Влияние кадмия на морфогенез, анатомию стебля и процесс регенерации льна-долгунца из клеточных и тканевых культур in vitro

Гончарук, Евгения Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние кадмия на морфогенез, анатомию стебля и процесс регенерации льна-долгунца из клеточных и тканевых культур in vitro
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние кадмия на морфогенез, анатомию стебля и процесс регенерации льна-долгунца из клеточных и тканевых культур in vitro"

На правах рукописи

t-i : . VJ

— ОГ

ГОНЧАРУК Евгения Александровна _ г: ^ППП

ВЛИЯНИЕ КАДМИЯ НА МОРФОГЕНЕЗ, АНАТОМИЮ СТЕКЛЯ И ПРОЦЕСС РЕГЕНЕРАЦИИ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА ИЗ КЛЕТОЧНЫХ II ТКАНЕВЫХ КУЛЬТУР IN VITRO

Специальность 03.00.23- биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2000

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А.Тимирязева.

Научный руководитель: академик РАСХН III свел уха B.C., Официальные оппоненты: доктор биологических наук Мазин В.В.,

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский

часов на заседании Диссертационного Совета Д.020.40.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу:

доктор биологических наук Кириченко Е.Б.

институт льна РАСХН

Защита диссертации состоится « »

2000 г. в

127550, г.Москва, ул.Тимирязевская, 42

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке: ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан « »

2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Меликова С.А.

/7 L/6.//-Z

П Я t / /. 7 . „

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последние годы уделяется особое внимание проблеме загрязнения окружающей природной среды тяжелыми металлами. Кадмий является наиболее опасным и одним из самых распространенных элементов-загрязнителей. Полностью исключить присутствие тяжелых металлов в окружающей среде невозможно. В настоящее время разрабатываются различные приемы ведения сельского хозяйства в условиях поступления поллютантов, снижающие риск дальнейшего загрязнения окружающей среды. Для решения поставленной задачи используют различные мелиоративные приемы, направленные на максимальное физико-химическое связывание тяжелых металлов в почве, что позволяет снизить их миграцию в грунтовые воды. Помимо данных способов, значительный интерес представляют биологические методы очистки загрязненных почв при помощи растений. Такие методы основаны на способности некоторых видов и генотипов растений извлекать из почвы тяжелые металлы. Для достижения этой цели важно создавать формы, устойчивые к повышенному содержанию тяжелых металлов в почвенном растворе.

Лен - одна из важнейших российских технических культур комплексного использования. Селекция льна, проводимая на основе традиционных методов, остается трудоемким процессом, требующим длительного времени и определенных навыков. На сегодняшний день биотехнологические методы выращивания этой культуры с целью получения новых форм и генотипов освоены слабо. В связи с этим, в условиях повышенного поступления тяжелых металлов в окружающую среду, помимо селекции на качество, устойчивость к полеганию и комплексу болезней, семенную продуктивность важно получать растения, устойчивые к неблагоприятным факторам антропогенного воздействия.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение методами клеточной селекции in vitro форм растений льна-долгунца, устойчивых к кадмию, а также изучение влияния данного металла на про-

цесс формирования лубяных пучков стебля льна. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить условия культивирования каллусной ткани льна-долгунца in vitro с последующей оптимизацией питательных сред, обеспечивающих получение растений-регенерантов;

• разработать и осуществить технологию клеточной селекции льна-долгунца in vitro на устойчивость к кадмию;

• изучить влияние повышенных концентраций кадмия на рост и развитие растений льна-долгунца в условиях вегетационного и лабораторного опытов;

• сравнить содержание кадмия и других тяжелых металлов в диких и культурных растениях льна, выращиваемых в условиях повышенного содержания кадмия;

• изучить влияние кадмия на мезо- и ультра структуру стебля льна.

Научная новнзна работы заключается в том, что впервые разработана и проведена клеточная селекция льна-долгунца на устойчивость к кадмию в условиях in vitro. Установлено, что концентрация кадмия в питательной среде 15 мг/л позволяет проводить отбор клеток и получать расгения-регенеранты, устойчивые к этому элементу. В результате работ in vivo было показано влияние соли кадмия на мезо- и ультраструктуру стебля льна. Установлено, что кадмий воздействует на строение лубяных пучков, снижая в них число элементарных волоконец и приводя к образованию нитевидных лубяных пучков, а также к некомпактному расположению клеток элементарных волоконец в пучке. Сравнительный анализ по накоплению хрома, никеля и кадмия у культурных и диких растений льна позволил установить, что культурные сорта льна накапливают кадмий, не концентрируя при этом в вегетативной массе хром и никель, тогда как дикие формы льна, напротив, не накапливают кадмий в растениях, но концентрируют хром и никель.

Практическая значимость. Линии, полученные при помощи биотехнологических методов'селекции, в дальнейшем могут быть использова-

ны для рекультивации земель в качестве культур, очищающих почву от соединений токсичных элементов, или в качестве сырья для получения различной продукции, не употребляемой человеком в пищу, такой как технические масла, прядильное волокно и др.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на IV Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1997), VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997), на V Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1999), на Научной конференции МСХА (Москва, 7-10.12.99), а также на заседаниях кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ и 2 статьи находятся в публикации.

Объем п структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, а также из четырех глав экспериментальной части, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 122 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 18 рисунков. Библиографический список содержит 153 источника, из которых 55 зарубежной литературы.

ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исходным материалом служили 9 сортов льна-долгунца: ВНИИЛ 11, К 6, Лазурный, Торжокский 4, Псковский 359, Спартак, Призыв 81, Тверца, дикий лен. Семена всех изучаемых генотипов были любезно предоставлены сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института льна РАСХН.

Условия получения н культнвнровання каллуснон ткани льна-долгунца. Каллусную ткань получали из сегментов гипокотилей, изолированных со стерильных 5-15-дневных проростков.

В эксперименте придерживались принятых на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА принципов стерилизации растительного ма-

териала, питательных сред, инструментов и посуды, представленных в методическом пособии «Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии» (1996).

Для получения первичной и пересадочной каллусной ткани использовали модифицированную питательную среду МС, содержащую сахарозу 2%, а также гормоны ауксинового и цитокининового типа действия. Из группы ауксинов были изучены 2,4-Д в концентрации 0,5; 1,0; 2,0 мг/л, а также НУК - 0,1 мг/л. Для индукции морфогенеза в питательную среду добавляли цитокинины (БАП 1 и 2 мг/л) или биологически активные вещества (эпин - 0,1; 1; 10 мг/л, кокосовая вода - 10 мг/л, аспарагин - 160 мг/л, нитрат серебра - 10 мг/л).

Культивирование стерильных проростков и каллусной ткани проводили в климатической камере, где поддерживалась температура 25±1°С и 16-часовой фотопериод. Пересадку каллусной ткани осуществляли один раз в месяц, учитывая следующие показатели: интенсивность роста каллуса, его консистентность, формирование морфогенных структур. Для определения интенсивности роста каллусную ткань взвешивали в начале и в конце пассажа в стерильных условиях.

Клеточная селекция. Клеточную селекцию проводили на каллусной ткани, которую культивировали на модифицированной питательной среде МС, содержащей соль кадмия Сс1(ЫО))2 в концентрациях - 5, 15, 25, 35 мг/л (по элементу). В работе придерживались следующих схем селекции:

• индукция и пролиферация каллусной ткани в нормальных условиях (0-3 пассаж); культивирование каллусов в присутствии кадмия (4-7 пассаж) с последующим их выращиванием в течение 8 и 9-го пассажей на среде без ионов кадмия; повторное проведение клеточной селекции;

• индукция и пролиферация каллусной ткани в присутствии кадмия (0-7 пассаж); последующее их выращивание в течение 8 и 9-го пассажей на среде без ионов кадмия; повторное проведение клеточной селекции.

Лабораторные н вегетационные опыты. Лабораторные исследования проводили на пяти генотипах льна-долгунца: Спартак, Псковский 359, Смоленский, Торжокский 4, ВНИИЛ 11. Семена проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной водным раствором с добавлением кадмия в концентрациях 5, 15, 25, 35 мг/л. Контролем служила вода. У опытных и контрольных растений измеряли длину и массу стеблевой и корневой части на 7 день прорастания семян.

Для проведения мезо- и ультраструктурного анализа стеблей растений льна-долгунца, выращенных в стрессовых условиях, а также для выявления воздействия металла на биометрические показатели интактиых растений, был заложен вегетационный опыт. Кадмий вносили при набивке сосудов в виде нитрата кадмия по 15 мг на 1 кг почвы. Измерения высоты стебля производили в фазу «елочки», «быстрого роста» и «ранней желтой спелости». Образцы для микроскопических исследований отбирали из средней части стебля в онтогенетическую фазу быстрого роста.

Анатомическое строение стебля льна-долгунца. Мезо- и ультраструктурный анализ стебля льна-долгунца проводили во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии (Москва). Подготовка срезов для проведения световой и электронной микроскопии осуществлялась по методикам, изложенным в литературных источниках (Кисели, 1962; Клейн, 1974).

Полутонкие срезы для световой микроскопии анализировали и фотографировали при помощи микроскопа «Opton» (Германия). Рабочее увеличение х20, х40. Анализ ультратонких срезов растительного материала производили на электронном микроскопе Н-300 "Hitachi" (Япония). При просмотре использовали увеличение х700, х4000 - х20000. Фотографирование объектов производили при увеличении х700, х5000, х7000, хЮООО.

Анализ элементного состава зеленой массы льна-долгунца проводили на 2-х культурных сортах (Спартак, Псковский 359) и одном диком виде льна L. tenuifolium. Определяли содержание кадмия, никеля, хрома в

листьях и стеблях растений, находящихся в фазе ранней желтой спелости, с использованием метода сухого озоления (Кузнецов, 1992). Определение металлов (кадмия, никеля, хрома) проводили на атомно-абсорбционном спектрофотометре ААБ-З.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Раздел 1. Изучение морфофнзиологических и биохимических изменений при выращивании льна-долгунца в присутствии кадмия 1.1.Влияние попов кадмия на рост и развитие растений льна-долгунца в условиях вегетационного опыта Было изучено влияние кадмия на рост и развитие восьми генотипов

льна-долгунца, находящихся в онтогенетических фазах «елочки» и «быстрого роста». Визуальные наблюдения позволили выявить сходство в развитии растений льна-долгунца в фазе «елочки» в опытных и контрольных вариантах. Растения имели по 7-8 пар листьев правильной морфологии, расположенных на стебле поочередно по спирали.

Хотя фаза «елочки» характеризуется активным ростом корневой системы и медленным - надземной части, показатель роста последней несколько колебался в опыте. Наибольшей высотой стебля в анализируемой фазе отличался сорт ВНИИЛ 11, наименьшей - Псковский 359. Возможно, данные различия связаны с сортовыми особенностями, определяющими физиологическое развитие растений. Остальные анализируемые генотипы, включая дикий вид льна, не отличались между собой по морфологическим характеристикам. В связи с этим нами были проанализированы учитываемые ранее показатели в последующую онтогенетическую фазу «быстрого роста». Фаза «быстрого роста» характеризуется активным ростом стебля льна-долгунца, что способствует выявлению различий между контрольным и опытным вариантом при воздействии кадмия. Данные представлены в таблице 1.

В процессе вегетации установлены морфофизиологические различия между вариантами, которые выражались в образовании боковых побегов у растений, выращиваемых на почве с внесением кадмия, тогда как у растений контрольных вариантов наблюдалось преобладание линейного роста

стебля. Вероятно, данные морфофизиологические различия связаны с присутствием ионов кадмия в почвенном растворе.

Таблица 1

Влияние кадмия на рост и развитие растений льна-долгунца в фазе «бы

строго роста»

Сорт Средняя длина стебля, см Фаза развития Средняя вегетативная масса, г

Контроль Кадмий Контроль Кадмий Контроль Кадмий

Псковский 359 59,7011,49 54,30+1,09 быстрого роста-бутонизации цветение 11,4510,31 10,3610,27

Спартак 64,90±1,29 55,9011,17 быстрого рос-та-цветенне зеленая спелость 24,3010,55 20,5010,76

Как видно из таблицы 1, растения, выращиваемые в стрессовых условиях, характеризовались менее активным ростом по сравнению с контролем, что отражалось в средней длине стебля. Такие же закономерности характерны и для средней массы надземной части растений. Замечено, что при разнице в росте, растения опытных вариантов находились на более поздних этапах развития. Так, когда растения контрольного варианта сорта Псковский 359 проходили фазу быстрого роста, переходящую в фазу бутонизации, растения опытного варианта находились уже в фазе цветения. Аналогичные результаты были получены и для сорта Спартак. При этом следует учитывать разницу в сроках созревания между исследуемыми генотипами.

Таким образом, при внесении металла в почву растения льна-долгунца в фазе "елочки" развиваются без угнетения роста, тогда как на более поздних этапах развития для растений опытного варианта прослеживается тенденция к снижению параметров анализируемых показателей длины стебля и массы растений в среднем на 9-13%. Также при внесении металла наблюдается смещение онтогенетических фаз развития с тенденцией опережения контрольных вариантов опытными растениями на 7-10дней. Возможно, это связано с реакцией растений льна-долгунца на присутствие в почве стрессового фактора - ионов кадмия.

1.2. Содержание тяжелых металлов в растениях льна, культивируемых в условиях присутствия кадмия

Для определения и сопоставления особенностей поглощения тяжелых

металлов диким и культурными видами льна проводился анализ элементного состава растений. Результаты анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2

Содержание тяжелых металлов в вегетативной массе культурного и дикорастущего видов льна при внесении кадмия в почву

Сорт Анализируемые Вариант

элементы

К (контроль), мг/кг К+С(1, мг/кг

Сг 0 0

Псковский 359 N1 0 0

са 0,45±0,01 0,65±0,02

Сг 0 0

Спартак № 0 0

Сс1 0,50+0,01 0,7010,02

Сг 0,45±0,01 0,45±0,01

Ь.ТепшГошт № 0,49±0,01 0,49±0,01

Сй 0 0

Как видно из таблицы 2, культурные сорта и дикий вид льна качест-

венно отличаются по способности накапливать тяжелые металлы. Так, растения льна-долгунца обоих культурных сортов имеют тенденцию к накоплению кадмия в вегетативной массе даже на почве, не загрязненной металлом. При внесении же металла в почву концентрация кадмия в вегетативной массе сортов Псковский 359 и Спартак возрастает в 1,4 раза по сравнению с контролем. Однако, это не распространяется на другие металлы, в частности на хром и никель. Так, концентрации этих элементов у сортов культурных растений обоих вариантов оказались следовыми, тогда как дикий вид льна накапливал хром и никель в концентрациях 0,45 мг/кг и 0,49 мг/кг соответственно. Что касается кадмия, данный металл не поглощался из почв растениями дикого вида льна. Вероятно, это связано с генетическими особенностями растений дикорастущего льна, а также с действием механизмов, связанных с ограничением накопления металла - задержкой поглощения или осаждением металла на поверхности корней. Однако в природе данный путь предотвращения поступления металлов в растения встречается редко. В данном случае неодинаковая реакция растений льна куль-

турного и дикого видов на присутствие кадмия в почве как в низких, так и в высоких концентрациях может быть связана со специфичными механизмами взаимодействия на уровне целого растения и металла почвенного раствора. Таким образом, элементный анализ растений показал, что кадмий поглощается культурными видами растений, тогда как дикие формы льна данный элемент не накапливают.

1.3. Влияние нонов кадмия на формирование проростков в условиях лабораторного опыта.

Было изучено влияние различных концентраций кадмия на рост и

развитие проростков пяти генотипов льна-долгунца. В таблице 3 представлены лишь наиболее характерные данные на примере трех сортов.

Установлено, что не зависимо от генотипа наблюдается снижение всех учитываемых показателей в опытном варианте по сравнению с контролем при увеличении концентрации кадмия в растворе. Наиболее ярко данная тенденция выражена у сортов Смоленский и Спартак (табл.3).

Таблица 3

Биометрические показатели проростков льна при внесении различных концентраций кадмия в водный раствор

Сорт Конц. са^о^ (мг/л) Средняя масса (г) Средняя длина (см)

стеблей корней стебля Корня

0 1,41±0,07 0,46±0,02 1,710,1 2,810,1

Смоленский 15 !,02±-0,03 0,33±0,02 1,010,1 2,210,1

25 0,70±0,03 0,1710,01 0,710,1 1,210,1

35 0,58±0,02 0,15±0,01 0,5+0,1 0,810,1

0 0,66±0,03 0,2210,01 2,210,1 2,510,1

ВНИИЛ11 15 0,57±0,03 0,3810,02 1,910,1 2,910,1

25 0,90+0,05 0,29+0,01 1,610,1 2,210,1

35 0,73+0,04 0,17+0,01 1,410,1 1,6+0,1

0 1,48±0,06 0,61+0,03 2,110,1 4,110,2

Спартак 15 1,19±0,04 0,34+0,01 1,610,1 3,010,2

25 0,68+0,03 0,1510,01 1,0+0,1 1,010,1

35 0,49±0,02 0,1010,01 0,710,1 0,510,1

Исключение составляет лишь сорт ВНИИЛ 11, для которого в вари-

антах с внесением кадмия в концентрации 25 и 35 мг/л средняя масса стеблей и корней выше контроля на 10-36% при общей тенденции снижения роста надземной и подземной частей проростков. Увеличение массы стеблей и, особенно, корней в этом варианте можно объяснить тем, что при из-

бытке кадмия в растворе нарушались морфофизиологические процессы, которые в первую очередь проявились в изменении морфологии корней. Корни в этих вариантах были сильно утолщенные, вероятно, за счет появления оводненных клеток. Для остальных изучаемых генотипов (Спартак, Смоленский, Торжокский 4, Псковский 359) все учитываемые показатели находились в обратной корреляции с концентрацией металла в растворе.

Раздел 2. Изучение мезо- и ультраструктуры стебля льна-долгунца при

воздействии кадмия

Эксперименты проводились с целью изучения воздействия кадмия на

процессы формирования льняного стебля. Лубяные волокна являются основными структурными элементами, которые используются как сырье для текстильной промышленности. В условиях проводимого эксперимента нами установлены основные характеристики лубяных пучков и элементарных волоконец при воздействии кадмия.

Мезоструктурный анализа стебля льна-долгунца показал, что поперечный срез с лубяной части стебля сохраняет свою характерную структуру как в контрольном, так и в опытном варианте у всех изучаемых генотипов. При более детальном рассмотрении клеток лубяных пучков было установлено, что наличие кадмия в субстрате приводило к образованию пучков нитевидной формы толщиной в 1-2 клетки (рис.1).

При этом клетки элементарных волоконец имели различные поперечные размеры в пределах одного пучка, которые колебались от 17 до 28 мкм или от 16 до 32 мкм в зависимости от генотипа. Это является косвенным показателем небольшой длины элементарных волокон растений, то есть более низкого качества волокна. В опытных вариантах, как следствие воздействия металла, наблюдалось также рыхлое некомпактное расположение клеток в лубяном пучке по сравнению с их компактным 3-слойным распределением в контрольном варианте.

Рисунок 1.

Мезоетрукгура срсдшшой части стебля льна-долгунца (Ыпиш и5!(а(1$$!тиш) сорта Смоленский в фазе быстрого роста (х120)

В нормальных условиях При воздействии кадмия

А - однослойный эпидермис, В - коровая паренхима, С - клетки элементарных волоконец лубяного пучка, О - флоэма, Е - ксилема.

Поскольку степень одревеснения волокна меняется у растений одного и того же вида в зависимости от условий выращивания, нами было проанализировано воздействие кадмия на интенсивность процесса лигнификации. При внесении кадмия на поперечных срезах стебля наблюдалось розовое окрашивание большей части срединных пластинок в лубяном пучке, что свидетельствовало о значительной степени одревеснения. В контрольных вариантах в пределах одного пучка розовое окрашивание проявлялось в области 1-2 срединных пластинок, что позволяет судить о низкой степени одревеснения волокна у растений, выращиваемых в нормальных условиях. Процент одревесневших волокон находился в отрицательной корреляционной зависимости с качеством волокна. Установленные закономерности указывают на негативное воздействие кадмия на растения льна, выражающееся в увеличении степени лигнификации срединных пластинок клеток лубяных пучков.

Исследование ультраструктурных особенностей клеток волокон 1лпит изиаЦЗБтит сортов Псковский 359, Смоленский, Спартак под влиянием кадмия показало, что значительных изменений ультраструктуры различных слоев клеточной стенки, пластид, цитоплазмы и ядра не выявлено.

Однако, во всех опытных образцах наблюдались различия по толщине вторичной клеточной стенки в пределах одного лубяного пучка и образовывались клетки неправильной формы или с отличающимися размерами. Кроме этого, часто встречались клетки, у которых первичная и вторичная клеточные стенки не прилегали друг к другу, что также позволяет предположить о воздействии кадмия на клеточном уровне (рис.2). Таким образом, негативное воздействие стрессового фактора было выявлено как при проведении мезо-, так и ультраструктурного анализа срезов средней части стебля льна-долгунца. Рисунок 2.

Характерная ультраструкгура клетки лубяного пучка в нормальных н стрессовых условиях выраишваннн (Псковским 359)

В нормальных условиях При воздействии кадмия

А - срединная пластинка, В - первичная клеточная стенка, С - вторичная клеточная стенка, D - пластиды, Е - вакуоль, F - цитоплазма.

Раздел 3. Изучение условий культивирования льна-долгунца in vitro.

При введении льна-долгунца в культуру in vitro было установлено, что разные генотипы льна обладают различной способностью формировать стерильные проростки. Семена сортов К 6, Торжокский 4, Псковский 359, Спартак, дикий лен L.Tenuifoium в течение 7 дней формировали на безгормональной питательной среде нормальные по морфологии проростки. Ос-

\г

тальные генотипы (ВНИИЛ 11, Лазурный) образовывали слабые проростки с морфофизиологическими нарушениями: формировались утолщенные стебли, а корневая система находилась в зачаточном состоянии. Наиболее интенсивно в условиях in vitro развивались проростки сортов Спартак и Псковский 359, поэтому данные генотипы были использованы нами в последующих работах при оптимизации условий регенерации льна из каллусной ткани, культивируемой в стрессовых и нормальных условиях.

В связи с тем, что клеточную селекцию проводят, как правило, на каллусной ткани, то первоначально необходимо подобрать оптимальный состав питательной среды, обеспечивающий получение хорошо пролифе-рирующей каллусной ткани, способной в дальнейшем регенерировать растения. При изучении влияния ауксинов и их концентраций на процесс кал-лусогенеза льна-долгунца in vitro было установлено, что культивирование изолированных сегментов гипокотилен разных сортов льна на средах, содержащих 2,4-Д в концентрации 0,5 мг/л и 2 мг/л, не приводило к формированию каллусной ткани. При использовании 2,4-Д в концентрации 1 мг/л процесс каллусообразования происходил у всех исследуемых сортов. Однако интенсивность каллусогенеза была различна и зависела от исследуемого генотипа. Так, для сортов Псковский 359 и Спартак этот показатель достигал максимума и составлял по 5-ти бальной оценочной шкале - 5 баллов. Для всех остальных генотипов этот показатель находился в пределах 2-3 баллов.

Установлено так же, что возраст проростков оказывает немаловажное влияние на процесс формирования первичной и пересадочной каллусной ткани. Так, сегменты гипокотилей, изолированные с 5-7-дневных проростков, в 100% случаев образовывали ярко-желтый средней плотности каллус с признаками морфогенеза. В то время как на сегментах, изолированных с 1015-дневных проростков, образования каллусной ткани не происходило. В связи с этим в последующих экспериментах в качестве первичного экс-

планта нами использовались сегменты гипокотилей, изолированные с 5-7 дневных проростков.

Способность каллусной ткани к морфогенезу была неодинаковой и также зависела от изучаемого генотипа. Наибольшим морфогенетическим потенциалом обладала каллусная ткань, полученная из сегментов гипокотилей проростков сортов Псковский 359 и Спартак. Для увеличения морфо-генетического потенциала каллусной ткани, полученной из сегментов гипокотилей проростков нами было изучено влияние различных концентраций 6-бензиламинопурина (БАП) в сочетании с Р-нафтилуксусной кислотой (НУК) на этот процесс. Полученные данные представлены в табл.4.

Таблица 4

Показатели морфогеиной активности каллусной ткани при различных концентрациях цитокининов и их сочетаний

Сорт Вариант питательной среды Морфогенный каллус, % Образование корней, %

•1 10,0 0

ВНИИЛ 11 2 8,3 5,0

3 10,0 0

1 11,7 0

Кб 2 15,0 . 6,6

3 10,0 0

1 6,6 0

Лазурный 2 6,6 10,0

3 5,0 0

1 10,0 0

Торжокский 4 2 15,0 36,7

3 10,0 0

1 100,0 0

Псковский 359 2 95,0 11,7

3 80,0 0

1 100,0 0

Спартак 2 100,0 10,0

3 90,0 0

1 5,0 0

Призыв 81 2 5,0 6,7

3 3,3 0

1 5,0 0

Тверца 2 5,0 5,0

3 3,0 0

•Примечание: 1- БАП 1 мг/л; 2- БАП 1 мг/л+НУК 0,1 мг/л; 3- БАП 2 мг/л

Из таблицы 4 виднд, что применение БАП в концентрации 1 мг/л

наиболее эффективно для индукции морфогенетических процессов по сравнению с другими вариантами внесения гормонов. Вероятно, это связано с генетическими особенностями растений. Поскольку совместное внесение гормонов индуцирует ризогенез, дальнейшее использование данного варианта нецелесообразно в связи с отрицательным влиянием процесса корне-образования на последующую регенерацию растений из каллусной ткани. Таким образом, в дальнейшей работе по клеточной селекции с целью получения растений-регенерантов нами был использован только БАП в концентрации 1 мг/л.

Раздел 4. Клеточная селекция льна-долгунца на устойчивость к воздействию повышенных концентраций кадмия.

В связи с тем, что поступление кадмия в окружающую среду из различных промышленных источников увеличивается на территории НЧЗ, а также в районах традиционного сеяния льна-долгунца, необходимо решение проблемы получения растений, устойчивых к воздействию данного фактора. В эксперименте изучены две схемы селекции, по которым кадмий вносился на разных этапах опыта в концентрации 15 мг/л. Выбор данной концентрации обоснован литературными данными и результатами проведенных нами лабораторных исследований. Для индукции каллусогенеза во всех вариантах эксперимента использовали 2,4-Д в установленной ранее оптимальной для данного процесса концентрации 1 мг/л. Показатели первых этапов селекции по изучаемым схемам представлены в таблице 5.

Из таблицы 5 видно, что при внесении кадмия в питательную среду на нулевом пассаже в опытном варианте для всех генотипов наблюдалось отсутствие процесса каллусообразования и, как следствие, неспособность к формированию морфогенного каллуса. В связи с этим внесение кадмия на нулевом пассаже оказалось нецелесообразным.

Данные таблицы 5 показывают, что для всех испытуемых генотипов внесение кадмия в питательную среду на 3 пассаже приводило к снижению морфогенетического потенциала каллусной ткани. Однако, на фоне общей закономерности снижения-морфогенетической активности ткани выделять"

ются генотипы Псковский 359 и Спартак, регенерационная способность которых в обоих вариантах опыта выше, чем у остальных испытуемых генотипов на 60-80%.

Таблица 5

Формирование и пролиферация каллусной ткани в стрессовых условиях, смоделированных на 0 н 3 пассаже

Сорт Пассаж Интенсивность кал- Морфогенный каллус,

лусогенеза, балл %

ВНИИЛ 11 0 0/2« 0/0

3 2/2 3,3/5,0

Кб 0 . 0/3 0/0

3 2/3 5,0/10,0

Лазурный 0 0/2 0/0

3 1/2 0/6,6

Торжокский 4 0 0/3 0/0

3 2/3 5,0/11,7

Псковский 359 0 1/5 ' 0/20,0

3 4/5 50,0/80,0

Спартак 0 1/5 0/33,3

3 4/5 60,0/95,0

Призыв 81 0 0/1 0/0

3 1/1 0/6,6

Тверца 0 0/1 0/0

3 1/3 0/5,0

•Примечание: числитель - вариант с внесением кадмия; знаменатель - контроль

Таким образом, селекцию на устойчивость к металлу в дальнейшем мы проводили с генотипами Спартак и Псковский 359, так как данные сорта отличались высокой морфогенной активностью и образовывали больше каллусов, способных к регенерации растений.

Поскольку прирост каллусной ткани в стрессовых условиях необходимо прослеживать в динамике, а подобных экспериментов с растениями льна по клеточной селекции не проводилось, нами были испытаны несколько концентраций кадмия в питательной среде для выявления пороговой концентрации. В связи с этим, каллусную ткань обоих генотипов, полученную после 3 пассажей на питательной среде, содержащей 2,4-Д, помешали на селективные среды с различными концентрациями металла и культивировали в течение четырех пассажей (с 4 по 7) . Результаты представлены в таблицах 6,7.

1С

Таблица 6

Прирост каллусной ткани (г) в зависимости от концентрации кадмия и числа субкультивировании (Псковский 359)

№ пассажа Концентрация кадмия (мг/л)

5 15 25 35 Контроль

IV 0,023 0,030 0,029 0,023 0,023

V 0,029 0,024 0,028 0,023 0,037

VI 0,037 0,020 0,027 0,020 0,056

VII 0,052 0,018 0,025 0,018 0,084

Таблица 7

Прирост каллусной ткани (г) в зависимости от концентрации кадмия и числа субкультивировании (сорт Спартак)

№ пассажа Концентрация кАдмня (мг/л)

5 15 25 35 Контроль

IV 0,028 0,029 0,029 0,028 0,029

V 0,033 0,032 0,030 0,024 0,052

VI 0,057 0,049 0,020 0,010 0,075

VII 0,090 0,060 0,020 0,010 0,100

При анализе полученных данных прослеживается тенденция угнетения прироста каллусной ткани обоих генотипов льна с увеличением концентрации кадмия в субстрате при возрастании числа субкультивирований. Так, в течение первых 4-х пассажей на селективных средах было отмечено, что концентрация 5 мг/л не угнетала рост каллусной ткани по сравнению с контролем и гибель растительного материала при этом не происходила, хотя, вероятно, что клетки в течение этого времени уже успевают поглотить достаточное количество элемента.

Использование концентрации 15 мг/л показало, что прирост каллусной массы снижался с увеличением числа субкультивирований по сравнению с контролем у сорта Псковский 359 и гибель каллусной ткани, на данном этапе, составила в среднем 30%.

У сорта Спартак данная концентрация несколько стимулировала прирост каллусной массы с увеличением числа субкультивирований, хотя по сравнению с контролем этот показатель снижался в 1,5 раза. Гибель растительного материала на данном этапе селекции у сорта Спартак не наблюдалась. Возможно, это связано с пониженной проницаемостью клеток каллусной ткани данного генотипа для кадмия по сравнению с сортом Псковский

359. Использование концентраций 25 и 35 мг/л приводило к ингибированию пролиферации каллуса с увеличением числа субкультивирований. Каллусная ткань в этих вариантах у обоих сортов была рыхлой с элементами некроти-зации, что приводило к ее гибели в среднем на 70%. Причем оставшаяся каллусная ткань потенциально не являлась морфогенетически активной, поскольку клетки каллуса были рыхлыми и имели коричневый оттенок.

После четырех пассажей на селективных средах каллусную ткань обоих генотипов переносили на питательную среду Мурасига-Скуга без селектирующего фактора. Пересаженная каллусная ткань сортов Псковский 359 и Спартак после селекции на среде с кадмием 5 и 15 мг/л характеризовалась кремовым цветом с заметными зелеными очагами морфогенетически активных структур. В течение 2 пассажей в данных условиях каллусная ткань развивалась без угнетения роста, прирост был на уровне контрольного варианта. Что касается помещенной в такие же условия каллусной ткани после культивирования на среде, содержащей кадмий в концентрации 25 и 35 мг/л, ее рост и развитие значительно отличались от контроля. Оставшиеся каллусные клетки не восстанавливали способность к наращиванию массы. Это приводило в дальнейшем к полной гибели всей каллусной ткани. Вероятно, это связано с высокой токсичностью этих концентраций для кал-лусных клеток. Их использование на первых этапах селекции вызывает необратимые изменения клеточных структур с последующим накоплением металла в тканях.

Последующие 10-14-ый пассажи проводили вновь на селективных средах с внесением металла. Относительно каллуса, культивируемого при внесении кадмия 5 мг/л, для обоих сортов отмечается прирост ткани на уровне контрольного варианта без угнетения роста и развития. Использование концентрации 15 мг/л в конце второго этапа селекционного процесса вызывало 50% гибель культивируемых клеток у обоих генотипов. Применение концентраций 25 и 35 мг/л на данном этапе селекции приводило к ги-

бели каллусной ткани уже на 10 пассаже, что проявлялось в полной некро-тизации культивируемых клеток.

Таким образом, оптимальной для получения устойчивых каллусных клеток оказалась концентрация 15 мг/л. Применение данной концентрации позволяет по окончанию селекционного процесса получить отобранный растительный материал, обладающий устойчивостью к воздействию стрессового фактора.

Регенерацию растений из каллусов, прошедших селекционный процесс, проводили на питательной среде Мурасига-Скуга, содержащей БАП 1 мг/л в присутствии кадмия в концентрации 15 мг/л. Контролем служила среда без кадмия. Полученные результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8

Образование растеннй-регенерантов из каллуснон ткани сортов Псков-

ский 359 и Спартак после клеточной селекции

Сорт Количество каллусов, шт Среднее количество каллусов, % Среднее число обра зующихся растенин-регенерантов, шт

Развивающихся Образующих адвентивные почки

Псковский 359 60 100/100» 10/15 5,8+0,1/8,9+0,2

Спартак 60 100/100 15/20 8,7+0,3/11,5+0,3

•I 1рнмечание: числитель - вариант с внесением кадмия; знаменатель - контроль

Данные таблицы 8 показывают, что и в стрессовых, и в контрольных условиях каллусная ткань обоих генотипов активно развивается в течение длительного культивирования, образуя адвентивные почки. Однако, процент образования адвентивных почек как в стрессовых, так и в контрольных условиях у анализируемых сортов невысокий (10-20%). Воздействие кадмия на каллусные клетки выражается в уменьшении числа растений-регенерантов в 1,3-1,5 раза по сравнению с контролем. В связи с этим нами была проведена работа по оптимизации состава питательной среды с целью увеличения выхода растений-регенерантов.

В качестве исследуемых веществ в питательную среду были индивидуально добавлены следующие компоненты: аспарагин - 160 мг/л, кокосовая вода - 10 мг/л, гибереллиновая кислота - 1мг/л, иннозит - 100 мг/л и

нитрат серебра - 10 мг/л. В качестве контроля была использована ранее подобранная среда, содержащая БАП в концентрации 1 мг/л. Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9

Влияние различных веществ на морфогенез каллусной ткани

Сорт Концентрация, мг/л Применяемые вещества Ср. кол-во каллусов, образующих адвентивные почки,% Ср.число рас-тений-рсгене-рантов, шт.

Псковский 359 1 БАП 15 8,9±0,2

160 Аспарагин 13,3 6,0±0,2

10 Кокосовая вода 10,0 5,2±0,2

1 Гибереллиновая кислота 11,6 5,9±0,2

100 Иннозит 10,0 5,2±0,1

10 Нитрат серебра 8,3 4,5+0,1

Спартак 1 БАП 20 11,5+0,3

160 Аспарагин 16,7 11,010,2

10 Кокосовая вода 15,0 8,7±0,2

1 Гибереллиновая кислота 15,0 8,7±0,3

100 Инозит 15,0 8,7±0,3

10 Нитрат серебра 10,0 5,4±0,1

Как видно из таблицы 9, различные биологически активные вещества

неодинаково влияют на образование адвентивных почек у изучаемых генотипов льна-долгунца. Так, при добавлении в питательную среду гиберелли-новой кислоты и аспарагина количество каллусов, образующих адвентивные почки возрастает лишь на 1-3%, использование кокосовой воды и ин-нозита не оказывало стимулирующего эффекта на процесс морфогенеза, а при внесении в питательную среду нитрата серебра снижалась морфогене-тическая активность каллусной ткани.

Таким образом, применение изучаемых веществ не оказало существенного влияния на интенсивность образования адвентивных почек и формирование растений-регенерантов. В связи с этим, был проведен эксперимент по изучению влияния вещества группы брассиностероидов на морфо-генетический потенциал каллусной ткани. Исходя из литературных источников, данная группа соединений позволяет активизировать у растений процессы, отвечающие за- морфогенетическую активность, например, син-

тез растительных гормонов, которые способны повлиять на морфогенез. В качестве изучаемого фактора был использован эпин. Это вещество содержится в клетках всех растений и обеспечивает их выживаемость в экстремальных условиях, способствуя возобновлению утраченных под воздействием того или иного фактора жизненно важных функций. Исходя из того, что эпин не был ранее включен в работу in vitro, но известно, что он стимулирует физиологические процессы интактных растений в концентрации 0,1 мг/л, нами был взят широкий диапазон концентраций. Результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10

Влияние эпина на морфогенез каллусной ткани

Сорт Концентрация, мг/л Среднее количество каллусов, образующих адвентивные почки, % Среднее число растений-регенерантов, шт.

Псковский 359 0,05 10,0 5,0±0,1

0,1 10,0 6,5±0,2

1,0 13,3 7,3±0,2

Спартак 0,05 10,0 5,5±0,2

0,1 11,7 6,6+0,2

1,0 15,0 8,3±0,2

Как видно из таблицы 10, внесение в питательную среду различных концентраций эпина не оказывало существенного влияния на морфогенети-ческие процессы по сравнению с биологически активными веществами, применяемыми нами ранее (табл.9). Прослеживая воздействие возрастающих концентраций брассиностероида на анализируемый показатель, можно отметить некоторое стимулирование морфогенетических процессов при использовании концентрации 1.0 мг/л относительно предыдущих концентраций. Применение других концентраций брассиностероида было неэффективным. Сопоставляя полученные результаты с ранее представленными данными по применению БАП (табл.8), следует отметить, что БАП остается единственным цитокинином, который в 20% случаев стимулирует регенерацию растений из длительно пассируемой каллусной ткани в стрессовых и нормальных условиях.

Выводы

1. Установлено, что внесение кадмия в почву в концентрации 15 мг/кг приводит к торможению роста стеблевой и корневой частей растения льна-долгунца на 9-13% с одновременным уменьшением надземной массы растений на 10-15% по сравнению с контролем.

2. Показано, что выращивание растений льна-долгунца в стрессовых условиях приводит к сокращению онтогенетических фаз развития, следующих за фазой "елочки" на 7-10 дней по сравнению с контролем.

3. Выявлено, что сорта льна культурного поглощают ионы кадмия, но не накапливают ионы хрома и никеля, в то время как дикий вид льна поглощает ионы хрома и никеля, не накапливая при этом кадмий в вегетативной массе.

4. Мезо- и ультраструктурный анализ стеблей льна-долгунца показал, что присутствие кадмия в субстрате негативно влияет на формирование лубяных пучков, что выражается в уменьшении количества клеток элементарных волоконец в пучке, в формировании нитевидных лубяных пучков, некомпактном расположении клеток элементарных волоконец в лубяном пучке, а также в неравномерности размеров клеток элементарных волоконец в пределах одного пучка и в сроках формирования вторичной клеточной стенки. Изменений ультраструктуры различных слоев клеточной стенки, пластид, цитоплазмы и ядра не выявлено.

5. Установлено, что присутствие кадмия в субстрате вызывает одревеснение срединных пластинок клеток элементарных волоконец большей части лубяного пучка относительно контрольного варианта, в котором лигнифика-ции были подвержены всего 2-3 срединные пластинки всех клеток лубяного пучка.

6. Отмечено, что процессы каллусогенеза и морфогенеза наиболее интенсивно происходят на сегментах гипокотилей, изолированных с 5-7-дневных проростков льна, культивируемых на питательной среде, содержащей 2,4-Д и БАЛ в. концентрациях по 1 мг/л.

2И

7. Присутствие дополнительно в питательной среде нитрата серебра, аспара-гина, кокосовой воды или эпина не приводит к повышению морфофизио-логического потенциала каллусной ткани, культивируемой в нормальных и стрессовых условиях.

8. Разработана и проведена клеточная селекция льна-долгунца к содержанию кадмия в питательной среде. Установлено, что присутствие кадмия в питательной среде в концентрации 15 мг/л позволяет провести клеточную селекцию и получить растения-регенеранты.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1 Гончарук Е.А., Калашникова Е.А. Влияние фиторегуляторов на морфоге-нетический потенциал изолированных тканей льна-долгунца//Тез. докл. IV Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений», Москва, 1997, с. 275.

2 Гончарук Е.А., Калашникова Е.А. Перспективы использования методов биотехнологии в селекции льна-долгунца на устойчивость к тяжелым ме-таллам//Тез. докл. VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда», Москва, 1997. с. 283.

3 Гончарук Е.А., Калашникова Е.А. Влияние условий культивирования на морфогенетические реакции и каллусогенез изолированных тканей льна-долгунца//Известия ТСХА, 1997, вып.4, с.35-40.

4 Гончарук Е.А., Калашникова Е.А. Влияние регуляторов роста на морфогенез каллусной ткани льна-долгунца, культивируемого в стрессовых условиях/Лез. докл. V Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений», Москва, 1999, с.316.

5 Гончарук Е.А., Калашникова Е.А. Изучение морфофизиологических реакций генотипов льна-долгунца в различных условиях выращивания при воздействии соли калмия//Сборник статьей кафедры сельскохозяйственной биотехнологии, Москва, 2000, с. .----

Г.'

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гончарук, Евгения Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Состояние окружающей среды и проблемы ее загрязнения в связи с изменением природной экологии.

1.1.1 Характеристика антропогенного воздействия на природные процессы, регулирующие состояние окружающей среды.

1.1.2. Проблема загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами.

1.2. Кадмий, как один из основных элементов загрязнения природной среды тяжелыми металлами.

1.2.1. Источники поступления кадмия в окружающую среду.

1.2.2. Поведение кадмия в системе почва-растение.

1.2.3. Основы механизма токсичности кадмия.

1.2.4. Пути снижения токсического действия кадмия различными мет одами.*.;., *.

1.2.5. Перспективные методы селекции растений на устойчивость к тяжелым металлам.

1.3. Влияние повышенных концентраций кадмия на анатомическое строение растений.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Биологические особенности культуры.

2.2. Характеристика исходных сортов.

2.3. Культивирование льна-долгунца в условиях in vitro.

2.3.1. Экспланты и среды.

2.3.2. Клеточная селекция.

2.4. Лабораторные и вегетационные опыты.

2.5. Анатомическое строение стебля.

2.5.1. Световая микроскопия.

2.5.2. Электронная микроскопия.

2.6. Анализ элементного состава зеленой массы льна-долгунца.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА В ПРИСУТСТВИИ КАДМИЯ.

3.1 .Влияние ионов кадмия на рост и развитие растений льна-долгунца в условиях вегетационного опыта.

3.2. Содержание тяжелых металлов в растениях льна, культивируемых в условиях присутствия кадмия.

3.3. Влияние ионов кадмия на формирование проростков в условиях лабораторного опыта.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ МЕЗО- И УЛЬТРАСТРУКТУРЫ СТЕБЛЯ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ КАДМИЯ.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА В УСЛОВИЯХ IN VITRO.

ГЛАВА 6. КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ВОЗДЕЙСТВИЮ ПОВЫШЕННЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ КАДМИЯ В СУБСТРАТЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние кадмия на морфогенез, анатомию стебля и процесс регенерации льна-долгунца из клеточных и тканевых культур in vitro"

В последние годы уделяется особое внимание проблеме загрязнения окружающей природной среды тяжелыми металлами. Эти вещества поступают из различных антропогенных источников. Рассеиваясь, они попадают в почву, а затем в растения и оказывают отрицательное действие как на биоту, так и на живые организмы. Среди тяжелых металлов выделяется кадмий, который является наиболее опасным и одним из самых распространенных элементов-загрязнителей данной группы. В настоящее время разрабатываются различные приемы ведения сельского хозяйства в условиях поступления поллютантов, снижающие риск дальнейшего загрязнения окружающей среды. Актуальность данной проблемы выражается и в том, что исключить присутствие тяжелых металлов невозможно, поэтому необходимо использовать разрабатываемые способы для ведения сельского хозяйства в условиях повышенного содержания данных элементов-загрязнителей.

Для достижения поставленной задачи используют различные мелиоративные приемы, направленные на максимальное физико-химическое связывание тяжелых металлов в почве, что позволяет снизить их миграцию в грунтовые воды. К таким приемам относится известкование, внесение органических и минеральных удобрений, использование цеолитов и других сорбентов, а также, в экстремальных случаях, нанесение почвенного слоя. Помимо данных способов, определенный интерес представляют биологические методы деконтаминации загрязненных почв при помощи растений. Такие приемы основаны на способности некоторых видов и генотипов растений извлекать из почвы тяжелые металлы. Исключив возможность дальнейшего загрязнения почв и занимая поля техническими культурами, а также растениями, дающими экологически безопасную продукцию, можно постепенно снизить содержание тяжелых металлов за счет естественных процессов самоочищения в результате выноса элементов растениями. Для достижения этой цели необходимы растения, естественно устойчивые к повышенному содержанию тяжелых металлов в почвенном растворе, поэтому важно создавать такие растения.

Лен - одна из важнейших исконно российских технических культур комплексного использования. Продукты переработки льна-долгунца востребованы во многих отраслях промышленности. В то же время селекция льна, проводимая на основе традиционных методов, остается трудоемким процессом, требующим длительного времени и определенных навыков. Следует отметить, что на сегодняшний день биотехнологические методы выращивания этой культуры с целью получения новых форм и генотипов освоены слабо. В настоящее время помимо селекции на качество (тонковолокнистость, структурный состав волокнистой части, состав масла), устойчивость к полеганию и комплексу болезней, семенную продуктивность и дружность созревания растений, важно вести селекцию на экологическую устойчивость с учетом экологических особенностей региона будущего возделывания сорта и характер последующей переработки продукции льна. Учитывая широкий ареал возделывания данной культуры, включая страны центральной и северной Европы, следует отметить неодинаковую экологическую обстановку в регионах возделывания данной культуры. Так, в России, Украине и Белоруссии наблюдается значительное загрязнение почв тяжелыми металлами. В связи с этим целесообразно использовать данную культуру для рекультивации земель с возможностью последующего получения волокна и продуктов его переработки.

Поскольку экспериментов по изучению культивирования льна-долгунца в условиях in vitro с последующим получением форм растений, устойчивых к тяжелым металлам, не проводилось, то целью данной работы являлось получение методами клеточной селекции форм растений льна-долгунца, устойчивых к кадмию, а также изучение влияния данного металла на процесс формирования лубяных пучков стебля льна. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• разработать и провести клеточную селекцию льна-долгунца in vitro на устойчивость к кадмию;

• изучить влияние кадмия на рост и развития растений льна-долгунца в условиях вегетационного и лабораторного опытов;

• изучить влияние кадмия на мезо- и ультраструктуру стебля льна. Научная новизна работы заключается в том, что впервые была разработана и проведена клеточная селекция на устойчивость к кадмию in vitro. Показано, что присутствие кадмия в питательной среде в концентрации 25 и 35 мг/л приводило к быстрому ингибированию всех изучаемых процессов. Поэтому эти концентрации не целесообразно использовать в работах по клеточной селекции. Концентрация кадмия в питательной среде 15 мг/л позволяет проводить отбор клеток, и получать растения-регенеранты, устойчивые к металлу. В результате работ in vivo было показано влияние кадмия на мезо- и ультраструктуру стебля льна. Установлено, что кадмий воздействует на строение лубяных пучков, снижая в них число элементарных волоконец и приводя к образованию нитевидных лубяных пучков толщиной в 1-2 клетки, а также к некомпактному расположению клеток элементарных волоконец в пучке. Изменений различных слоев клеточной стенки, пластид, цитоплазмы и ядра при воздействии кадмия не было выявлено. Сравнительный анализ по накоплению хрома, никеля и кадмия у культурных и диких растений льна позволил установить, что культурные виды льна накапливают кадмий, не концентрируя при этом в вегетативной массе хром и никель, тогда как дикие виды льна, напротив, не накапливают кадмия в растениях, но концентрируют хром и никель.

Практическая значимость работы заключается в том, что линии, полученные при помощи методов селекции биотехнологии, в дальнейшем могут быть использованы для рекультивации земель в качестве культур, очищающих почву от соединений токсичных элементов, или в качестве сырья для получения различной продукции, не употребляемой человеком в пищу, такой как технических масла, прядильное волокно и др.

Полученные результаты были доложены на IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1997), VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997), на V Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999), на Научной конференции МСХА (Москва, 7-10 декабря, 1999).

Вся экспериментальная работа была выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА под руководством академика РАСХН Шевелухи B.C. и кандидата биологических наук Калашниковой Е.А.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гончарук, Евгения Александровна

Выводы

1. Установлено, что внесение кадмия в почву приводит к торможению роста стеблевой и корневой частей растения льна-долгунца на 9-13% с одновременным уменьшением надземной массы растений на 10-15% по сравнению с контролем.

3. Выявлено, что культурные виды растений льна поглощают ионы кадмия, но не накапливают ионы хрома и никеля, в то время как дикие виды поглощают ионы хрома и никеля, не накапливая при этом кадмий в вегетативной массе.

5. Установлено, что присутствие кадмия в субстрате вызывает одревеснение срединных пластинок клеток элементарных волоконец большей части лубяного пучка относительно контрольного варианта, в котором лигнификации были подвержены всего 2-3 срединные пластинки всех клеток лубяного пучка.

7. Присутствие дополнительно в питательной среде нитрата серебра, ас-парагина, кокосовой воды или эпина не приводит к повышению морфофизиоло-гического потенциала каллусной ткани, культивируемой в нормальных и стрессовых условиях.

Заключение

В последнее десятилетие агроэкологическое состояние регионов традиционного сеяния льна-долгунца подверглось существенным изменениям. Соединения тяжелых металлов, включая наиболее распространенный и опасный элемент - кадмий, поступают в почву из антропогенных источников и, являясь термодинамически неустойчивыми в почвенных условиях, необратимо переходят в жидкую фазу почв. При регулярном загрязнении почв антропогенными формами соединений кадмия они могут сохраняться и накапливаться в почвах. Увеличивающиеся размеры загрязнения окружающей среды выбросами промышленных предприятий, содержащими тяжелые металлы, в том числе кадмий, приводят к повышению содержания этого металла в агроценозах и, как следствие, к уменьшению количества и снижению качества урожая. Так, техногенное загрязнение окружающей среды отрицательно сказывается на состоянии почв и процессах поглощения и утилизации элементов питания растениями, поэтому возникла проблема создания новых форм льна-долгунца при помощи методов селекции. При этом существование корреляционных связей между изменением условий выращивания и структурными анатомическими особенностями растений предполагают проведение анализа данных изменений. В связи с этим в работе наряду с получением устойчивых к повышенным концентрациям кадмия форм растений льна-долгунца был проведен мезо- и ультраструктурный анализ изменений, происходящих в стебле льна при воздействии стрессового фактора.

В проведенных нами вегетационных и лабораторных экспериментах было установлено, что кадмий угнетал линейный рост растений, а также способствовал снижению массы их надземной части. В то же время воздействие стрессового фактора приводило к смещению онтогенетических фаз развития льна-долгунца, что выражалось в опережении контрольного варианта опытными растениями. Экспериментально было также показано, что влияние, оказываемое кадмием на растения, определялось генотипом, поскольку реакция растений различных сортов на воздействие стрессового фактора проявлялось в различной степени в зависимости от генотипа. При этом общая тенденция угнетения анализируемых показателей прослеживалась у растений всех анализируемых сортов.

Проведенный сравнительный анализ элементного состава вегетативной массы растений дикорастущего и культурного льна показал, что кадмий поглощался культурными видами растений, тогда как дикие формы льна данный элемент не накапливали даже при выращивании в стрессовых условиях. Однако относительно других анализируемых металлов (хром, никель) следует отметить тенденцию их накопления дикорастущим льном при том, что культурные растения льна-долгунца эти элементы не накапливали.

При изучении воздействия кадмия на мезо- и ультраструктуру стебля льна-долгунца было установлено, что присутствие металла в почвенном растворе негативно влияло на формирование лубяных пучков. Это выражалось в уменьшении количества клеток элементарных волоконец в пучке, в формировании нитевидных пучков, толщиной в 1-2 клетки, а также в нарушении компактности расположения клеток элементарных волоконец в лубяном пучке. В то же время, при воздействии кадмия наблюдалась неравномерность размеров клеток элементарных волоконец в пределах одного пучка. Все эти факторы являются косвенными показателями волокна невысокого качества. При анализе ультраструктуры клеток лубяных пучков под влиянием стресса заметных изменений различных слоев клеточной стенки, пластид, цитоплазмы и ядра не наблюдалось. Однако присутствие кадмия отрицательно влияло на равномерность формирования клеток пучка и сроки формирования вторичной клеточной стенки.

В связи с поставленными задачами нами проводились исследования по изучению условий культивирования льна-долгунца in vitro, в результате которых было выявлено, что оптимальным первичным эксплантом для индукции каллусогенеза являются сегменты гипокотилей, изолированные с 5-7-дневных проростков. Также было установлено, что наиболее интенсивно каллусная ткань формировалась на среде, содержащей 2,4-Д в концентрации 1 мг/л. При изучении условий для индукции процесса морфогенеза нами определена оптимальная юз концентрация БАП 1 мг/л , при которой процент образования морфогенного каллуса на начальных этапах культивирования составил 95-100%. Полученные экспериментальные данные по выращиванию культуры льна-долгунца in vitro использовались при проведении селекции на устойчивость растений к кадмию. В процессе проведения селекции определена обратная зависимость прироста каллусной ткани от возрастающих показателей концентрации кадмия в субстрате и числа субкультивирований, что также позволило определить оптимальную концентрацию металла 15 мг/л для проведения дальнейшего селекционного процесса и, впоследствии, отобрать устойчивые каллусные клетки. Относительно более высоких концентраций (25 и 35 мг/л) следует отметить, что в данных условиях каллусная ткань некротизировалась и отмирала, в связи с этим, использование этих концентраций в дальнейших сериях эксперимента было нецелесообразным.

После проведения клеточной селекции нами были получены растения-регенеранты из отобранных каллусных клеток, устойчивых к воздействию кадмия. При этом было установлено, что процент образования адвентивных почек у исследуемых сортов невысокий как в стрессовых, так и в контрольных условиях (20%). В связи с этим нами были проведены работы по оптимизации состава питательной среды для культивирования морфогенных каллусных клеток с целью увеличения выхода растений-регенерантов. Было показано, что применение изучаемых веществ (аспарагин, кокосовая вода, гибереллиновая кислота, инно-зит, нитрат серебра) не оказывало существенного влияния на интенсивность образования адвентивных почек и формирование растений-регенерантов. Наряду с данными веществами было изучено влияние эпина, относящегося к группе брассиностероидов, на исследуемые показатели регенерации. Однако, применение эпина существенно не влияло на морфогенетическую активность по сравнению с другими веществами. Однако, при использовании концентрации анализируемого вещества 1 мг/л отмечалось некоторое стимулирование морфогенети-ческих процессов, особенно у сорта Спартак. При сопоставлении полученных данных по образованию адвентивных почек и выходу растений-регенерантов с

104 данными по применению БАП было отмечено, что БАП интенсивнее стимулировал морфогенез по сравнению с другими веществами.

Таким образом, в результате работы было изучено влияние соли кадмия на интактные растения льна-долгунца в условиях вегетационного, лабораторного опыта, а также разработана и проведена клеточная селекция льна-долгунца на устойчивость к соли кадмия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гончарук, Евгения Александровна, Москва

1. Акентьева Л.И., Беляева В.А.,Экологические проблемы интродукции растений на современном этапе: вопросы теории и практики//Материалы международной научной конференции, ч.1, Краснодар, 1993, 377 с.

2. Алексеев Ю.В., Биологическое качество растительной продукции в условиях интенсивного загрязнения/ЛПерспективы создания экологически чистых технологий возделывания сельскохозяйственных культур. JL: 1990, с. 53-54.

3. Алексеева-Попова Н.В. Устойчивость к тяжелым металлам дикорастущих видов. Ленинград, 1991, 213 с.с 5. Алексеенко В.А. и др., Цинк и кадмий в окружающей среде, М: Наука, 1992, 200 с.

4. Анталова С. и др., Исследование поведения кадмия в системе почва-растение в полевых экспериментах/ЛПоведение поллютантов в почвах и ландшафтах, Пущино, Институт почвоведения и фотосинтеза, 1990, с. 9096.

5. Бабанская Т.Н., Влияние меди и кадмия на агрохимические свойства почв, рост и продуктивность растений//Тез.докладов междунар. студ. конф. "Кризис почвенных ресурсов: причины и следствия", С-Пб, 1997, 155 с.

6. Бацелис К., Мутагенез в селекции льна-долгунца// Сельскохозяйственная наука, №2,1997.

7. Белецкий Ю.Д., Щербакова Л.Б., Янчич В.И. Улыраструктурные особенности тканей подсолнечника in у^о//Международн. конф. Биология культивируемых клеток и биотехнология, Новосибирск, 1988, 200 с.

8. Виленский В.Д., Миклишанский А.З., Химический состав снежного покрова Восточной Антарктиды, Геохимия, №11, 1976.

9. Гамзикова О.И., Барсукова B.C., Возможности регулирования устойчивости пшеницы к присутствию кадмия и никеля в среде//Совершенствование методологии агрохимических исследований, М: МГУ, 1997,416 с.

10. Гамзикова О.И., Барсукова B.C. К изучению генетического контроля устойчивости мягкой пшеницы к кадмию и никелю//Изогенные линии и генетические коллекции, Новосибирск, 1993,193 с.

11. Глазовская М.А., Геохимия природных и техногенных ландшафтов СССР, М.: Высшая школа, 1988, 328 с.

12. Головатый С.Е., Жигарев П.Ф., Решецкий Н.П., Оценка способов снижения поступления кадмия в растениеводческую продукцию/ЯТочвенные исследования и применение удобрений, вып. 23, Минск, 1995, 314 с.

13. Горешникова Е.В., Влияние свойств дерново-подзолистой почвы и известкования на поступление кадмия, цинка и свинца в растения, автореферат канд. дисс. М. 1995, 24 с.

14. Горшкова Т., Джибео Д., Ибрагимов М., Метаболизируемые полисахариды клеточных стенок в фотосинтетических pulse-chase-экспериментах с растениями льна//Физиология растений, т.43, №2, 1996, с. 180-185.

15. Горшкова Т.А., Метаболизм полисахаридов растительной клеточной стенки//Автореф. дис. на соиск уч. степ. д.б. н., М, 1996.

16. Джое Лети, Получение форм твердой пшеницы устойчивых к грибу Septoria nodorum в условиях in vitro//Автореф. дисс. на соиск уч. степ, канд. с-х. наук, М, 1998.

17. Добровольский В.В., Тяжелые металлы в окружающей среде, М.: МГУ, 1989,210 с.

18. Доронин С.В., Игитова Н.С., Повышение качества льняного волок-на//Почва, биология растений и агротехника их возделывания, тез. докл-ов научн. конф., Киров, 1997.

19. Ефремова Л.Л., Обухов А.И., Охрана и рекультивация почв, загрязненных тяжелыми металлами/ЛГяжелые металлы в окружающей среде и охрана природы, М.:МГУ, 1988, с. 179-182.

20. Жунусова К.Х., Фурсов В.И., Кондыбаева П.Б., Содержание свинца и кадмия в продуктах питания//Актуальные проблемы современной биологии, Алма-Ата, 1991, с. 77-79.

21. Жученко А.А., Лен в России и мировые тенденции его производст-ва//Сб.науч.тр.ВНИИЛ. Торжок, 1994, с.5-19.

22. Ильин В.Б., Кадмий в почве//Химизация сельского хозяйства. №9. 1991.

23. Ильин В.Б., Степанова М.Д., Защитные возможности системы почва-растение при загрязнении почвы тяжелыми металлами// Тяжелые металлы в окружающей среде, М.: МГУ, 1989, с. 80-84.

24. Кабата-Пендиас А., Пендиас X., Микроэлементы в почвах и растениях,1989, М.: Мир, с.166-180.

25. Казакова О.Н., Сячкова Н.С., Устойчивый сорт основа производства экологически чистой продукции льна-долгунца//Проблемы разработки региональной модели устойчивого развития, сб.докл-ов конф., Смоленск,1990.

26. Калашникова З.В., Накопление кобальта и кадмия в урожае некоторых сельскохозяйственных культур при облучении растений на почвах, загрязненных тяжелыми металлами//Агрохимия, №9,1991, с.77-82.

27. Каменова-Юхименко С., Георгиева В., Георгиева Н., Влияние поли-стимулина К на приобретение устойчивости к повышенному содержанию кадмия//Растениеводство, т.32, №3,1995, с.50.

28. Карапетьянц М.Х., Введение в теорию химических процессов, М.: Высшая школа, 1981, 334 с.

29. Кауричев И.С., Ноздрунова Е.М., О миграции и качественном составе воднорастворимого органического вещества в почвах лесолуговой зо-ны//Известия ТСХА. Почвоведение. Агрохимия, 1962, т.5, №48. С.91-106.

30. Кисели Д., Практическая микротехника и гистохимия, Будапешт, 1962, 396 с.

31. Кисс А. Сандр, Исследование аккумуляции кадмия в организме животных и растений, его токсичность и возможность снижения токсичноста с помощью антагонистов магния и цинка//Ншщапап Journal of animal production, vol.43, №1,1994, pp. 61-71.

32. Клейн P.M., Клейн Д.Н., Методы исследования растений, М., 1974, 527 с.

33. Комаров В.Л., Практический курс анатомии растений, М., 1941, 312 с.

34. Кошелева Л.Л., Физиология питания и продуктивность льна-долгунца, Минск, 1980,199с.

35. Кудрявцева Л.П., Совершенствование методики селекции льна-долгунца на устойчивость к антракнозу и полиспорозу// Автореф. дисс. на соиск уч. степ. канд. с-х. наук, М, 1993.

36. Кудрявцева Л.П., Устойчивость к антракнозу коллекционных образцов льна//Селекция, семеноводство, возделывание и первичная обработка льна-долгунца, сб.науч.трудов, вып.28-29, Торжок, 1994, с.63-65.

37. Кузнецов А.В., Методические указания по определению тяжелых металлов в почвах сельхозугодий и продукции растениеводства, Москва, 1992, 61 с.

38. Курчий Б.А., Мелышчук Ю.П., Инициация перекисного окисления ли-пидов клеточных мембран возможный молекулярный механизм действия ионов кадмия/УТез.Докл. II съезда всесоюзного общества физиологов, М., 1992. С.116

39. Ларионов Г.А., Миграция меди, кадмия, свинца в системе почва-растение-животное//Автореф. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук, 1997, 23 с.

40. Лукипудис Сл., Лен-долгунец как почвоочищающая земледельческая культура //Научные труды второй научно-практической конференции "Экологические проблемы сельского хозяйства", вып. XL, кн.2, 1992, с. 99-103.

41. Марченков А.Н., Районированные сорта льна-долгунца, Торжок, 1988, 27 с.

42. Минеев В.Г., Гомонова Н.Ф., Накопление тяжелых металлов в почве и поступление их в растения в длительном агрохимическом опы-те//Докл.РАСХН, вып. 6, 1993, с. 20-22.

43. Москалева Г.И., Куликова А.Е. Анатомическое исследование листа дикорастущих видов льна//Растениеводство, генетика и селекция технических культур, Ленинград, 1992, с. 65-73.

44. Мукосеев В.К., Микрофотографирование фотоувеличите-лем//Ботанический журнал, т.39, №5,1954, с.751-752.

45. Наумов Н.А., Козлов В.Е., Основы ботанической микротехники, М., 1954,312 с.

46. Нгуен Тхи Ли Ань, Повышение устойчивости яровой пшеницы к абиотическим стрессам методами биотехнологии//Автореф. дисс. на соиск уч. степ, канд.с-х. наук, М.: 1995,22 с.

47. Обухов А.И., Бабьева И.П., Гринь А.В., Зырин Н.Г., Научные основы разработки предельно допустимых концентраций тяжелых металлов в почвах// Тяжелые металлы в окружающей среде, М.: МГУ, 1989, 210 с.

48. Обухов А.И. Лепнева О.М., Охрана и рекультивация почв, загрязненных тяжелыми металлами//Тяжелые металлы в окружающей среде и охрана природы, М.: МГУ, 1988, с. 23-36.

49. Ордина Н.А., Структура лубоволокнистых растений и ее изменение в процессе переработки, Москва, 1978,127 с.

50. Орешкин В.Н., Кузьменкова B.C., Свинец и кадмий в современных и древних горизонтах тундровых почв//Тез. докл. Криопедология, Сыктывкар, 1997, с. 130.

51. Пашина Л.В., Генетический контроль признака содержания волокна в стебле льна-долгунца//Цитология и генетика, т.27, вып.З, 1993.

52. Петрунина B.C., Геохимическая экология растений в провинциях с избыточным содержанием микроэлементов//Тр.Биогеохимической лаборатории, т.XIII, М„ 1974, с. 57-72.

53. Пиунова В.В., Пинский Д.Л., Золотарева Б.Н., Ионообменная адсорбция кадмия, магния, свинца Са-формой гуминовой кислоты//Тяжелые металлы в окружающей среде, Материалы международного симпозиума 1518 октября, Пущино, 1996, 321 с.

54. Покровская С.Ф., Регулирование поведения свинца и кадмия в системе почва-растение:Обзорная информация, НИИМЭИагропром, М., 1995, 52 с.

55. Полонецкая Л.М., Бочук A.M., Регенерация побегов из различных экс-плантов льна-долгунца//У1 съезд белорусского общества генетиков и селекционеров. Горки, 1992.

56. Поляков А.В., Черкиова О.Ф., Влияние способа стерилизации питательной среды и регуляторов роста на морфогенез льна-долгунца в культуре ткани//Селекция, семеноводство, возделывание и первичная обработка льна-долгунца, Торжок, вып. 28-29,1994, с.131-134.

57. Праздников С.С., Способы рекультивации загрязненных тяжелыми металлами почв//Совершенствование методологии агрохимических исследований, М.: МГУ, 1997,416 с.

58. Проблемы экологического мониторинга и моделирование экосистем, С-Петербург: Гидрометеоиздат, 1992. 260 с.

59. Прозина М.Н., Ботаническая микротехника , М., 1960,206 с.

60. Рассадина В.Г., Клеточная инженерия для сортоулучшения картофе-ля//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, №4, 1994, с.22.

61. Савин В.А., Эффективность использования продуктов переработки льна-долгунца в рационе лактирующих коров//Автореф. диссертации, СПб, 1995.20 с.

62. Садовникова JI.K., Решетников С.И., Методические основы восстановления низкоплодородных почв, загрязненных тяжелыми металла-ми//Улучшение и использование малопродуктивных почв, Новочеркасск,1991, с. 103-117.

63. Сальников В.В., Агеева М.В., Юмашев В.Н., Лозовая В.В. Ультраструктурный анализ лубяных волокон//Физиология растений, т.40, №3,1992, с. 458-464.

64. Соколова Т.А., Лазарев А.В., Питрюк В.А., Куйбышева И.П., Пространственное варьирование минералогического и химического состава илистых фракций подзолистых почв//Почвоведение, 1990, № 7, с. 82-91.

65. Соколовский В.Г., Состояние природной среды, М.: Лесн. Пром-ть, 1990,176 с.

66. Соловьев А.Я., Льноводство, М.: Колос, 1978, 319 с.

67. Строганова М.Н., Скрябина О.И., Шоба В.Н. Структура почвенного покрова Центрально-лесного государственного заповедника.//Генезис и экология Центрального лесного государственного заповедника, М.: Наука, 1979, с. 54-86.

68. Таланов Г.А., Смирнов A.M., Антропогенные поллютанты, их ветери-нарно-санитарное и токсикологическое значение//Сельскохозяйственная биология, серия биология животных, вып.2, 1994.

69. Тихвинский С.Ф. Улучшение качества прядильного льна. Ленинград, 1978, 112 с.

70. Тяжелые металлы в окружающей среде и охрана природы, М.:МГУ, 1988.

71. Умаров М.М., Азиева Е.Е., Некоторые биохимические показатели загрязнения почв тяжелыми металлами.// Тяжелые металлы в окружающей среде, М.: МГУ, 1989, 210 с.

72. У эр Дж., Проблемы загрязнения окружающей среды и токсикологии, М.: Мир, 1993, 192 с.

73. Хотылева Л.В., Полонецкая Л.М., Корпусенко Л.И., Методика культуры тканей льна-долгунца in УЙго//Известия АН Беларуссии, серия биологичнских наук, №3, 1991, с. 24-26.

74. Цаплина М.А., Распределение тяжелых металлов в основных компонентах лугового биоценоза//Агрохимия, 1992, №9, с. 106-108.

75. Цаплина М.А., Трансформация и транспорт оксидов свинца, кадмия и цинка в дерново-подзолистой почвеШочвоведение, № 1,1994, с.45-50.

76. Шевелуха B.C., Развитие фундаментальных исследований в биологии и стратегия селекции растений//Селекция и семеноводство, №2, 1993.

77. Элиас В.В., Плеханова Н.О., Плеханов С.Е., Карташева Н.В. Тяжелые металлы в поверхностных водах Байкала// Проблемы экологии, т.2, Ново-сибирск:Наука, 1995,285 с.

78. Ягодин Б.А., Агрогеохимия и мониторинг состояния окружающей среды, Известия ТСХА, вып.5,1990г.

79. Ягодин Б.А., Решетникова Н.В., Али Мохамед Аль-Мосава, Влияние металлургических шлаков на прорастание семян и содержание тяжелых металлов в почве и растениях при длительном взаимодействии с почвой, Агрохимия, № 9,1994.

80. Alloway В., The accumulation of cadmium by vegetables grown on soils contaminated from a varity of sources//The science of the total environment, № 91. 1991, pp. 223-236.

81. Anke M. et al., Essentiality of fluorine molybdenum, vanadium, nickel, arsenic and cadmium//Acta Agronomica Hungarica 40, 1991, pp.210-213.

82. Barakat M.N., Cocking ^C., Regeneration of plants from linum protoplasts/ZPlant protoplasts and genet., Berlin, 1989, p. 160-172.

83. Bednarek W., Lipinski W., Cadmium and nikel in soil influenced by different mineral fertilization// Cadmium, nikel and lithium in natural environment, Warsaw, 1997, p.388.

84. Веке G.J., Graham D.P., Growth and chemical composition of flax cultivars on artifically salinized soil//Plant Scince, vol. 75, №1,1995, p.159-161.

85. Chamel A., Gambonnet В., Air pollution and ecosystems: Int.Symp., Grenoble, 18-22 May, 1988, 671-677.

86. Cointry E.L., Mroginskiy L.A., Picardi L.A., Influence of different growth regulators concentrations on Linum Usitatissimum shoots formation//Agri Scientia, vol.10,1993.

87. Deischen Т., Untersuchungen zur Schwermetallverfugharkeit in Klarschlammgedungen Boden und im Gefassversuch, Bonn, 1989, 162 s.

88. Deischen Т., Durch Bodenberdecking Sanierung schwermetallbelasteter Garten//Wasser+Boden, Bd.46, № 12,1994, s.19-23.

89. Der Knoterich "frisst" auch Schwermetalle//Taspo, №5,1989,8 s.-109 Ebbs S.D., Lasat M.M., Cornish J., Gordon R., Phytoextraction of cadmium and zinc from a contaminated soil//Agricultural research service, U.S.Plant, soil &nutrl, 1997.

90. El-Enany A.E., Allevaiation of cadmium toxicity on maiz seedlings by calcium//Biologia Plantarum, 37 (1), 1995, p. 93-99.

91. Eriksson J.E., The influenceof pH, soil tipe and time on absorbtion and uptake by plants of Cd added tothe soil//Water, air and soil pollution, 1989, vol.48, №3-4,p. 317-335. '

92. Franken S., Heyland K., Bildanalyse als methode zur differenzierung der faserqualitat von lein (Linum usitatissimum L.) an Stengelquerschnitten und118deren bedeutung fur die Zuchtung// Konressband Gottingen, №38,1994, p. 501504.

93. Freidt W., Nichterlein K., Nickuel M., Biotehnology in breeding of flax (Linum usitatissimum): the present status and future prospects//FLAX: Breed and Utis: Proc.EEC Flax Workshop., Brussels, 4-5 Vay, 1988, p. 5-13.

94. Gaudchau, Michael; Schneider, Martin; Investigation of heavy metall accumulation in various medicinal plants and linseed// International symposium-fcybreeding research on medicinal and aromauc plants, 1996,433 p.

95. Glinski J., Turski R., Heavy metal pollution of polish soil//New enviromental aspects of land use in Poland and Hungary, 1993, №400, p. 1-5.

96. Hardiman R.T., Yacoby В., Absorption and translocation of Cd in bush beans/ZPhysiologia plantarum, vol. 61, №4,1987, pp. 670-674.

97. Hatch D.J. The effect of pH on the uptake of cadmium by four plants species grown in flowing solution culture//Plant and soil, vol.105, №1, 1988, pp. 121126.

98. Helal H.M., Rietz E., Sauerbeck D., Aufhahme und Verlagerung von Schwermetallen in Leinpflanzen// Konressband Gottingen, 1991, p. 757-760.

99. Hitoshi Obata, Noriyki Inoue, Kunio Imai and Masano Umebayashi, Cadmium tolerance of calli induced from roots of plants with differences in cadmium tolerance//Soil Sci. Plant Nutr., vol. 40, №2,1994, p. 351-354.

100. Ivanka G. Dimitrova, Dafiia I. Ninova, Histological changes in leaves of herbaceous plants in response to emissions of metallurgical industry/ZBotanique, T.85,1994, pp.137-145.

101. Jackson P.J. et al., Poly (gamma-glutamilcysteinyl) glycin: its role in cadmium resistance in plant cells/ZProc. Nat. Acad.Sci.USA, vol. 84, №11, 1987, p. 6619-6623.

102. Jianjun Chen, Peter B.Goldsbrough. Increased Activity of Glutamylcysteine Synthetase in Tomato Cells Selected for Cadmium Tolerance/ZPlant Physiol, 1994, vol.106, №1, p.233-239.(23)

103. Joshi K.K. Embryogenesis in endosperm, stem and leaf calli of Linum austriacum// Embryology and seed reproduction, XI Int. Symp., Leningrad, 1990, p.67.

104. Khater A., Abou Seeda M., Soliman S., Cadmimn application on bean plant// Agrochimica, vol. 35, № 5-6, p. 434-442.

105. Leita L., Baca Garcia M.T., Gd uptake by Pisum Sativum//Agrochimica, vol.36, № 3, 1992.

106. M.A.A.Gadallah, Effect of Cd and kinetin on chlorophyll content, sacharides and dry matter accumulation in sunflower plants// Biological plantarum, 37 (2), 1995, 233-240.

107. Ma Mi, Tsang Wing Keung, Kwan К M Frances, Preliminary studies of the identification and expression of metallothionein-like gene in Festuca Rubra//Acta Botanica Sinica, vol.30, № 11, p. 1078-1081.

108. Maroti M., Bognar J., Effect of toxic metals inhibiting the growth of plant callus tissues//Acta Agronomica Hungarica, vol. 40, №1-2,1991, p. 39-47.

109. Marshall G., Courduries P., A seedling bioassy^ for screening putative fusarium oxysporum F.SP. lini resistant somaclonal lines of linseed//Natural fibres, vol. 38,1994, p.27-28.

110. Marshall G., Field analysis of variation in somaclones of fibre flax (Linum Usitatissimum L.)//Natural Fibres, vol.37,1994, p.9-15.

111. Meharg A.A. The role of the plasmalemma in metal tolerance in angiosperms//Physiol.Plant.88,1993, р.191-198.(22).

112. Meharg A.A., Integrated tolerance mechanisms: constitutive and adaptive plant responses to elevated metal concentrations in the environment/ZPlant, cell and environment, vol.17, №9, p. 989-993.

113. Mengel K., Kirkby E.A, Principles of plant nutrition, Switzerland, 1987, 687 P

114. Mersik S., Kubik I., Chelating of heavy metals by the humus acids and influence of peat on the uptake of Zn, Pb, and Cd by plants// Int.conf., vol.422, Warsaw, 1995, pp. 19-31.

115. Metz R., Wilke B.M., Einfluss der Bodenbelastung von Rieseifeldern auf Wachstum, Ertrag und Scnwermetallentzug von Mais//Wiss. Zeltschrifl der Humboldt Universitat zu Berlin, R.Agrarwissenschaflen, Bd.41, №3,1992.

116. Naiki N., Yamagata Sh., Isolation and some properties of copper-binding proteins found in copper-resistant strain of yeast/ZPlant a. Cell Physiol., vol. 17, № 6, 1976, p. 1281-1295.

117. Priem Bernard, Morvan Henri, Influence of different concentrations xylomannoside on Linum Usitatissimum shoots//C.r.Acad. sci, ser.3, №11, 1990, p.411-416.

118. Qi Bin He, Bal Ram Singh, Plant availability of Cd in soils// Acta Agric. Scand, Sect. В., Soil and Plant Sci, 1993, vol.43, p. 134-141.

119. Reese R.N., Wagner G.J., Effects of buthionine sulfoximine on Cd-binding peptide levels in suspension-cultured tobacco cells treated with Cd, Zn or Cu//Plant Physiol, vol.84, №3,1987, p.574, 577.

120. Sawert A., Weigel H.I., Jager H.J.,Aufnahme und organspezifische Vertellung von Cadmium bei Solanaccan//Angewandte Botanik, Bd. 61, H.5/6, s. 439-451.

121. Scheller H.V. et al. Phytochelatin synthesis and glutathione levels in response to heavy metals in tomato celMPlant Physiol., vol.85, №4,1987, p.1031-1935.

122. Schubert S., Untersuchungen zur Aufiiahme und Verlagerung von Cadmium in Diatlein (linum usitatissimum L.)//Konressband Gottingen, №35, 1992, p. 527-530.

123. Shalaby A.M., Al-Wakeel S.A.M.|Biologia plantarum, 37 (1), 1995, p. 101106

124. Sharma G.K., Heavy metals environment: Int.Conf., Athens, Sept, vol.1, 1985,610-611.

125. Technology of obtaining good quality flax fibre//Natural fibres, vol. 38, 1994, p. 47-49.

126. Tejklova E., Long-term in vitro shoot-tip culture and plant regeneration in flax//Rostlinna vyroba, vol.38, №12,1992, p. 1022.

127. Teruo Asami, Soil pollution by metals in Japan//Transaction of the XII Congress Inter.Soc.Soil Sci., vol. 2,1986, p.222-223.

128. Usha Keshan and S.Mukheiji, Effect of cadmium toxicity on chlorophyll content, Hill activity and chlorophyllase activity in Vigna radiata L.Leaves// Plant Physiologi, vol.35, № 3,1992, pp.225-230.

129. Yin-Ming Li, Rufus L.chaney, Albert A.Schneiter, Screening for low grain cadmium phenotypes in sunflower, durum wheat and flax//Euphytica, vol.94, 1997, p.23-30.

130. Zhan Xiang-can, Jones David A., Kerr Allen, Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes//Plant Mol. Biol., №5, 1988, p. 551559.

Информация о работе

Гончарук, Евгения Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.23

Диссертация

Влияние кадмия на морфогенез, анатомию стебля и процесс регенерации льна-долгунца из клеточных и тканевых культур in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы