в работе Лоренса и Тенниса и остается постоянной во всем исследованном нами диапазоне концентраций Н202, 5 мкМ —5 мМ. Разность между спектрами продуктов взаимодействия Н202 с оксигенированной и полностью окисленной формами фермента близко напоминает разность между спектрами окисленного и оксигенированного цитохрома Ьс1. Полученные результаты свидетельствуют, что при реакции Н202 с окисленным цитохромом М наблюдается возникновение только одного спектрально различимого продукта.

При добавлении Н202 к полностью окисленной форме фермента в разностном спектре поглощения также регистрируется неглубокий провал с

минимумом около 740 нм, обусловленный исчезновением полосы переноса заряда высокоспинового окисленного тема d (рис. 4).

В предшествующих работах исследования взаимодействия перекиси водорода с цитохромом bd ограничивались видимой областью спектра поглощения. Мы обнаружили, что увеличение экстинкции при 680 нм в спектре окисленного цитохрома bd под действием Н202 сопровождается спектральными изменениями и в полосе Соре. При внесении в образец Н202 в у—области возникает разностный спектр с пиком при 440 нм и провалом в области 405 — 410 нм, соответствующий длинноволновому сдвигу полосы Соре (рис. 4). Изменения поглощения в Соре и при 680 нм сравнимы по величине, тогда как в случае гемов типа a, b или с ответы в у—области, как правило, в 5—10 раз больше, чем в видимом диапазоне длин волн /Poole, 1988/. Это указывает на то, что вызываемые перекисью водорода оптические изменения в области полосы Соре, сопутствующие возникновению максимума при 680 нм, принадлежат гему d.

о X X

о с ь

5

400 500 600 700 * 800

Шина долны, ни

Рис. 4. Сопоставление вызываемых Н2О2 спектральных ответов цитохрома bd E.coli в видимой области и полосе Соре. Фермент прединкубировали 5 мин с 28 мкМ BOCI4. Представлены разностные спектры, записанные через 5 мин после добавления 40 мкМ (1) и 0,5 мМ Н202 (2). Концентрация цитохрома bd — 1,7 мкМ. Остальные условия — те же, что и на рис. 1.

Кривая титрования спектральных изменений цитохрома bd при 680 нм перекисью водорода имеет вид изотермы адсорбции. Величина кажущейся константы диссоциации (Kd) составляет 30 — 40 мкМ.

Изучение кинетики взаимодействия Н202 с окисленным цитохромом bd проводили с использованием метода быстрого смешивания. На рис. 5 представлена типичная кривая при конечной концентрации Н202 после смешивания 5 мМ. Обнаружено, что скорость реакции удовлетворительно

описывается уравнением для одноэкспоненциальной кривой и возрастает пропорционально увеличению концентрации Н202 (рис. 5, вставка). Значение константы скорости второго порядка для цитохрома Ьй составляет 600 М-,с-1.

Рис. 5. Кинетика реакции перекиси водорода с окисленным цитохромом Ъй. Цитохром М прединкубировали 5 мин с 28 мкМ ВОС14 с последующим быстрым смешиванием с Н2О2 (конечная концентрация после смешивания — 5 мМ)„ Кинетику реакции отслеживали в двухволиовом режиме при 680 им относительно 720 им. Экспериментальная кривая описывается одной экспонентой с к = 3,41 с-1. Вставка: зависимость константы скорости реакции первого порядка от концентрации Н202. Концентрация фермента после смешивания — 1 мкМ. Среда измерения как указано на рис. 1.

Спектральные изменения, вызываемые добавлением Н202, полностью обращаются каталазой. Кинетика исчезновения поглощения при 680 нм, вызванного добавлением к цитохрому М, прединкубированному с Н2Ог, избытка каталазы, показана на рис. 6 (кривая 1); распад соединения 680 удовлетворительно соответствует реакции первого порядка с к и Ю-3 с-1. Как обсуждается ниже, это в 20 раз медленнее, чем можно было ожидать для диссоциации перекисного аддукта, исходя из предположения об обратимом связывании перекиси с ферментом и экспериментально определенных величин К,! = 40 мкМ и коп = 600 М- 'с"

КСЫ, будучи добавлен на фоне избытка Н202, также вызывает исчезновение пика при 680 нм (рис. 6, кривая 2). Скорости обращения вызванных Н202 спектральных изменений как каталазой (я10_3 с-1), так и цианидом («2*10-3 с" ') близки между собой.

з с

5 U О

с

0) X I

ш

о

5

10

Время, иин

15

20

Рис. 6. Кинетика обращения каталазой (1) и цианидом (2) спектральных изменений цитохрома Ьй Е.соН, вызванных добавлением НгОг- Фермент прединкубировали 5 мкн с 20 мкМ ВОС14 и затем 5 мин с 1 мМ НоОг- В начальный момент времени добавили 18 нМ каталазу (1) или 50 мМ КСЫ (2). За исчезновением пика при 680 ям следили в двухволповом режиме (2) или путем последовательной записи спектров (1). Цитохром Ьс1 — 1,4 мкМ. Основные условия — те же, что и на рис. 1.

Добавление СО к связанному с мембраной восстановленному цитохрому bd вызывает в видимой области разностного спектра поглощения появление полосы с Ат,1Х = 644 нм и л|пш = 624 нм, которая сопровождается пиком при 540 нм и V/ — образным ответом в области Соре.

Красный сдвиг полосы поглощения около 630 нм обычно приписывают тему d. Что касается изменений в области Соре, то они, по мнению ряда авторов, объясняются вкладом гема bj95 /Poole, 1988/.

Мы обнаружили, что изменения е Соре, равно как и развитие пика при 540 нм, тигруются СО параллельно с увеличением поглощения а —полосы комплекса гема с! с СО и достигают насыщения при 3 — 6 мкМ СО. В области Соре наблюдается также вторая фаза спектральных изменений, которая не достигает насыщения даже при концентрации СО 1 мМ и не вносит существенного вклада в полученную концентрационную зависимость спектральных изменений цитохрома d. Как показано ниже, эта фаза отражает взаимодействие с лигандом незначительной части гема b5ss (1 — 3%).

Мы определили кажущуюся К^ комплекса СО с гемом d бактериальных мембран. Для этого проводили титрование СО спектральных изменений цитохрома bd и Mb, находившихся в одном растворе, следя за распределением

РЕАКЦИЯ ЦИТОХРОМА BD С СО Взаимодействие СО с мембранной формой цитохрома bd

лиганда между этими гемопротеидами и принимая Ка МЬ равной 37 нМ. Величина Кй составляет около 80 нМ.

Взаимодействие СО с выделенным цитохромом Ь(1 Разностный спектр выделенною цитохрома Ьй при низкой концентрации СО (рис. 7, спектр 1) напоминает таковой комплекса СО с мембранной формой цитохрома (I. Однако в случае выделенного фермента отличия между спектрами при высокой (1 мМ| и низкой (20 мкМ) концентрации СО гораздо более выражены: соответствующий разностный спектр представлен полосой с максимумом при 422 им, минимумом при 434 им и небольшим плечом около 440 нм в полосе Соре и двумя провалами, при 562 и 531 нм, в видимой области (рис. 7, кривая 3).

Длина волны, ни

Рис. 7. Спектральные изменения выделенного цитохрома Ы, вызываемые окисыо углерода. Представлены разностные спектры поглощения выделенного цитохрома 1x1 Е.соИ: обработанный 20 мкМ (1) и 1 мМ СО (2) после восстановления дигионигом минус восстановленный дитиояитом; (3) — разность между (2) и (1). Концентрация цитохрома Ьс1 - 6,24 мкМ. Остальные условия — те же, что и на рис. I.

Спектральные изменения выделенного цитохрома Ь<7 при 540 нм и 644 — 623 нм, как и в случае с мембранным ферментом, титруются одновременно, имеют вид кривых с насыщением и отражают один и тот же процесс — связывание СО с гемои (I (рис. 8, кривые 2 и 3). Пик при 540 нм может быть как Р~полосой комплекса гема с! с СО, так и частью его расщепленной а—полосы. Концентрационная зависимость спектральных изменений в Соре имеет ярко выраженный двухфазный характер: первая фача соответствует наблюдаемым изменениям н видимой облас-н; вторая фама не насыщается даже при ! мМ С О п вносит бои,шип ьклад и суммарную амплитуду изменений н у—итоге, чем н с\уч.|е ме.мГфиШин! формы фермента (рис. 8, спектр I). Амплитуда сторон «(мчи

соответствует взаимодействию лиганда с некоторой частью тема Ь558 (около 10 — 15%).

Кажущуюся К,1 выделенного цитохрома с1 с СО определяли как и для мембран. Ее значение оказалось равным 0,1 мкМ.

Рис. 8. Зависимость спектральных изменений выделенного цитохрома Ь<Х в разных диапазонах длин волн от концентрации окиси углерода. Представлены кривые, полученные после обработки с помощью программы ИМ соответствующих разностных (СО+восстановленные дитмонитом минус восстановленные дитионитом) спектров поглощения: (1) — 470—444 нм; (2) — 644 — 624 нм; (3) — 540 нм относительно опорной линии, соединяющей точки при 500 и 590 нм. Цитохром Ьс1 — 2,36 мкМ. Остальные условия — те же, что и на рис. 1.

Влияние мембранного окружения на СО—связывающие свойства цитохрома

Ъ(1

Мы нашли, что мембранное окружение фермента существенно влияет на его способность связывать СО. В бактериальных мембранах с лигандом взаимодействует только гем <1. Выделение цитохрома Ьй, в результате которого фермент лишается своего природного окружения и оказывается в мицеллах анионного детергента лаурилсаркозината натрия, приводит к появлению фракции гема Ьцв, способной реагировать с окисью углерода. Это выражается в увеличении амплитуды ответа в Соре по отношению к видимой области в разностном (СО + восстановленный минус восстановленный) спектре поглощения. То же происходит и при простой обработке мембран цвиттергентом БВ—12. Однако встраивание выделенного фермента в азолектиновые липосомы возвращает его лиганд—связывающие свойства к имеющимся у мембранной формы цитохрома Ъд.

Исследование магнита—оптической активности выделенного восстановленного цитохрома Ъй и его комплекса с СО

Спектроскопия МКД все шире применяется при изучении гемопротеинов. В частности, она позволяет следить за изменением спинового состояния гемов при связывании лигандов. Сигналы МКД комплекса Ьс1 ранее не исследовались.

Спектр МКД восстановленного цитохрома ЬЛ, записанный при комнатной температуре, показан на рис. 9 сплошной линией (кривая 1). На спектре можно выделить 3 основных сигнала.

В видимой области основной вклад вносит сигнал типа А с центром при 560,7 нм (рис. 9,Б, кривая 1). Этот сигнал принадлежит низкоспиновому тему Ь5582+-

Отрицательная полоса с минимумом около 600 нм по форме и положению типична для высокоспинового тема Ь2+, соответствуя высокоспиновому тему Ьда^.

В области Соре наблюдается асимметричный сигнал с максимумом яри 437 нм (рис. 9,А), также напоминающий по форме и величине сигнал высокоспинового гемопротеида. Большая часть этого сигнала принадлежит восстановленному высокоспиновому тему Как будет показано ниже,

некоторый вклад в эту полосу вносят и другие хромофорные группы, в особенности, высокоспиновый гем с!2+.

Добавление 20 мкМ СО вызывает сужение сигнала в области Соре, что выражается в разностном спектре МКД кривой УУ—образной формы. При этом не наблюдается изменений сигнала типа А цитохрома Ъцд и отрицательной полосы при б00 нм гема Ь^дз- Поэтому наиболее вероятно, что эти изменения МКД в области Соре отражают образование комплекса низкоспинового гема (1 с лигандом, с12+ — СО.

Увеличение концентрации СО до 1 иМ приводит к уменьшению сигнала А—типа низкоспинового гема Ь55а2+ (рис. 9,Б), соответствующему переходу 15 — 20% этого гема в комплекс с СО, Ь;5$2*~—СО. В то же время мы не обнаружили изменения формы или интенсивности сигнала МКД гема Ь555 при 600 нм.

В полосе Соре наблюдаются .лишь незначительные добавочные изменения, главным образом выражающиеся в небольшом нарастании провала при 430 нм (рис. 9,А). При этом величина минимума при 442 нм практически не меняется.

Таким образом, все вышеизложенное свидетельствует об отсутствии взаимодействия высокоспинового гема Ь$352+ с окисью углерода.

Шина волны, ни

150

100

50

1 н 0

1 X -50

и

1 -100

X

X -150

и < -200

-250

-300

500

3=2-1

550

600

Шина волны, ни

650

708

Рис. 9. Изменения сигнала МКД цитохрома М в полосе Соре (А) и видимой области (Б), вызываемые 1 чМ СО. Представлены спектры МКД выделенного фермента: 1 — восстановленный дитионитом (сплошная линия); 2 — после добавления СО (пунктирная линия); 3 — разность между 2 и 1. Цнгохром Ы — 6,24 мкМ. Остальные условия — тс же, что и па рис. I.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА ВО С ЦИАНИДОМ ¡'(•акция КС1Ч с цитохромом Ьс1 бактериальных мембран Д< кмвлошю л() мМ КСМ к субклеточным пузырькам 1;.а>Н, содержащим цтохрчм /л/, вы п.иии;! р<1< над «женкиуилекев п;м<1 (I (развитие нромг!\<| при еш

нм). При этом наблюдается не описанный ранее длинноволновый сдвиг полосы Соре (ЛЕ4зз_410 ~ 100 мМ~1см~>) и рост поглощения при 562 нм. Увеличение амплитуды разностного спектра в Соре коррелирует во времени с нарастанием оптической плотности при 562 нм, но не совпадает с возникновением провала при 648 нм. Поэтому можно думать, что большая часть изменений в у —полосе отражает восстановление тема Ь158 эндогенными источниками электронов, а не собственно связывание лигэнда.

Как уже отмечалось, прединкубация мембран с окислителями ферридинием и персульфатом не вызывает окисления тема (I При добавлении КСЫ к таким мембранам вслед за описанным выше увеличением амплитуды разностного спектра в Соре в течение первых 4 — 5 мин происходит медленное обращение спектральных изменений и в конце концов возникает устойчивый ответ с Ле429-4|о ~ 14 мМ~'см~'. Его небольшая величина свидетельствует о связывании цианида исключительно с гемом (1.

Реакция КСЫ с окисленной формой цитохрома Ьс1

На рис. 10 представлен разностный спектр поглощения фермента (обработанный КСЫ минус окисленный ВОС14). В видимой области добавление субмиллимолярных концентраций КСЫ приводит к появлению полосы с максимумом при 624 нм и небольшими провалами около 597 и 650 нм, а также пика при 577 нм (рис. 10,Б, спектр 1). Кроме того, наблюдается исчезновение полосы при 740 нм, являющейся полосой переноса заряда высокоспинового окисленного гема с1. В области Соре регистрируется небольшой длинноволновый сдвиг с максимумом при 431 нм и минимумом при 409 нм с АЕ431 ~40У ~ 17—19 мМ~'см-1 (рис. 10,А, кривая 1), напоминающий таковой у цитохром с1 — содержащих мембран в присутствии окислителей. Небольшая величина изменений в Соре указывает на отсутствие взаимодействия цианида с темами типа Ь при данной концентрации лиганда.

Повышение концентрации КСЫ до 50 мМ приводит к увеличению амплитуды ответа в Соре и появлению пика при 537 нм (рис. 10, кривая 2). Приращение спектральных изменений в у — полосе отражает связывание цианида дополнительно с частью 20%) низкоспичового гема Ьцц.

КСЫ реагирует с окисленным гемом й с эффективной константой скорости (к-эф) ~ 0,02 с-1; это гораздо быстрее, чем в случае оксигенированной формы гема с1 (кЭф ~ 0,002 с"1, /КгаэпозеЬкауа е1 а1., 1993/) или его оксоферрильного комплекса (кЭф ~ 0,002 с"1).

Влияние мембранного окружения на цианид—связывающие свойства

цитохрома Ьс1

Мы обнаружили, что способность цитохрома ЬЛ связывать цианид зависит от липидного окружения фермента.

Добавление 50 мМ КСЫ к цитохром й — содержащим мембранам вызывает значительный по величине длинноволновый спектральный сдвиг в области Соре. Однако, как было схазано выше, он объясняется восстановлением гема Ь

эндогенными источниками электронов, а не его взаимодействием с лигандом. Окислители, добавленные к мембранам, акцептируют электроны с гемов типа Ь, так что конечный ответ в Соре в случае мембран представлен небольшим пиком с максимумом при 429—431 нм и минимумом около 410 нм в разностном спектре поглощения с экстинкцией ~ 14 мМ~1см~1, указывая на реакцию цианида исключительно с гемом d.

Выделение и очистка фермента, также как и простая обработка мембран детергентом приводит к тому, что KCN, помимо гема d, приобретает способность взаимодействовать с частью низкоспинового гема b^ss- Это выражается в появлении дополнительных (по—сравнению с мембранами) спектральных изменений в у—полосе, — ростом амплитуды разностного спектра с максимумом при 430 — 435 нм и минимумом при 408 — 414 нм, которые не обращаются окислителями.

Встраивание цитохрома bd в азолектиновые липосомы стабилизирует связь б—го аксиального лиганда Met с железом гема Ьцц, возвращая его свойства к таковым фермента, ассоциированного с бактериальной мембраной, —. цианид перестает связываться с гемом Ь.

Длина волны, ни

Рис. 10. Сопоставление вызываемых цианидом спектральных ответов выделенного цитохрома Ы в полосе Соре (А) и видимой области (Б). Фермент прединкубировали 5 мин с 80 мкМ ВОС14. Представлены разностные спектры, записанные через 30 мин после добавления 0,5 мМ (1) и через 10 мин после внесения 50 мМ КСИ (2). Концентрация цитохрома Ьс1 — 8,36 мкМ. Остальные условия — тс же, что и на рис. 1.

Исследование магнито—оптической активности выделенного полностью окисленного цитохрома М и его комплекса с цианидом

Мы исследовали сигналы МКД выделенного полностью окисленного цитохрома bd и его цианидного комплекса при комнатной температуре.

В области Соре спектра МКД окисленного цитохрома Ьс1 наиболее выражен характерный для низкоспинового гема Ь3^ интенсивный сигнал типа А с ^тах = 411 нм, Лтш = 425 нм и точкой пересечения нулевой линии при 417 нм (рис. 11, кривая 1 (сплошная линия). Этот сигнал относится к низкоспинопому гёму ЬЯ5д3+. Высокоспиновые окисленные темы Ь^95 и (1 не вносят существенного вклада в спектр МКД в 7 — области.

Добавление 0,5 мМ KCN к окисленному ферменту не вызывает изменений в спектре МКД, что однозначно свидетельствует против взаимодействия с КСЫ как низкоспинового гема Ьцц3+, так и высокоспинового Ь,535'Сигнал тема (1, по—видимому, очень мал.

50 мМ цианид, добавленный к ферменту, вызывает некоторые изменения сигнала МКД, которые выражаются в появлении полосы с максимумом при 420 нм и минимумами около 412 и 433 нм в разностном спектре МКД (рис. 11, кривая 3). Это соответствует переходу 20% низкоспинового гема Ьцд3+ в комплекс с цианидом, что хорошо моделируется миоглобином и его комплексом с цианидом.

Однако мы не обнаружили каких—либо видимых признаков взаимодействия КСЫ с высокоспиновым окисленным гемом

Алина волны, ни

Рис. 11. Изменения характеристик МКД цитохрома М в полосе Соре, вызываемые 50 мМ цианидом. Представлены спектры МКД выделенного фермента: 1 — окисленный 80 мкМ ВОС14 (5 мин инкубации; сплошная линия); 2 — через 30 мин после добавления КСЫ (пунктирная линия); 3 — разность между 2 и 1. Концентрация цитохрома М — 8,36 мкМ. Остальные условия — те же, что и на рис. 1.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Сколько интермедиатов возникает, при реакции Н2Ог с цитохромом bd?

Полученные нами результаты свидетельствуют, что при взаимодействи] Н202 с окисленным цитохромом bd наблюдается возникновение только одноп спектрально различимого продукта. Это противоречит данным Лоренса и сотр /Lorence, Gennis, 1989/, согласно которым существуют два спектр аль» различных состояния цитохрома bd, связанного с Н202 ("перекисньп интермедиат" и "перекисное состояние"). Разностный спектр продукт взаимодействия Н202 с окисленным bd, наблюдаемый в нашей работе соответствует "перекисному интермедиату" в работе Лоренса и Тенниса., Чт касается разностного спектра, приписанного Лоренсом и Теннисом "перокс: состоянию", возникавшему при добавлении избытка Н202 к ферменту, т аналогичные спектральные изменения наблюдаются и в наших опытах, однак при взаимодействии перекиси водорода с оксигенированной, а не окисленно формой цитохрома bd. фактически "перокси — состояние" отличается о "перекисного интермедиата" лишь наличием провала при 648 нм в разностно] (обработанный Н202 минус исходный) спектре поглощения и разностный спект "перокси — состояние минус перокси — интермедиат" практически не отличаете от такового "окисленный минус оксигенированный" для цитохрома bd. Таки; образом, представляется вероятным, что и в опытах Лоренса и Геннис взаимодействие Н202 с цитохромом bd давало всего один конечный продукт, то же, что И наблюдаемый в настоящей работе и идентифицированный в боле позднем исследовании как оксоферрильный комплекс гема d /Kablow, et al 1991/, а кажущееся возникновение двух интермедиатов является следствие: наличия двух спектрально различающихся исходных состояний — окисленного оксигенированного. Мы полагаем, что низкие концентрации Н202 в опыта Лоренса и сотр. реагировали преимущественно со свободной окислены о формой цитохрома d, тогда как при увеличении концентрации перекиси реакцию вступала и фракция оксигенированного фермента.

Природа перекисного комплекса гема d (формы 680)

Для понимания природы продукта взаимодействия перекиси водорода окисленным цитохромом bd (соединения 680) следует подробнее обсудит проблему кажущейся обратимости этого процесса.

Реакция цитохрома bd с Н202 обратима 8 том смысле, что добавленк каталазы приводит к исчезновению вызванных Н202 спектральных изменений, простейшем случае это могло бы означать, что форма 680 является действительв иерекисным комплексом, образующимся в реакции обратимого присоединен» Н202 к гемовому железу окисленного цитохрома d: Kd « 40 мкМ

d3+ + Н202 О (*»-»-(Н)ООН (1)

Если схема (I) верна, то, учитывая полученную в эксперименте кажутцуюс величину Kd ~ 30 — 40 мкМ и константу скорости взаимодействия Н202

■емопротеином kon = 600 М~ 'с~следует ожидать, что константа скорости диссоциации перекисного комплекса kc[t = Kd * kon должна быть ~ 2*10~2 с-1. Эднако, как уже отмечалось, обращение спектральных изменений при добавлении избытка каталазы к продукту взаимодействия Ы2О2 с цитохромом bd происходит в 20 раз медленнее.

Более вероятно, что, как показано на схеме ¡2), реакция образования {тормьт 680 при взаимодействии Н202 с ферментом в истинном смысле необратима: изначально образующийся равновесный комплекс, спектральные еарактеристики которого нам не известны, быстро претерпевает дальнейшие изменения, возможно, аналогичные реакциям, имеющим место в активном центре пероксидаз, в ходе которых образуется оксоферрильное состояние цитохрома d, характеризующееся пиком при 680 нм и длинноволновым сдвигом полосы Соре:

в\

d3++ Н202 <=> d3+ — (Н)ООН => d'4 =02~ bd4Jr = 02~ d3+ (2) R R ^ R+ R \ R

H20 н2о

1 2 3 4

Ох о Соединение 0 => Соединение I => Соединение II =? Ох

Схема взаимодействия перекиси водорода с цитохромом d.

Взаимодействует ли гем b59s с внешними' лигандами?

Небольшая величина спектрального ответа в Соре при взаимодействии цитохрома bd с перекисью водорода свидетельствует о связывании лиганда лишь с гемом d. То же наблюдается и при реакции с ферментом сравнительно низких концентраций СО, KCN и NO. Добавление к цитохрому bd высоких концентраций как окиси углерода (1 мМ), так и цианида (50 мМ) приводит к дополнительным спектральным изменениям е у—полосе поглощения фермента. Методом МКД установлено, что эти изменения соответствуют связыванию с лигандами 15—20% низкоспинового тема bi5S.

Таким образом, полученные результаты однозначно свидетельствуют против связывания экзогенных лигандов с гемом 6595. Складывается впечатление, что гем Ь59д, несмотря на высокоспиновое состояние как в окисленной, так и в восстановленной формах, проявляет удивительную устойчивость к взаимодействию с классическими лигандами высокоспиновых железопорфириновых комплексов. Исключение составляют данные Хилла и сотр. /Hill et al., 1993/, согласно которым около 15% гема b593 в замороженных мембранах Е.соН может медленно присоединять молекулу СО, фотодиссоциирующую от гема d.

Нельзя исключить, что, несмотря на высокоспиновое состояние железопорфириновой группы, особенности белкового окружения гема bjgj

таковы, что этот редокс—центр защищен от взаимодействия с лигандами; в этом случае участие b5S$ в кооперативном с гемом d восстановлении кислорода маловероятно и, соответственно, предположение об организации .кислородоредуктазного центра цитохрома bd по принципу двухъядерного домена, аналогичного гем/медь — содержащему кислородоредуктазному центру семейства других дыхательных оксидаз, не имеет достаточных оснований. В этом случае можно предположить, что роль гема Ь593 ограничивается переносом ' электрона к тему d.

Другое возможное объяснение, представляющееся нам предпочтительным, заключается в следующем: 1) как гем так и гем d потенциально способны связывать внешние лиганды; 2) гемы расположены очень близко, образуя двухъядерный центр, аналогичный гем/Cu — центру других дыхательных оксидаз; 3) из —за пространственной близости гемов ¿>jSj и cl возникают стерические ограничения, позволяющие связаться в таком двухгемовом центре лишь одной молекуле лиганда; 4) гем d имеет более высокое сродство к лигандам, чем bj9j. В таком случае конечным наблюдаемым результатом при добавлении лиганда всегда будет его присоединение к гему d, а гем bsgs будет оставаться в свободном состоянии. При этом, однако, остается открытой возможность присоединения лигандов к Ьздз на промежуточных стадиях связывания, а также челночная переброска кислородных лигандов между темами в процессе восстановления кислорода до воды. В пользу такой модели может свидетельствовать частичное перераспределение молекулы окиси углерода, исходно связанной в кислородоредуктазном центре с гемом d, между темами d и b535 в соотношении и 5:1 при длительном освещении замороженных образцов /Hill et al., 1993/.

ВЫВОДЫ

1. Разработан простой и быстрый метод перевода оксигенированного цитохрома Ьс1 Е.соН в полностью окисленную форму с использованием липофилышх акцепторов электронов. Проведено систематическое исследование взаимодействия окисленного, оксигенированного и восстановленного фермента в мембранной форма и в детергентном растворе с внешними лигандами — перекисью водорода, окисью углерода, цианидом и N0 с применением методов абсорбционной спектроскопии и МКД.

2. При реакции Н2О2 с окисленным цитохромом о а возникает лишь один спектрально различимый продукт, характеризующийся пиком при 680 нм и длинноволновым сдвигом у—полосы поглощения. Н2О2 связывается с гемом d с кажущейся 30—40 мкМ, но не взаимодействует с гемом Ь$95. Константа скорости реакции перекиси с цитохромом bd оказалась равной 600 М~'с-1, а скорость распада после добавления каталазы — 10_3 с-1, что в 20 раз ниже ожидаемой величины константы скорости диссоциации перекисного аддукта, исходя из предположения об обратимом присоединении перекиси к ферменту (к0(г = Кй * коп ~ 2*10-2 с-1)- Предполагается, что реакция Н202 с ферментом носит необратимый характер и приводит к возникновению оксоферрильного комплекса гема с1.

3. Как в бактериальных мембранах, так и в выделенном комплексе Ьй СО и N0 в низких концентрациях связываются только с гемом й с Кй для СО около 0,1 мкМ. При высокой концентрации окиси углерода в реакцию с лигандом вступает также часть низкоспинового гема Ьцд. Связывание лигандов с высокоспиновым гемом Ьз95 не обнаружено.

4. Цианид взаимодействует как с комплексом М субклеточных пузырьков, так и с выделенным ферментом: реагируя с гемом d. В случае выделенного фермента . увеличение концентрации цианида до 50 мМ приводит к взаимодействию с лигандом дополнительно части окисленного гема Ь558 (-20%).

5. Способность цитохрома ЬЛ присоединять внешние лиганды зависит от его мембранного окружения. Как природная (бактериальная) мембрана, так и искусственная фосфолипидная (липосомы) стабилизирует координационную сферу гема Ьца, предотвращая взаимодействие с такими лигандами как СО и цианид.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Борисов В.Б., Смирнова И.А., Красносельская И.А., Константинов A.A. Оксигенировашшй цитохром bd из Escherichia coli может быть превращен в окисленную форму липофильными акцепторами электронов. Биохимия, 1994, т.59, вып.4, с.598 —606.

2. Борисов В.Б., Геннис Р.Б., Константинов A.A. Взаимодействие цитохрома bd из Escherichia coli с перекисью водорода. Биохимия, 1995, т.60, вып.2, с.315 — 327.

3. Borisov Y.B., Smirnova I.A., Arutjunjan A.M., Gennis R.B., Konstantinov A.A. Membrane environment effect on ligand — binding properties of E.coli cytochrome bd. Abstract book of the 23rd FEBS Meeting, August 13-18, 1995, Basel, p.241.

4. Borisov V., Gennis R., Konstantinov A.A. Peroxide complex of cytochrome bd: kinetics of generation and stability. Biochem. Mol. Biol. Int., in press.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ

БСА — бычий сывороточный альбумин, МКД — магнитный круговой дихроизм, трис — трис(гидроксиметил)метиламин, трицин — N—[(трисгидроксиметил) — метил]глицин, ФМС — феназинметосульфат, ФМСФ — фенилметансульфонилфторид, ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота, BQ — 1,4—бензохинон, ВОС14 — тетрахлоро—1,4 —бензохинон, CHES — 2 — (циклогексиламино)этансульфоновая кислота, Ес — потенциал полувосстановления, HEPES — N — 2 — гидроксиэтилшшеразин — N1— 2 — этансульфоновая кислота, МЬ — миоглобин, SB —12 — N—додецил—N.N-диметиламин—3—пропан—сульфонат, Дер — трансмембранная разность электрохимических потенциалов.