Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Компьютерное конструирование трехмерной структуры цитохрома Р450 1А2 и поиск его потенциальных лигандов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белкина, Наталья Валерьевна, Москва

О /

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

БЕЛКИНА Наталья Валерьевна

КОМПЬЮТЕРНОЕ КОНСТРУИРОВАНИЕ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ ЦИТОХРОМА Р450 1А2 И ПОИСК ЕГО ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ЛИГАНДОВ

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.С. Иванов

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.............................................4

Введение......................................................5

Цель работы...................................................7

Основные задачи работы........................................7

Обзор Литературы..............................................8

Цитохром Р450 1А2.............................................8

Создание новых лекарственных средств ......................... 11

Методы молекулярного докинга ............................. 11

Создание лигандов de novo.............................11

Локирование целой молекулы............................13

Ограничения прямых методов ............................ 15

Методы типа QSAR.........................................16

Методы CoMFA и CoMSIA........................................16

Ограничения непрямых методов .......................... 19

Материалы и методы...........................................20

Аппаратная база работы.......................................20

Программная база работы......................................20

Информационные ресурсы, использованные в работе .............. 21

Моделирование трехмерной структуры CYP1A2 .................... 23

Оценка качества построения модели CYP1A2 ..................... 25

Программа ERRAT ....................................... 25

Программа PR0CHEK ..................................... 25

Создание библиотек конформеров...............................2 6

Оптимизация комплекса двух молекул...........................26

Оптимизация конформации лиганда при поиске в базах данных .... 27

Процедура локирования - программа ОоскЭеагсЬ ................. 28

Создание ОБАИ модели с использованием метода СоМБ1А..........29

Создание корреляционных уравнений методом нейронных сетей .... 29

Результаты и обсуждение......................................32

Моделирование трехмерной структуры СУР1А2....................32

Оценка качества построения модели СУР1А2 ..................... 37

Моделирование комплексов СУР1А2 с кофеином и

7-этоксирезоруфином..........................................44

Предсказание констант диссоциации............................4 6

Использование нейронных сетей ......................... 4 6

Создание ЗБ-ОЗАЛ+СоМЗЬА модели ........................ 51

Скрининг баз данных......................................54

Выводы.......................................................7 0

Список литературы............................................71

Приложение 1.................................................84

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

3D-QSAR - 3-Dimensional QSAR.

CMC - Comprehensive Medical Chemistry.

CoMFA - Comparative Molecular Field Analysis.

CoMSIA - Comparative Molecular Similarity Indices Analysis.

CYP101 - цитохром P450 cam.

CYP102 - цитохром P450 Bm-3.

CYP107A1 - цитохром P450 Erif.

CYP108 - цитохром P450 Terp.

CYP1A2 - цитохром P450 1A2.

Kd - константа диссоциации белок-лигандного комплекса.

MelQx - 2-амино-З,8-диметилимидазо[4,5-f] хиноксалин.

PDB - Protein Data Bank.

PhIP - 2-амино-1-метил-6-фенилимидазо [4,5-Ь]пиридин.

QSAR - Quantitative Structure-Activity Relationship.

QSMR - Quantitative Structure-Metabolism Relationship.

RMSD - среднеквадратичная разность расстояний между

тождественными атомами.

SCR - структурно-консервативный регион.

ВВЕДЕНИЕ

Цитохромы Р450 являются гемсодержащими монооксигеназами ферментами, присущими почти всем живым существам и окисляющими как эндогенные, так и экзогенные низкомолекулярные органические соединения. К этому обширному надсемейству принадлежит и цитохром Р450 1А2 человека (СУР1А2), который участвует в метаболизме стероидов и, кроме того, способен окислять многие лекарственные соединения и другие ксенобиотики, иногда образуя при этом канцерогенные вещества. По этой причине ингибиторы СУР1А2 могут найти применение для профилактики онкологических заболеваний, причиной которых служит лекарственная терапия или контакт с вредными химикатами на производстве, в быту или вследствие проживания в экологически неблагополучных районах. Кроме того, окислительная модификация лекарственных соединений уменьшает их терапевтический эффект, и потому ингибирование СУР1А2 позволяет снизить обычно применяемые дозы.

В последние годы прямой поиск ингибиторов ферментов вытесняется вычислительным экспериментом, при котором взаимодействие реальных молекул лиганда и белка так или иначе симулируется с помощью их молекулярных моделей. Подобный подход позволяет в разумное время выявить потенциальные ингибиторы среди сотен тысяч доступных соединений, структуры которых объединены в электронные банки данных.

Необходимой предпосылкой при этом является знание трехмерной структуры участка связывания молекулы-лиганда на поверхности белка - обычно активного центра фермента. Расчетные методы, позволяющие оценить стерическую комплементарность лиганда участку связывания и энергию их взаимодействия, в конечном итоге приводят к гипотетическим структурам лиганд-белковых комплексов. Сведения о расположении лигандов в этих комплексах необходимы для вычисления значений константы диссоциации комплекса - параметра, отражающего эффективность лигандов в качестве конкурентных ингибиторов.

К сожалению, трехмерная структура цитохрома СУР1А2 человека, равно как и других мембранных цитохромов Р450, пока экспериментально не определена. Поэтому общей проблемой при поиске ингибиторов этих ферментов является возможность использования молекулярных моделей активного центра, основанных не на опытных данных (обычно - результатах рентгеноструктурного анализа), а на применении вычислительных методов. Применение расчетных молекулярных моделей активных центров цитохромов Р450 может значительно упростить и ускорить направленный поиск крайне необходимых лекарственных соединений. Эффективность такого подхода зависит от методологии как конструирования молекулярной модели фермента, так и последующего использования модели при поиске прочно связывающихся лигандов.

Построение трехмерной молекулярной модели белка с использованием его гомологии с другими белками, предсказание структуры комплексов белков с низкомолекулярными лигандами и корреляционный расчет констант диссоциации лиганд-белковых комплексов - все эти вычислительные методы интенсивно развиваются в последние годы, и их надежность постепенно увеличивается. Тем не менее, каждый из этих методов неизбежно сопряжен с ошибками, поскольку вынужденно основан на большом числе допущений и упрощений. С еще большей неопределенностью связан подход, развитый в данной работе, который основан на последовательном применении всех трех методов. Поэтому его применение, оправданное практической необходимостью, должно быть основано на тщательной экспериментальной проработке для каждого класса ферментов.

Выбор СУР1А2 в качестве объекта исследования обусловлен не только его биологической значимостью. Этот фермент по своей аминокислотной последовательности в значительной степени гомологичен бактериальным цитохромам с известной трехмерной структурой, что способствует надежности моделирования. С другой стороны, известны свойства комплексов СУР1А2 с различными соединениями, что позволяет оценить достоверность расчетной модели фермента и применить корреляционные методы для

предсказания констант диссоциации ранее неизвестных лиганд-белковых комплексов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

На примере цитохрома СУР1А2 человека разработать и проверить методологию использования расчетной молекулярной модели белка для поиска возможных лигандов.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ РАБОТЫ

1. Построение трехмерной молекулярной модели СУР1А2, основанной на гомологии этого белка с бактериальными цитохромами Р450, структура которых определена рентгеноструктурным методом.

2. Моделирование структуры комплексов СУР1А2 с низкомолекулярными лигандами, для которых известны данные об эффективности их связывания с ферментом.

3. Разработка корреляционных уравнений на основе характеристик полученных комплексов для предсказания констант диссоциации комплексов СУР1А2 с ранее не исследованными лигандами.

4. Поиск новых эффективных лигандов СУР1А2 в банках данных низкомолекулярных соединений путем предсказания пространственного строения их комплексов с СУР1А2 и последующей оценки соответствующих констант диссоциации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Цитохром Р450 1А2

Цитохромы Р450 представляют собой суперсемейство гем содержащих монооксигеназ, которые обнаружены почти у всех видов живых существ. Ферменты, входящие в это суперсемейство, отвечают за окислительный метаболизм широкого спектра как экзогенных, так и эндогенных низкомолекулярных веществ [Арчаков, 1975] и являются ключевым звеном метаболизма многих лекарственных веществ. Осуществляемая цитохромами Р450 окислительная модификация некоторых экзогенных низкомолекулярных веществ иногда приводит к образованию их канцерогенных производных. Все вышесказанное определяет интерес к особенностям строения и функций различных представителей суперсемейства цитохромов Р450.

Аминокислотная последовательность различных цитохромов Р450 определена для многих видов эукариотических и прокариотических организмов [Nelson, 1996], однако трехмерная структура известна только для пяти бактериальных цитохромов Р450. Эти данные используются при моделировании трехмерных структур

эукариотических цитохромов Р450.

Одним из наиболее интересных представителей суперсемейства является цитохром Р4501А2 (CYP1A2), который является ключевым ферментом окислительного метаболизма многих лекарств и ответственен за окислительную активацию многих канцерогенов. В настоящее время выделены и хорошо изучены CYP1A2 крысы [Guengerich, 1982; Ryan, 1980; Fisher, 1981; Goldstein, 1982], кролика [Johnson, 1977; Haugen, 1975; Hashimoto, 1976] мыши [Negishi, 1979] и человека [Distlerath, 1985]. Аминокислотные последовательности CYP1A2 человека и CYP1A2 крысы идентичны на 75% [Jaiswal, 1987]. Следует отметить, что разработано большое число систем экспрессии CYP1A2 [Eugster, 1993; Sandhu, 1994]. Данный белок чаще всего выделяется в высокоспиновом состоянии. Для CYP1A2 характерны следующие специфические реакциями: О-деэтилирование 7-этоксирезоруфина [Glass, 1988; Burke, 1994], О-деэтилирование фенацетина [Pang, 1985; Jensen, 1995],

N-деметилирование кофеина [Tassaneeyakul, 1994; Notarianni, 1995] и N-гидроксилирование ряда гетероциклических аминов [Yamazoe, 1984; Boobis, 1994]. Рекомбинантный CYP1A2 человека и CYP1A2, выделенный из микросом печени крысы, имеют сходный спектр каталитической активности, хотя существуют и некоторые отличия. Скорость О-деэтилирования 7-метоксирезоруфина у крысы выше, чем у человека, и составляет 1,5 и 0,3 нмоль продукта в минуту на нмоль цитохрома Р450, соответственно. Скорость N-гидроксилирования 2-амино-З,8-диметилимидазо[4,5-f] хиноксалина (MelQx) выше у человека, чем у крысы - 3,0 и 0,5 нмоль продукта в минуту на нмоль цитохрома Р450, соответственно. С другой стороны, N-гидроксилирование, например, 2-амино-1-метил-6-фенилимидазо [4,5-Ь]пиридина (PhIP) оба цитохрома осуществляют с одинаковой скоростью - 4,0 нмоль продукта в минуту на нмоль цитохрома Р450. Канцерогенные соединения MelQx и PhIP образуются при кулинарной обработке мяса, причем N-гидроксилирование этих соединений, катализируемое CYP1A2, является основным путем метаболизма, приводящим к образованию мутагенных производных [Eaton, 1995; Gooderham, 1997].

Иммунохимические исследования показали, что содержание CYP1A2 в микросомах печени человека варьирует в среднем от 10 до 245 пмоль/мг белка, а в микросомах печени интактных крыс - от 4 до 35 пмоль/мг белка. Уровень содержания CYP1A2 меняется в зависимости от состояния, диеты и индивидуальных особенностей организма [Guengerich, 1997]. Индукция CYP1A2, т.е. значительное увеличение синтеза фермента, может быть обусловлена воздействием сигаретного дыма, употреблением определенных лекарственных средств, таких как оральные контрацептивы, барбитураты или некоторые анестетики, или проживанием в областях с загрязненной окружающей средой.

Характерными субстратами CYP1A2 являются полициклические, гетероциклические и/или галогенированные углеводороды. Субстратами CYP1A2 являются многие экзогенные канцерогены и лекарства, а также эндогенные стероиды. Ингибирование CYP1A2 обычно носит конкурентный характер. Очень часто такими конкурирующими между собой соединениями являются лекарства и

ксенобиотики, входящие в состав продуктов питания. Клиническое значение такого рода взаимодействия зависит от относительных концентраций лекарств, а также от индивидуальных особенностей пациента [Hansten, 1993]. Например, многие представители группы хинолонов и фторхинолонов, которые широко используются как антибактериальные средства, являются конкурентными и обратимыми ингибиторами CYP1A2. Одновременный прием ципрофлоксацина и теофиллина может привести к повышению концентрации теофиллина в крови [Gillum, 1993], а если совместно с ципрофлоксацином применяется и циметидин, тоже являющийся специфическим ингибитором CYP1A2, метаболизм теофиллина подавляется практически полностью [Davis, 1992].

Именно участие CYP1A2 в окислительном метаболизме некоторых лекарств иногда ослабляет терапевтический эффект лекарственных средств и/или приводит к проявлению многих побочных действий. Поэтому, вещества, способные ингибировать CYP1A2, могут быть полезны для профилактики онкологических заболеваний как при лекарственной терапии, так и при контакте с вредными химическими соединениями на производстве, в быту или при проживании в экологически неблагополучных районах.

4Учитывая вышесказанное, CYP1A2 представляется нам объектом, заслуживающим внимания исследователей. Особенно важны подходы, позволяющие прогнозировать структурные и функциональные особенности данного фермента и определять круг возможных лигандов CYP1A2. Определение таких потенциальных лигандов может служить основой как для выбора ингибиторов CYP1A2, так и для предсказания особенностей метаболизма известных или вновь созданных лекарственных средств.

Создание новых лекарственных средств

Взаимодействие лекарственных соединений с макромолекулами-мишенями, такими как белки и нуклеиновые кислоты, часто лежит в основе молекулярных механизмов действия лекарств. Образование комплексов типа лиганд-мишень характерно для действия биологически активных соединений, в том числе активаторов и ингибиторов различных ферментов. В таких комплексах молекулы-лиганды пространственно комплементарны участку связывания на поверхности белка и удерживаются на нем благодаря различным видам взаимодействия (кулоновские, вандерваальсовы, водородные связи и т.п.).

Один из подходов к созданию новых лекарственных препаратов включает поиск в компьютерных банках данных, содержащих описание сотен тысяч структур низкомолекулярных веществ, новых базовых структур, комплементарных функционально важным участкам белков. Такой поиск может осуществляться различными методами, которые можно разделить на два класса:

1) Прямой поиск - методы, основанные на знании структуры места связывания лиганда в макромолекуле-мишени. В их основе лежат методы компьютерной молекулярной графики и/или молекулярного докинга.

2) Непрямой поиск - методы, основанные на знании структур и свойств известных лигандов. Эта группа включает в себя методы ОБАК.: построение фармакофоров, поиск по общим элементам структуры, ЗБ-£)ЗАК с использованием СоМЕА.

Методы молекулярного докинга

Вычислительный эксперимент, позволяющий выявить

пространственное соответствие структур лиганда и белка, называется процедурой геометрического докинга. Однако пространственная комплементарность лиганда к рецепторному участку является необходимым, но далеко не всегда достаточным условием эффективного связывания. Поэтому геометрический докинг как средство поиска потенциальных лигандов среди десятков и сотен тысяч органических соединений должен сочетаться с оценкой энергии

взаимодействия лиганда с белком, а также с процедурами, позволяющими в определенных пределах максимизировать эту энергию. Такого рода компьютерное моделирование взаимодействия молекулы лекарства с его биологической мишенью позволяет выявить принципиально новое вещество, которое могло бы служить лигандом для макромолекулы-мишени с известной структурой. Новые лиганды могут быть созданы с помощью компьютерного моделирования de novo или обнаружены в существующих банках данных низкомолекулярных химических соединений [Арчаков, 1996] .

Создание лигандов de novo

Данная группа методов носит название фрагментарных и позволяет создать новое фармакологически активное соединение, оперируя библиотекой молекулярных фрагментов. Новые небольшие молекулы строятся внутри определенного места связывания, при этом критерием успешного присоединения дополнительных фрагментов служит увеличение числа благоприятных контактов молекул лиганда и мишени. Фрагментарные методы могут быть разделены на две основные подгруппы, которые можно определить как восходящие (build-up) методы и методы конструирования промежуточных элементов (bridging).

Восходящие методы характеризуются тем, что единственн�