Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие фенольных соединений и гидрозитов

ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие фенольных соединений и гидрозитов"

госудл кя'веннш комитет kjccíiücícüil £кдшцш1 по imum-ff образованию

иркутский госудлрстпяшуи шшетппът ншно-ш^сждовлтшшм ии0г1п7т п'.олопш

Ли iipnrv?x рукописи

СЛКСОНОВ Нгумошп

'■иЗЛШОДЕИСТШЕ ФКНОЛШЯ СОЕДОЙШЙ ¡1 ПШХШТОВ 03.00.1В - гидробиология-

автореферат. -диссертации па соцокаяио учёной степени ••' 1< кандидата биологических наук

Á

1!або-ы выполнена в Яа^чно-ясследовагольском штотихусе биологии лрл Иркуашсои государственном университета,

Научный руиоаэди'оль: доктор биологических наук,

,профессор"Д.И.Стом Офвдалыше ошшошитц; доктор бислопгческах наук, ;

профессор О.П.Рсдаешо; кандидат биологических науи Е.В.Осипова

Ведущей зшрвждвадд: Красноярский государственный ушшроиг'м;

1 (

5

Защма состоится "¿¡/¿¿^^ШЪ т. в № чаоой т ыш-сдзлик оидайлизирошиого совета К 053.23.03 при 'Иркутском гооударстймноы уливарснтаге до адресу? 664003,' 'г. Иркутск, ул. Сухэ-Ватора, 5, .(Заолого-почьениый факультет ИГУ.

С аьгорс$ерато1.1 диссертации можно ознакомиться в'Цаучао^ ицйхаош'в Иркутского государственного университета»

Автора^арат разослал х* " . /. 1ЬЫ

Уч'ыий секретарь, рд1;1Ь1Пл;13яроваш!ОГО совоа'е, ь ,

цаидцдаъ.' биологических наук > Ь'.О.Кухшиская

ОБЩАЯ XAPAKTSВ1СТИKA РАБОТЫ

Актуальн петь темьч Изучению л прогнозирование состояния ВРД-|пн экосистем, основывающиеся на пр'инпшах попудяционнои экологии (Кокова, 1986), должно сопровождаться контролем за физиологическими и биохимическими процессам! ла органязмешшм, клеточном, су tí клеточном уровнях, что шкет бить использовано не только ддя промышленного мониторинга, но и для' понимания механизма токсического действия ксенобиотиков на гидробионтн (Крайнюкова, 1988; ¡Ория, 1988; Карнаухов, 1988; Malina , 1991).

Многокоипонентиость сбрасываемых вод, затрудняющая их исследование, необходимость анализа на только концентрации поступающих пе шест в, но и их действия на гидробионтов, заставляет всё большее витание уделять биологическим методам анализа качества природных и сточных вод (Брагинский, 1983; Филонко, I98b; Шуберт, 1988).

По объецу, концентрации, токсичности и по трудности очистки фенолсодерскадае сточике води целлюлозно-бумаглои, нефтехимической, хишческоК. фармацевтической отраслей прошшюкиоотй заившот одно из первых мест (Групко, ¡Сомова, IS78; Sohwai-ts , 1977) ¡1 поэтому изучение механизмов токсического действия фпноль;,ла соединений (ФС) на гддро&юктов шзет тшное значение для решения проблей санитарной гидробиологи;!, Исследование токсикодинашки эффектов, вь'зываемюс Ж, должно способствовать пониманию механизмов токсического действия <Х на гидрэбяонты, что ыояет быть полезный для разработки новья и вкбора адензатянх методов биоте «жирования сточпцх и природных вод.

Биотестироюпнс фелолсодермащгх стоадшх лод имеет своя асо-беяяоети, обусловленное склоячостьга ФС к, окислительным превра-гежош, резким различием то'.ихптотя, зависимостью их токсического эффекта от наличия у '¿ргакязыов, яслользугмпх дач биотос-с:;ролаш1Я, ферментов, оклеллюцнх фенолы (Стом, 1982; Барабой, 1984). В литературе яфетически, отсутствуют работы, в которых с,:.с,1япие фенолов на такие шпакетра как лопяая проницаемость ететочннх мембран, биоэлектрические потенциалы, ¡Тиуореоцсвдвя хлорофилла гкдрочашот* оценивали бы с учетом вшеизлешшяха особенностей,

С другой стороня ?як.хб параметры как окисление, аккуитуляг^ил, трансформация фенолов гпдрг.бионтаг-м достаточно подробно изучена (Кирео, Стом, 1936), Хогшдо но»еп известно о механизме окпелз-яия гидроуитами смесей фгаолов, хотя в реальных, сточных водах t

фенола присутствуют в виде смесей. Представляет интерес исследование Бозмокности использования закономерностей окисления ферменташ. гидрофитов смасей фенолов для развития методов энзяыодаагноотикп гидрофитов.

Целью ланиой работы было изучение механизмов взаимодействия факолышх токсикантов'и шдрофитов.

В соответствии с агам cJujm поставлены следующего задачи:

1, Изучить влияние фенольных соединенны на ионную проницаемость ¡¡лет; элодеи.

2, Сопоставить характер дейстЕнл полифенолов на мембранный потенциал, интенсивность фдуорзсцепвдн хлорофилла и движение ццтоплаз-ш клеток янтеллы,

3, Исследовать Епашшость и перспективы использования взаимодействия нолифенолов с фонодогшсдгшщили форыанташ гидрофитов для энзшлодаагностики и анализа фенольных соединений.

Тйордтичео^ое значение и научная новизна. Изучены ыехаиизш гокслческого действия ФС на гидрофиты, агращяе валную роль для . ионищаня процессов, нроисходода в водник растениях и экосистемах. Выявлена зависимость ыезд характером токсического действия нодпфенодов на гидрофит и (фзвко-хишчеоквш свойстгаш '1С, таки-ш 'как способность окисляться, растворяться в липадах, наличием у тест-объектов фенолоккславдих ферментов.

Показано, что виход электролитов из клеток элодея пра действии легяооккслякдихся нолифенолив в отличав от трудноокисляешх не зашоат от шшоглльности их молекул и сопровождается потаенным уровнен выхода углеводов.

Отмечено, что при действии п-бензохилояа и о-дифенода падение екоуости дккешгк ццтогихазш предшествовало сшшешш шмбран-пого потенциала и г;>псшпз флуоресценции хлорофилла клетки нител-дц, Установлено, что действие о-дпфенола на идклоз нигеллы имеет двухзтапяш характер; на первом этапе эффект определяется восстановленной исходной молекулой фенола, а на втором - претуществои-ио влиянием хияоиднцс продуктов с-дяфенолоксиддзкого окисления пирокатехина.

Кыдмексное ииплздоваяие (регистрация мембранного потеявда-ла, интенсивносй фдуоресцйдцня хлорофилла, скорости цинлоза, днглоатopiitci апаллз) аффектов о-ддфенола и п-бензохинока на глет-КЗ' нителлн позволило доказать наличие на поверхности клетки sai заы1с.шнх операторов шяЛоза. Именно на этих операторах и рвали-

Изучен процесс образования .интенсивно окрашенных продуктов црц инкубации гидрофитов. в водном растворе бинарной смеси двухатомных фенолов. Последовала возможность использования этой ¿иди--каториой реакции для определения активности псрокоидазн гидрофитов и для анализа '1С»

Практическое значение и использование результатов исолпдова-Ы32а Предложена установка для'язмерзния выхода электролитов из клеток водных растений и лабораторный блочный шкроспектрофлуори-.метр, которые могут бить использованы в лабораториях и организациях, занимающиеся проблемам* водной токсикологии, охраной окружающей орвдыо

Разработан простой высокочувствительный способ определения пероксидазы, основаяньй т. реакции окислении бинарной смеси двухатомных фенолов перекисью водорода, катализируемой перокеддазой ДА.С. В I2S2350 СССР). ■

Предложены ферментативные кинетические глотсды определения шшроколичеств пирокатехина и резорцина (A.C. JS I7I80SI СССР, A.C. Je I755I37 СССР).

Разработанный способ определения активности пероксидазы используется в Гвдрохдшчзском институте (г.Ростов-на-Дону) для анализа качества природных вод (Акт'внедрения от 03.01,87 г.), в лаборатории кибернетики биохимических сисгем Президиума СФСО АМН СССР при исследовании катализаторов для обезвреживания загрязняй-яри веществ (Акт о внедрений от 18.01.90 г.), в лаборатории .физиологии устойчивости растений СИФЙБРа (г.Иркутск) дяя определения активности фермента в связи с его участием в ростовых процэо-сах метки и корня в целом при действии низких положительных температур (Акт от 23.03.89 г.), на кафедрз "фармакологии Иркутского мединститута (Ант от IS.СВ.88 г«), в НИИ эпидемиологии, микробиологии -и гигиены МЗ Лит. ССР (Акт от 2I,I<J.88 г.).

Результаты работы Вклинены в отчёты ряда тем, выполнявшихся; лабораторией по задании ГКНТ СМ'СССР (J5 госрегистрацни 76Q3I4I5, 76033978, 8IC68I33). Разработанный методы включены в учгзбяоэ пособие для студентов биологического факультета (И1У, 1990).

Апробация работц. Материалы диссертация докладывались на П.Республиканском .совещании "Проблеш. экологии Прибайкалья", (Иркутск, 1982), I Всесоюзном совещании "Геохимия техногензза" (Иркутск, 1985), Республиканской.конференции "Еяотвсмроваяие и био-щздакапил природных и сточных вод"" (Роотов-яа-Дону, 1986), Все-

II- Всесоюзных симпозиумах по аптиоксидаятам (Москва, 1989, 1992).

Нубликащш. Материалы диссертации отражены в ¡24 научных публикациях, в т.ч. три авторских свидетельства на изобретения.

Структура п сбьём дяссергашцт Работа изложена на М страницах, состоит ца введения, 3 Глав, выводов, списка использованной литературы, включающего ¿26 работ , в т.ч. иностранных - 60 . Работа содерадт 1$ таблиц и 33 рисунка .

СОДЕШЛШСЕ РАБОТЫ

1. Постановка проблемы. По литературным данным можно сделать давод, что механизмы токсического действия фенолов на гддробяонты изучены недостаточно. Как правило, токсическое действие ФС на гидрофиты оценивается по какоед-то одиовд физиологическое параметру. Для понимания механизмов токсического действия ФО необходимо использовать комплексную оценку вдшняя токсикантов на ряд физиологических показателей клетки, Это позволит выявить роль фенолокисляю-№ ферментов гидрофитов-в механизма токсического действия ФС? использовать закономерности взаимодействия ЗгС и ферментов дли развития методов биологического контроля. • -

2, Объекты и методн исследования. Объектом исследования была выбрана водоросль из семейства харовьк - нителла ( •¿Uetfa ¡r/>. ), а также высшее водное растение элодея'( <5¿adea. ca*¡oc¿ens¡J), Используемую нителлу собирали в оз- Байкал'с глубины 3-IO м, сбор элодеи проводили в реке Ангара, фенольние соединения очищали í-летодаш возгонки, перегонки и перекристаллизации. Препараты о-дифенолокеидазы яолучали из клубней картофеля (Бузун к да., 1976). В работе использовали коммерческие препараты пероксндазн (Rea пае , ЕНР). Скорост! движения цитоплазмы в клетке лихеллн определяли по (Кашя, 1962), хлоропдастов элодеи до (Казанцев, IS69), Выход электролитов из клеток злодеи оценивали, измеряя электропроводность раствора moctoi реромвнного тока Е-8-2 к электродом ОК-ЭК (ВНР). Побеги элодеи,•

и нку бирова í í t i не в раса-ворах <80 (соотношение 3 г/100 ш), помещали в •Сйрмостатируегм'! иейкер (¿^--35?", .ПНР), Концентрацию ионов К* •издаращ на пламенном фотометре IÉM--I. Концентрацию обдах углеводов определили шмроновш методой (Ермаков, 1997). Измерение кекн ¿ранного логенщкйз- (MU) клетки иагашш соущеотодяли. открыто ьакуо длршм методом {Тагора, 1975). Для регистрации Щ использовали -рП-патр ДШ'-OI, 'работающий в роааияе милливольтметра и самопишущий потенциометр ШМ.

" ~-----------------.-.г ^f.Trnnf)¡^rrTrlrj:í fllfoy ) ХГ.7ТГ5ф-—

ии нителлн проводили на шкроспектрофлу оршлетре собственной конструкции (Сакоонов, Трипу зоб, 1981). Установка собрана на базе флуоресцентного микроскопа " рхиоуа! монохроматора " Бра-

со1 " и фотометрического устройства, состоящего из фотоумножителя ФЭУ-79 и шкровольтмзтра V -623 (рис. I),

Принцишальная схема микр^'^'ктрофдуориметра

^р-ШНШ ¿11

\

14[] 15 11 12

1-стабилязатор; 2-блок питания источника света; 3,8,10,13,21,

25-зеркала; 4-источшш света; 5-коллектор; 6-светофил ьт он; 7-допслнятелыгая система оснащения; 9-приоовая диафрагщ; 11,12,18,20, 24,¿1,29-линзи; 14-конденсор; 15-объект; КЗ-объектив: 17-опак-1Ш1юиинатор; 19-фильтр; 22тсисгема для визуального наблюдения препарата; 23-окуляр; .

26-входная щель; 28-дифраквдояная решётка; 30-выходная щель; 31-ФЭУ; 32-шлливольтметр; 33-регистратор; 34-ВС-22.

Рис. I

Клетку нителлн помещали в специальную камеру -с исследуемым аствором. Освещали светом ртутной лампы НВО-200 с А =440 ни меток междоузлия нителлн диаметром 60 мкм. вьщеляемый световым эндом. Измерение флуоресценции хлорофилла проводили при X -35 нм. Для предотвращения фотохимического обесцвечивания хлоро-шла при каждом последующем измерении световой зонд перемещали №ль клетки. •

■ Активность перокскдазы оценивали по скорости окисления гвая->ла (Гавриленко, 1975) и о-дианизидина (Угарова, 1977). Кончен->ации перекиси водорода определяли по ( аеогво , 1953), а пе-■ксидазы по ( эдаппог. , 1966). Спектры поглощения и кинэти-окисления бинарных смесей ФС регистрировали на спектрофотомет-" Бресогс! Ы-40". Оценку результатов осуществлял!! после их атлетической обработки (Плохянский, 1970) при доверительной роятности Р=0,95.

- а -

3. Влчгшке Гпонольшк соединощй на выход электролитов из к^вуод элодеит Изучены концентрационные л временные зависимости выхода электролитов (ВЭ) из клеток элодег при действии фенола, гваякола, резорцина, пирокатехина, гидрохинона, п-бензохпнона. В зависимости от строения и концентрации фенольных' соединений ВЭ составлял от 2 до 50 % от исходного содержания электролитов в клетках. При действии всех фенольных соединении (ФО) на клетки злодеи наблюдали корреляцию меэду ЕЭ и выходом катионов К* из клеток элодеи. Как показала результаты экспериментов экзоосмос ионов п под влиянием хинояа, гидрохинона, пирокатехина значительно вша, чем при действии фенола, гваякола, резорцина (рис. 2).

Для последних §С наблюдалось

Зависимость выхода электролитов из клеток элодеи от концентрации фенолов в среде при времени инкубации 3 ч

установление стационарного уровня ЕЗ, который та ступал через час инкубации элодеи в растворе гваякола и через два часа - ыонофенола, Эффект этой группы ФС, видшо определяется их лппофилыюстыо. Такое преполо-жение подтвердили опыты с хлорофиллом: зависимость ВЭ из клеток злодеи от временя инкубации в растворах ФС подобна зависимости при исследовании действия хлороформа на ВЭ из злодеи (рис. 3). ВЗ при действии фенола, гваякола, резорцина и хлороформа в высоких концентрациях на клетки злодеи прямо пропорционален их коэффициентам распределения в система сктанол- вода.

Известно, что гидрохинон н пирокатехин значительно более гидрофильные соединения, чем гваякол и фенол. Кроме того, известна способность зЫ-реагентов увеличивать ионную проницаемость клеток водных растений Шухшдняров, 1991). Хинон и продукты окисления пирокатехина и гидрохинона блокируют зН-группы белков' (Тсрчинскни, 1977). Иоядо предположить, что в основе эффекта этих соедшеый на ВЭ ле^ит взаимодействие с тиодовши грушшыа иек-

ЛГЛ'Ш'Г/ 'РЯК ГГП 1ГиГ(ИПП С яьои - М7У ) Пе««''."■•(! -

1-роз орцин; й-моносГенол; 3-гваякол; 4~1ырокатехин; -гидрохинон; б-н-бензохипоц.

Рис» 2 ь

Выход электролитов из клегок листьев элодеи при деИстеп фенолов в концентрации 50 г*Л (а) и I иМ (б)

10

8

6 4

30 60 120 р40

30 60 120 РАО

1-резорцин; й-глонофеиол; 3-гваякол; 4-хлооо1юрм; 5-арбутин;

6-гидрохшон; 7-п-бепзохинон.

Рис. 3

хинона на клетки элодеи приводит к значительно большему снижении содержания тколових групп злодеи, .чем пирокатехин. Действие гидрохинона вцзцвало и более интенсивна ВЭ из клеток, чем пирокатехин.

В пользу воздействия именно процессов окисления уС на ВЭ из клеток элодеи свидетельствуют опыты но влиянию на ВЭ трудноокис-ляющегося гликозида арбутина. ВЭ из клеток элодеи под действием гидрохинона и два раза вше, чем под шшянием его гликозида (рис. 3 6).,

По разног,^ влияли ФС и на выход углеводов из клегок злодеи. При варьировании в среде пикубаидя содержания п~бензохинона, гидрохинона и монофэнола бцш подобраны концентрация, вызнваюаще' близкий по величине зкзоосмос ионов. Зиход :ка углеводов был значительно .вше при действии соответствующих концентраций п-бензо-хинона и гидрохинона, чем мояоренола (табл. I). Это лшшиИ раз указывает на принципиальные различия мех-:-!ниуг.,а нарушения проницаемости клеточной мембраны злодеи при действии гидрохинона, п-бензохнаопа и ¡.юно ре пола.

Полученные результаты свидетельствуют об индуцировании полд-феяолами ВЭ из клеток листьев элодея. Эффект зависят от структуры ФС и он значительно иксе при действия лсгкооиясляетяас гкдро^итакй полифеколсв, чем трудноокисляемях. ВЭ г.од влиянием трудно ока осте -глых «С мо:кно объяснить их вксоко!; степенью растворяемости в ляли-дах шгазмдлеммы. Тогда как учеличвшо проницаемости клеток элодеи для попев я углеводов при действия легкоскпслнйдллся ¿С связано с

Таблица I

Влияние мсшофепола, гидрохинона и п-бенэохинона на выход ¡.^.-ктродатов и углеводов из клеток элодеи

Среда инкубацип (концентрация ФС, 1Í.I) Электропроводность раствора, мкс Концентрация , углеводов, мг/л

Дистиллированная

вода (контроль) 10,1+0,8 4,6+0,7

Монофенол (22,0) 65,8+5,9 5,0j-0,7

Гидрохинон (1,0) 57,2+5,5 12,2+1,1

ц-БецзохияйН (0,2) 59,8+5,4 13, Olí,0

блокированием «ГН-групп белков плазмалеьш,

4, Действия йенольных соединений на интенсивность сТшуоресцвя-нпи хлорофилла, мембланны!| потенциал и движение цитоплазмы клеток йИИШШЬ. Изучал;! гашение флуореси;енции хлорофилла к летки ¡штелш фенолами в зависимости от концентрации соединений. и времени инку-' бапди, Анализ данных яо степени гашения интенсивности (флуоресценции хлорофилла (ИФХ) нителлн позволил построить убывающий рад токсичности: п-бензохипоя, пирокатехин, гидрохинон, гваякол, монофе-яол, резорцин. Большой эффект пирокатехина по сравнению с гидрохиноном объясняется наличием в ндтелле активной о-дифенолоксндазы, окисляющей молекулы пирокатехина до более токсичного о-хинона.

Одновременное исследование изменения нескольких физиологических параметров клетки при действии фенольных соединении монет бно'Ь полезно для выяснения механизма влияния этих веществ на клетку в целом. В связи с этим изучено влияние п-бензохшшяа, пирокатехина и гваякола в концентрациях, останавливающих движение протоплазмы клетки дателиы через 15 шя., соответствующих 0,2 Ш, 2 г.М, 50 ¡л Н, на 1Ж ¡1 шмбрашшй потенциал (Ш). К моменту прекращения вдклоза в клетке нителлн гваякол вызывал значительное падение мембранного потенциала на 130+8 мв, а действие п-бензохино-на и гшрокатехина не изменяло Ш по сравнению с контролем (рис. 4 К

В основе механизма токсического действия гваякола, по-видимому, лехшт его влияние на плазматическую мембрану. Эти предположения хорошо согласуются с результатами исследования механизма доЯотьия даяшдс ооедщкшиЯ на цяклоз нителлн по принципу Фергюсо-на (Стой, 1976), Из пах следует, что пирокатехин, гидрохинон п и-сеизозшнол ог-носятоя к садмуряо-сльдаХачесюш ыкл-ши, эСХфвкг'

Действие на МП клетки нителли п~бензохинона и некоторых нолифенолов в концентрациях, останавливающих движение цитоплазмы за 15"мая

МП, мв

I-резорпдн üQ Ш; 2-п-оензохидон 0,2 t.M; З-шрокатехйн 2 ii.lj 4-гваякол 50 1.1.1; 5-хлороформ 50 Ш.

Рис. 4

которых обусловлен их химическим взаимодействием с коьшонелташ клетки, а действие гваякола близко к наркотическому. В последнем случае вещества накапливаются в мембране, происходит "мехаяическо е" по врожденно мембраны, приводящее к разобщению .»мин сопряжённых процессов (Альберт, 1971).

Вышесказанное в какой-то мерз подтверждалось тем, что такой наркотик как хлорофор:.1 в концентрации, останавливающей движение за 15 шн вызывал падение Iffi, близкое к значению, отмечешюцу при действии гваякола. Причину наибольшей активности гваякола, вероятно, еле,дует искать в его высоком коэффициенте распределения липид-года, что приводит к значительному накоплению данного соеди-нешш в мембранах, в частности в мембранах хлоропластов. В пользу этого сглдетедьсгвует подобие яинетяческих кривых гашения фдуо- " ресценвди хлорофилла при действии гваякола и хлороформа.

il-бензо-ашон известен как сбигни цитостатический агент (Бар-бье, 1073) и тушитель флуоресценции хлорофилла (Красновский, 1974). Поэтсвд отсутствие его влияния на \1Ж в концентрации, вызывающей повреждение клетки может бить понятно, если принять, что п-бензохпнен не достигает хлоропластов, связываясь с компонентами клетки в поверхностной области клерки. Для проверки этого предположения j.'ui действовали на клетку нителли я-хлормеркурийбензоатом натрия (иШЕ), Он представляет собой слабопроникаиций в метку реагент па SH-гругшн. D соответствии с ожиданием эффект ПХ1ЛБ был сходен с действием п-бензеишона: оба соединения к моменту остановки шкдоаа галактически не влияли на lUät (рис. 5).

УвссиСш-сгь шрокатохлиа окисляться о-дцфенооксадазоЙ иител-ль дг' c-y.'i.ii.im яоь; ¿.лшую токсичность иаствооа штока-

6 18 30 50 70 SO

£ ,1'глп

Влияние фенсльных соединений технна. С целью разграничения и ЛХМ> на интенсивность

флуоресценции хлорофилла влияния на ИФХ и циклоз иителлы клетки нигелли не окисленных молекул ш1рокатехина

от действия продуктов его окисления, перед опытом клетки иителлы обраба т ывали диэтилдяти окарбащ-том натрия (ДДК) - ингибитором о-дифе нолоксидазы.

Сравнению данных по действию пирокатехина на клетки с активной и ингибированной о-да-Ткнолоксида-эой показало, что подавление ИМ . изменилось незначительно, в.то время как продолжительность движения протоплазмы возросла с 15 до 80 мин., причём в течение первых 12 м;к характер подавления никлоза ь обоих случаях одинаков (рис. 6).

На этом этапе действие пирокатехина на движение цитоплазмы связано преимущественно с токсическим действием полифенола. Резкое падение скорости движения протоплазмы с 12 по 15 шн в клетках с активным ферментом соот ветствовало действию хянопа на . этом времешюм участке, т.е. здесь наблюдали эфпект, обусловленный продуктами о-даОенолоясп-дазного окаолошт пирокатехина. 70 30 г,г,'.йн Таким образом выявлен двух-эташьй характер действия пирокатехина на циклоз в клетках иителлы. Па лерБ^.,.1 этапе за подавление цхклоза отвечают восстановленные молекулы пирокатехина, а на втором - хиноидные продукты его окисления.

Высокая чувствительность реахцда киаоза на присутствие продуктов окислительного нреврм';ешш: пирокатехина, остановы» двлаиш

1-п-бензохшол 0,2 Ш; 2-ПЕЖ 0,2 хАА;

3-пирокатехля 2 Ш;

4-пирокатех:1н после предварительной обработки

клеток раствором дЭДТК,' 2 г,1,1; 5-гваякол 50 Ш.

Рис. 5

Влияние предобтботки клеток иителлы раствором ДЭДТК (2 i.iV.) на подавление шклоза пирокатехином (2 t.f,!)

3 6 9 15 30 I-клетки, необработанные ДЗДТК;

2-клеткк, предварит мгьно инкубированные в ДЭДТК 30 мш.

Рис. 6

протоплазмы цод гшяшем не проникающего в клетку 11X1,35 при неизменном уровне ЙОХ, данные о локализации о-диреяолоксядази зз районе ллазшлс:.з.ш клетки ннтелли (Стон, 1975), проявление сильного сродства о-беиаохаасна к сульфгндрпльшлл группам (Торчинский, 1977) и веда пая роль -последних в двкмошш протоплазмы (Кашя, 1962) позволили предположить, что в поверхностной области клетки, возможно в нлязматеыме, имеется Sll-зааяснмый регулятор цпклоза (Аларыдя, Саксонов, 1970).

ДДК значительно ошикал токсичность пирокатехина, определённую по остановке движения цатошазш клетки нителлы. Такой ме эффект получен яря добавлении к раствору пирокатехина аскорбиновой кислоты или цястеняа, блокирую:;1;« процесс окисления пирокатехина до о-хннона я вссотапап'швакпдос хиноны, По восстановительными, антисяоидапгчпкл! свойствами обладают п сами .{©ноли. Вопрос возня-кал, не оудут ли изменять офрект ыоли.геполов другие ФС, тем более, что з реальных, средах - сточных я црародиих водах, как правило, присутствуют яе индивидуальные соединения, а их смеси.

Для проверки такой возможности был поставлен опыт по влиянию смеси'пирокатехина л резорцина на движение цитоплазмы и флуоресценцию хлорофилла клетки ннтеллы. Добавление резордааа, как и ДДК, но в tiSíti-ccii степени снижало токсичность пирокатехина, одзяй» ьаемую яо длительности циклоза клетки нителлы. Гаыешю флуоресценции хлорофилла клеши нителля при этом практически не изменялось по сравнения о действием одного пирокатехина.

При изучении комплексного действия яолифеполов на водные растения нами было отмечено, что при инкубировании талломов im-телди и побегов злодеи в растворе смеси парокатехип-резорцян, . раствор окрашивается в золёный цвет. С течением времени зелёная окраска сменяется бурой и переходит а тёмно-коричневую. Скорость окрашивания раствора увеличивалась с повышением концентрации фенолов в снеси ni щсси тндрофитоз. Погружение этих растении з раствори только пирокатехина или одного резорцина не приводило к окрашиванию. Известно, что некоторые способы определения активности окислительных ферментов растений оиюьшш на цввмшх реакыдях окисления этими энзишыи фенолов и аминов. Изменения активности ферментов растений яря действия токсикантов используются дач &н-знмодиагяостики объектов окружащей среды ( Kelier , 1977).

Поэтому шш был доставлен ряд ияятов с целью выяснения роди рерменгев и пабдждаег.юм окрашивании «леса пнпокатехнн-разор-.• 4-е,/Сг. i'. Си fY.W.íH* / ГП"» 'I tmiri.r- .-í1." Л т.п i*;- M.,v-.-n,<

^пользования цветной реаквди для разработки новьк методов энзи-юдиагн о стики гидр офиго в.

5. Окисление ферментами-гидрофитов бинарной змеей двухатомное фенолов. Предварительная термическая■обработка высших водных >астений и водорослей, их шдеркнваннз перед погружением в смесь ;вухатомных фенолов в растворах сульфида натрия, ДЦК. Добавление к ¡меси ФС избытка перекиси водорода подавляло возникновение зелёной жраски, либо значительно её ослабляло. Напротив, насыщение рост-юра воздухом, добавление низкой концентрации перекиси водорода, годделачивание ускоряло образование окрашенных продуктов реакции дабл. 2 К

Таблица 2

Окрашивание раствора смеси пирокатехин-резорцин в присутствии гидрофитов

Состав смеси Концентрации компонентов, М.1 Гидрофиты Время, мш Оптическая плотность, Д|5д

¡ирокатехин 10,0 нителла 30 -

^езорцан 10,0 нителла 30

¡ирокатехкн-резордан 2,0; 2,0 10,0;10,0 нителла Ш1телла 30 30 0,16+0, СЕ ' 0,32+0,04

1ирокатехин-эозорцин Ю,0;Ю,0 нет 30 —

1ирокагехин-резордая Ю,0;Ю,0 * нет 180 ■ 0,06+0,01

1ирокатехкн-эезорцин-ДДК Ю,0;Ю,0; 2,0 нителла 30 0,14+0,02

.Хирокатехин- оезорцин- адталаза 10,0;10,0; 10,0 мкг/ш нителла 30 0,25+0,03

Зирокатехин-резорцин- 10,0;10,0; 2,0 нителла 30 0,46+0,04

л с □прокат ехик- резорцин- пероксидаза- «Л 10,0;Ю,0; 2,0 1.ЖГ/1Л1; 2.0 нет 3 • 0,60+0,01

Доказательством участия ферментов в возникновении окраски раствора слукит её появление при внесении в раствор пирокатехмя-резирщш препарата о-дифенолоксидазн, выделенного из клубня кар- "-------- -----------^.я^тп.л,, пппт>пшчрж 11П пнпоксилази корня

хрена д перекиси водорода.

Спектры продуктов поглощения реакции окисления смеси дифено-лов о~дифенолонсидазяой л пароксидазной системой (ряо. 7),совпадали и характеризовались двумя

Спектры поглощения продуктов реакция перокспдазного

окисления смеси пирокатехин-резорцин

4С0 '460 600 700 900 I-резорцян отсутствует;

- 2-0,5 г,15-; 3-2 Ш: 4-4 Ш; 5-1 ô Nil: 6-Ô Ш:

. рН буфера 7,8 концентрации пероксидазы 1,5 mMj.переписи водорода 10 и Ш

Рис, 7

1> нм

спектральньш пиками с максимумами при 460 ли и 700 шл. Продуктом окисления пирокатехина о-дифенолоксядазоп является о-хяяон. Поото:.у следует допустить, что для возникновения зеленой окраски смесь должка содержать пирокатехин, резорцин и хлнон. При добавлении к смеси пирокатехин-резорцин п-бензохинона спектр поглощения имел те не два спектральных пика, что регистрируются при перонсидазном, а такие о-дафенаюксидазяом окислении смеси шрокатехин-резорцш,

При окислении двухатомных фенолов о-дифеполоксядазой ско«» росгь накопления проектов реак-

ции меньше, чем яри окислении одного пирокатехина. В противоположность этому при окислении смеси двухатомных фенолов перокси-дазпой системой окорость накопления продуктов реакции на порядок вике, чем при оккслешш одного пирокатехина, т.е. иксшю для определения акт-'^яости порокслдазы целесообразно использовать яяди-каторяув реакцию, Бсзколло, отмеченное различие связано с тем, что для о-ддфеволоксидазн только пирокатехин служит субстратом, тогда как ддя пероксидазн субстрата!,и являются и пирокатехин и резорцин ( Dunford, 1986 ).

Для Ецяонення оцтимальяю; условий окисления смеси пирокатехина и резорцина пероксидом водорода в присутствии пероксидази исследованы зависимости скорости индикаторной реакция от концентраций фермента, пирокатехина, резорцина, персксида водорода, рН 'буфера (рис, 8). •

liait ивдно из рисунка скорость индикаторной реавдш весьма чувствительна к изменению концентрации резорцина и при уменьшения последней: в реакционной смеси с 5 до 0,5 ъЫ падает в 5 раз.

Зависимость скорости индикаторной реакции

от кокцонтпацпи дероксидазы (в)»,о _от концентрации перекиси водорода

_1 '-О .... ___9

(Ш. юнг <10"

значения рН (60, в реакционной смеси

-2

ОН- мин< 10'

С, нМ

Скорость реакции в отсутствии пероксида водорода была незяачител: ной - менее 4 % от скорости окисления системой пероксидаза-цере-кясь водорода. Оптимальные значения рН 7,5-6,0, а концентрации пероксида водорода в реакционной смеси - 10-20 Ш (рис. 8а, б).

Прямая зависимость начальной скорости индикаторной реакции от концентрации фермента в реакционной смеси в интервале■0,5-5,0 тД.ч (рис. 8 в) и определение оптимальных условий реакций позв! лили предлол;ить способ определения активности пероксддазы (Саксо-нов, 1536). Достоинствам! предложенного метода являются хорошая воспроизводимость, достаточно высокая чувствительность, широкая распространенность полифенолышх субстратов, а так же отсутствие у субстратов канцерогенных свойств.

Предложенный способ был испрльзовак при изучении токсическо' го влияния сульфида натрия на злодеи (Оаксонов, 1986), действия пестицидов на норкеплоди (Акт внедрения, Вильнюс, 1388), эффекта низкой положительной температуры на клетки кукурузы (Саксояов, в печати).

. Предложенная индикаторная реакция использована и для измере ния мидроаолкчеств пирокатехина и резорцина в воде. Разработаны кинетические ферментативные способы определения микроколичеств резорцина и пирокатехина в воде (Саксонов, 1992), отличающиеся высокой чувствительностью (до I мкг в пробе) и экспрессивностью (3-4 мкн одко определение). 1

Предварительные спектральные исследования свидетельствуют о то;л, что предложенная система для количественного определения • пи рокатехика я резорщна канет быть использована для измерения ш-кроколичеств других фенолов.

выводы

I, Установлено, что при действии феяольних соединений (ФС) ¡¡а клетки водное растений, их токсический эффект проявляется в /величении выхода электролитов из клеток, снижении мембранного по-генциала, гашении флуоресценции хлорофилла, подавлении движения цитоплазмы.

Вшвлвна связь шгду яоврекдавдш действием ФО на гидрофита с эдной стороны их способностью окисляться, растворяться вллпядах, з другой - активностью фенолокислякщх ферментов гидрофитов и их ионалпзапдей.

2„ Показано, что легкоокисляешз ЗС пирокатехин и гидрохинон оказывают более сильное поврездапщее воздействие на клетки водных застсшш, внзывают более високий выход злектролитов из клеток злодеи, чем трудноокпсляенш гваякол, мояофенол, резорцин. Яоло.тл-рвльная корреляция кекду выходом электролитов из клеток злодеи при действии гваякола, моно-пенола, резорцина и коэфгшщентом раояреде-хенкн в системе октанол-вода, а так.ке подобное действие трудно- . жледяепцх -1-0 и хлороформа свидетельствуют о наркотическом дейст-ии этих совденеяяй«

3, В отличие от трудиоокисляешгс но наблюдается корреляции ¿заду вихедом электролитов из клеток злодеи при действия пирокатехина, гидрохинона, продуктов их окисления, в чаотности п-беязо-апюна, и коэффициентами распределения в системе октанол-вода. Зкзоосмос электролитов при действия легхосшюляемых фенолов сои-зовоядается интенсивным выходов 'углеводов.

Ряд эффективности по выгоду электролитов яз клеток элодеи ювпадает с рядом, отражающим степень интибировашш ЭН-груш в 5елках клеток злодеи, что свидетельствует об участии дН-групп «ибрадша белков в механизме действия лвгкоокясляакык ФС на ;летки злодеи,

4« При действии трудноокисляемшс ФС снижение скорости движе-шя цитоплазмы клеток нигеллы сопровождается падением мембранного гатепинала и гашением флуоресценции хлорофилла. При этом кияети-шские кривые этих параметров подобны кинетическим кривым при действии на клетки хлоророрш» •

Снижению скорости движения цитоплазмы клеток нителяы при действии легкоокисляег.шх ФС и п~беызо:ашона предиествует падению ,1ембрашюго потенциала и гашении флуоресцеции хлорофилла. Следовательно снижение скорости движения цитоплазмы в клетках нителлы 1Ш'Лбтся «солеа окспрэсснш л чувствительным тестом по сравнению с

гашением фигу оресценцип хлорофилла и падением мембранного потондиа-ла при оценке токсического действия легкоокисляемых

5. Комплексная оценка ряда физиологических параметров клеток нителлы и даннке по локализации фенолокисляющк ферментов в клетке позволяют иредполсшть, что высокая чувствительность движения цитоплазмы к действие легкоокисляемых фенолов определяется наличием на поверхности клетки бН-зависимых операторов циклоза, на которш первоначально реализуется токсическое воздействие н-бензохшшна и продуктов ферментативного окисления о-дафенола.

6. Сравнение скорости движения цитоплазмы в нативных клетказ нителлы и в клетках с кигдбдроваяной ййэт1ОДИтаокар<Заштом натрия о~дифенолокскдазой показало двухэтапний характер действия о-дифе-нолов на цпклоз яативной клетки нителлы. На первом этапе проявляется эффект действие восстановленного пирокатехина, а второй характеризуется нпеиг.хдественно действием хнкоидных продуктов ферментативного окисления о-дифокола.

7. Установлено, что при действии смеси пирокатехин-резорцин на клетки нителлы повреждающий эффект на движение цитоплазмы значительно ослабляется по сравнении с влиянием одного пирокатехина. При этом интенсивность флуоресценции хлорофилла остаётся неизменной. Бинарная смесь оказывает на исследуемые параметры действие качественно сходное с эффектом пирокатехина на'клетки нителлы с ингибированной о-дифенолоксидазой. Это позволяет предположить, что причиной ослабления поврелцданжего действия смеси на двидеше цитоплазмы является блокирование резорцином продукта окисления пирокатехина - о-беизохинона или промежуточных радикальных продуктов окисления.

8. Обнаружено, что инкубация гидрофитов в растворе, содержащем пирокатехин п резорцин, приводит к возникновению ярко—зелено] окраски раствора.

Показано, что обоазозание окраски связано с взаимодействием ФС и продуктов их ферментативного окисления. Проведена олтишза-ция реакции окисления пирокатехин-резорцин пепоксидазной системой, в результате чего яредло:г.ок высокочувствительный кзтод определения активности пе'сксндазк, который момст быть гароко использован ддя энзима диагност::::;: объектов окру;. саш;ей сродц,

9. Разработаны экспрессные скособи определения широко распространённых фонолвики токсикантов - пирокатехина и резорцина, оонованпке на иорг-::с:хдазпоц окислении оиипряоЛ емчен, состоящей чч тгте ттопн-асляоиого и легкоокисляемого фенолов.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Апарцин М.С., Саксонов М.Н., Стом Д.И. К вопросу о меха низме действия пирокатехина и я-бензохинона на клетки нитаялы//

' ДАН СССР, 1979,- Т. ,244, ffi 2.- С.510-512.

2. Влияние п-бензохинона и некоторых полиоенолов на мембран кий потенциал метки нятеллн, измеренный открыто-вакуолярлшм мето дом/ ¡Li¡.Саксонов, М. С.Апарцин, М.И.Грудиннн, Д.И.Стом// Гндробио ВДН.-19В0.- т. 166, Га 4,- С. 89-94.

3. Саксонов М.Н., Трипузов Г.Б. Цктоспектрофлуориметр - при бор для изучения действия фенолышх токсикантов на отдельные мет iui нителли// Влияние Фенольнпх соединений на гидробионтов,- Иркут

1981.- С, 17-24.

4. Саксонов М.Н., Трипузов Г.Б., Стом .U.M. Влияние некоторы фенолов и хиноноп на tuход электролитов из клеток элодеи// Пробле мн экологии Прибайксшья: Тез. докл. Всесоюзн. научн. конф.- Иркут 1982.- С. 64-65.•

5. ТЛетод определения активности пероксидазн для биотестироь ыия природных и сточных вод/ М.Н.Саксонов, А.Э.Бапаян, Т.Ii.Забели на, Д. 1-1.Стом// Епояддикадпя и биотестирсвоние природних код: Тез, докл. Всесоюзя. конф.- Ростов-на-Дону, 1986,- С.140.

6. Саксонов М.Н,, Забелина Т.В., Стом Д.И. Смесь пирокатехк резорцин в качестве Н-донора-яри определении активности пероксид зн// Тез. докл. Всееоюзн. симпозиума по фенольшм соединениям.-Таллия, L987.- С. 135-136.

7. Саксонов М.Н. Новый сносо'о определения пероксвдазы//Мнфо; мациошшп листок ЦНГИ,- Иркутск, 1987, Л 87-69.

8. Саксонов М.Н., Атавина Т.Г. Метод биотестированпя по инт сипности tJjfyopecnenuKii хлорофилла клетки нптеллн// Методы биотес-тировалия вод: - Черноголовка, 1988.- С. 94-95.

9. Саксонов М.Н., Трипузов Г.Б., Стом Д.И. Метод биотестирования по выходу электролитов из клеток элодеи// Методы бистостнро-валия вод: - - Черноголовка, 1988.- С. 96-97.

10. Саксонов М.Н.Исследование токсического действия иокотор; феяолыгах антиокемдштов// Бисантиоксиданти: Тез.дом. Ш Всесомзн конф.- M,,19t:9.- С. 256.

11. Методы био'тестдрованил вод/ Д.И. Стом, Т.А,Гиль,А.Э.Балаян,MI. Саксонов, ТЛ'.Атавина// Методические указания для студентов.- Иркутск: язд-ьо ИГУ, 1990.- 24 с.

12. Саксонов М.Н., Бо.лмасова СЛ. Кинетический cf ерментагив-инй метод определения й.енолышх аятиоксидантов//Биоантиоксидан-ти: Тез. докл. 17 Всесочзн". копф.- ГЛ., 1992,- С. 141.

13. Смесь пирокатехин-резорцин в качестве субстрата при определении активности лерокпидазн в растениях// Флзпол. и бпо~ Хим. растений.- в печати .

14. Chrawoova T.G., Secooaov U.U., Stern D.J. bffeots of Piicnolic Compounds on chlorophyl fluorescens intenaity ia Z/itel-1& CeXXa// ilatuxal Fhonols irv Plant Reetstanoe: International Scientific Syrapoeium ( 13-17 oeptenbei 1993 ) Univeraity of tlu-njeh, German/.- iu preso.

По материалам диссертации получено три авторских свидетельства на изобретение:

1. A.C. М262350, СССР. Саксонов М.Н., Балати А.Э. Забелина Т.В., Стом Д.К. Способ определения активности перокекдази,-Заявл. 19.12.84; опубл 07.86, бол.. 37.

2. A.C. ii 1718051, СССР. Саксонов М.Н., Болмасова С.И,, Стом i.И, Способ определения резорцина,- Заявл. 27.06.90; опубл. 07.03.92, б'ал.Э.

3. A.C. Ге 1755137," СССР. Саксонов Й.Н., Болмасова С.И., ■ Стом Д.И. Способ определения пирокатехина.- Заявл. 08.06.90; опубл. 15.08.92, бюл. 30.

Поклисако к печати 24.11.93 Заказ 24

Orfeeit Г.О п.л. Формат 60 х 20. Щб.Тираг 100 ака.

-- ------попирпа4ии Ирйугского госу-