Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фенольные соединения клеточной стенки различных частей стебля льна (Linum usitatissimum) в pulse-chase экспериментах с интактными растениями

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Погодина, Наталья Михайловна, Казань

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И БИОФИЗИКИ КНЦ РАН

На правах рукописи

It

ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ РАЗЛИЧНЫХ ЧАСТЕЙ СТЕБЛЯ ЛЬНА (Linum usitatissimum) В PULSE-CHASE ЭКСПЕРИМЕНТАХ С ИНТАКТНЫМИ РАСТЕНИЯМИ

ПОГОДИНА Наталья Михайловна

03.00.12 - физиология растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук В.В. ЛОЗОВАЯ,

доктор биологических наук Т.А. ГОРШКОВА

КАЗАНЬ - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Состав лигнина 8

1.2. Оксикоричные кислоты 12

1.3. Пути биосинтеза предшественников фенольных

соединений клеточной стенки 16

1.4. Основные ферменты, участвующие в образовании фенольных соединений клеточной стенки • • ч ' . 21

1.5. Транспорт монолигнолов в клеточную стенку 28

1.6. Полимеризация монолигнолов и образование лигнина

1.7. Ковалентные связи лигнина с другими компонентами

клеточной стенки 36

1.8. Локализация лигнина 37

1.9. Регуляция состава лигнина 42

1.10. Влияние стресса на метаболизм фенольных соединений 44 Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Объект исследования 50

2.2. Методика pulse-chase экспериментов 50

2.3. Выделение клеточной стенки 54

2.4. Выделение лигнина Класона 55

2.5. Измерение содержания лигнина с применением

тиогликолевой кислоты 55

2.6. Окисление клеточных стенок сульфатом

меди в щелочной среде 57

2.7. Анализ фенольных соединений клеточной стенки

с применением ГЖХ и ТСХ 57

2.8. Идентификация фенольных соединений 58

2.9. Анализ радиоактивности 59

2.10. Изучение локализации фенольных

соединений в клеточной стенке стебля льна 59

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение.

3.1. Подходы к определению содержания и

состава фенольных соединений клеточной стенки 61

3.2. Особенности состава фенольных соединений

клеточной стенки различных частей стебля льна 71

3.3. Влияние засухи на синтез фенольных соединений

клеточной стенки стебля льна 90

Заключение 105

Выводы 108

Литература 110

ВВЕДЕНИЕ

Постановка проблемы, ее актуальность. Клеточные стенки высших растений содержат, помимо сложных полисахаридов, фенольные соединения, которые обычно подразделяют на две группы: лигнин и оксикоричные кислоты (в основном феруловая, синаповая и я-кумаровая). Считается, что фенольные соединения формируют разветвленную сеть по всему матриксу, образуют разнообразные связи с различными полимерами и между собой и предохраняют клетки от химических, физических и биологических воздействий.

Фенольные соединения входят в состав клеточных стенок как древесных, так и травянистых растений. Химия лигнина древесных растений развита достаточно хорошо, поскольку эта проблема важна для целлюлозо-бумажной промышленности (Брауне, Брауне 1964), однако в физиологии лигнина древесных растений много неясных вопросов. У недревесных растений детально изучены полисахариды клеточных стенок, а лигнин и оксикоричные кислоты вызвали особый интерес недавно, после появления информации об участии этих веществ в регуляции роста и морфогенеза, в ответной реакции на поранение и воздействие патогенов (Vance et al., 1980;Tan et al.,1992; Lozovaya et al., 1996; Яблокова с сотр., 1996; Cvikrova et al., 1998). Между тем и состав клеточных стенок, и метаболизм их фенольных соединений у недревесных растений имеет свои особенности. Актуален и прикладной аспект исследований фенольных соединений клеточных стенок, поскольку состав лигнина и оксикоричных

кислот связывают с качеством волокна, бумаги, а также с качеством продуктов и кормов (Ордина, 1978; McDougall, 1993; Jung et al., 1995).

В настоящее время хорошо изучен путь синтеза предшественников лигнина и ферменты, участвующие в этом процессе (Запрометов 1993, 1996; Boudet et al. 1995). Более того, реализованы молекулярно-генетические подходы к трансформации некоторых цитоплазматических ферментов, синтезирующих предшественники фенольных соединений клеточной стенки (Baucher, 1998). Однако процессы, происходящие за пределами плазмалеммы, где осуществляются сборка лигнина свободно-радикальным способом, его взаимодействие с другими соединениями, встраивание в клеточную стенку, а также возможные постсинтетические модификации, изучены недостаточно и требуют иных подходов для исследования. Важным этапом в характеристике этих процессов являются работы не на модельных системах различного уровня организации, а на целом растении. Исследования фенольных соединений крайне затруднены сложностью их анализа, а также тем, что они синтезируются на протяжении всей жизни растения, и необходимы специальные приемы, позволяющие отделить только что синтезированное вещество от накопленного пула этого соединения. Существенную информацию по этим вопросам могут дать pulse-chase эксперименты с экзогенными мечеными субстратами.

Цель и задачи исследования. Целью представляемой работы являлась характеристика метаболизма фенольных соединений клеточных стенок разных частей стебля льна. Ее реализацию связывали с решением конкретных задач:

1. Охарактеризовать особенности состава фенольных соединений клеточной стенки в различных частях стебля льна.

2. Проанализировать включение метки в различные фенольные соединения клеточной стенки в pulse-chase экспериментах при фиксации 14С02 целым растением.

3. Исследовать изменения в метаболизме фенольных соединений клеточной стенки льна в условиях засухи.

Научная новизна работы. Проведено системное исследование фенольных соединений клеточной стенки в различных частях одного растения. На примере льна приведены количественные характеристики состава и соотношения лигнина и оксикоричных кислот в двудольных растениях. Впервые показано, что в структуре лигнина возможны модификации на постсинтетическом этапе - со временем происходит более прочное связывание и закрепление полимера внутри клеточной стенки. Охарактеризованы изменения, происходящие в метаболизме фенольных соединений клеточной стенки при засухе. Установлено, что связывание и закрепление субъединиц лигнина в клеточной стенке может меняться под воздействием стрессовых условий.

Практическая ценность работы. Практическое значение работы во многом связано с тем, что объектом исследований являлся лен-долгунец -источник натурального волокна, являющийся традиционной экспортной российской культурой. Качество волокна напрямую связывают с биохимическим составом клеточной стенки, и в частности, ее фенольных соединений. С

использованием комплекса аналитических подходов детально охарактеризован уровень и состав фенольных соединений клеточной стенки в льняном волокне и в тканях ксилемы, которые определяют устойчивость к полеганию.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на итоговых конференциях и семинарах КИББ КНЦ РАН, на VII и VIII международных конференциях по клеточной стенке (Сант - Яго, Испания, 1995; Норидж, Великобритания, 1998). Диссертационная работа в завершенном виде докладывалась на семинарах в Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН. Работа поддержана грантом Российского Фонда Фундаментальных исследований № 98-04-50020.

Благодарности. Приношу свою благодарность коллегам, работавшим со мной в группе: Уланову A.B., Яблоковой Е.В., М.В. Агеевой. Глубокую признательность выражаю С.Б. Чемикосовой и В.В. Сальникову за совместные экспериментальные работы, плодотворное обсуждение полученных данных и неоценимую дружескую поддержку. Особую благодарность выражаю моим научным руководителям Т.А. Горшковой и В.В. Лозовой за всестороннюю поддержку, терпение и веру в успех нашей работы. Я благодарна своей семье за большую поддержку и понимание.

ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Состав лигнина.

Более века назад при помощи гистохимического окрашивания научились обнаруживать в клеточной стенке один из ее полимеров - лигнин. Примерно пятьдесят лет тому назад уровень развития химии позволил приступить к попыткам расшифровать его структуру (Erdtman 1957). Несмотря на полтора века исследований лигнина, до сих пор в изучении этого полимера очень много умозрительных заключений и споров. Первым поводом для разногласий исследователей был вопрос о том, являются ли лигнины истинным компонентом растений, или же это артефакт, образующийся в ходе процедуры выделения. Однако тщательные исследования школ Kratzl (1951), Higuchi (1967) и Freudenberg (1968) установили, что эти вещества являются растительными полимерами, происходящими из оксикоричных спиртов.

По современным представлениям лигнин может быть определен, как трехмерный аморфный полифенольный продукт, образующийся в результате полимеризации по свободно-радикальному механизму трёх основных фенилпропаноидных предшественников - кониферилового, синапового и п-кумарового спиртов, называемых монолигнолами (рис. 1). Монолигнолы, входящие в состав лигнина, отличаются между собой количеством метоксильных групп у С-3 и С-5 атомов бензольного кольца: у и-кумарового спирта они отсутствуют, у кониферилового - присутствуют у С-3, а у

соон

а,

соон

он

п-Кумаройал хислата

осн.

Феруяо(!ал кисло/па

оси.

он

Сйналодая /шалота

сн,он

а;

„I

он

п-КушроЗый слирт

сн.он

а.

Л

СИ, он

оси.

Коншрершюдый спирт

Сцналодый спирт

Рисунок 1. Оксикоричные кислоты. Спирты-предшественники лигнина.

синапового - у С-3 и С-5 атомов. По сложившейся терминологии три монолигнола называют также и-гидроксифенильными гваяцильными и сирингильными единицами и обозначают соответственно Н, G и S. Соотношение этих трех главных единиц, а также типов внутримолекулярных связей и определяет различия лигнинов (Wallace, Fry, 1993).

У голосеменных растений лигнин состоит в основном из Н-единиц, у большинства покрытосеменных - из G и S, у трав - из Н, G и S (Fry 1988). До сих пор остаются разногласия по поводу наличия лигнина в определенных растительных формах, таких как мхи, водоросли.

Монолигнолы могут быть связаны между собой в молекуле лигнина разнообразными эфирными и углерод-углеродными связями. Наиболее распространенными являются (3-0-4, обнаружены также [3-5, (5-1, |3-|3, 5-5 и 40-5 связи (Boudet et al. 1995). Показано, что лигнин трав имеет в два-три раза более низкое содержание лабильных (3-0-4 связей, чем лигнин древесных покрытосеменных (Boudet et al. 1995)

До настоящего времени не найдено способа выделения лигнина в нативном виде и судить о его составе, как правило, приходится по получаемым различными способами продуктам деградации. Количество и набор этих продуктов характеризуют исходный полимер. В случае лигнина проблемой является полнота гидролиза, поскольку прочные связи между его мономерами являются очень устойчивыми. Тем не менее, именно этот подход позволил получить основной объем имеющейся информации о структуре лигнина. В настоящее время наиболее часто используют щелочное окисление лигнина с

нитробензолом или оксидом меди (Boudet et al. 1995), а в последнее время получения тиоэтилированных производных лигнина (Lapierre 1993). Получаемые при этих подходах соединения анализируют с помощью различных видов хроматографии.

Существует ряд разногласий по поводу того, насколько адекватно представляют действительную структуру лигнина in vivo эти «лигнинопроизводные» вещества (Lewis, Yamamoto 1990). Более того, в научной литературе иногда используется термин «лигниноподобные», который звучит при недостатке доказательств химической природы исследуемого соединения.

Lewis и Yamamoto (1990) предложили ряд критериев, которым должны отвечать анализируемое вещество и содержащие его растительные ткани, чтобы это соединение можно было определить как лигнин:

1) Исследуемое растение должно обладать аппаратом, способным на а) синтез по крайней мере одного из трех монолигнолов (я-кумарового, кониферилового или синапового спиртов); б) транспорт фенилпропаноидных мономеров из цитоплазмы в клеточную стенку и в) их последующую полимеризацию.

2) Вещество(а), образующиеся таким образом, должны быть компонентом матрикса клеточной стенки, и не содержать других компонентов, кроме фенилпропаноидных (суберин, например, также содержит ароматические структуры, но они соединены с ацильными остатками).

3) Гистохимические исследования должны подтверждать наличие лигнина в клеточной стенке данного растения.

4) При окислении клеточной стенки, по крайней мере, одно из производных этого полимера должно обладать свойствами, совпадающие с лигниновыми субструктурами (Lewis, Yamamoto 1990).

1.2. Оксикоричные кислоты клеточной стенки

Оксикоричные кислоты - это вещества, содержащие в своей молекуле, помимо карбоксильной группы, бензольное ядро с одной или несколькими гидроксильными группами (рис. 1). Гидроксилирование бензольного ядра значительно увеличивает реакционную способность вещества и придает ему способность к образованию меж- и внутримолекулярных связей. Именно в образовании различных связей и заключается основная роль оксикоричных кислот в клеточной стенке. Соединясь с полимерами клеточной стенки оксикоричные кислоты модифицируют их, изменяя характер взаимодействия с различными ферментами, а также и укрепляют клеточную стенку за счет образования поперечных связей между различными ее компонентами.

Содержание и распределение фенольных кислот различно в различных типах клеточных стенок и при различном физиологическом состоянии клеток. Хотя их количество может сильно варьировать, можно сказать, что содержание оксикоричных кислот в клеточной стенке большинства однодольных растений примерно на порядок больше, чем у двудольных растений. Однако даже в клетках однодольных оно не превышает нескольких процентов от клеточной

стенки. Так, например, в клеточной стенке алейронового слоя пшеницы содержание оксикоричных кислот составляет 1.8%. (Bacic, Stone ,1981); в суспензионной культуры кукурузы - 1.7% (Grabber et al.,1995); в суспензионной культуре риса от 0.02 до 0.16% (Negrel et al.,1996). Несмотря на небольшое содержание оксикоричных кислот в клеточной стенке, они, как отмечают Wallace и Fry (1994), имеют существенное значение для регуляции ее свойств.

Оксикоричные кислоты образуют с полисахаридоми и лигнином разнообразные связи, которые были достаточно широко изучены (Jung, Ralph, 1990). Частичный ферментативный гидролиз клеточных стенок различных травянистых растений и последующее хроматографическое разделение выявило, что оксикоричные кислоты соединяются сложной эфирной связью с определенными углеводными фрагментами. Эти соединения с небольшим молекулярным весом легко поддаются детальному описанию с помощью ЯМР. Связанные Фер-Ара-Кси, п-Кум-Ара-(Кси)2, Фер-Ара-(Кси)2, Фер-Ара-(Кси)3 были выделены и описаны с помощью ферментативного гидролиза компонентов клеточной стенки проростков бамбука (Ishii, Hiroi, 1990a,b; Ishii et al., 1990), бермудской травы (Hartley et al., 1990), соломы ячменя (Muller-Harvey et al.,1986), кукурузы (Kato, Nevins, 1985), пшеничных отрубей (Smith, Hartley, 1983). В этих случаях оксикоричные кислоты образовывали сложную эфирную связь по первому гидроксилу с арабинозным остатком, который в свою очередь связан в 3-положении с ксилозой. Были также получены ацетопроизводные с 2-ацетокси-группой на арабинозном звене цепи Фер-Ара-Кси-Кси (Ishii, 1991). Muller-Harvey et al. (1986) установили, что у ячменя, в

среднем на каждые 31 арабинозный остаток приходится одна молекула п-кумаровой кислоты, присоединенной сложной эфирной связью с, а каждые 15 -с феруловой кислотой. Ishii et al. (1990) также удалось выделить Фер-Кси-Глю5, что указывает на возможность взаимодействия феруловой кислоты со вторичным гидроксилом ксилозы в ксилоглюканах. Вторичные сложные эфиры были также описаны для галактозы в 4-0-(6-0-ферулоил-б-Б-галактопиранозил)-В-галактозе и для арабинозы в 3 -<2-(3 -О-ферулоил-а-Ь-арабинопиранозил)-Ь-арабинозе, в пектинах шпината (Fry, 1982).

В 1955 году Smith впервые идентифицировал я-кумаровую кислоту, связанную сложной эфирной связью с лигнином, который он выделил из соломы пшеницы. Higuchi с коллегами сообщали о присутствии я-кумаровой кислоты у трав и детально исследовали ее связи с лигнином в бамбуке (Higuchi et al., 1967; Shimada et al., 1971; Nakamura, Higuchi, 1976, 1978a,б). Исходя из устойчивости сложного я-кумаратного эфира к метанолизу, эти ученые предположили, что я-кумаровая кислота образует связь с боковыми цепями лигнина скорее в у-положении, нежели в а-положении.

Nimz с коллегами (Nimz et al., 1980) исследовали лигнин бамбука и

1 ^

пшеничной соломы при помощи С-ЯМР, и обнаружили доказательства существования и простой, и сложной эфирной связи, образованной я-кумаровой кислотой. Позднее группа Monties (Scalbert et al., 1985, 1986; Sharma et al., 1986) установила наличие простых эфирных связей между фенольными кислотами и участками лигнина в соломе пшеницы. После полного гидролиза щелочью сложных эфирных связей, дальнейшее освобождение фенольных

кислот осуществляли посредством ацидолиза - традиционного метода разрушения простых эфирных связей внутри лигнина. Спектр 13С-ЯМР указывает на наличие фенольных кислот, связанных как простой, так и сложной эфирной связью. Изучение феноль�