Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна"

На правах рукописи

ПАВЛЕНЧЕВА НАТАЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

Метаболизм тканеспецифичного галактана и развитие флоэмных волокон льна

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2004

Работа выполнена в лаборатории механизмов роста растительных клеток Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Т.Л.Горшкова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор В.Б. Иванов (ИФР. РАН, Москва)

Ведущая организация:

доктор биологический наук,

профессор В. И. Чиков (КИББ КазНЦ РАН, Казань)

Всероссийский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт льна РАСХН (г.Торжок)

Защита состоится на заседании диссертационного

совета К 002.005.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН (420111, г. Казань, а/я 30, ул. Лобачевского, 2/31).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А. Б. Иванова

ВВЕДЕНИЕ

Постановка проблемы и ее актуальность. Дифференциация клетки и формирование специализированных тканей — основополагающий процесс индивидуального развития организма. В высших растениях к числу высокоспециализированных клеток принадлежат склеренхимные волокна, которые присутствуют в различных органах растения и в частности, обеспечивают прочность стебля. К ним относятся флоэмные волокна, которые составляют основу урожая технических волокнистых культур, таких как лен и конопля. Отличительной особенностью склеренхимных волокон являются толстые клеточные стенки и необычная длина индивидуальных клеток, достигающая нескольких сантиметров. Развитие этих уникальных клеток - интригующий процесс, важнейшим этапом в характеристике которого является выявление отдельных стадий, их временная и пространственная локализация. Без них невозможны ни понимание хода морфогенеза, ни изучение биохимических процессов, с помощью которых он реализуется. С другой стороны, особый интерес представляет выявление и изучение тканеспецифичных процессов.

В стебле льна существует так называемая точка слома (Goгshkova et а1., 1996; SaLmkov et а1., 1998), где волокнистая часть стебля резко меняет свои механические свойства, становясь более прочной. Считается, что склеренхимные волокна формируются путем длительного апикального роста, совмещенного с отложением вторичной клеточной стенки в срединной части клетки (Эзау, 1980; РаИп, 1990), что не объясняет скачкообразного изменения механических свойств. Отмеченное противоречие побудило нас пересмотреть представления о характере формирования волокон склеренхимы.

Растения льна содержат достаточно редкий полисахарид клеточной стенки, который является тканеспецифичным полимером и присутствует только в клетках флоэмных волокон (Goгshkova et а1., 1996; Goгshkova et а1., 2003). Этот полимер - рМ,4-галактан, который является высокомолекулярным соединением (степень полимеризации сравнима с таковой у целлюлозы), но растворяется в воде и достаточно легко выделяется с помощью гель-фильтрации. Это отличает его от большинства других полисахаридов матрикса клеточной стенки, которые обычно находятся в сложном взаимодействии друг с другом и с целлюлозными микрофибриллами, так что полностью извлечь какой-то один из них, не нарушая, его структуры, крайне сложно. Тканеспецифичность и доступность для выделения р-1,4-галактана стебля льна

I- 1-ис..НАЦИОНАЛЫ1ЛЯ , БИБЛИОТЕКА /

С.Петербург ... | ' 09 ■ {

на интактных растениях метаболизма индивидуального полимера клеточной стенки и его сопряженности со стадиями формирования клетки.

Цель и задачи исследования. Целью представляемой работы являлась характеристика метаболизма тканеспецифичного галактана и его связи с развитием флоэмных волокон льна Были поставлены следующие задачи:

1) Оценить содержание галактана в различных участках стебля и на различных стадиях развития растений льна.

2) Изучить метаболизм тканеспецифичного галактана в экспериментах с экзогенным меченым субстратом - |4СОг

3) Охарактеризовать локализацию в стебле и продолжительность отдельных стадий развития льняного волокна

Научная новизна работы. Впервые обнаружено, что интрузивный рост флоэмных волокон льна ограничен во времени до 3-5 дней (скорость удлинения клетки составляет примерно 1 см в сутки), что заставляет пересмотреть существовавшие представления о формировании волокон склеренхимы. Установлено, что точка слома на стебле льна является индикатором, разграничивающим отдельные стадии развития флоэмных волокон: удлинение первичных флоэмных волокон происходит только на участке стебля выше точки слома, ниже ее клеточная стенка лишь утолщается

Впервые обнаружено, что буферрастворимый (3-1,4-галактан отсутствует в ходе удлинения волокон и появляется только после завершения интрузивного роста на стадии утолщения клеточной стенки, то есть представляет собой редкий полисахарид клеточной стенки, синтезируемый только на определенной стадии развития клетки. Показано, что тканеспецифичный галактан подвергается постсинтетической модификации. Оценено время его полужизни в системе интактного растения.

Практическая ценность работы. Охарактеризован легко идентифицируемый индикатор (точка слома) окончания интрузивного роста флоэмных волокон и начала синтеза тканеспецифичного полимера клеточной стенки. Наличие такого индикатора делает растения льна удобной моделью для функциональной геномики формирования растительного волокна, изучения механизмов формирования полисахаридов клеточной стенки и роста растительных клеток.

Выявление существенных сортовых различий в содержании и распределении молекулярной массы тканеспецифичного галактана флоэмных волокон льна позволяет

приступить к разработке новых генетических маркеров для использования в селекции льна-долгунца. Показано, что воздействие неблагоприятного фактора в период быстрого роста растений льна приводит к невосполнимым впоследствии потерям качества урожая, связанным с неоднородностью длины волокон в различных участках стебля.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на IX международной конференции по клеточной стенке (Тулуза, Франция, 2001), на конференции по растительным биополимерам (Нант, Франция, 2001), II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), V съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003) и на итоговых конференциях и семинарах КИББ КазНЦ РАН (2001,2002,2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список цитируемой литературы) и состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. В работе представлено 7 таблиц и 27 рисунков. Список литературы включает 165 источников, в том числе 34 - отечественных.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.1. Объектом исследований служили растения льна - долгунца (Ыпиш шШШяжыт Ь.) сорта Новоторжский. В некоторых экспериментах использовали и другие сорта из коллекции ВНИИльна (Торжок), отличающиеся по качеству волокна (Славный, Псковский кряж. Светоч, Колхидский стелющийся). Растения выращивали в условиях вегетационного опыта в ящиках со слоем почвы 50 см на открытом воздухе при естественном освещении и ежедневном поливе. В экспериментах по влиянию почвенной засухи на удлинение волокон растения выращивали в сосудах Митчерлиха при влажности почвы 70% от ее полной влагоемкости. Почвенную засуху создавали путем прекращения полива и доведения влажности почвы до 40% от ее полной влагоемкости. Основная часть экспериментов была выполнена на растениях, находившихся на стадии быстрого роста. Положение точки слома на стебле льна определяли вручную в 20 повторностях; выше этой точки стебель льна легко рвется, в то время как ниже нее с трудом поддается разрыву.

1.2. Выделение клеточной стенки и буферрастворимых полимеров

Для биохимического анализа фиксировали различные участки стебля растения в соответствии со схемами, приведенными при изложении результатов. Ниже точки слома стебель делили на внутреннюю (ксилемную) и внешнюю (волокнистую) части. Для анализов образцов использовали внешнюю часть, содержащую волокна. Образцы для биохимического анализа фиксировали жидким азотом. Эксперименты проводили в 3-6 кратной повторности.

Для выделения клеточных стенок и буферрастворимых полимеров материал (1501 000 мг сырой массы) гомогенизировали в 10 мл 50 мМ К-фосфатного буфера, рН 7. Гомогенат центрифугировали в течение 10 минут при 10 000g. Содержащиеся в супернатанте буферрастворимые полимеры осаждали этанолом (конечная концентрация 80%), промывали и высушивали. Из осадка, оставшегося после получения буферрастворимых полимеров, выделяли клеточную стенку по методике Талмадж (Talmadge-et al., 1973). Для удаления крахмала осадок в течение ночи обрабатывали глюкоамилазой (Sigma, USA). Тест на наличие крахмала с использованием KI - I2 давал на полученной клеточной стенке отрицательные результаты. Полисахариды матрикса клеточной стенки удаляли кипячением осадка в уксусно - азотном реактиве (смесь азотной и ледяной уксусной кислот в соотношении 1:10) в течении 1 часа. Оставшийся при этом осадок представлял собой целлюлозу (Updegiaff, 1969).

1.3. Гель - хроматография буферрастворимых полимеров

Для анализа буферрастворимых полимеров использовали хроматографические системы с колонками, позволяющими разделить полисахариды в диапозоне масс от 5 000 до 5 000 000: 1) HPLC система (UK6 инжектор и 510 HPLC насос^ек, Milford, USA) с преколонкой (7,8x300 мм; Ultrahydrogel 500, Waters) и последовательно соединенными колонками (Ultrahydrogel 2000 и Ultrahydrogel 500, Waters). Элюцию проводили ацетатным буфером 0,4 М (рН 3,0) со скоростью 0,8 мл/мин. В качестве детектора был использован дифференциальный рефрактометр (Pharmacia, Uppsala, Sweden); 2) FPLC система (Pharmacia LKB P500) с колонкой (15x500 мм; Superosa 6, Pharmacia). Элюцию проводили ацетатным буфером 0,1 М ( рН 4,5) со скоростью 0,5 мл/мин. В качестве детектора был использован дифференциальный рефрактометр LKB 2142. Объем отбираемых фракций - 1 мл; 3) HPLC система (HPLC насос, Gilson 302, France) с колонкой (12x400 мм; Sepharose 4В, Pharmacia). Элюцию проводили ацетатным буфером 0,01М (рН 4,5) со скоростью 0,25

мл/мин. В качестве детектора был использован дифференциальный рефрактометр Knauer (Germany). Объем отбираемых фракций - 1 мл.

Для анализа содержания Сахаров использовали фенольный метод Дюбуа (Dubois et al, 1956). Моносахаридный состав определяли.с помощью системы Dionex (Dionex, Sunnyvale, USA) с амперометрическим детектором. В качестве элюента использовали 15 мМИаОН, 20 мин.

1.4. Эксперименты по изучению метаболизма галактана с 14со2

Для введения 14СО2 в растения использовали замкнутую фотосинтетическую систему, состоящую из фотосинтетической камеры, газгольдера, компрессора и поглотителя СО2. Общий объем системы составлял 90 литров. Внесение 370 MBKNaHl4C03 не приводило к существенному отклонению концентрации СО2 от естественной. Эксперименты проводили на интактных растениях льна, которые целиком помещали в фотосинтетическую камеру. Время экспозиции растений с (40 минут) выбирали с

учетом необходимости попадания метки в метаболические пулы анализируемых тканей растения. Количество растений, помещенных в фотосинтетическую камеру, рассчитывали таким образом, чтобы убыль радиоактивности за время экспозиции не превышала 30%. Опыты проводили в 10 часов утра при естественном освещении в безоблачный день. Температура в фотосинтетической камере составляла 26°С. Часть растений фиксировали сразу после их экспозиции с 14СОг, остальные - через 8 часов, 1 сутки и 5 суток роста растений в естественных условиях. Пробы, отобранные с каждого растения, обрабатывали отдельно. Количество биологических повторностей в опыте - 3.

После выделения и фракционирования буферрастворимых полимеров и клеточной стенки по описанным' выше методикам радиоактивность полученных фракций просчитывали на жидкостно-сцинтилляционном радиометре "Delta-ЗОО" фирмы "Tracer Analytic" (США).

1.5. Приготовление гистологических срезов

Для приготовления гистологических срезов отрезки стебля длиной З мм фиксировали в течение 24 часов в фиксаторе Чемберлена, промывали 80% этанолом и помещали в 70% этанол. Зафиксированный и обезвоженный материал заливали в парафиновые блоки по методике З.П. Паушевой (Паушева, 1970). Срезы готовили на салазочном микротоме и наклеивали на предметные стекла. Затем парафин удаляли и окрашивали срезы по методу Генденгайна (Паушева, 1970), заключали в канадский бальзам и анализировали с помощью

светового микроскопа (МБИ-3, при увеличении 80). Количество биологических повторностей - 10, аналитических- 15.

Все полученные результаты обработаны статистически по общепринятой методике (Лакин, 1980), средние квадратичные отклонения приведены в таблицах.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Положения точки слома на стебле растения в онтогенезе

Первым этапом наших исследований было выяснение положения точки слома на стебле растения в онтогенезе. Оказалось, что точка слома обнаруживается только на определенных стадиях жизни растения. В ранний период развития растений льна, в фазы всходов и елочки (примерно три недели после прорастания), ее не идентифицировали. При наступлении периода быстрого роста точку слома легко выявляли с точностью до нескольких миллиметров (рис. 1).

В ходе развития растения точка слома перемещается вверх по стеблю. Когда растение начинает цвести (примерно семь недель после прорастания), рост стебля заканчивается; в дальнейшем увеличение высоты растения достигается только за счет роста метелок. В этот период точка слома исчезала (рис. 1). Расстояние от верхушки стебля до точки слома варьировало в ходе развития растения в нескольких экспериментах с различными сортами льна между 45 и 90 мм. Обычно, чем быстрее растет растение, тем больше это расстояние.

2.2. Гель-проникающая хроматография буферрастворимых полимеров стебля льна на различных стадиях развития растения

Определяли наличие тканеспецифичного галактана в участках стебля выше и ниже точки слома, зафиксированных на разных стадиях роста растений (рис.2). Для этого методом гель-проникающей хроматографии анализировали профили элюции буферрастворимых полимеров, осажденных 80% этанолом. При построении схемы эксперимента основывались на следующих соображениях. Лен, как и другие двудольные растения, растет в высоту апикальной меристемой. Но, в отличие от многих.других растений, флоэмные волокна формируются в нем только из протофлоэмы, то есть являются первичными (камбий, хотя и активен, но флоэмные волокна в результате его деятельности не возникают) (Esau, 1943, Эсау, 1969). Следовательно, отслеживая участок стебля на одной и той же высоте в ходе развития растения, можно анализировать последовательные стадии формирования волокон. В качестве ориентира при проведении опыта брали положение точки слома на стебле.

Детально охарактеризуем проведение эксперимента (рис. 2), поскольку в последующих опытах использовали аналогичные подходы. В начале эксперимента находили точку слома, измеряли расстояние до нее от семядолей (в данном случае оно составляло 18,5 см) (рис. 26), а также длину участка выше точки слома (рис 2а).

Через 10 суток фиксировали участок длиной 18,5 см от семядолей (рис. 2д), часть стебля до новой точки слома (17 см) (рис. 2г) и участок выше новой точки слома (рис. 2в). Следующую фиксацию (через 20 суток после начала эксперимента) проводили после исчезновения точки слома, когда растения вступали в фазу цветения. Фиксировали участок стебля длиной 18,5 см (рис. 2ж) и выросшую часть стебля (рис. 2е). Последнюю фиксацию проводили через 2 месяца после начала опыта. На этой стадии фиксировали весь стебель целиком, поскольку предварительные эксперименты показали отсутствие буферрастворимого тканеспецифичного галактана у зрелых растений. Из всех зафиксированных участков стебля выделяли буферрастворимые полимеры. Для сопоставления хроматограмм образцов из участков, имевших различную длину, рассчитывали объем пробы буферрастворимых полимеров, приходившийся на единицу длины. Таким образом, хроматограммы для всех участков стебля, зафиксированных в одном опыте, сопоставимы - между собой. Стебель льна ниже точки слома легко разделяется на наружную и внутреннюю части (ОогеЪкоуа Ы а1. 1996). Разделение происходит по поверхности пучков флоэмных волокон, которые практически полностью оказываются в наружной части. Подобное разделение не влияет на характеристики высокомолекулярного буферрастворимого галактана, поскольку этот полимер является тканеспецифичным (ОогеЪкоуа й а1., 1996; ОогеЪкоуа Ы а1., 2003), однако уменьшает массу проб, облегчая работу с ними. Содержание клеточной стенки у зафиксированных образцов хорошо иллюстрирует ход формирования волокна: в молодых растениях на участке ниже точки слома оно составляло 0,5 мг/см, а в зрелом растении достигало 1,9 мг/см (рис 2).

На рисунке 3 приведены примеры профилей элюции образцов, взятых выше (а) и ниже (б) точки слома. Хроматограмма буферрастворимых полимеров стебля льна состоит

Рисунок 3. Профили элюции буферрастворимых

полимеров на колонках Ultrahydrogel 2 000 - Ultrahydrogel 500 из участков стебля льна выше (а) и ниже (б) точки слома АГ (белок) - арабиногалактановый белок.

из двух частей (рис. 3). Соответствующая низкомолекулярной массе часть представлена арабиногалактановым белком (рис. 3, пик 1 и 3), который не является тканеспецифичным (ОокЪкоуа й а1., 1996). Тканеспецифичный галактан элюирует первым (рис. 3, пик 2), в области, характерной для полимеров с массой 2 000 000 Да (ОогеЪкоуа Ы а1., 1996). Моносахаридный состав полисахаридов (пики 1, 2, 3) (табл. 1) соответствовал тканеспецифичному галактану (пик 2) и арабиногалактановому белку (пики 1 и 3) (ОогеЫкЭУа Ы а1., 1996). На хроматограммах образцов, взятых выше точки слома (рис. 2 а, в), пик высокомолекулярного галактана отсутствовал (рис. 3 а), независимо от высоты растения в момент фиксации. В образцах, отобранных ниже точки слома (рис. 2 б, г, д), тканеспецифичный галактан всегда присутствовал.

В фазе цветения (рис. 2 е, ж), уже после исчезновения точки слома, анализируемый полимер присутствовал во всех участках стебля, хотя и в разных количествах, а в зрелых растениях (рис. 2 з) полностью исчезал из буферрастворимой фракции (данные не приведены). Таким образом, тканеспецифичный галактан подвержен постсинтетической модификации и/или гидролизу. К аналогичному выводу привели и специальные

Таблица 1. Состав нейтральных моносахаридов (моль%) во фракциях буферрастворимых полимеров стебля льна (обозначения на рис. 3).

Участок Пик Рамноза Арабиноза Галактоза Глюкоза

Выше ТС 1 Следы 32,2±0,1 67,8±0,2 Следы

Ниже ТС 2 6,8±2,4 3,0±0,9 84,1 ±4,1 6,2±2,4

3 2,5±1,2 24,6±2,1 72,4±0,6 0,3±0

жакримыгг» 10 суток 20 суток 60 суток _

Рисунок 4. Анализ буферрастворимых полимеров в ходе развития растений льна. А -схема отбора образцов, Б - профили элюции буферрастворимых- полимеров на колонках Superóse 6; • - точка слома.

эксперименты, в которых были проанализированы 10-сантиметровые участки стебля, отобранные в процессе развития растений (рис. 4). Полученные хроматограммы хорошо иллюстрируют постепенное снижение количества галактана, приводящее к его отсутствию в зрелых растениях.

2.3. Анализ буферрастворимых полимеров из участков стебля, находящихся вблизи точки слома

Для более полной характеристики инициации синтеза галактана были зафиксированы отрезки стебля длиной 1 см в районе точки слома. Два отрезка были взяты над точкой слома, три - непосредственно после и один - в нижней части стебля (5 см от семядолей) (рис. 5).

На хроматограммах образцов, взятых выше точки слома, как и в предыдущих экспериментах, пика галактана не обнаруживали. Появление его происходило непосредственно под точкой слома (рис. 5). В образцах, зафиксированных на сантиметр ниже точки слома (отрезок 4), пик тканеспецифичного галактана уже хорошо выражен.

Таким образом, результаты всех вышеприведенных экспериментов говорят о том, что: 1) буферрастворимый тканеспецифичный высокомолекулярный галактан обнаруживается не на всем протяжении развития волокон: он отсутствует выше точки слома и совпадает по времени возникновения с возрастанием механической прочности волокнистой части стебля; 2) тканеспецифичный галактан претерпевает постсинтетические

изменения, которые приводят к тому, что в зрелых волокнах он отсутствует в буферрастворимой фракции; 3) точка слома - легко обнаруживаемый индикатор начала синтеза тканеспецифичного галактана.

2.4. Характеристика тканеспецифичного галактана различных сортов льна

Буферрастворимые полимеры проанализировали в растениях пяти различных сортов льна из коллекции ВНИИльна (г. Торжок), отличающихся по качеству волокна. Корректное сравнение различных сортов между собой затруднено тем, что они могут отличаться, например, по высоте растений и скорости созревания. Отдавая себе в этом отчет, мы, тем не менее, сопоставили участки одинаковой длины в нижней (20 см вверх от семядолей) части стебля растений в период быстрого роста (рис. 6). Содержание клеточной стенки в образцах различных селекционных сортов было схожим, за исключением сорта Псковский, у которого оно было существенно ниже. Ни в одном из проанализированных участков стебля выше точки слома, ни у одного из проанализированных сортов высокомолекулярный галактан обнаружен не был.

В образцах, отобранных ниже точки слома, профили элюции (рис. 7) существенно отличались даже у сортов, имевших сходную высоту растения (Псковский и Новоторжский), а также у сортов, близких по выходу клеточной стенки (Новоторжский, Колхидский, Светоч, Славный) (рис. 6) Возможно, содержание и распределение

молекулярной массы тканеспецифичного галактана являются важной детерминантой качества волокна, так как, содержание других полисахаридов варьирует у различных сортов значительно менее существенно (Горшкова и др., 1996).

галахтан АГ (белок)

2.5. Оценка содержания галактана

Поскольку галактан является компонентом клеточной стенки, претерпевающим постсинтетические изменения в ходе развития, волокна, определение его содержания является непростой задачей. Данные по содержанию галактана у растений, находящихся на стадии быстрого роста, приведены в таблице 2. Для оценки содержания галактана использовали два подхода: 1) оценка содержания галактана после разделения буферрастворимых полимеров на колонке Sepharose 4B и анализ Сахаров по методу Дюбуа (Dubois et al., 1956); 2) оценка содержания галактана путем определения содержания моносахаридов в буферрастворимой фракции.

2.6. Изучение метаболизма высокомолекулярного галактана в экспериментах

Выявление постсинтетических изменений тканеспецифичного галактана поставило вопрос об их динамике. Интенсивность постсинтетических модификаций полисахаридов клеточной стенки крайне редко оценивалась в системе интактного растения. Классическим подходом для решения таких задач служит анализ перераспределения метки после введения экзогенного меченого субстрата. Тканеспецифичность буферрастворимого (Ы,4-

Рисунок 7. Профили элюции буферрастворимых полимеров

различных сортов льна на колонках Шга11ус1го§е1-2000 - ШгаЬускс^е! 500. АГ(белок) - арабиногалактановый белок.

полимеров

1«

16 20 22 24 SB

>р on ухку жаимя фиш)

с "С02

Таблица 2. Оценка содержания тканеспецифичного галактана в стебле льна по профилю элюции и моносахаридному составу.

, Параметр По профилю элюции По моносахаридному составу

Новоторжский* Новоторжский** Светоч**

Сухая масса участка стебля (мг) 310 _ _

Сухая масса волокнистой части стебля (мг) 44 27 23

Сухая масса клеточной стенки волокнистой части стебля (мг) 28 17 16

Сухая; масса буферрастворимых полимеров волокнистой части стебля (мг) 7,8 5,7 4,7

Сухая масса тканеспецифичного галактана (мг) 0,3 0,3 0,1

Доля тканеспецифичного галактана от массы буферрастворимых полимеров (%) 3,8 5,7 2,5

Доля тканеспецифичного галактана от массы клеточной стенки (%) 1,1 1,9 0,7

Доля тканеспецифичного галактана от массы волокнистой части стебля (%) 0,7 1,2 0,5

Доля тканеспецифичного галактана от массы участка стебля (%) 0,1 - -

Примечание: - среднеквадратичное отклонение не превышало 15%. * - участок стебля от семядолей до точки слома, ** - участок стебля 20 см вверх от семядолей (рис. 6).

галактана, подтвержденная иммуноцитохимически (ОогеЬкоуа й а1., 2004), позволяет исследовать метаболизм этого полимера, не выделяя волокна. Проведение эксперимента на целых растениях и использование в качестве субстрата 14СО2 максимально приближают ситуацию к естественной.

Для анализа использовали волокнистую часть стебля от семядолей до точки слома. Предварительные эксперименты показали, что через 10 суток после введения 14СО2 в растение метка уже практически не обнаруживается в тканеспецифичном галактане, поэтому фиксацию проб проводили сразу после фотосинтеза с 14СО2 и через различные промежутки времени в течение 5 суток. Общая радиоактивность анализируемого участка стебля была достаточно высокой для надежной регистрации радиоактивности полимеров клеточной стенки после их детального фракционирования. Динамика радиоактивности клеточной стенки имела обычный характер (табл. 3). Доля радиоактивности клеточной стенки от общей радиоактивности постепенно увеличивалась и составляла через 5 суток около 40% от общей радиоактивности анализируемого участка.

Таблица 3. Общая радиоактивность волокнистой части стебля, радиоактивность выделенной из нее клеточной стенки и доля радиоактивности клеточной стенки от обшей радиоактивности сразу после 40-минутной экспозиции растений с|4СО2 и через 8 часов, 1 сутки и 5 суток роста растений в естественных условиях.

Параметр 40 мин.с ,4С02 8 часов I сутки 5 суток

Общая радиоактивность (млн имп /мин) 30,9±6,8 37,7±3,б 40,8±1,0 42,1±1,2

Радиоактивность клеточной стенки (млн имп /мин) 0,5±0,1 6,б±0,8 12,4±0,9 16,4±3,5

Доля радиоактивности клеточной стенки от общей радиоактивности (%) 1,6±0,5 17,5±3,1 30,4±2,4 39,0±3,6

Для определения радиоактивности галактана оценивали радиоактивность фракций после разделения буферрастворимых полимеров на колонке 8ерИагс«е 4В (рис. 8). Параллельная регистрация тканеспецифичного галактана с помощью рефрактометра не выявила существенного изменения, профиля элюции. Радиоактивность галактана определяли, суммируя радиоактивность собранных фракций (с 6-ой по 23-ю) (рис. 9).

Рисунок 8. Радиоактивность фракций Рисунок 9. Радиоактивность

галактана после разделения на колонке целлюлозы и тканеспецифичного галактана

БерЬагозе 4В сразу после 40-минутной сразу после 40-минутной экспозиции

экспозиции растений с14 С02 и через 8 часов, растений с ИС02 и через 8 часов, 1 сутки и 5

1 сутки и 5 суток роста растений в суток роста растений в естественных

естественных условиях (среднее для трех условиях, биологических повторностей в каждой временной точке).

После 40-минутной экспозиции с 14СО2 происходило постепенное включение метки в галактан; через сутки оно достигало максимальных значений, а к 5 суткам радиоактивность полимера существенно снижалась (рис- 8, 9). Для оценки интенсивности постсинтетической модификации галактана мы сопоставили включение метки в галактан и в неметаболизируемый полимер клеточной стенки - целлюлозу. В отличие от галактана, радиоактивность целлюлозы постоянно увеличивалась во времени. При этом происходило не только относительное уменьшение радиоактивности галактана в сравнении, с радиоактивностью целлюлозы, но и убыль ее абсолютных значений (рис. 8, 9). Сделав допущение, что скорость синтеза галактана и целлюлозы за период наблюдения не изменялась или изменялась синхронно, мы рассчитали время полужизни галактана, оценив прирост его радиоактивности и прирост радиоактивности целлюлозы за определенные промежутки времени по формуле: Tl/2= Tt: log 2 (Ru:Ru / Rr:Rr), где Tl/2 - время полужизни (час), Tt - промежуток времени от экспозиции с |4СО2 до фиксации (час), Rut -радиоактивность целлюлозы во время t, Rц-радиоактивность целлюлозы сразу после 40-минутной экспозиции с 14СО2, Rrt - радиоактивность галактана во время t, Rr - радиоактивность галактана сразу после 40-минутной экспозиции с |4СО2 (Горшкова, 1997) (табл.4). В первые 8 часов после "глотка" 4СО2 время полужизни полимера составило всего 4 часа, что свидетельствует о быстром распаде новосинтезированных молекул. В дальнейшем время полужизни галактана увеличивалось. С момента от "глотка" до 5 суток оно составило уже 52 часа, что свидетельствует о замедлении процесса распада оставшихся молекул галактана. Таким образом, постсинтетическая модификация галактана начинается сразу же после его образования и идет особенно интенсивно в первые часы после его

Таблица 4. Расчет времени полужизни тканеспецифичного галактана флоэмных

волокон льна по приросту радиоактивности (R) целлюлозы и галактана.

Время R целлюлозы (млн.имп/мин) Rгалактана (млн.имп/мин) Прирост R целл. Прирост Кгал. Прирост R целя 1 прирост кгал. Log Т 1|2 (час)

40 мин с 14СО2 0,3 0,14 - - - -

8 часов 5,7 0,73 19,0 5,2 3,6 1,8 4

jl сутки 10,7 2,41 35,6 17,2 2,1 1,1 22

' 5 суток 17,1 1,59 57,0 11,4 5,0 2,3 52

синтеза. По количеству метки, включенной в галактан за первые 40 минут экспозиции растений с 14СО2, можно оценить масштабы его синтеза, по сравнению- с- другими полисахаридами клеточной стенки. Сразу после "глотка" |4С02 его радиоактивность была достаточно высокой и составила 28% от радиоактивности всей клеточной стенки и 47% от радиоактивности целлюлозы.

2.7. Анализ количества клеток на поперечных срезах стебля льна-долгунца в ходе развития растений и при воздействии засухи

Изменение механических свойств в районе точки слома и активация, синтеза тканеспецифичного галактана позволили предположить, что в этом участке стебля могут происходить существенные изменения в развитии флоэмных волокон. Классическим приемом для изучения динамики удлинения и утолщения клеток является анализ срезов стебля. При этом продольные срезы позволяют характеризовать длину волокон только на ранних стадиях развития, поскольку через удлиняющиеся волокна невозможно сделать продольный срез, по крайней мере, пока эта клетка находится в толще стебля. Однако еще Т. Тамс (Ташшев, 1907) отмечала, что динамику удлинения можно анализировать и на поперечных срезах, поскольку интрузивный рост должен приводить к увеличению на них числа волокон. Для облегчения идентификации волокон удобно использовать краситель СеПиНиог, позволяющий выявлять клетки с интенсивным образованием полисахаридов клеточной стенки. Это особенно актуально на ранних стадиях развития волокон, когда их клеточная стенка имеет толщину, сопоставимую с клеточными стенками окружающих тканей (ОокИкоуа е! а1., 1996).

Для характеристики локализации в стебле и продолжительности отдельных стадий развития льняного волокна мы проанализировали поперечные срезы в различные периоды роста растений. Анализируя стебель сверху вниз, можно проследить' последовательные этапы развития волокон. Этот подход дает общие представления о ходе образования волокон, однако четких характеристик в этом случае получить невозможно, поскольку сопоставляются волокна, формировавшиеся на разных этапах развития растений, отличающихся гормональным балансом, обеспеченностью субстратами и т.д.

Более четким является подход, основанный на: а) наличии в стебле только первичных волокон; б) верхушечном росте растений; в) отсутствии ветвлений стебля. Он заключается в анализе волокон на одной и той же высоте стебля в ходе онтогенеза растений. В этом случае сопоставляются волокна, имеющие одинаковую предысторию.

Число волокон на поперечных срезах стебля растений льна в различных экспериментах составляло от 500 до 600. Нами показано, что на участке ниже точки слома количество волокон на поперечных срезах не изменялось в ходе дальнейшего развития растений (рис. 10). Подобная закономерность наблюдалась вне зависимости от того, где находилась точка слома в момент начала отсчета. Эти данные позволяют утверждать, что удлинение всех волокон завершается выше точки слома. Ниже нее происходит только утолщение клеточной стенки и ее модификация, приводящая к созреванию волокна. Зная, что удлинение волокон заканчивается на участке выше точки слома, мы рассчитали продолжительность стадии их удлинения. Скорость прироста растений в период быстрого роста составляла в среднем 1,5 - 2 см в сутки, средняя длина участка стебля выше точки слома - 7 см, следовательно, продолжительность стадии удлинения волокон составляет от 3.5 до 5 суток.

Для подтверждения выявленных закономерностей мы попытались искусственно изменить скорость роста и развития растений, воздействуя неблагоприятным фактором, в

качестве которого была выбрана почвенная засуха. Об изменении удлинения волокон при почвенной засухе также можно судить по количеству лубяных волокон на поперечных срезах стебля льна (рис. 11). Количество волокон на поперечных срезах ниже 1-й точки слома, идентифицированной в начале эксперимента, на 7-е сутки было таким же, как у контрольного варианта (рис. 10), и оставалось неизменным в ходе онтогенеза растений (рис. 11). Это связано с тем, что волокна, находившиеся в этой части стебля, уже выросли до момента наступления засухи. Количество волокон на поперечных срезах стебля ниже 2-й точки слома у растений, подвергшихся засухе, оказалось на 16 % ниже, чем количество волокон, находившихся под 1-й точкой слома. Из этого следует, что волокна, находившиеся над 1-й точкой слома замедлили свой рост. После отбора проб на 7-й день засухи оставшиеся, в сосудах растения поливали в обычном режиме до окончания эксперимента. При этом количество волокон ниже вновь появившихся 3-ей и 4-ой точки слома было сходным с таковым у контрольных растений и с количеством волокон под 1-й точкой слома, что свидетельствует об отсутствии последействия засухи (рис. 11).

Однако, несмотря на нормальные условия водообеспечения, количество волокон под второй точкой слома имело низкие значения вплоть до завершения эксперимента (рис. 11). Таким образом, волокна, удлинявшиеся во время почвенной засухи, оставались более короткими до конца онтогенеза. Это означает, что воздействие неблагоприятного фактора в период быстрого роста впоследствии приводит к невосполнимым потерям качества урожая, связанным с неоднородностью длины волокон в различных участках стебля. Полученные данные подтверждают наши представления о том, что интрузивный рост флоэмных волокон ограничен во времени и происходит только на участке выше точки слома.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В системе интактного растения исследован метаболизм тканеспецифичного полисахарида флоэмных волокон и его сопряженность со стадиями развития клетки. Показано, что высокомолекулярный буферрастворимый галактан не только тканеспецифичен, но и стадиеспедафичен: он отсутствует в ходе удлинения волокон и появляется только после завершения интрузивного роста. Совпадение по времени инициации синтеза галактана с возникновением в клеточной стенке слоя с особо упорядоченной структурой, характерной для зрелого волокна (Сальников и др., 1993), позволяет предположить, что он принимает участие в упаковке микрофибрилл целлюлозы. Дополнительным аргументом в пользу этого предположения служит локализация тканеспецифичного галактана в неупорядоченном внутреннем слое вторичной клеточной стенки (ОогеКкоуа е! а1., 2004), который исчезает при созревании волокна (Сальников и др., 1993), параллельно, с исчезновением буферрастворимого галактана в результате постсинтетической модификации. Судя по характеру метаболизма тканеспецифичного галактана, можно ожидать, что в районе точки слома происходит активация генов ферментов, обеспечивающих его синтез и модификацию, что делает лен перспективным объектом для поиска генов гликозилтрансфераз, по-прежнему остающихся одними из самых «южных для идентификации.

В результате проведенных исследований обнаружено, что склеренхимные волокна, несмотря на их удивительную длину, не являются исключением из общего правила, утверждающего, что удлинение клетки и формирование вторичной клеточной стенки происходят последовательно. Ранее считалось, что волокна формируются путем

длительного концевого роста, совмещенного с отложением слоев вторичной клеточной стенки в срединной части клеток. Установлено, что точка слома - это место, где: 1) заканчивается интрузивный рост всех волокон в этой части стебля; 2) активируется синтез тканеспецифичного галактана флоэмных волокон; 3) происходит возрастание механической прочности волокнистой части стебля. Наличие такого индикатора, как точка слома, делает растения льна удобной моделью для функциональной геномики формирования растительных волокон, изучения механизмов формирования полисахаридов клеточной стенки и роста растительных клеток.

ВЫВОДЫ

1) Установлено, что точка слома является индикатором, разграничивающим отдельные стадии развития флоэмных волокон стебля льна. С использованием методов микроскопии показано, что удлинение флоэмного волокна происходит только на участке стебля выше точки слома, ниже нее клеточная стенка лишь утолщается.

2) Обнаружено, что удлинение индивидуальной клетки, достигающей нескольких сантиметров в длину, занимает от 3 до 5 дней, причем, скорость удлинения волокна составляет примерно 1 см в сутки. Утолщение клеточной стенки может происходить в течение двух месяцев.

3) Показано, что высокомолекулярный буферрастворимый галактан стебля льна не только тканеспецифичен, но и стадиеспецифичен: он отсутствует в ходе удлинения волокон и появляется только после завершения интрузивного роста, на стадии утолщения клеточной стенки.

4) В опытах на различных сортах льна показано, что в период быстрого роста содержание тканеспецифичного галактана составляло 0,5% - 1,2% от сухой, массы волокнистой части стебля и 0,7%-1,9% от массы выделенной из нее клеточной стенки. При этом включение метки в тканеспецифичный галактан за первые 40 минут экспозиции растений с |4СО2 достигало 30 % от радиоактивности клеточной стенки.

5) Тканеспецифичный водорастворимый галактан подвергается постсинтетической модификации и в зрелом волокне не обнаруживается. В экспериментах с |4СО2 показано, что в первые 8 часов после введения метки время полужизни полимера составило всего 4 часа, что свидетельствует о быстром распаде новосинтезированных молекул.

6) Показано, что воздействие неблагоприятного фактора в период быстрого роста снижает скорость удлинения волокон. Волокно, растущее во время стресса, остается более коротким до окончания онтогенеза, в результате чего возникает неустранимая неоднородность длины волокон в различных участках стебля.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Developmentally regulated galactan at cell wall thickening stage of flax fiber formation. //Abstof Workshop of Plant Biopolymer Science: Food and Nonfood Application. Nantes. France.-2001.-281 P.

2. Flax bast fibers as a model to study cell elongation and wall thickening in situ.// Astr.of 9 Int. Cell Wall Meeting.Toulouse. France.. - 2001. - 337 P.

3. О характере роста лубяных волокон Linum usitatissimum Ь..Тез. докл.2 Межд. Конфер. по анатомии и морфологии растений. Санкт-Петербург. - 2002. - 431 С.

4. ТА. Горшкова, М.В.Агеева, В.В. Сальников, Н.В. Павленчева, А.В. Снегирева, Т.Е. Чернова, С.Б. Чемикосова. Стадии формирования лубяных волокон Linum usitatissimum (Linaceae)//Бсюшический журнал. - 2003. - №12. - Т 88. - С.1-11.

5. Метаболизм тканеспецифичного галактана лубяного волокна стебля льна. Тез. докл. 5 съезда общ. Физиол.растен. России. Пенза. - 2003. - 559 С.

6. T.A.Gorshkova, V.V.Salnikov, S.B. Chemikosova, M.V. Ageeva, N.V. Pavlencheva, J.E.G. van Dam. The snap point: a transition point in Linum usitatissimum bast fiber development// Indust. Crops and Prod. - 2003. - №18. - C.213-221.

7. TA.Gorshkova, V.V.Salnikov, S.B. Chemikosova, M.V. Ageeva, N.V. Pavlencheva, J.E.G. van Dam. Occurence of cell-specific galactan in coinciding with bast fiber development transition in flax. // Indust. Crops and Prod. In press.

3- 27 75

Отпечатано в 000 «Печатный двор». Казань,ул. Журначистов. 1/16 Тел.72-74-59,41-76-41,41-76-51. ЛицензияПД№7-0215от 01.11.01 Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ Подписано в печать 28 01.04. Усл.п. 11,5. Заказ МК-1292 Формат 60x901/16. Тираж 100экз Бумага офсетная Печать -ризография

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павленчева, Наталия Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Растительные волокна

1.2. Льняное лубяное волокно

1.3. Тканеспецифичный галактан лубяных волокон льна

1.4. Клеточная стенка растений и проблемы в ее изучении

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объект исследования

2.2. Выделение клеточной стенки и буферрастворимых полимеров

2.3. Гель - хроматография буферрастворимых полимеров

2.4. Эксперименты по изучению метаболизма галактана с 14СОг

2.5. Приготовление гистологических срезов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

• 3.1. Положение точки слома на стебле льна в онтогенезе

3.2. Гель-проникающая хроматография буферрастворимых полимеров участков стебля льна, зафиксированных на различных стадиях 47 развития растения

3.3. Характеристика тканеспецифичного галактана в ^ различных сортах льна

3.4. Оценка содержания галактана

3.5. Анализ буферрастворимых полимеров на участках стебля, находящихся вблизи точки слома

3.6. Анализ метаболизма высокомолекулярного галактана в экспериментах по перераспределению метки из СОг

3.7. Анализ количества волокон на поперечных срезах стебля льнадолгунца

3.8. Влияние почвенной засухи на удлинение волокон и содержание галактана

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Представления о характере формирования флоэмных волокон стебля льна

4.2. Возможные функции тканеспецифичного галактана флоэмных волокон стебля льна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна"

Постановка проблемы и ее актуальность. Дифференциация клетки и формирование специализированных тканей — основополагающий процесс индивидуаль-ного развития организма. В высших растениях к числу высокоспециализированных клеток принадлежат склеренхимные волокна, которые присутствуют в различных органах растения и, в частности, обеспечивают прочность стебля. К ним относятся флоэмные волокна, которые составляют основу урожая технических волокнистых культур, таких как лен и конопля. Отличительной особенностью склеренхимных волокон являются толстые клеточные стенки и необычная длина индивидуальных I клеток, достигающая нескольких сантиметров. Развитие этих уникальных клеток - интригующий процесс, важнейшим этапом в характеристике которого является выявление отдельных стадий, их временная и пространственная локализация. Без них невозможны ни' понимание хода морфогенеза, ни изучение биохимических процессов, с помощью которых он реализуется. С другой стороны, особый интерес представляет выявление и изучение тканеспецифичных процессов.

В стебле льна существует так называемая точка слома (ОогеЬкоуа е1 а1., 1996; 8а1шкоу е1 а1., 1998), где волокнистая часть стебля резко меняет свои механические свойства, становясь более прочной. Считается, что склеренхимные волокна формируются путем длительного апикального роста, совмещенного с отложением вторичной клеточной стенки в срединной части клетки (Эзау, 1980; РаЬп, 1990), что не объясняет скачкообразного изменения механических свойств. Отмеченное противоречие побудило нас пересмотреть представления о характере формирования волокон склеренхимы.

Растения льна содержат достаточно редкий полисахарид клеточной стенки, который является тканеспецифичным полимером и присутствует только в клетках флоэмных волокон (СогБЬкоуа а1., 1996; ОогеИкоуа а!.,

2003). Этот полимер - р-(1->4)-галактан, который является высокомолекулярным соединением (степень полимеризации сравнима с таковой у целлюлозы), но растворяется в воде и достаточно легко выделяется с помощью гель-фильтрации. Это отличает его от большинства других полисахаридов матрикса клеточной стенки, которые обычно находятся в сложном взаимодействии друг с другом и с целлюлозными микрофибриллами, так что полностью извлечь какой-то один из них, не нарушая его структуры, крайне сложно. Тканеспецифичность и доступность для выделения р-(1->4)-галактана стебля льна предоставляет редкую возможность исследования на интактных растениях метаболизма индивидуального полимера клеточной стенки и его сопряженности со стадиями формирования клетки.

Цель и задачи исследования. Целью представляемой работы являлась характеристика метаболизма тканеспецифичного галактана и его связи с развитием флоэмных волокон льна. Были поставлены следующие задачи:

1) Оценить содержание галактана в различных участках стебля и на различных стадиях развития растений льна.

2) Изучить метаболизм тканеспецифичного галактана в экспериментах с экзогенным меченым субстратом - 14С02.

3) Охарактеризовать локализацию в стебле и продолжительность отдельных стадий развития льняного волокна.

Научная новизна работы. Впервые обнаружено, что интрузивный рост флоэмных волокон льна ограничен во времени до 3-5 дней (скорость удлинения клетки составляет примерно 1 см в сутки), что заставляет пересмотреть существовавшие представления о формировании волокон склеренхимы. Установлено, что точка слома на стебле льна является индикатором, разграничивающим отдельные стадии развития флоэмных волокон: удлинение первичных флоэмных волокон происходит только на участке стебля выше точки слома, ниже ее клеточная стенка лишь утолщается.

Впервые обнаружено, что буферрастворимый Р-(1-»4)-галактан отсутствует в ходе удлинения волокон и появляется только после завершения интрузивного роста на стадии утолщения клеточной стенки, то есть представляет собой редкий полисахарид клеточной стенки, синтезируемый только на определенной стадии развития клетки. Показано, что тканеспецифичный галактан подвергается постсинтетической модификации. Оценено время его полужизни в системе интактного растения.

Практическая ценность работы. Охарактеризован легко идентифицируемый индикатор (точка слома) окончания интрузивного роста флоэмных волокон и начала синтеза тканеспецифичного полимера клеточной стенки. Наличие такого индикатора делает растения льна удобной моделью для функциональной геномики формирования растительного волокна, изучения механизмов формирования полисахаридов клеточной стенки и роста растительных клеток. I

Выявлены существенные сортовые различия в содержании и распределении молекулярной массы тканеспецифичного галактана флоэмных волокон льна, что позволяет приступить к разработке новых генетических маркеров для использования в селекции льна-долгунца. Показано, что воздействие неблагоприятного фактора в период быстрого роста растений льна приводит к невосполнимым впоследствии потерям качества урожая, связанным с неоднородностью длины волокон в различных участках стебля.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на IX международной конференции по клеточной стенке (Тулуза, Франция, 2001), на конференции по растительным биополимерам (Нант, Франция, 2001), II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), V съезде Общества физиологов растений России (Пенза,

2003) и на итоговых конференциях и семинарах КИББ КазНЦ РАН (2001, 2002,2003).

Благодарности. Глубокую признательность выражаю моему научному руководителю, заведующему лабораторией механизмов роста растительных клеток, д.б.н. Татьяне Анатольевне Горшковой за всестороннюю поддержку, терпение и неоценимую помощь в работе. Особую признательность приношу с.н.с., к.б.н Светлане Борисовне Чемикосовой и н.с., к.б.н Марине Вячеславовне Агеевой, а также с.н.с., к.б.н Вадиму Владимировичу Сальникову за бесценные советы, понимание и плодотворное обсуждение полученных данных. Отдельную благодарность хочу выразить моей семье за посильный вклад и искреннее участие, а также благодарю моих близких друзей за техническую поддержку.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Павленчева, Наталия Владимировна

ВЫВОДЫ

1) Установлено, что точка слома является индикатором, разграничивающим отдельные стадии развития флоэмных волокон стебля льна. С использованием методов микроскопии показано, что удлинение флоэмного волокна происходит только на участке стебля выше точки слома, ниже ее клеточная стенка лишь утолщается.

2) Обнаружено, что удлинение индивидуальной клетки, достигающей нескольких сантиметров в длину, занимает от 3 до 5 дней, причем, скорость удлинения волокна составляет примерно 1 см в сутки. Утолщение клеточной стенки может происходить в течение двух месяцев

3) Показано, что высокомолекулярный буферрастворимый галактан стебля льна не только тканеспецифичен, но и стадиеспецифичен: он

К отсутствует в ходе удлинения волокон и появляется только после завершения интрузивного роста, на стадии утолщения клеточной стенки.

4) В опытах на различных сортах льна показано, что в период быстрого роста содержание тканеспецифичного галактана составляло 0,5% - 1,2% от сухой массы волокнистой части стебля и 0,7%-1,9% от массы выделенной из нее клеточной стенки. При этом включение метки в тканеспецифичный галактан за первые 40 минут экспозиции растений с 14СОг достигало 30 % от радиоактивности клеточной стенки.

5) Тканеспецифичный водорастворимый галактан подвергается постсинтетической модификации и в зрелом волокне не обнаруживается. В экспериментах с 14СОг показано, что в первые 8 часов после введения метки время полужизни полимера составило всего 4 часа, что свидетельствует о быстром распаде новосинтезированных молекул.

6) Показано, что воздействие неблагоприятного фактора в период быстрого роста снижает скорость удлинения волокон. Волокно, растущее во время стресса, остается более коротким до окончания онтогенеза, в результате чего возникает неустранимая неоднородность длины волокон в различных участках стебля.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В системе интактного растения исследован метаболизм тканеспецифичного полисахарида флоэмных волокон и его сопряженность со стадиями развития клетки. Показано, что высокомолекулярный буферрастворимый галактан не только тканеспецифичен, но и стадиеспецифичен: он отсутствует в ходе удлинения волокон и появляется только после завершения интрузивного роста. Совпадение по времени инициации синтеза галактана с возникновением в клеточной стенке слоя с особо упорядоченной структурой (СогеЬкоуа а1., 2004), характерной для зрелого волокна, позволяет предположить, что он принимает , участие в упаковке микрофиблилл целлюлозы. Дополнительным аргументом в пользу этого предположения служит локализация тканеспецифичного галактана в неупорядоченном внутреннем слое вторичной клеточной стенки (ОогБЬкоуа е1. а1., 2004), который исчезает при созревании волокна (Сальников с сотр., 1993), параллельно с исчезновением буферрастворимого галактана в результате постсинтетической модификации. Судя по характеру метаболизма тканеспецифичного галактана, можно ожидать, что в районе точки слома происходит активация генов ферментов, обеспечивающих его синтез и модификацию, что делает лен перспективным объектом для поиска генов гликозилтрансфераз, по-прежнему остающихся одними из самых сложных для идентификации.

В результате проведенных исследований обнаружено, что склеренхимные волокна, несмотря на их удивительную длину, не являются исключением из общего правила, утверждающего, что удлинение клетки и формирование вторичной клеточной стенки происходит последовательно. Ранее считалось, что волокна формируются путем длительного концевого роста, совмещенного с отложением слоев вторичной клеточной стенки в срединной части клеток. Установлено, что точка слома - это место, где: 1) заканчивается интрузивный рост всех волокон в этой части стебля; 2) активируется синтез тканеспецифичного галактана флоэмных волокон; 3) происходит возрастание механической прочности волокнистой части стебля. Наличие такого индикатора, как точка слома, делает растения льна удобной ф моделью для функциональной геномики формирования растительных волокон, изучения механизмов формирования полисахаридов клеточной стенки и роста растительных клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павленчева, Наталия Владимировна, Казань

1. Агеева М.В. Ультраструктурные аспекты биогенеза клеточной стенки в лубяных волокнах льна-долгунца. Дисс. Канд. биол. наук. Казань, КИББ КазНЦ РАН. - 1990. 125 С. (рукопись)

2. Александров В.Г., Абесадзе К.Ю., Нассонов В.А., Яковлев М.С. Принципы построения стебля лубо-волокнистых текстильных растений и методы его изучения.// Тр. по прикладной ботанике, генетике и селекции. -1932. Т.З №2. - С.49-74.

3. Антонова Г.Ф. Рост клеток хвойных. Новосибирск: Наука. -1999.-227 С.

4. Афонин М.И., Миронова Е.Д. Химический состав соломки, Тресты, волокна и семян льна // Справочник льновода. Минск.:Ураджай. -1973.-С. 41-49.

5. Васильев А.Е. Опорные (механические) ткани.// Атлас ультраструктуры растительных тканей. Под ред. Даниловой М.Ф., Козубова Г.М. Петрозаводск. 1980. - С.221-234.

6. Вознесенский B.JL, Заленский О.В., Семихатова O.A. Методы исследования фотосинтеза и дыхания растений. M.-JL: Наука. 1965. - 305 С.

7. Горшкова Т.А. Метаболизм полисахаридов клеточной стенки растений: Дис докт. биол. наук. Казань, КИББ РАН. 1997. - 248 С.(рукопись)

8. Горшкова Т.А., Агеева М.В., Сальников В.В., Павленчева Н.В., Снегирева A.B., Чернова Т.Е., Чемикосова С.Б. Стадии формирования лубяных волокон Linum usitatissimum (Хшасеае)//Ботанический журнал. -2003.-№ 12. Т 88. - С.1-11

9. Заботин А.И., Барышева Т.С., Лозовая В.В, Заботина O.A., Ларская И.А. Клеточная стенка растений и формирование гипотермального синдрома. // Общая биология. Доклады Академии наук. 1995. - Т.343. - С. 567-570.

10. Заботин А.И., Барышева Т.С., Трофимова О.И., Лозовая В.В., Видхолм Дж. Исследование регуляции метаболизма каллозы в клетках высших растений in vivo II Физиология растений. 2002. - т 49 №6. - С. 890897.

11. Иванов В.Б. Клеточные основы роста растений. Отв. Редактор И.В. Обреимов. М.: Наука. 1974. - 222 С.

12. Иванов А.Н., Чернова H.H., Гурусова A.A., Ремизова Т.В. Исследование химического состава волокон льна различных селекционных сортов// Изв. Вузов. Технология текстильной промышленности. 1986. - №1. -С. 19-21.

13. Кошелева Л.Л. Физиология питания и продуктивности льна-долгунца. Минск.: Наука и техника. 1980. - 200 С.

14. Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва: Высшая школа. 1980. - 235 С.

15. Лотова Л. Морфология и анатомия высших растений. М.: Эдиториал УРСС. 2001. - 528 С.

16. Лозовая В.В., Сальников В.В., Юмашев Н.В. Формирование клеточных стенок в тканях стебля растений льна-долгунца. Казань. 1990. -171 С.

17. Марков В.В. Первичная обработка лубяных культур. М.: Легкая индустрия. 1967. - 459 С.

18. Марченков А.Н. Биологические особенности льна-долгунца // Справочник льновода. Л.:Агропромиздат. 1985. - С 12.

19. Мокроносов А.Т. Онтогенетический аспект фотосинтеза. М.: Наука.-1981.- 196 С.

20. Обручева Н.В. Физиология растущих клеток корня. М: Наука. -1965. 298 С.

21. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность. // Биоорганическая химия. 1998. - Т. 24. - С. 483-501.

22. Ордина H.A. Структура лубоволокнистых растений и ее изменение в процессе переработки. М.: Легкая индустрия. 1978. - 127 С.

23. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос. -1970.-285 С.

24. Палеев A.M. Роль углеводов клеточной стенки соломы и листьев S. cereale в образовании зерна.// Биохимия. 1938. - № 3. - С. 258-269.

25. Погодина Н.М. Фенольные соединения клеточной стенки различных частей стебля льна (Linum usitatissimum) в pulse-chase эксперементах с интактными растениями: Дис. канд.биол.наук.-Казань, КИББ РАН. 1999. - 128 С.(рукопись)

26. Раздорский В.Ф. анатомия растений. М.: Советская наука. 1949.- 524 С.

27. Сизов И.А. Лен. М.:Л. 1955. - 256 С.

28. Сальников В.В., Агеева М.В., Юмашев В.Н., Лозовая В.В. Ультраструктурный анализ лубяных волокон.// Физиология растений. 1993.- Т.40 №3. С.458-464.

29. Тарчевский И.А., Марченко Г.Н. Биосинтез и структура целлюлозы. М.: Наука. 1987. 279 С.

30. Тарчевский И.А. Катаболизм и стресс у растений. М.: Наука. -1993.-293 С.

31. Трухановец Н.Л., Рубан В.В., Ильченко В.П., Хотылева Л.В. Онтогенетическое развитие клеток волокна у разных генотипов льна-долгунца.// Докл. HAH Беларуси. 2001. - Т 45.№ 2. - С. 86-88.

32. Чиков В.И. Фотосинтез и транспорт ассимилятов. М.: Наука. -1987.- 187 С.

33. Эсау К. Анатомия растений. М.: Мир, 1969. 564 С.

34. Эзау К. Анатомия семенных растений. М.: "Мир". 1980. 2т. -558 С.

35. Akin D.E., Gamble G.R., Morrison III W.H., Rigsby L.L., Dodd R.B. Chemical and structural analysis of fiber and core tissues from flax.// J.Sci. Food Agric. 1996. - V 72. - P 155-165

36. Albersheim P. Concerning the structure and biosynthesis of the primary cell walls of plants. Int. Rev. Biochem. - 1978. - V. 16. - P. 127-150.

37. Albersheim P., Darvil A.G. Oligosaccharins.// Scientific Amer. -1985.-V. 253. P.44-50.

38. Albersheim P. The walls of growing plant cells. Sci Am. 1975. - V. 232. - P.80-95.

39. Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. Molecular biology of the cell. 2nd edt. 1989. - 1187 P.

40. Aldaba V.C. The structure and development of the cell wall in plants I. Bast fibers of Boehmeria and Linum.H. Amer. J Bot. 1927. - V. 14. - P. 16-22

41. Aldington S., Fry S. Oligosaccharins.// Advances in Botanical Research. 1993. - V. 19. - 701 P.

42. Aspinall G.O. Chemistry of cell wall polysaccharides. // The biochemistry of plants. Academic press. San-Diego. 1980. - V. 3. - P. 473-500.

43. Andeme-Onzighi C., Girault R., His I., Morvan C., Driouich A. Immunochemical characterization of early-developing flax fiber cell walls.// Protoplasma. 2000. - V 213. - P 235-245.

44. Anderson D.B. A microchemical study of the structure and development of flax fibers. // Amer. J Bot. 1927. - V. 14. - P. 187-211.

45. Boiler T. Ethylene and the regulation of antifungal hydrolases in plants. // Oxf. Surv. Plant. Mol. Cell Biol. 1998. - V.5. - P. 145-174.

46. Bolwell G.P. Synthsis of cell wall components: aspects of control. //Phytochemistry. 1988. - V. 27. - P. 1235-1253.

47. Brett C.T., Waldron K. W. Physiology and biochemistry of plant cell walls. London. Unwin Hyman Ltd. 1990. - 188 P.

48. Carpita N.C., Gibeaut D.M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the partial properties of the walls during growth. // Plant J. 1993. - V. 3. - P. 1-30.

49. Carpita N. McCann M. The Cell Wall. Biochemistry and molecular biology of plants. Buchamann B. Gruissem W. Jones K., eds. American society of Plant Physiologists. 2000. - P. 52-108.

50. Carpita N., Tierney M., Campbell M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics // Plant Molecular Biology. 2001. - V. 47. - P. 1-5.

51. Chikov V.I., Awakumova N.Y., Bakirova G.G., Belova L.A., Zaripova L.M. Apoplastic transport of 14C-photosynthates measured under drought and nitrogen supply. // Biologia plantarium. 2001. - V. 44 (4). - P. 517521.

52. Crooks D.M. Histological and regenerative studies on the flax seedlings. //Bot. Gaz. 1933. - V. 95. - P. 209-239.

53. Cutter E.G. Plant Anatomy: Experiment and Interpretation. Part 1: Cells and Tissues. 2nd edn. E. Arnold, London. 1984. - 264 P.

54. Darvill A.G., McNeil M., Albersheim P., Delmer D.P. The primary cell wall of flowerting plants.// The biochem. of plants. Academic press. 1980. -V. 1. —P. 91-162.

55. Davis E.A., Derouet C., du Penhoat C.H. Isolation and an N.M.R. study of pectins from flax (Linum usitatissimum L)// Carbohydrate Research. -1990.-V 197.-P 205-215.

56. Delmer D.P., Stone B.A. Biosynthesis of plant cell walls.// The biochem. of plants. Academic press. 1988. - V. 14. - P. 373-420.

57. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. 1956. Anal. Chem. - V. 28. - P.350-356.

58. Esau K. Vascular differentiation in the vegetative shoot of Linum. I. The procambium // Amer. J. Bot. 1942. - V. 29. - P.738-747.

59. Esau K. Vascular differentiation in the vegetative shoot of Linum. II.The first phloem and xylem.// Amer. J. Bot. 1943 a. - V. 30. - P. 248-255.

60. Esau K. Vascular differentiation in the vegetative shoot of Linum. III. The origin of bast fibers.// Amer J Bot. 1943 b. - V. 30. - P. 579-586

61. Esau K. Plant Anatomy. John Wiley & Sons, Inc New York, Chapman & Hall, Ltd London. 1953. - 733 P.

62. Esau K. Anatomy of Seed Plants. John Wiley & Sons, Inc New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore. 1977. - P. 74-81.

63. Edelman H.G., Fry S.C. Kinetics of integration of xyloglucan into the walls of suspension cultured rose cells. // J. of Experimental Botany. 1992. - V43 №249.-P. 463-470.

64. Edwards M.E., Dickson C.A., Chengappa S., Sidebottom C., Gidley M.J., Reid J.S. Molecular characterization of a membrane-bound galactosyltransferase of plant cell wall matrix polysaccharide biosynthesis in pea.//J. Biol.Chem. 1999. - V. 19. - 691-697.

65. Ericson M.C., Elbein A.D. Biosynthesis of cell wall polysaccharides and glycoproteins. // The biochem. of plants. 1980. - V. 3. Academic press. -P.589-616.

66. Fahn A. Plant Anatomy. Pergamon Press. Oxford. 1990. - 587 P.

67. Faik A., Price N.J., Raikhel N.V., Keegstra K. An Arabidopsis gene encoding an a-xylosyltransferase involved in xyloglucan biosynthesis. //Plant Biol. 2002. - V. 99.№ 11. - P. 7797-7802.

68. Fischer R.L., Bennett A.B. Role of cell wall hydrolases in fruit ripening. // Ann. Rev. of plant physiol. And plant molec. Boil. 1991. - V. 42. -P.675-703.

69. Fincher G.B., Stone B.A. Metabolism of noncellulosic polysaccharides. In: Plant Carbohydrates II (Encyclopedia of plant physiology, N.S. , Vol.l3B), eds. W. Tanner and F.A. Loewus. Springer, Berlin. 1981. - P. 68-132.

70. Franz G. Polysaccharidmetabolismus in den Zellwanden wachsender Keimlinge von Phaseolus aureus.// Planta. 1972. - V 102. - P 334-347.

71. Freudenberg K., Neish A.C. Composition and biosynthesis of lignin, molecular biology, biochemistry and biophysics. Berlin. Springer-Verlag. 1968. -V. 2.-129 P.

72. Fry S.C. Phenolic components of the primary cell wall: feruloylated disaccharides of D-galactose and L-arabinose from spinach polysaccharide.// Biochem. J. 1982. - V 203. - P 493-504.

73. Fry S.C. Primary cell wall metabolism. Oxford Surv Plant mol. Cell Biol. 2: 1-42, ed. B.J. Miflin. Oxford University Press. 1985. P. 1-42.

74. Fry S.C. The growing plant cell wall: Chemical and Metabolic Analysis. Longman Scientific and Techical. 1988. - 333 P.

75. Fry S.C. Polysaccharide-modifying enzymes in the plant cell wall // Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Mol. Biol. 1995. - V.46. - P.497-520.

76. Foster A.S. Practcal plant anatomy 2nd ed. New York. 1949. - 432 P.

77. Fulcher R.G., McCally M.E., Setterfield GM.E., Sutherland J. 0-1,3-glucans may be associated with cell plate formationduring cytokinesis.// Can. J. Bot. 1976. - V. 54. - P. 539-542.

78. Gibeaut D.M., Carpita N.C.Biosynthesis of plant cell wall polysaccharides.// Faseb J. 1994. - V. 8. - P. 904-915.

79. Gibeat D.M. Nucleotide sugars and glycosyltransferases for synthesis of cell wall matrix polysaccharides. // Plant Physiol. 2000. - V. 38. - P. 69-80.

80. Girault R., Bert F., Rihouey C., Janeau A., Morvan C., Jarvis M. Galactans and cellulose in flax fibres: putative contributions to the tensile strength.// Int J Biol Macromol. 1997. - V 21. - P 179-188.

81. Girault R., His I., Andeme-Onzighi C., Driouich A., Morvan C. Identification and partial characterization of proteins and proteoglucans encrusting the secondary cell walls of flax fibers.//Planta. 2000. - V. 211. - P. 256-264.

82. Gorshkova T.A., Wyatt S.E., Salnikov V.V., Gibeaut D.M., Ibragimov M.R., Lozovaya V.V., Carpita N.C. Cell-wall polysaccharides of developing flax plants.// Plant Physiol. 1996. - V 110. - P 721-729.

83. Gorshkova TA, Chemikosova SB, Lozovaya VV, Carpita NC Turnover of galactans and other cell wall polysaccharides during development of flax plants// Plant Physiol. 1997. - V 114. - P 723-729.

84. Gorshkova T.A., Salnikov V.V., Chemikosova S.B., Ageeva M.V., Pavlencheva N.V., van Dam J.E.G.The snap point: a transition point in Linum usitatissimum bast fiber development.// Ind. Crops and Prod. 2003. - V 18. - P 213-221.

85. Gorshkova T.A., Chemikosova S.B., Salnikov V.V., Pavlencheva N.V., Stolle-Smits T., van Dam J.E.G. Occurrence of cell-specific galactan in coinciding with bast fibre developmental transition in flax.// Ind. Crops and Prod. -2004. in press

86. Gross K.G. Fractionation and partial characterization of cell walls from normal and non-ripening tomato fruit.// Physiol. Plant. 1984. - V 62. - P 2532.

87. Goubert F., Martini F., Thoiron B, Morvan C. Incorporation of D-(U-14C)-glucose and 14C(>2 into the cell-wall polymers of flax hypocotyl, in the course of the fiber differentiation.// Plant Physiol. 1993. - V 34(6). - P 841-848.

88. Goubet F., Bourlard T., Girault R., Alexandre C., Vandevelde M-C., Morvan C. Structural features of galactans from flax fibers. // Carbohydr Polym. -1995.-V 27.-P 221-227.

89. Haberlandt E. Physiological plant anatomy. London. Hacmillan and company. 1914. - 264 P.

90. Hayashi T., Wong Y., Maclachlan G. Pea xyloglucan and cellulose. II Partial hydrolysis by pea endo -(l-»4)-p-glucanases.// Plant Physiol. 1984. - V 75.-P 605-610.

91. Harris M., ed. Handbook of textile fibres, Washington, Harris Desearch Lab. 1954. - 371 P.

92. Heredia A., Guillen R., Jimenez A., Fernandez-Bolanos J. Plant cell structure. // revista Espan. De Ciencia y Teen. De Alim. 1993. - V.33 (2). - P. 113-131.

93. Higuchi T., Shimada M., Kawamura I. Chemical properties of milled wood lignin of grasses.// Phytochemistry. 1967. - V. 11. - №6. - P. 1551-1556.

94. Hock C.W. Microscopic structure of flax and related bast fibers.// J Res Nat Bureau Std. 1942. - V 29. - P 41-50.

95. Hoson T., Nevis D.J. Anti-p-D-glucan antibodies inhibit auxin-induced cell elongation and changes in the cell wall of Zea coleoptile segments.// Plant Physiol. 1989. - V. 90. - P. 1353-1358.

96. Ivanov V.B. relationship between cell proliferation and transition to elongation in plant roots. // Int. J. dev. Biol. 1997. - V. 41. - P. 907-915.

97. Kauss H.Role of the plasma membrane structure, function and molecular biology. Eds. Larson C., Moller I.M. Berlin: Springer. - 1990. - P 320350.

98. Kauss H., Waldman T., Jerblick W., Takemoto J.Y. The phytotoxinft«syringomycin elicits Ca -dependent callóse synthesis in suspension cultured cells of Catharanthus roses J I Physiol.plant. - 1991. - V. 81. - P. 134-13 8.

99. Knee M. Metabolism of polymethylgalacturonate in apple fruit cortical tissue during ripening.// Phytochemistry. 1978. - V 17. - P 1261-1264.

100. Kratzl K., Eible J. Chemical and botanical evidence for lignification.// Holzforschung. 1951. - V. 3. - P. 76-77.

101. Lamport D.T.A. Cell Wall metabolism.// Ann. Rev. Plant Physiol. -1970. -V 21. -P 235-270.

102. Lev-Jadun S. ntrusive growth the plant analog of dendrite and axon growth in animals. //New Phytologist. - 2001. - V. 150. - P. 508-512.

103. Leung D.W.M., Bewley J.D. A role for a-galactosidase in the degradation of the endosperm cell walls of lettuce seeds, cv. Grand Rapids. // Planta. 1983. - V 157. - P 274-277.

104. Lozovaya V.V., Zabotina O.A., Widholm J.M. Synthesis and tunover of cell-wall polysaccharides and starch in photosynthetic soybean suspension cultures// Plant Physiol. 1996. - V 111. - P 921-929.

105. Lucas W.J., Ding B., vanDer Schoot C. Plasmodesmata and the supracellular nature of plants. //New Phytol. 1993 - V. 125. - P. 435-476.

106. Meins F., Ahl P. Induction of chitinase and (3-1,3-D-glucanase in tobacco plants infected with Pseudomonas tobacii and Phytophtora parasitica var. nicotianae. II Plant. Sci. 1989. - V. 61. - P. 155-161.

107. Meier H., Buchs L., Buchala A.J., Homewood T. (l-3)-|3-D-glucan (callóse) is a probable precursor of cellulose of cotton fibres. // Nature. 1981. -V. 289.-P.821-822.

108. Meinert M.D., Delmer D.P. Changes in biochemical composition of the cell wall of the cotton fiber during development. // Plant Physiol. 1977. - V. 56.-P. 1088-1097.

109. Mitcham E.J., Gross K.S., Ng T.J. Tomato fruit cell wall synthesis during development and senescense.// Plant Physiol. V. 89. - P. 1477-1481

110. McCartney L., Steele-King c.G., Jordan E., Knox J.P. Cell Wall pectic (1—>4)P-D- galactan marks the acceleration of cell elongation in the Arabidopsis seedling root meristem.// The plant J. 2003. - V. 33. - P. 447-454.

111. McCann M., Roberts K. Mosaics and murals// J. Cell Sci. 1990. - V. 96. - P 323-334.

112. McCann M.C., Wells B., Roberts K. Complexity in the spatial localization and length distribution of plant cell wall matrix polysaccharides // Journal of Microscopy. 1992. V.166. P.123-136.

113. McCann M.C., Stacey N.J., Wilson R., Roberts K. Oirentation of cthe macromolecules in the walls of elongating carrot cells. // J Cell Sci. 1993. - V. 106.-P. 1347-56.

114. McDougall G.J. Accumulation of wall-associated peroxidases during wound-induced suberinization of flax // Journal of Plant Physiology. 1993 a. - V. 142.-P 651-656.

115. McDoughall G.J. Isolation and partial characterization of the non-cellulosic polysaccharides of flax fibre. // Carbodydr Res. 1993 b. - V 241. - P 227-236.

116. McDougall G.J., Morrison I.M., Stewart, Weyers J.D.B., Hillman J.R. 1993b. Plant fibers: botany, chemistry, and processing for industrial use // J.Sci Food Agric. 1993. - V.62. - P 1-20.

117. McNeil M., Darvill A.G., Fry S.C., Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants. // Ann.Rev. Biochem. 1984. - V. 53. -P. 625-663.

118. Mohnen D. Biosynthesis of pectins and galactomanans. // B.M. pinto, ed, Carbohydrates and their derivativies including tannins, cellulose and related lignins. Elsevier/North-Holland Publishing, Amsterdam. 1999. - P. 497-527.

119. Mooney C., Stolle-Smits T., Schols H., de Jong E. Analysis of retted and non retted flax fibers by chemical and enzymatic means. // J. of Biotechnology. 2001. - V.89. - P. 205-216.

120. Morvan C., Abdul Hafez A.M., Jauneau A., Thoiron B., Demarty M. Incorporation of D-(U-14C)-glucose in the cell wall of linum plantlets during the first steps of growth. //Plant Cell Physiol. 1991. - V 32 (5). - P 609-621.

121. Nishitani K., Masuda Y. Acid pH-induced structural changes in cell wall xyloglucans in Vigna angularis epicotyl segments. // Plant Sci. Lett. 1982/3. - V 28.-P 87-94.

122. Northcote D.H., Pickett-Heaps J.D. A function of the Golgi apparatus in the polysaccharide synthesis and transport in the root-cap cells of wheat. // Biochem. J. 1966. - V 98. - P 159-167.

123. Northcote D.H. Chemistry of plant cell wall. //Ann. Rev. Plant Physiol.-1972.-V. 23.-P. 113-132.

124. Nunan K.J., Sims I.M., Bacic A.,Robinson S.P., Fincher G.B. Changes in Cell Wall Composition during ripening of grape berries.// Plant Physiol. 1998. - V. 118. - P. 783-792.

125. Packard M., Stack S.M. The preprophase band: possible involvement in the formation of the cell wall.//J. Cell Sci. 1976. - V. 22. - P. 403-411.

126. Parker M.L. Cell wall storage polysaccharides in cotyledons of Lupinus langustifolius L. II. Mobilization during germination and seedling development // Protoplasma. 1984. - V. 120. - P.233-241.

127. Peugnet I., Goubert F., Bruyant-Vannier M-P., Thoiron B., Morvan C., Schols H.A., Voragen A.G.J. Solubilization of rhamnogalacturonan I galactosyltransferases from membranes of flax cell suspension. // Planta. 2001. -V. 213.-P. 435-445.

128. Perrin R.M., DwRocher A.E., Bar-Peled M., zeng W., Norambuena 1., Orellana A., Raikhel N.V., Keegstra K. Xyloglucan fucosyltranferase, an enzyme involved in plant cell wall biosynthesis. // Science. 1999. - V. 284. - P. 19761979.

129. Perrin R., Wilkerson C., Keegstra K. Goldgi enzymes that synthesize plant cell wall polysaccharides: finding and evaluating candidates in the genomic era. // Plant molecular biology. 2001. - V. 47. - P. 115-130.

130. Pressey R., Avants J.K. Models of action of carrot and peach exopolygalacturonases. // Phytochemistry. 1975. - V. 14. - P. 957-961.

131. Pressey R., Avants J.K. Occurrence and properties of polygalacturonase in Avena and other plants. //Plant physiol. 1977. - V. 60. - P. 548-553.

132. Ryan C.A. Oligosaccharide signaling in plants. //Ann. Rev. Cell. Biol. 1987. - V. 3. - P.295-317.

133. Reid J.S.G. Structure and function in legume-seed polysaccharides. // Biochemistry of Plant Cell Walls, eds. C.T. Brett and J.R. Hillman. Cambridge University Press. 1985. - P 259-268.

134. Ruel K., Joseleau J.P. Use of enzyme-gold complexes for the ultrastructural localization of hemicelluloses in the plant cell wall.// Histochemistry. 1984. - V. 81. - P. 573-580.

135. Salnikov V.V., Ageeva M.V., Yumashev V.N., Lozovaya V.V. The ultrastructure of bast fibers. // Plant Physiol. 1993. - V 40. - P 458-464.

136. Salnikov V.V., van Dam J.E.G., Lozovaya V.V. Microscopy of cell wall formation in flax bast fibre. //Natural Fibres. 1998. - V 2. - P 187-194.

137. Seagull R.W. Fiber development and maturation. Cotton fiber development and processing, An illustrated overview. Ed.: Seagull R., alspaugh P. -2001.-87 P.

138. Schlupmann H., Bacic A., Read S.M., Uridine diphosphate glucose metabolism and callose synthesis in cultured pollen tubes of Nicotiana alata link et otto. // Plant Physiol. 1994. - V. 105. - P. 659-670.

139. Schoch-Bodmer H., Huber P. Das Spitzewachstum derFasern bei Linum perenne. //Experientia. 1945. - V. 1. № 9. - P. 327-328.

140. Schoch-Bodmer H., Huber P. Das Spitzewachstum der Bastfasern bei Linum usitatissimum und Linum perenne. II Ber Schweiz Bot Ges. 1951. - V 61. -P 377-404.

141. Serpe M.D., Muir A.J., Driouich A. Immunolocalization of (3-D-glucans, pectins, and arabinogalactan-proteins during intrusive growth and elongation of nonarticulated laticiters in Asclepias speciosa Torr. // Planta. 200. -V. 215.-P. 357-370.

142. Tammes T. Der Flachestengel. Eine statistisch-anatomishe Monographic // Naturk. Verhund. v.d. Holland Maatsch.d. Wetenschappen.t. Haarlem. Derde Versameling. Vierde Stuk 1907. - Deel VI.- 285 P.

143. Talbott L.D., Ray P.M. Changes in molecular size of previously deposited and newly synthesized pea cell wall matrix polysaccharides. // Plant Physiol. 1992. - V. 98. - P. 369-379.

144. Takeuchi Y., Komamine A., Saito T., Watanabe K., Morikawa N. Tunover of cell wall polysaccharides of Vinca rosea suspension culture. II. Radio gas chromatographical analysis. // Phisiol. Plant. 1980. - V 48. - P 536-541.

145. Takeuchi Y., Komamine A. Tunover of cell wall polysaccharides of Vinca rosea suspension culture. Synthesis and degradation of cell wall components. // Physiol.Plant. 1980. - V 51. - P 158-173.

146. Terry M.E., Jones R.L., Bonner B.A. Soluble cell wall polysaccharides released from pea stems by centrifugation. I Effect of auxin.// Plant Physiol. 1981. - V 68. - P 531-537.

147. Tucker G.A., Robertson N.G., Grierson D. Purification and changes in activities of tomato pectinesterase isoenzymes. //J. Sci. Food Agric. 1982. - V. 33.-P. 396-400.

148. Tucker G.A., Mitchell J. Cell walls, structure, utilization and manipulation. // Plant Biotech. 1993. - V. 3. - 55-103.

149. Updegraff D. M. Semi-micro determination of cellulose in biological materials. // Anal. Biochem. 1969. - V 32. - P 420-424.

150. Vian B.Brillonet J.M., Satiat-Jeanemaitre B. Structural visualization of xylans in cell walls of hardwood by means of xylanase-gold complex.// Biol.Cell. 1983. -V. 49. - P. 301-310.

151. Van Hazendonk J.M., Reinerink E.J.M., deWaard P., van Dam J.E.G. Structural analysis of acetylated hemicellulose polysaccharides from fiber flax {Linum usitatissimum L.).// Carbohydr Res. 1996. - V 291. - P 141-154.

152. Vicre M., Jauneau A., Knox J.P., Driouich A. Immunolocalization of P (1—>4)- and {3 (1—>6)-galactan epitopes in the cell wall and Goldgi stacks of developing flax root tissues.// Protoplasma. 1998. - V. 203. - P.26-34.

153. Waeghe T.J., Darvill A.G., McNeil M., Albersheim P. Determination, by metilation analysis, of the glycosyl-linkage compositions of microgram quantities of complex carbohydrates. //Carbohydr. Res. 1983. - V 123. - P 281304

154. Wallner S.J., Walker J.E. Glycosidases in cell wall-degrading extracts of ripening tomato fruits .//Plant Physiol. 1975. - V. 55. - P. 94-98.

155. Zabotin A.I., Barisheva T.S., Zabotina O.A., Larskaya I.A., Lozovaya V.V., Beldman G., Voragen A.G.J. Alterations in cell walls of winter wheat roots during low temperature acclimation.// J. of Plant Physiol. 1998. - V. 152. - P. 473-479.