Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы с мембранами эритроцитов и тубулином

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы с мембранами эритроцитов и тубулином"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА Н ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ пм.М.В.Ломоносова

НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ

На правах рукописи

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ С МЕМБРАНАМИ ЭРИТРОЦИТОВ И ТУБУЛИНОМ (03.00.04 - Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в отделе биохимии животном клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологическиих наук

В.И.Муронец

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Н.Б.Гусев

кандидат биологических наук, ст.н.сотр. Т. Б. Еронина

Ведущее учреждение: Институт биомедицинской химии РАМН.

Защита состоится 1996 г. в " часов на

заседании Специализированного Совета Д. 053.05.32 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: г.Москва 119899, Ленинские горы, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан £г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

М.В.Иванов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За два последних десятилетия накопилось много информации о взаимодействии ферментов не только друг с другом, но и с различными структурными элементами клеток. Однако возможное функциональное значение такого рода взаимодействий в большинстве случаев остается неясным. Наиболее подробно было исследовано взаимодействие D-глицеральдегид-З-фосфатдегндрогеназы (ГАФД, КФ 1.2.1.12) с интегральным белковым компонентом мембраны эритроцитов - так называемым белком полосы 3. На основании многочисленных работ группы Стека сложилось четкое представление об ингибирующем действии этого белка на активность ГАФД [Steck and Yu, 1975; Stek et al., 1982], что привело к возникновению ряда гипотез о роди адсорбции ГАФД на мембране эритроцитов в регуляции гликолиза в этих клетках. Однако исследованное недавно взаимодействие ГАФД с белком, формирующим мпкротрубочки - тубулином - заставило по-иному взглянуть на полученные Стеком результаты. Оказалось, что в условиях, близких к использованным в работах Стека, тубулин очень прочно связывается с ГАФД и ингибирует этот фермент. Незначительное же повышение ионной силы полностью снимает пнгибирование. хотя взаимодействие между ГАФД и тубулином сохраняется [Muronetz et al. 1994]. Можно было предположить, что пнгибирование активности ГАФД (а, возможно, и других N.AD-заиисимых дегидрогеназ) тубулином не имеет физиологического значения, поскольку минимальное повышение ионной силы приводит к его исчезновению. Те же опыты свидетельствовали о возможности функционирования ГАФД в связанном с тубулином (и, вероятно, с микротрубочками)состоянии.

Эти наблюдения послужили импульсом для проведения данной работы, в которой мы исследовали взаимодействие ГАФД и лактатдегпдрогеназы (ЛДГ, КФ 1.1.1.27) с другим структурным компонентом клетки - мембранами эритроцитов. Наличие в белке полосы 3 и в тубулине сходных "кислых" фрагментов позволяло предположить единый .механизм взаимодействия \АО-завпсп.мых дегидрогепаз с этими двумя структурными элементами клетки. Можно было ожидать, что при повышении ионной силы сохранится взаимодействие дегидрогеназ с мембранами эритроцитов, а иш ибпрование их активности устранится. Наблюдение сохранения активности NAD-зависимых дегидрогеназ в связанном с мембранами и тубулином состоянии могло бы послужить основой для понимания роли адсорбции этих ферментов в регуляции гликолиза.

Целью исследования прежде всего было выявление корреляции между адсорбцией двух NAD-зависимых дегидрогеназ на мембране эритроцитов в разных условиях и изменением их каталитической активности. Другой задачей работы было изучение взаимодействия ЛДГ с тубулином в тех же условиях, в которых ранее изучалось его связывание с ГАФД, а также исследование комплексов двух дегидрогеназ с тубулином методом седиментационного анализа.

Научная новизна. В работе было впервые показано, что при низкой ионной силе лактатдегидрогеназа образует прочные комплексы с димерной формой тубулина, а также с мембранами эритроцитов, причем активность фермента при этом снижается. Повышение ионной силы приводит к устранению ингибирующего действия тубулина и мембран из-за диссоциации таких комплексов на исходные компоненты. На мембране эритроцитов обнаружены также участки связывания для ЛДГ, не ингибирующне активность фермента и сохраняющиеся как при низкой, так и при высокой ионной силе. Показано также, что ГАФД связывается с мембранами эритроцитов при низкой и высокой ионной силе, однако в последнем случае ее активность не изменяется. Таким образом, можно сделать вывод о том, что в условиях, близких к физиологическим, обе NAD-зависимые дегидрогеназы гликолиза адсорбируются на мембране эритроцитов (вероятно, в разных участках), причем их активность при этом сохраняется.

Практическое значение работы состоит в том, что полученные в ней результаты позволяют выяснить, как влияет адсорбция двух NAD-зависимых дегидрогеназ на структурных элементах клеток на свойства этих ферментов, а, следовательно, и на регуляцию гликолиза. Эти наблюдения могут служить основой для создания концепций о механизмах регуляции метаболизма в эритроцитах. Полученная информация может быть использована при чтении спецкурсов на кафедре биохимии биологического факультета, а также на других кафедрах биохимии университетов и медицинских институтов.

Апробация. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, на международном симпозиуме по интегральной биохимии (Барселона, 1994), на международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии. Наследие А.Н.Белозерского" (Москва, 1995), на международной конференции "Биокатализ-95" (Суздаль, 1995), на всероссийской конференции студентов и аспирантов "Ломоносов-95" (Москва, 1995) и на ежегодном съезде германского общества клеточной биологии (Гамбург. 1996).

Публикации. Результаты исследования изложены в 4-х печатных работах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит/л^страниц машинописного текста, таблиц и Д./.. рисунков. Список литературы включает/^источников.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

D-глицеральдегид-З-фосфат (3-ФГА) получали по методу Шевчука [Szewczuk et al., 1961]. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу выделяли из мышц кролика по методу Хилла [Hill et al..1975]. Эритроцитарную массу из крови человека получали со станции переливания крови. Тубулин из мозга быка выделяли по методу Кирияма и Бориси [Kyriyama and Borisy, 1981].

QnpeOe,lenue Komteumpaauu белка. Концентрацию ГАФД из мышц кролика и ЛДГ из мышц свиньи определяли по методу Бредфорд [Bradford, 1976] при 595 нм, используя калибровочные графики, сделанные с этими же белками, и спектрофотометрически при 280 нм, используя известные коэффициенты экстинкции (все коэффициенты приведены для растворов концентрации 1 мг/мл): ГАФД (холофермент) - 1.0; ЛДГ - 1,45. Концентрацию тубулина и цитоплазматпческого фрагмента белка полосы 3 определяли спектрофотометрически (А°',% icm. :so - соответственно 1,15 и 0,63 ).

Молекулярные массы белков считали равными: ГАФД - 144 кДа, ЛДГ - 140 кДа, тубулин - 100 кДа, цитоплазматический фрагмент белка полосы 3 - 43 кДа.

Определение активности. Активность дегидрогеназ определяли спектрофотометрически при 25 °С в среде следующего состава: 100 мМ глицин, 50 мМ калий-фосфат, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ NAD, 0.5 мМ 3-ФГА. рН 8,9 (для ГАФД) или 100 мМ калий-фосфат, 1 мМ ЭДТА, 0,4 мМ NFADH, 0,4 мМ пируват, рН 7,4 (для ЛДГ). В опытах по изучению влияния тубулина, белка полосы 3 и мембран эритроцитов на активность дегидрогеназ состав среды изменяли следующим образом: для ГАФД - 25 мМ Hepes/NaOH, 0,1 мМ арсенат Na ^ 0,5 мМ ЭДТА . 0,1 мМ NAD, 0,1 мМ 3-ФГА, рН 7,0, а для ЛДГ - 10 мМ Hepes/NaOH, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол (ДТТ), 25 мкМ NADH, 0.2 мМ пируват, рН 6,9. В отдельных экспериментах использовали те же буферы с добавлением 0,15 М NaCl. В смесь для определения активности вносили различные количества тубулина (растворимого или иммобилизованного на сефарозе), цитоплазматпческого

фрагмента белка полосы 3 или мембран эритроцитов и исследовали п.\ влияние на каталитические свойства дегпдрогеназ.

Получение мембран эритроцитов проводили по методу Додж и соавт. [Dodge et al.. 1963]. Полученные мембраны несколько раз отмывали от гемоглобина буфером для лизиса и переводили в буфер, используемым в последующем для измерения активности ферментов н их связывания. Все операции проводились при 4 °С. Отмытые мембраны использовались в течение 24 ч. Количество "теней" эритроцитов в препаратах мембран определяли с помощью микроскопии в камере Горяева.

Выделение иитоплазматического фрагмента белка полосы 3 мембран эритроцитов. Для получения цитоплазматического фрагмента белка полосы 3 использовали метод, предложенный Беннеттом и Стенбаком [Bennet and Stenbuck, 1980]. Отмытые от гемоглобина мембраны эритроцитов освобождали от спектрина и актина, получали "вывернутые" везикулы. Везикулы обрабатывали а-хнмотрнпсином и проводили очистку цитоплазматического фрагмента на ДЭАЭ-целлюлозе. По результатам электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия полученный препарат содержал основной пик с молекулярной массой 43 кДа (цитоплазматический фрагмент белка полосы 3), дополнительный компонент с молекулярной массой 23 кДа (кислый участок цитоплазматического фрагмента) и незначительное количество низкомолекулярных полипептидов.

Иммобилизация белков. Тубулин, полученный в димерной форме, был иммобилизован на сефарозе-4В, активированной BrCN (30 мг BrCN на 1 г влажного геля сефарозы) по методу, описанному Чередниковой и др. [Cherednikova et al., 1980]. Концентрацию иммобилизованного белка определяли по модифицированному методу Бредфорд [Asryants et. al.. 1985].

Изучение связывания дегидроггназ с мембранами эритроцитов проводили следующим образом. Отмытые мембраны суспендировали в соответствующих буферах. В пробы помещали одинаковое количество мембран и титровали их тем или иным ферментом, увеличивая его концентрацию. Пробы инкубировали в течение 20 минут при 25 °С, периодически перемешивая, и центрифугировали 10 минут. Из проб отбирали аликвоты для измерения в супернатанте количества несвязавшегося фермента (по белку). Из кривой титрования (зависимость концентрации связанного белка дегидрогеназы от концентрации свободного фермента) определяли Кд с помощью программы нелинейной регрессии, используя уравнение: А = А™* [Е] I Кд + [Е], где А - концентрация связанного белка, Ainax " сорбционная емкость белка, [Е] - концентрация свободного фермента в растворе.

Кд - кажущаяся константа диссоциации белкового комплекса. Количество фермента, связывающегося с мембраной, определяли в расчете на 100 мкг белка мембран или на одну "тень" эритроцитов..

Изучение связывания лактатдегидрогеназы с тубулином. Исследование связывания ЛДГ с иммобилизованным тубулином проводили сходным образом, используя вместо препаратов мембран суспензию связанного с сефарозой белка согласно описанному ранее методу [Muronetzet al., 1994].

Седиментационный анализ. Опыты по седиментации проводили на аналитической ультрацентрифуге Beckman Spinko Е с использованием фотоэлектрической сканирующей приставки при температуре 4 °С. Коэффициенты седиментации рассчитывали для температуры 20 °С.

Измерение интенсивности флуоресценции проводили при температуре 20 °С на спектрофлуориметре Hitachi MPF-4, используя длину волны возбуждения 380 нм. Спектры эмиссии флуоресценции снимали в пределах от 400 до 600 нм. При расчетах использовали изменение интенсивности флуоресценции в максимуме эмиссии (при длине волны 468 нм).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Взаимодействие лактатдегидуогеиазы с тубулином.

Взаимодействие ГАФД с тубулином было изучено достаточно подробно кинетическими методами, а также с использованием иммобилизации одного из партнеров на нерастворимом носителе. В этой работе мы прежде всего попытались исследовать возможность ассоциации с тубулином другой NAD-зависимой дегидрогеназы гликолиза - лактатдегидрогеназы. Оказалось, что при низкой ионной силе и ненасыщающих концентрациях субстратов (10 мМ Hepes/NaOH, 0.5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 25 мкМ NADH, 0,2 мМ пируват, рН 6,9) тубулин является эффективным ингибитором лактатдегидрогеназы -добавление увеличивающихся концентраций тубулина приводило к снижению активности фермента (рис.1, кривая 1). Ингнбпрование наблюдалось при титровании ЛДГ как растворимым, так и иммобилизованным на сефарозе тубулином (рис. 1, кривая 2), причем максимальное снижение активности составляло соответственно 75-80% и 100% для двух форм тубулина.

Были также исследованы параметры связывания растворимой ЛДГ с иммобилизованным тубулином. На рисунке 2 изображены кривые связывания двух белков в различных условиях. В отсутствие субстратов и кофакторов стехиометрия связывания составлял;) 1.66±0,02 молей дпмера тубулина на тетрамер ЛДГ, а Кд - 13.6±3 нМ (рис. 2, кривая 1 п таблица 1).

сГ л

й I

!< 5 (

га

К а

I

Л

с а ь-X

о о

X

<5

Ь.0 <.0 2Л 3.0 Чй -[Губ], мкМ

з

1

I -7 г

2 3

Ю

Ь

к а о

С ч с

1

0.5 1.0 1.5 2.0 [ЛДПсвоб., мкМ

Рис.1. Ингибирование каталитической активности ЛДГ туоулииом. Активность измеряли при низкой ионной силе (кривые 1 и 2) и в присутствии 0,15 М ИаС1 (кривые 3 и 4). Концентрация ЛДГ 1.32 нМ. Кривые 1 (•) и 3 (■) - растворимый тубулпн, кривые 2 (о) и 4 (□) - иммобилизованный тубулин.

Рис. 2. Связывание ЛДГ с туоулииом. Иммобилизованный тубулин (0,7 мкМ) инкубировали с различными концентрациями ЛДГ в 10 мМ Нерез, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, рН 6,9 (1) и в том же буфере с добавлением 0,15 М ИаС1 (2).

Таблица 1. Параметры взаимодействия лактатдегидрогеиазы с туоулииом.

Ингибироваиие ЛДГ Связывание ЛДГ с иммобилизованным тубулином

растворимым тубулином ' иммобилизованным тубулином без субстратов в присутствии субстратов (0.2 мМпируват, 44 мкМ МАОН)

Остаточная активность, % 20-25 0 — —

Кажущаяся Кё, нМ 33±5 15±2 13.6+3 48.7±3

Стехиометрия связывания (теграмер ЛДГ: димер тубулпна) — — 1 : 1.66 1 : 1.4

Полученные значения Кд практически идентичны тем, которые были рассчитаны из кривых зависимости ингибирования ЛДГ от концентрации иммобилизованного тубулина - 15±2 нМ. Более высокие значения Кд (33±5 нМ), рассчитанные из данных по ингнбированию ЛДГ растворимым тубулином, вероятно, свидетельствуют о повышении прочности ассоциации двух белков при иммобилизации одного из них на сефарозе. Увеличение концентрации кофактора (NADH) приводило к уменьшению эффективности ингибирования ЛДГ тубулином, а также к ослаблению связывания ЛДГ с иммобилизованным тубулином (таблица 1).

При высокой ионной силе (в исходный буфер добавляли 0,15 М NaCl) не было обнаружено ни ингибирующего действия тубулина, ни связывания ЛДГ с тубулином (рис. 1. кривые 3, 4; рис. 2, кривая 2).

Возможным объяснением ингибирующего влияния' тубулина могло быть взаимодействие отрицательно-заряженной С-концевой части этого белка с нуклеотид-связывающим доменом дегидрогеназы, который обладает сродством к отрицательно-заряженным лигандам. Подтверждением этому может служить не только защита от ингибирования кофактором, но и обнаруженная нами стехиометрия связывания - приблизительно один мономер тубулина" на один активный центр ЛДГ. Вероятно, связывание кофактора с активным центром ЛДГ препятствует взаимодействию с ним тубулина и, следовательно, ингибнрованию ферментативной активности.

Следует также отметить,, что по сравнению с известными данными о связывании тубулина с ГАФД [Muronetz, 1994], взаимодействие ЛДГ с тубулином является менее прочным ( Кд равно 13,6 нМ ), а кроме того при высокой ионной силе полностью отсутствует связывание двух этих белков друг с другом (тогда как в случае. ГАФД и тубулина связывание сохраняется, но с измененными параметрами).

Поскольку увеличение ионной силы приводило к уменьшению сродства ЛДГ к тубулину, мы провели исследование влияния ионной силы на интенсивность,, флуоресценции 8-аналино-1-нафталин сульфоната (АНС) в присутствии тубулина, так как в одной из работ [Ward, 19S5], было показано увеличение интенсивности излучения комплекса АНС-тубулпн в присутствии ионов Mg+: . На рисунке 3 изображено возрастание интенсивности флуоресценции АНС в присутствии тубулина при титровании NaCl. Вероятно, добавление соли вызывает конформационные изменения т\булпна, что снижает его сродство к ЛДГ (концентрация NaCl. вызывающая 50% от максимального эффекта, равна 25 .мМ). Таким образом, отсутствие связывания ЛДГ с тубулином вызвано, по-видимому, изменением конформацпи тубулина. в результате чего он перестает взаимодействовать с ферментом.

2. Седимеитаииоииын анализ комплексов ЛДГ и ГАФД с тубулипом.

Опыты по ультрацентрифугированию были проведены в тех же условиях, в которых наблюдалось ингибирование ГАФД и ЛДГ тубулином, т.е. при низкой ионной силе (25 мМ НерезЛЧаОН, 0,1 мМ арсенат натрия, 0,5 мМ ЭДТА, рН 7,0 для ГАФД и 10 мМ Нерез/ЫаОН, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, рН 6,9 - для ЛДП- Оказалось, что при низкой ионной силе действительно образуются высокомолекулярные ассоциаты тубулина с ГАФД и лактатдегидрогеназой. Об этом прежде всего свидетельствуют опыты, проведенные при 60 000 об/мин (262 000 g) при различных соотношениях молярных концентраций ГАФД:тубулин и лактатдегидрогеназаггубулин. Оказалось, что при седиментационном анализе смеси двух белков в таких условиях можно обнаружить только тот из них, который находится в избытке, поскольку высокомолекулярные комплексы осаждаются практически мгновенно. Коэффициенты седиментации оставшихся в растворе белков - ГАФД, лактатдегидрогеназы и тубулина - оказались равными соответственно 7,9±0,3 Б, 6,8±0,09 Б и 4,87+0,12 - 5,19±0,4 Б (таблица 2). Практически такие же величины коэффициентов седиментации были определены для этих белков при раздельном центрифугировании.

Коэффициенты седиментации высокомолекулярных комплексов ГЛФД стубулпном п ЛДГ с тубулпном удалось определить только при проведении центрифугирования при низких скоростях.

Таблица 2. Коэффициенты седиментации комплексов тудулииа с

N А О-зависиммми оегиорогеиазами__

Концентрация белков в пробе, мкМ Коэффициенты седиментации, взол Молярное соотношение белков в комплексе (димер тубулина: тетрамер фермента)

Комплекс Компонент, добавленный в избытке

Комплекс ГАФД-тубулин ГАФД - 8.6, тубулин - 2.6 74.9±9.35 7.9±0.3 1 : 1.49

Комплекс ГАФД-тубулин ГАФД - 2.6, тубулин - 8.3 168.3±42 .5 4.87+0.12 1.91 : 1-

Комплекс ЛДГ-тубулин ЛДГ - 1.84, тубулин - 1.4 >25 ООО 6.8+0.09 1 : 1.58

Комплекс ЛДГ-тубулин ЛДГ - 0.36, тубулин -1.49 > 1 ООО 5.19+0.4 2.07 : 1

Коэффициент седиментации комплекса тубулина с ГАФД, определенный после добавления избытка дегидрогеназы при центрифугировании со скоростью 4000 об/мин (1163 равен 74,9+9,35 Б. Можно также рассчитать молярное соотношение тубулина и дегидрогеназ в таких высокомолекулярных комплексах, исходя из количества остающегося в надосадочной жидкости компонента, добавленного в избытке. Оказалось, что молярное соотношение компонентов в комплексе составляет около одного димера тубулина на 1,5 тетрамера ГАФД. Для комплексов ЛДГ-тубулин при избытке дегидрогеназы характерно образование чрезвычайно высокомолекулярных комплексов с коэффициентами седиментации более 25 ООО Б, что свидетельствует о выраженной агрегации белков. При добавлении избытка тубулина к ЛДГ размеры комплексов существенно снижаются - до ~ 1044±93 Б, а молярное соотношение компонентов в комплексе становится равным один тетрамер ЛДГ на два димера тубулина. В случае ГАФД добавление избытка тубулина, напротив, приводит к увеличению массы комплексов (до 168 Б), а соотношение компонентов становится равным двум дпмерам тубулина на один тетрамер ГАФД. Эти опыты свидетельствуют не только об

образовании комплексов между дегидрогеназами и тубулином, но и о том, что характер связывания двух дегидрогеназ с тубулином сушсственно отличается. Причины этих отличий остаются неясными. Можно лишь заметить, что активные центры в тетрамерах двух дегидрогеназ расположены по-разному: в ГЛФД четыре активных центра сближены друг с другом и находятся ближе к центру белковой глобулы, а в ЛДГ активные центры максимально отдалены друг от друга и локализованы на периферии молекулы.■ Возможно, именно это обстоятельство приводит к формированию более крупных агрегатов ЛДГ с тубулином, поскольку в этом случае облегчается взаимодействие одного димера тубулина с активными центрами двух разных теграмеров дегидрогеназы.

Таким образом, из результатов настоящей работы, а также данных, полученных ранее [Мигопе1г, 1994], можно сделать вывод, что при низкой ионной силе обе дегидрогеназы ингибируются тубулином сходным образом и, вероятно, по единому механизму. Иная ситуация наблюдается при повышении ионной силы до физиологических значений. В этом случае ГАФД остается в связанном с тубулином состоянии, не теряя ферментативной активности, тогда как ЛДГ не взаимодействует с тубулином и, естественно, не изменяет своих каталитических параметров. Можно предположить, что ЛДГ имеет лишь один тип участков связывания с тубулином, взаимодействие с которым становится невозможным при связывании с ферментом ЫАЭН, а также при повышении ионной силы. С другой стороны, ГАФД, вероятно, имеет два типа участков связывания: участки с высоким сродством к тубулипу (не проявляющиеся при высокой ионной силе или добавлении кофакторов), взаимодействие с которыми приводит к пнгнбпрованшо ферментативной активности, и участки с низким сродством к тубулину, сохраняющиеся при высокой ионной силен не влияющие на активность дегидрогеназы.

3. Взаимодействие ГАФД с мембранами эритроцитов и белком полосы 3.

'■ Предположив, что взаимодействие двух ЫЛО-зависимых дегидрогеназ с белком полосы 3 мембран эритроцитов (а точнее, с его "кислым хвостом") может подчиняться тем же закономерностям, что и их связывание с тубулинйм, мы исследовали связывание ГАФД и ЛДГ с мембранами эритроцитов в различных условиях. Как уже упоминалось выше, при низкой ионной силе интегральный компонент мембран эритроцитов - белок полосы 3 - вызывает пнгпбирование ГАФД. Аналогичное действие оказывают и мембраны эритроциюв. На рис. 4 (крнвай 1)' приведены полученные нами результаты по ингибнрующему действию мембран эритроцитов на ГАФД.

2 0.9-1. "

go.-t O.o L

О м и at w ss> 6n id го

Мембраны эритроцитов,-мкг белка/мл

» :

ь 0.2

о о.1

t 0.0 ---

О 00 Qi) 08 (.2 16 2.0 г.н

2.8

[Белок полосы 3]/[ГАФД] (мкМ/мкМ)

Рис. 4. Ингибирование каталитической активности ГА ФД мембранами эритроцитов. Активность фермента измеряли в стандартной среде (см.методы) (кривая 1) и в среде с добавлением с 0,15 М NaCl (кривая 2). Концентрация ГАФД 0,083 мкМ.

Рис. 5. Ингибирование каталитической активности ГАФД цитотазматическим фрагментом белка полосы 3. Условия измерения активности идентичны описанным выше (рис. 4). Концентрация ГАФД 0,042 мкМ (в расчете на тетрамер). (1) - без добавления NaCl, (2) - с добавлением 0,15 М NaCl.

Из этих данных следует, что добавление отмытых мембран эритроцитов обеспечивает полное ингибирование активности ГАФД (при условии, что активность этого фермента измеряется при низкой ионной силе и ненасыщающих концентрациях субстратов: 0,1 мМ NAD н 0,1 мМ 3-ФГА).

Аналогичное влияние оказывает на активность ГАФД и изолированный из мембран эритроцитов цито плазматический фрагмент белка полосы 3 (рис. 5, кривая 1).

Константа диссоциации комплекса ГАФД-фрагмент белка полосы 3 (определенная из данных по ингибированию) составляет 0,15+0,025 мкМ. Важно отметить, что, как и в случае с тубулином, ингибирующее действие и мембран эритроцитов, и фрагмента белка полосы 3 практически полностью снимается при повышении ионной силы до физиологических значений (рис. 4 и 5, кривые 2).

Далее мы исследовали связывание ГАФД с мембранами эритроцитов в тех же условиях, при которых были поставлены опыты по ингибированию (рис. 6).

Рис. 6. Связывание ГАФД с мембранами эритроцитов. Отмытые мембраны

эритроцитов (110 мкг белка/мл) инкубировали с 'различными концентрациями фермента(0,35-16,1мкМ) в буфере, содержащем 25 мМ Hepes, 0,1 мМ арсенат натрия, 0,5 мМ ЭДТА, 0,1 мМ NAD, рН 7,0, без добавления (!) и с добавлением(2) 0,15 М NaCl.

Из приведенных данных видно, что в присутствии 0,1 мМ NAD и при низкой ионной силе'наблюдается эффективное связывание ГАФД с мембранами эритроцитов с Кд, равной 0,13+0,04 мкМ (максимальное количество связанного фермента в расчете на 100 мкг белка мембран эритроцитов равно 1,04±0,05 нмолей или 14,8 х 106 молекул дегидрогеназы на "тень" эритроцитов) (рис.6, кривая 1). Добавление обоих субстратов реакции (0,1 мМ NAD и 0,1 мМ 3-ФГА), вызывающее переход, по крайней мере, части молекул фермента в ацилированное состояние, приводит к некоторому ослаблению сродства ГАФД к мембранам эритроцитов (Кд увеличивается до 0,43 ±0,19 мкМ) (таблица 3).

При повышении ионной силы (после добавления 0,15 М NaCl) количество связывающегося фермента уменьшается незначительно (до 0,75+0,18 нмолей на 100 мкг белка эритроцитов), а Кд возрастает до 4,43±2,57 мкМ (рис. 6, кривая 2).

Последнее наблюдение свидетельствует о том, что при физиологических значениях ионной силы ГАФД достаточно прочно связывается с мембранами эритроцитов, причем ингибирования ее активности в этих условиях не наблюдается. Причина некоторого снижения количества дегидрогеназы, связывающейся при высокой ионной силе, может быть связана с тем, что добавление 0,15 М NaCl, вероятно, вызывает образование замкнутых везикул из некоторого количества мембран эритроцитов. Это приводит к тому, что часть внутренней поверхности мембран эритроцитов (и, следовательно, цитоплазматических' фрагментов белка полосы три) становится недоступной для дегидрогеназы. Однако, судя по данным микроскопии, количество таких замкнутых везикул невелико. Возможно, интенсивное отмывание мембран (в частности 0,5 М NaCl), вызывающее удаление спектрпна, актина и других белков, приводит к тому, что большая часть мембран остается в незамкнутом состоянии или оказывается "вывернутой" и, следовательно, доступной для взаимодействия с дегидрогепазами.

1.5 ,

«

2 | *

Z I N ----

Г ш V « •

П т.

m к»

° Г 2

е D.51 _ ~

2 f — %

I я я

0.0к-'-'-

О 5 10 15

[ГАФД]своб., мкМ

Отсутствие ингпбнрующего действия мембран при высокой ионной силе можно было бы объяснить тем. что, переход фермента в ацплпрованное состояние (образование фосфоглицеронл-фермента) в присутствии субстратов реакции пли само по себе добавление субстратов в реакционную среду вызывает распад комплекса. ГАФД -ме.мбрана эритроцитов.

Для того, чтобы проверить это предположение, мы определили параметры связывания ГАФД с мембраной эритроцитов при высокой ионной силе в присутствии кофактора (0,1 мМ NAD), а также в присутствии обоих субстратов (0,1 яМ NAD и 0,1 мМ 3-ФГА). Оказалось, что ни в одном случае не наблюдалось уменьшения прочности комплекса (Кд 3,3-4,4 ±2,5 мкМ). Однако нельзя было исключить, что ацпл-фермент может подвергаться гидролизу за время, необходимое для проведения опытов по связыванию. Учитывая такую возможность, мы изучили взаимодействие ГАФД с мембранами в присутствии цистепна (50 мкМ), который, как было недавно показано [Kuzminskaya, 1993; Schmalhausen, 1995], предотвращает гидролиз ацпл-фермента. Однако и в этом случае не обнаружили изменений в параметрах связывания (Кд - 3,43±0,88 мкМ) (таблица 3).

Таблица 3. Параметры связывания ГАФД с мембранами эритроцитов

в присутствии субстратов.

Холофермент (0.1 мМ NAD) Ацил-фермент (0.1 мМ NAD, 0.1 мМ ФГА) Ацил-фермент (0.1 мМ NAD, 0.1 мМ ФГА. 50 мкМ цистеин)

Низкая ионная сила Кд = 0.13=0.04, мкМ N = 1.04+0.05 Кд = 0.4310.19, мкМ N = 0.54+0.08 Кд = 0.44±0.14, мкМ N = 0.59±0.07

В присутствии 0.15 М NaCl Кд = 4.43+2.57, мкМ N = 0.75+0.18 Кд = 3.26+2.69, мкМ N = 0.98±0.3 Кд = 3.43±0.88, мкМ N = 1.11 ±0.12

Кд - кажущаяся константа диссоциации N - количество нмолей ГАФД на 100 мкг белка мембран

Таким образом можно прийти к заключению, что при физиологических значениях рН и ионной силы ГАФД взаимодействует с мембранами эритроцитов, причем каталитическая активность

фермента при этом сохраняется. Вероятно, что, как и в случае с тубулнном, такой характер взаимодействия обусловлен наличием в молекуле фермента двух типов участков связывания, отличающихся как по сродству к "кислому фрагменту" белка полосы три, так и по влиянию на каталитические параметры ГАФД.

4. Взаимодействие ЛДГ с мембранами эритроцитов.

Структурное сходство между ГАФД и ЛДГ (присутствие Ь'АБ-связывающих доменов), а также сходный характер влияния тубулина на активность обеих дегидрогеназ, позволили нам предположить, что ЛДГ, так же как и ГАФД, может изменять активность в присутствии мембран эритроцитов. На рис. 7 представлены данные по ингибирующему действию мембран эритроцитов на активность ЛДГ.

л 03

й ог

I м

О

10.6 »05

<5 Ч

Рис. 7. Ингибирование каталитической активности ЛДГ мембранами эритроцитов. Активность фермента измеряли в присутствии различных концентраций мембран ("теней") эритроцитов в стандартной

среде (см. методы) (1) и в среде того же состава, но с добавлением 0,15 М КтаС1 (2). Концентрация ЛДГ 0,86 нМ.

о.о ол и м <.6 гл 2м га ы з£ — Мембраны эритроцитов, мкг белка/мл

1?

Из приведенных кривых следует, что активность ЛДГ снижается до постоянного остаточного уровня при добавлении небольших количеств мембран эритроцитов. Дальнейшее, даже весьма существенное, повышение концентрации мембран не приводит к полному ингибнрованию (сохраняется 20-30% от исходной активности фермента) (рис. 7, кривая 1) . Повышение ионной силы полностью устраняет ингибирующее действие мембран эритроцитов (рис.7, кривая 2).

Опыты по связыванию ЛДГ с мембранами эритроцитов действительно подтвердили достаточно прочное взаимодействие фермента с мембранами при низкой ионной силе (Кд=0.6±0,08 мкМ, количество адсорбированной ЛДГ - 1,8±0,1 нмолеп в расчете на 100 мкг белка мембран) (рис. 8. кривая 1).

Связывание ЛДГ с

2 15. ,__-мембранами эритроцитов.

| —Отмытые мембраны

■ - эритроцитов (96 мкг белка/мл)

| инкубировали с различными

1 концентрациями фермента(0,34-

3 о5г ^ мкМ) в буфере, содержащем =■ ' \ г %___10 мМ Нереэ, 0,5 мМ ЭДТА, 1

" мМ ДТТ, 25 мкМ

•15 "1.5 -П-25-Го РН 6-9' без добавления (1) и

ГППГ1 - .. с добавлением (2) 0,15 М МаС1.

[ЛДПсвоб., мкМ 4

Повышение ионной силы приводило к значительному уменьшению количества адсорбированного фермента (до 0,48±0,08 нмолей в расчете на 100 мкг белка мембран), тогда как прочность связывания практически не изменялась (Кд=0.76±0,42 мкМ) (рис. 8, кривая 2). Следует заметить, что число участков связывания лактатдегидрогеназы, не выявляемых при повышении ионной силы (1,32 нмоля на 100 мкг белка ) близко к числу участков связывания ГАФД (около 1 нмоля на 100 мкг белка мембран).

Схема, представленная на рис. 9, иллюстрирует возможные варианты взаимодействия МАБ-зависимых дегидрогеназ с тубулином и мембранами эритроцитов при различных значениях ионной силы.

По-видимому, при низкой ионной силе происходит связывание ЛДГ с двумя типами участков связывания на мембране эритроцитов (рис. 9, А). При взаимодействии с одним из них (вероятно, как и в случае с ГАФД - с "кислым" фрагментом белка полосы 3) активность ЛДГ полностью ингибируется, тогда как связывание с другим типом участков (их число составляет около 25% от общего числа участков связывания ЛДГ на мембранах) не приводит к каким-либо изменениям активности. Именно перераспределением ЛДГ между "ингпбирующими" и ''непнгибирующимп" участками связывания на мембране эритроцитов и обусловлено, вероятно, неполное подавление активности фермента при его титровании мембранами эритроцитов.

При повышении ионной силы связывание за счет "ингибирующпх" участков устраняется и, таким образом, ингпбированпе ЛДГ не проявляется (в этих условиях тубулин также не взаимодействует с ЛДГ) (рис. 9, Б). Однако ЛДГ в этом случае сохраняет способность адсорбироваться на "неингнбирующих" участках и катализировать в таком состоянии ферментативную реакцию.

0)

мембрана эритроцитов

мембрана эритроцитов

/А

Рис. 9. Схема взаимодействия N АО-зависимых дегидрогеназ с туоулином и мембранами эритроцитов при низкой (А) и высокой (Б) ионной силе. 1 - ЛДГ, 2 - тубулин, 3 - белок полосы 3, 4 - ГАФД, незаштрихованные символы - активный фермент, заштрихованные -неактивный.

Таким образом, нами было показано, что две ИАО-зависимые дегндрогеназы гликолиза эффективно ингибируются мембранами эритроцитов при низкой ионной силе и очень низких концентрациях субстратов и кофактора, вероятно, благодаря взаимодействию "кислого фрагмента" белка полосы три, локализованного в мембранах, с. К'АО-связывающпмн доменами ферментов. Это взаимодействие аналогично взаимодействию тубулина (также содержащего "кислый фрагмент") с этими дегпдрогеназами (настоящая работа, а также данные литературы [Мигошг. 1994]) (рис. 9, А).

Совершенно иной тип связывания дегндрогеназ с мембранами характерен для физиологических условий - при добавлении в среду инкубации 0,15 М хлористого натрия взаимодействие белков с мембраной сохраняется, однако ингнбпрующее действие мембран полностью исчезает (рис. 9, Б). В случае ГАФД эти наблюдения полностью совпадают с результатами опытов, полученных в системе ГАФД-тубулин. Вероятно, механизм взаимодействия ГАФД с тубулином и с цнтоплазматпческим фрагментом белка полосы 3, а также его функциональные последствия сходны, если не идентичны. ЛДГ же весьма прочно связывается с мембранами эритроцитов в участках, отличных от мест локализации белка полосы 3, причем такое связывание не изменяет ее каталитической активности.

Важно отметить, что в условиях, близких к физиологическим, две дегидрогеназы гликолиза, по-видимому, адсорбируются в разных областях мембраны эритроцитов, что может создавать сложности в передаче NADH из активного центра ГАФД в активный центр ЛДГ по сравнению с ситуацией, наблюдаемой в цитоплазме при свободном перемещении ферментов.

Таким образом, можно считать доказанным, что в условиях, близких к характерным для функционирования эритроцитов in vivo, ГАФД и ЛДГ могут адсорбироваться на мембранах и при этом осуществлять своп каталитические функции. Ингнбированне же активности этих дегндрогеназ белком полосы 3 и тубулином, наблюдаемое при очень низкой ионной силе и минимальных концентрациях субстратов, вероятно, не имеет сколь-либо существенного значения для регуляции метаболизма, хотя, безусловно, интересно с этимологической точки зрения для понимания особенностей функционирования этих ферментов.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что при низкой ■ ионной силе тубулин прочно связывается' с лактатдегидрогеназой и ингпбирует ее активность. Величины Кд, рассчитанные из опытов по ингибированию и по прямому связыванию, равны соответственно 15,0 и 13.6 нМ; стехиометрия связывания - 1,66 молей димера тубулина на тетрамер ЛДГ.

2. Показано, что в присутствии 0Л5 М \'аС1 лактатдегпдрогсназа не связывается с тубулнном ¡1 ипгиопрующее влияние тубулпна па активность фермента не проявляется.

3. Методом седиментационного анализа показано, что ЛДГ н ГАФД образуют высокомолекулярные комплексы с тубулнном.

4. Показано, что при низкой ионной силе мембраны эритроцитов ингибнруют активность двух NAD-зависимых дегидрогеназ -ГАФД и ЛДГ - на 100 и 70-80% соответственно. При этом Кд комплексов равны 0,13 и 0,6 мкМ, а количество связанных тетрамеров ферментов - 1,04 и 1,8 нмолей в расчете на 100 мкг белка мембран, соответственно.

5. Показано, что ГАФД и ЛДГ связываются с мембранами при физиологических значениях ионной силы (Кд равно 4,43 и 0.75 мкМ, а количество связанных тетрамеров ферментов - 0,75 и 0,4S нмолей в расчете на 100 мкг белка мембран, соответственно), сохраняя при этом свою каталитическую активность.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. V.I.Muronetz, N.A.Shcherbatova, N.K. Nagradova, B.N.Khoiodenko. Functional consequences of interaction between D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and 3-phosphoglycerate kinase. Abstr.of Symposium of Integrative Biochemistry, Barselona, Spain, 1994, p. 132.

2. N.A.Shcherbatova, V.I.Muronetz. Investigation of the complexes of tubulin with NAD-dependent dehydrogenases by ultracentrifugation. European Journal of Cell Biology, 1996, supplement 42, 69, p. 160.

3. V.I.Muronetz, N.A.Shcherbatova, N.K.Nagradova. Interaction of NAD-dependent dehydrogenases with human erythrocyte membranes.Evidence that glyceraldehyde-3-phosplvate dehydrogenase and lactate dehydrogenase are catalytically active in a membrane-bound state. - Biotechnology and Applied Biochemistry, 1996,_23, в печати.

4. H.A. Щербатова, H.K. Наградова, В.И. Муронец. Влияние мембран эритроцитов и тубулина на активность NAD-зависимых дегидрогеназ. - Биохимия, 1996, 61. в печати.