Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МЕТАБОЛИЗМ ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОГО ГАЛАКТАНА И РАЗВИТИЕ ФЛОЭМНЫХ ВОЛОКОН ЛЬНА

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "МЕТАБОЛИЗМ ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОГО ГАЛАКТАНА И РАЗВИТИЕ ФЛОЭМНЫХ ВОЛОКОН ЛЬНА"

//- ЪлЯИ

На правах рукописи

ПАВЛЕНЧЕВА НАТАЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

Метаболизм тканеспецифичного галактана и развитие флоэмных волокон льна

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2004

Работа выполнена в лаборатории механизмов роста растительных клеток Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, ТА. Горшкова

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор В.Б. Иванов (ИФР РАН, Москва)

доктор биологический наук, профессор В.И. Чиков (КИББ КазНЦ РАН, Казань)

Всероссийский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт льна РАСХН (г.Торжок)

Зашита состоится "¡^¿¿уЁ?^2004 г. п-г^ час. «а заседании диссертационного совета К 002.00S.0t по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии н биофизики КНЦ РАН (420111, г. Казань, а/я 30, ул. Лобачевского, 2/31).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной! библиотеке Казанского научно! • центра РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Б, Иванова

ВВЕДЕНИЕ

Постановка проблемы и ее актуальность. Дифференциация клетки и формирование специализированных тканей - основополагающий процесс индивидуального развитая организма. В высших растениях к числу высокоспештизированных клеток принадлежат склере]кимные волокна, которые присутствуют в различных органах растения и, в частности, обеспечивают прочность стебая. К ним относятся флоэмные волокна, которые составляют основу урожая технических волокнистых культур, таких как лен и конопля,' Отличительной особенностью склеренхимных волокон являются толстые клеточные стенки и необычная длина индивидуальных клеток, достигающая нескольких сантиметров. Развитие этих уникальных клеток - интригующий процесс, важнейшим этапом в характеристике которого является выявление отдельных стадий, их временная и пространственная локализация. Без них невозможны ни понимание хода морфогенеза, ни изучение биохимических процессов, с помощью которых он реализуется. С другой стороны, ' особый интерес представляет выявление и изучение тканеспенифичных процессов.

В стебле льна существует так называемая точка слома (Gonhkova et al., 1996; Salnikov et al., 1998), где волокнистая часть стебля резко меняет свои механические свойства, становясь более прочной. Считается, что склеренхимные волокна формируются путем длительного апикального роста, совмещенного с отложением вторичной клеточной стенки в срединной части клетки (Эзау, 1980; Fahn, 1990), что не объясняет скачкообразного изменения механическихсвойств. Отмеченное противоречие побудило нас пересмотреть представления о характере формирования волокон склеренхимы.

Растения льна содержат достаточно редкий полисахарид клеточной стенки, который является тканеспецифичным полимером и присутствует только в клетках флоэмных ват окон (Gorshkova et al., 1996; Gorshkova et al,, 2003). Этот полимер - р-1,4-гал актам, который является высокомолекулярным соединением (степень полимеризации сравнима с таковой у целлюлозы), но растворяется в воде и достаточно легко выделяется с помощью гель-фильтрации. Это отличает его от большинства других полисахаридов матрикса клеточной стенки, которые обычно находятся в сложном взаимодействии друг с другом и с целлюлозными микрофибриллами, так что полностью извлечь какой-то один 1И них, не нарушая: его структуры, крайне сложно, Тканеспшифичность и доступность для выделения (^1,4-галакта^-с1ебл*-тнтТ1^ело^шляет ревкую возможность исследования

I фонд

иа интактныч растениях метаболизма индивидуального полимера неточной стенки и его сопряженности со стадиями формирования клетки.

Цель и зал а ни исследования, Целью представляемой работы являлась характеристика метаболизма тканеспецифичного галактана и его связи с развитием флоэмных волокон льна. Били поставлены следующие задачи:

1) Оценить содержание галактана в различных участках стебля и на различных стадиях развития растений льна.

2) Изучить метаболизм тканеспецифичного галактана в экспериментах с экзогенным меченым субстратом - |4С01.

3) Охарактеризовать локализацию в стебле и продолжительность отдельных стадий развития льняного волокна.

Научная новизна работы. Впервые обнаружено, что интрузивный рост флоэмных волокон льна ограничен во времени до 3-5 дней (скорость удлинения клетки составляет примерно 1 см в сутки), что заставляет пересмотреть существовавшие представления о формировании волокон склеренхимы. Установлено, что точка слома на стебле льна является индикатором, разграничивающим отдельные стадии развития флоэмных волокон: удлинение первичных флоэмных волокон происходит только на участке стебля выше точки слома, ниже ее клеточная стенка лишь утолщается.

Впервые обнаружено, что буферрастворимый р-1,4-галактан отсутствует в ходе удлинения волокон и появляется только после завершения интрузивного роста на стадии утолщения клеточной стенки, то есть представляет собой редкий полисахарид клеточной стенки, синтезируемый только на определенной стадии развития клетки. Показано, что тканеспеиифичный галаетан подвергается постсинтетической модификации. Оценено время его полужизни в системе интактного растения.

Практическая ценность работы. Охарактеризован легко идентифицируемыП индикатор (точка слома) окончания интрузивного роста флоэмных волокон и начала синтеза тканеспецифичного полимера клеточной стенки. Наличие такого индикатора делает растения льна удобной моделью для функциональной геномики формирования растительного волокна, изучения механизмов формирования полисахаридов клеточной стенки и роста растительных клеток.

Выявление существенных сортовых различий в содержании и распределении молекулярной массы тканеспецифичного галактана флоэмных волокон льна позволяет

приступить к разработке новых генетических маркеров для использования в селекции льна-долгунца. Показано, что воздействие неблагоприятного фактора в период быстрого роста растений льна приводит к невосполнимым впоследствии потерям качества урожая, связанным с неоднородностью длины волокон в различных участках стебля.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на IX международной конференции по клеточной стенке (Тулуза, Франция, 2001). на хонференмш по расплельным биополимерам (Нант, францня, 2001).Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), V съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2005) и на итоговых конференциях и семинарах КИББ КазНЦ РАН (2001,2002,2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объем диссертация. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список цитируемой Л1гтературы) и состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка .иггературы. В работе представлено 7 таблиц и 27 рисунков. Список литературы включает 165 источников, в том числе 34 - отечественных.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.1. Объектом исследований служили растения льна - долгунца (¿¡пит изХасжтит I,.) сорта Новоторжский, В некоторых экспериментах использовали и другие сорта из коллекции ВШШльна (Торжок), отличающиеся по качеству волокна (Славный, Псковский кряж, Светоч, Колхидский стелющийся). Растения выращивали в условиях вегетационного опыта в ящиках со слоем почвы 50 см на открытом воздухе при естественном освещении и ежедневном поливе. В экспериментах по влиянию почвенной засухи на удлинение волокон растения выращивали в сосудах Мнтчерлиха при влажности почвы 70% от ее полной влзгоемкости. Почвенную засуху создавали путем прекращения полива и доведения влажности почвы до 40% от ее полной влагоемкости. Основная часть экспериментов была выполнена на растениях, находившихся на стадии быстрого роста. Положение точки слома на стебле льна определяли вручную в 20 повторностях; выше этой точки стебель льна легко рвется, в то время как ниже нее с трудом поддается разрыву.

1.2. Выделение клеточной стенки it буферрасгворимых полимеров

Для биохимического анализа фиксировали различные участки стебля растения в соответствии со схемами, приведенными при изложении результатов. Ниже точки слома стебель делили на внутреннюю (ксилемнуго) и внешнюю (волокнистую) части. Для анализов образцов использовали внешнюю часть, содержащую волокна. Образцы для биохимического анализа фиксировали жидким азотом. Эксперименты проводили в 3-6 кратной повторности.

Дтя выделения клеточных стенок и буферрасгворимых полимеров материал (1501 ООО мг сырой массы) гомогенизировали в 10 мл 50 мМ К-фосфатного буфера, рН 7, Гомогенат центрифугировали в течение 10 минут при 10 000g. Содержащиеся в сунернатанте буферрастворимые полимеры осаждали этанолом (конечная концентрация 80%), промывали и высушивали. Из осадка, оставшегося после получения буферрасгворимых полимеров, выделяли клеточную стенку по методике Талмалж (Talmadge et al., 1973). Доя удаления крахмала осадок в течение ночи обрабатывали глюкоамилазоИ (Sigma, USA), Тест на наличие крахмала с использованием Kl - h давал на полученной клеточной стенке отрицательные результаты. Полисахариды матрикса клеточной стенки удаляли кипячением осадка в уксусно-азотном реактиве (смесь азотной и ледяной уксусной кислот в соотношении 1:10) в течении 1 часа. Оставшийся при этом осадок представлял собой целлюлозу (Updegraff, 1969),

1.3. Гель - хроматография буферрасгворимых полимеров

Для анализа буферрасгворимых полимеров использовали хроматографические системы с колонками, позволяющими разделить полисахариды в диапозонс масс от 5 000 ло 5 000 000: 1) HPLC система (UK6 инжектор и 510 HPLC насос, Waters, Mil ford, USA) с преколоикой (7,8x300 мм; Ultrahydrogel 500, Waters) и последовательно соединенными колонками (Ultrahydrogel 2000 и Ultrahydrogel 500, Waters). Элюцию проводили ацетатным буфером 0,4 M (рН 3,0) со скоростью 0,8 мл/мин. В качестве детектора был использован дифференциальный рефрактометр (Pharmacia, Uppsala, Sweden); 2) FPLC система (Pharmacia LKB P500) с колонкой (15x500 мм; Superosa б, Pharmacia). Элюцию проводили ацетатным буфером 0,1 M ( рН 4,5) со скоростью 0,5 мл/мин. В качестве детектора был использован дифференциальный рефрактометр LKB 2142, Объем отбираемых фракций - 1 мл; 3) HPLC система (HPLC насос, Gilson 302, France) с колонкой (12x400 мм; Sepharose 4В, Pharmacia). Элюцию проводили ацетатным буфером 0,01 M (рН 4,5) со скоростью 0,25

мл'мин. В качестве детектора был использован дифференциальный рефрактометр Knauer (Germany). Объем отбираемых фракций - 1 мл.

Для анализа содержания Сахаров использовали фенольный метод Дюбуа (Dubois et al, 1956). Моносахарида ый состав определяли с помощью системы Dionex (Dionex, Sunnyvale, USA) с амперо метрическим детектором. В качестве элюента использовали 15 мМ NaOH, 20 мин.

1.4. Эксперименты по изучению метаболизма галактана с "СО]

Для введения MCOi в растения использовали замкнутую фотосинтетнческ> ю систему, состоящую из фотоси нтетической камеры, газгольдера, компрессора и поглотителя СО} Общий объем системы составлял 90 литров. Внесение 370 МБк NaHuCOj не приводило к существенному отклонению концентрации СОг от естественной. Эксперименты проводили на интгктных растениях льна, которые неликом помещали в фогосшпетическую камеру. Время экспозиции растений с "COi (40 минут) выбирали с учетом необходимости попадания метки в метаболические пулы анализируемых тканей растения. Количество растений, помещенных в фотостггетическую камеру, рассчитывали таким образом, чтобы убыль радиоактивности за время экспозиции не превышала 30%. Опыты проводили в 10 часов утра при естественном освещении в безоблачный день. Температура в фотосинтетнческой камере составляла 2б°С. Часть растений фиксировали сразу после их экспозиции с мСОг, остальные - через 8 часов, 1 сутки и 5 суток роста растений в естественных условиях, Пробы, отобранные с каждого растения, обрабатывали огдельно. Количество биологических повторностей в опыте — 3.

После выделения и фракционирования буферрастворимых полимеров и клеточной стенки по описанным выше, методикам радиоактивность полученных фракций просчитывали на жидкостно-сцинтидляшюнном радиометре "DeIta-300" фирмы "Tracer Analytic" (США).

1.5. Приготовление гистологических срезов

Для приготъАзения гистологических срезов отрезки стебля длиной Змм фиксировали в течение 24 часов в фиксаторе Чемберлена, промывали 80% этанолом и помещали в 70% энная. Зафиксированный и обезвоженный материал заливали'в парафиновые блоки по методике З.П. Паушевой (Паушева; 1970). Срезы готовили на салазочном микротоме и наклеивали на предметные стекла. Затем парафин удаляли и окрашивали срезы по методу Гендешайна (Паушева, 1970), заключали в канадский бальзам и анализировали с помощью

светового микроскопа (МБИ-3, при увеличении 80). Количество биологических новторностей - 10, аналитических - 15.

Все полученные результаты обработаны статистически по общепринятой методике (Лэкин, 1980), средине квадратичные отклонения приведены в таблицах.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Положений точки слома на стебле растении в онтогенезе Первым этапом наших исследований было выяснение положения точки слома на стебле растения в онтогенезе. Оказалось, что точка слома обнаруживается только на определенных стадиях жизни растения, В ранний период развития растений льна, в фазы всходов и елочки (примерно три недели после прорастания), ее не идентифицировали. При наступлении периода быстрого роста точку слома легко выявляли с точностью до нескольких миллиметров (рис. 1).

В ходе развития растения точка слома перемещается вверх по стеблю. Когда растение начинает цвести (примерно семь недель после прорастания), рост стебля заканчивается; в дальнейшем увеличение высоты растения достигается только за счет роста метелок. В этот период точка слома исчезала (рис. 1). Расстояние от верхушки стебля ло точки слома варьировало в ходе развития растения в нескольких экспериментах с различными сортами льна между 45 и 90 мм. Обычно, чем быстрее растет растение, тем больше это расстояние.

170 " 1»0 ' ■ 100

во

Iго

I в°

3 50 ■ М"

30 ■■ го ■■

ю . • о

V

\\ \ 1.1

1*0

В Ю 15 20 23 Ж Э5 40 45 50 95 60 63 70 75 во ВВ ВО

суики

Рисунок 1. Кривая роста льна-долгунца и положение точки слома (-) на стебле. Фазы к периоды развития льна-долгунца (дни после посева): всходы (5-10), елочка (10-25), быстрый рост (25-45), бутонизация (45-55), цветение (55-65), созреванне ( зеленая, ранняя желтая, желтая, полная спелости) (65-90),

2.2. Гель-проникаюшая хроматография буферра створим ых полимеров стебля льна на различных стали ян развитая растения

Определял» наличие тканеснецнфичного галактана в учасгках стебля выше и ниже точки слома, зафиксированных на разных стадиях роста растений (ркс.2). Для этого методом гсль-проникаюшей хроматографии анализировали профили элюции буферрастворимых полимеров, осажденных 8044 этанолом. При построении схемы эксперимента основывались на следующих соображениях. Лен, ках и другие двудольные растения, растет в высоту апикальной меристемой. Но, в отличие от многих других растений, флоэмные волокна формируются в нем только из прстофлоэмы, то есть являются первичными (камбий, хотя и активен, но флоэмныс волокна в результате его деятельности не возникают) (Esau, 1943, Эсау, 1969). Следовательно, отслеживая участок стебля на одной и той же высоте в ходе развития растения, можно анализировать последовательные стадии формирования волокон. В качестве ориентира при проведении опыта брали положение точки слома на стебле.

Детально охарактеризуем проведение эксперимента (рис. 2), поскольку в последующих опытах использовали аналогичные подходы. В начале эксперимента находили точку слома,, измеряли расстояние до нее от семядолей (в данном случае оно составляло 18,5 см) (рис. 26), а также длину участка выше точки слома (рис 2а).

Рисунок 2. Схема огбора образцов для анализа буферрастворимых полимеров стебля на различных стадиях развития растений льна, длина (см) зафиксированных участков и выход клеточной стенки (мг/см).4 - участки, в которых анализировали волокнистую (наружную) часть стебля. • -точка слома, КС - клеточная стенка.

см мг КС'см 46,6 1.»

начат

ЭКСПрНМЕИП

Чф«э II тут*«

ч^р п 2Q ty~rv к

Через 10 суток фиксировали участок длиной 18,5 см от семядолей (рис. 2д), часть стебля до новой точки слома (17 см) (рис, 2г) и участок выше новой точки слома (рис. 2в). Следующую фиксацию (через 20 суток после начала эксперимента) проводили после исчезновения точки слома, когда растения вступали в фазу цветения. Фиксировали участок стебля длиной 18,5 см (рис. 2ж) и выросшую часть стебля {рис. 2е). Последнюю фиксацию проводили через 2 месяца после начала опыта. На этой стадии фиксировали весь стебель целиком, поскольку предварительные эксперименты показали отсутствие буферрастворимого тканеспецифичного галактана у зрелых растений. Из всех зафиксированных участков стебля выделяли буферрастворимые полимеры. Для сопоставления хроматограмм образцов из участков, имевших различную длину, рассчитывали объем пробы буферрастворимых полимеров, приходившийся на единицу длины. Таким образом, хроматограммы для всех участков стебля, зафиксированных в одном опыте, сопоставимы между собой. Стебель льна ниже точки слома легко разделяется на наружную и внутреннюю части (СгогеЬкоуа ег а). 1996), Разделение происходит по поверхности пучков флозмных волокон, которые практически полностью оказываются в наружной части. Подобное разделение не влияет на характеристики высокомолекулярного буферрастворимого галактана, поскольку этот полимер является тканеспеиифичным (ОотзЬкоуа ег а1., 1996; Оог51икоча е1 а1., 2003), однако уменьшает массу проб, облегчая работу с ними. Содержание клеточной стенки у зафиксированных образное хорошо иллюстрирует ход формирования волокна: в молодых растениях на участке ниже точки слома оно составляло 0,5 мг/см, а в зрелом растении достигало 1,9 мгУсм (рис 2).

На рисунке 3 приведены примеры профилей элюции образцов, взятых выше (а) и ниже (б) точки слома. Хроматограмма буферрастворимых полимеров стебля льна состоит

гшштм АГ «редок)

Ч В. 0 & 1 * * * : : : ; : /»¡Ч» ' ! "у/ ' " |<}И9ЯЦС)ЦЙ ! | ■ » 1 ■

о

11 1» и ^О £ ■ржяулфжашп (шин) 1

Рисунок 3, Профили элюции буферрастворимых

полимеров на колонках 1Л1гаЬуёго§е| 2 000 - ШиаЬуЛч^е! 500 из участков стебля льна выше (а) и ниже (б) точки слома АГ (белок) - арабиногалактановый белок.

и

из двух частей (рис, 3). Соответствующая низкомолекулярной массе часть представлена арабиногалактановым белком (рис, 3, пик 1 и 3), который не является тканеспеиифичным (ОогеЬкоуа « а!., I996). Тканеспецифичный гзлактан элюирует первым (рис. 3, иик 2), в области, характерной для полимеров с массой 2 ООО ООО Да (СогзМсота е( а!.. 1996). Монос» аридный состав полисахаридов {пики 1, 2, 3) (табл. 1) соответствовал тканеспецифичному галактану (пик 2) и арабиногалактановому белку (пики 1 и 3) (СогеЬкоуа е1 а!., 1996). На хром ато граммах образцов, взятых выше точки слома (рис. 2 а, в), пик высокомолекулярного галактана отсутствовал (рис, 3 а), независимо от высоты растения в момент фиксации. В образцах, отобранных ниже точки слома (рис. 2 б, г, д), тканеспецифичный галакган всегда присутствовал.

В фазе цветения (рис, 2 с, ж), уже после исчезновения точки слома, анализируемый полимер присутствовал во всех участках стебля, хотя и в разных количествах, а в зрелых растениях (рис. 2 з) полностью исчезал из буферрастворимой фракции (данные не приведены). Таким образом, тканеспецифичный галакган подвержен постсинтетической модификации и/или гидролизу. К аналогичному'выводу' привели и специальные

Таблица 1. Состав нейтральных моносахаридов (моль%) во фракциях буферрастворимых полимеров стебля льна (обозначения на рис. 3).

Участок Пик Рамноза Лрабиноза Галактоза Глюкоза

Выше ТС 1 t Стелы 32.2±0,1 67.8±0.2 Следы

Ниже ТС 2 б,8±2,4 1 3,0±0,9 84,1 ±4,1 б,2±2,4

3 2,5±1,2 1 24,6±2,1 72.4±0.6 0.3±0

......

t (Кем

«ре «ре черв шперннготя Исут«* Л>*утм 60 суток

14

16

18

20

22

24

Рисунок 4, Анализ буферрастворимых полимеров в ходе развития растений льна, Л -схема отбора образцов, Б - профили элюции буферрастворимых- полимеров на колонках Superóse 6; • - точка слома.

>кснериме|ггы, в которых были проанализированы 10-сантиметровые участки стебля, отобранные в процессе развития растений (рис, 4). Полученные хроматограммы хорошо иллюстрируют постепенное снижение количества галактана, приводящее к его отсутствию в зрелых растениях,

2Д. Л нал »1 буф ерра створ н мых полимеров из участков стебля, находящихся вСлнт точки слома

Для более полной характеристики инициации синтеза галактана были зафиксированы отрезки стебля длиной 1 см в районе точки слома. Два отрезка были взяты над точкой слома, три - непосредственно после и один - в нижней части стебля (5 см от семядолей) (рис. 5).

Рисунок 5, Анализ буферрастворнмых полимеров сантиметровых участков вокруг точки слома.

А - схема отбора образцов, Б - профили элюцни буфер-растворимых полимеров на колонках ТЛКаЬу&озе! 2000 -и!1гаЬу^^1500; * - точка слома,

АГ(белок) - зрабиногалактано-вый белок.

На хроматограммах образцов, взятых выше точки слома, как и в предыдущих экспериментах, пика галактана не обнаруживали. Появление его происходило непосредственно под точкой слома (рис, 5). В образцах, зафиксированных на сантиметр ниже точки слома (отрезок 4), пиктканеспеиифичного галактана уже хорошо выражен.

Таким образом, результата всех вышеприведенных экспериментов говорят о том, что: 1) буферрастворимый тканеспецифичный высокомолекулярный 1 галакгак обнаруживается не на всем протяжении развития волокон: он отсутствует выше точки слома и совпадает по времени возникновения с возрастанием механической прочности волокнистой части стебля; 2) тканеспецифичный галактан претерпевает постсинтетические

изменения, которые приводят к тому, что в зрелых волокнах он отсутствует в буферрастворнмой фракции; 3) точка слома - легко обнаруживаемый индикатор начала синтеза тканеспецнфичного галактана,

2.4. Характеристика тканеспеинфичного галактана различных сортов льна Буферрастворимые полимеры проанализировали в растениях пяти различных сортов льна из коллекции ВИИИльна (г. Торжок), отличающихся по качеству волокна. Корректное сравнение различных сортов между собой затруднено тем, что они могут отличаться, например, по высоте растений и скорости созревания. Отдавая себе в эгом отчет, мы, тем не менее, сопоставили участки одинаковой длины в нижней (20 см вверх от семядолей) части стебля растений в период быстрого роста (рис. б). Содержание клеточной стенки в образцах различных селекционных сортов было схожим, за исключением сорта Псковский, у которого оно было существенно ниже. Ни в одном из проанализированных участков стебля выше точки слома, ни у одного из проанализированных сортов высокомолекулярный галактан обнаружен не был.

ем ыг КС/см

г КС/см

¿4,1

5,4

оч тяг КС/<я

_______И.Я

-------я»т

од«

СК . «Г КС/М 4Л'

_______ИЛ-

О.ТЗ

да нт КОЧ-*1

------НЛ>

0,81

20см

Нйвпгфрмтй К^ипдошй

Рисунок 6, Схема отбора образцов* для анализа буферрастворимых полимеров стебля различных сортов льна, длина стебля (см) и выход клеточной стенки (мг/см); • • точка слома, КС - клеточная стенка, * - анализировали волокнистую (наружную) часть стебля.

В образцах, отобранных ниже точки слома, профили элюции (рис. 7) существенно отличались даже у сортов, имевших сходную высоту растения (Псковский и Новоторжский), а также у сортов, близких по выходу клеточной стенки (Новоторжский, Колхидский, Светоч, Славный) (рис, 6.) Во * можно, содержание и распределение

молекулярной массы тканеспецифичного галактана являются важной детерминантов качества волокна, так как содержание других полисахаридов варьирует у различных сортов значительно менее существен но (Горшкова и др., 1996).

Рисунок 7. Профили элкшин буферрасгворимых полимеров

различных сортов льна на колонках икгаЬуйп^е) 2000 - иИта)1у(1го£е1 500-, АГ(белок) — арабиногалактановый белок.

2.5. Оценка содержания галактана

Поскольку галактан является компонентом клеточной стенки, претерпевающим постсиитетическне изменения в ходе развития волокна, определение его содержания является непростой задачей. Данные по содержанию галактана у растений, находящихся на стадии быстрого роста, приведены в таблице 2. Для оценки содержания галактана использовали два подхода*. 1) опенка содержания галактана после разделетм буферрасгворимых полимеров на колонке Sepharose 4В и анализ Сахаров по методу Дюбуа (Dubois et al., 1956); 2) оценка содержания галактана путем определения содержания моносахаридов в буферрастворимой фракции.

2.6. Изучение метаболизма высокомолекулярного галактана в экспериментах с иСОг

Выявление постсинтетических изменений тканеспецифичного галактана поставило вопрос об их динамике. Интенсивность постсинтетических модификаций полисахаридов клеточной стенки крайне редко оценивалась в системе интактного растения. Классическим подходом для решения таких задач служит анализ перераспределения метки после введения экзогенного меченого субстрата, Тканеспецифичносгь буферрастворимого р-1,4-

Таблица 2. Оценка содержания тканеспецифичного галактана а стебле льнл но профилю элюиии и моносахарндному составу.

Параметр По профилю -»люшщ По моносахарклному составу

1 Новоторжски й * Новогоржскнй" Светоч**

Сухая масса участка стебля (мг) 310 _ _

Сухая масса волокнистой части стебля (мг) 44 27 23

Сухая масса клеточной стенки волокнистой! ^ части стебля (мг) \ 17 16

Сухая масса буферрастворимых полимеров волокнистой части стебля (мг) 7,8 5,7 4,7

Сухая масса ткалеснецифнчиото галактана Гмг! 0.3 0.3 0,1

Доля тканеспецифичного галактана ог мае«* - -буферрастворимых потимеров (%) 1 5.7 2,5

Доля тканеспецифичного галактана от массы клеточной стенки 1,1 1,9 0,7

Доля тканеспецифичного галактана от массы волокнистой части стебля (%) 0,7 1.2 0,5

Доля тканеспеннфячного галактана от массы участка стебля (Чо) 0,1 - -

Примечание: - среднеквадратичное отклонение не превышало 15%. * - участок стебля от семядолей до точки слома, ** * участок стебля 20 см вверх от семядолей (рис, б).

галактана, подтвержденная^" им муноцитох им ичес к и (ОогеЬко\а"е( а1., 2004), позволяет исследовать метаболизм этого полимера, не выделяя волокна. Проведение эксперимента па целых растениях и использование в качестве субстрата "СО^ максимально приближают ситуацию к естественной. *-

Дтя анализа использовали волокнистую часть стебля от семядолей до точки слома. Предварительные эксперименты показали, что через 10 суток после введения нСОг в растение метка уже практически не обнаруживается в тканеспеиифичном галаюане, поэтому фиксацию проб проводили сразу после фотосинтеза с '"СО] и через различные промежутки времени в течение 5 суток. Обшая радиоактивность анализируемого участка стебля была достаточно высокой для надежной регистрации радиоактивности полимеров клеточной стенки после их детального фракционирования, Динамика радиоактивности клеточной стенки имела обычный характер (табл. 3). Доля радиоактивности клеточной стенки от обшей радиоактивности постепенно увеличивалась и составляла через 5 суток около 40% от общей радиоактивности анализируемого участка.

Таблица 3. Обща* радиоактивность волокнистой части стебля, радиоактивность выделенной из нее клеточной стенки и доля радиоактивности клеточной стенки от общей радиоактивности сразу после 40-минутной экспозиции растений с МС02 и через 8 часов, 1 сугкн и 5 суток роста растений в естественных условиях;

Параметр 40 мия.с "СО, 8 часов 1 сутки 5 суток

Общая радиоактивность (мля.имп /мин) 30,9±б,8 37,7±3,б 40,8±1,0 42,1±1,2'

Радиоактивность клеточной стенки (млн.имп /мин) <Х5±0,1 6,б±0,8 12,4+0,9 16,4±3,5

Доля радиоактивности клеточной стенки от обшей радиоактивности (W 1,6±0,5 17,5±Э,1 30,4*2,4 39,0±3,6--

Для определения радиоактивности галактана оценивали радиоактивность фракций после разделения буферрастворимых полимеров на колонке 5ерЬаго$е 4В (рис, 8). Параллельная регистрация тканеспеиифичного галактана с помощью рефрактометра не выявила существенного юменекия профиля элкщии. Радиоактивность галактана определяли, суммируя радиоактивность собранных фракций (с 6-ой по 23-ю) (рис, 9).

- = $ Я S S R

М0М*РЯ фрикций

гэ-i Ö4Q Мине 14С02

19- D9 чассв

«■ ж 1 □сутки Щ5 суток

¡«

б

1 а,

1 ^

X 4-

Jk.

0 ■ юдогд галакгяи

' Рисунок 8. Радиоактивность фрахцнД

галактана после разделения на колонке БерЬак«« 4В сразу после 40-минутной экспозиции растений с14 СС>1 и через 8 часов, 1 сутки и 5 суток роста растений в естественных условиях (среднее для трех биологических повторностей в каждой временной точке).

Рисунок 9, Радиоактивность целлюлозы н тванеспецифичного галактана сразу после 40-минутнсй экспозиции растений с 1*СОа и через 8 часов, 1 сутки и 5 суток роста растений в естественных условиях.

После 40-минутной экспозиции с "COj происходило постепенное включение метки в г ал актам; через сутки оно достигало максимальных значений, а к 5 суткам радиоактивность полимера существенно снижалась (рис, 8, 9). Для оценки интенсивности поетеннтетической модификации галактана мы сопоставили включение метки в голакган и в неметаболизируемый полимер клеточной стенки - целлюлозу. В отличие or галактана, радиоактивность целлюлозы постоянно увеличивалась во времени. При этом происходило не только относительное уменьшение радиоактивности галактана в сравнен»и с радиоактивностью целлюлозы, но и убыль ее абсолюты* значений (рис. 8, 9). Сделав допущение, что скорость синтеза галактана л целлюлозы за период наблюдения не изменялась или изменялась синхронно, мы рассчитали время полужизни галактана, оненив прирост его радиоактивности и прирост радиоактивности целлюлозы за определенные промежутки времени по формуле: TI/2- Т,: log г (RUt^Rn / Rr,:Rr), где Т1/2- время полужизни (час), Т,-промежуток времени от экспозиции с "СОг до фиксации (час), Ки,-радиоактнвность целлюлозы во время t,Ru-радиоактивность целлюлозы сразу после 40-минутной экспозиции с "СОг, Rr,—радиоактивность галактана во время!, Rr-радиоактивность галактана сразу после 40-минутной экспозиции с "COj (Горшкова, 1997) (габл.4). В первые 8 часов после "глотка" uCOi время лолужизни полимера составило всего 4 часа, что свидетельствует о быстром распаде новосшггезированных, молекул. В дальнейшем время полужизни галактана увеличивалось. С момента от "глотка" до 5 суток оно составило уже 52 часа, что свидетельствует о замедлении процесса распада оставшихся молекул галактана. Таким образом, постсинтетнческая модификация галактана начинается сразу же после его образования и идет особенно интенсивно в первые часы после его

Таблица 4, Расчет времен»! полужизни тканеспенифичного гатактана флоэчных

волокон льна по приросту радиоактивности (R) целлюлозы и галактана.

Бремя К целлюлозы (млн.ямп/мин) R галахтаиа (млн.имп/мин) Прирост R иелл. Прирост Кгал. Прирост R иелл / прирост кгал. Log Т 112 (час)

40 мни с "СО, 0,3 0,14 - - - - -

8 часов 5,7 0,73 19,0 5,2 3,6 1.8 4

I сутки 10,7 . 2,41 35,6 17,2 2,1 1,1 22

5 суток 17.1 1,59 57,0 И,4 5.0 2,3 52

синтеза. По количеству метки, включенной в галактан за первые 40 минут экспозиции растений с "СОз, можно оценить масштабы его синтеза, по сравнению, с эдгими полисахаридами клеточной стенки. Сразу после "глотка" "СО^сго радиоактивность была достаточно высокой и составила 2В^/о от радиоактивности всей клеточной стенки и 47% от радиоактивности целлюлозы.

2,7. Анализ количества клеток на поперечных срезах- стебля льва-до лгу низ в ходе развития растений и при воздействии засухи

Изменение механических свойств в районе точки слома и активация сишеза тканеепецифичного галактана позволили предположить, что в этом участке стебля могут происходить существенные изменения в развитии флоэмкых волокон. Классическим приемом для изучения динамики удлинения и утолщения клеток является анализ срезов стебля. При этом продольные срезы позволяют характеризовать длину волокон только на ранних стадиях развития, поскольку через удлиняющиеся волокна невозможно сделать продольный срез, по крайней мере, пока эта клетка находится в толще стебля. Однако еще Т. Тамс (Тапипез, 1907) отмечала, что динамику удлинения можно анализировать и на поперечных срезах, поскольку интрузивный рост должен приводить к увеличению на них числа волокон. Для облегчения идентификации волокон удобно использовать краситель СеНиПиог, позволяющий выявлять клетки с интенсивным образованием полисахаридов клеточной стенки. Это особенно актуально на ранних стадиях развития волокон, когда их клеточная стенка имеет толщину, сопоставимую с клеточными стенками окружающих тканей (ОопЬкоуа е1 а],, 1996).

Для характеристики локализации в стебле и продолжительности отдельных стадий развития льняного волокна мы проанализировали поперечные срезы в различные периоды роста растений. Анализируя стебель сверху вниз, можно проследить последовательные этапы развития волокон. Этот подход дает общие представления о ходе образования волокон, однако четких характеристик в эточ случае получить невозможно, поскольку сопоставляются волокна, формировавшиеся на разных этапах развития растений, отличающихся гормональным балансом, обеспеченностью субстратами и т.д.

Более четким является подход, основанный на: а) наличии в стебле только первичных волокон; б) верхушечном росте растений; в) отсутствии ветвлений стебля. Он заключается в анализе волокон на одной и той же высоте стебля в ходе онтогенеза растений. В этом случае сопоставляются волокна, имеющие одинаковую предысторию.

Число волокон на поперечных срезах стебля растений льна в различных экспериментах составляло от 500 до 600, Нами показано, что на участке ниже точки слома количество волокон на поперечных срезах не изменялось в ходе дальнейшего развития растений (рис. 10). Подобная закономерность наблюдалась вне зависимости от того, где находилась точка слома в момент начала отсчета. Эти данные позволяют утверждать, что удлинение всех волокон завершается выше точки слома. Ниже нее происходит только утолщение клеточной стенки и ее модификация, приводящая к созреванию волокна. Зная, что удлинение волокон заканчивается на участке выше точки слома, мы рассчитали продолжительность стадии их удлинения, Скорость прироста растений в период быстрого роста составляла в среднем 1,5 - 2 см в сутки, средняя длнна участка стебля выше точки слома * 7 см, следовательно, продолжительность стадии удлинения волокон составляет от 3.5 до 5 суток.

Рисунок 10. Количество волокон на поперечник срезах льна в процессе развития растений • - точка слома, существующая в момент отбора образцов.

Для подтверждения выявленных закономерностей мы попытались искусственно изменить скорость роста и развития растений, воздействуя неблагоприятным фактором, в

качестве которого была выбрана почвенная засуха. Об изменении удлинения волокон при почвенной засухе также можно судить по количеству лубяных волокон на поперечных срезах стебля льна (рис. 11). Количество волокон на поперечных срезах ниже 1-й точки слома, идентифицированной в начале эксперимента, на 7-е сутки было таким же, как у контрольного варианта (рис. 10), и оставалось неизменным в ходе онтогенеза растений (рис. 11). Ого связано с тем, что волокна, находившиеся в этой части стебля, уже выросли до момента наступления засухи. Количество волокон на поперечных срезах стебля ниже 2-й точки слома у растений, подвергшихся засухе, оказалось на 16 % ниже, чем количество волокон, находившихся под 1-й точкой слома. Из этого следует, что волокна, находившиеся над 1-й точкой слома замедлили свой рост. После отбора проб на 7-й день засухи оставшиеся в сосудах растения поливали в обычном режиме до окончания эксперимента. При этом количество волокон ниже вновь появившихся 3-еЙ и 4-ой точки слома было сходным с таковым у контрольных растений и с количеством волокон под 1-й точкой слома, что свидетельствует об отсутствии последействия засухи (рис. 11 ).

Рисунок 11. Влияние засухи иа количество волокон на поперечных срезах льна. - точка слома, существующая в момент отбора образцов.

Однако, несмотря на нормальные условия водообеспечения, количество волокон под второй точкой слома имело низкие значения вплоть до завершения эксперимента (рис. 11). Таким образом, волокна, удлинявшиеся во время почвенной засухи, оставались более короткими до конца онтогенеза. Это означает, что воздействие неблагоприятного фактора в период быстрого роста впоследствии приводит к невосполнимым потерям качества урожая, связанным с неоднородностью длины волокон в различных участках стебля. Полученные данные подтверждают наши представления о том, что интрузивный рост флоэчных волокон ограничен во времени и происход)гт только на участке выше точки слома.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В системе интактного растения исследован метаболизм тканеспеиифичною полисахарида флоэчных волокон и его сопряженность со стадиями развития клетки. Показано, что высокомолекулярный буферрастворимый галактан не только тканеспецнфичен, но и стадиеспеиифичен: он отсутствует в ходе удлинения волокон и появляется только после завершения интрузивного роста. Совпадение по времени инициации синтеза галактана с возникновением в клеточной стенке слоя с особо упорядоченной структурой, характерной для зрелого волокна (Сальников и др.. 1993), позволяет предположить, что он принимает участие в упаковке микрофибрилл целлюлозы. Дополнительным аргументом в пользу этою предположения служит локализация тханеслецифичного галактана в неупорядоченном внутреннем слое вторичной клеточной стенки (Gorshkova el al., 2004), который исчезает при созревании волокна (Сальников и др., 1993), параллельно с исчезновением буферрастворимого галактана в результате постсинтетической модификации. Судя по характеру метаболизма тканеспецифичного галактана, можно ожидать, что в районе точки слома происходит активация генов ферментов, обеспечивающих его синтез и модификацию, что делает лен перспективным объектом для поиска генов гликозилтрансфераз, по-прежнему остающихся одними из самых сложных для идентификации.

В результате проведенных исследований обнаружено, что склеренхимные волокна, несмотря на их удивительную длину, не являются исключением из общего правила, утверждающего, что удлинение клетки и формирование вторичной клеточной стенки происходят последовательно. Ранее считалось, что ват окна формируются путем

длительного концевого роста, совмещенного с отложением слоев вторичной клеточной стенки в срединной части клеток. Установлено, что точка слома - это место, где: 1) заканчивается интрузивный рост всех волокон в этой части стебля; 2) активируется си ¡лез тканеспеиифнчного галактана флоэмных волокон; 3) происходит возрастание механической прочности волокнистой части стебля. Наличие такого индикатора, как точка-слома, делает растения льна удобной моделью для функциональной геном и ки формирования растительных волокон, изучения механизмов формирования полисахаридов клеточной стенки и роста растительных клеток.

ВЫВОДЫ

1) Установлено, что точка слома является индикатором, разграничивающим отдельные стадии развития флоэмных волокон стебля льна, С использованием методов микроскопии показано, что удлинение флоэмного волокна происходит только на участке стебля выше точки слома, ниже нее клеточная стенка лишь утолщается.

2) Обнаружено, что удлинение индивидуальной клетки, достигающей нескольких сантиметров в длину, занимает от 3 до 5 дней, причем, скорость удлинения волокна составляет примерно 1 см в сутки. Утолщение клеточной стенки может происходить в течение двух месяцев,

3) Показано, что высокомолекулярный буферрастворимый галактан стебля льна не только тканеспецифичен, но и стадиеспецифичен: он отсутствует в ходе удлинения волокон и появляется только после завершения интрузивного роста, на стадии утолщения клеточной стенки.

4) В опытах на различных сортах льна показано, что в период быстрого роста содержание тканеспецифичного галактана составляло 0,544 - 1,2% от сухой массы волокнистой части стебля и 0,790-1,9% от массы выделенной из нее клеточной стснки. При этом включение метки в тканеспецифичный галактан за первые 40 минут экспозиции растений с иСОг достигало 30 % от радиоактивности клеточной стенки.

5) Тканеспецифичный водорастворимый галактан подвергается постсинтетической модификации и в зрелом волокне не обнаруживается, В экспериментах с "СО^ показано, что в первые 8 часов после введения метки время полужизни полимера составило всего 4 часа, что свидетельствует о быстром распаде новосинтезированных молекул.

б) Показано, что воздействие неблагоприятного фактора в период быстрого роста снижает скорость удлинения волокон. Волокно, растущее во время стресса, остается более коротким до окончания онтогенеза, в результате чего возникает неустранимая неоднородность длины волокон в различных участках стебля.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Developmental^ regulated galactan at cell wall thickening stage of flax fiber formation. //Abst.of Workshop of Plant В copolymer Science: Food and Nonfood Application. Nantes, France. - 2001.-281 P.

2. Flax bast fibers as a model to study cell elongation and wall thickening in situ.// Astr.of 9 Ini. Cell Wall Meeting.Toulouse, France.. - 2001. - 337 P.

3. О характере роста лубяных волокон Linum usitatissimum ¿.Тез. докл.2 Межд. Конфер, по анатомии и морфологии растений. Санкт-Петербург. - 2002. - 431 С.

4. Т.А. Горшкова, М Л.Агеева, В .В, Сальников, Н.В. Павленчева, А.В. Снегирева, Т.Е. Чернова, С.Б. Чем и косова. Стадии формирования лубяных волокон Linum usitatissimum (2Ысй»У/Ботаническийжурнал. - 2003. - Ш2. -Т 88. - С.1-11.

5. Метаболизм тканеспецифнчного галактана лубяного волокна стебля льна. Тез. докл, 5 съезда общ. Физиол.растен. России. Пенза. -2003. • 559 С.

6. T.A.Gorshkova, V.V.Salnikov, S.B. Chemikosova, M.V. Ageeva, N.V. Pavlencheva, J.E.G. van Dam, The snap point: a transition point in Linum usitatissimum bast fiber development// Indust Crops and Prod. - 2003. - №18. - C.213-221.

7. T.A.Gorshkova, V.V.Salnikov, S.B, Chemikosova, M.V. Ageeva, N.V. Pavlencheva, J.E.G. van Dam. Occurence of cell-specific galactan in coinciding with bast fiber development transition in flax. // Indust Crops and Prod. In press.

»-2775

Отпечатано в ООО «Печатный двор». Казань, Журналистов. 1/16. Тел. 72Л4-59. 41-76-41,41-76-51. Лицензия ПЗ М7-ЙШ от 01.11.01 Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением М1ПР РФ. Подписано в печать 28.0!.04. Усл,п..т, 1,1, Заказ 292. Формат 60x901/16. Тираж !00 окг Бумага офсетная. Печать - ризогрифия